KR100873179B1

KR100873179B1 - 폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스의 감염 억제용조성물

Info

Publication number: KR100873179B1
Application number: KR1020070093093A
Authority: KR
Inventors: 성문희; 김철중; 부하령; 최영기; 이일한; 유대원
Original assignee: 주식회사 바이오리더스; 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-09-13
Filing date: 2007-09-13
Publication date: 2008-12-10

Abstract

본 발명은 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스 감염의 억제 또는 예방용 약학조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 인플루엔자 바이러스와 같이 호흡기 및 전신감염을 유도하는 바이러스에 대한 감염 억제 효능을 가지는 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 함유하여, 바이러스의 감염을 억제하고, 바이러스성 질병을 예방할 수 있는 약학 조성물, 건강기능식품 및 사료첨가제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인플루엔자 바이러스 및 다양한 바이러스성 질병의 예방을 위한 동물용 사료첨가제나 약품으로 사용가능할 뿐만 아니라, 인체용 약학 조성물 및 건강기능식품으로 사용할 수 있는 효과가 있다.

폴리감마글루탐산, 바이러스 감염, 인플루엔자

Description

폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스의 감염 억제용 조성물{Composition for Preventing Virus Infection Comprising Poly-gamma-glutamic Acid}

본 발명은 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스 감염의 억제 또는 예방용 약학조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 인플루엔자 바이러스와 같이 호흡기 및 전신감염을 유도하는 바이러스에 대한 감염 억제 효능을 가지는 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 함유하여, 바이러스의 감염을 억제하고, 바이러스성 질병을 예방할 수 있는 약학 조성물, 건강기능식품 또는 사료첨가제에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스 (Orthomyxoviridae)에 속하며 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS의 여덟 개의 RNA 단편을 갖고 있는 바이러스이다. 기본적으로 지질 이중층 구조를 갖는 바이러스 외피(envelop) 및 외부 당단백질에 의해 둘러싸인 내부 뉴클레오캡시드 또는 핵단백질과 결합된 리보핵산(RNA)으로 구성된다. 바이러스 외피의 내부 층은 주로 매트릭스 단백질로 구성되고 외부 층은 대부분 숙주에서 유래된 지질 물질로 구성된다. 이 중 외피 단백질을 이루고 있는 두개의 단백질 헤마글루티닌(hemagglutinin: 이하 "HA" 이라함)과 뉴라미니다아제(neuraminidase: 이하 "NA" 이라함)는 면역항체를 유도하는데 중요한 면역원이며, 이들은 항원의 대/소변이(antigenic shift and drift) 과정을 통해 변형되는 특징을 갖고 있다. 이런 독감 바이러스의 변화는 동일 아종내의 다른 독감 바이러스에 대하여 형성된 면역도 회피할 수 있게 할 수 있으며, 일반적으로 독감 바이러스에 의해 유도된 면역은 단기간에 소실되기 때문에 매 시즌에 유행이 예측되는 바이러스에 대하여 새로이 면역을 유도해야 한다. 인플루엔자는 A, B, C의 세 그룹으로 분류된다.

인플루엔자는 독감을 유발하는데 이는 급성의 호흡기 질병 (acute respiratory disease)으로 1~5일의 잠복기를 거친 후, 증세가 나타난다. 감염된 사람의 경우 대부분은 증세가 없으며, 주로 열이 나고 오한, 통증, 식욕부진 등의 증세를 유도한다. 일부에서 바이러스성 폐렴, 세균성 폐렴 등이 유발되며, 사망까지 이르게 할 수 있다. 지난 250년 동안 적어도 십여 번의 주요 독감 유행(major influenza pandemic)이 있었으며, 매 2~3년마다 type A 바이러스에 의한 독감이 유행하고 있다. 독감은 호흡기로 전염되므로 그 전염성이 매우 높고 불현성 감염율이 높아서 한꺼번에 많은 사람들에 감염된다. 주로 5~9세의 어린이와 55살 이상의 노인에게 자주 발생하며, 가을에서 봄 사이에 잘 발생한다. 독감은 전염을 조절하기가 매우 어려우며, 불현성 감염이 많기 때문에 환자를 격리할 필요가 없다. 독감 백신은 여러 가지 형을 혼합한 불활성화 백신으로 어느 정도의 부작용이 있으며, 3~6개월밖에 지속되지 않으므로 어린이와 노약자와 같은 위험성이 높은 사람에게 접종한다.

폴리감마글루탐산(γ-PGA)은 미생물에 의해 생산되는 점액성 물질이다. 폴리감마글루탐산(PGA)은 볏짚을 이용한 한국의 전통 콩 발효식품인 청국장, 일본의 전통 콩 발효식품인 낫또, 네팔의 전통 콩 발효식품인 키네마 등에서 분리된 바실러스 속 균주로부터 생산된다. 바실러스 속 균주로부터 생산되는 폴리감마글루탐산(γ-PGA)은 식용, 수용성, 음이온성 및 생분해성 고분자물질로 흡습제, 보습제 및 화장품의 원료물질로 이용이 가능하다. 최근, 폴리감마글루탐산(γ-PGA)을 이용한 난분해성 중합체의 대체상품 소재, 에스테르화 반응에 의한 내열성 플라스틱의 개발과 수용성 섬유 및 막생산 등에 관한 연구가 선진국을 중심으로 활발히 진행되고 있다.

본 발명자들은 고분자량의 폴리감마글루탐산(PGA)을 생산하는 내염성 균주 바실러스 서브틸리스 청국장 균주를 사용하여 폴리감마글루탐산(PGA)을 생산하는 방법에 관한 특허(대한민국 등록특허 제500,796호)를 획득하였으며, 그 외에 폴리감마글루탐산(PGA)을 함유하는 항암조성물, 면역보강제 및 면역증강제에 대한 특허(대한민국 등록특허 제496,606호, 대한민국 등록특허 제517,114호, 대한민국 등록특허 제475,406호)를 획득한 바 있다.

이에, 본 발명자들은 인체에 대한 부작용이나 해가 없으면서, 인플루엔자와 같이 호흡기 또는 전신감염을 유발하는 바이러스에 대한 감염 억제 효능을 가지는 사료첨가제, 건강기능식품 및 약학조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 폴리감 마글루탐산을 투여한 가축에 바이러스를 감염시킨 결과, 바이러스 감염을 억제할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인플루엔자 바이러스와 같이 호흡기 및 전신감염을 유발하는 바이러스에 대한 감염 억제 효능을 가지는 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 함유하여, 바이러스의 감염을 억제하고 이를 통해 질병을 예방할 수 있는 약학 조성물, 건강기능식품 및 사료첨가제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스 감염 억제 또는 질병 예방용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스의 감염 억제 또는 예방용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 또한, 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스의 감염 억제 또는 예방용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명에 따른 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인플루엔자 바이러스 및 다양한 바이러스성 질병의 예방을 위한 동물용 사료첨가제나 약 품으로 사용가능할 뿐만 아니라, 인체용 약학 조성물 및 건강기능식품으로 사용할 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 일 관점에서 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스 감염의 억제 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 바이러스에 대한 감염의 억제 또는 예방 효과를 가지는 상기 폴리감마글루탐산은 분자량 10kDa~15,000kDa의 폴리감마글루탐산을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 3000kDa~15,000kDa의 고분자량 폴리감마글루탐산을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 호흡기 감염 또는 전신 감염을 유발할 수 있는 바이러스일 수 있고, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바이러스 감염억제 및 질병 예방용 조성물은 상기 인플루엔자 바이러스에 의한 팬더믹 인플루엔자, 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 또는 페렴에 대한 예방용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 바이러스 감염 예방용 약학조성물 100중량부에 대하여 0.2~2 중량부의 폴리감마글루탐산을 함유하는 것이 바람직하며, 폴리감마글루탐산이 0.2 중량부 이하로 함유될 경우, 바이러스 감염억제효과를 기대할 수 없으며, 2 중량부 이상으로 함유될 경우, 함량증가에 따른 감염억제 효과의 증가를 기대할 수 없을 뿐 만 아니라 고비용을 초래하여, 경제적이지 못하다.

상기 폴리감마글루탐산을 0.1~2.0 중량부 함유하는 조성물은 에탄올이 함유된 액상제형으로 제조할 경우, 인간을 포함하는 동물의 개체별 살포 또는 대규모 집단 방역에 사용될 수 있는 분산형 제형이 가능하다. 상기 분산형 제형에 사용되는 에탄올의 함량은 50% 이상일 경우, 폴리감마글루탐산이 침전될 수 있으며, 1 % 이하일 경우, 점도가 증가하여 분산이 가능하지 않을 수 있어, 1~50%로 첨가되는 것이 바람직하다.

본 발명은 다른 관점에서, 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스 감염 예방용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 건강기능 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태가 가능하며, 향미제, 천연 탄수화물, 비타민, 광물, 미네랄, 풍미제, 착색제, 중진제, 안정제, 방부제 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 바이러스 감염 예방용 사료첨가제에 관한 것이다.

본 발명에 의한 사료첨가제는 가축의 바이러스에 의한 감염성 질환을 효과적으로 예방할 수 있으며, 본 발명의 사료첨가제는 가축은 소, 돼지, 토끼, 말, 염소, 개, 고양이, 사슴 등의 포유동물과 닭, 오리, 칠면조, 메추리 등의 가금류에 급여될 수 있다.

본 발명의 사료첨가제 100중량부에 대하여 0.2~2.0 중량부의 폴리감마글루탐산을 함유하는 것이 바람직하며, 폴리감마글루탐산이 0.2 중량부 이하로 함유될 경 우, 바이러스 예방효과를 기대할 수 없으며, 2.0 중량부 이상으로 함유될 경우, 함량증가에 따른 감염억제 효과의 증가를 기대할 수 없을 뿐만 아니라 고비용을 초래하여, 경제적이지 못하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 초거대 폴리감마글루탐산의 제조 및 분자량 측정

폴리감마글루탐산 생산용 기본배지(5%의 L-글루탐산이 첨가된 GS배지; Glucose 5%, (NH₄)₂SO₄ 1%, KH₂PO₄ 0.27%, Na₂HPO₄·12H₂O 0.42%, NaCl 0.05%, MgSO₄·7H₂O 0.3%, pH 6.8)가 3 L 들어있는 5 L 크기의 발효기에, 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilis var chungkookjang, KCTC 0697BP)균주의 배양액을 1% 접종하여 교반속도는 150rpm, 공기주입속도는 1vvm으로 하여 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 배양액을 필터프레스를 사용하여 균체를 제거하여 폴리감마글루탐산 함유 시료액을 수득하였다.

상기 시료액에 2N 황산용액을 첨가 후 10℃에서 12시간 동안 정치시켜 폴리 감마글루탐산 침전물을 수득하였다. 이것을 충분한 양의 증류수로 세척한 후, 누체여과기를 이용하여 폴리감마글루탐산을 수득하였다. 상기 수득한 폴리감마글루탐산을 GPC(Gel Permeation Column)를 이용하여 분자량을 측정한 결과, 1~15,000 kDa의 폴리감마글루탐산이 생성된 것을 확인하였고, 분자량별로 분리하여, 7,000kDa의 평균분자량을 가지는 폴리감마글루탐산을 이용하여 다음 실시예에 사용하였다.

실시예 2: 폴리감마글루탐산의 경구투여 독성

폴리감마글루탐산의 경구투여시 안전성을 확인하기 위하여 GLP (Good Laboratory Practice) 인증을 받은 안전성평가 연구기관인 (주)바이오톡스텍에 폴리감마글루탐산의 랫드를 이용한 단회 경구투여 독성시험을 의뢰하였다. 시험은 Good Laboratory Practice(GLP) 규정 및 시험기준과 (주)바이오톡스텍의 표준작업수순서(SOPs)를 준수하여 수행되었다.

랫드는 6 주령, 수컷 10 마리 (159.76~177.27g)와 암컷 10 마리 (121.60~138.80g)를 사용하였으며, 개체별 폴리감마글루탐산의 투여액량은 절식 후 투여당일의 체중을 기준으로 산출하였다. 모든 랫드는 투여 전에 음수는 자유섭취 시키면서 약 16시간 동안 절식시킨 후, 경구투여용 존데를 부착한 일회용 주사기(5ml)를 이용하여 위내에 단회 강제 경구투여하였고, 투여 후 약 4 시간 후에 사료를 급여하였다.

예비시험으로 100mg/ml농도의 폴리감마글루탐산을 20ml/kg의 투여용량으로 랫드 암·수 각 2 마리에 단회 경구투여한 결과, 사망 예가 관찰되지 않아, 2000mg/20ml/kg의 단일용량을 설정하였다. 대조군에는 시험물질 투여군과 동일한 액량의 부형제를 투여하였다. 투여액량은 20ml/kg 으로 하였다.

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 관찰기간동안 폴리감마글루탐산 경구투여에 기인한 사망 예 및 일반증상은 관찰되지 않았다. 관찰기간 동안, 랫드의 체중은 암·수 대조군 및 시험물질 투여군에서 순조로운 증가가 관찰되었다. 부검결과 암·수 대조군과 시험물질 투여군에서 육안적인 이상소견은 관찰되지 않았다. 이상으로 폴리감마글루탐산을 랫드에 단회 경구투여한 결과, 시험물질에 의한 일반증상 및 사망 예가 관찰되지 않아, 폴리감마글루탐산의 치사량은 암·수 각 2000mg/kg 이상인 것으로 판단되었다.

실시예 3: 폴리감마글루탐산에 의한 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 증강 효과

본 실시예에서는 폴리감마글루탐산의 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적 감염억제 효과를 조사하기 위하여, 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 실험동물의 폐사와 바이러스의 증식 및 항체 생산을 확인하였다.

(1) 바이러스의 준비

병원체로 사용된 인플루엔자 바이러스는 충북대학교 의과대학 미생물학 실험실 최영기 교수로부터 분양받은, mouse에서 고병원성을 나타내는 H1N1 인플루엔자 바이러스주 (A/Puerto Rico/8/34(H1N1))를 Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell에서 증폭한 뒤 실험에 사용하였으며, 실험동물로는 6주령의 암컷 Balb/C 마우스를 사용하였다.

분양된 바이러스의 순수 분리는 다음과 같이 실시하였다.

일차적으로 분리된 바이러스를 항생제가 들어있는 PBS에 희석해서 10일령 된 백색 산란계의 유정란에 접종한 뒤 37℃에서 48시간 정치 배양한 뒤 유정란의 요수를 취하여 증폭된 바이러스를 사용하였다.

두 번째로 6 well 세포배양 플레이트에서 페니실린과 스트렙토마이신과 5% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 포함된 alpha-MEM(minimun essential medium, Gibco, USA) 배지에서 자란 MDCK cell을 PBS로 3번 세척을 해주고 페니실린과 스트렙토마이신(이하 P/S)은 포함하고 FBS가 들어 있지 않은 배지로 희석해서 각 well에 바이러스를 희석한 후 감염시킨 후, 5% 이산화탄소가 충진된 37℃ 세포 배양기에서 1시간 배양하였다. FBS가 들어 있지 않은 0.1% TPCK(N-alpha-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone) treated-trypsin EDTA와 P/S가 포함된 alpha-MEM 배지를 각 well에 넣어주고 세포 배양기에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포 배양 플레이트를 PBS로 세척해주고 배지를 포함하고 있는 0.1% noble agar를 사용하여 고정하였다.

배양된 플라크를 미리 준비된 MDCK cell이 배양된 24 well 플레이트에 각 well 당 1개의 플라크를 접종하고 FBS가 들어 있지 않은 0.1% TPCK treated-trypsin EDTA와 P/S가 포함된 alpha-MEM 배지를 각 well에 넣어주고 세포 배양기에서 배양하였다. 48시간 뒤 각 well의 배지를 취하여 원심분리해서 상층액을 상기와 동일한 방법으로 준비된 MDCK cell 플라스크에 감염시킨 후 48시간에서 36시간 배양해서 얻어진 배양액을 원심분리하여 상층액을 마이크로 튜브에 옮겨서 -80℃ 저온 냉동고에 동물 실험 전까지 보관하였다.

(2) 동물실험

우선 대조군 (실험군 3)으로는 인플루엔자 바이러스를 단독으로 비강 투여한 마우스를 사용하였고, 실험군 1은 폴리감마글루탐산 (γ-PGA)의 투여한 후, 다음날 인플루엔자 바이러스를 투여 바이러스에 대한 면역을 증가시켜 감염을 억제하였다. 실험군 1의 마우스는 디에틸에테르를 사용하여 30초간 마취한 후, 최종 농도 0.5%의 폴리감마글루탐산 (7,000 kDa) 30μl를 각 마우스의 비강에 투여했다. 다음날 동일한 양의 폴리감마글루탐산과 함께 인플루엔자 바이러스를 동시에 투여하였다.

실험군 2는 실험군 1의 바이러스 감염한 날에 폴리감마글루탐산과 함께 인플루엔자 바이러스를 동시에 투여한 마우스를 실험군으로 사용하였다. 실험군의 편성은 표 2에 나타내었다.

실험군의 편성

실험군 (Group)	투여일 (γ-PGA 또는 바이러스)		개체 수 (head)
실험군 (Group)	1일 전	0일 (D-day)	개체 수 (head)
1	γ-PGA	γ-PGA + A부피 바이러스	5
1	γ-PGA	γ-PGA + B부피 바이러스	5
2	-	γ-PGA + A부피 바이러스	5
2	-	γ-PGA + B부피 바이러스	5
대조군	-	A부피 바이러스	5
대조군	-	B부피 바이러스	5

A 부피 바이러스 : 2.5 X 10⁵ EID₅₀, B 부피 바이러스 : 1.25 X 10⁵ EID₅₀

바이러스의 감염은 실험동물에 디에틸에테르를 사용해서 30초간 마취한 후, 바이러스 30μl를 각 마우스에 비강을 통해 투여하였으며, A 부피 투여 그룹은 2.5 X 10⁵ EID₅₀ 바이러스를 투여하였으며, B 부피 투여그룹은 1.25 X 10⁵ EID₅₀를 투여하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 대조군 (실험군 3)은 바이러스 투여 후 7일째 전량이 폐사하였다. 폴리감마글루탐산과 동시에 투여한 실험군에서는 실험군 1의 A부피를 투여한 그룹에서 12일째 2마리가 폐사하였다. 폴리감마글루탐산을 하루 전에 투여한 실험군 1에서는 바이러스 투여 후 2주 이상 생존하였다. 이는 폴리감마글루탐산을 미리 투여하는 것이, 면역력을 유도하여 바이러스 감염을 억제하고, 동시에 투여하여도 개체가 생존하는데 도움을 주는 것을 나타낸다.

바이러스를 비강 투여한 후, 일주일 뒤에 3일 간격(바이러스 투여 후 7일째, 10일째 및 13일째)으로 그룹당 마우스를 한 마리씩 안락사시켜 폐 조직과 혈청을 채취하였다.

각 실험군별 일짜에 따른 마우스 폐 조직에서의 인플루엔자 바이러스의 역가(titer)는 하기의 HA(Haemagglutination Aggregation) 테스트법으로 측정하였다.

폐사한 마우스를 포함하여, 해당 날짜의 마우스를 디에틸에테르를 사용해서 30초간 마취를 하고, 흉강을 절제하여, 폐 조직을 수득하여 액체 질소를 이용하여 급속 동결시키고, 역가 측정 전까지 -80℃에서 보관하였다. 항생제가 들어있는 PBS(500μl)에 채취된 폐조직을 담가서 고압 습윤 증기 소독된 작은 금속 구슬과 함께 조직 분쇄기에 넣고 3분간 분쇄하였다. 조직 분쇄물은 원심분리하여, 상층액을 수득하고, 10진 희석하여 각 희석액을 백색 산란계의 10일 된 유정란에 접종하였다.

접종한 유정란을 37℃에서 48시간 배양 후 요수를 얻었다. 얻어진 요수를 96 well의 둥근 바닥 플레이트 첫 well에 50 μl 넣고 각 각 다음 well로 동일 부피의 PBS로 2진 희석하고, 마지막 well의 희석 후 50μl는 버렸다. 마지막으로 0.5% 닭의 적혈구를 포함하고 있는 PBS를 well에 50μl씩 넣어주고 실온에서 40분간 반응시켰다.

각 역가는 10진 희석된 접종액 200μl안에서 계산된 값으로 log₁₀N = 10^N 에서 N값들을 표기하였다.

마우스 폐 조직에서의 인플루엔자 바이러스의 역가(titer)

실험군 (Group)	바이러스 부피	감염 후 경과일 수에 측정된 역가
실험군 (Group)	바이러스 부피	7일	10일	13일
1	A	5	-	-
1	B	5	3	1
2	A	3	-	-
2	B	3	4	3
3	A	5.3	x	x
3	B	5	x	x

역가는 희석된 200 μl 안에서 계산된 값으로 log10N = 10N에서 N값으로 표기

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 바이러스 투여 7일 후, 대조군인 실험군 3의 A 부피의 바이러스를 투여한 군은 역가 5.3, B 부피의 바이러스를 투여한 군은 역가 5를 나타내었고, 전량 폐사를 하였기 때문에 증가나 감소 추세를 볼 수 없다. 실험군 1의 B부피 바이러스를 투여한 군에서는 시간이 지날수록 점점 역가가 감소되는 경향을 보였다. 그러나 실험군 2는 미약한 감소추세를 보였다. 이것으로 폴리감마글루탐산을 투여하는 것이 개체가 고병원성의 바이러스를 극복하는데 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 감소추세는 폴리감마글루탐산으로 먼저 면역 자극을 가한 그룹의 감소추세가 더 큰 것으로 보아 폴리감마글루탐산의 면역 자극이 바이러스에 저항하는 효과를 일으키는 것으로 보인다.

각 그룹별 일짜에 따른 마우스 혈청에서의 항체 역가 측정은 하기의 HI (Haemagglutination Inhibition) 테스트법으로 측정하였다.

모든 혈청은 Vibrio cholerae에서 추출한 RDE(receptor-destroying enzyme) 을 혈청 샘플 부피 대비 1:3으로 처리한 뒤(예를 들면, 혈청 10μl에 RDE 30μl 첨가), 37℃ 배양기에서 18~20시간 배양하였다. 혈청 내 비특이적인 수용체들의 활성을 제거한 샘플을 96 well 둥근 바닥 플레이트에서 25μl씩 순차적 2진 희석하였다. 두 번째로 혈청 샘플에 동일 부피의 4HAU 바이러스를 넣고, 37℃ 배양기에서 30분간 반응시키고, 마지막으로 0.5% 닭 적혈구가 포함된 PBS를 50μl씩 넣어준 뒤 실온에서 40분간 반응시켰다.

마우스 혈청에서의 항체 역가(titer)

실험군 (Group)	바이러스 부피	감염 후 경과일 수에 측정된 역가
실험군 (Group)	바이러스 부피	7일	10일	13일	15일
1	A	0	0	0	5
1	B	0	0	0	3
2	A	0	0	5	6
2	B	0	0	2	3
3	A	0	0	0	0
3	B	0	0	0	0

역가는 희석된 50μl 안에서 계산된 값으로 log₁₀N = 10^N에서 N값으로 표기

그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 폴리감마글루탐산과 동시에 바이러스를 투여한 실험군에서 바이러스에 대한 항체 역가가 증가하였다. 실험군 2는 13일째 항체가 나타나기 시작했고, 15일까지 증가하는 것으로 나타났다. 실험군 1은 15일째 바이러스에 대한 항체가 나타나기 시작했다. 대조군은 7일에 전량이 폐사를 하였기 때문에 7일 표본만 측정하였다. 그러나 바이러스에 대한 항체는 나타나지 않았다. 바이러스 투여하기 전날 폴리감마글루탐산으로 면역 자극을 한 그룹에서는 항체 생성이 늦기는 했지만 폴리감마글루탐산과 바이러스를 동시 투여만 한 그룹에서보다 강한 항체 생성을 보였다.

이 결과로부터, 본 발명에 의한 폴리감마글루탐산이 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 증강 효과를 나타내어, 감염을 억제한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 폴리감마글루탐산에 의한 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 증강 효과

본 실시예에서는 폴리감마글루탐산이 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적 감염억제 효과를 나타내는지 조사하기 위하여 실험동물에서의 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 폐사와 바이러스의 증식 및 항체 생산을 확인하였다.

병원체로 사용된 인플루엔자 바이러스는 충북대학교 미생물학 실험실 최영기 교수로부터 분양받은, mouse에서 고병원성을 나타내는 H1N1 인플루엔자 바이러스주 (A/Puerto Rico/8/34(H1N1))를 Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell에서 증폭한 뒤 실험에 사용하였으며, 실험동물로는 6주령의 암컷 Balb/C 마우스를 사용하였다.

동물실험은 다음과 같이 수행하였다.

대조군(실험군 1)은 인플루엔자 바이러스를 단독으로 투여하였고, 실험군 2는 2회에 걸쳐 폴리감마글루탐산을 투여한 후, 인플루엔자 바이러스 투여한 군이며, 실험군 3은 폴리감마글루탐산과 인플루엔자 바이러스를 동시에 투여하였다.

인플루엔자 바이러스와 폴리감마글루탐산은 실험 마우스의 비강을 통하여 투여하였으며, 디에틸에테르로 30초간 마취한 후 투여하였으며, 폴리감마글루탐산의 경우, 해당 부피의 최종 농도 0.5% y-PGA (7, 000 kDa)을 30μl를 각 마우스에 비강을 통해 투여하였으며, 바이러스는 10⁴ EID₅₀(30μl)를 투여하였다.

실험군 3은 실험군 2의 바이러스 감염한 날에 폴리감마글루탐산과 함께 인플루엔자 바이러스를 동시에 투여한 마우스를 실험군으로 사용하였다.

폐사율을 측정하기 위한 마우스를 각 군당 6마리, 일자별 바이러스 변화량을 측정하기 위한 마우스 18마리, 대조군은 15마리를 실험에 사용하였으며, 병원성 관찰 지표로 체중 변화율을 측정하기 위해서 일자별 그리고 그룹별 체중 변화를 모니터링하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군(실험군1)에서 바이러스 투여하고 일주일이 경과한 후, 1마리가 폐사하기 시작해서 9일째 3마리, 12일에는 심하게 병원성을 나타내는 마우스 2마리가 남았다. 나머지 실험군은 12일 약한 발병 증세만 나타내고 12일 이상 생존했다.

바이러스를 비강 투여한 후, 일주일 뒤에 2일 간격(바이러스 투여 후 1일, 3일, 5일, 7일, 9일, 12일)으로 실험군 당 두 마리씩 안락사해서 각 마우스의 폐 조직과 혈청을 채취하였다.

각 실험군별 일짜에 따른 마우스 폐 조직에서의 인플루엔자 바이러스의 역가(titer)는 실시예 2와 동일한 HA(Haemagglutination Aggregation) 테스트법으로 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 각 역가는 10진 희석된 접종액 200 μl안에서 계산된 값으로 log₁₀N = 10^N 에서 N값들을 표기하였다. 바이러스의 역가는 실험군 1과 실험군 2에서 바이러스 투여 후 5일째 최고값인 5.5를 나타내었다.

바이러스 투여 전 폴리감마글루탐산으로 면역을 자극한 실험군 2는 바이러스 투여 후 첫날에서 비교적 낮은 바이러스 역가를 보였고, 5일째까지 증가하다가 5일 이후 감소추세로 돌아섰고 7일 이후에는 급격히 감소했고 12일째 바이러스가 더 이상 발견되지 않았다. 바이러스 투여일에 폴리감마글루탐산과 동시에 투여한 실험군 3은 바이러스 투여 후 5일째 대조군과 같은 역가를 나타냈지만, 5일 이후 감소추세로 돌아섰고, 실험군 2와 같이 바이러스 투여 후 7일째 급격히 감소하였고 12일째 바이러스가 더 이상 발견되지 않았다. 이는 투여한 폴리감마글루탐산이 개체가 바이러스에 저항하는데 도움을 주고 있음을 의미하고 더욱이 개체가 증가된 면역력으로 바이러스를 제거하는데 도움을 주고 있다.

병원성 관찰 지표로 체중 변화율을 측정하기 위해서 일자 별 그리고 그룹별 체중 변화를 모니터링 하였다(도 4). 각 값들은 바이러스 투여 전 체중 대비 감소율을 퍼센트 값으로 표기하였다.

대조군(실험군1) 바이러스 투여 후, 5일 이후 체중감소가 급격히 증가하기 시작해서 7일 이후엔 치사율 20%를 넘기는 것으로 나타났다. 다른 두 그룹은 바이러스 투여 후 7일째까지 체중 감소를 보이더니 7일 이후엔 체중이 증가 추세로 돌아서면서 회복을 하였다. 이는 바이러스 투여 후 폐사 진행 상태와 폐 조직에서의 바이러스 역가에 비추어볼 때 상관관계가 있음을 알 수 있다.

실시예 5: 폴리감마글루탐산(γ-PGA)에 의한 대식세포에서의 IFN-β의 분비 유도

본 발명의 γ-PGA의 면역계의 일차적인 면역반응, 바이러스 억제활성에 주요한 역할을 하는 대식세포(macrophage)의 활성화에 미치는 영향을 확인하였다.

대식세포의 활성화에 대한 지표로서 대식세포가 분비하는 주요한 사이토카인으로, innate immunity의 반응을 매개하는 인터페론 베타(IFN-β)의 분비를 검사하였다.

이를 위해 Balb/c 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7(ATCC TIB-71)를 DMEM(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신, 10% FBS 첨가) 배지에 부유시킨 후, 6 well 플레이트에 5x10⁵cell/well로 분주하여 12시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한 다음 γ-PGA(7,000kDa)을 각각 0.1%, 0.5% 농도로 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 희석하여 12시간동안 배양하였다.

자극을 위한 배양이 진행되는 동안 3, 6, 12, 24시간 간격으로, 각 well의 배양 상등액을 수거하였고, 수거한 상등액의 부피만큼 배양액을 보충하였다. 수거된 배양 상등액에 존재하는 IFN-β의 분비량을 ELISA 키트(BD Bioscience, USA)를 이용하여 측정하였다.

IFN-β의 항마우스 단클론항체로 코팅된 96웰 플레이트에 IFN-β 표준용액 100μl와 배양상등액 100μl를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 세척완충액(250μl/well)으로 3회 세척한 다음, 제1차 항체인 biotinylated 항마우스 IFN-β 각각의 다클론 항체 100μl을 첨가하여 1시간동안 상온에서 반응시킨 후, 세척 완충액(250μl/well)으로 3회 세척하였다. 이후에 제2차 항체인 아비딘-호오스래디쉬-퍼옥시다아제 컨쥬게이트(avidin-horseradish peroxidase conjugate)를 100μl 넣어 상온에서 1시간동안 반응시키고 3회 세척한 후, TMB 발색용액으로 15분 동안 반응시킨 다음 50μl의 고정 용액(stop solution)으로 발색을 고정시켰다. 그리고 450nm에서 ELISA 리더로 측정하여 IFN-β 각각의 양을 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, γ-PGA와 함께 배양된 대식세포가 6시간 이후부터 인터페론 베타의 분비를 시작해서 시간이 증가함에 따라 분비량이 증가되는 것을 알 수 있으며, γ-PGA의 농도가 증가함에 따라 인터페론 베타의 분비량도 증가하는 것으로 보아 γ-PGA 농도 의존적인 반응을 하는 것을 알 수 있었다.

γ-PGA가 대식세포 자극제로서 우수한 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었으며, 대식세포 활성화에 있어서 농도에 의존하는 경향을 보였다.

이로부터 본 발명에 따른 γ-PGA가, 면역반응 및 바이러스 성장억제에 주요한 역할을 하는 대식세포의 활성화 지표로서 대식세포가 분비하는 IFN-β의 분비를 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

도 1은 바이러스를 감염시킨 마우스의 감염 경과일 수에 따른 생존 개체수 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 바이러스를 감염시킨 마우스의 감염 경과일 수에 따른 사망 개체수 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 바이러스를 감염시킨 마우스의 폐 조직에서의 바이러스 역가 변화를 감염 경과일 수에 따라 나타낸 그래프이다.

도 4는 바이러스를 감염시킨 마우스의 감염 경과일 수에 따른 체중 감소율을 나타낸 그래프이다.

도 5는 폴리감마글루탐산 처리에 의한 대식세포에서의 IFN-β 증가를 확인한 그래프이다.

Claims

분자량이 3,000kDa~15,000kDa인 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는, 인플루엔자 감염 억제 또는 예방용 약학조성물.
제1항에 있어서, 상기 인플루엔자는 조류 인플루엔자임을 특징으로 하는 약학조성물.
제1항에 있어서, 상기 분자량이 3,000kDa~15,000kDa인 폴리감마글루탐산은 IFN-β 분비를 유도하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
제1항에 있어서, 폴리감마글루탐산이 에탄올에 희석된 형태의 분산형 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
분자량이 3,000kDa~15,000kDa인 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 인플루엔자 감염 억제 또는 예방용 건강기능식품.
제5항에 있어서, 상기 인플루엔자는 조류 인플루엔자임을 특징으로 하는 건

강기능식품.
분자량이 3,000kDa~15,000kDa인 유효량의 폴리감마글루탐산을 함유하는 인플루엔자 감염 억제 또는 예방용 사료첨가제.
제7항에 있어서, 상기 인플루엔자는 조류 인플루엔자임을 특징으로 하는 사료첨가제.