CN105246887A - 香豆素衍生物以及用于治疗过度增生性疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

提供香豆素衍生物化合物和用于治疗过度增生性疾病(如癌症、多囊性肾病以及不同组织的纤维化(例如，特发性肺纤维化))的方法。所述方法包括向受试者施用如本文所述的化合物。本文还提供用于抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法。

Description

香豆素衍生物以及用于治疗过度增生性疾病的方法
优先权申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/788,398的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文。
背景
多种疾病涉及细胞的过度增殖。例如癌症是通常已知的过度增生性疾病。癌症是一大类异质疾病，其中一组细胞展示不受控制的生长，从而导致侵入并破坏相邻组织的侵袭。细胞经常转移，其中肿瘤细胞通过淋巴系统或通过血流扩散至体内的其他位置。癌症可由环境因素或遗传因素(或两者的组合)引起。导致癌症的常见环境因素包括烟草使用、不良饮食和肥胖、感染、辐射、缺乏身体活动以及环境污染物。这些环境因素可引起或增强细胞的遗传物质的异常。细胞繁殖是通常由几类基因(包括致癌基因和肿瘤抑制基因)严格调控的极其复杂的过程。这些调控基因中的异常/突变可导致癌症的发展。一小部分的癌症(大约百分之五至百分之十)是完全遗传性的。在2007年，癌症导致全球所有人死亡(790万)的约13％。随着越来越多的人活到老年并且随着民众生活方式变化在发展中国家发生，比例不断上升。
还存在其他形式的过度增生性疾病，如但不限于，多囊性肾病(PKD)和相关的囊性肾病。多囊性肾病(PKD或PCKD)是肾的囊性遗传性病症。存在两种类型的PKD：常染色体显性多囊性肾病(ADPKD)和不太常见的常染色体隐性多囊性肾病(ARPKD)。两种形式引起肾上皮细胞的过度增殖，但两种形式均不是癌症。它在人和一些其他动物中发生。PKD特征在于通常在两个肾中都存在多个囊肿(因此，“多囊性”)；然而，17％的病例最初呈现一个肾中的可观察到的疾病，其中大多数情况下进展为成人中的双侧疾病。囊肿很多并且是充满液体的，从而导致肾的重度增大。所述疾病还可损害肝、胰腺并且在一些罕见情况下，损害心脏和大脑的血管系统。PKD是最常见的威胁生命的遗传病以及透析和移植的主要遗传原因，从而影响全世界估计有1250万人。在一半患有PKD的人中，不存在疾病的家族史。然而，在显性形式的疾病中，它影响多个家族成员，具有变化的出现时间和严重程度的一些差异。
其他过度增生性疾病包括不同组织的纤维化。纤维化是器官或组织中过量纤维结缔组织的形成。纤维化可导致组织或器官的退化和/或如果纤维化变得分布广泛和具侵袭性，则组织或器官功能丧失。纤维化在哺乳动物中的许多疾病状态中起作用，所述疾病状态包括但不限于，肺纤维化、特发性肺纤维化、肝硬化、心内膜心肌纤维化、血管或椎管狭窄、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统性纤维化、克罗恩氏病、瘢痕疙瘩或陈旧性心肌梗塞、硬皮病/系统性硬化症、关节纤维化以及粘连性关节囊炎。
这类过度增生性疾病已经为人所知数十年；然而，有效的治疗仍然难以实现。
概述
提供香豆素衍生物化合物和用于治疗过度增生性疾病(如癌症、多囊性肾病以及不同组织的纤维化(例如，特发性肺纤维化))的方法。所述方法包括向受试者施用如本文所述的化合物。
一类CFTR纠正剂包括下式的化合物：
以及其药学上可接受的盐或前药。在此类化合物中，R1是氢、卤素、羟基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的C1-6烷基或取代的或未取代的杂环烷基；R2是氢、卤素、羟基、硝基、氰基、叠氮基、氰硫基、三氟甲基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羰基或取代的或未取代的C1-6烷基；R3是氢或取代的或未取代的C1-6烷基；R4是取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基；X是S或O；并且Y是O或NCH3。任选地，所述化合物选自由以下组成的组：
以及
其中R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、卤素、羟基、取代的或未取代的烷氧基、氰基、硝基、三氟甲基、取代的或未取代的羰基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C2-6烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的磺酰胺、取代的或未取代的磺酰基或取代的或未取代的硫代。任选地，R1和R2、R5和R6、R6和R7、R7和R8或R8和R9组合以形成取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
一类CFTR纠正剂包括下式的化合物：
以及其药学上可接受的盐或前药。在此类化合物中，L是杂芳基；并且R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
一类CFTR纠正剂包括下式的化合物：
以及其药学上可接受的盐或前药。在此类化合物中，X1、X2、X3和X4各自独立地选自CH和N；Y是O或NR，其中R是氢或甲基；R2是氢、C1-6烷基、卤素或三氟烷基；并且R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
一类CFTR纠正剂包括下式的化合物：
以及其药学上可接受的盐或前药。在此类化合物中，X1是O或NCH3；X2是CH或N；Y是O、NH或NCH3；并且R5、R6、R7、R8以及R9各自独立地选自氢和甲氧基。
一类CFTR纠正剂包括下式的化合物：
以及其药学上可接受的盐或前药。在此类化合物中，R1和R2各自独立地选自氢、取代的或未取代的氨基和取代的或未取代的羰基。
一类CFTR纠正剂包括下式的化合物：
以及其药学上可接受的盐或前药。在此类化合物中，X是CH2、NH或O。
本文还描述一种用于治疗受试者的过度增生性疾病的方法。用于治疗受试者的过度增生性疾病的方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的化合物。任选地，过度增生性疾病是癌症。任选地，过度增生性疾病是多囊性肾病。任选地，过度增生性疾病是纤维化(例如，特发性肺纤维化)。
本文还提供抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法。抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法包括使细胞与如本文所述的化合物相接触。任选的，所述两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白选自由以下组成的组：Hsp-90、Hsp-70、Hsc-70以及Hsp-40。任选地，所述方法在体外进行。任选地，所述方法在体内进行。
一个或多个实施方案的细节在以下附图和描述中阐述。其他特征、目的和优点将由说明书和附图以及权利要求书而显而易见。
附图说明
图1包括示出用于分析化合物的特性的生长曲线测定的一般方法的示意图(右侧的图)、原代人ADPKD过度增殖性培养物的图片(左上方的照片)以及转移性ARCaP-M细胞系的图片(左下方的照片)。
图2是示出化合物DBM228在囊性ADPKD细胞、前列腺癌细胞系以及肾癌细胞系中的存活力的曲线图。
图3是示出化合物DBM101在汇合的囊性ADPKD细胞、增殖性囊性ADPKD细胞、汇合的正常肾细胞以及增殖性正常肾细胞中的存活力的曲线图。
图4是示出用化合物DBM227、化合物DBM228、化合物DBM308、化合物DBM318、化合物DBM701、化合物DBM707、化合物DBM717以及化合物DBM328处理的骨髓瘤细胞的生长抑制的曲线图。
图5A是示出用化合物DBM101(001-2)、化合物DBM228(N828)、化合物DBM308(3-8Cl)以及化合物DBM328(3-8COOH)处理的克隆的多囊性肾组织细胞的生长抑制的曲线图。
图5B是示出用化合物DBM101(001-2)、化合物DBM228(N828)、化合物DBM308(3-8Cl)以及化合物DBM328(3-8COOH)处理的克隆的非囊性肾组织细胞的生长抑制的曲线图。
图6是示出用化合物DBM228、化合物DBM308、化合物DBM318、化合物DBM701、化合物DBM707、化合物DBM715以及化合物DBM328处理的原代人特发性肺纤维化肌成纤维细胞的生长抑制的曲线图。
图7是示出用化合物DBM701处理的原代人特发性肺纤维化肌成纤维细胞和原代人慢性阻塞性肺病(COPD)成纤维细胞的生长抑制的曲线图。
图8是示出用化合物DBM701处理的原代人特发性肺纤维化肌成纤维细胞的生长抑制的曲线图。
图9是示出在用紫杉醇、长春新碱和化合物DBM228处理之后多重耐药性NCI/ADR-RES卵巢癌细胞系的抑制的图。
图10是示出在用不同剂量的化合物DBM308(30nM、300nM和3μM)、替莫唑胺(TMZ)(500μM)以及DMSO处理之后原代人多形性成胶质细胞瘤细胞的神经球生长的图。
图11A包括示出用增加浓度的化合物DBM228(左上图：对照；右上图：40nM化合物DBM228；左下图：100nM化合物DBM228；右下图：400nM化合物DBM228)处理的U251MG成胶质细胞瘤细胞的图。
图11B是示出用化合物DBM228、化合物DBM318以及化合物DBM328处理的U251MG细胞中半胱天冬酶3/7活化的变化百分比的图。
图11C是示出在用紫杉醇、长春新碱、对照(化合物DBM328)、化合物DBM227、化合物DBM228、化合物DBM308、化合物DBM318、化合物DBM701、化合物DBM707以及化合物DBM715处理之后生物化学微管蛋白聚合的抑制的图。
图12包括在用化合物DBM228、化合物DBM328、化合物DBM308或DMSO媒介物对照处理之后人过度增殖性GBM癌细胞的细胞内信号传导分子磷光体阵列的结果(左上图)；对于p38α、JNKpan以及c-Jun磷酸化，化合物DBM228(002-N8-28)、化合物DBM308(003-8Cl)以及化合物DBM328(003-8COOH)的磷酸化百分比对比媒介物对照的曲线图(左下图)；针对c-Jun磷酸化的增强作用提供化合物DBM228(002-N8-28)的剂量响应作用(右上图)；以及c-Jun磷酸化的化合物DBM228(002-N8-28)的增强作用的作用的时间依赖性的曲线图。
详述
本文所述的香豆素衍生物化合物和方法适用于治疗过度增生性疾病。如本文所用，过度增生性疾病是涉及影响受试者的健康的失调的或未调控但加速的细胞生长(对比正常组织中的细胞的正常条件)的任何病症或病状。这种失调的或未调控且加速的细胞生长可能导致受试者的死亡。本文所述的化合物和方法适用于治疗过度增生性病症，所述过度增生性病症包括但不限于，癌症、多囊性肾病和纤维化(例如，特发性肺纤维化)。
I.化合物
本文所述的一类香豆素衍生物由式I：
以及其药学上可接受的盐或前药表示。
在式I中，R1是氢、卤素、羟基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的C1-6烷基或取代的或未取代的杂环烷基。
此外，在式I中，R2是氢、卤素、羟基、硝基、氰基、叠氮基、氰硫基、三氟甲基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羰基或取代的或未取代的C1-6烷基。
另外，在式I中，R3是氢或取代的或未取代的C1-6烷基。
此外，在式I中，R4是取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基。
此外，在式I中，X是S或O。
此外，在式I中，Y是O、NH或NCH3。
如本文所用，术语烷基和烯基包括直链的和支链的单价取代基。实例包括甲基、乙基、异丁基等。适用于本文所述的化合物和方法的这些基团的范围包括C1-C8烷基和C3-C8烯基。
杂烷基和杂烯基与烷基和烯基类似地定义，但可在主链内包含O、S或N杂原子或其组合。适用于本文所述的化合物和方法的这些基团的范围包括C1-C8杂烷基和C3-C8杂烯基。
术语环烷基包括具有单个环或多个稠环的环状烷基。实例包括环己基、环戊基乙基和金刚烷基。适用于本文所述的化合物和方法的这些基团的范围包括C3-C9环烷基。
术语杂环烷基与环烷基类似地定义，但可在环状主链内包含O、S或N杂原子或其组合。适用于本文所述的化合物和方法的这些基团的范围包括C4-C9杂环烷基。
芳基包括例如苯基和取代的苯基。杂芳基包含O、N或S杂原子，单独地或以五个或六个成员的环组合。具有一个杂原子的杂芳基的实例包括在任何可用碳原子上取代的或通过任何可用碳原子连接的吡啶基、噻吩基和呋喃基。具有多于一个杂原子的杂芳基的实例包括在任何可用碳原子上取代的或通过任何可用碳原子连接的嘧啶基、噁唑基和噻唑基。芳基和杂芳基可包括另外的稠合环。这类基团的实例包括在任何可用碳原子上取代的或通过任何可用碳原子连接的茚满基、萘基、苯并噻吩基、喹啉基以及其异构体。
以上提及的所有基团可以是未取代的或可被可为相同或不同的以下中的一个或多个取代。适当取代基的实例包括但不限于以下：烷氧基(例如，甲氧基)、烷基、芳基、羧酸盐、羧酸酯、氰基、卤素(例如，氯、溴、氟、碘)、杂芳基、硝基、氨基、烷基磺酰基、磺酰胺、反向磺酰胺和硫代。
在一些实例中，式I由结构I-A表示：
在结构I-A中，R1和R2是如以上针对式I所定义。
此外在结构I-A中，R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、卤素、羟基、取代的或未取代的烷氧基、氰基、硝基、三氟甲基、取代的或未取代的羰基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C2-6烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的磺酰胺、取代的或未取代的磺酰基或取代的或未取代的硫代。羰基可以是羧酸或酸衍生物。如本文所用，酸衍生物是指羧酸的功能性衍生物，例如像酯或酰胺。
在一些实例中，式I由结构I-B表示：
在结构I-B中，R1和R2是如以上针对式I所定义。
此外在结构I-B中，R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对结构I-A所定义。
在一些实例中，式I由结构I-C表示：
在结构I-C中，R1和R2是如以上针对式I所定义。
此外在结构I-C中，R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对结构I-A所定义。
在一些实例中，式I由结构I-D表示：
在结构I-D中，R1和R2是如以上针对式I所定义。
此外在结构I-D中，R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对结构I-A所定义。
任选地，结构I-A、I-B、I-C和I-D中的相邻R基团例如R1和R2、R5和R6、R6和R7、R7和R8或R8和R9可组合以形成取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
式I的实例包括以下化合物：
在化合物P1至P107中，R可以是卤素(例如，氯)。在一些实施方案中，所述化合物不是化合物DBM328。
本文所述的一类香豆素衍生物由式II：
以及其药学上可接受的盐或前药表示。
在式II中，L是杂芳基。
此外，在式II中，R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
在一些实例中，式II由结构II-A表示：
在结构II-A中，X是NH或O。
此外在结构II-A中，R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对式II所定义。
在一些实例中，式II由结构II-B表示：
在结构II-B中，R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对式II所定义。
在一些实例中，式II由结构II-C表示：
在结构II-C中，R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对式II所定义。
式II的实例包括以下化合物：
本文所述的一类香豆素衍生物由式III：
以及其药学上可接受的盐或前药表示。
在式III中，X1、X2、X3和X4各自独立地选自CH和N。
此外，在式III中，Y是O或NR，其中R是氢或甲基。
另外，在式III中，R2是氢、C1-6烷基、卤素或三氟烷基。任选地，R2是Cl或甲基。
此外，在式III中，R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
在一些实例中，式III由结构III-A表示：
在结构III-A中，R2、R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对式III所定义。
在一些实例中，式III由结构III-B表示：
在结构III-B中，R2、R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对式III所定义。
在一些实例中，式III由结构III-C表示：
在结构III-C中，R2、R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对式III所定义。
在一些实例中，式III由结构III-D表示：
在结构III-D中，R是氢或甲基。
此外，在结构III-D中，R2、R5、R6、R7、R8和R9是如以上针对式III所定义。
式III的实例包括以下化合物：
本文所述的一类香豆素衍生物由式IV：
以及其药学上可接受的盐或前药表示。
在式IV中，X1是O或NCH3。
此外，在式IV中，X2是CH或N。
另外，在式IV中，Y是O、NH或NCH3。
此外，在式IV中，R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
式IV的实例包括以下化合物：
本文所述的一类香豆素衍生物由式V：
以及其药学上可接受的盐或前药表示。
在式V中，R1和R2各自独立地选自氢、取代的或未取代的氨基和取代的或未取代的羰基。
式V的实例包括以下化合物：
本文所述的一类香豆素衍生物由式VI：
以及其药学上可接受的盐或前药表示。
在式VI中，X是CH2、NH或O。
式VI的实例包括以下化合物：
II.制备所述化合物的方法
本文所述的化合物可按多种方式制备。所述化合物可使用不同合成方法来合成。这些方法中的至少一些是合成有机化学领域中已知的。本文所述的化合物可从可容易获得的起始材料来制备。最佳反应条件可根据所使用的具体反应物或溶剂变化，但这类条件可由本领域的技术人员通过常规优化工序来确定。
对式I-VI的变化包括如针对每种化合物所描述的不同成分的添加、减少或移动。类似地，当一个或多个手性中心存在于分子中时，包括所有可能的手性变体。另外，化合物合成可涉及不同化学基团的保护和去保护。保护和脱保护的使用以及适当保护基团的选择可由本领域的技术人员确定。保护基团的化学可例如在Greene等,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第2版,Wiley&Sons,1991中找到，所述文献以引用的方式整体并入本文。
用于产生本文所述的化合物的反应可在溶剂中进行，所述溶剂可由有机合成领域中的技术人员选择。溶剂可在反应进行的条件下(即，温度和压力)大致上不与起始材料(反应物)、中间体或产物起反应。反应可在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。产物或中间体形成可根据本领域中已知的任何适合的方法进行监测。例如，可通过光谱手段如核磁共振光谱法(例如，1H或13C)、红外光谱法、分光光度测定法(例如，UV-可见)或质谱法或通过色谱法如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法来监测产物形成。
III.药物制剂
可在药物组合物中提供本文所述的化合物或其衍生物。取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域，以多种方式施用药物组合物。通过几种施用途径中的任何一种施用药物组合物，所述施用途径包括局部、口服、胃肠外、静脉内、关节内、腹膜内、肌肉内、皮下、皮内、腔内(例如，直肠、膀胱内、膀胱器官的腔)、经皮、肝内、颅内、喷雾/吸入或通过经由支气管镜检查安装。皮内施用包括在传入淋巴转运功能障碍的部位的部位处施用。任选地，通过口吸入、鼻吸入、鼻内粘膜施用或栓剂来施用药物组合物。所述药物组合物还可例如在炎症的部位(例如像发炎的关节)处注射或输注。通过吸入剂施用药学组合物可经由通过喷雾或液滴机制(例如呈气雾剂形式)递送来通过鼻或口进行。
取决于所意图的施用模式，药物组合物可以呈固体、半固体或液体剂型的形式，例如像片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉末、液体或悬浮液，优选是适于单次施用精确剂量的单位剂型。所述组合物将包括治疗有效量的本文所述的化合物或其衍生物与药学上可接受的载体的组合，并且此外可包括其他药用剂、药物剂、载体或稀释剂。所谓药学上可接受的意指不是生物学上或在其他方面不希望的材料，它可以连同所选择的化合物一起向个体施用而不会以有害的方式与含有它的药物组合物的其他组分引起不可接受的生物作用或相互作用。
如本文所用，术语载体涵盖任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域熟知的用于药物配制的其他材料。用于组合物的载体的选择将取决于组合物的意图施用途径。含有这些材料的药学上可接受的载体和制剂的制备在例如UniversityoftheSciences,Philadelphia,Lippincott,Williams&Wilkins,PhiladelphiaPa.,2005编著的Remington'sPharmaceuticalSciences，第21版中描述。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲液，如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和具有其他有机酸的缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如(ICI,Inc.；Bridgewater,NewJersey)、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM(BASF；FlorhamPark,NJ)。
适于胃肠外注射的含有本文所述的化合物或其衍生物的组合物可包含生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于复水成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。适合的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其适合的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯，如油酸乙酯。适当的流动性可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所要求的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。防止微生物作用可通过各种抗菌和抗真菌剂来促进，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可以包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，使可注射药物形式的吸收延长。
用于口服施用本文所述的化合物或其衍生物的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在这些固体剂型中，本文所述的化合物或其衍生物与以下混合：至少一种惰性的常用赋形剂(或载体)，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或(a)填充剂(filler)或填充剂(extender)，例如像淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂，例如像羧甲基纤维素、海藻酸盐(alignate)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)湿润剂，例如像甘油，(d)崩解剂，例如像琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液缓凝剂，例如像石蜡，(f)吸收加速剂，例如像季铵化合物，(g)润湿剂，例如像十六醇和单硬脂酸甘油酯，(h)吸附剂，例如像高岭土和膨润土，以及(i)润滑剂，例如像滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物还可以在使用如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的软填充和硬填充明胶胶囊中用作填充剂。
如片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可以制备成具有包衣和壳，如肠溶衣和本领域熟知的其他物质。它们可以含有遮光剂并且也可以是在肠道某个部分以延迟的方式释放一种或多种活性化合物的那些组合物。可以使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。活性化合物也可以是微囊封形式，如果合适，可具有一种或多种上述赋形剂。
用于口服施用本文所述的化合物或其衍生物的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型还可以含有本领域常用的惰性稀释剂，如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油类，具体来讲是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨醇的脂肪酸酯，或这些物质的混合物等。
除了这类惰性稀释剂之外，所述组合物还可以包括其他试剂，如润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂或芳香剂。
除了活性化合物之外，悬浮液还可以含有其他试剂，例如像乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶，或这些物质的混合物等。
用于直肠施用的本文所述的化合物或其衍生物的组合物任选是栓剂，它可通过使所述化合物与适合的无刺激性赋形剂或载体(如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，它们在常温下是固体但是在体温下是液体，并且因此在直肠或阴道腔中融化并且释放活性组分。
用于局部施用本文所述的化合物或其衍生物的剂型包括软膏、粉末、喷雾以及吸入剂。本文所述的化合物或其衍生物是在无菌条件下与生理学上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合的。眼用制剂、软膏、散剂和溶液也涵盖在所述组合物的范围之内。
所述组合物可以包括一种或多种本文中描述的化合物和药学上可接受的载体。如本文所用的术语药学上可接受的盐是指在合理的医学判断的范围内的本文所述的化合物或其衍生物的那些盐，它们适用于与受试者的组织相接触使用而没有不当的毒性、刺激、过敏反应等，与合理的益处/风险比率相称，并且对于它们的预定用途来说有效，以及可能时是指本文所述的化合物的两性离子形式。术语盐是指本文所述的化合物的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可在分离和纯化所述化合物期间原位制备或通过单独使游离碱形式的纯化化合物与适合的有机酸或无机酸反应并分离因此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、醋酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐甲磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐、甲烷磺酸盐和十二烷基磺酸盐等。它们可包括基于碱金属和碱土金属(如钠、锂、钾、钙、镁等)的阳离子，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。(参见S.M.Barge等,J.Pharm.Sci.(1977)66,1，其以引用的方式整体并入本文，至少针对其中所教导的组合物)。
施用本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐可使用治疗有效量的本文所述的化合物和组合物或如本文所述的其药学上可接受的盐持续有效治疗病症的时间段来进行。本文所述的化合物和组合物或如本文所述的其药学上可接受的盐的有效量可由本领域的普通技术人员确定，本文所述的化合物和其药学上可接受的盐或前药的有效量可由本领域中的普通技术人员确定，并且对于哺乳动物来说包括每天每千克体重约0.5至约200mg活性化合物的示例性剂量，这可以单次剂量或单独的分次剂量的形式施用，如每天1至4次。或者，剂量可以是每天每千克体重约0.5至约150mg活性化合物、每天每千克体重约0.5至100mg活性化合物、每天每千克体重约0.5至约75mg活性化合物、每天每千克体重约0.5至约50mg活性化合物、每天每千克体重约0.5至约25mg活性化合物、每天每千克体重约1至约20mg活性化合物、每天每千克体重约1至约10mg活性化合物、每天每千克体重约20mg活性化合物、每天每千克体重约10mg活性化合物，或每天每千克体重约5mg活性化合物。本领域技术人员将理解，对于任何具体的受试者来说，具体的剂量水平和给药频率可以改变，并且将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、所述化合物的代谢稳定性和作用时长、受试者的物种、年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、施用模式和时间、排泄率、药物组合和具体病状的严重程度。
IV.使用方法
本文所述的方法包括一种治疗受试者的过度增生性疾病的方法。这些方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药的步骤。当用于描述方法中化合物的量时，措辞“有效量”是指实现所需的药理学作用或其他作用的化合物的量，例如引起肿瘤生长速率降低的量。另外步骤可包括于本文所述的方法中。例如，所述方法还可另外包括选择患有过度增生性疾病的受试者以及向所述受试者施用如本文所述的一种或多种化合物的步骤。本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐适用于治疗人(包括但不限于，小儿和老人群体)和动物(例如，兽医应用)的过度增生性疾病。任选地，过度增生性疾病是癌症。任选地，过度增生性疾病是多囊性肾病。任选地，过度增生性疾病是特发性肺纤维化。
如以上所述，本文所述的化合物适用于治疗过度增生性疾病，包括癌症、多囊性肾病以及纤维化。本文所述的化合物不会显著抑制正常细胞类型或非增殖性细胞中的细胞增殖。
任选地，癌症是膀胱癌、脑癌、乳癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖系统癌症、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌或睾丸癌。
任选地，多囊性肾病是常染色体显性多囊性肾病(ADPKD)或常染色体隐性多囊性肾病(ARPKD)。治疗受试者的多囊性肾病的方法还可包括治疗或预防多囊性肾病的症状。症状可与ADPKD或ARPKD相关。例如，症状可包括脑动脉瘤，肝、胰腺和睾丸中的囊肿，尿路感染、高血压和结肠憩室。
任选地，纤维化是肺纤维化、特发性肺纤维化、肝硬化、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统性纤维化、克罗恩氏病、瘢痕疙瘩、陈旧性心肌梗塞、硬皮病/系统性硬化症、关节纤维化以及乳房、前列腺、血液、脑、肾、肝或皮肤的粘连性关节囊炎。在另一实施方案中，纤维化是特发性肺纤维化。
在本文所述的方法中，所治疗的受试者可用一种或多种另外的药剂进一步治疗。所述一种或多种另外药剂和本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药可以任何顺序以单一组合物(例如，作为混合物)或以分开组合物一起施用，包括同时施用以及最多相隔几天的时间上间隔的顺序来施用。所述方法还可包括多于单次施用所述一种或多种另外药剂和/或本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药。所述一种或多种另外药剂和本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药的施用可通过相同或不同的途径且同时或顺序地实现。
治疗剂包括但不限于化学治疗剂。化学治疗剂是有效抑制或阻止异常生长细胞的生长的化合物或组合物。因此，这种药剂可治疗性地用于治疗以不正常的细胞生长为标志的癌症以及其他疾病。化学治疗化合物的说明性实例包括但不限于，贝沙罗汀、吉非替尼、埃罗替尼、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、拓扑替康、依立替康、替莫唑胺、卡莫司汀、长春瑞滨、卡培他滨、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、硼替佐米、奥利莫森、六甲密胺、异环磷酰胺、CPT-11、deflunomide、环己酰亚胺、达卡巴嗪(dicarbazine)、天冬酰胺酶、米托坦(mitotant)、硫酸长春碱、卡铂、秋水仙碱、依托泊苷、美法仑、6-巯基嘌吟、替尼泊苷、长春花碱、抗生素衍生物(例如蒽环类，如阿霉素、脂质体阿霉素和己烯雌酚阿霉素、博莱霉素、柔红霉素以及更生霉素)；抗雌激素(例如，他莫昔芬)；抗代谢物(例如，氟尿嘧啶(FU)、5-FU、甲氨蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2B、谷氨酸、普卡霉素、巯基嘌呤以及6-硫鸟嘌呤)；细胞毒性剂(例如，卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌氮芥、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂、长春新碱和硫酸长春新碱)；激素类(例如，甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、乙炔雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲基睾酮、二磷酸已烯雌酚、率西祠米以及睾内酯)；氮芥衍生物(例如，美法仑(mephalen)、苯丁酸氮芥、二氯甲基二乙胺(氮芥)和噻替派)；以及类固醇(例如，倍他米松磷酸钠)。
治疗剂还可包括但不限于疼痛药物(例如，NSAID、曲马多、氯压定、麻醉剂以及类阿片)、降低血压的药剂(例如，抗高血压剂或利尿剂)以及抗生素。治疗剂还可包括脱氢可的松、咪唑硫嘌呤以及N-乙酰半胱氨酸。
任何上述治疗剂可以与本文所述的组合物的任何组合使用。伴随地(例如，作为混合物)、分开地但同时地(例如，通过分离的静脉管线进入同一受试者)或顺序地(例如，首先给予化合物或药剂之一，接着第二)。因此，术语组合用于指伴随、同时或顺序施用两种或更多种药剂。
如本文所述的方法和化合物适用于预防性治疗和治疗性治疗。对于预防性使用来说，在发作之前(例如，在过度增生性疾病的明显体征之前)、早期发作期间(例如，初始出现过度增生性疾病的体征和症状)或在发展过度增生性疾病之后向受试者施用治疗有效量的如本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐。预防性施用可在显现过度增生性疾病的症状之前的几天至几年发生。治疗性治疗涉及在诊断过度增生性疾病之后向受试者施用治疗有效量的如本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐。
本文所述的方法和化合物还适用于抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用。抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法包括使细胞与如本文所述的化合物相接触。任选的，所述两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白选自由以下组成的组：Hsp-90、Hsp-70、Hsc-70以及Hsp-40。任选地，所述方法在体外进行。任选地，所述方法在体内进行。
任选地，本文所述的方法和化合物可用于调控参与波形蛋白的磷酸化的激酶。例如，本文所述的方法和化合物可用于调控细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)，包括Cdk5。任选地，使用本文所述的方法和化合物调控参与波形蛋白的磷酸化的激酶可导致波形蛋白纤丝分解。任选地，波形蛋白纤丝分解可导致癌细胞的增加的细胞凋亡。
本文用于预防性和治疗性治疗的方法任选地包括选择患有过度增生性疾病或处于发展过度增生性疾病的风险的受试者。熟练的技术人员可使用例如各种预测和诊断方法作出这种决定，包括例如，疾病或病状的个人或家族史、临床测试(例如，成像、活组织检查、基因测试)等。
V.试剂盒
本文还提供用于治疗或预防受试者的过度增生性疾病的试剂盒。试剂盒可包括本文所述的任何化合物或组合物。例如，试剂盒可包括式I、式II、式III、式IV、式V、式VI的化合物或其组合。试剂盒还可包括一种或多种另外的药剂，如化学治疗剂、疼痛药物、降低血压的药剂(例如，抗高血压剂或利尿剂)、抗生素、脱氢可的松、咪唑硫嘌呤以及N-乙酰半胱氨酸。试剂盒可包括本文所述的任何化合物或组合物的口服制剂。试剂盒可包括本文所述的任何化合物或组合物的静脉内制剂。试剂盒可另外包括用于使用所述试剂盒的指导(例如，用于治疗受试者的说明书)、容器、用于施用化合物或组合物的装置(例如，注射器)和/或载体。
VI.筛选方法
提供筛选用于治疗过度增生性疾病的化合物的方法。所述方法涉及使细胞与待筛选的候选化合物相接触并且确定所述候选化合物对过度增殖性细胞的增殖的作用的步骤。所述方法可在体外或体内进行。所述方法提供筛选能够治疗至少部分地由过度增殖性细胞引起的疾病或病状的化合物的有效和可靠的方式。
任选地，所述方法可包括使过度增殖性细胞与候选药剂相接触；获得指示细胞生长的测量值，如但不限于细胞数目、细胞存活力、细胞周期进展、细胞凋亡频率或参与细胞凋亡过程的酶的活性；并且如果特性的测量值显著小于特性的基线值，则鉴别所述候选药剂为推定药剂。
在一个实施方案中，这种筛选测定可例如通过以下方式来进行：在适当的模型系统(如但不限于本文所述的那些系统)中测定指示细胞生长的测量值的抑制的量并且检测与不存在候选化合物时相比，在存在候选化合物下前述的水平或活性的差异。
各种筛选测定可与需要测量测试化合物对本文所讨论的疾病状态和病状的症状的作用的体内测定组合。
用于在筛选测定中使用的适合测试化合物可从任何适合的来源如常规化合物文库获得。测试化合物还可使用本领域中已知的组合文库方法中的多种方法中的任何一种来获得，包括生物文库、空间可寻址平行固相或液相文库、需要去卷积的合成文库方法、“一珠一化合物”文库方法以及使用亲合色谱法选择的合成文库方法。生物文库方法包括肽文库，而其他四种方法包括肽、非肽低聚物或化合物的小分子库。因此，几乎任何数量的化学提取物或化合物可使用本文所述的方法进行筛选。所述提取物或化合物的实例包括但不限于基于植物、真菌、原核或动物的提取物、发酵液和合成化合物以及现有化合物的修改。众多方法也可供用于产生任何数量的化学化合物的随机或直接合成(例如，半合成或全合成)，包括但不限于基于糖、脂质、肽、多肽和核酸的化合物。合成化合物文库和呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可商购的。此外，如果需要，根据本领域中已知的方法例如通过标准提取和分级方法来产生天然或合成产生的文库。此外，如果需要，任何文库或化合物可容易地使用标准化学、物理或生物化学方法进行修改。
用于合成分子文库的的方法的实例可在本领域中找到。化合物文库可呈现在溶液中或在珠、细菌、孢子、质粒或噬菌体上。
本公开的筛选测定特别适合于高通量形式，从而提供用于筛选例如小有机分子、肽、核酸分子等的组合文库的方式。
如本文所用，术语治疗(treatment)、治疗(treat)或治疗(treating)是指一种减少疾病或病状的一种或多种症状的方法。因此，在所公开的方法中，治疗可指所述疾病或病状的一种或多种症状的严重程度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％降低。例如，如果与对照相比，存在受试者的疾病的一种或多种症状或病征(例如，肿瘤大小或肿瘤生长速率)的10％减少，那么用于治疗疾病的方法被认为是治疗。如本文所用，对照是指未治疗的病状(例如，未用本文所述的化合物和组合物治疗的肿瘤细胞)。因此，与天然或对照水平相比，减少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或10％与100％之间的任何百分比减少。应当理解，治疗不一定是指疾病、病状或疾病或病状的症状的治愈或完全消除。
如本文所用，术语疾病或病症的预防(prevent)、预防(preventing)和预防(prevention)是指在受试者开始显示所述疾病或病症的一种或多种症状之前或约同时发生的行为，例如施用组合物或治疗剂，所述行为抑制或延迟所述疾病或病症的一种或多种症状的发作或严重程度。
如本文所用，对减少、降低或抑制的提及包括与对照水平相比，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的变化。所述术语可包括但不一定包括完全消除。
如本文所用，受试者意指哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物包括例如人；非人灵长类动物，例如，猿和猴子；牛；马；羊；大鼠；小鼠；猪；以及山羊。非哺乳动物包括例如鱼和鸟。
贯穿本申请，引用了各种公布。这些公布的公开内容整体特此以引用的方式并入本申请。
以下实施例意图进一步说明本文所述的方法和组合物的某些方面，而不意图限制权利要求书的范围。
实施例
实施例1：合成
DBM-308的合成方案在方案1中示出。
方案1：
DBM-E-1的合成方案在方案2中示出。
方案2：
DBM-E-2的合成方案在方案3中示出。
方案3：
根据以下所列出的程序制备DBM-E-3并且合成方案在方案4中示出。
方案4：
使3-(2-溴乙酰基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(150mg，0.54mmol)和1-溴-2-乙氧基苯(108mg，0.54mmol)在微波中在Cs2CO3(528mg，1.62mmol)、Pd2(dba)3(40mg，0.054mmol.)、xantphose(60mg，0.108mmol)以及二噁烷(2mL)存在下在160℃下反应15分钟。然后将所得到的产物通过制备型-HPLC进行纯化以得到呈黄色固体的8-氯-3-(2-(2-乙氧基苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(20mg，10％)。ESI-MS(EI+,m/z):399.1[M+1]+；1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.40(t,J＝7Hz,3H),4.14(q,J＝7Hz,2H),6.99-7.05(m,3H),7.39(t,J＝8Hz,1H),7.76-7.79(m,2H),7.93(t,J＝7Hz,1H),8.48-8.49(m,1H),8.65(s,1H),9.54(s,1H)。
根据以下所列出的程序制备DBM-E-4并且合成方案在方案5中示出。
方案5：
步骤1：N,N-二甲基-2-(2-硝基苯氧基)乙烷胺：
在0℃下向2-硝基苯酚(13.9g，10mmol)、2-(二甲基氨基)乙醇(10.7g，12mmol)和PPh3(29g，11mmol)于干燥THF(200mL)中的溶液逐滴添加DIAD(22g，11mmol)。然后，将混合物在室温下搅拌17小时。除去溶剂。将残余物溶解于1NHCl水溶液中并且用EtOAc洗涤。将水层用饱和NaHCO3中和并且用EtOAc(2x)萃取。收集有机层，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)且浓缩以得到呈黄色油状物的N,N-二甲基-2-(2-硝基苯氧基)乙烷胺(2.1g，10％)。ESI-MS(EI+,m/z):211.0[M+1]+。
步骤2：2-(2-二甲基氨基)乙氧基)苯胺：
向N,N-二甲基-2-(2-硝基苯氧基)乙烷胺(1.0g，4.76mmol)于EtOH(10mL)中的溶液中添加Pd/C(800mg，10％)。将混合物在50℃下在H2下搅拌2小时。将反应混合物冷却至室温并且然后过滤。浓缩滤液以得到呈黄色油状物的2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯胺(730mg，85％)。ESI-MS(EI+,m/z):181.0[M+1]+。
步骤3：N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺：
使2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯胺(550mg，3mmol)和苯甲酰基异硫氰酸酯(727mg，3.6mmol)反应。然后将所得到的混合物通过过滤纯化以提供呈白色固体的N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(360mg，35％)。ESI-MS(EI+,m/z):344.0[M+1]+。
步骤4：1-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)硫脲：
使N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(343mg，1.0mmol)与NaOMe于MeOH(1mL，30％)中的溶液反应，并且将所得混合物通过过滤纯化以提供呈白色固体的1-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-苯基)硫脲(160mg，67％)。ESI-MS(EI+,m/z):240.0[M+1]+。
步骤5：8-氯-3-(2-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
使3-(2-溴乙酰基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(约279mg，50％，0.53mmol)和1-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)硫脲(106mg，0.44mmol)在乙醇中在80℃下反应。然后将产物通过过滤纯化以提供呈黄色固体的8-氯-3-(2-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(60mg，31％)。ESI-MS(EI+,m/z):442.0[M+1]+；1HNMR(500MHz,CF3COOD):δ3.64(s,6H),4.27(s,2H),5.02(s,2H),7.65(d,J＝8.0Hz,1H),7.75(t,J＝8.0Hz,1H),7.94-7.99(m,2H),8.12(s,1H),8.14(d,J＝8.0Hz,1H),8.20(d,J＝7.5Hz,1H),8.33(d,J＝7.5Hz,1H),9.03(s,1H)
根据以下所列出的程序制备DBM-E-5并且合成方案在方案6中示出。
方案6：
步骤1：N-(3,5-二甲基苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺：
使于乙腈中的3,5-二甲基苯胺(2.42g，20mmol)和苯甲酰基异硫氰酸酯(4.24g，26mmol)在0℃至室温的温度下反应17小时。然后将所得到的混合物通过过滤纯化以提供呈白色固体的N-(3,5-二甲基苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(3.5g，61％)。ESI-MS(EI+,m/z):285.1[M+1]+。
步骤2：1-(3,5-二甲基苯基)硫脲：
使N-(3,5-二甲基苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(3.5g，12.3mmol)和NaOMe于MeOH(4mL,30％)中的溶液在室温下混合两小时。然后将所得到的混合物通过过滤纯化以提供呈白色固体的1-(3,5-二甲基苯基)硫脲(1.1g，51％)。ESI-MS(EI+,m/z):181.0[M+1]+。
步骤3：8-氯-3-(2-(3,5-二甲基苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
使3-(2-溴乙酰基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(约1g，50％，1.67mmol)和1-(3,5-二甲基苯基)硫脲(600mg，3.33mmol)在乙醇中在80℃下反应。然后将产物通过过滤纯化以提供呈黄色固体的8-氯-3-(2-(3,5-二甲基苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(500mg，78％)。ESI-MS(EI+,m/z):383.0[M+1]+；
步骤4：8-氯-3-(2-((3,5-二甲基苯基)(甲基)氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
在0℃下向8-氯-3-(2-(3,5-二甲基苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(150mg，0.39mmol)于干燥DMF(10mL)中的溶液添加NaH(31mg，60％，0.78mmol)。然后将混合物在0℃下搅拌15分钟。添加MeI(56mg，0.39mmol)并且将混合物在室温下搅拌2小时。将反应溶液用饱和NH4Cl溶液淬灭，用EtOAc(80mL)稀释，用H2O(2x)和盐水(2x)洗涤，干燥(Na2SO4)、过滤且浓缩以得到呈黄色固体的8-氯-3-(2-((3,5-二甲基苯基)(甲基)氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(60mg，39％)。ESI-MS(EI+,m/z):397.0[M+1]+；1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ2.31(s,6H),3.56(s,3H),6.98(s,1H),7.13(s,2H),7.39(t,J＝8.0Hz,1H),7.63(s,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(d,J＝7.5Hz,1H),8.69(s,1H)。
根据以下所列出的程序制备DBM-E-6并且合成方案在方案7中示出。
方案7：
步骤1：3-(2-氨基噁唑-4-基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮：
向烘箱干燥的微波小瓶中添加3-(2-溴乙酰基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(600mg，50％，1mmol)、脲(90mg，1.5当量)以及干燥NMP(2mL)。将小瓶加盖并且用氮吹扫。将反应混合物在微波照射下加热至150℃持续30分钟。然后，使混合物冷却且通过制备型-HPLC纯化以得到呈淡黄色固体的3-(2-氨基噁唑-4-基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(150mg，57％)。ESI-MS(EI+,m/z):263.0[M+1]+
步骤2：8-氯-3-(2-(3,5-二甲基苯基氨基)噁唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
向烘箱干燥的微波小瓶中添加3-(2-氨基噁唑-4-基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(100mg，0.38mmol)、1-溴-3,5-二甲苯(702mg，3.8mmol)、Cs2CO3(249mg、0.76mmol)、Pd2(dba)3(35mg，0.038mmol)，xantphose(44mg，0.076mmol)和干燥二噁烷(3mL)。将小瓶加盖并且用氮吹扫。将反应混合物在微波照射下加热至100℃持续1小时。使混合物冷却且用EtOAc(100mL)稀释，用H2O(2x)和盐水(2x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤且浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～10％)纯化以得到粗产物。将粗产物通过制备型-HPLC纯化以得到呈黄色固体的8-氯-3-(2-(3,5-二甲基苯基氨基)噁唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(17mg，12％)。ESI-MS(EI+,m/z):367.1[M+1]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.30(s,6H),6.64(s,1H),7.34(s,1H),7.41(t,J＝8.0Hz,2H),7.77-7.79(m,1H),7.95(d,J＝7Hz,1H),8.20(s,1H),8.50(s,1H),10.18(s,1H)。
根据以下所列出的程序制备DBM-E-7并且合成方案在方案8中示出。
方案8：
步骤1：3-氯-2-(甲基氨基)苄腈：
在0℃下向2-氨基-3-氯苄腈(5.0g，32.9mmol)于干燥DMF(60mL)中的溶液添加NaH(1.97g，60％，49.3mmol)。然后，将混合物在0℃下搅拌15分钟。添加MeI(4.67g，32.9mmol)并且将混合物在室温下搅拌2小时。将反应溶液用饱和NH4Cl溶液淬灭，用EtOAc(200mL)稀释，用H2O(2x)和盐水(2x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤且浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～5％)纯化以得到呈白色固体的3-氯-2-(甲基氨基)苄腈(4.8g，88％)。ESI-MS(EI+,m/z):167.0[M+1]+。
步骤2：3-氯-2-(甲基氨基)苯甲醛：
在-78℃下向3-氯-2-(甲基氨基)苄腈(4g，24mmol)于干燥DCM(50mL)中的溶液添加DIBAL-H(1M，36mL，36mmol)。然后，将混合物在室温下搅拌17小时。将反应混合物用饱和柠檬酸溶液淬灭，用DCM(150mL)稀释，用H2O(2x)和盐水(2x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤且浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～3％)纯化以得到呈黄色油状物的3-氯-2-(甲基氨基)苯甲醛(1.4g，34％)。ESI-MS(EI+,m/z):170.0[M+1]+。
步骤3：3-乙酰基-8-氯-1-甲基喹啉-2(1H)-酮：
在120℃下将3-氯-2-(甲基氨基)苯甲醛(800mg，4.7mmol)于二甲苯(30mL)中的溶液用2,2,6-三甲基-4H-1,3-二噁英-4-酮(6.7g，47mmol)处理。将反应混合物在120℃下加热2小时并且然后冷却至室温。除去溶剂，并且将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～3％)纯化以得到呈黄色固体的3-乙酰基-8-氯-1-甲基喹啉-2(1H)-酮(500mg，45％)。ESI-MS(EI+,m/z):236.0[M+1]+；1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ2.61(s,3H),3.86(s,3H),7.31(t,J＝8Hz,1H),7.79-7.81(m,1H),7.92-7.94(m,1H),8.41(s,1H)。
步骤4：3-(2-溴乙酰基)-8-氯-1-甲基喹啉-2(1H)-酮：
在室温下向3-乙酰基-8-氯-1-甲基喹啉-2(1H)-酮(432mg，1.84mmol)于CHCl3(20mL)中的溶液添加CuBr2(404mg，1.84mmol)。将混合物在70℃下搅拌17小时。蒸发溶剂，将粗产物用EtOAc(100mL)稀释，用水(2x)、盐水(2x)洗涤，干燥(Na2SO4)，并且浓缩以提供3-(2-溴乙酰基)-8-氯-1-甲基喹啉-2(1H)-酮(约500mg，50％)，其直接用于下一步骤。ESI-MS(EI+,m/z):313.9[M+H]+。
步骤5：8-氯-3-(2-(3,5-二甲基苯基氨基)噻唑-4-基)-1-甲基喹啉-2(1H)-酮：
使3-(2-溴乙酰基)-8-氯-1-甲基喹啉-2(1H)-酮(约200mg，50％，0.32mmol)和1-(3,5-二甲基苯基)硫脲(115mg，0.64mmol)在乙醇中在80℃下反应。然后将产物通过过滤纯化以提供呈黄色固体的8-氯-3-(2-(3,5-二甲基苯基氨基)噻唑-4-基)-1-甲基喹啉-2(1H)-酮(50mg，50％)。ESI-MS(EI+,m/z):396.0[M+1]+；1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ2.31(s,6H),3.94(s,3H),6.64(s,1H),7.29-7.35(m,3H),7.69-7.71(m,1H),7.81(d,J＝7.0Hz,1H),7.99(s,1H),8.58(s,1H),10.16(s,1H)。
根据以下所列出的程序制备DBM-E-8并且合成方案在方案9中示出。
方案9：
步骤1：8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮：
将3-氯-2-羟基苯甲醛(1g，6.4mmol)和CH3COOH(1.3g，12.8mmol)于Ac2O(45mL)中的混合物加热至175℃持续6小时。然后使混合物冷却至室温。收集所形成的的沉淀物以得到呈褐色固体的8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(1.02g，88％)。ESI-MS(EI+,m/z):181.0[M+1]+。
步骤2：3-溴-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮：
向8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(1g，5.56mmol)和CH3COOK(1.09g，11.1mmol)于CH3COOH(30mL)中的混合物添加Br2(4.4g，27.8mmol)。将混合物在50℃下搅拌4小时。将反应混合物冷却至室温并且倒入水(100mL)中且过滤以得到棕色固体。将粗产物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～5％)纯化以得到呈黄色固体的3-溴-8-氯-2H-苯并吡喃2-酮(640mg，45％)。ESI-MS(EI+,m/z):260.9[M+1]+。
步骤3：8-氯-3-(噻唑-2-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
将3-溴-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(620mg，2.4mmol)、2-(三丁基甲锡烷基)噻唑(1.8g，4.8mmol)和Pd(PPh3)4(276mg，0.24mmol)于干燥二噁烷(20mL)中的混合物加热至100℃持续6小时。然后将反应混合物冷却至室温并且浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～30％)纯化以得到呈黄色固体的8-氯-3-(噻唑-2-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(500mg，79％)。ESI-MS(EI+,m/z):264.0[M+1]+。
步骤4：3-(5-溴噻唑-2-基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮：
向8-氯-3-(噻唑-2-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(400mg，1.52mmol)和CH3COOK(447mg，4.56mmol)于CH3COOH(15mL)中的混合物添加Br2(479mg，3.04mmol)。然后，将混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物倒入水(100mL)中且过滤以得到棕色固体。将粗产物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～20％)纯化以得到呈黄色固体的3-(5-溴噻唑-2-基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(250mg，48％)。ESI-MS(EI+,m/z):342.0[M+1]+。
步骤5：8-氯-3-(5-(3,5-二甲基苯基氨基)噻唑-2-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
使3-(5-溴噻唑-2-基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(100mg，0.3mmol)和3,5-二甲基苯胺(182mg，1.5mmol)在微波中在Cs2CO3(293mg，0.9mmol)、Pd2(dba)3(21mg，0.03mmol.)、xantphose(52mg，0.09mmol)以及二噁烷(2mL)存在下在150℃下反应25分钟。然后将混合物通过制备型-HPLC纯化以提供呈黄色固体的8-氯-3-(5-(3,5-二甲基苯基氨基)噻唑-2-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(25mg，22％)。ESI-MS(EI+,m/z):383.1[M+1]+；1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ2.25(s,6H),6.56(s,1H),6.74(s,2H),7.43(t,J＝8Hz,1H),7.63(s,1H),7.79-7.81(m,1H),7.93-7.94(m,1H),8.81(s,1H),9.15(s,1H)。
根据以下所列出的程序制备DBM-E-10并且合成方案在方案10中示出。
方案10：
步骤1：N-(3,5-二甲基苯基)噻唑-2-胺：
将2-溴噻唑(3.26g，20mmol)、3,5-二甲基苯胺(3.6g，30mmol)和对甲苯磺酸(1.7g，10mmol)溶解于异丙醇(50mL)中。将混合物在80℃下搅拌17小时。将反应混合物用EtOAc(200mL)稀释，用H2O(2x)和盐水(2x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤且浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～20％)纯化以得到呈白色固体的N-(3,5-二甲基苯基)噻唑-2-胺(1.1g,27％)。ESI-MS(EI+,m/z):205.0[M+1]+。
步骤2：3,5-二甲基苯基(噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯：
将N-(3,5-二甲基)噻唑-2-胺(1.02g，5mmol)、(Boc)2O(5.45g，25mmol)和DMAP(1.52g，12.5mmol)于t-BuOH(20mL)中的混合物加热至80℃持续36小时。除去溶剂，并且将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～5％)纯化以得到呈白色固体的3,5-二甲基苯基(噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(360mg，24％)。ESI-MS(EI+,m/z):305.0[M+1]+。
步骤3：5-溴噻唑-2-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸叔丁酯：
在室温下向3,5-二甲基苯基(噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(390mg，1.28mmol)于THF(15mL)中的混合物添加NBS(252mg，1.41mmol)。然后，将混合物在室温下搅拌1小时。除去溶剂，并且将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～5％)纯化以得到呈淡黄色固体的5-溴噻唑-2-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸叔丁酯(445mg，90％)。ESI-MS(EI+,m/z):385.0[M+1]+。
步骤4：3,5-二甲基苯基(5-(三甲基甲锡烷基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯：
将5-溴噻唑-2-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸叔丁酯(445mg，1.17mmol)、1,1,1,2,2,2-六甲基二锡烷(579mg，1.76mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(83mg，0.12mmol)于二噁烷(15mL)中的混合物在100℃下搅拌1小时。然后将混合物冷却至室温并且用饱和KF溶液淬灭。将混合物在室温下搅拌1小时，用EtOAc(100mL)稀释，用H2O(2x)和盐水(2x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤且浓缩。粗产物3,5-二甲基苯基(5-(三甲基甲锡烷基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(约500mg)直接用于下一步骤。ESI-MS(EI+,m/z):469.0[M+1]+。
步骤5：5-(8-氯-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)噻唑-2-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸叔丁基酯：
将3,5-二甲基苯基(5-(三甲基甲锡烷基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(约500mg)、3-溴-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(300mg，1.16mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(83mg，0.12mmol)于二噁烷(15mL)中的混合物在100℃下搅拌1小时。然后，使混合物冷却至室温，用EtOAc(100mL)稀释，用H2O(2x)和盐水(2x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤且浓缩。将残余物通过制备型-HPLC纯化以得到呈黄色固体的5-(8-氯-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)噻唑-2-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸叔丁酯(30mg，对于两个步骤10％)。ESI-MS(EI+,m/z):483.0[M+1]+。
步骤5：8-氯-3-(2-(3,5-二甲基苯基氨基)噻唑-5-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
向5-(8-氯-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)噻唑-2-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸叔丁基酯(25mg，0.05mmol)于二噁烷(2mL)中的溶液添加HCl于二噁烷(4M，60mL)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌17小时。然后除去溶剂。将固体用Et2O洗涤以得到呈黄色固体的8-氯-3-(2-(3,5-二甲基苯基氨基)噻唑-5-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(17mg，71％)。ESI-MS(EI+,m/z):383.1[M+1]+；1HNMR(400MHz,CF3COOD):δ2.91(s,6H),7.58(s,2H),7.71(s,1H),7.96(t,J＝8.0Hz,1H),8.16(d,J＝8.0Hz,1H),8.30(d,J＝8.0Hz,1H),8.61(s,1H),8.82(s,1H)。
DBM-E-11的合成方案在方案11中示出。
方案11：
DBM-E-12的合成方案在方案12中示出。
方案12：
根据以下所列出的程序制备DBM-E-13并且合成方案在方案13中示出。
方案13：
步骤1：1-硝基-2-丙氧基苯：
将2-硝基苯酚(3g，21.6mmol)、1-溴丙烷(3.9g，32.4mmol)和K2CO3(8.9g，64.8mmol)于DMF(50mL)中的混合物在70℃下搅拌2小时。使反应混合物冷却至室温，用EtOAc(150mL)稀释，用H2O(2x)和盐水(2x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤且浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/PE＝0％～3％)纯化以得到呈黄色油状物的1-硝基-2-丙氧基苯(3.36g，86％)。ESI-MS(EI+,m/z):182.0[M+1]+。
步骤2：2-丙氧基苯胺：
将1-硝基-2-丙氧基苯(1.5g，8.3mol)、Fe(2.32g，41.5mmol)、NH4Cl(2.19g，41.5mmol)于EtOH(20mL)和H2O(2mL)中的混合物在90℃下搅拌2小时。过滤反应混合物。浓缩滤液并且将残余物用DCM(100mL)稀释，干燥(Na2SO4)，过滤且浓缩以得到呈黄色油状物的2-丙氧基苯胺(1.16g，93％)。ESI-MS(EI+,m/z):152.0[M+1]+。
步骤3：N-(2-丙氧基苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺：
使2-丙氧基苯胺(1.16g，7.68mmol)和苯甲酰基异硫氰酸酯(1.63g，10.0mmol)在乙腈中在0℃至室温的温度下反应3小时。然后将混合物通过过滤纯化以提供呈白色固体的N-(2-丙氧基苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(1.36g，56％)。ESI-MS(EI+,m/z):315.0[M+1]+。
步骤4：1-(2-丙氧基苯基)硫脲：
使N-(2-丙氧基苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(1.36g，4.3mmol)与NaOMe于MeOH(4mL，30％)中的溶液反应。然后将所得到的混合物通过过滤纯化以提供呈白色固体的1-(2-丙氧基苯基)硫脲(650mg，71％)。ESI-MS(EI+,m/z):211.0[M+1]+。
步骤5：8-氯-3-(2-(2-丙氧基苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
使3-(2-溴乙酰基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(约300mg，50％，0.5mmol)和1-(2-丙氧基苯基)硫脲(158mg，0.75mmol)在乙醇中在80℃下反应。然后将产物通过过滤纯化以提供呈黄色固体的8-氯-3-(2-(2-丙氧基苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(115mg，56％)。ESI-MS(EI+,m/z):413.0[M+1]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.99(t,J＝7.2Hz,3H),1.78-1.84(m,2H),4.03(t,J＝6.8Hz,2H),7.01-7.05(m,3H),7.39(t,J＝8Hz,1H),7.76-7.79(m,2H),7.93(d,J＝7.6Hz,1H),8.41-8.44(m,1H),8.64(s,1H),9.49(s,1H)。
DBM-E-14的合成方案在方案14中示出。
方案14：
DBM-E-15的合成方案在方案15中示出。
方案15：
根据以下所列出的程序制备DBM-E-16并且合成方案在方案16中示出。
方案16：
步骤1：N-(2-甲氧基-5-甲基苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺：
使2-甲氧基-5-甲基苯胺(500mg，3.65mmol)和苯甲酰基异硫氰酸酯(773mg，4.74mmol)在乙腈中在0℃至室温的温度下反应2小时。然后将混合物通过过滤纯化以提供呈白色固体的N-(2-甲氧基-5-甲基苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(600mg，55％)。ESI-MS(EI+,m/z):301.1[M+1]+。
步骤2：1-(2-甲氧基-5-甲基苯基)硫脲：
使N-(2-甲氧基-5-甲基苯基氨基硫代甲酰基)-苯甲酰胺(600mg，2mmol)与NaOMe于MeOH(0.7mL，30％)中的溶液反应。然后将所得到的混合物通过过滤纯化以提供呈白色固体的1-(2-甲氧基-5-甲基苯基)硫脲(300mg，76％)。ESI-MS(EI+,m/z):197.0[M+1]+。
步骤3：8-氯-3-(2-(2-甲氧基-5-甲基苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
使3-(2-溴乙酰基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(约300mg，50％，0.5mmol)和1-(2-甲氧基-5-甲基苯基)硫脲(197mg，1mmol)在乙醇中在80℃下反应。然后将产物通过过滤纯化以提供呈黄色固体的8-氯-3-(2-(2-甲氧基-5-甲基苯基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(60mg，30％)。ESI-MS(EI+,m/z):399.0[M+1]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.36(s,3H),3.84(s,3H),6.82(d,J＝8.4Hz,1H),6.93(d,J＝8.4Hz,1H),7.39(t,J＝8.0Hz,1H),7.75-7.77(m,2H),7.83(d,J＝7.6Hz,1H),8.29(s,1H),8.58(s,1H),9.62(s,1H)。
DBM-E-17的合成方案在方案17中示出。
方案17：
DBM-E-18的合成方案在方案18中示出。
方案18：
根据以下所列出的程序制备DBM-E-20并且合成方案在方案19中示出。
方案19：
步骤1：3-(2-氨基噻唑-4-基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮：
使3-(2-溴乙酰基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(约1.4g，50％，2.33mmol)和硫脲(355mg，4.67mmol)于EtOH(25mL)中的混合物在80℃下搅拌2小时。收集所形成的的沉淀物以得到呈黄色固体的3-(2-氨基噻唑-4-基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(630mg，96％)。ESI-MS(EI+,m/z):279.0[M+1]+；
步骤2：8-氯-3-(2-(3-甲氧基吡啶-4-基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮：
使3-(2-氨基噻唑-4-基)-8-氯-2H-苯并吡喃-2-酮(100mg，0.36mmol)和4-溴-3-甲氧基吡啶盐酸盐(80mg，0.36mmol)在微波中在Cs2CO3(351mg，1.08mmol)、Pd2(dba)3(25mg，0.036mmol)、xantphose(41mg，0.072mmol)以及干燥二噁烷(2mL)存在下在150℃下反应1.5小时。然后将混合物通过制备型-HPLC纯化以提供呈黄色固体的8-氯-3-(2-(3-甲氧基吡啶-4-基氨基)噻唑-4-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(45mg，33％)。ESI-MS(EI+,m/z):386.1[M+1]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.98(s,3H),7.42(t,J＝8Hz,1H),7.77-7.79(m,1H),7.92(s,1H),8.00(d,J＝7Hz,1H),8.21-8.26(m,2H),8.68-8.74(m,2H),10.27(s,1H)。
DBM-E-22的合成方案在方案20中示出。
方案20：
DBM-E-23的合成方案在方案21中示出。
方案21：
DBM-E-9的合成方案在方案22中示出。
方案22：
实施例2：测定设计
本文所述的化合物有效用于抑制过度增殖性细胞类型中的细胞增殖。为了研究这些化合物的作用，开发测定来区分所述化合物对增殖性细胞对比汇合细胞的作用。测定设计在接种之后24小时产生增殖密度并且提供3天活跃细胞生长/双层窗，其中测量本文所述的化合物的抗增殖作用。对于增殖性细胞的研究，96孔全区域孔板的1,000–2,000人过度增殖性细胞每孔的接种密度显示在24小时接种时间段之后跨3天(72小时)活跃细胞生长/加倍周期的细胞数目的加倍，其中在24小时接种时间段细胞在开始增殖之前附着。在此3天生长窗中，细胞数目增加，其中在72小时周期内每日加倍(参见图1)。
在每个测定设计中，在细胞接种之后在24小时时间点添加化合物。跨增殖性细胞的3天生长窗并且在已经细胞的接近汇合的培养物上持续相同时间段测定化合物相对于媒介物对照和相对于作为阳性对照的VelCade(在美国被批准用于治疗复发多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的蛋白酶体抑制剂)的作用。以相同方式处理正常细胞，其中在选定病例中需要接种密度的一些调整。此测定设计适用于以下所呈现的数据系列。
使用CELLTITER-GLO发光细胞存活力测定(Promega；Madison,WI)来测定在测定结束时的细胞数目。CELLTITER-GLO发光细胞存活力测定是基于所存在的ATP的定量(代谢活跃细胞的指示符)测定培养物中的存活细胞的数目的均相法。计算IC50值。将细胞数目(每孔细胞的数目)转化为DMSO匹配对照的％。每个测量一式三份地进行。所测试的典型剂量范围是250皮摩尔至50微摩尔。
实施例3：
本文所述的化合物展示在引起过度增殖性癌细胞的生长停滞方面的纳摩尔(nM)选择性，但对“正常”非癌性人细胞的生长和存活力没有作用直到中微摩尔(μM)浓度。两种早期类似物，化合物DBM227和化合物DBM228已经由NCI发展治疗学计划(NCIDevelopmentalTherapeuticsProgram)在外部进行了评价和验证，其中它们在NCI-60细胞组中展示250nM的平均GI50的nM效力(22种细胞系具有≤100nM的GI50值)。例如，在NCI60人癌细胞系组上对化合物DBM-228进行特性分析(参见表1)。GI50意指50％的生长抑制，并且表示在药物孵育期间导致对照细胞中的净细胞溶质ATP增加(如通过(Promega,Madison,WI)所测量)的50％减少的药物浓度。TGI意指导致总生长抑制或“白细胞郁滞”的药物浓度。LC50是导致在药物治疗结束时所测量的细胞溶质ATP与在开始时的细胞溶质ATP相比50％减少的药物的浓度，从而指示在治疗后细胞的净损失(细胞毒性)。
表1：
实施例4：化合物DBM228对人过度增殖性细胞平台的作用
在原代人ADPKD囊性表皮细胞系以及来自前列腺(ARCaP-M)和肾(CAKI-1)的两种常见癌细胞系上对如本文所述的化合物进行测试。参见图2。纳摩尔范围产生细胞生长抑制性CRC，其中细胞生长停滞但不是杀死。在此延伸的12点CRC中在和大约1微摩尔剂量，存在细胞生长抑制稳定期。在更高中微摩尔浓度下，存在细胞毒性作用。
实施例5：化合物DBM101对体外增殖性对比汇合人囊性ADPKD和非囊性肾上皮细胞的作用
在汇合的囊性ADPKD细胞、增殖性囊性ADPKD细胞、汇合的正常肾细胞以及增殖性正常肾细胞上对如本文所述的化合物进行测试。参见图3。
如图3中所示，本文所述的化合物的细胞生长抑制作用在有效纳摩尔剂量下是对于过度增殖性“患病”细胞选择性的。与此鲜明对比，汇合的患病细胞以及增殖性和汇合的正常细胞仅部分地受影响并且在中微摩尔剂量下。
实施例6：化合物的效力和效率
本文所述的化合物展示显著效力和功效(1uMGI50)。对于鉴别化合物的典型筛选实验，将细胞以针对每种细胞系预先确定的接种密度接种在96或384孔微量滴定板中以便确保药物暴露在达到汇合之前在增殖期期间发生。在接种之后，将细胞孵育24小时，之后添加实验药物。在24小时之后，测定测试板(CellTiterGlo–细胞溶质ATP的测量)以确定在药物添加时每种细胞系的细胞群体的基线测量。然后添加实验药物，并且将细胞培养持续48小时药物暴露窗。在48小时之后，测定细胞并且计算每种实验药剂的三个剂量响应参数：(1)50％的生长抑制(GI50)是在药物孵育期间在对照细胞中导致净细胞溶质ATP增加(如通过CellTiterGlo所测量)的50％减少的药物浓度，(2)导致总生长抑制(TGI)或“白细胞郁滞”的药物浓度，以及(3)导致在药物治疗结束时所测量的细胞溶质ATP与在开始时的细胞溶质ATP相比50％减少、指示在治疗后细胞的净损失(“细胞毒性”)的LC50或药物浓度。如果达到活性水平，则计算这三个参数中的每个的值；然而，如果未达到或超过所述作用，则所述参数的值被表示为大于或小于所测试的最大或最小浓度。结果在图4和表2中示出。
表2：
如在图4中所证明，化合物DBM308、DBM318、DBM701、DBM707以及DBM715展示显著功效和效力。此外，这些化合物被设计成除去可能妨碍成功的药物开发的有问题的官能团。当用这些抗增殖性化合物并行处理原代正常人细胞(即，呼吸道和肾上皮细胞、皮肤角质形成细胞、肝细胞以及脑星形细胞)时，观察到作用的显著差异。在任何最佳类别内类似物的情况下在nM范围中没有观察到细胞生长抑制作用并且不会合并直到低μM；细胞毒性未发生直到中至高μM范围。鉴于最有效的类似物具有跨NCI-60组平均约250nM的GI50，存在对这些过度增殖性癌细胞对比“正常”人细胞的作用或选择性的至少2对数分离。
实施例7：化合物的浓度响应作用
在作为来自囊性对比非囊性肾组织的“克隆”获得的原代培养物中测定化合物DBM228、化合物DBM308、化合物DBM101以及化合物DBM328的浓度响应作用。用GraphPadPrism软件计算CRC图、IC50值以及最大抑制百分比对比无作用的最低剂量。化合物DBM308在此72小时处理中并且就细胞生长抑制作用而言作为有力且有效的类似物出现。在过度增殖性PKD细胞(图5A和表3)与WT细胞(图5B和表4)之间还存在作用的显著分离。
表3：
药物 IC50(μM) 最大抑制
001-2(DBM101) 7.2 77％
N828(DBM308) 0.69 61％
3-8Cl(DBM308) 0.54 84％
3-8COOH(DBM328) 78 48％
表4：
药物 IC50(μM) 最大抑制
001-2(DBM101) >100 48％
N828(DBM308) >100 49％
3-8Cl(DBM308) >100 52％
3-8COOH(DBM328) >100 28％
实施例8：化合物对体外原代人特发性肺纤维化肌成纤维细胞的生长的作用
在人特发性肺纤维化肌成纤维细胞上测定化合物DBM228、DBM308、DBM318、DBM701、DBM707、DBM715以及DBM328的抗增殖作用。化合物DBM328充当阴性对照并且在整个CRC期间无作用。结果在图6中示出。
实施例9：化合物DBM701对体外原代人特发性肺纤维化肌成纤维细胞对比原代人COPD成纤维细胞的生长的作用
测定化合物DBM701对原代人特发性肺纤维化(IPF)肌成纤维细胞的作用的分离并且将其与原代人COPD成纤维细胞进行比较。结果在图7和表5中示出。在IPF过度增殖性肌成纤维细胞与从COPD肺分离的成纤维细胞之间的作用中存在较少分离；然而，观察到显著分离。
表5：
GI50(μM) TGI(μM) LC50(μM)
IPF 0.109 0.450 ＞30
COPD 0.318 5.9 ＞30
在化合物DBM701的情况下对原代人特发性肺纤维化(IPF)肌成纤维细胞的生长观察到“双”CRC。在达1微摩尔的纳摩尔范围中观察到生长抑制和白细胞郁滞并且对于化合物DBM701细胞毒性开始在微摩尔范围中出现(图8)。
实施例10：针对多重耐药性癌症的体外抗增殖性功效
具体地说抗有丝分裂药物并且一般来说常规化学治疗剂中的主要限制是它们对获得性/固有多重耐药性的细胞机制的敏感性(即MDR流出泵，如p-糖蛋白，MRP1)。然而，本文所述的化合物(包括化合物DBM227和化合物DBM228)在NCI-ADR/RES细胞系中展示优异效力(分别100nM和44.5nM)。此细胞系表达高水平的MDR1和P-糖蛋白并且代表用于在癌症多重耐药性的体外细胞模型中分析化合物的特性的良好模型。在NCI-60组内发现的药物响应性细胞中，药剂(如紫杉醇和长春新碱)展示有效细胞毒性，其中GI50值经常在1-10nM的范围内。然而，在多重耐药性NCI-ADR/RES细胞系中，这些常见药物的效力显著向右偏移，而化合物DBM228保持有效(图9)。化合物还展示在OVCAR-3和SK-OV-3细胞系中的显著效力(分别50nM和330nMGI50)，其已知证明对几种临床上相关的药物(包括阿霉素、美法仑和顺铂)的抗性。因此，本文所述的化合物可有效治疗多重耐药性癌症。
实施例11：对原代人多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞的细胞毒性作用的剂量依赖性生长停滞
本文所述的化合物比已知一线抗癌药物如替莫唑胺(TMZ)更有效，替莫唑胺是仅细胞毒性的并且在高微摩尔剂量下。如在图10中所示，化合物DBM308展示对在3D神经球上体外生长的原代人多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞的细胞毒性作用的剂量依赖性生长停滞。化合物DBM308具有在纳摩尔剂量下的细胞生长抑制作用以及与TMZ等效的细胞毒性作用(但是在3微摩尔对比500微摩尔下)。数据表示为平均值±SEM并且代表使用样品重复的至少两个独立实验。
实施例12：细胞周期停滞
对U251-MG细胞进行细胞周期分析以确定在细胞周期中的哪一点本文所述的化合物起作用。将U251MG成胶质细胞瘤细胞用递增浓度的化合物DBM228处理24小时。基于碘化丙啶的细胞周期分析揭示G2/M停滞(参见图11A和表6)。
表6：
对照(DMSO) 40nM 100nM 400nM
前G0/G1 1.7％ 3.2％ 13.6％ 43.1％
G0/G1 54.1％ 52.2％ 19.7％ 1.8％
S 13.3％ 14.4％ 25.6％ 5.8％
G2/M 30.9％ 30.2％ 41.1％ 49.3％
表6示出在细胞周期的不同阶段中鉴别的细胞的百分比。在G2/M阶段中观察到细胞百分比增加，从而指示G2/M阶段阻断。然而，在更高nM剂量下，细胞似乎朝向细胞凋亡和编程性细胞死亡进展，鉴于前G0/G1中的细胞的更高％。
在用化合物DBM228、化合物DBM318以及化合物DBM328处理24小时之后，测定U251MG细胞中的半胱天冬酶3/7活化。在U251MG细胞中检测到半胱天冬酶3/7活化指示细胞凋亡的活化。结果在图11B中示出。针对化合物DBM227、DBM228、DBM308、DBM318、DBM701、DBM707、DBM715、紫杉醇、长春新碱以及阴性对照化合物DBM328测定微管蛋白聚合。生物化学微管蛋白聚合被化合物DBM227、DBM228、DBM308、DBM318、DBM701、DBM707以及DBM715适度抑制。紫杉醇充当聚合增强剂对照，并且长春新碱充当聚合抑制剂对照。阴性对照DBM328还抑制微管聚合。
实施例13：药物处理的对比媒介物处理的人过度增殖性GBM癌细胞中的细胞内信号传导分子磷酸-阵列
在化合物处理的人过度增殖性GBM癌细胞中和媒介物处理的人过度增殖性GBM癌细胞中进行细胞内信号传导分子磷酸-阵列。所测试的化合物包括化合物DBM228(002-N8-28)、化合物DBM328(003-8COOH)以及化合物DBM308(003-8Cl)。DMSO充当媒介物对照。结果在图12中示出。数字反映在对应于主要激酶和其他信号传导蛋白的典型斑点印迹中斑点的对数。化合物DBM328(003-8COOH)是用于此阵列实验的阴性对照以补充DMSO媒介物对照。对于化合物DBM228(002-N8-28)提供剂量响应作用以用于增强c-Jun磷酸化(参见图12的右上图)以及需要24小时的作用的时间依赖性(参见图12的右下图)。
实施例14：人过度增生性疾病的波形蛋白磷酸化和分解
波形蛋白是在多种培养细胞(包括间充质和肿瘤细胞)中广泛表达的一类中间体纤丝。它们构成细胞骨架的支架网络的一部分，其中它们的作用包括细胞形状、分裂、迁移、分泌、信号传导分子分布、伤口愈合以及平滑肌力量发育的维持。通过由一系列蛋白激酶和磷酸酶引起的磷酸化事件调控丝状波形蛋白网络的细胞内组织结构。
具体地说，波形蛋白磷酸化在通过体外波形蛋白纤丝的分解调控空间重组构方面具有作用。波形蛋白纤丝的分解还导致单个“活化的”亚基的增加，其信号传导半胱天冬酶依赖性细胞凋亡事件。波形蛋白代表存在于有丝分裂中的最常见的中间体纤丝，其中观察到波形蛋白的过度磷酸化。例如，已经证明在特定丝氨酸残基处波形蛋白的磷酸化在胞质分裂期间在卵裂沟处发生。
特定激酶和磷酸酶牵涉在波形蛋白调控中。例如，P21活化的激酶和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cdk)调控在S56处的波形蛋白。此外，Cdk5介导Ser-56处的波形蛋白磷酸化，其中波形蛋白通过中性粒细胞参与GTP诱导的分泌。
进行定制、高灵敏度和综合蛋白质组学研究以分析化合物DBM308对波形蛋白的作用。并行进行媒介物和化合物DBM328(无活性类似物)对照。蛋白质组学数据显示在关键苏氨酸残基56处磷酸化的波形蛋白的24.22倍上调。DMSO媒介物对照是1.0并且无活性的类似物化合物DBM308对照是1.4(P＝0.0006–数据的最显著的变化–蛋白质组学阵列中的99％的蛋白质未受影响)。
蛋白质组学数据揭示几种激酶如Cdk5在化合物DBM308处理的细胞对比对照中差别地调控。
随附的权利要求书的化合物和方法的范围不受限于本文所述的具体化合物和方法，本文所述的化合物和方法意图作为权利要求书的几个方面的说明，并且功能等效的任何化合物和方法均在本公开的范围内。除了本文所示和描述的化合物和方法之外，意图所述化合物和方法的各种修改属于随附权利要求书的范围。此外，虽然仅具体地描述了某些代表性化合物、方法以及这些化合物和方法的方面，但是意图其他化合物和方法也属于随附权利要求书的范围。因此，本文中可明确地提及步骤、要素、组分或成分的组合；然而，即使不明确说明，也包括步骤、要素、组分和成分的所有其他组合。

Claims (21)

1.一种用于治疗受试者的过度增生性疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是氢、卤素、羟基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的C1-6烷基或取代的或未取代的杂环烷基；
R2是氢、卤素、羟基、硝基、氰基、叠氮基、氰硫基、三氟甲基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羰基或取代的或未取代的C1-6烷基；
R3是氢或取代的或未取代的C1-6烷基；
R4是取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基；
X是S或O；以及
Y是O、NH或NCH3。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的组：
其中R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、卤素、羟基、取代的或未取代的烷氧基、氰基、硝基、三氟甲基、取代的或未取代的羰基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C2-6烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的磺酰胺、取代的或未取代的磺酰基或取代的或未取代的硫代；以及
其中任选地，R1和R2、R5和R6、R6和R7、R7和R8或R8和R9组合以形成取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
3.一种用于治疗受试者的过度增生性疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
L是杂芳基；以及
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
4.一种用于治疗受试者的过度增生性疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
X1、X2、X3和X4各自独立地选自CH和N；
Y是O或NR，其中R是氢或甲基；
R2是氢、C1-6烷基、卤素或三氟烷基；以及
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
5.一种用于治疗受试者的过度增生性疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
X1是O或NCH3；
X2是CH或N；
Y是O、NH或NCH3；以及
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
6.一种用于治疗受试者的过度增生性疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1和R2各自独立地选自氢、取代的或未取代的氨基和取代的或未取代的羰基。
7.一种用于治疗受试者的过度增生性疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
X是CH2、NH或O。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述过度增生性疾病是癌症。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述过度增生性疾病是多囊性肾病。
10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述过度增生性疾病是纤维化。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述纤维化是特发性肺纤维化。
12.一种抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法，所述方法包括：
使细胞与有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药相接触，其中：
R1是氢、卤素、羟基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的C1-6烷基或取代的或未取代的杂环烷基；
R2是氢、卤素、羟基、硝基、氰基、叠氮基、氰硫基、三氟甲基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羰基或取代的或未取代的C1-6烷基；
R3是氢或取代的或未取代的C1-6烷基；
R4是取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基；
X是S或O；以及
Y是O、NH或NCH3。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的组：
其中R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、卤素、羟基、取代的或未取代的烷氧基、氰基、硝基、三氟甲基、取代的或未取代的羰基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C2-6烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的磺酰胺、取代的或未取代的磺酰基或取代的或未取代的硫代；以及
其中任选地，R1和R2、R5和R6、R6和R7、R7和R8或R8和R9组合以形成取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的杂芳基、或取代的或未取代的杂环烷基。
14.一种抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法，所述方法包括：
使细胞与有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药相接触，其中：
L是杂芳基；以及
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
15.一种抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法，所述方法包括：
使细胞与有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药相接触，其中：
X1、X2、X3和X4各自独立地选自CH和N；
Y是O或NR，其中R是氢或甲基；
R2是氢、C1-6烷基、卤素或三氟烷基；以及
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
16.一种抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法，所述方法包括：
使细胞与有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药相接触，其中：
X1是O或NCH3；
X2是CH或N；
Y是O、NH或NCH3；以及
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢和甲氧基。
17.一种抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法，所述方法包括：
使细胞与有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药相接触，其中：
R1和R2各自独立地选自氢、取代的或未取代的氨基和取代的或未取代的羰基。
18.一种抑制细胞中的两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白之间的相互作用的方法，所述方法包括：
使细胞与有效量的以下式的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药相接触，其中：
X是CH2、NH或O。
19.如权利要求12-18中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种热休克蛋白伴侣蛋白选自由以下组成的组：Hsp-90、Hsp-70、Hsc-70以及Hsp-40。
20.如权利要求12-19中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
21.如权利要求12-19中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
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