CN103189063B - 治疗组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

根据本发明的实施方案，提供了PAD4抑制组合物以及其用于治疗癌症和自身免疫疾病的方法。

Description

治疗组合物和方法
相关申请的引用
本申请要求2010年11月1日提交的美国临时专利申请编号61/408,792的优先权，该临时申请的全部内容以引用方式纳入本文。
政府资助
该发明获得了美国国立卫生研究所授予的基金编号R01CA136856的政府支持。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
该发明涉及用于抑制肽酰基精氨酸脱亚胺酶（peptidylarginine deiminase4，PAD4）的组合物及方法。具体的方面涉及PAD4抑制剂以及用于治疗癌症和自身免疫疾病的方法。
背景技术
PAD4为以翻译后的方式将肽酰基精氨酸转化为瓜氨酸的酶。PAD4的过表达已被与癌症和自身免疫疾病（例如类风湿性关节炎）联系起来，并且涉及这些疾病的发病机理。仍然需要PAD4抑制剂及其用于治疗癌症和自身免疫疾病的方法。
发明内容
本发明提供了组合物，所述组合物包含具有以下结构式的化合物，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：
其中n为1或2；X为卤素；每个Y独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基。
根据本发明，提供了组合物，其包括具有由本文中以下编号标明的结构式的化合物，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br。
根据本发明，提供了组合物，其包括具有以下结构式的化合物，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I），其中n为1或2，X为卤素，每个Y独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基，R1为脂肪族取代基或芳香族取代基，R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；或由本文中以下编号标明的结构式：（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明，提供了组合物，其包括具有以下结构式的化合物，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：
其中n为1或2，X为卤素，Y1和Y2均独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基，R1为脂肪族取代基或芳香族取代基，R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明，提供了组合物,其包括具有以下结构式的化合物，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（III），其中n为1，Y1和Y2均为H，X为Cl或F，R1为脂肪族取代基或芳香族取代基，R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有以下结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：
其中n为1或2，X为卤素，每个Y独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基，R1为脂肪族取代基或芳香族取代基，R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有以下结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I），其中n为1或2，X为卤素，每个Y独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基，R1为脂肪族取代基或芳香族取代基，R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有以下结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：
其中n为1或2，X为卤素，Y1和Y2均独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基，R1为脂肪族取代基或芳香族取代基，R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有以下结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（III），其中n为1，Y1和Y2均为H，X为Cl或F，R1为脂肪族取代基或芳香族取代基，R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括选自以下的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：YW3-56、YW3-56F、YW3-56Br、YW-56A，YW3-56A-F、YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体，其中所述受试者为人。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体，其中所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体，其中所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险，所述癌症的特征在于一个或多个肿瘤抑制基因的病态水平或活性。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体，其中所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险，所述癌症的特征在于p53肿瘤抑制基因的病态水平或活性。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体，其中所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险，并且其中给予受试者治疗有效量的组合物可检测地增加自体吞噬和／或降低癌症细胞的增殖。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体，其中所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险；并且所述方法还包括给予额外的治疗剂和/或辅助抗癌治疗（adjunct anti-cancer treatment）。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体，其中所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险；并且所述方法还包括给予治疗有效量的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体，其中所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险；并且所述方法还包括给予治疗有效量的SAHA。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包括具有由本文中以下编号标明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体，其中所述受试者患有自身免疫疾病或具有患自身免疫疾病的风险。根据本发明的实施方案提供了商业化包装，其包括一种或多种具有由本文中以下编号标明的结构式的本发明PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br。
根据本发明的实施方案，提供了商业化包装，其包括一种或多种具有由本文中以下编号标明的结构式的本发明PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且还包括选自以下的辅助组分：可药用载体、缓冲剂、稀释剂和复溶剂（reconstituting agent）。
根据本发明的实施方案，提供了使用PAD4抑制剂治疗受试者的方法，其包括组合物，所述组合物包括一种或多种具有由以下本文所示或所述编号标明的结构式的PAD4抑制剂，及其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且所述组合物任选地还包括可药用载体。
根据本发明的实施方案，提供了测定方法，其包括使细胞与荧光PAD4抑制剂接触，并检测所述PAD4抑制剂的荧光。
根据本发明的实施方案，提供了测定方法，其包括使细胞与选自以下的荧光PAD4抑制剂接触：YW3-56、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F、YW3-56A-Br和YW4-15；及其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯。
附图说明
图1为示出所实施的用于评估化合物抑制癌症细胞生长的活性的MTT测定法的结果的图。
图2为示出所实施的用于化合物的PAD4抑制效力的PAD4酶活性测定法的结果的图。
图3为示出化合物YW3-56和YW4-15的摄取的流式细胞术分析的结果的图。
图4A为示出所实施的用于评估化合物抑制癌症细胞生长的活性的MTT测定法的结果的图像。
图4B为示出所实施的用于评估化合物抑制癌症细胞生长的活性的MTT测定法的结果的图。
图5为示出多种浓度PAD4抑制剂YW3-56对U2OS癌症细胞的作用的一系列图像。
图6为示出PAD4抑制剂YW3-56对LC3-I裂解（表明细胞死亡）的作用的蛋白质印迹图像。
图7为示出用PAD4抑制剂YW3-56处理的U2OS细胞中LC3染色的图像。
图8为示出在YW3-56处理的细胞而非对照细胞中具有自噬体和自噬溶酶体结构特征的囊泡的一系列透射电子显微照片。
图9为示出S180肉瘤的抑制特性的图。
图10为示出在S180细胞中YW3-56以浓度依赖方式诱导的p53及其靶基因表达的图。
图11A为示出在对照和YW3-56处理的小鼠的脾脏中对p53及其靶基因mRNA水平的RT-qPCR分析的结果的图。
图11B为示出在对照和YW3-56处理的小鼠的肝脏中对p53及其靶基因mRNA水平的RT-qPCR分析的结果的图。
图12为示出PAD4抑制剂YW3-56对小鼠中肿瘤的作用的图。
图13A为示出以所示试剂处理后小鼠整个体重的图。
图13B为示出以所示试剂处理后小鼠大脑重量的图。
图13C为示出以所示试剂处理后小鼠心脏重量的图。
图13D为示出以所示试剂处理后小鼠肾脏重量的图。
图13E为示出以所示试剂处理后小鼠肝脏重量的图。
图13F为示出以所示试剂处理后小鼠脾脏重量的图。
图14A为示出对以PAD4抑制剂YW3-56处理的U2OS细胞（具有或不具有shRNA进行的p53耗尽）的生长抑制的MTT测定法结果的图。
图14B为示出U2OS细胞的PAD4抑制剂处理对所示蛋白质的表达的作用的图。
图14C为蛋白质印迹的图像，其示出使用反转录定量PCR（RT-qPCR）方法分析的U2OS细胞的PAD4抑制剂处理对p53及其靶基因表达的作用。
图14D为示出将PAD4与自体吞噬联系起来的p53-sestrin2-mTOR信号传导通路的示意图。
图14E为示出血清饥饿或刺激时PAD4抑制剂对U2OS细胞的作用的蛋白质印迹的图像。
图14F为示出FYW3-56处理之前和之后Sestrin2耗尽对p70S6K磷酸化的作用的蛋白质印迹的图像。
图14G示出8μM的YW3-56处理8小时之前和之后对p53和PAD4缔合以及sestrin2启动子的组蛋白H3R17Me和H3Cit修饰的ChIP分子。
图15A为示出以PAD4抑制剂处理癌症细胞后p53、PUMA和p21蛋白质的mRNA水平变化的图。
图15B为示出以PAD4抑制剂处理癌症细胞后p53及其靶基因的变化的蛋白质印迹的图像。
图15C为示出以PAD4抑制剂处理癌症细胞后p53、PUMA和p21蛋白质的mRNA水平变化的图。
具体实施方式
除非上下文明确指出相反，单数形式“一（a）”、“一个（an）”和“所述（the）”包含复数指代对象。
本申请使用的科技术语意在具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。发现这些术语在多篇标准参考文献的语境中被说明性定义和使用，所述参考文献包括：J.Sambrook and D.W.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press;3rd Ed.,2001;F.M.Ausubel,Ed.,Short Protocols inMolecular Biology,Current Protocols;5th Ed.,2002;B.Alberts et al.,MolecularBiology of the Cell,4th Ed.,Garland,2002;D.L.Nelson and M.M.Cox,LehningerPrinciples of Biochemistry,4th Ed.,W.H.Freeman&Company,2004;Chu,E.and Devita,V.T.,Eds.,Physicians'Cancer Chemotherapy Drug Manual,Jones&BartlettPublishers,2005;J.M.Kirkwood et al.,Eds.,Current Cancer Therapeutics,4th Ed.,Current Medicine Group,2001;Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins,21st Ed.,2006;L.V.Allen,Jr.et al.,Ansel'sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,8th Ed.,Philadelphia,Pa.:Lippincott,Williams&Wilkins,2004;和L.Brunton et al.,Goodman&Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill Professional,11th Ed.,2005。
根据本发明的实施方案提供了PAD4抑制性组合物及其用于治疗癌症和自身免疫疾病的方法。
根据本发明实施方案提供的组合物，包括一种或多种具有以下结构式的化合物：
其中n为1或2；X为卤素；每个Y独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基。在本发明的一些化合物中，R1和R2在环状结构中连接在一起。
本发明的组合物包括本文中所示和/或所述的化学结构的立体异构体。本发明的组合物包括具有所示和/或所述的化学结构的化合物的各个对映异构体，例如由以下编号标明的结构：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F及YW3-56A-Br；以及这些中任意化合物的全部或部分消旋混合物。
根据本发明的实施方案提供的组合物，包括一种或多种具有以下结构式的化合物：
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且R3为4-9个碳的、取代或无取代的、直链、支链或环状的烃基团。
根据本发明的实施方案提供的组合物，包括一种或多种具有以下结构式的化合物：
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；和R2为脂肪族取代基或芳香族取代基。
根据本发明的实施方案提供的组合物，包括一种或多种具有以下结构式的化合物：
其中n为1；X为F或Cl；Y1为H；Y2为H；R1为任选地取代的芳香族或杂芳香族取代基；和R2为任选地取代的芳香族或杂芳香族取代基。
本文所用的术语“芳香族”是指任选地取代的单环或双环的芳香族环体系或杂芳香族环体系。芳香族取代基的实例包括苯基、苯甲基和萘基，其均可以为杂芳香族基团。芳香族取代基本身可在任意可取代位置被取代，并且可具有1至最多数目的取代基。作为一个非限制性实例，芳香族取代基本身可在任意可取代的位置被C1-C4任选地取代的烃基团、卤素、卤素、硝基、氰基、任选地取代的氨基、羟基或氧代基取代。
本文所用的术语“脂肪族”是指取代的或未取代的、直链或支链的烃基团。芳香族基团的示例性实例为甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。脂肪族取代基本身可在任意可取代的位置被取代，并且可具有1至最多数目的取代基。作为一个非限制性实例，脂肪族取代基本身可在任意可取代的位置被C1-C4任选地取代的烃基团、卤素、硝基、氰基、任选地取代的氨基、羟基或氧代基取代。
本文所用的术语“卤素”是指F、Cl、Br或I，优选F或Cl。
包括本发明的两种或多种PAD4抑制剂的混合物的组合物也被具体地考虑到，并且被认为在本发明的范围内。
本发明的具体PAD4抑制剂的结构在下文中示出。
结构3，也被称为YW1-28：
结构4，也被称为YW1-44：
结构5，也被称为YW1-30：
结构6，也被称为YW1-49：
结构7，也被称为BL1-26：
结构8，也被称为YW1-90：
结构9，也被称为YW1-91：
结构10，也被称为YW1-94：
结构11，也被称为YW1-98：
结构12，也被称为BL1-07：
结构13，也被称为BL1-15:
结构15，也被称为YW3-88:
结构16，也被称为YW4-03:
结构17，也被称为YW4-06:
结构18，也被称为YW3-64:
结构19，也被称为YW3-75:
结构20，也被称为YW3-56:
结构21，也被称为YW3-71:
结构23，也被称为YW3-92:
结构24，也被称为YW4-15:
根据本发明的实施方案提供的组合物，包括一种或多种具有由以下本文中所示或所述编号标明的结构式的化合物，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br。
本文中所用的术语“PAD4抑制剂”是指本发明组合物的特异性降低PAD4酶活性的活性。如上文所指出的，PAD4是翻译后的方式将肽酰基精氨酸转化为瓜氨酸的酶。鉴别和表征PAD4抑制剂的特异性抑制活性的测定法是已知的，如本文中所举例说明的以及记载于Knuckley et al.,Bioorg.Med.Chem.,16（2）：739-45（2008）。
本发明的PAD4抑制剂是通过公知的化学合成方法合成的。用于合成本发明的PAD4抑制剂的示例性方法记载于本文所包括的实施例中。
根据本发明的实施方案，提供了一种组合物，所述组合物包括PAD4抑制剂（20），也标明为化合物YW3-56；以及其盐、立体异构体、水合物、酰胺和酯。
根据其他实施方案，PAD4抑制剂（20）YW3-56中的Cl可为F或Br。如标明为YW3-56F的PAD4抑制剂中所示，PAD4抑制剂（20）YW3-56中的Cl被F替代。
类似地，如标明为YW3-56Br的PAD4抑制剂中所示，PAD4抑制剂（20）YW3-56中的Cl被Br替代。
根据其他实施方案，PAD4抑制剂（20）YW3-56中的苯基可取代。例如，如标明为YW3-56A的PAD4抑制剂中所示，PAD4抑制剂（20）YW3-56中的苯基可被N3取代。
PAD4抑制剂YW3-56A结构中的Cl可被F或Br替代，分别获得YW3-56A-F和YW3-56A-Br。
PAD4抑制剂20和24（分别为YW3-56、YW4-15）、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F和YW3-56A-Br具有固有的荧光。并且因此可用在PAD4抑制剂检测应用中，例如但不限于检测和监测这些PAD4抑制剂的细胞及组织摄取以及PAD4抑制剂的细胞内定位，和PAD4抑制剂对以所述PAD4抑制剂处理的细胞的作用的检测和监测。
根据本发明的实施方案提供的测定方法，包括使细胞与荧光PAD4抑制剂接触，并检测所述PAD4抑制剂的荧光。
治疗方法。
根据本发明实施方案的PAD4抑制剂组合物抑制癌症细胞生长及肿瘤生长，并且可用作癌症治疗的化学治疗剂。
本文中使用的术语“癌症”是指实体瘤、血液肿瘤和/或恶性肿瘤、肿瘤发生前的过度增殖、原位癌症、新生物和转移灶。根据本发明实施方案的PAD4抑制剂可用于治疗患有癌症或具有患癌症风险的受试者，所述癌症例如皮肤癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、胃癌、胰脏癌、血细胞癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、结缔组织（肉瘤）和其他软组织的癌症。
许多自身免疫疾病（例如类风湿性关节炎、多发性硬化症和自身免疫性肾炎）包括对携带自身来源肽的瓜氨酸化肽的自身抗原的免疫应答。根据本发明的实施方案，给予本发明的PAD4抑制剂以治疗受试者中的自身免疫疾病。
根据本发明提供了用于治疗癌症和自身免疫疾病的方法和组合物。本文中使用的术语“治疗”和“处理”是指治疗受试者中的癌症或自身免疫疾病，包括：预防、抑制或改善受试者中的癌症或自身免疫疾病，例如，减慢所述癌症和自身免疫疾病的进程，并且/或者减低或改善所述癌症或自身免疫疾病的体征或症状。因此，本发明的方法和组合物可用于预防及改善癌症或自身免疫疾病的体征和/或症状。
根据本发明的实施方案，提供了治疗患有癌症或自身免疫疾病的受试者或者具有患癌症或自身免疫疾病的风险的受试者的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的本发明PAD4抑制剂。
根据本发明的实施方案，提供了治疗患有癌症或自身免疫疾病的受试者或者具有患癌症或自身免疫疾病的风险的受试者的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的本发明PAD4抑制剂，所述PAD4抑制剂为具有由以下本文中所示或所述编号标明的结构的PAD4抑制剂，及其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br。
使用公知的医疗和诊断技术将受试者鉴别为患有癌症或自身免疫疾病或者具有患癌症或自身免疫疾病的风险。
组合物的治疗有效量是在待治疗受试者中具有有益作用的量。在患有癌症或具有患癌症风险的受试者中，所述癌症例如特征在于异常细胞增殖的病症，包括但不限于肿瘤发生前的过度增殖、原位癌症、新生物、转移灶、肿瘤或其他易对PAD4抑制剂起反应的病症，组合物的治疗有效量可有效地改善或预防所述病症的一种或多种体征和/或症状。例如，组合物的治疗有效量可有效地、可检测地增加自体吞噬和/或降低癌症细胞的增殖，所述癌症包括但不限于肿瘤发生前的过度增殖、原位癌症、新生物、转移灶、肿瘤或其他特征在于易对PAD4抑制剂起反应的异常细胞增殖的病症。
在具体的实施方案中，使用本文所述的方法和组合物治疗的癌症特征在于减少的肿瘤抑制基因，例如p53。
一种或多种肿瘤抑制基因的降低的水平和活性可例如通过测量细胞中基因拷贝数、蛋白质或RNA水平来测定，所述细胞为已知为或疑似为混合型、癌前期的、癌症的、转移的或者其他特征在于与正常细胞相比的异常细胞增殖的细胞。用于一种或多种肿瘤抑制基因的降低的水平或活性的测定法，包括但不限于免疫测定法和核酸测定法。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括将治疗有效量的包括PAD4抑制剂的组合物给予需要其的受试者，其中所述PAD4抑制剂具有由以下本文所示或所述编号标明的结构，及其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且其中所述受试者患有特征在于一种或多种肿瘤抑制基因的水平或活性降低的病症或者具有患所述病症的风险，所述病症例如癌症，例如肿瘤发生前的过度增殖、原位癌症、新生物、转移灶或肿瘤。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括将治疗有效量的包括PAD4抑制剂的组合物给予需要其的受试者，其中所述PAD4抑制剂具有由以下本文所示或所述编号标明的结构，及其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且其中所述受试者患有癌症或者具有患癌症的风险，例如肿瘤发生前的过度增殖、原位癌症、新生物、转移灶或肿瘤。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括将治疗有效量的包括PAD4抑制剂的组合物给予需要其的受试者，其中所述PAD4抑制剂具有由以下本文所示或所述编号标明的结构，及其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且其中所述受试者患有癌症或者具有患癌症的风险，例如肿瘤发生前的过度增殖、原位癌症、新生物、转移灶或肿瘤，所述癌症的特征在于与相应健康细胞或组织相比增加的PAD4。这类特征在于与相应健康细胞或组织相比增加的PAD4的癌症是已知的，例如记载于Chang，X.et al.,BMC Cancer.9:40，2009。特征在于与相应健康细胞或组织相比增加的PAD4水平和/或活性的癌症还可通过以下方式鉴别：获得受试者的样本，通过多种标准测定技术中的任意技术来实施测定法以相对于对照评估所述样本中的PAD4，所述标准测定技术例如免疫学或分子生物学方法，例如免疫细胞化学、蛋白质印迹、PCR和ELISA。
根据本发明的具体实施方案，提供了包括将一种或多种本发明PAD4抑制剂给予需要其的受试者的方法，其可用于例如以表观遗传学方法改变细胞信号传导通路以进行疾病治疗。
根据本发明的具体实施方案，提供了调节细胞中肿瘤抑制基因的方法，其包括使所述细胞与有效量的PAD4抑制剂接触。
根据本发明的实施方案，提供了治疗受试者的方法，其包括将治疗有效量的包括PAD4抑制剂的组合物给予需要其的受试者，其中所述PAD4抑制剂具有由以下本文所示或所述编号标明的结构，及其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F或YW3-56A-Br；并且其中所述受试者患有自身免疫疾病或者具有患自身免疫疾病的风险，所述自身免疫疾病特征在于对携带自身来源肽的瓜氨酸化肽的自身抗原的免疫应答，例如但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化症和自身免疫性肾炎。
组合疗法
根据本发明的实施方案，提供了治疗剂的组合。在一些实施方案中，将选自所述组的两种或多种PAD4抑制剂给予受试者以治疗需要其的受试者中的癌症或自身免疫疾病。在其他实施方案中，将至少一种本发明的PAD4抑制剂和至少一种额外的治疗剂给予受试者以治疗需要其的受试者中的癌症或自身免疫疾病。在其他实施方案中，至少一种本发明的PAD4抑制剂和至少两种额外的治疗剂给予受试者以治疗需要其的受试者中的癌症或自身免疫疾病。
本文中所使用的术语“额外的治疗剂”是指化合物、化合物的混合物、生物大分子（如核酸、抗体、蛋白质或其部分，如肽），或从诸如细菌、植物、真菌或动物（特别是哺乳动物）细胞或组织的生物材料制备的提取物，所述提取物为可在受试者中局部地或全身地发挥作用的生物学上、生理学上或药理学上活性物质。
本发明的方法和组合物的实施方案中所包括的额外治疗剂，包括但不限于抗生素、抗病毒剂、抗肿瘤剂、止痛剂、退热剂、抗抑郁剂、抗精神病药物、抗癌剂、抗组胺剂、抗骨质疏松药剂、抗骨坏死药剂、抗炎剂、抗焦虑剂、化疗药剂、利尿剂、生长因子、激素、非激素类抗炎剂、类固醇药物和血管活性物质。
额外的治疗剂是实施方案的抗癌剂。抗癌剂记载于，Goodman et al.,Goodmanand Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，8th Ed.,MacmillanPublishing Co.,1990。
抗癌剂示例性地包括，抗代谢物(antimetabolites)、烷化剂(alkylatingagents)、异恶唑乙酸(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿考达唑(acodazole)、阿克罗宁(acronine)、阿多来新(adozelesin)、阿地白介素(aldesleukin)、阿利维甲酸(alitretinoin)、别嘌醇（allopurinol）、六甲蜜胺（altretamine）、安波霉素（ambomycin）、阿美蒽醌（ametantrone）、氨磷汀（amifostine）、鲁米特（aminoglutethimide）安吖啶（amsacrine）、阿那曲唑（anastrozole）、氨茴霉素（anthramycin）、白砒（arsenictrioxide）、门冬酰胺酶（asparaginase）、曲林菌素（asperlin）、阿扎胞苷（azacitidine）、阿扎替派（azetepa）、阿佐霉素（azotomycin）、巴马司他（batimastat）、苯佐替派（benzodepa）、比卡鲁胺（bicalutamide）、蒽双咪腙（bisantrene）、双奈法德（bisnafidedimesylate）、比折来新（bizelesin）、博莱霉素（bleomycin）、布喹那（brequinar）、溴匹立明（bropirimine）、马利兰（busulfan）、放线菌素（cactinomycin）、卡普睾酮（calusterone）、卡培他滨（capecitabine）、卡醋胺（caracemide）、卡贝替姆（carbetimer）、卡铂（carboplatin）、卡莫司汀（carmustine）、卡柔比星（carubicin）、卡折来新（carzelesin）、西地芬戈（cedefingol）、塞来昔布（celecoxib）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）、西罗霉素（cirolemycin）、顺铂（cisplatin）、克拉屈滨（cladribine）、克立那托（crisnatol mesylate）、环磷酰胺（cyclophosphamide）、阿糖胞苷（cytarabine）、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、右奥马铂(dexormaplatin)、地扎胍宁(dezaguanine)、甲磺酸地扎呱宁（dezaguanine mesylate）、地吖醌（diaziquone）、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、屈洛昔芬(droloxifene)、屈他雄酮(dromostanolone)、达佐霉素(duazomycin)、依达曲沙(edatrexate)、依氟鸟氨酸（eflomithine）、依沙芦星(elsamitrucin)、恩洛铂(enloplatin)、恩普氨酯（enpromate）、依匹哌啶(epipropidine)、表柔比星（epirubicin）、厄布洛唑(erbulozole)、依索比星(esorubicin)、雌氮芥(estramustine)、依他硝唑（etanidazole）、依托泊苷(etoposide)、氯苯乙嘧胺（etoprine）、法倔唑(fadrozole)、法扎拉滨（fazarabine）、芬维A胺(fenretinide)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟西他滨(flurocitabine)、磷喹酮(fosquidone)、福司曲星(fostriecin)、氟维司群(fulvestrant)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、去甲氧柔红霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊莫福新(ilmofosine)、白细胞介素II(interleukin II;IL-2,包括重组白细胞介素II或rIL2)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂(iproplatin)、伊立替康(irinotecan)、兰瑞肽(lanreotide)、来曲唑(letrozole)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide)、利罗唑(liarozole)、洛美曲索(lometrexol)、洛莫司汀(lomustine)、洛索蒽醌(losoxantrone)、马索罗酚(masoprocol)、美登素(maytansine)、盐酸氮芥(mechlorethamine hydrochloride)、甲地孕酮(megestrol)、醋酸美伦孕酮(melengestrolacetate)、马法兰(melphalan)、美诺立尔(menogaril)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、氯苯氨啶(metoprine)、美妥替哌(meturedepa)、米丁度胺(mitindomide)、米托卡星(mitocarcin)、丝裂红素(mitocromin)、米托洁林(mitogillin)、米托马星(mitomalcin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托司培(mitosper)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、霉酚酸(mycophenolic acid)、奈拉滨(nelarabine)、噻氨酯哒唑(nocodazole)、诺拉霉素(nogalamycin)、ormnaplatin、奥昔舒仑(oxisuran)、紫杉醇(paclitaxel)、培门冬酶(pegaspargase)、培利霉素(peliomycin)、戊氮芥(pentamustine)、培利霉素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、哌泊溴烷(pipobroman)、哌酰硫烷(piposulfan)、盐酸吡罗蒽醌（piroxantrone hydrochloride）、普卡（plicamycin）、普洛美坦（plomestane）、卟吩姆（porfimer）、泊非霉素(porfiromycin)、泼尼莫司汀（prednimustine）、甲基苄肼（procarbazine）、嘌呤霉素（puromycin）、吡唑呋喃菌素（pyrazofurin）、利波腺苷（riboprine）、罗谷亚胺（rogletimide）、沙芬戈（safingol）、司莫司汀（semustine）、辛曲秦（simtrazene）、磷乙酰天冬氨酸(sparfosate)、稀疏霉素（sparsomycin）、螺环锗（spirogermanium）、螺莫司汀（spiromustine）、螺铂（spiroplatin）、链黑菌素（streptonigrin）、链脲佐菌素（streptozocin）、磺氯苯脲(sulofenur)、他利霉素（talisomycin）、他莫昔芬（tamoxifen）、替可加兰(tecogalan)、替加氟（tegafur）、替洛蒽醌（teloxantrone）、替莫泊芬(temoporfin)、替尼泊苷（teniposide）、替罗昔隆（teroxirone）、睾内酯（testolactone）、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤（thioguanine）、塞替派(thiotepa)、噻唑呋林(tiazofurin)、替拉扎明（tirapazamine）、拓扑替康（topotecan）、托瑞米芬（toremifene）、曲托龙（trestolone）、曲西立滨（triciribine）、三甲曲（trimetrexate）、曲普瑞林（triptorelin）、妥布氯唑（tubulozole）、尿嘧啶芥末（uracil mustard）、乌瑞替派（uredepa）、伐普肽(vapreotide)、维替泊芬（verteporfin）、长春碱（vinblastine）、硫酸长春新碱（vincristine sulfate）、长春地辛（vindesine）、长春匹定（vinepidine）、长春甘酯（vinglycinate）、长春罗新（vinleurosine）、长春瑞滨（vinorelbine）、长春罗定（vinrosidine）、长春利定（vinzolidine）、伏氯唑(vorozole)、折尼铂（zeniplatin）、净司他丁（zinostatin）、唑来膦酸（zoledronate）和佐柔比星（zorubicin）.
本发明实施方案的组合疗法中所包括的具体的额外治疗剂为组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）抑制剂，如SAHA（辛二酰苯胺异异羟肟酸）。
额外的治疗剂可以为对受试者或受试者身体受感染区域的放射治疗。
采用一种或多种本发明的PAD4抑制剂和一种或多种额外的治疗剂的组合疗法显示出协同作用，例如，与单独使用一种或多种本发明的PAD4抑制剂或一种或多种额外的治疗剂作为单一疗法时观察到的治疗效果相比更高的治疗效果。
具体地说，发现一种或多种本发明的PAD4抑制剂与SAHA的给药产生协同的抗癌作用。
根据实施方案，组合疗法包括：（1）包括一种或多种本发明的PAD4抑制剂与一种或多种额外的治疗剂的组合物；和（2）一种或多种本发明的PAD4抑制剂与一种或多种额外的治疗剂的共同给药，其中所述一种或多种本发明的PAD4抑制剂与一种或多种额外的治疗剂尚未被配制在同一组合物中。当使用分开的配方时，所述一种或多种本发明的PAD4抑制剂可以在所述一种或多种额外的治疗剂的给药的同时、间歇、错开、之前、之后或它们的组合。
组合疗法允许本发明方法中所使用的一种或多种本发明PAD4抑制剂和一种或多种额外的治疗剂的有效剂量降低且治疗指数增加。
药物组合物
根据本发明的实施方案，提供了包括本发明的PAD4抑制剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以使用一种或多种可药用载体和/或赋形剂以常规方式制备。
在本发明的具体实施方案中，药物组合物包含本发明的PAD4抑制剂及可药用载体。术语“可药用载体”是这样的载体，其对待给予所述组合物的受试者是基本上无毒的，并且对于本发明的PAD4抑制剂来说是基本上化学惰性的。
本发明的药物组合物通常包含约0.1-99%的本发明的PAD4抑制剂。药物组合物中PAD4抑制剂的组合也被认为在本发明的范围内。
任选地，治疗患有癌症或有患癌症风险的受试者的方法还可包括辅助的抗癌治疗。辅助的抗癌治疗可以是抗癌剂或其他额外的治疗剂的给药。辅助的抗癌治疗可以是对患者或受试者身体受感染区域的放射治疗。
适于递送给受试者的药物组合物可以被制备为各种形式，所述形式示例性地包括生理学上可接受的无菌水性溶液或非水性溶液、分散液、悬液或乳液，以及可复溶于无菌注射用溶液或分散液中的无菌粉剂。适合的水性和非水性载体包括：水，乙醇，多元醇如丙二醇、聚乙二醇、甘油等，它们的适合混合物；植物油，如橄榄油；及可注射的酯类，如油酸乙酯（ethyloleaste）。例如，可以通过使用包衣（例如卵磷脂），通过维持分散液中所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂如月桂基硫酸钠来维持适合的流动性。可以包括示例性地包括缓冲剂、溶剂或稀释剂的额外组分。
通过适合的途径（包括肠胃外给药和口服给药）来给予这类制剂。给药可以包括全身或局部注射，以及具体的静脉注射。
这类组合物还可包含佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保对微生物作用的预防，所述抗细菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、山梨酸等。可能还需要包括等张剂，例如糖、氯化钠和性质上类似的物质。可通通过使用延迟吸收的试剂（例如单硬脂酸铝和明胶）来实现对可注射药物形式的缓释递送。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，将本发明的化合物中混入至少一种惰性的常规赋型剂（或载体）如柠檬酸钠或磷酸氢二钙；或（a）填充剂与增容剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及硅酸；（b）粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；（c）保湿剂，如甘油；（d）崩解剂，如琼脂、碳酸钙、植物淀粉如马铃薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钙；（e）液体缓聚剂，如石蜡；（f）吸收加速剂，如季铵类化合物；（g）湿润剂，如十六醇，单硬脂酸甘油酯，和乙二醇；（h）吸收剂，如高岭土和膨润土；及（i）润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、月桂硫酸钠，或者它们的混合物。对于胶囊剂、片剂和丸剂，所述剂型也可包含缓冲剂。
在使用诸如乳糖或乳以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软和硬填充的明胶胶囊中，相似类型的固体组合物也可以用作填充剂。
固体剂型如片剂、锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可以使用包衣和外壳（如肠溶包衣和其他本领域中公知的包衣）来制备。它们可含有遮光剂，并且还可以是在肠道的某一部分中以缓释方式释放一种或多种所述活性化合物的组合物。可以使用的包埋组合物的实例为聚合物质和蜡。所述活性化合物也可以为微包囊形式，在适当的条件下含有一种或多种上述赋型剂。
用于口服给药的液体剂型包括可药用载体，其被制成乳液、溶液、悬液、糖浆或酏剂。除所述活性化合物之外，液体剂型还可包含本领域中常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油（特别是棉花籽油、落花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪族酸酯，或它们的混合物等。
除这些惰性稀释剂，所述组合物还可包括其他佐剂，如湿润剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂和香味剂。
除本发明的缀合物外，悬液中还可包含悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨醇酯、微晶状纤维素、氢氧化铝氧化物（aluminum metahydroxide）、膨润土、琼脂或黄蓍树胶，或这些物质的混合物等。
在具体的实施方案中，本发明的组合物被制成局部应用的制剂。
在具体的实施方案中，局部用制剂可以是软膏剂、洗液、乳膏或凝胶。局部用剂型如软膏剂、洗液、乳膏或凝胶基记载于Remington:The Science and Practice ofPharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins,2006，p.880-882和p.886-888;和Allen,L.V.et al.,Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,8th Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,2005，p.277-297。
药物组合物的可药用载体、赋形剂以及制剂是本领域中已知的，示例性地包括但不限于，如记载于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,2006;和Allen,L.V.et al.,Ansel'sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,8th Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,2005。
术语“受试者”是指需要对病理病症（特别是癌症和/或自身免疫疾病）的治疗的个体，通常包括哺乳动物和禽类，例如但不限于人、其他灵长类、猫、狗、牛、马、啮齿动物、猪、绵羊、山羊和家禽。根据实施方案，需要对对病理病症（特别是癌症和/或自身免疫疾病）的治疗的受试者是人。
根据本发明的药物组合物适合于以多种全身和/或局部途径给予受试者，包括但不限于静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、动脉内、心内、真皮内、经气管、表皮下、被膜下、蛛网膜下、椎管内、胸骨内、口服、含服、经耳、直肠、阴道、局部、透皮、肠胃外、肺部、眼部、经鼻、肿瘤内和粘膜。
本发明的组合物可以短期或长期给药。例如，本文所述组合物可以在一段相对有限的时间段内（例如数秒至数小时），作为单一剂量或分为多次剂量给予。在其他实施方案中，给药可以包括在数天至数年的时间段内给予的多次剂量，例如用于癌症的长期治疗。
本发明药物组合物的治疗有效量将根据所使用的具体药物组合物、待治疗的病症的严重程度、受试者的种类、受试者的年龄和性别、以及待治疗受试者的整体健康状况而变化。本领域技术人员可以在考虑到这些剂医疗实践中的其他常规考虑因素的情况下决定治疗有效量。通常地说，考虑到的治疗有效量可在约0.001-10毫克／千克的范围内，任选地在0.01-10毫克／千克的范围内，并且进一步任选地在0.1-5毫克／千克的范围内。另外，剂量也将根据治疗是短期的还是长期的来进行调整。
本发明实施方案的PAD4抑制剂被配制为具有增强的脂溶性和／或者水溶性。
在具体的实施方案中，可药用载体可以是颗粒状载体，如脂质颗粒，包括脂质体、微团、单层或多层囊泡；聚合物颗粒，如水凝胶颗粒、聚乙醇酸颗粒或聚乳酸颗粒；无机颗粒，如磷酸钙颗粒，例如记载于美国专利5,648,097；以及无机／有机颗粒状载体，例如记载于美国专利6,630,486。
颗粒状可药用载体可以选自脂质颗粒、聚合物颗粒、无机颗粒和无机／有机颗粒。也可包含多种颗粒类型的混合物作为颗粒状的可药用载体。
通常配制颗粒状载体以使得颗粒具有约1纳米-10微米的平均粒径。在具体的实施方案中，通常配制颗粒状载体以使得颗粒具有约1纳米-100纳米的平均粒径。
商业化包装。
根据本发明的实施方案，提供了用于治疗需要其的受试者中的癌症或自身免疫疾病的商业化包装，包括一种或多种具有由以下本文中所示或所述编号表明的结构式的PAD4抑制剂，或其盐、立体异构体、水合物、酰胺或酯：（I）、（II）、（III）、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、YW3-56F、YW3-56Br、YW3-56A、YW3-56A-F、及YW3-56A-Br。在本发明的商业化包装中可任选地包括一种或多种辅助组分，例如可药用载体，如缓冲剂、稀释剂或复溶剂（reconstituting regent）。
下述实施例中举例说明了本发明的组合物和方法的实施方案。提供这些实施例用于举例说明的目的，而不应被认为是对本发明的组合物和方法的范围的限制。
实施例
实施例1
可以使用溶液相合成方法来制备本发明的具有以下结构式的的PAD4抑制剂：
其中n为1或2；X为卤素；每个Y独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且R2为脂肪族取代基或芳香族取代基。
为制备具有结构(III)的抑制剂，将具有不同立体和疏水性质的芳香族取代基和脂肪族取代基连接在L-鸟氨酸（L-Orn）的C末端，如以下方案1中所示。经由标准的酯或酰胺偶联化学将具有羟基或氨基官能团的不同基元（building block）连接在Orn的侧链氨基基团上。
实施例2
可以使用固相合成方法来制备本发明的具有以下结构式的的PAD4抑制剂：
其中n为1或2；X为卤素；每个Y独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且R2为脂肪族取代基或芳香族取代基。
在该实施例中，首先在溶液相中大量制备带有Fmoc-Nα和Dmab-Cα的L-鸟氨酸起始原料，然后通过其ε-胺基侧链将该起始原料固定于氯-三苯甲基树脂上。选择性地移除Fmoc和Dmab保护基团，以便随后经由标准的酰胺偶联化学连接R1NH2和R2CO2H。在酸处理条件下从树脂上解离后，所得的胺中间体与乙基氯乙脒（ethyl chloroacetamidine）（或氟乙脒，fluoroacetamidine）反应得到所需的终产物。应用纯化方法如色谱纯化方法。该方法可以用于制备本发明的PAD4抑制剂。
实施例3
合成方案1示出了YW3-56的代表性合成。
方案1：
试剂和条件：
a)BnNH2、EDCI、HOBt、DIPEA、DMF、室温（rt）、4小时、产率为83%。
b)20%的TFA的二氯甲烷溶液、rt、4小时；6-(二甲基氨基)-2-萘酸、EDCI、HOBt、DIPEA、DMF、rt、两步产率74%。
c)H2、Pd/C、甲醇、rt；氯乙脒乙酯、甲醇、rt、两步产率52%。
如该合成中通常所述，经由EDCI介导的酰胺偶联反应将适当保护的BocOrn(Cbz)OH与苄胺（BnNH2）偶联。然后在TFA酸性处理条件下，将所述偶联产物的Boc保护基团移除，通过EDCI将所得的游离氨基团与二甲基氨基萘酸偶联。然后通过催化的氢化作用处理该偶联产物以移除侧链氨基基团上的Cbz保护基，其随后与氯乙脒乙酯（ethylchloroacetamidate）反应以便以良好的产率产生终产物YW3-56。该方法可以用于制备本发明的PAD4抑制性化合物。
在该合成的一个具体描述的实例中，将BocOrn(Cbz)OH（1.0g，2.73mmol）、苄胺（684mg，4.10mmol）、EDCI（780mg，4.10mmol）以及溶解于DMF（60mL）中的DIPEA（1.056g，8.09mmol）在室温下搅拌四小时。在真空中蒸发所述溶剂，将所得残渣溶解于50mL乙酸乙酯中，将所得溶液用饱和碳酸氢钠水溶液（30mL X3）、5%硫酸氢钾水溶液（30mL X3）和饱和氯化钠水溶液（30mL X3）充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空中蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为25%乙酸乙酯/己烷），得到白色固体状的题述化合物，产率：1.03g（83%）。
在0°C下向BocOrn(Cbz)NHBn（1.03g，2.26mmol）的无水二DCM（10mL）溶液中加入TFA（2mL），使温度缓慢升至室温，然后搅拌4小时。在氮气气流下移除所述溶剂。所得粗产品不经纯化直接用于下一步。
将Horn(Cbz)NHBn（100mg，0.225mmol）、6-(二甲基氨基)-2-萘酸（42mg，0.195mmol）、EDCI（45mg，0.235mmol）以及溶解于DMF（10mL）中的DIPEA（76mg，0.588mmol）的混合物在室温下搅拌4小时。在真空中蒸发所述溶剂，将所得残渣溶解于20mL乙酸乙酯中。将所得溶液用饱和碳酸氢钠水溶液（10mL X3）、5%硫酸氢钾水溶液（10mL X3）和饱和氯化钠水溶液（10mL X3）充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空中蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为5%甲醇/DCM），得到白色固体状的题述化合物，产率：85mg（两步74%）。
向(S)-苯甲基5-(苯甲基氨基)-4-(6-(二甲基氨基)-2-萘氨基)-5-氧代戊基氨基甲酸酯（80mg，0.145mmol）的甲醇（10mL）溶液中加入10mg Pd/C（10%）。在室温下，在氢气球下搅拌所得反应混合物8小时。过滤后，将所得滤液在真空中蒸发，将所得残渣用乙醚反复研磨以产生无色粉末状的(S)-N-(5-氨基-1-(苯甲基氨基)-1-氧代戊-2-基)-6-(二甲基氨基)-2-萘甲酰胺。
将溶解于甲醇（4mL）中的(S)-N-(5-氨基-1-(苯甲基氨基)-1-氧代戊-2-基)-6-(二甲基氨基)-2-萘甲酰胺（78mg，0.186mmol）、氯乙脒乙酯（110mg，0.90mmol）和TEA（150μL）的混合物在室温下搅拌24小时。在真空中蒸发所述溶剂，将所得残渣溶解于20mL乙酸乙酯中。将所得溶液用饱和碳酸氢钠水溶液（10mL X3）和饱和氯化钠水溶液充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空中蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为5%甲醇/DCM），得到浅黄色固体状的题述化合物，产率：47.6mg（两步52%）。
所述用于化合物YW3-56的具体合成方案在经过微小的常规修改后可用于合成本发明的其他化合物，以获得所需化合物。
实施例4
方案2示出了YW3-53的代表性合成：
方案2：
试剂和条件：
a)BnNH2、EDCI、HOBt、DIPEA、DMF、室温（rt）、4小时、产率为83%。
b)20%的TFA的二氯甲烷溶液、rt、4小时；2-二甲基氨基萘-6-磺酰氯、TEA、DMF、THF、rt、两步产率74%。
c)H2、Pd/C、甲醇、rt；氯乙脒乙酯、甲醇、rt、两步产率46%。
将Orn(Cbz)NHBn（76mg，0.282mmol）、2-二甲基氨基萘-6-磺酰氯（92mg，0.235mmol）、溶解于DMF（1mL）中的TEA（114mg，1.128mmol）和THF（4mL）的混合物在室温下搅拌两小时。在真空中蒸发所述溶剂，将所得残渣溶解于20mL乙酸乙酯中，将所得溶液用饱和碳酸氢钠水溶液（10mL X3）、5%硫酸氢钾水溶液（10mL X3）和饱和氯化钠水溶液（10mL X3）充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空中蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为5%甲醇/DCM），得到白色固体状的题述化合物，产率：116mg（两步70%）。
向(S)-苯甲基5-(苯甲基氨基)-4-(6-(二甲基氨基)萘-2-磺酰氨基)-5-氧代戊基氨基甲酸酯（23mg，0.039mmol）的甲醇（5mL）溶液中加入5mg Pd/C（10%）。在室温下，在氢气球下搅拌所得反应混合物8小时。过滤后，将所得滤液在真空中蒸发，将所得残渣用乙醚反复研磨以产生无色粉末状的(S)-5-氨基-N-苯甲基-2-(6-(二甲基氨基)萘-2-磺酰氨基)戊酰胺。
将溶解于甲醇（4mL）中的(S)-5-氨基-N-苯甲基-2-(6-(二甲基氨基)萘-2-磺酰氨基)戊酰胺（20mg，0.044mmol）、氯乙脒乙酯（15mg，0.095mmol）和TEA（20μL）的混合物在室温下搅拌24小时。在真空中蒸发所述溶剂，将所得残渣溶解于20mL乙酸乙酯中。将所形成的溶液用饱和碳酸氢钠水溶液（10mL X3）和饱和氯化钠水溶液充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空中蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为5%甲醇/DCM），得到浅黄色固体状的题述化合物，产率：10mg（两步46%）。
所述用于化合物YW3-56的具体合成方案在经过微小的常规修改后可用于合成本发明的其他化合物，以获得所需化合物。
实施例5
方案3示出了YW4-15的代表性合成：
方案3：
试剂和条件：
a)HATU、DIPEA、DMF、室温（rt）、4小时、产率为90%。
b)H2、Pd/C、甲醇、rt、12小时、产率90%。
c)生物素、HATU、DIPEA、DMF、室温（rt）、2小时、产率为77%。
d)20%的TFA的二氯甲烷溶液、rt、2小时、BocOrn(CbZ)OH、HATU、DIPEA、DMF、室温（rt）、2小时、产率为90%。
e)20%的TFA的二氯甲烷溶液、rt、2小时。
f)6-(二甲基氨基)-2-羧酸、DIPEA、DMF、室温（rt）、2小时、产率为85%。
g)H2、Pd/C、甲醇、室温、氯乙脒乙酯、甲醇、rt、两步产率50%。
将溶解于DMF（20mL）中的4-{[(苯甲氧基)羰基]氨基}-丁酸（260mg，1.097mmol）、4-[(N-Boc)氨基甲基]苯胺（222mg，1.0mmol）、HATU（418mg，1.10mmol）以及DIPEA（350μL）在室温下搅拌4小时。在氮气气流下移除所述溶剂，将所得残渣溶解于30mL乙酸乙酯中，将所得溶液用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空中蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为2%甲醇/DCM），得到题述化合物，产率：395mg（90%）。
向化合物3（380mg，0.86mmol）的甲醇（5mL）溶液中加入40mg Pd/C（10%），用氢气鼓泡8小时，TLC表明起始原料完全消失。过滤后，将所得滤液在真空下蒸发，将所得残渣用乙醚反复研磨以产生无色粉末状的化合物4，产率：240mg（90%）。
将溶解于DMF（20mL）中的化合物4（240mg，0.78mmol）、生物素（173mg，0.71mmol）、HATU（150mg，0.39mmol）以及DIPEA（200μL）的混合物于室温下搅拌4小时。在氮气气流下移除所述溶剂，将所得残渣溶解于30mL乙酸乙酯中，将所形成的溶液用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空下蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为10%甲醇/DCM），得到化合物5，产率：145mg（77%）。
在0°C下向化合物5（140mg，0.26mmol）的无水DCM（5mL）溶液中加入TFA（1mL），使温度缓慢升高至室温，并且搅拌2小时。在氮气气流下移除所述溶剂。将所得粗品加入到BocOrn(CbZ)OH（103mg，0.281mmol）、HATU（107mg，0.268mmol）以及DIPEA（127μL）的DMF（10mL）溶液中，于室温下搅拌4小时。在氮气气流下移除所述溶剂，将所得残渣溶解于30mL乙酸乙酯中，将所形成的溶液用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空下蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为10%甲醇/DCM），得到题述化合物，产率：165mg（两步90%）。
在0°C下向化合物6（150mg，0.26mmol）的无水DCM（5mL）溶液中加入TFA（1mL），使温度缓慢升高至室温，并且搅拌2小时。在氮气气流下移除所述溶剂。所得粗品不经纯化直接用于下一步。
将溶解于DMF（5mL）中的化合物7（145mg，0.186mmol）、6-(二甲基氨基)-2-萘酸（46mg，0.20mmol）、HATU（78mg，0.20mmol）以及DIPEA（72μL）的混合物在室温下搅拌4小时。在氮气气流下移除所述溶剂，将所得残渣溶解于30mL乙酸乙酯中，将所形成的溶液用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空下蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为5%甲醇/DCM），得到化合物8，产率：139mg（85%）。
向化合物8（135mg，0.153mmol）的甲醇（15mL）溶液中加入25mg Pd/C（10%），用氢气鼓泡8小时，TLC表明起始原料完全消失。过滤后，将所得滤液在真空下蒸发，将所得粗产品加入到氯乙酰脒乙酯（46mg，0.380mmol）和TEA（150μL）的甲醇（4mL）溶液中，于室温下搅拌24小时后。将所述溶剂在真空中蒸发，将所得残渣溶解于20mL乙酸乙酯中，将所形成的溶液用饱和碳酸氢钠水溶液（10mL x3）和饱和氯化钠水溶液充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空下蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为15%甲醇/DCM），得到浅黄色固体状的题述化合物，产率：62mg（两步50%）。
所述用于化合物YW4-15的具体合成方案在经过微小的常规修改后可用于合成本发明的其他化合物，以获得所需化合物。
实施例6
方案4示出了YW1-30的代表性合成：
方案4：
试剂和条件：
a)Fmoc-Lys-OH、THF、H2O、NaHCO3、室温、12小时、产率62%。
b)20%TFA的二氯甲烷溶液、室温、2小时；Bop、DIPEA、产率69%。
c)H2、Pd/C、甲醇、室温；氯乙脒乙酯、甲醇、室温、两步产率50%。
将溶解于TFA（10mL）和水（2.5mL）中的BocOrn(CbZ)OSu（345mg，0.75mmol）、Fmoc-Lys-OH（298mg，0.80mmol）、碳酸氢钠（80mg，0.75mmol）的混合物于室温下搅拌反应12小时。将所述溶剂在真空中蒸发，将所得残渣通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为5%甲醇/DCM），得到白色固体状的题述化合物，产率：332mg（62%）。
在0°C下向化合物2（332mg，0.44mmol）的无水DCM（10mL）溶液中加入TFA（2mL），使温度缓慢升高至室温，然后搅拌2小时。在氮气气流下移除所述溶剂。所得粗产品加入到(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐（213mg，0.484mmol）和DIPEA（75μL）的THF（20mL）溶液中，将所得反应混合物于室温下搅拌12小时。在真空中蒸发所述溶剂，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为5%甲醇/DCM），得到题述化合物，产率：182mg（两步69%）。
将化合物3（300mg，0.43mmol）的甲醇（15mL）溶液中加入25mg Pd/C（10%）。将所得反应混合物在室温下，在氢气球下搅拌8小时。过滤后，将所得滤液在真空下蒸发，将所得粗品加入到氯乙脒乙酯（200mg，0.86mmol）和TEA（52μL）的甲醇（4mL）溶液中，于室温下搅拌4小时。在真空中移除所述溶剂，将所得残渣溶解于20mL乙酸乙酯中，将所形成的溶液用饱和碳酸氢钠水溶液（10mL x3）和饱和氯化钠水溶液充分洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，将所得滤液在真空下蒸发，将所得粗材料通过快速色谱法纯化（230-400目硅胶，洗脱液为15%甲醇/DCM），得到浅黄色固体状的题述化合物，产率：95mg（两步41%）。
所述用于化合物YW1-30的具体合成方案在经过微小的常规修改后可用于合成本发明的其他化合物，以获得所需化合物。
实施例7
实施MTT测定法来评估抑制癌症细胞生长的活性。在24孔板中将U2OS人骨肉瘤细胞用不同浓度的各个化合物处理72小时。加入MTT试剂至终浓度0.5毫克／毫升，并且继续孵育4小时。黄色的MTT在活细胞内被还原成不可溶的紫色甲臜。移除细胞培养基，加入DMSO来将甲臜溶解到溶液中。然后用Thermo BioMate3分光光度计在570纳米处测量所得溶液的吸光度。结果在图1中示出，并且示出了平均值和标准差（n≥3）。
实施例8
进行PAD4酶活性测定来测定PAD4抑制作用。所述抑制剂的PAD4抑制效力是使用用于瓜氨酸生产的比色测定法来测定。
PAD4抑制剂的抑制效力是通过对PAD4催化的BAEE的瓜氨酸化产生的瓜氨酸的比色测量来测定的。将0.2微克PAD4在100微升含50毫摩Tris-HCl、pH7.6、5毫摩CaCl2、2毫摩DTT的缓冲液中于37°C下用抑制剂预孵育0.5小时。通过加入BAEE至5毫摩开始所述反应，1.5小时后加入25微升5摩HClO4以终止所述反应。然后将所述样品于4摄氏度下以12000rpm离心2分钟。通过与120微升试剂A（0.5%w/v二乙酰一肟和15%w/v NaCl的水溶液）和240微升试剂B（1%w/v安替比林，0.15%w/v FeCl2，25%v/v H2SO4和25%H3PO4）混合来测定所得上清液（120μl）中的瓜氨酸。将所得混合物加热煮沸15分钟，在冰浴中冷却至室温。用ThermoBioMate3分光光度计测量所述试剂混合物在464纳米处的吸光度。通过将未经抑制剂处理的PAD4酶活性标准化为100%，将抑制剂的效力表示为相对PAD4瓜氨酸化活性。
结果在图2中示出，并且示出了平均值和标准差（n≥3）。图2中的结果代表了本文中所述化合物的PAD4抑制活性。在鉴别本文中称为PAD4抑制剂时获得了类似的结果。
几种化合物抑制癌症细胞生长的IC50（微摩）和抑制PAD4活性的IC50（微摩）在表1中示出。
实施例9
使用流式细胞术评估化合物YW3-56和YW4-15的细胞摄取。用10微摩YW3-56或YW4-15处理U2OS细胞12小时，收集细胞并用PBS洗涤一次。将细胞沉淀重悬浮于1毫升预暖的DMEM中。将未经处理的细胞用作阴性对照。用FC500流式细胞仪（Beckman Coulter Inc.）评估荧光，并用WinMDI2.9软件分析。结果如图3所示。
实施例10
利用MTT测定法分析PAD4抑制剂的细胞生长抑制作用。
在24孔板中用不同浓度的各个化合物处理细胞72小时。加入MTT试剂至终浓度0.5毫克／毫升，继续孵育4小时。黄色的MTT试剂在活细胞内被还原成不可溶的紫色甲臜。移除细胞培养基，加入DMSO来将甲臜溶解到溶液中。然后用Thermo BioMate3分光光度计在570纳米处测量所得溶液的吸光度。
图4A示出了说明本发明PAD4抑制剂对U2OS细胞生长抑制的作用的代表性图像，使用MTT测定法，所用的所有抑制剂浓度均为20微摩，且处理时间为三天。在20微摩浓度下，几种抑制剂YW4-03、YW3-88和YW3-56消除了细胞生长。将具有相似结构的化合物分为一组，圆圈指明结构差异。
图4B示出了在用20微摩的各种PAD4抑制剂处理U2OS细胞后，作为在570纳米处吸光度值测得的MTT吸光信号。示出了平均值和标准差（n≥3）。
实施例11
用相差显微镜分析用本发明化合物处理的细胞的细胞生长和形态变化。
在相差显微术分析中，使用装配有Spot Insight数码相机（NDS Inc.）和10x相差目镜的VistaVision倒置显微镜（VWR Inc.）分析细胞生长和形态。
在本实施例中，用0、2、4、6、8、12或16微摩YW3-56处理U2OS细胞24小时。如图5所示，YW3-56处理以浓度依赖方式减少培养物中U2OS细胞密度。
当施加8-16微摩YW3-56时，细胞逐渐失去其与培养皿的吸附并且漂浮。YW3-56处理后，在U2OS细胞中为检测到凋亡细胞的显著特征，如染色质浓缩和断裂。出乎意料地，在大多数YW3-56处理的细胞中观察到大而清晰的泡状结构，如图5中的小插图所示。除U2OS细胞之外，本发明化合物还可有效防止其他癌症细胞类型的生长，如乳腺癌细胞、结肠癌细胞等。
实施例12
YW3-56通过自体吞噬诱导细胞死亡，自体吞噬是一个其中通过与溶酶体融合来降解细胞蛋白质和细胞器的细胞死亡过程。裂解LC3-I以产生快速移动的亚型LC3-II是特征性的自噬过程事件。如图6中的蛋白质印迹所示，在YW3-56处理后，以浓度依赖的方式诱导LC3裂解。
基本上如Li,P.et al.,Oncogene29(21),3153-3162(2010)中所述进行蛋白质印迹和免疫染色。蛋白质印迹中所用抗体为适合浓度的抗p53的抗体(Sigma)、抗PAD4的抗体、抗p21的抗体(Sigma)、抗PUMA的抗体(Calbiochem)、抗SESN2的抗体(Abcam)、抗p70S6K的抗体(Cell Signaling)、抗p70S6K-pT389的抗体(Cell Signaling)、抗LC3的抗体(CellSignaling)和抗β-肌动蛋白的抗体(Sigma)。抗LC3B的抗体(Cell Signaling)用于免疫染色。用DNA染料Hoechst对DNA进行染色.
在YW3-56处理后的U2OS细胞内（而非对照细胞内）的多个大斑点中检测LC3染色，如图7中所示，这表明YW3-56处理后形成自噬体及自噬溶酶体。
用6微摩YW3-56处理U2OS细胞24小时，用2%戊二醛在0.1摩磷酸盐缓冲液（pH7.4）中固定。对U2OS细胞形态的透射电子显微术分析是使用Penn State Electron MicroscopyFaciliy的服务进行的。进行透射电子显微术分析，并且如图8所示，在YW3-56处理的细胞内（而非对照细胞内）检测到多个含有内吞膜-和细胞器-结构的较大囊泡（具有自噬体及自噬溶酶体的结构特征）。
在YW3-56处理的细胞内检测具有自噬体或自噬溶酶体的特征的不同结构（由箭头标出）。以低分辨率和高分辨率示出了两个代表性的细胞。
实施例13
PAD4抑制剂抑制体内癌症生长。
在本实施例中采用良好确立的肉瘤S180细胞来源的小鼠肿瘤模型，以确定本发明PAD4抑制剂对小鼠中肿瘤生长的作用。
基本上如Wang,W.et al.,Mol.Biosyst.,2011,7:766-772中所述，用S180腹水肿瘤细胞通过皮下注射形成实体瘤。简要地说，为初始化皮下肿瘤，从荷瘤小鼠获得腹水形式的细胞，其每周顺序移植一次。通过在在右腋窝上的皮肤下注射0.2毫升含有1x107活的肿瘤细胞的0.9%盐水移植皮下肿瘤。移植24小时后，将雄性ICR小鼠随机分成数个实验组。阳性对照组中的小鼠每天腹膜内注射溶于0.2毫升0.9%盐水中的2毫克／千克的多柔比星，连续7天。阴性对照组中的小鼠每天腹膜内注射0.2毫升0.9%盐水，连续7天。实验组中的小鼠每天腹膜内注射YW3-56（10毫克／千克）、SAHA（5毫克／千克）或YW3-56（5毫克／千克）和SAHA（2.5毫克／千克）的组合，连续7天。每天记录小鼠体重。最后一次给药24小时后，对所有小鼠的称重，处死，立即解剖以获得并称量肿瘤和重要器官的重量。
如图9中所示，MTT测定法中YW3-56对S180细胞的生长抑制IC50为约10-15微摩。
RT-qPCR确认了YW3-56处理以浓度依赖的方式诱导了p53及其靶基因（包括sestrin1（SESN1）和sestrin2（SESN2））的表达。用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）按生产商的说明书提取RNA。用qScript cDNA SuperMix（Quanta Biosciences）按生产商的说明书把1微克RNA反转录成cDNA。用SYBR Green SuperMix（Quanta Biosciences）在StepOnePlusReal－Time PCR System（Applied Biosystems）中进行定量PCR。图10为示出在S180细胞中，YW3-56以及浓度依赖的方式诱导的p53及其靶基因的表达。
在10毫克／千克体重的YW3-56注射（每两天注射，持续3个月）后，p53及其靶基因在小鼠肝脏和脾脏中的表达。
图11a和图11b示出了小鼠中长期YW3-56处理的作用。将两只裸鼠模拟注射或注射YW3-56（持续3个月）。RT-qPCR分析对照和YW3-56处理小鼠中p53及其靶基因的mRNA水平。如果用2倍表达变化作为截止值，如图11a所示，没有检测到脾脏中基因表达的变化。图11b示除了对处理的小鼠和模拟处理的小鼠的肝脏中p53及其靶基因表达的RT-qPCR分析的结果。检测到p53和p21mRNA的大约2倍的增加，而在肝脏样品中检测到PUMA和OKL38的大约2倍的降低，表明YW3-56处理后的肝脏中基因表达的某些变化。然而，这些变化处于较低水平，没有观察到肝脏的重量和形态的明显变化。
如图12中所示，每天腹膜内注射浓度为10毫克／千克小鼠体重的YW3-56，持续1周，S180肿瘤生长下降到以等张盐水注射的对照组的约51.5%。
SAHA（也叫做Vorionostat）是美国FDA批准的用来治疗皮肤T细胞淋巴瘤的药物，SAHA通过抑制HDAC来增加蛋白乙酰化和增加肿瘤抑制基因的表达。作为比较和评估YW3-56作用的参照，每天注射浓度为5毫克／千克体重的HDAC抑制剂SAHA，持续1周。如图12中所示S180来源的肿瘤的生长下降对照组的约44.6%。
因为PAD4和HDAC2合作抑制p53靶基因的表达，在本实施例中测试了PAD4抑制剂和HDAC2抑制剂对肿瘤生长的协同作用。注射均为其单独使用时的一半剂量的YW3-56和SAHA的混合物，如图12中所示，肿瘤生长下降到对照组的约27.1%，证明这些抑制剂的协同作用。与常用化疗药物多柔比星相比，如图12中所示，YW3-56和SAHA的混合物显示出与以为2毫克／千克体重浓度施加的多柔比星接近的癌症生长抑制作用。
未使用或使用YW3-56、SAHA、YW3-56+SAHA或多柔比星处理的小鼠的体重和重要器官的重量。
图13A-13F示出了整个身体的重量，图13A；大脑，图13B；心脏，图13C；肝脏，图13D；肾脏，图13E；脾脏，图13F；重量参数是在以下列物质每日腹膜内注射1周后的小鼠中测定的：对照PBS、10毫克／千克体重剂量的YW3-56、5毫克／千克体重的SAHA、5毫克／千克体重的YW3-56和2.5毫克／千克体重的SAHA的混合物、或2毫克／千克体重的多柔比星。（f）中的＊表明多柔比星处理后脾脏重量的下降。
如图13B－13F中所示，单独的SAHA或SAHA和YW3-56的混合物均未对小鼠的生长和重要器官的大小产生损害。相反，如图13B－13F中所示，多柔比星处理后脾脏重量下降为对照小鼠的约50%，表明与直接抑制细胞周期的抑制剂相比，靶向表观遗传学通路的抑制剂毒性更小。
如图13中所示，进行包括在两只裸鼠中每天注射10毫克／千克体重的YW3-56的三个月的YW3-56处理，在YW3-56处理后小鼠身体大小和重要器官的大小均没有变化。并且，除肝脏中p53和p21mRNA略有升高外，在肝脏和脾脏组织中p53及其靶基因的水平基本变化，说明YW3-56对小鼠正常组织和器官的基因表达没有显著影响。
实施例14
PAD4参与染色质释放到细胞外空间形成染色质NET（嗜中性粒细胞胞外诱捕网）。
脂多糖（LPS）和豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（PMA）处理后，可在人嗜中性粒细胞中诱导NET形成（Brinkman et al.,2004）。为测试LPS处理时PAD4对于染色质解聚和NET形成是否很重要，进行了免疫染色实验。在LPS处理前，大约3.69%的PAD4+/+嗜中性粒细胞内因组蛋白H3瓜氨酸化被阳性染色，但没有检测到NET形成，而在PAD4-/-嗜中性粒细胞内没有观察到组蛋白H3瓜氨酸化或NET形成。LPS处理后，通过蛋白质印迹或免疫染色在PAD4+/+而非PAD4-/-嗜中性粒细胞中检测到组蛋白H3瓜氨酸化增加。PAD4+/+嗜中性粒细胞内，LPS处理后的DNA染色鉴别了不同程度的染色质解聚，包括膨胀的细胞核（用NIH image J软件进行的核区域定量表明大小增加约3.5倍）以及伸长的染色质。LPS处理后，LPS诱导的解聚的染色质可被组蛋白瓜氨酸化抗体和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗体阳性染色，说明这些结构确实是NET。PAD4抑制剂Cl-脒（Cl－amidine）抑制人HL-60粒细胞中NET样结构的形成（Wang et al.，2009）。类似地，用Cl－脒预处理PAD4+/+嗜中性粒细胞能显著减少LPS诱导的组蛋白瓜氨酸化和染色质解聚，说明PAD活性对于NET形成非常重要。另外，在PMA处理后，在PAD4+/+而非PAD4-/-嗜中性粒细胞中检测到染色质解聚和组蛋白瓜氨酸化。上述结果说明PAD4-/-小鼠嗜中性粒细胞在LPS和PMA处理后缺乏瓜氨酸化组蛋白或形成NET的能力。
活性氧簇（ROS）如H2O2诱导成人嗜中性粒细胞内形成NET（Fuchs et al.，2007；Neeli et al.，2008）而在新生儿嗜中性粒细胞未诱导形成NET（Yost et al.，2009），说明在调节NET形成时ROS下游的细胞应答非常重要。
为测试H2O2诱导的NET形成是否需要PAD4，用H2O2处理PAD4+/+和PAD4-/-嗜中性粒细胞。H2O2处理后，在PAD4+/+而非PAD4-/-嗜中性粒细胞中检测到组蛋白H3瓜氨酸化和NET形成，说明在NET形成过程中PAD4在H2O2刺激的下游发挥作用。
表II说明了LPS、PMA和H2O2处理在诱导PAD4+/+和PAD4-/-嗜中性粒细胞中染色质结构变化方面的效力。表II显示了在LPS、PMA和H2O2处理后，具有阳性组蛋白瓜氨酸化、增大的细胞核和NET形成的小鼠嗜中性粒细胞的百分比。PAD4是刺激嗜中性粒细胞后NET形成所必需的。
表II
在LPS、PMA和H2O2处理后，具有阳性组蛋白瓜氨酸化、增大的细胞核和NET形成的小鼠嗜中性粒细胞的百分比。
1如果细胞核直径比常规嗜中性粒细胞（直径约10微米）大超过1.5倍，则该细胞核被记录为增大的细胞核。
2增大的细胞核也被发现是组蛋白瓜氨酸化阳性的。
3如果染色质从细胞核挤出并伸长到细胞外空间，并且在LPS处理后通过嗜中性粒细胞弹性蛋白酶染色确认，则记录NET形成。
4NET被发现是组蛋白瓜氨酸化阳性的。
5示出了平均值和标准差（三次重复实验，每次实验计数超过500个细胞）。
6U.D.代表没有检测到。
7用200微摩Cl－脒处理嗜中性粒细胞30分钟，然后用LPS处理3小时。
未处理的嗜中性粒细胞中组蛋白瓜氨酸化和细胞核结构。未用各种刺激化合物处理之前，少量（大约3.69%）的PAD4+/+嗜中性粒细胞显示出较强的组蛋白瓜氨酸化（H3Cit）染色。刺激前，没有观察到染色质解聚。相比之下，PAD4-/-嗜中性粒细胞内没有观察到组蛋白瓜H3Cit和染色质解聚。在三次独立的重复试验中，对每种基因型，从5只小鼠体内纯化嗜中性粒细胞。脂多糖处理诱导PAD4+/+嗜中性粒细胞中的组蛋白瓜氨酸化和染色质结构变化。观察到膨胀的细胞核和延展的染色质。相反，LPS处理不诱导PAD4-/-嗜中性粒细胞中的组蛋白瓜氨酸化和染色质结构变化。LPS处理后的PAD4+/+嗜中性粒细胞中，组蛋白瓜氨酸化和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶共定位解聚的染色质。H2O2处理诱导PAD4+/+而非PAD4-/-嗜中性粒细胞中的组蛋白瓜氨酸化和染色质结构变化。在三次独立的实验中，每次从5只PAD4+/+或5只PAD4-/-小鼠中纯化外周血嗜中性粒细胞，分别用于LPS处理和H2O2处理。
虽然每种处理都刺激某种程度的细胞核形态变化和NET形成，但是在当前处理条件下，LPS是最有效的NET形成诱导剂。另外，反转录PCR（RT-PCR）实验显示嗜中性粒细胞中的PAD4耗尽不影响其他编码活性酶的PAD家族成员的表达，如PAD-1、PAD-2和PAD-3。综上所述，上述结果表明在用促炎性刺激物如LPS、PMA和H2O2处理时，PAD4对于小鼠嗜中性粒细胞中的NET形成非常重要。
实施例15
PAD4抑制剂通过抑制mTOR信号传导通路活化肿瘤抑制基因的表达并诱导自体吞噬。
在耗尽或未耗尽p53的U2OS细胞中进行MTT测定法以分析p53在YW3-56介导的细胞生长抑制和自体吞噬中的作用。
在5％CO2的培养箱内，在补加有1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的DMEM中培养U2OS和S180细胞。如Li,P.et al.,Regulation of p53target gene expression bypeptidylarginine deiminase4.Mol Cell Biol28(15),4745-4758(2008)中所述制备U2OSCtrl-shRNA和U2OS p53-shRNA细胞。YW3-56的浓度和处理时间如所述图和文本中所示进行。对于饥饿测定，首先用无血清的DMEM培养U2OS细胞16小时，然后加入10%的胎牛血清和不同浓度的YW3-56，将细胞再培养8小时，然后进行进一步分析。用XtremeGene siRNA转染试剂（Roche Inc.）将SESN2siRNA（Santa Cruz）和GFP siRNA（Dharmacon Inc.）转染到到U2OS细胞中。在存在siRNA的情况将细胞培养48小时，然后加入YW3-56，继续培养8小时，然后进行分析。
比较用相同浓度的抑制剂处理的细胞，p53耗尽后，YW3-56对细胞生长抑制的作用显著降低。图14A，通过shRNA进行p53耗尽的U2OS细胞和未耗尽p53的U2OS细胞的生长抑制的MTT测定，＊指出p<0.02。
通过蛋白质印迹和反转录定量PCR（RT-qPCR）分析确定p53mRNA和蛋白质的下降。图14B，示出使用反转录PCR（RT-qPCR）法分析的YW3-56对p53及其靶基因表达的作用。
响应于在DNA损伤、饥饿和应激信号，p53激活很多下游肿瘤抑制基因以调控细胞周期停止、凋亡和自体吞噬。为鉴别将YW3-56处理与细胞生长抑制联系起来的分子，进行蛋白质印迹和RT-qPCR。YW3-56处理以药物剂量依赖的和p53依赖的方式在mRNA和蛋白质水平上均增加了细胞周期抑制基因和促凋亡基因（如PUMA）的表达。
因为YW3-56处理的一个显著作用是诱导自体吞噬，研究了将YW3-56处理与自体吞噬之间的分子联系。
另外，在p53耗尽的细胞中Sestrin1和Sestrin2的基础和诱导表达的能力在mRNA和蛋白质水平上均降低。
高浓度YW3-56仍然能够在p53耗尽的细胞中诱导Sestrin1和Sestrin2，说明这些启动子在YW3-56处理后被较低水平的p53或可能的其他因子所激活。
图14C示出在p53耗尽的U2OS细胞中和无p53耗尽的U2OS细胞中，YW3-56处理后，检测到的对p21、PUMA和Sestrin2表达的诱导。Sestrin2诱导的同时，p70S6K磷酸化受到抑制，LC3蛋白裂解被诱导。
图14D示出了对p53-sestrin2-mTOR信号传导通路的说明。Sestrin2与TSC1/2形成复合体来抑制mTOR信号传导及随后的p70S6K磷酸化，从而提供一个连接YW3-56与自体吞噬的分子机制。
p53直接结合在SESN2启动子上来调节其表达。
进行染色质免疫沉淀实验用来测试p53和组蛋白Arg修饰是否直接调节SESN2基因启动子。基本上如Li,P.et al.,Mol.Cell Biol.,28(15),4745-4758(2008)所述进行ChIP实验。ChIP中使用的抗体为抗p53的抗体（Sigma）、抗PAD4的抗体、抗H3Cit的抗体（Abcam）和抗H3R17Me的抗体（Abcam）。设计多对跨越Sesn2不同区域的引物来家别SESN2基因上的p53结合位点。在未处理的U2OS细胞中，p53结合在＋733位置相对较多，而在紫外线放射诱导的DNA损伤后，p53与该位点的结合显著升高。在YW3-56处理8小时后，Sesn2基因的＋733位置处的p53结合增加了超过4倍，同时组蛋白H3Arg17甲基化也增强了（图14G，上图）。相反，在YW3-56处理后，在＋733位置处的PAD4结合和组蛋白H3瓜氨酸化（H3Cit）均降低了。ChIP结果支持一个模型：YW3-56处理后，p53与Sesn2启动子结合，而PAD4与Sesn2启动子分离，进而造成H3Cit降低和H3R17Me增加，以促进SESN2的表达。
数个p53靶基因，如DRAM、Sestrin1和2，参与介导p53激活后的自体吞噬。图14B显示在U2OS细胞中，YW3-56处理后DRAM mRNA没有变化。相反，YW3-56处理后，sestrin1和2的mRNA（图14B）和Sestrin2蛋白质水平（图14C）以浓度依赖的方式显著升高。
图14E显示在血清饥饿或刺激时，在U2OS细胞中，YW3-56对Sestrin2的诱导和对p70S6K磷酸化的抑制。图14F显示YW3-56处理前和处理后，Sestrin2耗尽对p70S6K磷酸化的作用。
图14G，在以8微摩YW3-56处理前和处理8小时后，对p53和PAD4与sestrin2启动子的结合以及组蛋白H3R17Me和H3Cit修饰的ChIP分析。示出了平均值和标准差（n=2x3）（＊标明p<0.005）。
实施例16。
YW3-88和BL1-07对p53及其靶基因表达的诱导。
图15A显示在以不同浓度YW3-88处理后，用RT-qPCR分析测量U2OS细胞中p53及其靶基因的mRNA水平的变化。比较每种基因的相对丰度，以β-肌动蛋白作为参照。在以12微摩浓度的YW3-88处理后，检测到几个p53靶基因（如p21、GADD45、PUMA、OKL38、DRAM、和Sestrin2）增加。图15B显示通过蛋白质印迹分析的YW3-88处理后U2OS细胞中p53、p21和PUMA蛋白的量。检测到p21和PUMA蛋白的增加。图15C显示以不同浓度BL1-07处理后，用RT-qPCR分析测量了p53及其靶基因的mRNA水平的变化。与其进行细胞杀伤的较高剂量需求相一致，甚至在较高浓度下，BL1-07诱导p53及其靶基因能力仍然较弱。
任何该申请所引用的专利和参考文献都分别注明，并跟参考文献中的引用格式保持一致。
该申请所述化合物和使用方法是现有结果的代表，例证，而不是用来限制现有发明的范围。该领域的专家对该申请及其应用可有变通。这些变化和应用可发生在该申请所提供的发明范围内。

Claims (36)

1.一种组合物，包括一种或多种具有选自以下的结构式的化合物，及其盐、立体异构体或酰胺：
其中n为1或2；X为卤素；每个Y独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且，其中当Y为H，R2为苯环的时候，R1为除了甲基以外的脂肪族取代基或者R1为芳香族取代基；
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且R3为4-9个碳的、取代或无取代的、直链、支链或环状的烃基团；
2.权利要求1的组合物，其中所述具有结构式(I)的化合物选自：
3.权利要求1的组合物，其中所述化合物具有选自以下的结构式：
4.权利要求1的组合物，还包含可药用载体。
5.权利要求1的组合物，其中所述化合物具有以下结构式：
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基。
6.权利要求5的组合物，其中n为1；Y1和Y2均为氢；X为F或Cl。
7.权利要求5的组合物，其中所述化合物具有选自以下的结构式：
8.组合物在制备用于治疗患有或有风险患上癌症或自身免疫疾病的受试者的药物中的用途，其中所述组合物包含一种或多种具有选自以下的结构式的化合物，及其盐、立体异构体或酰胺：
其中n为1或2；X为卤素；每个Y独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且R3为4-9个碳的、取代或无取代的、直链、支链或环状的烃基团；
9.权利要求8的用途，其中所述具有结构式(I)的化合物选自：
10.权利要求8的用途，其中所述组合物包含选自以下的化合物：
11.权利要求8的用途，其中所述组合物包含具有以下结构式的化合物：
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基。
12.权利要求11的用途，其中n为1；Y1和Y2均为氢；X为F或Cl。
13.权利要求11的用途，其中所述化合物具有选自以下的结构式：
14.权利要求8的用途，其中所述受试者为人。
15.权利要求8的用途，其中所述癌症的特征在于一个或多个肿瘤抑制基因的病态水平或活性降低。
16.权利要求15的用途，其中所述肿瘤抑制基因为p53。
17.权利要求8的用途，其中给予受试者治疗有效量的组合物可检测地增加自体吞噬和/或降低癌症细胞的增殖。
18.一种联合药物，包含权利要求1-7任一项的组合物和额外的治疗剂。
19.权利要求18的联合药物，其中所述额外的治疗剂是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
20.权利要求19的联合药物，其中所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为SAHA。
21.化合物，及其盐、立体异构体或酰胺，以及其任意两种或多种的混合物，在制备作为PAD4抑制剂的药物中的用途，其中所述化合物具有选自以下结构式：
其中n为1或2；X为卤素；每个Y独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；
22.权利要求21的用途，其中所述具有结构式(I)的PAD4抑制剂选自：
23.一种商业化包装，包括：
一种或多种具有选自以下的结构式的PAD4抑制剂，及其盐、立体异构体或酰胺：
其中n为1或2；X为卤素；每个Y独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且R3为4-9个碳的、取代或无取代的、直链、支链或环状的烃基团；
24.权利要求23的商业化包装，其中所述具有结构式(I)的PAD4抑制剂选自：
25.权利要求23的商业化包装，其中所述PAD4抑制剂具有选自以下的结构式：
26.权利要求23的商业化包装，其中所述PAD4抑制剂具有以下结构式：
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基。
27.权利要求26的商业化包装，其中n为1；Y1和Y2均为氢；X为F或Cl。
28.权利要求26的商业化包装，其中所述PAD4抑制剂具有选自以下的结构式：
29.权利要求28的商业化包装，还包含选自以下的辅助组分：可药用载体、缓冲剂、稀释剂和复溶剂。
30.组合物在制备作为PAD4抑制剂治疗受试者的药物中的用途，其中所述组合物包含一种或多种具有选自以下结构式的化合物，及其盐、立体异构体或酰胺：
其中n为1或2；X为卤素；每个Y独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为H、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基；并且R3为4-9个碳的、取代或无取代的、直链、支链或环状的烃基团；
31.权利要求30的用途，其中具有结构式(I)的化合物选自：
32.权利要求30的用途，其中所述组合物包含选自以下的化合物：
33.权利要求30的用途，其中所述组合物包含具有以下结构式的化合物：
其中n为1或2；X为卤素；Y1和Y2均独立地为氢、卤素、O-连接的脂肪族取代基或N-连接的脂肪族取代基；R1为脂肪族取代基或芳香族取代基；R2为脂肪族取代基或芳香族取代基。
34.权利要求33的用途，其中n为1；Y1和Y2均为氢；X为F或Cl。
35.权利要求33的用途，其中所述化合物具有选自以下的结构式：
36.一种测定方法，包括：
使细胞与荧光PAD4抑制剂接触，并检测所述PAD4抑制剂的荧光，其中所述荧光PAD4抑制剂选自：
及其混合物、盐、立体异构体或酰胺。
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