KR101577955B1 - 아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

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임용택
노현종
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Abstract

음전하성 고분자 및 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist)의 복합체, 및 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 포함하는 아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물 {ADJUVANT COMPOSITION, PRODUCING METHOD OF THE SAME, AND VACCINE COMPOSITION INCLUDING THE SAME}
음전하성 고분자 및 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist)의 복합체, 및 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 포함하는 아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
면역 반응의 조절을 위한 생체물질의 합리적인 설계 및 합성이 암 면역요법 및 감염성 질환의 예방 및 치료 둘 다에서 중요 분야로서 떠오르고 있다. 아주번트로 알려진 잘 설계된 면역조절 생체물질의 개발을 위한 주요 도전 중 하나는 예방 및/또는 치료 백신과 같은 최종 적용에 따라서 면역 반응의 적절한 유형(즉, 체액성 또는 세포성 면역)을 어떻게 선택적으로 유도하는지를 배우는 것이다. 무기질염, 미생물-유래 아주번트, 에멀젼, 사이토카인, 다당류, 및 핵산-기저 아주번트를 포함하는 수 백의 여러 아주번트들이 지난 수십년간 신규한 백신 디자인으로 연구되고 사용되었지만, 부족한 효능, 용인되지 않는 국소 또는 전신 독성, 제조의 어려움, 낮은 안정성 및 생산 비용과 같은 제한들로 인해 인간용으로 성공적으로 승인되지 못하고 있다. 이러한 이유로, 현재까지 알루미늄-기저 무기질염(알룸)만이 인간 백신에서 아주번트로 가장 널리 사용되고 있다. 알룸은 강한 Th2 반응을 유발하지만, Th1-세포-매개 면역을 필요로 하는 병원균들에 대항하기에는 상대적으로 효과적이지 않다. 알룸은 저장고 작용(depot effect) 및 항원 표시 세포(antigen presenting cells, APCs)의 활성화를 유도하여 면역 반응을 유도한다고 알려져 왔다. 최근에는, NLRP3 인플라마솜(inflammasome)이, 비록 아주번트-유도 항체 반응에서의 역할이 논란이 되고는 있지만, 알룸의 면역자극 특성에 관련되어 있다고 여겨지고 있다[Reed SG, Orr MT, Fox CB. Key roles of adjuvants in modern vaccines. Nature medicine 19, 1597-1608 (2013)]. 시약 3-O-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A(MPLA)는 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota)의 Re595 균주로부터의 지질다당류(LPS)의 비독성 유도체이다. MPLA는 톨-유사 수용체 (TLR) 패밀리에 속하는 TLR4를 통해 작용하는 것으로 입증되었다. APCs로서 작용하는 MPLA-자극 DCs는 증가된 수준의 부자극 분자를 발현하고, B 및 T 세포의 활성화 및 분화에 중요한 IL-6, TNF-α, IL-1β, IFN-β 및 IL-12과 같은 사이토카인을 분비한다. 그러므로, MPLA는 선척적 면역 반응뿐만 아니라 T 및 B 세포 반응도 유도할 수 있다. 마우스, 기니피그, 원숭이, 및 인간에게 실시된 면역원성 연구는 또한 MPLA의 첨가가 후보 백신에 대한 특이 항체 및 세포성 면역 반응 둘 다를 강화시킴을 보였다. 그러나, MPLA는 난용성 면역-강화 물질이므로, 나노에멀젼(AS02) 또는 리포솜(AS01)과 같은 구조물에 의해 통합이 이루어져야 한다. 그렇기는 하지만, 나노에멀젼 및 리포솜의 제조의 어려움 및 낮은 안정성으로 인해 백신 아주번트의 대량 생산에 어려움이 있다. 게다가, 나노에멀젼 및 리포솜의 액상 제형은 안정성을 위해 냉장 환경에 보관해야 한다. 따라서, 콜드체인(cold-chain) 환경이 잘 갖추어져 있지 못한 개발도상국이나 후진국에서 보관에 어려움이 있어, 안정성에 큰 문제가 있는 현실이다.
본원은, 음전하성 고분자 및 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist)의 복합체, 및 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 포함하는 아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 음전하성 고분자 및 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist)의 복합체 및 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 포함하는 아주번트 조성물을 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 상기 본원의 제 1 측면에 따른 아주번트 조성물; 및 항원을 포함하는, 백신 조성물을 제공한다.
본원의 제 3 측면은, 음전하성 고분자와 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist) 혼합하여 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체에 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 혼합하는 것을 포함하는 아주번트 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 본원의 아주번트 조성물은 온도감응형 하이드로겔 형태로서, 체온 미만의 온도에서 졸(sol) 상태로 존재하고, 체온에서 하이드로겔 상태로 상전이되며, 40℃ 초과의 온도에서 졸 상태로 상전이된다. 이에 따라, 본원의 아주번트 조성물이 체내에 주입되면, 생리학적 온도에서 비-유동 겔로서 전환되어 항원 및 면역자극 물질 수송 저장고를 생체 내에 지속적으로 제공할 수 있다.
종래의 아주번트 조성물은 주로 에멀젼 및 미립자 형태로서, 대부분은 바이러스를 포함하는 많은 병원균에 대항하는 방어에서 매우 중요한 세포성 면역(Th1)을 거의 자극하지 않고 항체(Th2) 반응만을 유도하나, 본원의 일 구현예에 따른 아주번트 조성물은 체액성 및 세포성 면역 둘 다에서 우수한 아주번트 효과를 나타낸다.
일 구현예에 있어서, 본원의 아주번트 조성물은 생체친화성 고분자인 음전하성 고분자를 사용함으로써, 수용액에서 난용성인 톨-유사 수용체 아고니스트를 수용액 내에 안정하게 분산시키고, 최종적으로 분말 형태로 저장할 수 있게 함으로써, 상온에서의 백신의 보관 안정성을 증가시킬 수 있다.
도 1a 및 도 1b는, 본원의 일 실시예에 따른 아주번트 조성물의 하이드로겔 형성 메커니즘 및 이를 이용한 백신화를 나타낸 개략도이다.
도 2a는, 본원의 일 실시예에 따른 아주번트 조성물의 퓨리에 변환 적외선 분광 분석(FT-IR) 결과이다.
도 2b는, 본원의 일 실시예에 따른 아주번트 조성물의 형성 바로 후(PM1) 및 실온에서 4 달 동안 보관 후(PM2)의 γ-PGA/MPLA 복합체의 활성(엔도포인트 역가)을 나타낸 것이다.
도 2c는, 본원의 일 실시예에 따른 아주번트 조성물의 유세포 분석기에 의해 측정된 DC 성숙 마커의 발현(부착 및 공동-자극 분자 CD40, CD54, CD80, 및 CD86)을 나타낸 것다.
도 2d는, 본원의 일 실시예에 따른 아주번트 조성물의 γ-PGA 단독, 또는 γ-PGA/MPLA 복합체 배지로의 처리 24 시간 후에 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 수득된 발현된 사이토카인(TNF-α, IL-6, 및 IL-12p70)의 농도를 나타낸 것이다.
도 3은, 본원의 일 실시예에 따른 아주번트 조성물을 포함하는 백신에서 항원과 PTG와의 결합을 GPC-MAALS를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는, 본원의 일 실시예에 따른 콜라겐 및 γ-PGA로부터 형성된 PTG의 CD 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는, 본원의 일 실시예에 따른 콜라겐/γ-PGA 혼합물의 실온(25℃) 및 37℃에서의 이미지(좌측도) 및 PTG(37℃)의 SEM 이미지(우측도)를 나타낸 것이다.
도 4c는, 본원의 일 실시예에 따른 아주번트 조성물을 포함하거나 포함하지 않은 백신의 OVA 항원(PTG 없이 또는 함께)의 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 따른 콜라겐, γ-PGA, 및 γ-PGA/콜라겐복합체의 온도별 점도 프로파일을 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6c는, 본원의 일 실시예에 따른 아주번트 조성물을 포함하는 백신의 1 차례 및 2 차례 주입 후 분석 결과로서, (도 6a) 면역글로불린 G 및 (도 6b) IgG의 서브타입인 IgG1 및 IgG2c의 ELISA 측정 결과, 및 (도 6c) ELISPOT을 이용한 Th-유도 사이토카인인 인터페론-감마(IFN-γ) 측정량을 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7h는, 본원의 일 실시예에 따른 아주번트 조성물을 포함하는 백신의 1 차례 및 2 차례 주입 후 분석 결과로서, (도 7a) 면역글로불린 G, (도 7b) IgG의 서브타입인 IgG1 및 IgG2c의 ELISA 측정 결과, (도 7c) ELISPOT을 이용한 Th-유도 사이토카인인 인터페론-감마(IFN-γ) 측정량, (도 7d) 혈중 항체 농도, (도 7e) PR8 바이러스에 대한 생존률, (도 7f) PR8 바이러스에 대한 몸무게 변화, (도 7g) H5N1에 대한 생존률, 및 (도 7h) H5N1에 대한 생존률 측정 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
본원의 제 1 측면은, 음전하성 고분자 및 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist)의 복합체, 및 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 포함하는, 아주번트 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 아주번트 조성물은 온도감응형 하이드로겔을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 온도감응형 하이드로겔은 온도 변화에 따라 다단계 상전이 특성을 가지는 것으로서, 상기 다단계 상전이 특성은 상기 온도감응형 하이드로겔이 체온 미만의 온도에서는 졸(sol) 상태로 존재하고, 체온에서는 하이드로겔 상태로 상전이되며, 약 40℃ 초과의 온도에서는 졸 상태로 상전이되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 하이드로겔은, 가교 과정이나 추가적인 합성물을 포함하지 않고도 다단계 상전이 특성을 가질 수 있고, 상기 다단계 상전이 특성을 이용하여 일정한 온도 상승 등의 추가적 자극에 의해 아주번트로서 기능을 하는 유효 성분, 예를 들어, 톨-유사 수용체 아고니스트의 방출 거동을 지능적으로 조절할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 하이드로겔은, 상기 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질과 상기 음전하성 고분자가 분자간 비공유 결합에 의해 연결되어 3 차원 구조체를 형성한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 음전하성 고분자는 카르복실기 또는 히드록시기를 함유하는 것으로서, 예를 들어, 폴리감마글루탐산, 히알루론산, 셀룰로오스, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 음전하성 고분자는, 난용성인 톨-유사 수용체 아고니스트가 계면활성제 없이 수용액에 용이하면서 재현성있게 분산될 수 있도록 한다. 상기 음전하성 고분자는 동결건조 안정제 역할을 함으로써, 상기 아주번트 조성물이 안정하게 분말 형태로 제조될 수 있도록 하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 음전하성 고분자는 백신의 항원과 정전기적 인력 또는 친유성 결합을 통해 상호작용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 MPLA(Monophosphoryl lipid A), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 플라젤린(flagellin), 시피지(CpG), 폴리아이시[poly(I:C)], 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 콜라겐계 물질은 콜라겐 또는 정제콜라겐 유도체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 정제콜라겐 유도체는 I 형 콜라겐, II 형 콜라겐, III 형 콜라겐, IV 형 콜라겐, 이들의 유도체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질과 상기 음전하성 고분자가 분자간 비공유 결합에 의해 연결되어 3 차원 구조체를 형성할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
콜라겐계 물질은, 자체의 성질에 의해서 입체적인 구조(hyper-structure, triple-helix)를 이루는데, 온도가 올라갈수록 입체적 구조가 변화하며 차츰 단순한 랜덤 코일(random coil) 구조로 변하게 된다. 하지만, 상온에서 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질(콜라겐의 삼중 헬릭스 구조가 풀린 랜덤 코일 형태)에 음전하를 가지는 음전하성 고분자를 혼합하게 되면, 상기 콜라겐 또는 젤라틴의 구조에서 노출된 양전하성 관능기와 음전하성 고분자의 음전하성 관능기가 결합되어, 정전기적 인력에 의해 불투명한 상태의 하이드로겔이 형성된다.
상온에서 겔과 유사한 거동을 보이고 고점도 특성을 나타내는 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질의 용액은 음전하성 고분자의 첨가와 함께 점도가 급격하게 감소하여 흐름 특성이 우수해진다. 아울러, 온도가 체온 정도의 온도로 변화하게 되면, 콜라겐의 수소 결합과 구조변형 및 상기 언급된 정전기적 인력의 조합으로 인해 3 차원 구조를 갖는 신개념의 하이드로겔이 형성된다. 또한, 약 40℃ 초과의 온도에서는 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질 구조의 추가적인 변형으로 인해, 3 차원 구조가 결국에는 파괴되게 됨으로써, 투명한 상태의 졸 상태로 변하게 된다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 하이드로겔의 점도는 약 0.1 Pas 내지 약 5 Pas일 수 있으며, 예를 들어, 약 0.1 Pas 내지 약 3 Pas, 약 0.1 Pas 내지 약 1 Pas, 약 0.1 Pas 내지 약 0.5 Pas, 약 0.5 Pas 내지 약 5 Pas, 약 1 Pas 내지 약 5 Pas, 또는 약 3 Pas 내지 약 5 Pas일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질과 상기 음전하성 고분자의 중량비가 약 1 내지 100 : 약 0.1 내지 10, 예를 들어, 약 1 내지 4 : 약 1로서 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 아주번트 조성물은 수용액에 용해시켜 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
도 1a는 본원의 아주번트 조성물의 하이드로겔 형성 메커니즘을 개략적으로 나타낸다. 구체적으로, 도 1a는 콜라겐 및 폴리(γ-글루탐산)(γ-PGA)/MPLA 복합체로부터 하이드로겔(슈도써모겔, PTG)의 형성에 대하여 가능한 메커니즘으로서, MPLA의 히드록시기 및 γ-PGA의 카르복시기 사이의 수소 결합 유도 복합체를 형성하고(도 1a의 1), 체온은 실온에서 γ-PGA와의 정전기적 인력에 의해 유도된 콜라겐 삼중 헬릭스의 언폴딩을 가속시켜 물리학적 겔화(3-D 네트워크 구조)를 야기한다(도 1a의 2).
본원의 본원의 제 2 측면은, 상기 본원의 제 1 측면에 따른 아주번트 조성물; 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 측면에 따른 상기 아주번트 조성물에 대하여 상기 본원의 제 1 측면에 대하여 기재된 내용이 모두 적용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항원은 단백질, 세포, 바이러스, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 단백질은, 예를 들어, 오버알부민, 재조합 단백질, 서브유닛(subunit), 스플릿(split) 단백질 항원을 포함할 수 있으며, 상기 세포는, 예를 들어, 수지상세포를 포함할 수 있고, 상기 바이러스는, 예를 들어, 인플루엔자, 고병원성인플루엔자, PR8 바이러스, H1N1 바이러스, H5N1 바이러스 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
도 1b는 본원의 아주번트 조성물을 이용한 백신화를 개략적으로 나타낸 것으로, 친유성 면역자극 MPLA 및 바이러스 항원(H1N1, H5N1)을 PTG 내로 통합시킨 후, 이를 체내에 주입하게 되면, 면역 시스템의 자극을 지속하고 체액성 및 세포성 면역 둘 다를 유도하기 위해 주입 부위에서 병원균-유사 면역 감작 중추 및 항원 저장고로서의 역할을 할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 음전하성 고분자와 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist) 혼합하여 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체에 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 혼합하는 것을 포함하는, 아주번트 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 측면에 따른 상기 아주번트 조성물에 대하여 본원의 제 1 측면에 대하여 기재된 내용이 모두 적용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 음전하성 고분자는 카르복실기 또는 히드록시기를 함유하는 것으로서, 예를 들어, 폴리감마글루탐산, 히알루론산, 셀룰로오스, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 음전하성 고분자는, 난용성인 상기 톨-유사 수용체 아고니스트가 계면활성제 없이 수용액에 용이하면서 재현성있게 분산될 수 있도록 한다. 상기 음전하성 고분자는 동결건조 안정제 역할을 함으로써, 상기 아주번트 조성물이 안정하게 분말 형태로 제조될 수 있도록 하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 음전하성 고분자는 백신의 항원과 정전기적 인력 또는 친유성 결합을 통해 상호작용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 MPLA(Monophosphoryl lipid A), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 플라젤린(flagellin), 시피지(CpG), 폴리아이시[poly(I:C)], 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 콜라겐계 물질은 콜라겐 또는 정제콜라겐 유도체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 정제콜라겐 유도체는 I 형 콜라겐, II 형 콜라겐, III 형 콜라겐, IV 형 콜라겐, 이들의 유도체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질과 상기 음전하성 고분자가 분자간 비공유 결합에 의해 연결되어 3 차원 구조체를 형성할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
콜라겐계 물질은, 자체의 성질에 의해서 입체적인 구조(hyper-structure, triple-helix)를 이루는데, 온도가 올라갈수록 입체적 구조가 변화하며 차츰 단순한 랜덤 코일(random coil) 구조로 변하게 된다. 하지만, 상온에서 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질(콜라겐의 삼중 헬릭스 구조가 풀린 랜덤 코일 형태)에 음전하를 가지는 음전하성 고분자를 혼합하게 되면, 상기 콜라겐 또는 젤라틴의 구조에서 노출된 양전하성 관능기와 음전하성 고분자의 음전하성 관능기가 결합되어, 정전기적 인력에 의해 불투명한 상태의 하이드로겔이 형성된다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하며, 본 실시예에 의하여 본원의 범위가 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
물질
폴리(γ-글루탐산) (γ-PGA; Mw = 500 kDa)은 BioLeaders Corporation(대한민국, 대전)으로부터 제공받았다. 콜라겐(제 1 유형)은 Bioland Corporation(대한민국, 천안)에서 구입하였다. 3-O-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A(MPLA)는 Avanti Polar Lipids, Inc에서 구입하였다. 달걀 알부민(OVA) 및 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP)-결합 염소 항-마우스 IgG, IgG1, 및 IgG2c 항체는 Southern Biotech(미국 및 캐나다)에서 구입하였다. ELISPOT 시약은 BD Pharmingen(미국, 캘리포니아, 샌디에고)에서 구입하였다.
통계
하기 실시예에서, 그룹간의 차이를 ANOVA(analysis of variance)로 분석하여, 평균을 Student's t-test에 의해 비교하였다. P-수치 <0.05, <0.01, 및 <0.001은 각각 유의성 있음 및 상당히 유의성 있음으로 간주되었다. 생존 비교는 GraphPad Prism 5.0을 사용한 로그-랭크(log-rank) 시험으로 실시하였다.
실시예 1: γ- PGA / MPLA 복합체의 제조
250 mL의 디메틸 술폭사이드(DMSO)에 용해된 MPLA(1 mg, 0.57 mmol)를 실온에서 5 분 동안 격렬하게 교반하면서 10 mL의 탈이온수(DW)에 용해된 γ-PGA(13.3 mg)에 첨가하였다. 반응 후, 용액을 25℃에서 24 시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 상기 용액을 동결건조시킨 후, 10 mL의 DW에 재용해시켰고, DW 중의 셀룰로오스 막 튜브(MWCO = 12-14 kDa)로 3 일 동안 투석시켰다. 상기 용액을 동결건조하여 분말 형태의 최종 산물을 수득하였다.
실시예 2: γ-PGA/MPLA 복합체의 특성화
FTIR-ATR(Cary 630 FTIR Spectrometer, Agilent Technologies) 분석을 위해, γ-PGA/MPLA 복합체[γ-PGA:MPLA (1:5 (w/w)]를 DMSO-d 6 : D2O의 혼합 용액에 용해시켰다(8:2(v/v)). γ-PGA를 포함하는 복합체의 분자량 및 몰 반경(molar radius)을 굴절률(RI) 및 MALLS(multi-angle laser light-scattering) 검출기를 수반한 SEC(size-exclusion chromatography)로 측정하였다. 스태틱 레이저 광-산란 검출기(static laser light-scattering detectors)로 SEC 크로마토그램의 각 보유 시간을 측정하였다. 산란 강도는 각 보유 시간에서의 농도에 관련되어 있으며, 이는 별개의 농도-감응성의 RI 검출기에 의해 측정된 것이다. 이 시스템은 점도 검출기가 첨부되었을 때 0.8 mL/min의 유속으로 용리되었다. 세 개의 연속되어 연결된 HPLC-SEC 컬럼(TSKgel GMPWXL, TOSHO)이 사용되었다. 특성화는 컬럼 오븐 내에서 40℃에서 실시되었다. γ-PGA 및 γ-PGA 복합체(γ-PGA/MPLA/OVA)를 SEC 분석에서 또한 이동상인 0.1 M NaNO3에 용해시켰으며; 여과하였고(기공 크기 = 220 nm; Millex-GV); 주입하였다(200 μL). 광 산란을 DAWN Heleos II MALLS 검출기로 측정하였다. 사용된 RI 검출기는 Viscotek VE3580 RI 검출기이다.
실시예 3: γ- PGA / MPLA 복합체의 저장 안정성 및 아주번트 효과
γ-PGA/MPLA 복합체의 저장 안정성 및 아주번트 효과를 시험하기 위해, 혈청 내에서의 OVA 항원-특이 IgG 반응을 4 달 동안 실온 보관한 후 분석하였다. 각 마우스(n=5)로부터의 혈청 시료에서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하여 항체 역가를 결정하였다. 우선, 96-웰 면역흡착 플레이트(NUNC, Denmark)를 100 μL의 각 항원(1 ㎍ mL-1)으로 4℃에서 밤새 감작시켰다. 플레이트를 차단시켜(PBST 중의 2 % BSA, 37℃에서 1 시간) 비특이 결합을 방지한 후, 차단 완충용액 내에 희석된, 100 μL의 2 배 계열 희석된 시료를 상기 플레이트에 첨가(37℃에서 1 시간)한 후, 1:4,000으로 희석된 HRP-결합 염소 항-마우스 IgG 항체(Southern Biotech)를 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 100 μL의 퍼옥시다아제 기질 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine, TMB; BD Pharmingen)을 각 웰에 첨가하였다. 2 N H2SO4를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 450 nm의 파장에서 ELISA 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale CA)로 흡광도를 기록하였다. 엔도포인트(endopoint) 역가를 0.2의 광학 밀도(O.D.) 컷오프 수치를 사용하여 측정하였다.
실시예 4: 슈도써모겔(PTG)의 형성 및 특성화
상기 실시예 1에서와 같이 제조된 γ-PGA/MPLA 복합체를 PBS(Phosphate Buffered Saline)에 용해시키고, 콜라겐과 γ-PGA 의 중량비가 약 1 내지 4 : 약 1이 되게 정량화 한 후에 PBS 용액 내에서 강하게 교반시켰다. 온도를 상온에서 37℃까지 1℃씩 상승시키면서 겔화 거동을 관찰하였다.
γ-PGA/MPLA/콜라겐 복합체(하이드로겔, 슈도써모겔, PTG)의 겔화 거동을 회전 Haake RheoStress 600 Rheometer(Haake, Karlsruhe, Germany)를 사용하여 연구하였다. 평행 기하구조 플레이트(parallel geometry plate)(rotor PP35H, 35 mm 지름 및 1 mm 갭을 가짐)를 γ-PGA/MPLA/콜라겐의 비-진동 실험에 사용하였다. 온도는 순환 Haake DC-30 바스 및 Haake Universal Temperature Controller(UTC) 시스템으로 조절하였다. 상이한 온도에서 콜라겐 및 γ-PGA/MPLA/콜라겐 복합체CD(circular dichroism) 스펙트럼을 Jasco J-815 Spectropolarimeter(Jasco)를 사용하여 기록하였다. 1 mm 및 2 mm 경로 길이의 석영 셀(Hellma, Inc.)을 사용하여 190 nm 내지 250 nm로부터 1 nm 간격으로 스펙트럼을 수득하고, 데이터를 2 mm 경로 길이에 대해 분석하였다.
실시예 5: 마우스로부터의 BMDCs의 생성
BMDCs는 C57BL/6(H-2b) 마우스의 골수 세포로부터 생성되었다. 간략하게는, 골수는 경골 및 대퇴골로부터 수집되었다. 적혈구 세포는 0.83 M NH4Cl 완충용액(Sigma)에 의해 격감되었다. 골수 세포(2 x 106 세포)를 수집하여 10% 열-불활성 우태아혈청(FBS), 50 IU mL-1 페니실린, 50 IU mL-1 스트렙토마이신, 및 20 ng mL-1 재조합 마우스 과립 대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF; Pepro Tech)가 보충된 10 mL의 RPMI 배지를 포함하는 100 mm 페트리 디쉬에 배양하였다. 7 일 후에, 부착되지 않은 세포 및 느슨하게 부착된 세포(imDCs)를 수확하고 세척하여 생체외 실험에 사용하였다.
실시예 6: 생체외 사이토카인 및 성숙 검정
BMDCs를 웰(1 mL) 당 1 x 106의 밀도로 6-웰 플레이트에 배양하고 밤새 부착되도록 하였다. γ-PGA/MPLA (1 ㎍) 복합체를 1 mL 총 부피까지 웰에 첨가하였다. 트랜스펙션 후 24 시간째에, 배양 상청액을 수집하고 제조업자의 지시에 따라 사이토카인-특이 ELISAs(BD Pharmingen)를 사용하여 TNF-α, IL-6 및 IL-12p70에 대해 분석하였다. 사이토카인 농도를 450 nm의 O.D. 및 570 nm의 참조를 사용하는 VICTOR3TM 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 정량하였다. 생체외 DP 성숙 마커의 발현에서의 γ-PGA/MPLA (1 ㎍) 복합체의 효과를 처리 24 시간 후에 유세포 분석기로 측정하였다. DCs를 FITC-결합 항-CD40, 항-CD80, 항-CD86, 및 PE-항-CD54 (BD Pharmingen)로 착색하였다.
실시예 7: 바이러스 형성
인플루엔자 바이러스를 37 ㎍에서 47 시간 동안 A/Puerto Rico/8/34(PR8) 및 A/environment/Korea/deltaW150/2006(H5N1)을 갖는 10 일령의 발육 계란의 요막강(allantoic cavity)에서 성장시켰다. 요막액(allantoic fluid)을 수확하여 20% 수크로스 기울기를 통해 초원심분리로 정제하였다. 정제된 바이러스를 사용 전에 0.025 % 포르말린과 함께 4℃에서 72 시간 동안 인큐베이션하여 불활성화시켰다.
실시예 8: 동물 및 면역화 연구
암컷 BALB/c 및 C57BL/6 마우스 (5-6 주령)을 KOATECH(대한민국, 평택)에서 구입하였다. 마우스를 사용한 모든 실험은 실험실 연구 동물의 관리 및 사용에 대한 한국 NIH 지침에 따라 실시하였다. 향상된 Biosafety Level 3 봉쇄 연구실에서의 동물 관리 및 사용은 BioLeaders Corporation(대한민국, 대전)의 동물 실험 위원회, 프로토콜 번호 BSL-ABSL-13-010에 의해 승인되었다. 50 μL의 PBS 중의 PTG, OVA (20 ㎍) 및 포르말린-불활성화된 PR8 바이러스(0.5 ㎍) 또는 W150 바이러스(0.5 ㎍)의 혼합물을 사용하여 마우스를 근육내 면역화시켰다. 투여는 2 주 간격으로 두 번 실시하였다. 각 백신화 후 2 주째에 안와정맥총(retro-orbital plexus)을 통해 마우스로부터 혈청 시료를 수집하였다. 1,300 rpm에서 20 분 동안 원심분리하여 혈액으로부터 혈청을 수득하였다. 모든 시료는 사용 전에 -20℃에서 보관하였다.
실시예 9: ELISA 에 의한 IgG 서브클래스의 검출
항원-특이 IgG, IgG1, 및 IgG2c 항체 역가는 각 마우스(n=8)로부터의 혈청 시료를 사용하는 ELISA를 이용하여 검출하였다. 특히, 96-웰 ELISA 플레이트(NUNC, Denmark)를 4℃에서 밤새 100 μL의 각 항원(1 ㎍ mL-1)으로 감작시켰다. 차단(PBST 중의 5% BSA, 37℃에서 1 시간)하여 비-특이 결합을 방지한 후, 100 μL의 각 시료를 차단 완충용액 내에서 2 배 계열 희석한 후(37℃에서 1 시간), 1 : 4,000으로 희석된 HRP-결합 염소 항-마우스 IgG, IgG1, 및 IgG2c 항체(Southern Biotech)를 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 100 μL의 퍼옥시다아제 기질 TMB(BD Pharmingen)를 각 웰에 첨가하였다. 2 N 황산을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 450 nm의 파장에서 ELISA를 사용하여 흡광도를 기록하였다(Molecular Devices, Sunnyvale CA). 0.2의 O.D. 컷오프 수치를 사용하여 엔도포인트 역가를 결정하였다.
실시예 10: ELISPOT 검정
마지막 면역화 후 14 일째에, 각 그룹으로부터 3 마리의 면역화된 마우스를 희생시켜 비장세포를 수확하고 이 비장세포를 사용하여 ELISPOT 검정을 제조업자의 지시에 따라 마우스 IFN-γ ELISPOT 키트(BD Pharmingen)를 사용하여 실시하였다. 간략하게는, MultiScreenTM 96-웰 막 플레이트(Millipore, Billerica)를 4℃에서 밤새 PBS 중의 항-마우스 IFN-γ 캡쳐 항체(5 ㎍ mL-1)로 코팅시켰다. 항체 코팅을 폐기하고 PBS로 플레이트를 세척한 후, RPMI 1640 완전 배지(Invitrogen) 및 10% FBS (Invitrogen)를 함유하는 차단 용액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 비장세포를 OVA 펩티드(5 ㎍ mL-1) 또는 불활성화된 PR8 바이러스(5,000 TCID mL-1)를 함유하는 배지 내에서 웰 당 5x105 세포로 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 60 시간 내지 72 시간의 인큐베이션 후에, 상기 플레이트를 비오틴화된 항 마우스 IFN-γ 항체, 스트렙타비딘-호스레디쉬 퍼옥시다아제, 및 기질 용액으로 연속적으로 처리하였다. 최종적으로, ImmunoScan Entry analyzer(Cellular Technology, Shaker Heights, USA)를 사용하여 스팟을 계수하였다
실시예 11: 혈구응집 저해( hemagglutination inhibition , HI ) 시험
항-HA 항체 역가를 HI 검정을 사용하여 측정하였다. 각 시료를 수용체-파괴 효소(receptor-destroying enzyme, RDE; Denka Seikenm, Japan)로 처리하고 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 56℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, PBS를 첨가하여 1:10으로 희석하여 효소 활성을 불활성화시켰다. RDE-처리 혈청을 U-보텀 96-웰 플레이트 내에서 계열 희석(2 배)시켰다. 바이러스의 4 개의 혈구응집 유닛(hemagglutination unis, HAUs)을 시험에 첨가하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 칠면조 적혈구 세포(tRBCs; PBS 중 0.5%)를 첨가하고, 조심스럽게 혼합한 후, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
실시예 12: 접종 연구
마지막 백신화 후 2 주째에, 면역화된 마우스를 마취시키고 50×LD50 (C57BL/6에서의 치사량에 근거함) 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 바이러스 및 인플루엔자 A/environment/Korea/w149/2006 (H5N1) 바이러스를 비강내 투여하였다. 바이러스 접종에 따른 마우스의 체중 감소 및 생존률을 매일 평가하였다. 생존률은 사망 또는 동물을 안락사시키는 시점인 25%의 체중 감소에 근거하여 결정하였다.
결과
폴리(γ-글루탐산)에 의한 소수성 면역자극 MPLA 의 혼성
면역조절 PTG를 생성하기 위한 첫 번째 단계로서, 소수성 MPLA 및 항원(알부민(OVA) 및 바이러스 항원)의 가용성을 조정하기 위해 폴리(γ-글루탐산)(γ-PGA)을 선택하였다. γ-PGA를 MPLA와 혼합하였을 때, 난용성 MPLA는 수용액에 쉽게 용해될 수 있으나, MPLA 단독으로는 이의 소수성 성질때문에 수용액에서 침전된다(도 1a). 이온화된 카르복시기로부터 발생한 정전기적 반발에 의한 pH 5.5 내지 7.4에서의 γ-PGA의 확장된 풀린 상태는 MPLA와의 수소 결합 및 이차 상호작용에 좀 더 민감해지도록 할 수 있다.
MPLA와 γ-PGA의 상호작용은 두 부분(즉, 2,509.11 cm-1에서의 카르복실산 피크, 및 3,416.31 cm-1에서의 수소 및 카르복실산염 결합의 피크)에 초점을 맞추어 FTIR-ATR로 특성화하였다(도 2a). 3,416.31 cm-1에서의 수소 결합 표시점은 γ-PGA 및 MPLA 사이의 분자간 수소 결합에 의해 증가했다. 카르복실산 피크(2,509.11 cm-1에서)는 또한 복합체 형성 후에 감소했는데, 이는 γ-PGA의 카르복실산이 MPLA와 수소 결합을 형성하는데 사용되었기 때문이다. γ-PGA의 소수성 주사슬 또한 소수성 상호작용에 의해 MPLA 의 소수성 알킬 사슬과 상호작용할 수 있다. 동결건조된 γ-PGA/MPLA 복합체는 냉장 보관이 필요한 액상 제형인 종래의 아주번트와 비교했을 때 우수한 안정성을 갖는 장점이 있다. 뿐만 아니라, γ-PGA/MPLA 복합체의 동결건조 동안에, γ-PGA는 MPLA에 대해 동결건조 안정화제로서의 역할을 할 수 있다. 동결건조하여 시료를 제조하는 동안에, 잦은 냉각 및 해동은 MPLA와 같은 생물학적 활성 물질에 손상을 준다. 실제로, 바실리(bacilli)에 의해 생성된 γ-PGA는 이의 높은 산성 아미노산 조성때문에 높은 부동 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
γ- PGA / MPLA 복합체의 면역자극 활성
동결건조된 γ-PGA/MPLA 복합체의 장기간 면역자극 효능을 조사하기 위해, 신선하게 제조되고/제조되었거나 실온에서 4 달간 보관된 γ-PGA/MPLA 복합체를 항원과 함께 사용하여 자극된 DCs로부터의 사이토카인 분비를 측정하였다. 항원-특이 인 비보 면역 반응을 조사하기 위해, 모델 단백질 항원인 OVA를 γ-PGA/MPLA 복합체에 통합시켰다. GPC-MALLS 데이터(도 3)는 기울기(몰 질량에 의해 나눠진 몰 반경)가 γ-PGA가 MPLA 및 OVA와 혼합된 후 감소를 보이며, 이는 γ-PGA 및 MPLA 사이의 수소 결합-유도 복합체 형성 및 γ-PGA 및 OVA 사이의 이온성 및 소수성 상호작용-유도 복합체 형성을 제시하는 것이다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 사이토카인 분비 수준은 신선한 γ-PGA/MPLA 복합체 및 실온에서 4 달간 보관된 γ-PGA/MPLA 복합체로 처리된 DCs 둘 다에서 거의 동일하였다. 또한, 처리 24 시간 후에 BMDC 성숙 마커의 발현을 유세포 분석기로 분석하였다(도 2c). FACS 분석 데이터는 CD40, CD54, CD80, 및 CD86이, γ-PGA/MPLA 복합체로 처리한 BMDCs에서 γ-PGA 만을 처리했을 때에 비해 더 높은 수준으로 발현되었음을 보였으며, 이는 실온에서 4 달 동안 보관된 MPLA가 여전히 활성이어서 DCs를 성숙시킬 수 있음을 제시하는 것이다. γ-PGA/MPLA 복합체에 노출된 DCs는 또한 MPLA 없이 γ-PGA을 처리했을 때에 비해 상당히 더 높은 수준의 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, 및 IL-12p70)을 분비했다(도 2d). 이 실험 결과는 γ-PGA 물질이, 용이하고 왕성한 구성 전략을 통해 장기간 효능을 나타낼 수 있도록 소수성 면역자극 물질, MPLA 및 단백질 항원의 공동-결합에 사용될 수 있음을 제시한다.
슈도써모겔의 형성 및 특성화
γ-PGA/MPLA 복합체가 분말 형태로 보관될 수 있기 때문에, 투여 전에 하이드로겔-유형 백신 아주번트 및/또는 다양한 바이러스 항원의 조합의 추가 형성을 위한 중간 물질로서 사용될 수 있다. γ-PGA/MPLA 복합체 및 콜라겐을 혼합하여 제조된 체온-유도 스마트 PTG는 주입 부위에서 저장고로서 사용되어, 면역계의 자극을 지속하기 위해 면역자극 물질 및 항원의 느린 방출을 제공할 수 있다. 콜라겐은 삼중 헬릭스로 구성되어 있으며, 세 개의 사슬은 좌측 헬릭스로서 꼬여 있고, 주기적인 수소 결합에 의해 우세하게 안정화된 우측 삼중 헬릭스로 꼬여진다(도 1a). 이러한 삼중 헬릭스는 공유 교차 연결을 통해 피브릴(fibril)을 형성하기 위해 측면 및 세로로 연결되었다. 열 변성은 일반적으로 수소 결합을 깨트리고 삼중 헬릭스의 풀림을 유도한다. 도 4a는 25℃ 및 37℃에서 콜라겐의 CD(the circular dichroism) 데이터를 보인다(도 4a의 a 및 b). 콜라겐은 221 nm에서 회전 최대치(rotatory maximum)를 보이고 197 nm에서 최저치를 보이며, 대략 212 nm에서 일관된 영점 교차점(cross over point)(zero rotation)을 보이며, 이는 콜라겐의 삼중 헬릭스 구조에서 일반적인 것이다. 온도의 증가에 따라(도 4a: c-42℃ 및 d-60℃), CD 스펙트럼은 212　nm에서의 몰 타원율의 양성 최대치가 197　nm에서의 음성 최소치의 증가와 함께 감소함을 나타냈다. 증가된 온도에서의 CD 스펙트럼에서의 변화는 콜라겐 삼중 헬릭스 구조의 분해의 시작과 관련된 것이다. 반대로, 콜라겐이 음이온성 γ-PGA와 25℃에서 혼합되었을 때도, CD(mdeg) 스펙트럼의 강도는 급격하게 감소되고 레드-쉬프트(red-shifted)(205 nm에서 210 nm으로)되었으며, 이는 콜라겐의 삼중 헬릭스의 분해 및 γ-PGA와의 정전기적 인력을 통한 무작위-코일-배치로의 전환을 제시하는 것이다(도 4a의 삽도의 a'). 체온 또는 37℃에서, 197 nm에서 관찰된 대부분의 삼중 헬릭스 구조는 사라지고, 좀더 어수선한 형태가 형성되었으며(도 4a의 삽도의 b'), 이는 콜라겐의 삼중 헬릭스 구조의 붕괴 및 γ-PGA과의 뒤이은 정전기적 인력을 제시하는 것이다. 체온이, 실온에서 γ-PGA와의 정전기적 인력에 의해 유도되는 콜라겐 삼중 헬릭스의 풀림을 촉진하여, 물리적 겔화를 야기하는 것으로 추측된다. 종래의 온도-유도 하이드로겔 메카니즘에서, 더 낮은 완전 혼합 온도(critical solution temperature) 또는 더 높은 완전 혼합 온도를 보이는 온도-감응 중합체 물질은 교질입자 응집, 패킹, 소수성 연계, 및 결정화에서 사용되었다. γ-PGA가 실온(25℃)에서 콜라겐과 혼합되었을 때, 높은 점성의 투명한 콜라겐 용액이 급격히 변하여 낮은 점성의 탁한 용액으로 바뀌었다(도 5). 이러한 변화는 새로운 복합체 구조가 양이온성 콜라겐 및 음이온성 γ-PGA 사이의 정전기적 인력에 의해 생성됨을 제시한다. 그러나, γ-PGA/콜라겐 혼합물은 25℃에서 졸 상태를 유지하였다. 그에 반하여, 온도가 체온(37℃)까지 올라갔을 때, γ-PGA/콜라겐 혼합물의 점성이 급격히 증가되며, 이는 3-차원 겔 구조가 형성됨을 제시하는 것이다(도 4b 및 도 5). 주입가능한 열-감응 하이드로겔은 소정 비율의 백신 항원 및 면역자극 물질을 수송하여 요구되는 시간 및 특정 비율을 이룰 수 있도록 설계될 수 있으며, 이러한 특징은 치료 효과를 증가시키고 종래의 백신 제형의 단점을 해소하는데 이용될 수 있다. 본 실시예에서, 캡슐화된 OVA 단백질의 방출이 7 일까지 지속되었다(도 4c).
모델 항원 ( OVA )-특이 면역 반응
OVA-특이 체액성 면역 반응을 평가하기 위해, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하여 혈청 내의 항-OVA IgG 항체 역가를 측정하였다. 이의 결과는 OVA와 PTG를 함께 사용한 근육내 면역화가 OVA 단독 또는 OVA와 알룸을 사용했을 때보다 더 높은 항-OVA-IgG 항체 역가를 유도하였음을 입증하였다(도 6a). 전통적인 항원 투여량(100 μg)의 1/5(20 μg)만이 사용되었을 때에도, PTG 그룹은 알룸 또는 항원 단독일 때와 비교했을 때 상당히 더 높은 항체 수준을 나타냈다(도 6b). OVA-특이 세포성 면역 반응을 평가하기 위해, 마우스의 비장으로부터의 IFN-γ 분비 T 세포의 H-2Kb-제한 OVA257 -264 에피토프를 표적으로 하는 ELISPOT 검정을 실시하였다. 흥미롭게도, OVA와 PTG를 함꼐 사용한 마우스의 면역화는 OVA 펩티드로 재자극된 비장세포에서 더 많은 IFN-γ 스팟을 야기하였다. IFN-γ 분비 세포의 수는 OVA와 알룸을 함께 접종한 마우스에 비해 OVA와 PTG를 함께 접종한 마우스에서 8.2 배 더 많았다(도 6c). 실제로, IFN-γ 분비 세포는 OVA와 알룸을 함께 면역화한 마우스에서는 거의 발견되지 않았다(도 6c). OVA와 PTG를 함께 사용했을 때 OVA-특이 항체 생산 및 IFN-γ 생산 세포를 더 많이 유도하였으며, 이는 PTG 시스템이 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 다를 강력하게 유도하는 효과적인 아주번트로서의 기능을 할 수 있음을 나타내는 것이다.
바이러스 항원-특이 체액성 및 세포성 면역
인플루엔자 A 바이러스 항원, 또는 비활성화 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34(PR8, H1N1)의 존재 하에서의 PTG의 아주번트 기능을 시험하였다. PTG 존재 하에서 PR8(0.5 ㎍)을 이용한 근육내 면역화는 마우스의 혈청에서 PR8-특이 IgG 역가(PR8와 알룸을 함께 사용했을 때보다 8.5 배 더 높음)뿐만 아니라 PR8-특이 IgG-서브타입인 IgG1 및 IgG2c 항체 역가도 높은 수준으로 유도하였다(도 7a 및 도 7b). 이에 반해서, PR8-특이 IgG 및 IgG1 및 IgG2c의 수준은 PR8 항원만으로 면역화시킨 마우스에서는 매우 낮았다. 이 실험 결과는 PTG로의 인플루엔자 A/PR8 항원의 통합이 풍부하고 강한 PR8-특이 체액성 면역 반응을 유도하였음을 제시한다. PR8 항원과 PTG를 함께 사용한 마우스의 면역화는 또한 비활성화 PR8 바이러스로 재자극시킨 비장세포에서 더 많은 IFN-γ 스팟을 야기하였다. PR8 항원과 PTG을 함께 접종한 그룹에서의 IFN-γ 생산 세포의 수는 PR8 항원과 알룸을 함께 접종한 그룹에서의 수보다 7.3 배 더 많았다(도 7c). 증가된 반응이 헤모글로빈 저해(hemagglutination inhibition, HI) 역가에서도 관찰되었으며, 이는 적혈구 세포를 응집시키는 인플루엔자 HA의 능력을 차단하는 특이 항체에 기인하는 것이다 (도 7d). 이러한 실험 결과는 PR8와 PTG를 함께 사용했을 때 높은 수준의 기능성 항체 및 IFN-γ 생산 세포를 끌어낼 수 있음을 입증하였으며, 이는 PTG 시스템이 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 다를 유도하는 아주번트로서 기능을 할 수 있음을 제시하는 것이다.
치명적인 인플루엔자 바이러스에 대항하는 방어 면역
면역화된 마우스가 왕성한 체액성 및 세포성 면역 반응을 보임이 입증되었기 때문에, 치명적인 투여량의 인플루엔자 바이러스에 대항하는 방어 면역의 도입을 조사하였다. 50 배의 50% 치사량(50xLD50)으로 인플루엔자 A/PuertoRico/8/34 바이러스(H1N1)를 마우스에게 비강 투여한 후, PR8과 PTG로 함께 면역화시킨 마우스는 치명적인 PR8 바이러스 공격에 대해 100% 방어 면역을 나타낸 반면, PBS-접종된 마우스는 공격 후 7 일째에 100% 사망률을 보였다(도 7e 및 도 7f). 알룸과 PR8 바이러스로 면역화시킨 마우스는 14 일째에 87.5% 생존률을 보였으며 10% 이상의 체중이 감소되었다(도 7e). 50 배의 50% 치사량(50 x LD50)의 고감염성 조류 인플루엔자 바이러스(H5N1)에 대해서도 우수한 면역 반응을 보였다(도 7g 및 도 7h). PTG의 강한 아주번트-유사 기능은, 더 적은 면역원성 분할 바이러스 제제가 사용된 상황에서, 또는 바이러스에 대해 면역학적으로 경험이 없는 집단에 바이러스를 갖는 집단 예방 접종의 개념으로 "dose sparing"을 제공해야만 한다면 항체 반응을 증가시키는 데 사용될 수 있음을 제시한다.
본 실시예에서는 신규한 유형의 온도감응형 하이드로겔(PTG) 및 항원 저장고 및 면역자극 화합물과 결합하는 아주번트로서의 이의 유망한 적용을 제시한다. PTG 시스템의 겔화 메카니즘은 콜라겐 삼중 헬릭스의 풀림으로부터 야기된 물리적으로 교차결합된 중합체의 형성 후 음이온 전하의 γ-PGA와의 정전기적 인력에 기여할 수 있으며, 이는 종래의 하이드로겔 시스템에서는 관찰되지 않은 것이다. 주위 온도에서, γ-PGA/콜라겐 복합체는 자유-유동 졸로서 MPLA와 같은 약학적 제제와 쉽게 혼합될 수 있다. 그 후, 상기 복합체는 주입되어 생리학적 온도에서 비-유동 겔로 전환되어 지속적인 항원 및 면역자극 물질 수송 저장고를 생체 내에 제공한다. 인 시츄 겔-형성 하이드로겔은 국소 면역화 및 백신 수송을 위한 흥미로운 경로이다. 이러한 커뮤니케이션에서의 결과는 하기 이유들로 인해 의미가 있다. 첫째로, 다양한 유형의 에멀젼 및 미립자 시스템이 아주번트 물질로서 보고되어 왔지만, 대부분은 바이러스를 포함하는 많은 병원균에 대항하는 방어에서 매우 중요한 세포성 면역(Th1)을 거의 자극하지 않고 우수한 항체(Th2) 반응만을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이에 반하여, PTG는 체액성 및 세포성 면역 둘 다에서 아주번트 효과를 가짐이 본 실시예에서 입증되었다. 둘째로, PTG 아주번트 시스템에서 사용된 모든 성분 물질은 일반적으로 안전하다고 인정(generally recognized as safe, GRAS)된 것으로, 임상적 허용가능성을 증가시킨다. 셋째로, PTG의 강력한 아주번트 기능이 일반적으로 면역원성이 매우 크지는 않지만 효과적인 아주번트를 필요로 하는 재조합 단백질 항원과 결합될 수 있다. 종래의 임상 사용에서, PTG는 이중 주사기를 사용하여 현지 약물 투여 전에 백신 항원과 혼합하였다. 마지막으로, PTG 시스템은 소수성 MPLA의 증가된 가용성; 증가된 안정성(화학 교차결합을 위한 독성 개시제를 사용하지 않으며 광-조사를 하지 않음); 간단한 제형 형성; 및 통합된 바이러스 항원의 조절된 방출을 위한 주사 부위에서의 항원 저장고 형성과 같은 많은 이점들을 나타낸다. 상기한 바와 같은 이유로, PTG가 암 및 전염성 질환의 조절을 위한 면역 프라이밍의 백신 아주번트 전략으로서 유망한 후보자임이 제안될 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 음전하성 고분자 및 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist)의 복합체, 및 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 포함하는, 아주번트 조성물로서,
    상기 아주번트 조성물은 온도 변화에 따라 다단계 상전이 특성을 가지며,
    상기 다단계 상전이 특성에 의해 상기 아주번트 조성물이, 체온 미만의 온도에서 졸(sol) 상태로 존재하고, 체온에서 하이드로겔 상태로 상전이되며, 40℃ 초과의 온도에서 졸 상태로 상전이되는 것인,
    아주번트 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 음전하성 고분자는 카르복실기 또는 히드록시기를 함유하는 것인, 아주번트 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 음전하성 고분자는 폴리감마글루탐산, 히알루론산, 셀룰로오스, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 아주번트 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 MPLA(Monophosphoryl lipid A), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 플라젤린(flagellin), 시피지(CpG), 폴리아이시(poly(I:C), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 아주번트 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 콜라겐계 물질은 콜라겐 또는 정제 콜라겐 유도체인 것인, 아주번트 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질과 상기 음전하성 고분자가 분자간 비공유 결합에 의해 연결되어 있는 것인, 아주번트 조성물.
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 하이드로겔은, 상기 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질과 상기 음전하성 고분자가 분자간 비공유 가교결합에 의해 연결되어 3 차원 구조체를 형성한 것인, 아주번트 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질과 상기 음전하성 고분자의 중량비가 1 내지 100 : 0.1 내지 10으로 포함되는 것인, 아주번트 조성물.
  12. 제 1 항, 제 4 항 내지 제 8 항, 제 10 항, 및 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 아주번트 조성물; 및 항원을 포함하는,
    백신 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 항원은 단백질, 세포, 바이러스, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 백신 조성물.
  14. 음전하성 고분자와 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist)를 혼합하여 복합체를 형성하고, 및
    상기 복합체에 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 혼합하는 것
    을 포함하는, 아주번트 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 아주번트 조성물은 온도 변화에 따라 다단계 상전이 특성을 가지며,
    상기 다단계 상전이 특성에 의해 상기 아주번트 조성물이, 체온 미만의 온도에서 졸(sol) 상태로 존재하고, 체온에서 하이드로겔 상태로 상전이되며, 40℃ 초과의 온도에서 졸 상태로 상전이되는 것인,
    아주번트 조성물의 제조 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 음전하성 고분자는 카르복실기 또는 히드록시기를 함유하는 것인, 아주번트 조성물의 제조 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 음전하성 고분자는 폴리감마글루탐산, 히알루론산, 셀룰로오스, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 아주번트 조성물의 제조 방법.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 MPLA(Monophosphoryl lipid A), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 플라젤린(flagellin), 시피지(CpG), 폴리아이시[poly(I:C)], 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 아주번트 조성물의 제조 방법.
  18. 제 14 항에 있어서,
    상기 콜라겐계 물질은 콜라겐 또는 정제 콜라겐 유도체인 것인, 아주번트 조성물의 제조 방법.
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