CN101076332A - 吡唑或三唑化合物及其用于制备治疗体细胞突变相关疾病的药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过给药本发明的化合物或组合物来治疗或预防与mRNA中的无义突变相关的疾病的方法、化合物和组合物。更具体地，本发明涉及用于抑制与mRNA中的无义突变相关的翻译提前终止的方法、化合物和组合物。
Description
相关申请
根据美国的35U.S.C.§119的规定，本申请要求于2004年10月13日递交的申请号分别为60/617,633、60/617,634、60/617,655和60/617,670的美国申请的优先权，这些申请以其全部内容引入作为参考。根据美国的35U.S.C.§119的规定，本申请还要求于2004年10月13日递交的申请号为60/617,653和2004年11月3日递交的申请号为60/624,170的美国申请的优先权。于2004年11月3日递交的申请号为60/624,170的美国申请以其全部内容引入作为参考。本申请还引入于2005年10月13日提出的标题为“Compounds for Nonsense Suppression，and Methods forTheir Use(用于无义突变抑制的化合物及其使用方法)”的国际专利申请，其代理卷号为19025.040、19025.041、19025.042和19025.044，其全部内容被作为参考。
技术领域
本发明涉及通过给药本发明的化合物或组合物来治疗或预防与mRNA中的无义突变相关的疾病的方法、化合物和组合物。更具体地，本发明涉及用于抑制与mRNA中的无义突变相关的翻译提前终止的方法、化合物和组合物。
背景技术
细胞内的基因表达取决于依次进行的转录和翻译过程。这些过程一起从其相应基因的核苷酸序列产生蛋白。
转录包括通过RNA聚合酶由DNA合成mRNA。转录从基因的启动子区开始并继续进行直到诱导终止，例如通过在初生态RNA中形成茎-环(stem-loop)结构或者结合ρ基因产物。
然后，蛋白是由mRNA在tRNA、tRNA合成酶及多种其他种类蛋白和RNA的帮助下在核糖体上进行翻译过程而产生的。翻译包括三个阶段：起始、延长和终止。翻译是通过形成起始复合物而起始的，所述起始复合物由识别mRNA上的指示翻译机器开始在mRNA上进行翻译的信号的蛋白因子、mRNA、tRNA、辅助因子和核糖体亚单位组成。一旦形成起始复合物，通过由核糖体以及tRNA和tRNA合成酶的肽基转移酶活性来重复增加氨基酸，发生多肽链增长。核糖体A位点的三个终止密码子(UAA、UAG、UGA)之一的存在发出信号使多肽链释放因子(RFs)结合并识别终止信号。然后，位于核糖体P位点的tRNA的3′核苷酸与初生多肽链之间的酯键水解，释放出完成的多肽链，且所述核糖体亚单位循环用于又一轮翻译。
其中碱基数目发生改变的DNA序列的突变归类为插入或缺失突变(例如，移码突变)并且使大部分基因组破裂。将一个碱基变为另一个碱基并导致氨基酸替代的DNA突变标记为错义突变。碱基替代细分为转换类(一个嘌呤转换为另一嘌呤，或者一个嘧啶转换为另一嘧啶)和颠换类(嘌呤颠换为嘧啶，或者嘧啶颠换为嘌呤)。
转换突变和颠换突变可以导致无义突变，将氨基酸密码子变为三种终止密码子之一。这些提前终止密码子可以使翻译提前终止从而在细胞中产生异常的蛋白。必需基因中的无义突变是致命的并且还可以导致许多人类疾病如癌症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化病和血友病等。
在人类癌症中，人类p53基因是最常见的突变基因(Zambetti，G.P.和Levine，A.，FASEB 7：855-865(1993))。在遗传性癌症和自发性癌症中均发现，超过50种不同的人类癌症含有p53突变且在全部人类癌症的50-55％发生该基因的突变(Hollstein，M.等人，Nucleic Acids Res.22：3551-55(1994)；International Agency for Research on Cancer(IARC)database)。大约70％的结肠直肠癌、50％的肺癌和40％的乳腺癌含有突变型p53(Koshland，D.，Science 262：1953(1993))。异常型p53与预后不良、更加迅速蔓延的肿瘤、转移以及低于5年的存活率有关(Id.)。人们认为p53在诱导细胞生长停滞和/或DNA损伤后的细胞凋亡的作用对于破坏将要另外获得生长优势的变异细胞是必要的。此外，p53使快速分裂的细胞对调亡信号敏感。在报导的超过15000种p53基因突变中，大约7％为无义突变。因此，对于p53无义突变需要安全有效的治疗。
在具有无义突变的细菌株和真核菌株中，tRNA分子之一中的突变以致突变体tRNA能识别无义密码子、参与翻译过程的蛋白的突变、核糖体(核糖体RNA或核糖体蛋白)突变或者添加公知的改变翻译过程的化合物(例如：环己酰亚胺或者氨基糖苷类抗生素)，可导致发生无义突变的抑制。结果是氨基酸将在无义突变位点结合到多肽链中，并且翻译将不在无义密码子处提前终止。插入的氨基酸不一定与野生型蛋白的原始氨基酸相同，但是许多氨基酸替换对蛋白结构或功能没有显著的作用。因此，通过抑制无义突变而得到的蛋白将可能具有与野生型蛋白接近的活性。该方案提供了通过抑制无义突变而避免翻译提前终止以治疗与无义突变有关的疾病的机会。
氨基糖类苷抗生素的促进通读真核生物终止密码子的能力已经在作为由无义突变引起的人类疾病的可能的治疗剂的这些药物中引起关注。这样的治疗策略或许可行的一种疾病为晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病(late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis，LINCL)，这是一种目前还未有效治疗的致命性幼年神经变性疾病。编码溶酶体三肽基-肽酶1(TPP-I)的基因CLN2中的提前终止密码子突变与在用LINCL诊断的大约一半的儿童中的疾病有关。已经考察了氨基糖苷庆大霉素在LINCL细胞系中恢复TPP-I活性的能力。在一种来自患者的常见无义突变(Arg208Stop)和不同的罕见无义突变的双重杂合子的细胞系中，用庆大霉素治疗最大程度地恢复大约7％的TPP-I正常水平。这些结果表明通过氨基糖苷或功能类似的医药品来药理学抑制无义突变可能在LINCL中具有治疗潜力(Sleat等人，Eur.J.Ped.Neurol.5：Suppl A 57-62(2001))。
在囊性纤维化病跨膜电导调节(Cystic Fibrosis TransmembraneConductance Regulator，CFTR)基因的具有提前停止密码子的培养细胞中，用氨基糖苷类治疗导致生成全长CFTR(Bedwell等人，Nat.Med.3：1280-1284(1997)；Howard等人Nat.Med.2：467-469(1996))。在用于迪谢纳肌肉营养不良的小鼠模型中，观察到庆大霉素硫酸盐在导致全长抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的提前停止密码子处抑制翻译终止(Barton-Davis等人，J.Clin.Invest.104：375-381(1999))。全长抗肌萎缩蛋白的少量增加提供了对mdx小鼠收缩诱导损伤的保护。在这些研究中没有确定插在无义密码子位点的氨基酸。
因此，通过调解无义密码子误读而抑制翻译提前终止的小分子疗法或预防法将用于治疗许多疾病。小分子药物，特别是口服可生物利用的药物的发现，其可为公众引入可抵抗由无义突变引起的疾病的广谱选择性疗法或预防法的发现才刚开始。
Clitocine(6-氨基-5-硝基-4-(β-D-核-呋喃氨基)嘧啶)为首先从蘑菇卷边杯伞(Clitocybe inversa)中分离的天然产生的外环氨基核苷(Kubo等人，Tet.Lett.27：4277(1986))。还报导了clitocine的全合成(Moss等人，J.Med.Chem.31：786-790(1988)和Kamikawa等人，J.Chem.Soc.Chem.Commun.195(1988))。已经报导clitocine具有杀虫活性和抵抗白血病细胞系的细胞抑制活性(Kubo等人，Tet.Lett.27：4277(1986)和Moss等人，J.Med.Chem.31：786-790(1988))。但是至今还没有公开clitocine作为用作与无义突变有关的疾病的治疗剂的用途。也没有报导开发出具有作为用于与无义突变有关的癌症或疾病的治疗剂的功效的clitocine类似物或衍生物。
因此，为了开发用于治疗或预防与mRNA无义突变有关的疾病的新颖的药物，仍需要开发特性且最优化的先导分子。因此，本发明的一个目的是提供这样的化合物。
在此提及的所有文献都引入本申请作为参考，如同它们完全在此阐明一样。
发明概述
根据本发明，鉴定了抑制与mRNA中无义突变相关的翻译提前终止的化合物并提供了它们的使用方法。
根据本发明的一个方面，提供了式1的化合物或者所述式1的化合物的药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物，该化合物可用于抑制与mRNA中无义突变相关的翻译提前终止，并且可用于治疗与mRNA中无义突变相关的疾病：
其中：
A1为C、CH或N；
V和X独立地选自N或C；
W选自N、C或CH；
其中至少V、W或X之一为N，且其中如果W为N，则至少V或X之一也为N；
Y和Z独立地选自N、C、C-Rc、C＝O、C＝S，其中Rc为H、CH3或NH2；条件是当Y或Z之一为C＝O或C＝S时，则另一个也可选自NH、S或O；
R1为羧基、氰基或任选地被C1-C4烷氧基取代的羰基；
R2不存在或者为硝基；
Ar1为任选地被R基取代的C1-C4烷基；任选地被一个、两个或三个独立选择的基取代的C6至C10芳基；任选地被独立选择的一个、两个或三个独立选择的R基取代的5至10元杂环；与Ar2和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；或与Ar3和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar2不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；
Ar3不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar4不存在；或者为其中任意一种与A1共同形成4至7元碳环或杂环的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4硫代烷基(thioalkyl)；
R为氢；-Ra基、或两个R基，其中R也可包括氧基，与跟其相连的苯基或杂环共同形成选自RR的环结构；
其中：
Ar1-2和Ar1-3选自任选地被一个或多个以下基团取代的11至14元杂三环的环结构：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、任选地被卤素或C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或者任选地被用C1-C4烷基取代的羰基取代的氨基；
RR为任选地被一个或多个以下基团取代的9至10元双环结构：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、氧代基团或C1-C4卤代烷氧基；
Ra选自：羟基；卤素；任选地被一个或多个独立选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地被一个或多个独立选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的4至6元杂环；具有两个环结构的9至10元杂环；任选地被羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地被一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫代；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；或任选地被一个或两个独立选择的C1-C4烷基、磺酰基或羰基取代的氨基，其中氨基磺酰基任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代且其中氨基羰基任选地被任选地用-Rb基取代的C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酰氧基或氨基取代；
其中-Rb为任选地被下列基团中的一种或多种取代的C6-C8芳基：羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、或者任选地被一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
本发明的另一个方面提供了用于抑制与无义突变相关的翻译提前终止的方法，以及用于预防或治疗与mRNA无义突变相关的疾病的方法。这样的疾病包括但不限于由与无义突变相关的翻译提前终止引起的遗传疾病如CNS疾病、炎症性疾病、神经变性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病或肺部疾病；所述疾病更优选为癌症(或其他增殖疾病)、淀粉样变、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、巨人症、侏儒症、甲状腺机能减退、甲状腺功能亢进、囊性纤维化病、衰老、肥胖症、帕金森症、尼-皮病、家族高胆甾醇血、视网膜色素变性、马方综合征、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化病、血友病、或典型的晚期婴儿神经元蜡样色素脂褐质病(LINCL)。
在一实施方式中，本发明涉及用于抑制与mRNA无义突变相关的翻译提前终止的方法，所述方法包括向需要其的受治疗者给药无义抑制量的至少一种本发明的化合物。
在另一实施方式中，提供了用于治疗癌症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化病、血友病或典型的晚期婴儿神经元蜡样色素脂褐质病的方法，所述方法包括向需要其的受治疗者给药治疗有效量的至少一种本发明的化合物。
参照下面的优选实施方式和详细描述，本发明的这些和其他方面将更容易被理解。
某些实施方式
1、一种治疗或预防由体细胞突变引起的疾病的方法，所述方法包括向需要其的病人给药有效量的式1的化合物或者所述式1的化合物的药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物：
其中：
A1为C、CH或N；
V和X独立地选自N或C；
W选自N、C或CH；
其中至少V、W或X之一为N，且之中如果W为N，则至少V或X只有也为N；
Y和Z独立地选自N、C、C-Rc、C＝O、C＝S，其中Rc为H、CH3或NH2；条件是当Y或Z之一为C＝O或C＝S时，则另一个也可选自NH、S或O；
R1为羧基、氰基或者任选地被C1-C4烷氧基取代的羰基；
R2不存在或者为硝基；
Ar1为任选地被R基取代的C1-C4烷基；任选地被一个、两个或三个独立选择的R基取代的C6至C10芳基；任选地被一个、两个或三个独立选择的R基取代的5至10元杂环；与Ar2和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；或与Ar3和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar2不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；
Ar3不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar4不存在；或者为其中任意一种与A1共同形成4至7元碳环或杂环的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4硫代烷基；
R为氢；-Ra基或两个R基，其中R也还可包括氧基，与跟其相连的苯基或杂环共同形成选自RR的环结构；
其中：
Ar1-2和Ar1-3选自任选地被一个或多个以下基团取代的7-14元杂三环结构：卤素，、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、任选地被卤素或C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或者任选地被用C1-C4烷基取代的羰基取代的氨基；
RR为任选地被一个或多个以下基团取代的9至10元双环的环结构：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、氧代基团或C1-C4卤代烷氧基；
Ra选自：羟基；卤素；任选地被一个或多个独立选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地被一个或多个独立选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的4至6元杂环；具有两个环结构的9至10元杂环；任选地被羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地被一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫代；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；或任选地被一个或两个独立选择的C1-C4烷基、磺酰基或羰基取代的氨基，其中氨基磺酰基任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代且其中氨基羰基任选地被任选地用-Rb基取代的C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酰氧基或氨基取代；
其中-Rb为任选地被下列基团中的一种或多种取代的C6-C8芳基：羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或者任选地被一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
2、根据实施方式1所述的方法，其中所述化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合多晶型物、外消旋物、立体异构体或多晶型物以含有所述化合物和药学可接受的载体或稀释剂的组合物给药。
3、根据实施方式1所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
4、根据实施方式1所述的方法，其中Ar1-2选自以下基团：
其中*表示Ar1-2与式1的6元环连接的键；
Ar1-3选自以下基团：
其中*表示Ar1-3与式1的6元环连接的键；
RR选自以下基团：喹啉基、萘基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基、苯并[1，4]间二氧杂环戊烯基、吲哚基或喹喔啉基，
其中*表示RR与式1的5元环连接的键。
5、根据实施方式1所述的方法，其中，式1的化合物为式1-A的化合物：
其中A1、A2、A3、A4和A5独立地选自N、C和CH；Ar3不存在或者为氢且n为0、1或2。
6、根据实施方式5所述的方法，其中R2不存在且A1、A2、A3、A4和A5独立地选自C和CH。
7、根据实施方式5所述的方法，其中R1为羧基。
8、根据实施方式1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-B的化合物：
9、根据实施方式8所述的方法，其中R1为羧基。
10、根据实施方式1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-C的化合物：
11、根据实施方式10所述的方法，其中Ar1为噻吩基。
12、根据实施方式10所述的方法，其中R1为羧基。
13、根据实施方式1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-D的化合物：
14、根据实施方式13所述的方法，其中Ar2不存在。
15、根据实施方式13所述的方法，其中Ar3为氢。
16、根据实施方式13所述的方法，其中R1为羧基。
17、根据实施方式1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-E的化合物：
18、根据实施方式17所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
19、根据实施方式18所述的方法，其中所述一个或两个R基独立地选自C1-C4烷基和卤素。
20、根据实施方式17所述的方法，其中R1为羧基。
21、根据实施方式1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-F的化合物：
22、根据实施方式21所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
23、根据实施方式22所述的方法，其中所述一个或两个R基独立地选自C1-C4烷基、卤素、C1-C4卤代烷基和甲磺酰基，或者两个R基共同形成喹啉基。
24、根据实施方式21所述的方法，其中R1为羧基。
25、根据实施方式1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-G的化合物：
26、根据实施方式25所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
27、根据实施方式26所述的方法，其中所述一个或两个R基独立地选自C1-C4烷基和氰基。
28、根据实施方式25所述的方法，其中R1为羧基。
29、根据实施方式1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-H的化合物：
30、根据实施方式29所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
31、根据实施方式30所述的方法，其中所述一个或两个R基为C1-C4烷基。
32、根据实施方式29所述的方法，其中R1为羧基。
33、根据实施方式1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-I的化合物：
34、根据实施方式33所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
35、根据实施方式34所述的方法，其中所述一个或两个R基为C1-C4烷基。
36、根据实施方式33所述的方法，其中R1为羧基。
37、根据实施方式1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-J的化合物：
38、根据实施方式37所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
39、根据实施方式38所述的方法，其中所述一个或两个R基为C1-C4烷基。
40、根据实施方式37所述的方法，其中R1为羧基。
41、一种治疗或预防自身免疫性疾病、血液病、胶原病、糖尿病、神经变性疾病、心血管疾病、肺部疾病、炎症性疾病或中枢神经系统疾病的方法，所述方法包括向需要其的病人给药有效量的式1的化合物、或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物。
42、根据实施方式41所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
43、根据实施方式41所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
44、根据实施方式41所述的方法，其中所述炎症性疾病为关节炎。
45、根据实施方式41所述的方法，其中所述中枢神经系统疾病为多发性硬化、肌营养不良、迪谢纳肌营养不良、阿尔茨海默病、神经变性疾病或帕金森症。
46、根据实施方式41所述的方法，其中，所述血液病为血友病、冯·维勒布兰德病或β地中海贫血症。
47、根据实施方式41所述的方法，其中，所述胶原病为成骨不全或硬化。
48、一种治疗或预防家族性红细胞增多症、免疫缺陷、肾疾病、囊性纤维化病、家族性高胆固醇血症、视网膜色素变性、淀粉样变、血友病、阿尔茨海默病、泰-萨病、尼-皮病、帕金森症、动脉粥样硬化、巨人症、侏儒症、甲状腺功能亢进、衰老、肥胖症、迪谢纳肌营养不良或马方综合征的方法，该方法包括对需要的病人给药有效量的式1的化合物、或者式1的化合物的药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物。
49、根据实施方式48所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
50、一种治疗或预防人类癌症的方法，所述方法包括向需要其的人给药有效量的式1的化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物。
51、根据实施方式50所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
52、根据实施方式50所述的方法，其中所述癌症为头与颈、眼、皮肤、口、咽、食道、胸、骨、血、肺、结肠、乙状结肠、直肠、胃、前列腺、乳房、卵巢、肾、肝、胰腺、脑、肠、心脏或肾上腺的癌症。
53、根据实施方式50所述的方法，其中所述化合物、或者其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物或立体异构体或多晶型物包含药学可接受的载体或稀释剂。
54、根据实施方式50所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。
55、根据实施方式50所述的方法，其中所述癌症为肉瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、血液产生的肿瘤或多发性骨髓瘤。
56、根据实施方式50所述的方法，其中所述癌症为急性成淋巴细胞性白血病、B细胞型急性淋巴细胞白血病、T细胞型急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性成单核细胞性白血病、急性红白血病、急性成巨核细胞白血病、急性粒单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病或多发性骨髓瘤。
57、一种治疗或预防与p53基因突变相关的疾病的方法，所述方法包括对需要的病人给药有效量的式1的化合物、或者式1的化合物的药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物。
58、根据实施方式57所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
59、根据实施方式57所述的方法，其中所述疾病为肉瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤。
60、一种抑制癌细胞生长的方法，所述方法包括使癌细胞与有效量的式1的化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物接触。
61、一种在哺乳动物中选择性地产生制备蛋白质的方法，所述方法包括：
在所述哺乳动物中转录含有无义突变的基因；并
将有效量的本发明的化合物提供给所述哺乳动物，其中所述蛋白质通过所述含有无义突变的基因产生。
附图简述
图1提供了用于评价无义突变抑制的基于荧光素酶分析用构建体的图示。
图2提供了为使荧光素酶蛋白的N-末端带有一个或多个表位标签而设计的荧光素酶构建体的图示。
图3提供了用于评价通读效率(readthrough efficiency)的基于荧光素酶分析用构建体的图示。
发明详述
翻译提前终止会产生异常蛋白，所述异常蛋白可能是致命的或能够引起多种疾病，所述疾病包括但不限于癌症、溶酶体贮积症、肌肉萎缩、囊性纤维化病和血友病。根据本发明，已经鉴定了抑制无义突变的化合物并提供了它们的使用方法。
A、本发明的化合物
本发明一方面提供了本发明的化合物，所述化合物可用于抑制无义突变。在一些实施方式中，本发明的化合物特别抑制无义突变，而在其他实施方式中，本发明的化合物在抑制无义突变的同时还治疗疾病，所述疾病包括但不限于癌症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化病和血友病。
本发明的用于抑制无义突变的优选化合物包括下式(1)所示的那些或者式1的化合物的药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物：
其中：
A1为C、CH或N；
V和X独立地选自N或C；
W选自N、C或CH；
其中至少V、W或X之一为N，且其中如果W为N，则至少V或X之一也为N；
Y和Z独立地选自N、C、C-Rc、C＝O、C＝S，其中Rc为H、CH3或NH2；条件是当Y或Z之一为C＝O或C＝S时，则另一个也可选自NH、S或O；
R1为羧基、氰基、或者任选地被C1-C4烷氧基取代的羰基；
R2不存在或者为硝基；
Ar1为任选地被R基取代的C1-C4烷基；任选地被一个、两个或三个独立选择的R基取代的C6至C10芳基；任选地被独立选择的一个、两个或三个独立选择R基取代的5至10元杂环；与Ar2和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；或与Ar3和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar2不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；
Ar3不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar4不存在；或者为其中任意一种与A共同形成4至7元碳环或杂环的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4硫代烷基；
R为氢；-Ra基或两个R基，其中R也可包括氧基，与跟其相连的苯基或杂环共同形成选自RR的环结构；
其中：
Ar1-2和Ar1-3选自任选地被一个或多个以下基团取代的7-14元杂三环结构：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、任选地被卤素或C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或者任选地被用C1-C4烷基取代的羰基取代的氨基；
RR为任选地被一个或多个以下基团取代的9至10元双环结构：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基氧代基团或C1-C4卤代烷氧基；
Ra选自由以下基团所组成的组中：羟基；卤素；任选地被一个或多个独立选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地被一个或多个独立选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的4至6元杂环；具有两个环结构的9至10元杂环；任选地被羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地被一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫代；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；或任选地被一个或两个独立选择的C1-C4烷基、磺酰基或羰基取代的氨基，其中氨基磺酰基任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代并且其中氨基羰基任选地被任选地用-Rb基取代的C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酰氧基或氨基取代；
其中-Rb为任选地被如下基团中的一种或多种取代的C6-C8芳基：羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、或者任选地被一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
在式1的优选实施方式中，Ar1-2选自以下基团并且如式1中任选地取代：
其中*表示Ar1-2与式1的6元环连接的键。
在式1的另一优选实施方式中，Ar1-3选自以下基团并且如式1中任选地取代：
其中*表示Ar1-3与式1的6元环连接的键。
在式1的另一优选实施方式中，Ar4-A1可以与A1和跟Ar4-A1相连的含环的V/W/X/Y/Z共同形成3、4或5元稠环结构。在式1的一个优选实施方式中，Ar4-A1与跟Ar4-A1相连的含环的A1和V/W/X/Y/Z共同形成杂三环，所述杂三环可以任选地如在此所述地取代。在式1的又一优选实施方式中，Ar4-A1与跟Ar4-A1相连的含环的A1和V/W/X/Y/Z共同形成的杂三环可以选自：
其中*表示在式1的Ar4-A1、含环的A1和含环的V/W/X/Y/Z之间形成的三环的与Ar1连接的键。
在式1的又一优选实施方式中，RR选自以下基团：喹啉基、萘基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基、苯并[1，4]间二氧杂环戊烯基、吲哚基、或喹喔啉基；
其中*表示RR与式1的五元环连接的键。
在式1的再一优选实施方式中，Ar1-2可以选自：
其中*表示Ar1-2与式1的6元环连接的键。
在式1的再一优选实施方式中，Ar1-3可以选自：
其中*表示Ar1-3与式1的6元环连接的键。
在式1的再一优选实施方式中，Ar4-A1与跟Ar4-A1相连的含环的A1和V/W/X/Y/Z共同形成的杂三环可以选自：
其中*表示在式1的Ar4-A1、含环的A1和含环的V/W/X/Y/Z之间形成的三环的与Ar1连接的键。
在式1的再一优选实施方式中，RR可选自：
在式1的其他优选实施方式中，Ar1可以选自：
其中，*表示Ar1与式1的5元环连接的键。
如本领域技术人员所公认的，本发明的一些化合物可包括至少一个手性中心，并且可作为外消旋混合物或对映纯的组合物存在。如本文所用的，“对映纯的”是指基本上由单一异构体组成的组合物，优选由90％、92％、95％、98％、99％或100％的单一异构体组成。
如本文所用的术语“烷基”一般是指直链、支链或环状构型的饱和烃基，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、环己基、正庚基、辛基、正辛基等。在一些实施方式中，烷基取代基可以为C1至C8、C3至C8、C1至C6或C1至C4烷基。在一些实施方式中，所述烷基可以任选地被一个或多个卤素或烷氧基取代。例如：所述烷基可包括一个或多个卤素取代基以形成卤代烷基，包括单卤代烷基、二卤代烷基和三卤代烷基。
如本文所用的“烯基”一般是指具有一个或多个碳碳双键的线形的、支链或环状烯基，例如：包括3-丙烯基的C2至C6烯基。
如本文所用的“芳基”是指碳环芳环结构。芳基的范围包括具有5-20个碳原子的芳环。芳环结构包括具有一个或多个环结构的化合物，如单环、双环或三环化合物。芳基环结构的例子包括苯基、甲苯基、蒽基(anthracenyl)、芴基、茚基、甘菊环基(azulenyl)、苯蒽基(即：菲)和萘基(即：萘)环结构。在一些实施方式中，所述芳基可被任选地取代。
如本文所用的“杂环”是指环中的有一个或多个原子，其中杂原子为碳以外的其他元素的环结构。杂原子一般为O、S或N原子。杂环范围内可独立选择的为O、N和S杂环结构。所述环结构可包括具有一个或多个环结构的化合物，如单环、双环或三环化合物，且可为芳族的，即：所述环结构为杂芳基。杂环基的例子包括吗啉基、吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl)、吡咯烷基、哌啶基(piperidinyl)、哌嗪基、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酰胺基、环氧乙烷基(oxiranyl)、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基或四氢硫代吡喃基等。在一些实施方式中，所述杂环可以任选地取代。如本文所用的“杂芳基”是指环中有一个或多个原子，所述杂原子为碳以外的其他元素的芳环结构。杂原子一般为O、S或N原子。杂芳基范围内可独立选择的为O、N和S杂芳基环结构。所述环结构可包括具有一个或多个环结构的化合物，如单环、双环或三环化合物。在一些实施方式中，所述杂芳基可选自含有两个或更多个杂原子、三个或更多个杂原子或者四个或更多个杂原子的杂芳基。杂芳基环结构可以选自含有五个或更多个杂原子、六个或更多个杂原子或者八个或更多个杂原子的杂芳基环结构。在一个优选实施方式中，杂芳基包括5至10个碳原子。杂芳基环结构的例子包括：吖啶、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并间二氧杂环戊烯、苯并呋喃、1，3-二嗪、1，2-二嗪、1，2-二唑、1，4-二氮杂萘、呋喃、呋咱、咪唑、吲哚、异噁唑、异喹啉、异噻唑、噁唑、嘌呤、哒嗪、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吡咯、喹啉、喹喔啉、噻唑、噻吩、1，3，5-三嗪、1，2，4-三嗪、1，2，3-三嗪、四唑和喹唑啉。
如本文所用的“烷氧基”一般是指具有-O-R结构的基团。在一些实施方式中，R可为烷基，如C1至C8、C1至C6烷基或C1至C4烷基。在一些实施方式中，烷氧基的R基可以任选地被至少一个卤素取代。烷氧基的R基可以为卤代烷基，即：卤代烷氧基。
卤素取代基可以独立地选自卤素，如：氟、氯、溴、碘和砹。
为了本发明的目的，当将一个或多个官能团或取代基结合到包括优选实施方式在内的本发明的化合物中时，出现在所公开的化合物的任意位置的各官能团或取代基可被独立地选择并如果合适，被独立地取代。此外，当将一个或多个普通取代基放在本发明分子中的任意位置时，可以理解所述普通取代基可被替换为特定的取代基，并且得到的分子在本发明分子的范围内。
参考式1，在一实施方式中，R优选在间位或对位，并且优选为：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基，任选地被，一个或多个C1-C4烷基、-Rb基、吡咯基、咪唑基取代的氨基，或者两个R基与跟他们相连的苯基共同形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或2，3-二氢苯并[1，4]二氧芑基。特别优选的R基包括上表所示的基团。
在一优选实施方式中，式1的化合物为式1-A的化合物：
对于式1-A，A1、A2、A3、A4和A5独立地选自N、C和CH，n为0、1或2。在一优选实施方式中，R2不存在，A1、A2、A3、A4和A5独立地选自C和CH。R1优选为羧基，并优选位于间位或对位。在式1-A的另一实施方式中，R可以独立地选自：氢；羟基；C1-C4烷基；卤素；C1-C4卤代烷基；C1-C4烷氧基；C1-C4卤代烷氧基；苯氧基；苄氧基；任选地被一个或多个独立选择的卤素、C1-C4烷基和/或C1-C4烷氧基取代的C6-C8芳基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基取代的氨基；氰基；-C(O)-Rd基，其中Rd为羟基或C1-C4烷氧基；甲磺酰基；硝基；苯并呋喃基；吡咯烷基；吡咯烷酮基；吖啶酮基(azetidinonyl)；吗啉基；或者两个R基与跟它们相连的苯基或杂环共同形成选自RR的环结构。
在式1-A的一个优选实施方式中，V、W，和Y各自为N，同时X为C、，Z为C-Rc。Rc优选为氢或甲基。在一特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-1的化合物：
参考式1-A-1，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。在一实施方式中，R2优选不存在。在另一实施方式中，Rc优选为氢或甲基。在另一实施方式中，R优选独立地选自：卤素；C1-C4烷基；C1-C4卤代烷基；C1-C4烷氧基；任选地被一个或多个卤素取代的C1-C4烷氧基；任选地被一个或多个C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基取代的C6-C8芳基；苯并呋喃基；吡咯烷基；吡咯烷酮基和/或吖啶啶酮基。此外，n优选为0、1或2，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，W、X和Z各自为N，同时V为C且Y为C-Rc。Rc优选为氢或甲基。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-2的化合物：
参考式1-A-2，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。在一实施方式中，R2优选不存在。在另一实施方式中，R优选独立地选自：羟基；卤素；C1-C4烷基和/或苄氧基。在1-A-2的进一步实施方式中，n优选为0或1，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，X、Y和Z各自为N，同时V为C且W为CH。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-3的化合物：
参考式1-A-3，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。在一实施方式中，R2优选不存在。在式1-A-3的另一实施方式中，R优选独立地选自：卤素；C1-C4烷基；C1-C4卤代烷基；任选地被一个或多个卤素取代的C1-C4烷氧基；或者两个R基与跟它们相连的六元芳基共同形成萘基，所述萘基任选地被一个或多个C1-C4烷氧基取代。在进一步实施方式中，n优选为0、1或2，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，X和Z均为N，同时V为C、W为CH，Y为C-Rc。Rc优选为氢或氨基。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-4的化合物：
参考式1-A-4，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。在一实施方式中，R2优选不存在。在1-A-4的另一实施方式中，Rc优选为氢或氨基。在另一实施方式中，R优选独立地选自C1-C4烷基。在1-A-4的又一实施方式中，n优选为0或1，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，V和W均为N，同时X为C，Y和Z均为C-Rc。Rc优选为氢。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-5的化合物：
参考式1-A-5，R1优选为羧基或氰基并优选位于间位和对位。在式1-A-5的另一实施方式中，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。在实施方式中，R2优选不存在。在式1-A-5的另一实施方式中，R优选独立地选自：卤素；C1-C4烷基；C1-C4卤代烷基；任选地被一个或多个卤素取代的C1-C4烷氧基；苄氧基；硝基；任选地被一个或两个C1-C4烷基取代的氨基和/或两个R基与跟它们相连的六元芳基共同形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯或吲哚基。在另一实施方式中，n优选为0、1或2，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，V和Y均为N，同时X为C，W为CH，且Z为C-Rc。在一实施方式中，Rc优选为氢。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-6的化合物：
参考式1-A-6，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。在另一实施方式中，R2优选不存在。在1-A-6的实施方式中，R优选独立地选自C1-C4烷基。在另一实施方式中，n优选为0或1，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，V和Z均为N，同时X为C，W为CH，且Y为C-Rc。Rc优选为氢。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-7的化合物：
参考式1-A-7，R1优选为羧基或氰基并优选位于间位和对位。在另一实施方式中，R2优选不存在或为硝基。当R2不存在时，它优选位于邻位。在式1-A-7的实施方式中，R优选独立地选自：羟基；卤素；C1-C4烷基；C1-C4卤代烷基；任选地被一个或多个卤素取代的C1-C4烷氧基；-C(O)-OCH3基和/或两个R基与跟它们相连的六元芳基共同形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯。在式1-A-7的又一实施方式中，n优选为0、1或2，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，W和X均为N，同时V为C，Y和Z均为C-Rc。Rc优选为氢。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-8的化合物：
参考式1-A-8，R1优选为羧基或-C(O)-OCH3基并优选位于间位和对位。在另一实施方式中，R2优选不存在。在另一实施方式中，R优选独立地选自：羟基；卤素；C1-C4烷基；C1-C4卤代烷基；任选地被一个或多个卤素取代的C1-C4烷氧基；硝基和/或吗啉基。在式1-A-8的进一步实施方式中，n优选为0、1或2，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，X和Y均为N，同时V为C，W为CH、Z为C-Rc。Rc优选为氢。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-9的化合物：
参考式1-A-9，R1优选为羧基或氰基并优选位于间位和对位。在另一实施方式中，R2优选不存在。在式1-A-7的进一步实施方式中，R优选独立地选自：羟基；卤素；C1-C4烷基；C1-C4卤代烷基；任选地被一个或多个卤素取代的C1-C4烷氧基；苯氧基；硝基；任选地被一个或两个C1-C4烷基取代的氨基和/或两个R基与跟它们相连的六元芳基共同形成苯并[1，3]间二氧杂环戊烯、喹啉基或喹喔基。此外，n优选为0、1或2，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，V为N，同时X为C，W为CH，且Y和Z均为C-Rc。Rc优选为氢。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-10的化合物：
参考式1-A-10，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。R2优选不存在。R优选独立地选自：卤素；C1-C4烷基；C1-C4卤代烷基；任选地被一个或多个卤素取代的C1-C4烷氧基；苯氧基和/或两个R基与跟它们相连的六元芳基共同形成苯并[1，4]间二氧杂环戊烯。此外，n优选为0、1或2，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，X为N，同时V为C，W为CH，且Y和Z均为C-Rc。Rc优选为氢。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-11的化合物：
参考式1-A-11，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。R2优选不存在。R优选独立地选自C1-C4烷基。此外，n优选为0或1，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，W为N，同时X和V均为C且Y和Z均为C-Rc。Rc优选为氢。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-12的化合物：
参考式1-A-12，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。R2优选不存在。R优选独立地选自C1-C4烷基。此外，n优选为0或1，R基优选位于间位和/或对位。
在式1-A的又一优选实施方式中，Z为N，同时V和X均为C，W为CH，且Y为C-Rc。Rc优选为氢。在特别优选的实施方式中，式1-A的化合物包括如下式1-A-13的化合物：
参考式1-A-13，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。R2优选不存在。R优选独立地选自C1-C4烷基。此外，n优选为0或1，R基优选位于间位和/或对位。
在式1的又一优选实施方式中，V、W和Y各自为N，X和Z均为C。此外，Ar1和Ar2与跟它们相连的杂环共同形成如下的13元杂三环结构(式1-B)：
参考式1-B，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。
在式1的又一优选实施方式中，V和W均为N，X为C，Y和Z各自为CH(式1-C)：
参考式1-C，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。此外，Ar1优选为噻吩基。
在式1的又一优选实施方式中，X和Y均为N，V为C，W和Z独立地为C或CH(式1-D)：
对于式1-D，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。此外，Ar2和/或Ar3优选不存在。在另一优选实施方式中，Ar1优选为苯并噁唑(benzooxasole)。在式1-D的另一优选实施方式中，Ar3不存在，Ar1和Ar2与跟它们相连的五元环共同形成Ar1-2环结构。在式1-D的优选实施方式中，Ar1-2选自以下基团，如式1中被任选地取代：
其中，*表示Ar1-2与式1的6元环连接的键。在式1-D的再一优选实施方式中，Ar1-2可以选自：
在式1-D的另一优选实施方式中，Ar2不存在，Ar1和Ar3与跟它们相连的五元环共同形成Ar1-3环结构。在式1-D的优选实施方式中，Ar1-3选
自以下基团并如式1中被任选地取代：
其中，*表示Ar1-3与式1的6元环连接的键。在式1-D的再一优选实施方式中，Ar1-3可选自：
其中，*表示Ar1-3与式1的6元环连接的键。
在式1的再一优选实施方式，V和W各自为N，X为C，Y为NH，Z为C＝O(式1-E)：
参考式1-E，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。此外，Ar2和/或Ar3优选不存在。在另一优选实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或两个R基取代的苯基。此外，所述一个或两个R基优选独立地选自C1-C4烷基和卤素。
在式1的再一优选实施方式中，V和W各自为N，X为C，Y为O，且Z为C＝O(式1-F)：
参考式1-F，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。此外，Ar2和/或Ar3优选不存在。在另一优选实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或两个R基取代的苯基。此外，所述一个或两个R基优选独立地选自C1-C4烷基、卤素、C1-C4卤代烷基、和甲基磺酰基，或者两个R基共同形成喹啉基。
在式1的再一优选实施方式中，V为C，W和X各自为N，Y为C＝O，且Z为O(式1-G)：
参考式1-G，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。此外，Ar2和/或Ar3优选不存在。在另一优选实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或两个R基取代的苯基。此外，所述一个或两个R基优选独立地选自C1-C4烷基、和氰基。
在式1的再一优选实施方式中，V为C，W和X各自为N，Y为C＝O且Z为S(式1-H)：
参考式1-H，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。此外，Ar2和/或Ar3优选不存在。在另一优选实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或两个R基取代的苯基。此外，所述一个或两个R基优选独立地选自C1-C4烷基。
在式1的再一优选实施方式中，V为C，W和X各自为N，Y为C＝S，且Z为S(式1-I)：
参考式1-I，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。此外，Ar2和/或Ar3优选不存在。在另一优选实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或两个R基取代的苯基。此外，所述一个或两个R基优选独立地选自C1-C4烷基。
在式1的再一优选实施方式中，V为C，W和X各自为N，Y为C＝S，且Z为O(式1-J)：
参考式1-J，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。此外，Ar2和/或Ar3优选不存在。在另一优选实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或两个R基取代的苯基。此外，所述一个或两个R基优选独立地选自C1-C4烷基。
在式1的再一优选实施方式中，Ar4不存在(式1-K)：
在式1-K的实施方式中，可以优选式1-A至1-J中说明的的任何取代基模式。
在式1的实施方式中，Ar4为与A1共同形成4至7元碳环或杂环的C1-C4烷基(式1-L)。
在式1-L的一个优选实施方式中，Ar4为与A1共同形成4至7元碳环的C1-C4烷基。在式1-L的一优选实施方式中，Ar4为与A1共同形成5-6元碳环的C1-C4烷基。在式1-L的一实施方式中，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。在一优选实施方式中，Ar4为亚甲基。在式1-L的另一优选实施方式中，Ar2和Ar3优选不存在。在另一优选实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或两个R基取代的苯基。在一优选实施方式中，Ar1为任选地被一个或多个独立选择的卤素、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷氧基取代的苯基。在又一优选实施方式中，Ar1为由一个或多个独立选择的卤素、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷氧基取代的苯基。在又一优选实施方式中，Ar1为由卤素和C1-C4烷基取代的苯基。在又一优选实施方式中，Ar1为由氟和甲基取代的苯基。在优选的实施方式中，Ar1为任选地被一个或多个独立选择的卤素、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷氧基取代的苯基。在又一优选实施方式中，Ar1为由三氟甲氧基取代的苯基。
在式1的一实施方式中，Ar4为与A1连接而形成4至7元碳环或杂环的C1-C4烷氧基(式1-M)。
在式1-M的一优选实施方式中，Ar4为与A1连接以形成5至6元杂环的C1-C4烷氧基。在式1-M的一实施方式中，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。在式1-M的一优选实施方式中，Ar4为甲氧基。在式1-M的又一优选实施方式中，Ar2和Ar3优选不存在。在式1-M的另一优选实施方式中，Ar1不存在。在式1-M的另一优选实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
在式1-M的又一优选的实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或多个独立选择的卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4卤代烷基取代的苯基。在式1-M的又一优选实施方式中，Ar1优选为由一个、两个或三个多个独立选择的卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4卤代烷基取代的苯基。在式1-M的又一优选实施方式中，Ar1优选为由一个卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基取代的苯基。在式1-M的一优选实施方式中，Ar1优选为由一个氟、氯、甲基、甲氧基或三氟甲氧基取代的苯基。在式1-M的另一优选实施方式中，Ar1优选为由三个C1-C4烷氧基取代的苯基。在式1-M的进一步优选的实施方式中，Ar1优选为由三个甲氧基取代的苯基。
在式1的实施方式中，Ar4为与A1连接而形成4至7元杂环的C1-C4硫代烷基(式1-N)。
在式1-N的一优选实施方式中，Ar4为与A1连接而形成5至6元杂环的C1-C4硫代烷基。在式1-N的一实施方式中，R1优选为羧基并优选位于间位和对位。在式1-N的一优选实施方式中，Ar4为硫代甲基。在式1-N的进一步优选的实施方式中，Ar2和Ar3优选不存在。
在式1-N的又一优选实施方式中，Ar1优选为任选地被一个或多个R基取代的苯基。在式1-N的又一优选实施方式中，Ar1为由C1-C4烷基取代的苯基。在式1-N的进一步优选的实施方式中，Ar1为由甲基取代的苯基。
本发明优选的化合物包括下表X中的化合物：
如表X所示：如本文所用的，化合物12的结构与化合物292相同。如本文所用的，化合物13的结构与化合物293相同。如本文所用的，化合物14的结构与化合物294相同。如本文所用的，化合物15的结构与化合物295相同。如本文所用的，化合物16的结构与化合物296相同。如本文所用的，化合物17的结构与化合物297相同。如本文所用的，化合物18的结构与化合物298相同。如本文所用的，化合物19的结构与化合物299相同。如本文所用的，化合物20的结构与化合物300相同。如本文所用的，化合物21的结构与化合物301相同。如本文所用的，化合物22的结构与化合物302相同。如本文所用的，化合物23的结构与化合物303相同。如本文所用的，化合物24的结构与化合物304相同。如本文所用的，化合物25的结构与化合物305相同。如本文所用的，化合物26的结构与化合物306相同。如本文所用的，化合物27的结构与化合物307相同。如本文所用的，化合物28的结构与化合物308相同。如本文所用的，化合物29的结构与化合物309相同。如本文所用的，化合物30的结构与化合物310相同。如本文所用的，化合物31的结构与化合物311相同。如本文所用的，化合物32的结构与化合物312相同。如本文所用的，化合物33的结构与化合物313相同。如本文所用的，化合物34的结构与化合物314相同。如本文所用的，化合物35的结构与化合物315相同。如本文所用的，化合物36的结构与化合物36相同。如本文所用的，化合物37的结构与化合物317相同。如本文所用的，化合物38的结构与化合物318相同。如本文所用的，化合物39的结构与化合物319相同。如本文所用的，化合物40的结构与化合物320相同。如本文所用的，化合物41的结构与化合物321相同。如本文所用的，化合物42的结构与化合物322相同。如本文所用的，化合物43的结构与化合物323相同。如本文所用的，化合物44的结构与化合物324相同。如本文所用的，化合物45的结构与化合物325相同。如本文所用的，化合物46的结构与化合物326相同。
特别优选的化合物的为编号为：47、48、66、76、81、87、105、106、109、110、133、138、139、140、146、148、154、157、167、174、177、186、196、204的化合物。列出以上化合物仅仅是为了提供一些可用于本发明方法的例子。基于本公开内容，本领域技术人员将意识到本发明要求保护的范围内的其他化合物能够用于本文所述的方法。
B、本发明化合物的制备
本发明的化合物可以按本领域公知的任何方式制备。举例来说，本发明的化合物可以根据下述关于单个吖嗪环中心结构的一般方法进行制备。例如，：式1的其中V为N的化合物可以按照下述图示A所示的方法制备：
图示A
根据图示A，化合物A1的唑环上的未取代氮原子可以在交叉耦合反应中进行取代。这种类型的反应可以通过使用底物来完成，如Ar1-X(其中X为卤素如溴或碘，或者类卤化物如磺酸甲酯)或Ar1-M(其中M为基团，例如硼酸或三烷氧基硅烷)。用于该反应的催化剂可以包括铜盐(例如：铜(II)氧化物、铜(II)醋酸盐等)、钯盐(例如：钯(II)醋酸盐、四(三苯基膦)钯等)、以及其他具有催化性能的催化剂过渡金属盐。交叉耦合反应的一个具体例子来自Buchwald等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，7727的报导，包括在具有二胺配体的二碘化铜和合适的碱如磷酸钾或碳酸钾的催化下，芳基溴化物或碘化物与唑在高沸点溶剂如1，4-二噁烷、二甲氧基乙烷、甲苯等中反应。唑交叉耦合反应的另一具体例子为Lam，等人，Tetrahedron Lett.2001，42，3415的方法。该方法包括在铜(II)醋酸盐、胺试剂(如吡啶、三乙胺等)和分子筛存在下，唑化合物如A1与芳基硼酸试剂反应。可用于合成本发明的化合物的交叉耦合反应不限于这两个具体的例子。
某些官能团在本发明所述的合成中可以按保护的形式携带，然后在之后的步骤中释出。保护基策略已为有机合成领域的技术人员所公知，并且在教科书如Greene，Protective Groups in Organic Synthesis，JohnWiley and Sons，New York中有所描述。例如：羧酸可以通过羧酸酯化合物的各种有机合成而携带，然后在始于羧酸的点被裂解。裂解反应可以包括用氢氧化物(氢氧化钠、氢氧化锂等)在合适的溶剂中(水、乙醇、四氢呋喃、或者它们的混合物)在室温至溶剂的回流点的温度下的反应。或者，一些酯基可以用亲核试剂(碘化锂、苯硫基锂等)在溶剂如吡啶、二甲亚砜或二甲替甲酰胺中进行裂解。羧酸酯基的便利的掩蔽形式的其他基团为氰基。芳基腈化合物可以在酸性条件(例如：浓硫酸或干燥的氯化氢气体，接着醇解/水解)或碱性条件(氢氧化钠)下水解。
常规的杂环合成可以用于式1的各种实施方式。例如：对于含有中心吡咯环的化合物，可以将上述芳基化方法用于式B1的吡咯化合物(图示B)。
图示B
根据图示B，化合物B1可以通过两种途径之一而制得。第一种包括式B2化合物的交叉耦合，其中X表示卤素或类卤化物基团，Z表示氢原子或保护基。合适的保护基包括但不限于叔丁氧羰基、三苯甲基、三异丙基甲硅烷基等。其他交叉耦合组分包括试剂Ar-M，其中M表示金属或其他能够进行交叉耦合的原子，并且可以选自Mg、Zn、B或Si，在此所列的原子还结合于与所选的M原子化合价相配合的其他基团。交叉耦合反应还可以在催化剂存在下进行。合适的催化剂包括各种含Pd、Cu或Ni的化合物。耦合反应后，芳基化产物可以通过去除Z基而去保护，从而形成B1。去保护条件取决于所选的Z基并且已为有机合成领域的技术人员所熟知。第一种途径的变形起始于具有M基的吡咯(B3)，并且用式Ar-X的试剂如上所述进行交叉耦合。使用该途径的一种方法具有作为M基的B(OH)2和作为X的Br或I；用于该反应的催化剂为Pd(0)化合物(如Pd(PPh3)4)或Pd(II)化合物(如Pd(PPh3)2Cl2或Pd(OAc)2)，并且存在碱如Na2CO3或CsF。式B1的化合物的第三种合成起始于式B4的烯烃化合物。在碱性条件下用试剂甲苯磺酰基甲基异腈(TosMIC)处理。得到的产物为化合物B1，其中R和R均为氢原子。然后，按照图示A所述对化合物B1进行芳基化。
对于含有中心吡唑环的式1的化合物，可以将如上所述的芳基化方法用于式C1的吡唑化合物(图示C)。
图示C
对于图示C，化合物Cl可以源自式C2的插烯物酰胺化合物或式C4的二羰基化合物。任意底物可以用肼水合物在质子溶剂如乙醇或乙酸种进行处理，任选地存在酸催化剂如盐酸。反应一般在高温下进行。式C2的插烯物酰胺化合物可以通过式C3的酮化合物与酰胺的缩醛进行缩合而制得。该反应一般用纯的一当量或大于一当量的缩醛试剂进行或者在合适的溶剂中在溶剂的回流温度下进行。式C4的二酮试剂可以通过式C5的芳酰基酯与式C6的酮进行缩合而制得。该缩合反应一般在碱性条件下(例如：氢氧化钠)在各种溶剂中进行，或者首先在强碱性条件下(例如：锂二异丙基酰胺，低温，疏质子溶剂)生成C6的烯醇化物阴离子并随后加成酯C5。
对于其中吡唑环的4-位上连接有芳基之一的吡唑类化合物的变形，可以将上述的芳基化方法用于式D1的化合物(图示D)。
图示D
根据如上的图示D，N-未取代的吡唑可以通过肼与式D2的二羰基化合物或式D4的插烯物酰胺化合物的环缩合反应而形成。这些试剂依次分别地按照与上述类似的方法从酮D3和D5获得。对于R＝R＝H的情况，可以使用Coppola et ah，J.Het.Chem.1974，11，51-56的方法。该方法包括用氯氧化磷和二甲基甲酰胺的预制混合物对式D6的芳基乙酸试剂进行处理。然后碱处理得到甲酸基烯胺产物D4。
其中吡唑环的4-位上连接有芳基之一的式1的化合物的替代性合成如图示E所示。
图示E
根据图示E，之前所述的化合物D2和D4可以用式E2的芳基肼化合物直接缩合，反应条件与使用未取代的肼本身的反应条件类似。当R≠R时，区域选择性可以由R基的大小来控制，并且必须使用本领域技术人员公知的色谱法来分离产物。
对于含有中心咪唑环的式1的化合物，可以将上述的芳基化方法用于式F1的咪唑化合物(图示F)。
图示F
根据图示F，其中以表示卤素、胺或羟基的式F2化合物可以通过环缩合反应而转化成化合物F1。当R＝H时，α-溴代酮(F2，Y＝Br)可以用甲酰胺在高温下(＞150℃)进行处理，以得到咪唑产物。如果芳基和R的大小不同，则可以进行咪唑F1的交叉耦合反应而得到良好的区域选择性；否则可能得到两种异构体，所述两种异构体可以通过色谱法分离。本发明的咪唑还可以通过芳氨基酮底物(F3)与试剂如腈或亚胺酯(imidate)的环缩合反应而制得。对于具有2-氨基取代的化合物，化合物F3还可以用氰酰胺处理以得到2-氨基咪唑。然后可以根据选择将伯氨基官能化。
对于含有中心1，2，4-三唑环的式1的化合物，可以将上述的方法用于式G1的化合物(图示G)。
图示G
根据图示G，另一途径起始于腈试剂G2，所述腈试剂首先用干燥酸(气态HCl或由酸性氯化物原位生成的HCl)在醇溶剂中进行处理。中间体亚胺酯盐然后用芳基肼试剂进行处理，以得到化合物G3。该化合物然后与式R-C(OR′)3的原酸酯试剂进行环缩合反应，以得到产物G4，或者与试剂如羰基二咪唑进行环缩合反应，以得到G5。当化合物G5的Ar1基具有可与1，2，4-三唑氧原子反应的官能度时(例如CH2-Br基位于Ar1环的邻位)，则可以通过烷基化反应形成又一个环。可以使用碱性试剂和/或碱性条件如二甲基甲酰胺中的氢氧化钠或碳酸钾在室温至100℃的温度下进行内烷基化，以得到式G6的化合物。可以通过自由基溴化作用将CH3基转变成CH2Br而在Ar1环上得到邻位-CH2Br基。该反应可以使用试剂如N-溴琥珀酰亚胺在具有溶剂如四氯化碳或氯仿的回流溶液中进行。催化量的自由基引发剂如2，2′氮杂二(2-甲基丙腈)的存在可以有助于该反应。
对于含有中心1，2，3-三唑环的式1的化合物，可以将上述的方法用于式H1的化合物(图示H)。
图示H
根据图示H，三唑可以通过式H2的叠氮化物试剂与式H3的炔试剂的环加成反应而制得。该环加成反应可以在合适的疏质子溶剂中在高温下(如果需要，在密封容器中)进行。任选地，根据Sharpless等人，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.2002，412596-2599的方法，该反应可以在催化剂存在下进行，如五水硫酸铜-抗坏血酸。这些条件使产物产物更高、区域选择性更好。叠氮化合物可以通过使用试剂如亚硝酸钠/亚硝酸或烷基亚硝酸酯试剂首先将式H4的苯胺化合物转变成重氮盐(H5)而制得。所述重氮盐然后用叠氮盐如叠氮化钠处理，以得到叠氮化合物H2。这种转化的例子见于Carnazzi等人，J.Med.Chem.1994，37，1841的著作。炔化合物H3可以通过式和H6的芳基卤化物试剂与式H7的末端乙炔试剂的钯催化交叉耦合反应而制得。含有Pd(0)或Pd(II)的催化剂如二(三苯基膦)二氯化钯可用于该反应。该耦合反应一般在由铜(I)催化剂和作为铜配体的单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺调解，一般作为极性溶剂如二甲基甲酰胺的助溶剂。该反应还可以在适当的高温下进行。
含有中心氧杂二氮酮环的式1的化合物可以通过图示J和K(如下)所示的策略来制备。
图示J
图示K
根据图示J和K，两种变体使用相似的条件，原料使最终产物在一侧或另一侧具有羧基取代。芳基肼试剂(J1或K1)用羧酸试剂(J2或K2)酰基化，以得到酰肼J3或K3。还可以使用适当取代的芳酰基氯化物试剂黄河有机或无机碱来进行该缩合。使用类似羰基二咪唑的试剂在环缩合反应中形成环，得到的酯化合物(J4或K4)水解，以得到羧酸。可以将其他的非亲核酯裂解条件用于该转化。所述方法还可以通过将中间体连接至固体支撑体然后快速分离中间体并释放纯的终产物而进行。
具有硫代二氮酮核心环的式1的化合物可以使用图示L所示的方法制备。
图示L
根据图示L，如上图示J和K中所述的酰肼中间体可以用劳氏试剂(Lawesson′s reagent)处理，以得到中间体含磷杂环产物(L2)。可以用氢氧化物处理来除去磷基，得到的硫代酰肼L3按照与氧杂二氮酮类似的方法进行环缩合，以得到硫代二氮酮L4。然后用上述方法释放游离的羧基。
在一些优选实施方式中，本发明的化合物可以拆分为对映纯的化合物，或者使用本领域公知的方法合成为对映纯的化合物。举例说明，本发明的化合物可以通过如下方法进行拆分：直接将对映异构体混合物结晶，形成对映异构体的非对映异构体盐，形成并分离非对映异构体，或者对外消旋混合物进行酶拆分。
如本领域技术人员所认识到的一样，这些和其他反应方法可以用于制备本发明的化合物。对上述反应式和方法的各种修饰对于本领域技术人员来说是很显然的，本发明并不限于通过特定方法制备本发明的化合物。
C、本发明的方法
本发明的另一方面提供了用于抑制与无义突变相关的翻译提前终止的的方法，以及用于预防或治疗疾病的方法。在优选实施方式中，所述疾病与mRNA突变特别是无义突变相关。典型的疾病包括但不限于癌症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化病、血友病、大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa)以及典型的晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病。在该实施方式中，提供了用于治疗癌症、溶酶体贮积症、肌营养不良、囊性纤维化病、血友病、或典型的晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病的方法，该方法包括对需要的病人给予治疗有效量的至少一种本发明的化合物。
在一实施方式中，本发明是关于用于增加一种或多种特异性、功能性蛋白表达的方法。本发明的任何化合物能用于特别增加功能性蛋白的表达。在另一种实施方式中，当翻译提前终止通过对需要的病人给予治疗有效量的至少一种本发明的化合物而被抑制时，发生了功能蛋白表达的特异性增加。在优选实施方式中翻译提前终止与mRNA中的无义突变相关。在另一实施方式中，当mRNA衰变在病人中减少时，发生了功能性蛋白表达的特异性增加。在优选实施方式中，病人异常由突变介导的mRNA衰变引起。在特别优选实施方式中，突变介导的mRNA衰变为无义突变的结果。本发明的方法不限于任何特殊的理论。
本发明包括通过抑制病人体内翻译提前终止、无义密码子介导的mRNA衰变，或翻译提前终止和无义密码子介导的mRNA衰变而治疗和预防疾病或改善紊乱的方法，所述方法包括给予需要这类治疗或预防的病人治疗有效量的本发明化合物。
在一实施方式中，本发明包括与呈现翻译提前终止、无义密码子介导的mRNA衰变或翻译提前终止和无义密码子介导的mRNA衰变的基因相关的任何疾病。在一实施方式中，所述疾病部分地归因于由提前终止密码子引起的基因表达的缺乏或降低。可能呈现翻译提前终止和/或无义密码子介导的mRNA衰变基因以及与翻译提前终止和/或无义密码子介导的mRNA衰变相关的疾病的特别实例出自于2001年6月21日提交的美国临时专利申请60/390747，题目为“Methods For Identifying SmallMolecules That Modulate Premature Translation Termination And NonsenseMediated mRNA Decay”；以及于2003年6月23日提交的国际申请PCT/US03/19760。这两篇一并完整引入作为参考。
通过抑制翻译提前终止、无义密码子介导的mRNA衰变，或翻译提前终止和无义密码子介导的mRNA衰变而改善的疾病包括但不限于：遗传疾病、躯体疾病(somatic diseases)、癌症、自身免疫性疾病、血液病、胶原病、糖尿病、神经变性疾病、增殖疾病(proliferative diseases)、心血管疾病、肺部疾病、炎症性疾病或中枢神经系统疾病。
在一实施方式中，通过对需要的病人给予治疗有效量的本发明的化合物得以治疗或预防的疾病包括但不限于：淀粉样变、血友病、阿尔茨海默病、泰-萨病、尼-皮病、动脉粥样硬化、巨人症、侏儒症、甲状腺机能减退、甲状腺功能亢进、衰老、肥胖症、帕金森症、囊性纤维化病、肌营养不良、心脏病、肾结石、共济失调性毛细血管扩张症、家族性高胆固醇血症、视网膜色素变性、迪谢纳肌营养不良、大疱性表皮松解症和马方综合征。在一种实施方式中，所述疾病与无义突变相关。
在一实施方式中，本发明所述化合物用于治疗或预防自身免疫疾病。在一实施方式中，所述自身免疫疾病与无义突变相关。在优选实施方式中，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
在另一实施方式中，本发明所述化合物用于治疗或预防血液病。在一实施方式中，所述血液病与无义突变相关。在优选实施方式中，所述血液病为血友病、冯·维勒布兰德病、共济失调性毛细血管扩张症、β地中海贫血症或肾结石。
在另一实施方式中，本发明所述化合物用于治疗或预防胶原病。在一实施方式中，所述胶原病与无义突变相关。在优选实施方式中，所述胶原病为成骨不全或硬化。
在另一实施方式中，本发明所述化合物用于治疗或预防糖尿病。在一实施方式中，所述糖尿病与无义突变相关。
在另一实施方式中，本发明所述化合物用于治疗或预防炎症性疾病。在一实施方式中，所述炎症性疾病与无义突变相关。在优选实施方式中，所述炎症性疾病为关节炎、类风湿性关节炎或骨关节炎。
在另一实施方式中，本发明所述化合物用于治疗或预防中枢神经系统疾病。在一实施方式中，所述中枢神经系统疾病与无义突变相关。在优选实施方式中，所述中枢神经系统疾病为多发性硬化、肌营养不良、迪谢纳肌营养不良、阿尔茨海默病、泰-萨病、尼-皮病、晚婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病(LINCL)或帕金森症。
在另一实施方式中，本发明所述化合物用于治疗或预防癌症，特别是人类癌症。在一种优选实施方式中，所述癌症为头与颈、眼、皮肤、口、咽、食道、胸、骨、血、肺、结肠、乙状结肠、直肠、胃、前列腺、乳房、卵巢、肾、肝、胰腺、脑、肠、心脏或肾上腺的癌症。在另一实施方式中，所述癌症为实体瘤。在一实施方式中，所述癌症与无义突变相关。在另一实施方式中，所述癌症与遗传的无义突变相关。在另一实施方式中，所述癌症与体细胞突变相关。不受任何理论的限制，本发明的化合物的抗癌用途可能与其抗p53基因突变的作用有关。
在一实施方式中，所述癌症不是血液癌。在另一种实施方式中，所述癌症不是白血病。在另一种实施方式中，所述癌症不是多发性骨髓瘤。在另一实施方式中，所述癌症不是白血病。在另一种实施方式中，所述癌症不是前列腺癌。
在另一优选实施方式中，本发明所述化合物用于治疗或预防与肿瘤抑制基因变异有关的癌症。所述基因包括但不限于PTEN、BRCAl、BRCA2、Rb和p53基因。在一实施方式中，所述突变为遗传突变。在另一实施方式中，所述突变为体细胞突变。本发明的方法特别用于治疗或预防与肿瘤抑制基因中的无义突变相关的癌症。在优选实施方式中，本发明的方法特别用于治疗或预防与p53基因相关归因于p53在细胞凋亡中的作用的癌症。不受任何理论的限制，认为通过用有效量的本发明化合物接触细胞，导致无义突变的抑制，从而依次允许全长p53的产生，能诱导细胞凋亡。无义突变已经在p53基因中鉴定，并且已经在癌症中相关。p53基因中的几个无义突变已经被鉴定出来(参见例如Masuda等人，2000，Tokai J Exp Clin Med.25(2)：69-77；Oh等人，2000，MoI Cells10(3)：275-80；Li等人，2000，Lab Invest.80(4)：493-9；Yang等人，1999，Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 21(2)：114-8；Finkelstein等人，1998，MoIDiagn.3(1)：37-41；Kajiyama等人，1998，Dis Esophagus.11(4)：279-83；Kawamura等人，1999，Leuk Res.23(2)：115-26；Radig等人，1998，HumPathol.29(11)：1310-6；Schuyer等人，1998，Int J Cancer 76(3)：299-303；Wang-Gohrke等人，1998，Oncol Rep.5(1)：65-8；Fulop等人，1998，J ReprodMed.43(2)：119-27；Ninomiya等人，1997，J Dermatol Sci.14(3)：173-8；Hsieh等人，1996，Cancer Lett.100(1-2)：107-13；Rail等人，1996，Pancreas.12(1)：10-7；Fukutomi等人，1995，Nippon Rinsho.53(11)：2764-8；Frebourg等人，1995，Am J Hum Genet.56(3)：608-15；Dove等人，1995，Cancer Surv.25：335-55；Adamson等人，1995，Br J Haematol.89(1)：61-6；Grayson等人，1994，Am J Pediatr Hematol Oncol.16(4)：341-7；Lepelley等人，1994，Leukemia.8(8)：1342-9；Mclntyre等人，1994，J Clin Oncol.12(5)：925-30；Horio等人，1994，Oncogene.9(4)：1231-5；Nakamura等人，1992，Jpn JCancer Res.83(12)：1293-8；Davidoff等人，1992，Oncogene.7(1)：127-33以及Ishioka等人，1991，Biochem Biophys Res Commun.177(3)：901-6；thedisclosures of which are hereby incorporated by reference herein in theirentireties)。与p53基因编码翻译提前密码子相关的任何疾病，包括但不限于上述引用参考文献中所述的无义突变，能通过本发明化合物得到治疗或预防。
在其他的实施方式中，通过对需要的病人给予治疗有效量的本发明的化合物得以治疗或预防的疾病包括但不限于：实体瘤诸如肉瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、血液产生的肿瘤或多发性骨髓瘤。
在另一实施方式中，通过对需要的病人给予治疗有效量的本发明的化合物得以治疗或预防的疾病包括但不限于：急性成淋巴细胞性白血病、B细胞型急性淋巴细胞白血病、T细胞型急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性成单核细胞性白血病、急性红白血病、急性成巨核细胞白血病、急性粒单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病或多发性骨髓瘤。参见例如Harrison′s Principles of Internal Medicine，Eugene Braunwald等人编辑，pp.491-762(第15版，2001)。
在另一实施方式中，本发明包括对折磨人类的实体瘤和血液肿瘤的治疗。
在优选实施方式中，本发明包括一种治疗或预防疾病的方法，该方法通过调节翻译提前终止、无义密码子介导的mRNA衰变，或翻译提前终止和无义密码子介导的mRNA衰变而改善疾病或改善一种或几种与之相关的症状，所述方法包括使细胞与治疗有效量的本发明化合物接触。包括在本发明方法中的细胞包括动物细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞以及病毒感染的细胞。在一种实施方式中，所述无义密码子突变为遗传突变(即在祖先DNA(progenitor DNA)中存在无义密码子)。在另一中实施方式中，所述无义密码突变为体细胞突变(即所述无义密码子自发或通过诱变产生)。
在一些实施方式中，本发明化合物作为对抗与翻译提前终止、无义介导的mRNA衰变或翻译提前终止和无义密码子介导的mRNA衰变相关的疾病的预防措施，给药的受治对象包括但不限于植物、爬行动物、鸟类、两栖动物或优选哺乳动物更优选人类。
在优选的实施方式中，首先确定病人患有与翻译提前终止和/或无义密码子介导的mRNA衰变相关疾病。在另一种实施方式中，病人经过筛选过程以确定存在无义密码子突变，所述筛选过程包括通过可接受无义突变密码子筛选测定，筛选受治对象或筛选从受治对象中提取的细胞的步骤。在优选实施方式中，所述病人的DNA能通过测定其序列或进行DNA印迹(Southern Blot)、聚合酶链式反应(PCR)、应用短串联重复(STR)或限制性片段长度多态性(RFLP)分析，确定是否在病人的DNA中存在无义突变。在一实施方式中，通过与祖(progenitor)DNA比对确定所述无义突变是遗传突变还是体细胞突变。任选地，能通过蛋白质印迹或其他免疫测定法，测定病人表达的无义突变蛋白水平是否变化来确定所述无义突变是遗传突变还是体细胞突变。在另一种实施方式中，所述病人为在子宫中接受无义突变存在筛选的未出生的孩子。本发明的化合物既可以在出生前也可以在出生后给药。在相关的实施方式中，所述治疗个人化，其中筛选病人进行无义突变筛选测定，并通过给予本发明化合物治疗；特别地，可以用特别适于例如依照疾病类型、细胞类型以及有问题的基因而定的有问题突变的化合物治疗所述病人。所述方法为本领域技术人员公知。
在另一实施方式中，用例如如上所述的方法(即细胞的DNA能通过测定其序列或进行DNA印迹、聚合酶链式反应、应用短串联重复或限制性片段长度多态性分析，确定是否在病人的DNA中存在无义突变；细胞的RNA可以通过定量实时PCR测定转录丰度)筛选出翻译提前终止和/或无义密码子介导的mRNA衰变的细胞(例如动物细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、植物细胞以及病毒感染的细胞)。
本发明的具体方法还包括给予另外的治疗试剂(即不同于本发明化合物的治疗试剂)。在本发明的特定实施方式中，本发明的化合物可以与至少一种其他治疗试剂结合使用。治疗试剂包括但不限于：非阿片样镇痛药、非甾体抗炎药、类固醇、镇吐剂、β-肾上腺素阻滞剂、抗惊厥剂、抗抑郁药、Ca2+通道阻滞剂、抗癌剂和抗生素以及它们的混合物。
在一些实施方式中，本发明的化合物可以结合抗癌剂给药或配制。合适的抗癌试剂包括但不限于：烷化剂、氮芥、叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、纺锤体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、鬼臼毒素、亚硝基脲、顺铂、碳铂、干扰素、，天冬酰胺酶(asparginase)、三苯氧胺、亮丙瑞林、氟他米特、甲地孕酮、丝裂霉素C、，争光霉素、阿霉素、依立替康和紫杉酚。
在一些实施方式中，本发明的化合物可以结合抗生素给药或配制。在一些实施方式中，所述抗生素为氨基糖甙(例如妥布霉素)、头孢菌素(例如先锋霉素IV、头孢霉定、头孢呋新、头孢罗齐、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素(例如克拉霉素)、大环内酯(例如乙基琥珀酸红霉素酯)、青霉素(例如青霉素V)或喹诺酮(例如氧氟沙星、环丙沙星或氟哌酸)。在一优选实施方式中，所述抗生素有效抗绿脓假单胞菌活性。
不为受理论限制，认为本发明的方法通过抑制无义突变的机制综合起作用。在优选实施方式中，本发明所述方法包括给予治疗有效量的至少一种本发明的化合物例如式1所示的化合物。本发明化合物的相对活性可以通过本领域公知的任何方法测定，包括本文实施例2描述的测定。
本发明的化合物可以用体外荧光素酶无义突变抑制测定表征。荧光素酶测定包括在本发明的方法中。荧光素酶可以用作功能报告基因测定(只有蛋白有功能才产生光)，并且荧光素酶非常灵敏(光密度在nM范围与荧光素酶浓度成比例)。在一实施方式中，本发明的测定为基于细胞的荧光素酶报告测定。在优选基于细胞的荧光素酶报告测定中，含有提前终止密码子(UGA、UAA或UAG)的荧光素酶报告构建体稳定转染入293人胚肾细胞中。
在本发明的另一测定中，优选的测定为包括兔网织红细胞溶胞产物和含有无义密码子的荧光素酶报告子mRNA的生物化学测定。在本发明的另一个测定中，所述测定包括制备并优化的细胞提取物的生物化学测定(Lie & Macdonald，1999，Development 126(22)：4989-4996和Lie &Macdonald，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.270(2)：473-481)。在生物化学测定中，含有提前终止密码子(UGA、UAA或UAG)的mRNA在体外翻译反应中用作报告子，使用添加tRNA、氯高铁原卟啉、肌酸激酶、氨基酸、KOAc、Mg(OAc)2以及磷酸肌酸的兔网织红细胞溶胞产物。mRNA的翻译在病毒来源的引导序列中起始，因为不需要加帽的RNA，显著降低了测定的成本。使用T7启动子和MegaScript体外转录试剂盒(Ambion，Inc.；Austin，Texas)在体外制备合成mRNA。在本发明的测定中，已知庆大霉素、氨基糖甙的添加允许通读提前终止密码子，导致增强的荧光素酶活性，并能用作内标。本发明的分析可被用于高通量筛选中。成百上千的化合物能够在本发明基于细胞的生物化学测定中筛选。在优选的方面，基于细胞的功能性测定与所述的测定类似。
本发明的化合物包括能从包括提前终止密码子的mRNA分子提高特异性功能蛋白表达的化合物。在一种实施方式中，本发明的化合物能优先抑制翻译提前终止。例如：如果突变产生UAA，本发明的化合物能抑制该无义突变；但是如果所述突变产生UAG，本发明的化合物不能抑制该无义突变。能发生另一种非限定性的实例，如果突变产生UAA并且在+1位置紧接符合阅读框(in-frame)的胞嘧啶，本发明的化合物能抑制无义突变，但是如果突变产生UAA并且在+1位置紧接符合阅读框的腺嘌呤，本发明的化合物不能抑制无义突变。
带有含UGA无义密码子荧光素酶基因的稳定细胞系可以用待测化合物处理。在此方面，细胞可以生长在补充有1％青霉素-链霉素(P/S)和10％胎牛血清的标准培养基中至70％铺满，在处理前一天1∶1拆分。第二天，胰蛋白酶作用细胞，并且在96孔组织培养皿的每一孔中加入40000个细胞。制备每种化合物的系列稀释液，以产生六个点跨越2个log(30μM至0.3μM)的剂量响应曲线。二甲亚砜溶剂的终浓度保持常量每孔1％。用1％二甲亚砜处理后的细胞作为本底标准，并且用庆大霉素处理后的细胞作为阳性对照。
为阐述抑制特定遗传疾病改变的mRNA上无义密码子化合物的效果，在1282氨基酸处(W 1282X)带有无义突变密码子的支气管上皮细胞系能用本发明的化合物处理，并且用硫丙基喹啉(sulfopropylquinolinium，SPQ)测定监视作为cAMP激活的氯化物通道的囊性纤维化跨膜转导调节因子的功能(Yang等人，Hum.MoI.Genet.2(8)：1253-1261(1993)and Howard等人，Nat.Med.2(4)：467-469(1996))。在用本发明化合物处理的细胞中SPQ荧光的增加，与用cAMP处理的细胞以及未经处理细胞的SPQ荧光进行比较。细胞中SPQ荧光的增加与CFTR介导的卤化物溢出的刺激以及无义密码子的通读增加一致。从用本发明化合物处理后的含无义密码子等位基因表达全长CFTR，证明当用本发明化合物处理后，囊性纤维化细胞系提高了氯化物通道活性。
D、本发明化合物的代谢产物
这里所述的化合物在体内的代谢产物同样落入本发明范围。所述产物可以起因于例如给药化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等，主要归因于酶的处理。因此，本发明包括通过一种方法产生的化合物，该方法包括使本发明的化合物与哺乳动物组织或哺乳动物接触一段时间，足以产生该化合物的代谢产物。所述化合物通常通过制备放射性标记的本发明化合物(例如C14或H3)，以可测剂量(多于约0.5毫克/千克)给予诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴子的哺乳动物或者人，允许发生新陈代谢的足够的时间(通常约为30秒至30小时)，并且从尿、血或其他生物学样本中分离转化的产物而鉴定。这些产物由于被标记因此很容易分离(通过使用能结合在代谢产物上存在的抗原表位的抗体与其他物质分离)。所述代谢产物的结构以常规的方式鉴定，例如质谱(MS)或核磁共振(NMR)分析。一般而言，代谢产物的分析可以用本领域技术人员公知的与常规药物研究相同的方法完成。所述转化产物，只要它们不是与体内发现的不同，都有益于本发明化合物治疗剂量的诊断测定，即使它们本身什么没有生物学活性。
E、本发明的药物组合物
虽然可能以纯的本发明化合物给药，但是优选配方该化合物成药物组合物。照此，在本发明另一个方面，提供了用于本发明方法中的药物组合物。本发明的药物组合物可以根据给药的具体方式以及剂量组成，与诸如载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等的药学可接受的赋形剂制剂。所述药物组合物一般应当制成达到生理适合pH的制剂，根据制剂以及给药途径，范围可以从pH约3至pH约11，优选pH约3至pH约7。在另一种实施方式中，本发明药物组合物的pH可以调节到pH约4至pH约7。在可选的实施方式中，优选调节pH的范围为pH约5至pH约8。
更具体地，本发明的药物组合物包括治疗或预防有效量的至少一种本发明化合物，以及一种或多种药学可接受的赋形剂。任选地，本发明的药物组合物可以包括本发明化合物的组合，或可以包括有益于癌症、糖尿病性视网膜病变、渗出性黄斑变性治疗的第二活性成分。
本发明的制剂，例如用于肠胃外或口服给药的，大多为通常的固体、液体溶液、乳剂或悬浮剂，而用于肺给药的可吸入制剂，一般为液体或粉末，一般优选粉末制剂。本发明优选的药物组合物还可以制成冻干固体制剂，在给药前用生理可接受溶剂重新溶解配成原来浓度。可选的本发明药物组合物可以制成糖浆剂、乳膏、软膏剂、片剂等。
本发明的药物组合物能通过现有技术公知的任何药物给药途径给予受治者。具体典型的给药途径包括口、眼(ocular)、直肠、颊、局部、鼻、眼(ophthalmic)、皮下、肌内、静脉(推注和滴注)、大脑内、经皮，以及肺的给药。
术语“药学可接受的赋形剂”是指用于诸如本发明化合物的药物制剂的给药赋形剂。该术语指任何给药没有过度毒性的药物赋形剂。药学可接受的赋形剂部分地由具体给药的组合物以及用于该组合物给药的具体方法决定。因此，本发明药物组合物存在广泛多样的适合制剂(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.，Mack Publishing Co.，1990)。
合适的载体可以运载包括大型、代谢慢的大分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物以及灭活病毒颗粒。。其他典型的赋形剂包括诸如抗坏血酸的抗氧化剂，诸如EDTA的螯合剂，诸如糊精、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸的碳水化合物，诸如油、水、生理盐水、甘油和乙醇的液体，润湿或乳化剂，pH缓冲物质等。脂质体也包括在药学可接受的赋形剂的定义内。
本发明药物组合物可以制成任何适于指定给药方法的制剂形式。当计划用于口服使用时，可以制备例如片剂、含片(troches)、锭剂、水悬浮剂或有悬浮剂、非水溶液、可分散性粉末或颗粒(包括微粒化的颗粒或纳米颗粒)、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆剂、酏剂。计划口服使用的组合物可以根据本领域公知的任何制备药物组合物的方法制备，并且所述组合物可以含有一种或多种包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂以提供可口的制品。
特别适于与片剂结合使用的药学可接受的赋形剂包括例如诸如纤维素、碳酸钠或碳酸钙、乳糖、磷酸钠或磷酸钙的惰性稀释剂，诸如交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯酮、玉米淀粉或褐藻酸的崩解剂，诸如聚乙烯吡咯酮、淀粉、明胶或阿拉伯胶的粘合剂，以及诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石的润滑剂。片剂可以不包衣，或者用包括微囊法的公知技术包衣以延迟崩解并在胃肠道中吸收，从而因此在较长时期里提供持续活性。例如可以单独或与蜡一起使用诸如单硬酯酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的时间延迟物质。
口服使用的制剂还可以作成硬明胶胶囊，其中活性成分与例如纤维素、乳糖、磷酸钙或高岭土的惰性固体稀释剂混合，或者作成软明胶胶囊，其中活性成分与例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、花生油、液体石蜡或橄榄油的非水或油性介质混合。
在另一种实施方式中，本发明药物组合物可以作成悬浮剂制剂，包括混合有至少一种适于制备悬浮剂的药学可接受的赋形剂的本发明化合物。在另一种实施方式中，本发明的药物组合物可以通过加入适宜的赋形剂制成适于制备成悬浮液的分散性粉末以及颗粒制剂。
适合用于与悬浮液相关的赋形剂包括诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶、阿拉伯胶的悬浮剂，诸如天然产生的磷脂(如卵磷脂)的分散剂或湿润剂，烯烃氧化物与脂肪酸的缩合物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合物(如十七烷乙烯氧化乙醇(heptadecaethyleneoxycethanol))，环氧乙烷与具有得自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合物(如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)，以及卡波姆、蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇的增稠剂。所述悬浮剂还可以含有一种或多种诸如乙酸、甲基和/或正丙基对羟基苯甲酸甲酯防腐剂，一种或多种着色剂，以中或多种调味剂以及一种或几种诸如蔗糖或糖精的甜味剂。
本发明药物组合物还可以为水包油乳剂形式。所述油相可以为例如橄榄油或花生油的植物油，例如液体石蜡的矿物油，或者它们的混合物。适合的乳化剂包括诸如阿拉伯胶或西黄蓍胶的天然产生的胶，诸如大豆卵磷脂的天然产生的磷脂，得自脂肪酸和己糖醇酐的酯或部分酯例如失水山梨醇单硬脂酸酯，以及这些部分酯与环氧乙烷的缩合物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。所述乳剂还可以包括甜味剂和调味剂。糖浆剂和酏剂可以用诸如甘油、山梨醇或蔗糖的甜味剂制成制剂。所述制剂还可以包括湿润剂、防腐剂、调味剂或着色剂。
此外本发明的组合物可以制成无菌注射制品形式，例如无菌注射水性乳剂或油状悬浮剂(oleaginous suspension)。所述乳剂或悬浮剂可以根据已知现有技术使用上述所述的合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂制备。所述无菌注射制品还可以为无毒肠胃外可接受稀释剂或诸如丙二醇的溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。所述无菌注射液制品还可以制备成冻干粉末。可以使用的可接受载体和溶剂中包括水、林格氏液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油可以用作溶液或悬浮液介质。为此目的，可以使用任何温和不挥发的油包括合成单甘油酯或甘油二酯。此外，诸如油酸的脂肪酸同样可以用于可注射制品。
一般而言，在本发明方法中有益的本发明的化合物基本上不能溶解于水，并且在少量可溶于大多数药学可接受的质子溶剂以及植物油。然而，所述化合物通常可溶于长链脂肪酸(例如辛酸和癸酸)或甘油三酯介质中，并在丙二醇的中碳链脂肪酸酯中具有高度溶解性。本发明中还考虑了被取代或添加化学或生物化学部分(moiety)而修饰的化合物，所述部分使化合物更适合于给药(例如增加可溶性、生物活性、可口性、减少不利反应等)，例如：通过酯化作用、糖基化作用、聚乙二醇化作用(PEGylation)等。
在优选具体实施方式中，本发明所述化合物可以在适合于低溶解性化合物的脂质制剂(lipid-based formulation)中制成用于口服给药的的制剂。脂质制剂一般能提高所述化合物的口服生物利用度。照此，优选的本发明药物组合物包括治疗或预防有效量的本发明化合物、至少一种选自由中碳量脂肪酸或其丙二醇酯(例如：诸如辛酸和癸酸的可食用脂肪酸的丙二醇酯)组成的组中的药学可接受赋形剂，以及诸如聚乙二醇40氢化蓖麻油的药学可接受表面活性剂。
在可选的优选实施方式中，环糊精可以作为水溶解性增加剂加入。优选的环糊精包括α-、β-和γ-环糊精的羟丙基、羟乙基、葡萄糖基、麦芽糖基和-麦芽三糖基衍生物。特别优选的环糊精水溶解性增加剂为羟丙基-β-环糊精(HPBC)，可以加入上述任何物组合物组中，以进一步提高本发明化合物的水溶解特性。在一种实施方式中，所述组合物包括0.1％至20％的羟丙基β-环糊精，更优选1％至15％的羟丙基β-环糊精，甚至更优选2.5％至10％的羟丙基β-环糊精。使用的溶解性增加剂的量取决于本发明的化合物在组合物中的量。
这里所用的治疗有效量是指本发明药物组合物治疗、改善或调解已鉴定的疾病或状态、或者显示出可测治疗或抑制效果的量。所述效果能够通过例如本发明的测定法测得。所述效果还可以为预防在个体或高百分率的人群中预测到的疾病或状态。
受治者精确的有效量取决于受治者的体重、身高以及健康；状态的性质和程度；给药选择的治疗或治疗的组合、蛋白质的半衰期、mRNA的半衰期以及蛋白的定位。给定情况的治疗有效量可以通过临床医生技能和判断范围内的常规实验测定。
对于任何化合物，治疗有效量最初能够在例如瘤细胞的细胞培养测定，或者在通常为大鼠、小鼠、兔、犬或猪的动物模型中估计。所述动物模型还可以用于测定合适的浓度范围和给药途径。然后上述信息能被用于测定人类中有效剂量和给药途径。治疗/预防的有效性和毒性可以通过标准药物操作在细胞培养物或实验动物中测定，例如ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(在50％群体中致死的剂量)。毒性和治疗效果的剂量比为治疗指数，并且可以表达为比例LD50/ED50。优选显示出治疗指数大的药物组合物。得自细胞培养测定以及动物研究的数据可以用于计算人用制剂的剂量范围。在所述组合物中含有的剂量优选为低毒或无毒的包括ED50的循环浓度范围内。所述剂量可以根据应用剂量形式、病人敏感度以及给药途径在此范围内变化。
更具体地，关于本发明化合物观察到的浓度-生物学效果关系表明初始的血浆靶浓度的范围为从大约5微克/毫升至大约100微克/毫升，优选为从大约10微克/毫升至大约50微克/毫升，更优选为大约10微克/毫升至大约25微克/毫升。为了达到上述血浆浓度，本发明所述化合物根据给药途径，以从1毫克/千克至150毫克/千克的变化剂量给药。文献中提供了关于具体给药剂量和给药方法的指导，并且所述文献为本领域的开业医生普遍可得。一般而言，所述剂量范围为约1毫克/天至约10克/天，或者为约0.1克/天至约3克/天，或者为约0.3克/天至约3克/天，或者为约0.5克/天至约2克/天，以单次剂量、分份剂量或连续剂量给予约40至约100千克体重的病人(其中剂量可以为高于或低于此体重范围的病人，特别是低于40千克的儿童进行调整)。
然而，本发明特殊活性成分在急性或慢性疾病或状况的处理中的预防或治疗剂量的量值，将随疾病或状况的性质和严重程度，以及活性成分的给药途径而变化。所述剂量以及大概剂量频率也根据个体病人的年龄、体重和应答而变化。本领域技术人员能够容易地根据对上述因素适当考虑，选择合适的剂量服用法。一般而言，由于这里所述存在的情况，推荐每日剂量范围为每天从约1毫克/千克至约150毫克/千克。在一种实施方式中，本发明的化合物作为一天单独一次的剂量给予。在另一种实施方式中，本发明的化合物作为分份剂量贯穿一天给予。更具体地，以单次剂量或相等的分份剂量给予每日剂量。优选地，每日剂量范围应该为每天从约5毫克/千克到约100毫克/千克，更优选地，为约10毫克/千克到约90毫克/千克之间每天，甚至更优选为20毫克/千克到60毫克/千克每天。在住院病人中，所述治疗应该以较低剂量开始，大概约200毫克至300毫克，根据病人的整体反应情况，如果必要以单次剂量或分份剂量增加至每天约600毫克至约4000毫克。在某些情况下，必需使用的活性成分剂量超出这里公开的范围，对本领域普通技术人员显而易见。此外，值得注意的是临床医师或治疗内科医师了解如何以及何时中断、调整或终止治疗结合个体病人的反应。
本领域普通技术人员很容易了解不同的治疗有效量可以用于不同的疾病和状况。类似地，足以治疗或预防所述疾病的量，但是不足以引起或足以减少伴随常规治疗不利效果的量也包括在上述剂量的量和剂量频率时间表中。
如前文所述，精确剂量将由医生根据与要求治疗的受治者相关的因素测定。剂量和给药得以调整以提供足够水平的活性试剂或保持所需的效果。需要考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受治者的全身健康状态、受治者的年龄、体重以及性别、饮食、时间、感兴趣蛋白的半衰期、感兴趣RNA的半衰期、给药的频率、药物组合、反应敏感性以及对治疗的耐受/应答。长效药物组合物可以根据具体制剂的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周给药一次。
F、联合疗法
任何本发明的化合物可能组合一种或多种有益于这里所述的与mRNA无义突变相关疾病的治疗其他活性成分，包括单一剂量的形式、分离剂量形式同时或连续给予需要治疗病人的化合物。当连续给药时，所述组合物可能给药两次或者更多次。在可选实施方式中，本发明的一种或多种化合物以及一种或多种另外的活性成分可能以不同途径给药。
本领域技术人员会认识到各种活性成分能与本发明化合物组合给药，能起到增强或协同增强本发明化合物的抑制无义突变活性。
根据本发明的方法，活性成分的组合可以是：(1)共同制剂并且给药，或在组合制剂中同时给药；(2)作为单独制剂交替给药或平行给药；或(3)本领域公知任何其他组合治疗用药法。当交替治疗给药时，本发明所述方法可以包括连续给予或递送活性成分，例如在单独的溶液、乳剂、悬浮剂、片剂、丸剂或胶囊剂中，或者通过单独的注射器进行不同的注射。一般而言，在交替治疗中，每种活性成分的有效剂量得以连续给药，即，连续地，但是在同时的治疗中，两种或两种以上活性成分的有效剂量一起给药。也可以使用各种顺序的间隔组合治疗。
G、基因治疗
本发明的化合物或其他无义化合物(nonsense compound)能与基因治疗结合应用。在此实施方式中，基因可以被引入或提供给在所需基因中含有特定无义突变的哺乳动物，优选人类。在优选方面，所需基因选自由IGF1、EPO、p53、p19ARF、p21、PTEN、EI24和ApoAI组成的组中。为了得到病人或哺乳动物中全长多肽的表达，当该多肽是所需的多肽时，将给所述病人或哺乳动物提供有效量的本发明化合物或其他无义化合物。
主要有两种途径使含有无义突变的核苷酸(选择性的在载体中含有)到达病人细胞中：体内和体外。对于体内给药，如果已知，通常在需要所述多肽的位点，即该多肽的合成位点以及需要所述多肽生物学活性的位点(例如实体瘤)，直接将核苷酸注射给病人。对于体外治疗，移出病人细胞，将核苷酸引入所述分离的细胞，并将改良的细胞或者直接给予病人，或者例如包被在多孔膜中植入病人(参见例如US 4892538和US 5283187)。有多种技术可供将核苷酸引入活细胞。所述技术根据核苷酸转入体外培养细胞，或转入预期宿主的体内细胞而变化。适合于体外转移核苷酸进入哺乳动物细胞的技术包括脂质体、电穿孔术、显微注射、转导、细胞融合、二乙氨基乙基葡聚糖、磷酸钙沉淀方法等的应用。转导包括复制缺陷重组病毒(优选逆转录病毒)粒子与细胞报告子的联合，然后将含在所述粒子中核苷酸的引入细胞。通常用于基因体外给药的载体为逆转录病毒。
现有优选体内核的转导技术包括用病毒或非病毒载体(例如腺病毒、慢病毒属、单纯疱疹I型病毒或腺病毒伴随病毒(adeno-associatedvirus，AAV))以及基于脂质系统(对脂介导的基因转移有用的脂类例如DOTMA、DOPE和DC-Choi；参见例如Tonkinson el al，CancerInvestigation，14(1)：54-65(1996))的转染。用于基因治疗最优选的载体为病毒，最优选腺病毒、AAV、慢病毒属或逆转录病毒。例如逆转录病毒载体的病毒载体包括至少一个转录启动子/增强子或基因座定义元件(locus-defining element)，或者通过诸如交替剪接、核RNA导出、或者翻译后修饰信使的另外方式来控制基因表达的其他元件。此外，诸如逆转录病毒载体的病毒载体包括一种核酸序列，当转录编码多肽的基因时，该核酸序列可操作地连接于编码序列，起翻译起始序列作用。所述载体构建还包括包装信号，长末端重复(long terminal repeats，LTRs)或其部分，以及适合于所用病毒的正义链和反义链引物结合位点(如果仍没有存在于病毒载体中)。此外，所述载体通常包括用于从多肽所在的宿主细胞中分泌该多肽的信号序列。优选所述用于此目的的信号序列为哺乳动物信号序列，更优选该多肽的天然信号序列。可选地，所述载体构建体还可以包括指导多腺苷酸化信号，以及一种或多种限制位点和翻译终止序列。通过实例，所述载体通常包括5’LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成起始点，以及3’LTR或其部分。可以使用的其他载体为非病毒载体，例如阳离子脂质、多聚赖氨酸和树突三聚体(Dendrimer)。
在某些情况下，需要提供核酸放射源以及靶向靶细胞的试剂，诸如特异性细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体、靶细胞上受体配基等。在使用脂质体的地方，结合细胞表面膜蛋白的与内吞作用相关的蛋白可以用来靶向和/或促进摄取，例如衣壳蛋白或其片段趋向特定细胞类型，在循环中经受细胞内摄作用的蛋白的抗体，以及靶向细胞内定位并提高细胞内半衰期的蛋白。受体介导(recpto-mediated)的内吞作用技术通过例如Wu等人，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)和Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：3410-3414(1990)得到描述。为了回顾现有已知的基因标记和基因治疗方案，参见Anderson等人，Science 256：808-813(1992)，还参考WO 93/25673，以及这里引用的文献。
适合的基因治疗以及制备逆转录病毒粒子和结构蛋白的方法可以从诸如US 5681746、US 6800604和US 6800731中找到。
包括了以下实施例以辅助理解本发明。关于本发明的实验当然不应当解释为对本发明的特别限定，并且本发明在本领域技术人员眼界中的现在已知或者以后发展的变化，都认为落入这里所述以及在下文中要求的本发明的范围中。
实施例
参照下面的非限定性实施例来更详细地描述本发明，这些实施例用于更充分地说明本发明，而不能理解为限定本发明的范围。这些实施例阐述了本发明某些化合物的制备，这些化合物的体内和/或体外测试。本领域技术人员将理解这些实施例所述的技术作为实现本发明的优选模式，表示本发明人描述的用于很好地实现本发明的技术。然而，本领域技术人员应当理解的是，根据本发明公开的内容，对于公开的具体方法可以做合适的改变，并且仍可获得类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1：本发明化合物的制备
A.吡咯的制备
一般地，本发明的吡咯可以如下制备：
3-[1-(4-三氟甲基苯基)-]-1H-吡咯-3-基]苯甲酸钠盐(化合物14)的制备
A部分.往1-(三异丙基甲硅烷基)吡咯-3-硼酸(根据Alvarez，A.；Guzman，A.；Ruiz，A.；Velarde，E.，J.Org.Chem.1992，57，1653-1656的方法制备)(6.12g，22.9mmol)在无水二甲氧基乙烷(76毫升)的溶液中加入4-碘苯甲酸甲酯(96.61g，25.2mmol)、二氯双(三苯基膦)钯(II)(0.484g，0.69mmol)和氟化铯(6.96g，45.8mmol)。将该混合物在氮气气氛下加热回流17小时。反应混合物冷却至室温，用水(100毫升)稀释，并用乙酸乙酯(4×25mL)提取。提取物用水洗涤，用MgSO4干燥，并浓缩得到粗产物。该产物用硅凝胶色谱法(5-15％乙酸乙酯/己烷)提纯，得到2.69g为白色固体的4-(1H-吡咯-3-基)苯甲酸甲酯(收率：58％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ3.83(s，3H)，6.53(m，1H)，6.83(m，1H)，7.35(m，1H)，7.66(d，2H，J＝8.4Hz)，7.86(d，2H，J＝8.4Hz)，11.11(br s，1H)。
B部分.往4-(1H-吡咯-3-基)苯甲酸甲酯在无水二噁烷(67mL)的溶液中加入4-碘三氟甲苯(4.39g，16.1mmol)、二氧化铜(0.255g，1.34mmol)、乙二胺(81mg，1.35mmol)和磷酸钾(10.16g，44.1mmol)。将该混合物在氮气气氛下加热回流20小时，然后冷却至室温。将固体过滤，用乙酸乙酯洗涤并弃去。将滤出液浓缩，得到深色固体，该深色固体用水(50mL)稀释并用乙酸乙酯(3×20mL)提取。提取物用水(2×20mL)洗涤，合并，用，MgSO4干燥，浓缩，得到粗产物。该粗产物用硅凝胶色谱法(5-20％乙酸乙酯)提纯，得到为白色固体的2.00g 3-[1-(4-三氟甲基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸甲酯(收率：73％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ3.93(s，3H)，6.75(m，1H)，7.19(m，1H)，7.50(m，1H)，7.55(d，2H，J＝8.7Hz)，7.63(d，2H，J＝6.6Hz)，7.73(d，2H，J＝8.4Hz)，8.04(d，2H，J＝6.6Hz)。
C部分.往3-[1-(4-三氟甲基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸甲酯(1.24g，3.59mmol)在叔丁醇(4mL)和水(16mL)的悬浮体中加入氢氧化钠(0.215g，5.38mmol)。将该反应混合物在氮气气氛下加热回流4小时，然后冷却至室温。将固体过滤，用水(3×4mL)洗涤，干燥，得到为灰色固体的0.90g产物(收率：71％)。MS(ES+)：m/z 332.61。
D部分.3-[1-(4-三氟甲基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸的钠盐的一部分用1N aq.HCl中和，然后过滤、水洗涤并真空干燥，得到游离酸。熔点；224-226℃。MS(ES+)：m/e 332.28(100)。MS(ES-)：m/e 330.31(100)。
4-[1-(4-三氟甲基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸(化合物105)
A部分.往甲基三苯基溴化鏻(10.88g，30.46mmol，1eq.)和叔丁氧化钾(31mL，1M的THF溶液，30.46mmol，1eq.)在THF中的浆料中加入4-甲酰苯甲酸甲酯(5.0g，30.46mmol，1eq.)。将浅黄色的反应混合物在室温下搅拌5小时。加入己烷，搅拌10分钟后，将混合物过滤并用己烷洗涤两次。真空除去溶剂，将粗制的油状残余物用硅凝胶色谱法(0-14％乙酸乙酯/己烷)提纯，得到3.76g白色油状固体，4-乙烯基苯甲酸甲酯(23.21mmol，76.2％yield)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.99(2H，d，J＝9Hz)，7.45(2H，d，J＝9Hz)，6.76(1H，dd，J＝17，11Hz)，5.86(1H，d，J＝17Hz)，5.37(1H，d，J＝11Hz)，3.91(3H，s)。
B部分.在氮气下将叔丁氧化钠(3.681g，38.3mmol，2.0eq.)悬浮在无水DMSO中。通过套管向其中转入4-乙烯基苯甲酸甲酯(3.11g 19.15mmol，1.0eq.)和甲苯磺酰基异腈(4.86g，24.89mmol，1.3eq.)在无水DMSO中的溶液。将该深棕色混合物在室温下搅拌16小时。加入10％10％HCl溶液将混合物的pH调至6，用水稀释并用乙酸乙酯(3×50mL)提取。合并的有机提取物用水(2×50mL)和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩。粗制的残留物用硅凝胶色谱法(20-40％乙酸乙酯/己烷)提纯，得到990mg(4.92mmol，25.7％)膏状有色固体4-(1H-吡咯-3-基)苯甲酸甲酯。MS(ES+)：m/e 201.08.1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.39(1H，br s)，8.00(2H，d，J＝9Hz)，7.58(2H，d，J＝9Hz)，7.20(1H，m)，6.85(1H，m)，6.60(1H，m)，3.91(3H，s)。
C部分.往4-(1H-吡咯-3-基)苯甲酸甲酯(402mg，1.997mmol，1.0eq.)和4-三氟甲基-1-碘苯(652mg，2.39mmol，1.2eq.)在无水1，4-二噁烷(15mL)的搅拌溶液中加入铜(I)碘化物(38mg，0.199mmol，0.1eq.)、乙二胺(13μL，0.199mmol，0.1eq.)和三磷酸钾(762mg，1.66mmol，3.31eq.)。反应混合物除去气体，用氮气冲洗并加热回流18小时。反应混合物冷却、过滤并用乙酸乙酯洗涤。滤出液浓缩并用硅凝胶色谱法(10％乙酸乙酯/己烷)提纯，得到白色粉末4-[1-(4-三氟甲基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸甲酯(363.2mg，1.05mmol，52.7％)。MS(ES+)：m/e 345.11.1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.04(2H，d，J＝8Hz)，7.72(2H，d，J＝8Hz)，7.63(2H，d，J＝8Hz)，7.54(2H，d，J＝8Hz)，7.50(1H，m)，7.18(1H，m)，6.75(1H，m)，3.93(3H，s).
D部分.4-[1-(4-三氟甲基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸甲酯(150mg，0.434mmol，1eq.)悬浮在10mL of75％乙醇/水中。加入氢氧化钾(73μL1M溶液，3.0eq.)，将混合物在60℃下加热6小时。混合物用水稀释并用氯仿(2×3mL)洗涤。将水层酸化至pH 3，得到的沉淀过滤并用水洗涤。白色固体高度真空干燥，得到标题产物121mg(0.365mmol，84.15％)。熔点：315-317℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.03(1H，m)，7.90(2H，d，J＝8Hz)，7.83-7.76(4H，m)，7.58(1H，m)，7.52(2H，d，J＝8Hz)，6.76(1H，m).MS(ES+)：m/e 332.24(100)。MS(ES-)：m/e 330.25(100)。
使用修改的上述方法，可以制得以下化合物。
化合物6
3-[1-(4-异丙基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点210-215℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.30(1H，s)，7.92(1H，d，J＝8Hz)，7.80(1H，d，J＝8Hz)，7.46(1H，t，J＝8Hz)，7.44(1H，s)，7.37(2H，d，J＝8Hz)，7.31(2H，d，J＝8Hz)，7.11(1H，d，J＝2Hz)，6.69(1H，d，J＝2Hz)，2.96(1H，heptet，J＝7Hz)，1.29(6H，d，J＝7Hz).MS(ES+)：m/e 306(100)。.
化合物106
4-[1-(4-异丙基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点240-243℃。MS(ES+)：m/e 306.35(100)。MS(ES-)：m/e 304.26(100)。
化合物125
3-[1-(4-乙基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点190-192℃。MS(ES+)：m/e 292.36(100)。MS(ES-)：m/e 290.37(100)。
化合物126
4-[1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点178-180℃。MS(ES+)：m/e 294.26(100)。MS(ES-)：m/e 292.26(100)。
化合物127
4-[1-(3，4-二氟-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点231-233℃。MS(ES+)：m/e 300.27(100)。MS(ES-)：m/e 298.27(100)。
化合物128
4-[1-(3-三氟甲基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点209-211℃。MS(ES+)：m/e 332.34(100)。MS(ES-)：m/e 330.35(100)。
化合物129
4-[1-(4-乙基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点278-280℃。MS(ES+)：m/e 292.34(100)。MS(ES-)：m/e 290.31(100)。
化合物130
4-(1-苯基-1H-吡咯-3-基)苯甲酸：熔点239-241℃。MS(ES+)：m/e264.27(100)。MS(ES-)：m/e 262.32(100)。
化合物131
4-[1-(4-三氟甲氧基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点318-320℃。MS(ES+)：m/e 348.30(100)。MS(ES-)：m/e 346.33(100)。
化合物150
4-[1-(2，3-二氢苯并[1，4]二氧芑-6-基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点273-276℃。MS(ES+)：m/e 321.34(100)。MS(ES-)：m/e 320.33(100)。
化合物151
4-[1-(2-氟-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点202-204℃。MS(ES+)：m/e 282.3(100)。MS(ES-)：m/e 280.3(100)。
化合物152
4-[1-(3-氟-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点211-213℃。MS(ES+)：m/e 282.28(100)。MS(ES-)：m/e 280.24(100)。
化合物153
4-[1-(3，5-二氟-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点243-245℃。MS(ES+)：m/e 300.35(100)。MS(ES-)：m/e 298.38(100)。
化合物155
3-[1-(4-氯-苯基)1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点211-213℃。MS(ES+)：m/e 282.28(100)。MS(ES-)：m/e 280.24(100)。
化合物156
3-(1-p-甲苯基-1H-吡咯-3-基)苯甲酸：熔点178-181℃。MS(ES+)：m/e278.29(100)。MS(ES-)：m/e 276.34(100)。
化合物157
3-(1-m-甲苯基-1H-吡咯-3-基)苯甲酸：熔点201-202℃。MS(ES+)：m/e348.32(100)。MS(ES-)：m/e 346.32(100)。
化合物158
3-[1-(4-三氟甲氧基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：MS(ES+)：m/e348.32(100)。MS(ES-)：m/e 346.32(100)。
化合物159
4-(1-p-甲苯基-1H-吡咯-3-基)苯甲酸：MS(ES+)：m/e 278.35(100)。MS(ES-)：m/e 21631(100)。
化合物160
4-[1-(2-甲氧基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点200-202℃。MS(ES+)：m/e 294.32(100)。MS(ES-)：m/e 292.36(100)。
化合物194
4-(1-m-甲苯基-1H-吡咯-3-基)苯甲酸：熔点212-213℃。MS(ES+)：m/e278.29(100)。MS(ES-)：m/e 276.33(100)。
化合物195
4-(1-o-甲苯基-1H-吡咯-3-基)苯甲酸：熔点208-209℃。MS(ES+)：m/e278.30(100)。MS(ES-)：m/e 276.33(100)。
化合物196
4-[1-(4-氯-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点＞350℃。MS(ES+)：m/e298.25(100)。MS(ES-)：m/e 296.29(100)。
化合物197
4-[1-(2-氯-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点200-202℃。MS(ES+)：m/e 298.25(100)。MS(ES-)：m/e 296.30(100)。
化合物198
3-[1-(2-氯-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点198-200℃。MS(ES+)：m/e 298.25(100)。MS(ES-)：m/e 296.29(100)。
化合物199
4-[1-(2-三氟甲氧基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点164-165℃。MS(ES+)：m/e 348.24(100)。MS(ES-)：m/e 346.34(100)。
化合物200
3-[1-(2-甲氧基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点＞350℃。MS(ES+)：m/e 294.28(100)。MS(ES-)：m/e 292.35(100)。
化合物240
3-(1-o-甲苯基-1H-吡咯-3-基)苯甲酸：熔点161-163℃。MS(ES+)：m/e278.27(100)。MS(ES-)：m/e 276.29(100)。
化合物241
3-[1-(3-氟-4-甲基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点205-208℃。MS(ES+)：m/e 296.23(100)。MS(ES-)：m/e 294.27(100)。
化合物242
3-[1-(2，5-二氟-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点193-194℃。MS(ES+)：m/e 300.21(100)。MS(ES-)：m/e 298.20(100)。
化合物243
4-[1-(3-氯-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点199-201℃。MS(ES+)：m/e 298.19(100)。MS(ES-)：m/e 296.27(100)。
化合物244
4-[1-(3-氟-4-甲基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点264-268℃。MS(ES+)：m/e 296.23(100)。MS(ES-)：m/e 294.23(100)。
化合物245
4-[1-(2，5-二氟-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点215-218℃。MS(ES+)：m/e 300.21(100)。MS(ES-)：m/e 298.20(100)。
化合物246
3-[1-(3-苄氧基-苯基)-1H-吡咯-3-基]苯甲酸：熔点142-144℃。MS(ES+)：m/e 370.28(100)。MS(ES-)：m/e 368.26(100)。
化合物247
3-(1-苯并[1，3]二氧环戊烯-5-基-1H-吡咯-3-基)苯甲酸：熔点177-180℃。MS(ES+)：m/e 308.26(100)。MS(ES-)：m/e 306.24(100)。
B.咪唑的制备
本发明的咪唑通常可如下制备。
3-[4-(4-异丙基苯基)咪唑-1-基]苯甲酸(化合物2)的制备
A部分.异丙基苯(50g)在二硫化碳(250毫升)的溶液用氯化铝(170g)处理，得到的混合物冷却至0℃。以1mL/min的速度加入乙酰氯(33g)，得到的混合物搅拌过夜。混合物倒入液态HCl(2N，400mL)中，分层。水相用乙酸乙酯提取，并且将有机相合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到油状产物4-异丙基苯乙酮(66g)。
B部分.4-异丙基苯乙酮(65g)在乙酸乙酯(250mL)的溶液冷却至0℃，并用溴(65g)逐滴处理。将混合物搅拌5小时，然后加入水(250mL)淬灭。分相，水层用乙酸乙酯提取。有机相用饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤，合并，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发，得到产物2-溴-4′-异丙基苯乙酮(64g，66％)。
C部分.2-溴-4′-异丙基苯乙酮(2.41g)和甲酰胺(10mL)的混合物在180℃下加热1小时，然后冷却，倒入水中，用乙酸乙酯提取。有机相用盐水洗涤，合并，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发。残余物用柱色谱法提纯，得到黄色固体产物4-(4-异丙基-苯基)-1H-咪唑(550mg)。
D部分.4-(4-异丙基-苯基)-1H-咪唑(190mg)、3-碳甲氧基.-苯基硼酸(360mg)和Cu(OAc)2(300mg)在二氯甲烷(15mL)的溶液用吡啶(160mg)和4A分子筛(500mg)处理。在空气存在下将混合物搅拌14小时，然后通过塞里塑料过滤，塞里塑料垫用乙酸乙酯充分洗涤。滤出液和洗涤液合并，蒸发。残留物质用柱色谱法分离，得到黄色固体产物3-[4-(4-异丙基-苯基)-咪唑-1-基]苯甲酸甲酯(190mg)。
E部分.3-[4-(4-异丙基-苯基)-咪唑-1-基]苯甲酸甲酯(190mg)在5mL甲醇-1mL水中的溶液用氢氧化锂水合物(125mg)处理，得到的混合物加热回流1小时。溶液冷却并用醋酸中和。通过过滤收集得到的沉淀，用水洗涤，真空干燥，并从丙酮重结晶，得到为白色固体的题目产物(90mg)。熔点248-250℃。1H NMR(400MHz，DMSOd6)：δ8.38(1H，s)，8.31(1H，s)，8.18(1H，s)，7.97(1H，d，J＝8Hz)，7.91(1H，d，J＝8Hz)，7.78(2H，d5 J＝8Hz)，7.66(1H，t，J＝8Hz)，7.24(2H，d，J＝8Hz)，2.88(1H，heptet，J＝7Hz)，1.20(6H，d，J＝7Hz).MS(ES+)：m/e 308(21)，307(100)。
使用以上实施例所述的方法(使用合适的原料)合成以下化合物。
化合物2
3-[1-(4-异丙基-苯基)-1H-咪唑-4-基]苯甲酸：熔点225-226℃。1HNMR(400MHz，DMSOd6)：δ12.94(1H，br)，8.43(1H，s)，8.35(1H，s)，8.30(1H，s)，8.06(1H，d，J＝8Hz)，7.79(1H，d，J＝8Hz)，7.63(2H，d，J＝8Hz)，7.51(1H，t，J＝8Hz)，7.39(2H，d，J＝8Hz)，2.95(1H，heptet，J＝7Hz)，1.22(6H，d，J＝7Hz).MS(ES+)：m/e 308(18)，307(100)。
化合物262
3-(4-苯基-咪唑-1-基)苯甲酸：熔点277-279℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.33(1H，br)，8.42(1H，d，J＝1.5Hz)，8.39(1H，d，J＝1.5Hz)，8.19(1H，t，J＝1.8Hz)，7.98(1H，ddd，J＝8.22.3，1.2Hz)，7.91(1H，dt，J＝7.9，1.2Hz)，7.89-7.85(2H，m)，7.66(1H，t，J＝7.9Hz)，7.42-7.35(2H，m)，7.26-7.20(1H，m).MS(ES+)：m/e 266(44)，265(100)。MS(ES-)：m/e 264(18)，263(100)。
化合物263
4-(4-苯基-咪唑-1-基)苯甲酸：熔点263-265℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.11(1H，br)，8.47(1H，d，J＝1.2Hz)，8.40(1H，d，J＝1.2Hz)，8.07(2H，d，J＝8.8Hz)，7.89-7.84(4H，m)，7.42-7.36(2H，m)，7.27-7.21(1H，m).MS(ES+)：m/e 266(37)，265(100)。MS(ES-)：m/e 264(19)，263(100)。
3-[2-氨基-4-(4-异丙基苯基)-1H-咪唑-1-基]苯甲酸(化合物1)的制备
A部分.往3-氨基苯甲酸甲酯(4.76g，31.5mmol)和K2CO3(6.21g，45.0mmol)在DMF(150mL)的悬浮体中加入α-溴-4-异丙基苯乙酮(7.23g，30.0mmol)。混合物在室温下搅拌24小时。真空除去DMF，对残余物进行色谱处理，得到氨基酮，3-{[2-(4-异丙基苯基)-2-氧乙基]氨基}苯甲酸甲酯(2.15g，23％)。(ES+)：m/e 312.
B部分.3-{[2-(4-异丙基苯基)-2-氧乙基]氨基}苯甲酸甲酯(0.62g，2.0mmol)用在乙醇(15mL)中的氨基氰(1.68g，40mmol)回流48小时，真空除去溶剂。残余物用水处理。通过过滤收集沉淀，干燥，并进行色谱处理(硅凝胶，首先用1∶4乙酸乙酯-己烷，然后用50∶1二氯甲烷-甲醇)。最后的馏分(0.26g)用THF(10mL)中的NaOH(1N，3.0mL，3.0mmol)在65℃处理过夜。除去溶剂后，残余物用水处理，并用HCl(1N)酸化。通过过滤收集沉淀，用乙酸乙酯彻底洗涤，干燥，通过LC/MS得到单一成分的所需产物，3-[2-氨基-4-(4-异丙基苯基)-1H-咪唑-1-基]苯甲酸(0.13g，20％)，熔点279-282℃(decomp.).1H NMR(CDCl3，300MHz)δ(ppm)1.27(d，6H)，2.87-2.97(m，1H)，4.36(s，br，2H)，7.01(s，1H)，7.21-7.26(m，3H)，7.59-7.69(m，3H)，8.05-8.12(m，2H).(ES+)：m/e 322.
C.1，3-吡唑的制备
本发明的1，3-吡唑可以如下制备。
3-[3-(4-三氟甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸(化合物95)
A部分.4′-三氟甲氧基苯乙酮(1.50g)和二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(8.6mL)在115℃下加热16小时，然后冷却。蒸发掉挥发性组分，得到的棕色油直接用于下个步骤。该材料(1.90g)和水合肼(1.14mL)在醋酸(10mL)中的溶液在109℃下加热15小时，然后冷却并倒入水中(100mL)。用乙酸乙酯(2×100mL)提取，提取物用盐水洗涤，合并，用硫酸镁干燥，过滤，蒸发，得到纯的固体产物3-(4-三氟甲氧基-苯基)-1H-吡唑，LC/MS确定纯度为100％。
B部分.3-(4-三氟甲氧基-苯基)-1H-吡唑(250mg)、3-甲氧基羰基苯基硼酸(540mg)和吡啶(0.18mL)在二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液用铜(II)醋酸盐(214mg)和粉末化的活性4A分子筛(0.5g)处理。得到的混合物在60℃下加热16小时，并冷却。反应混合物倒入1M HCl溶液中(300mL)，得到的混合物通过玻璃微纤维滤垫过滤。该滤垫用乙酸乙酯洗涤，滤出液蒸发，得到固体产物3-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-吡唑-1-基]苯甲酸甲酯(204mg)。
C部分.3-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-吡唑-1-基]苯甲酸甲酯(100mg)和氢氧化钠(0.58mL，1M水溶液)在乙醇(5mL)中的溶液加热回流2天。混合物冷却并蒸发，残余物用1M HCl溶液酸化并用乙酸乙酯提取。提取物用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，蒸发，得到纯度为91％(通过LC/MS)的题目粉末固体(90mg)，熔点191-194℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.70(1H，d，J＝2.7Hz)，8.44(1H，t，J＝1.9Hz)，8.15(1H，ddd，J＝8.2，2.4，0.9Hz)，8.05(2H，d，J＝8.8Hz)，7.87(1H，dt，J＝7.7，1.1Hz)，7.64(1H，t，J＝8.0Hz)，7.43(2H，dd，J＝8.8，0.8Hz)，7.11(1H，d，J＝2.7Hz).MS(ES+)：m/e 350(20)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(20)，347(100)。
可以使用该方法的稍微改动的版本来制备以下化合物。
化合物78
3-[3-(3-氰基-苯基)-吡唑-1-基]苯甲酸：熔点164-166℃。1H NMR(300MHz5DMSO-d6)：δ8.73(1H，d，J＝2.5Hz)，8.44(1H，s)，8.37(1H，s)，8.28(1H，d，J＝7.9Hz)，8.17(1H，dd，J＝8.0，2.2Hz)，7.88(1H，d，J＝7.7Hz)，7.82(1H，d，J＝7.7Hz)，7.69-7.62(2H，m)，7.22(1H，d，J＝2.7Hz).MS(ES+)：m/e 291(20)，290(100)。MS(ES-)：m/e 289(20)，288(100)。
化合物79
3-(3-苯基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点180-182℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.67(1H，dd，J＝2.5，1.4Hz)，8.43(1H，m)，8.15(1H，dt，J＝8.2，1.1Hz)，7.94-7.91(2H，m)，7.86(1H，dd，J＝7.7，1.1Hz)，7.63(1H，t，J＝8.0Hz)，7.47-7.32(3H，m)，7.06(1H，d，J＝2.7Hz).MS(ES+)：m/e 266(20)，265(100)。MS(ES-)：m/e 264(20)，263(100)。
化合物80
3-[3-(4-氯苯基)吡唑-1-：熔点230-235℃。1H NMR
(300MHz，DMSOd6)：68.69(1H，d，J＝2.7Hz)，8.43(1H，narrow m)，8.16(1H，dm，J＝8Hz)，7.96(2H，d，J＝8.5Hz)，7.86(1H，d，J＝7.7Hz)，7.64(1H，t，J＝8.0Hz)，7.50(2H，d，J＝8.5Hz)，7.10(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 301(35)，299(100)。MS(ES-)：m/e 299(35)，297(100)。
化合物81
3-[3-(4-甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点210-211℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：68.63(1H，d，J＝2.5Hz)，8.41(1H，t，J＝1.7Hz)，8.13(1H，dm，J＝8Hz)，7.85(2H，d，J＝8.8Hz)，7.84-7.80(1H，m)，7.62(1H，t，J＝8.0Hz)，7.00(2H，d，J＝8.8Hz)，6.98(1H，d，J＝2.5Hz)，3.78(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(20)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(20)，293(100)。
化合物82
3-[3-(4-吗啉-4-基-苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点230-235℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：68.61(1H，dd，J＝2.6，1.0Hz)，8.41(1H，s)，8.12(1H，dt，J＝8.2，1.2Hz)，7.83(1H，d，J＝8Hz)，7.80(2H，d，J＝8.2Hz)，7.61(1H，t，J＝8.0Hz)，7.07(2H，d，J＝8.2Hz)，6.96(1H，dd，J＝2.3，1.5Hz)，3.76(4H，br)，3.19(4H，br)。MS(ES+)：m/e 351(20)，350(100)。MS(ES-)：m/e 349(20)，348(100)。
化合物92
3-[3-(4-氟-苯基)-吡唑-1-基]苯甲酸：熔点237-240℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：68.67(1H，d，J＝2.7Hz)，8.43(1H，t，J＝1.9Hz)，8.14(1H，ddd，J＝7.0，2.5，1.4Hz)，7.97(2H，dd，J＝8.8，5.5Hz)，7.85(1H，dt，J＝6.6，1.1Hz)37.63(1H，t，J＝7.8Hz)，7.28(2H，t，J＝8.8Hz)，7.06(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 284(20)，283(100)。MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物93
3-[3-(3-氟苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点173-174℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.70(1H，d，J＝2.5Hz)，8.42(1H，t，J＝1.8Hz)，8.16(1H，ddd，J＝8.2，2.4，1.1Hz)，7.87(1H，dt，J＝7.7，1.2Hz)，7.79(1H，dt，J＝7.9，1.1Hz)，7.73(1H，ddd，J＝10.3，2.5，1.4Hz)，7.64(1H，t，J＝8.0Hz)，7.51(1H，dt，J＝8.3，6.1Hz)，7.19(1H，ddt，J＝8，2，1Hz)，7.14(1H，d，J＝2.6Hz).MS(ES+)：m/e 284(20)，283(100)。MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物97
3-[3-(4-三氟甲基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点225-227℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.74(1H，d，J＝2.5Hz)，8.46(1H，t，J＝1.9Hz)，8.20-8.14(3H，m)，7.88(1H，d，J＝7.7Hz)，7.80(2H，d，J＝8.8Hz)，7.65(1H，t，J＝8.0Hz)，7.21(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 334(20)，333(100)。MS(ES-)：m/e 332(20)，331(100)。
化合物5
3-[3-(4-异丙基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点215-216℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ13.26(1H，br)，8.65(1H，d，J＝2Hz)，8.43(1H，s)，8.13(1H，d，J＝8Hz)，7.87-7.82(3H，m)，7.63(1H，t，J＝8Hz)，7.30(2H，d，J＝8Hz)，7.01(1H，d，J＝2Hz)，2.90(1H，heptet，J＝7Hz)，1.20(6H，d，J＝7Hz).MS(ES+)：m/e 308(22)，307(100)。
化合物137
3-(4，5-[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点191-192℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.25(1H，br s)，8.44-8.39(2H，m)，8.11-8.06(1H，m)，7.84-7.80(2H，m)，7.61(1H，dt，J＝7.9，4.1Hz)，7.32-7.22(3H，m)，2.92-2.87(2H，m)，2.83-2.78(2H，m).MS(ES+)：m/e 292(20)，291(100)。MS(ES-)：m/e 290(21)，289(100)。
化合物138
3-(4H-茚并[1，2-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点249-250℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.24(1H，br)，8.54(1H，s)，8.44(1H，t，J＝1.8Hz)，8.12(1H，dd，J-8.0，2.1Hz)，7.82(1H，d，J＝7.6Hz)，7.78(1H，dd，J＝7.9，1.2Hz)，7.61(1H，t，J＝7.9Hz)，7.57(1H，d，J＝7.6Hz)，7.42-7.32(2H，m)，3.76(2H，s).MS(ES+)：m/e 278(18)，277(100)。MS(ES-)：m/e 276(20)，275(100)。
化合物139
3-(6-甲氧基-4H-茚并[1，2-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点272-273℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.16(1H，br)，8.47(1H，s)，8.41(1H，s)，8.08(1H，dd，J＝8.1，2.0Hz)，7.80(1H5d，J＝7.6Hz)，7.67(1H，d，J＝8.5Hz)，7.59(1H，t，J＝7.9Hz)，7.17(1H，d，J＝2.0Hz)，6.95(1H，dd，J＝8.5，2.3Hz)，3.80(3H，s)，3.72(2H，s).MS(ES+)：m/e 308(20)，307(100)。MS(ES-)：m/e 306(21)，305(100)。
化合物140
3-(7-甲氧基-4H-茚并[1，2-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点225-227℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.25(1H，br)，8.52(1H，s)，8.45(1H，s)，8.11(1H，ddd，J＝8.2，2.4，1.2Hz)，7.82(1H，d，J＝7.6Hz)，7.61(1H，t，J＝7.9Hz)，7.45(1H，d，J＝8.5Hz)，7.34(1H，d，J＝2.3Hz)，6.90(1H，dd，J＝8.5，2.3Hz)，3.82(3H，s)，3.67(2H，s).MS(ES+)：m/e 308(20)，307(100)。MS(ES-)：m/e 306(18)，305(100)。
化合物142
3-(7-甲氧基-4，5-[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点217-218℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.23(1H，br)，8.38(1H，s)，8.37(1H，d，J＝2Hz)，8.06(1H，dd，J＝8.2，2.0Hz)，7.80(1H，d，J＝7.6Hz)，7.74(1H，d，J＝8.5Hz)，7.59(1H，t，J＝7.9Hz)，6.91-6.84(2H，m)，3.77(3H，s)，2.92-2.86(2H，m)，2.78-2.72(2H，m).MS(ES+)：m/e 322(20)，321(100)。MS(ES-)：m/e 320(21)，319(100)。
化合物143
3-(8-甲氧基-4，5-[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点192-193℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.25(1H，br)，8.43(1H，s)，8.38(1H，t，J＝1.8Hz)，8.09(1H，dd，J＝8.2，2.3Hz)，7.83(1H，d，J＝7.6Hz)，7.61(1H，t，J＝7.9Hz)，7.33(1H，d，J＝3.0Hz)，7.22(1H，d，J＝8.5Hz)，6.83(1H，dd，J＝8.5，3.0Hz)，3.80(3H，s)，2.87-2.82(2H，m)，2.77-2.72(2H，m).MS(ES+)：m/e322(18)，321(100)。MS(ES-)：m/e 320(24)，319(100)。
化合物144
3-(4H-苯并吡喃[4，3-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点227-228℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.29(1H，br)，8.49(1H，s)，8.39(1H，t，J＝1.9Hz)，8.09(1H，dd，J-8.2，2.3Hz)，7.86(1H，d，J＝7.6Hz)，7.76(1H，dd，J＝7.4，1.6Hz)，7.63(1H，t，J-7.9Hz)，7.26(1H，dt，J＝8.0，1.8Hz)，7.07-6.96(2H，m)，5.33(2H，s).MS(ES+)：m/e 294(17)，293(100)。MS(ES-)：m/e 292(18)，291(100)。
化合物145
4-(8-甲氧基-4，5-[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点290-292℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ12.98(1H，br)，8.45(1H，s)，8.04(2H，d，J-8.8Hz)，7.98(2H，d，J-8.8Hz)，7.34(1H，d，J＝2.9Hz)，7.23(1H，d，J＝8.5Hz)，6.84(1H，dd，J＝8.5，2.9Hz)，3.79(3H，s)，2.86-2.81(2H，m)，2.78-2.73(2H，m).MS(ES+)：m/e 323(4)，322(22)，321(100)。MS(ES-)：m/e 319(100)。
化合物147
3-(6-甲氧基-4，5-[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点232-233℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.25(1H，br)，8.42(1H，s)，8.39(1H，t，J＝1.9Hz)，8.08(1H，dd，J-8.0，2.2Hz)，7.82(1H，d，J＝7.6Hz)，7.61(1H，t，J＝7.9Hz)，7.46(1H，d，J＝7.6Hz)，7.27(1H，t，J＝8.0Hz)，6.96(1H，d，J＝8.2Hz)，3.81(3H，s)，2.90-2.85(2H，m)，2.77-2.72(2H，m).MS(ES+)：m/e 322(19)，321(100)。MS(ES-)：m/e 320(18)，319(100)。
化合物148
4-(6-甲氧基-4，5-二氢苯并[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点288-290℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ12.97(1H，br)，8.44(1H，s)，8.03(2H，d，J＝8.8Hz)，7.97(2H，d，J＝8.8Hz)，7.46(1H，d，J＝7.3Hz)，7.28(1H，t，J＝7.9Hz)，6.97(1H，d，J＝8.2Hz)，3.81(3H，s)，2.90-2.85(2H，m)，2.78-2.73(2H，m).MS(ES+)：m/e 323(3)，322(20)，321(100)。
化合物149
4-(7-甲氧基-4H-茚并[1，2-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点304-306℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ12.95(1H，br)，8.55(1H，s)，8.04(2H，d，J＝9.0Hz)，8.00(2H，d，J＝9.0Hz)，7.46(1H，d，J＝8.4Hz)，7.30(1H，d，J＝2.4Hz)，6.92(1H，dd，J＝8.4，2.4Hz)，3.82(3H，s)，3.67(2H，s).MS(ES+)：m/e 308(20)，307(100)。
化合物161
4-(4，5-二氢苯并[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点288-290℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ12.98(1H，br)，8.45(1H，s)，8.04(2H，d，J＝8.8Hz)，7.98(2H，d，J＝8.8Hz)，7.82(1H，dd，J＝7.6，2.0Hz)，7.34-7.26(3H，m)，2.95-2.90(2H，m)，2.81-2.76(2H，m).MS(ES+)：m/e 292(15)，291(100)。MS(ES-)：m/e 290(20)，289(100)。
化合物162
4-(4H-苯并吡喃[4，3-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点308-310℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.03(1H，br)，8.50(1H，s)，8.05(2H，d，J＝8.8Hz)，7.98(2H，d，J＝8.8Hz)，7.74(1H，dd，J＝7.5，1.6Hz)，7.27(1H，dt，J-7.8，1.8Hz)，7.05(1H，dt，J＝7.3，1.2Hz)，6.99(1H，d，J＝8.2Hz)，5.34(2H，s).MS(ES+)：m/e294(16)，293(100)。MS(ES-)：m/e292(22)，291(100)。
化合物163
4-(7-甲氧基-4，5-二氢苯并[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点279-280℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.94(1H，br)，8.41(1H，s)，8.02(2H，d，J＝8.8Hz)，7.95(2H，d，J＝8.8Hz)，7.74(1H，d，J＝8.2Hz)，6.91(1H，d，J＝2.6Hz)，6.87(1H，dd，J＝8.2，2.6Hz)，3.77(3H，s)，2.92-2.87(2H，m)，2.79-2.74(2H，m).MS(ES+)：m/e 322(20)，321(100)。MS(ES-)：m/e 320(20)，319(100)。
化合物169
3-[3-(2-氟-苯基)-吡唑-1-基]苯甲酸：熔点166-167℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.73(1H，d，J＝2.5Hz)，8.44(1H，t，J＝1.9Hz)，8.17(1H，ddd，J＝8.2，2.3，1.1Hz)，8.06(1H，dt，J＝7.7，1.9Hz)，7.88(1H，dt，J＝7.7，1Hz)，7.65(1H，t，J＝7.8Hz)，7.44-7.27(3H，m)，6.93(1H，dd，J＝3.9，2.8Hz).MS(ES+)：m/e 284(20)，283(100)。MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物170
3-(3-p-甲苯基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点180-182℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.12(1H，br)，8.54(1H，d，J＝2.5Hz)，8.47(1H，t，J＝1.8Hz)，8.13(1H，dt，J＝7.9，1.8Hz)，7.90(1H，dt，J＝7.9，1.3Hz)，7.80(2H，d，J＝8.5Hz)，7.57(1H，t，J＝7.8Hz)，7.31(2H，d，J＝8.5Hz)，7.09(1H，d，J＝2.5Hz)，2.34(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(14)，279(100)。MS(ES-)：m/e278(19)，277(100)。
化合物219
4-[3-(4-甲氧基-苯基)-吡唑-1-基]苯甲酸：熔点268-270℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.65(1H，d，J＝2.5Hz)，8.05(2H，d，J＝9.1Hz)，8.01(2H，d，J＝9.1Hz)，7.87(2H，d，J＝8.5Hz)，7.02(1H，d，J＝2.5Hz)，7.01(2H，d，J＝8.5Hz)，3.79(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(20)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(23)，293(100)。
化合物220
3-[3-(3-甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点179-180℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.67(1H，d，J＝2.5Hz)，8.42(1H，s)，8.15(1H，dm，J＝8.0Hz)，7.86(1H，d，J＝7.7Hz)，7.64(1H，t，J＝7.8Hz)，7.51(1H，d，J＝7.7Hz)，7.46(1H，s)，7.36(1H，t，J＝7.9Hz)，7.08(1H，d，J＝2.5Hz)，6.93(1H，dd，J＝8.2，2.5Hz)，3.82(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(20)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(20)，293(100)。
化合物221
4-[3-(3-甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点200-202℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.69(1H，d，J＝2.5Hz)，8.05(4H，s)，7.52(1H，dd，J＝7.7，1Hz)，7.48(1H，dd，J＝2.6，1Hz)，7.37(1H，t，J-7.9Hz)，7.12(1H，d，J＝2.5Hz)，6.94(1H，dd，J＝7.5，2.6Hz)，3.82(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(20)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(20)，293(100)。
化合物222
4-(3-苯基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点244-245℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.69(1H，d，J＝2.5Hz)，8.05(4H，s)，7.96-7.92(2H，m)，7.48-7.36(3H，m)，7.11(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 266(20)，265(100)。MS(ES-)：m/e 264(20)，263(100)。
D.1，4-吡唑的制备
本发明的1，4-吡唑可以如下制备。
3-[4-(4-甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸(化合物47)的制备
3-肼苯甲酸(300mg，1.97mmol)和4-甲氧基苯基丙二醛(351mg，1.97mmol)在4mL醋酸中的溶液在110℃下加热20小时。冷却后，溶液产生棕褐色沉淀，通过过滤收集沉淀，用乙酸乙酯和二乙醚洗涤。粉末进行真空干燥，得到题目化合物(429mg，1.46mmol，74％).熔点238-239℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.26(1H，s)，9.02(1H，s)，8.41(1H，s)，8.17(1H，s)，8.12(1H，d，J＝7.9Hz)，7.85(1H，d，J＝7.9Hz)，7.65(2H，d，J＝8.5Hz)，7.64(1H，t，J＝7.9Hz)，6.96(2H，d，J＝8.5Hz)，3.76(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(18)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(17)，293(100)。
下面的化合物可以使用刚才所述的类似方法制备。
化合物48
3-(4-p-甲苯基吡唑-1-基)苯甲酸：熔点208-209℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.26(1H，s)，9.08(1H，s)，8.42(1H，s)，8.21(1H，s)，8.12(1H，d，J＝8.2Hz)，7.85(1H，d，J＝7.7Hz)，7.63(1H，t，J＝8Hz)，7.62(2H，d，J＝8.2Hz)，7.20(2H，d，J＝8.2Hz)，2.30(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(18)，279(100)。MS(ES-)：m/e 278(17)，277(100)。
化合物49
3-[4-(4-氯苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点253-254℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.28(1H，s)，9.17(1H，s)，8.42(1H，s)，8.27(1H，s)，8.11(1H，dd，J＝8.0，1.3Hz)，7.86(1H，d，J-7.7Hz)，7.76(2H，d，J＝8.2Hz)，7.63(1H，t，J＝8.0Hz)，7.44(2H，d，J＝8.2Hz).MS(ES+)：m/e 301(35)，300(19)，299(100)。MS(ES-)：m/e 299(40)，298(17)，297(100)。
化合物50
4_[4-(4-甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点289-290℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.02(1H，s)，9.00(1H，s)，8.20(1H，s)，8.06(2H，d，J＝8.4Hz)，7.99(2H，d，J＝8.4Hz)，7.64(2H，d，J＝8.5Hz)，6.96(2H，d，J＝8.5Hz)，3.76(3H，s)。MS(ES+)：m/e 296(16)，295(100)。MS(ES-)：m/e294(19)，293(100)。
化合物51
4-(4-p-甲苯基吡唑-1-基)苯甲酸：熔点298-299℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.02(1H3s)，9.07(1H，s)，8.25(1H，s)，8.06(2H，d，J＝8.8Hz)，8.00(2H，d，J＝8.8Hz)，7.61(2H，d，J＝8.2Hz)，7.20(2H，d，J＝8.2Hz)，2.30(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(20)，279(100)。MS(ES-)：m/e 278(14)，277(100)。
化合物52
4-[4-(4-氯苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点300-302℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.03(1H，s)，9.14(1H，s)，8.29(1H，s)，8.06(2H，d，J＝8.8Hz)，7.98(2H，d，J-8.8Hz)，7.73(2H，d，J＝8.5Hz)，7.44(2H，d，J＝8.5Hz).MS(ES+)：m/e 301(35)，300(16)，299(100)。MS(ES-)：m/e 299(39)，298(18)，297(100)。
化合物113
3-(4-吡啶-2-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点243.245℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.29(1H，s)，8.58(1H，d，J＝5.0Hz)，8.44(1H，t，J＝1.8Hz)，8.38(1H，s)，8.17(1H，dd，J＝8.0，1.3Hz)，7.90-7.87(3H，m)，7.65(1H，t，J＝7.9Hz)，7.30(1H，q，J＝4.4Hz).MS(ES+)：m/e 267(24)，266(100)。MS(ES-)：m/e 265(19)，264(100)。
化合物114
4-(4-吡啶-2-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点260-262℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.39(1H，s)，8.61(1H，dd，J＝5.0，0.6Hz)，8.50(1H，s)，8.10-7.95(6H，m)，7.40(1H5dt，J＝6.0，1.5Hz).MS(ES+)：m/e 267(29)，266(100)。MS(ES-)：m/e 265(18)，264(100)。
化合物115
3-(4-吡啶-4-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点300-302℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.37(1H，s)，8.55(2H，d，J＝5.0Hz)，8.43(2H，s)，8.14(1H，dd，J＝8.2，1.5Hz)，7.89(1H，d，J＝7.6Hz)，7.73(2H，d，J＝6.1Hz)，7.66(1H，t，J＝7.9Hz).MS(ES+)：m/e 267(21)，266(100)。MS(ES-)：m/e265(18)，264(100)。
化合物116
4-(4-吡啶-4-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点＞350℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.36(1H，s)，8.56(2H，d，J-6.2Hz)，8.46(1H，s)，8.09(2H，d，J＝8.8Hz)，8.02(2H，d，J＝8.8Hz)，7.71(2H，d，J＝6.2Hz).MS(ES+)：m/e 267(30)，266(100)。MS(ES-)：m/e 265(17)，264(100)。
化合物117
3-(4-吡啶-4-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点297-299℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.95(1H，br)，9.45(1H，s)，9.12(1H，d，J＝1.2Hz)，8.77(1H，d，J＝5.2Hz)，8.47(1H，s)，8.45(1H，t，J＝1.8Hz)，8.18(1H，ddd，J＝8.2，2.3，0.9Hz)，7.94-7.89(2H，m)，7.66(1H，t，J＝7.9Hz).MS(ES+)：m/e 268(15)，267(100)。MS(ES-)：m/e 266(18)，265(100)。
化合物118
4-(4-吡啶-4-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点＞350℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.44(1H，s)，9.13(1H，dd，J＝4，1.4Hz)，8.79(1H，t，J＝4.5Hz)，8.51(1H，s)，8.07(4H，s)，7.90(1H，m).MS(ES+)：m/e 268(17)，267(100)。MS(ES-)：m/e 266(15)，265(100)。
化合物119
3-(4-吡啶-2-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点310-311℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.31(1H，br)，9.38(1H，s)，9.13(1H，d，J＝1.4Hz)，8.60(1H，dd，J＝2.5，1.6Hz)，8.48-8.42(3H，m)，8.17(1H，dt，J＝7.9，1.1Hz)，7.90(1H，dd，J＝6.4，1.2Hz)，7.66(1H，t，J＝7.9Hz).MS(ES+)：m/e268(13)，267(100)。MS(ES-)：m/e 266(15)，265(100)。
化合物120
4-(4-吡啶-2-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点319-321℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.08(1H，br)，9.37(1H，s)，9.12(1H，d，J＝1.6Hz)，8.62(1H，dd，J＝2.5，1.6Hz)，8.49(1H，d，J＝2.5Hz)，8.47(1H，s)，8.08(2H，d，J＝9.0Hz)，8.05(2H，d，J＝9.0Hz).MS(ES+)：m/e 268(11)，267(100)。MS(ES-)：m/e 266(13)，265(100)。
化合物121
3-(4-苯并恶唑噁唑-2-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点331-333℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.31(1H，br)，9.48(1H，s)，8.49(1H，t，J＝1.9Hz)，8.46(1H，s)，8.23(1H，dd，J＝8.1，2.3Hz)，7.93(1H，d，J＝7.9Hz)，7.77-7.71(2H，m)，7.67(1H，t，J＝7.9Hz)，7.42-7.34(2H，m).MS(ES+)：m/e 307(19)，306(100)。MS(ES-)：m/e 305(22)，304(100).
化合物122
3-(4-喹喔啉-2-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点325-326℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.32(1H，br)，9.60.(1H，s)，9.46(1H，s)，8.59(1H，s)，8.49(1H，t，J＝1.8Hz)，8.22(1H，dt，J＝7.9，1.2Hz)，8.08-8.03(2H，m)，7.92(1H，dt，J＝7.7，1.6Hz)，7.87-7.75(2H，m)，7.69(1H，t，J＝7.9Hz).MS(ES+)：m/e 318(20)，317(100)。MS(ES-)：r/e 316(22)，315(100)。
化合物123
3-(4-喹啉-2-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点250-252℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.44(1H，s)，8.51(1H，s)，8.49(1H，t，J＝1.8Hz)，8.41(1H，d，J＝8.8Hz)，8.22(1H，dt，J＝6.7，1.0Hz)，8.04(1H，d，J＝8.5Hz)，8.00(1H，d，J＝8.4Hz)，7.92(1H，dt，J＝8.2，1.0Hz)，7.74(1H，dt，J＝7.8，1.5Hz)，7.67(1H，t，J＝7.9Hz)，7.54(1H，dt，J＝7.9，1.1Hz).MS(ES+)：m/e 317(37)，316(100)。MS(ES-)：m/e 315(18)，314(100)。
3-[4-(2-氟苯基)吡唑-1-基]苯甲酸(化合物84)的制备
A部分.将含有氯氧化磷(3.25mL，34.9mmol)冷却至ca.10℃，并逐滴添加二甲基甲酰胺(3.25mL)。搅拌30分钟后，得到的混合物用2-氟苯基乙酸(1.79g，11.6mmol)在二甲基甲酰胺(6mL)中的溶液逐滴处理。该溶液加热至70℃，然后冷却并倒入冰中。融化后，混合物用固体NaHCO3中和，然后用50％NaOH水溶液调至碱性。搅拌1小时后，混合物用二乙醚(100mL)提取两次，乙醚提取物用盐水洗涤，合并，用无水硫酸镁干燥，过滤，蒸发，得到黄褐色油状的3-二甲基氨基-2-(2-氟苯基)-丙烯醛(1.72g，8.92mmol，77％).TLC RF 0.30(乙酸乙酯).1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ9.08(1H，s)，7.29-7.19(2H，m)，7.14-7.01(2H，m)，6.91(1H，s)，2.88(6H，br)。MS(ES+)：m/e 216(18)，195(23)，194(100)。
B部分.3-二甲基氨基-2-(2-氟苯基)-丙烯醛(812mg，4.20mmol)和3-肼苯甲酸(639mg，4.20mmol)在乙酸(8mL)中的溶液在110℃下加热18小时，冷却。通过过滤收集得到的棕褐色沉淀，用乙酸乙酯和二乙醚洗涤，真空干燥，得到作为粉末的题目化合物(833mg，2.95mmol，70％)。熔点225-226℃。1H NMR(300MHz，acetone-d6)：δ8.90(1H，dd，J＝1.5，0.6Hz)，8.55(1H，t，J＝1.8Hz)，8.21(1H，dd，J＝2.0，0.6Hz)，8.18(1H，ddd，J＝8.12.4，1.1Hz)，7.98(1H，ddd，J＝7.91.6，1.0Hz)，7.90-7.83(1H，m)，7.65(1H，t，J＝7.7Hz)，7.35-7.20(3H，m)，1H missing.MS(ES+)：m/e285(2)，284(18)，283(100)。
该过程可以适用于制备以下化合物。
化合物85
4-[4-(2-氟苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点260-261℃。1H NMR(300MHz，acetone-d6)：δ8.97(1H，dd，J-1.5，0.6Hz)，8.25(1H，dd，J＝2.0，0.6Hz)，8.15(2H，d，J＝9.4Hz)，8.09(2H，d，J＝9.4Hz)，7.91-7.85(1H，m)，7.38-7.23(3H，m)，1H missing.MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物88
3-[4-(3-溴苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点177-178℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.24(1H，s)，8.43(1H，s)，8.32(1H，s)，8.13(1H，dd，J＝8.5，0.5Hz)，8.00(1H，s)，7.87(1H，d，J＝7.6Hz)，7.75(1H，d，J＝7.6Hz)，7.64(1H，t，J＝7.9Hz)，7.42(1H，d，J＝8.2Hz)，7.34(1H，t，J＝7.7Hz)，1H missing.MS(ES+)：m/e 346(16)，345(100)，344(18)，343(99).MS(ES-)：m/e 344(16)，343(92)，342(18)，341(100)。
化合物89
4-[4-(3-溴苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点247-248℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.06(1H，br)，9.23(1H，s)，8.36(1H，s)，8.09-7.98(5H，m)，7.74(1H，d，J＝7.6Hz)，7.42(1H，d，J＝7.9Hz)，7.35(1H，t，J＝7.8Hz).MS(ES+)：m/e 346(14)，345(100)，344(15)，343(90)。MS(ES-)：：m/e344(14)，343(100)，342(13)，341(91)。
化合物90
3-(4-m-甲苯基吡唑-1-基)苯甲酸：熔点181-182℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.28(1H，br)，9.12(1H，s)，8.44(1H，t，J＝1.9Hz)，8.24(1H，s)，8.14(1H，dt，J＝8.2，1.3Hz)，7.86(1H，dd，J＝7.9，1.0Hz)，7.67-7.51(3H，m)，7.27(1H，t，J＝7.6Hz)，7.05(1H，d，J＝7.6Hz)，2.33(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(19)，279(100)。MS(ES-)：m/e 278(20)，277(100)。
化合物91
4-(4-m-甲苯基吡唑-1-基)苯甲酸：熔点251-252℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.02(1H，br)，9.10(1H，s)，8.27(1H，s)，8.09-7.99(4H，m)，7.57-7.50(2H，m)，7.28(1H，t，J＝7.8Hz)，7.06(1H，d，J＝7.3Hz)，2.33(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(19)，279(100)。MS(ES-)：m/e 278(21)，277(100)。
化合物98
3-(4-苯基吡唑-1-基)苯甲酸：熔点225-226℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.19(1H，br s)，9.14(1H，s)，8.43(1H，d，J＝1.7Hz)，8.26(1H，s)，8.14(1H，dd，J＝7.3，1.4Hz)，7.87(1H，d，J＝7.6Hz)，7.74(2H，d，J＝7.3Hz)，7.64(1H，t，J＝8.0Hz)，7.42-7.36(2H，m)，7.24(1H，t，J＝7.5Hz).MS(ES+)：m/e 266(16)，265(100)。MS(ES-)：m/e 264(13)，263(100)。
化合物99
4-(4-苯基吡唑-1-基)苯甲酸：熔点267-269℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.04(1H，br s)，9.13(1H，s)，8.30(1H，s)，8.07(2H，d，J-8.8Hz)，8.01(2H，d，J＝8.8Hz)，7.73(2H，d，J＝7.3Hz)，7.40(2H，t，J＝7.6Hz)，7.25(1H，t，J＝7.5Hz).MS(ES+)：m/e 266(19)，265(100)。MS(ES-)：m/e 264(13)，263(100)。
化合物100
3-[4-(4-羟基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点282-284℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.95(1H，s)，8.40(1H，s)，8.12(1H，s)，8.12-8.09(1H，m)，7.84(1H，d，J＝7.6Hz)，7.62(1H，t，J＝7.9Hz)，7.53(2H，d，J＝8.5Hz)，6.78(2H，d，J＝8.5Hz).MS(ES+)：m/e 282(18)，281(100)。MS(ES-)：m/e 280(17)，279(100)。
化合物101
3-[4-(4-硝基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点274-276℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.01(1H，br s)，9.39(1H，s)，8.44(2H，s)，8.25(2H，d，J＝8.8Hz)，8.14(1H，dd，J＝8.0，1.7Hz)，8.01(2H，d，J＝8.8Hz)，7.89(1H，d，J＝7.6Hz)，7.66(1H，t，J＝8.0Hz).MS(ES-)：m/e 309(17)，308(100)。
化合物102
4-[4-(4-硝基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点276-277℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.72(1H，br s)，9.37(1H，s)，8.47(1H，s)，8.26(2H，d，J＝8.8Hz)，8.09-7.97(6H，m).MS(ES-)：m/e 309(24)，308(100)。
化合物103
3-[4-(2，4-二氟苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点283-285℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.31(1H，br s)，9.02(1H，s)，8.42(1H，s)，8.19(1H，d，J＝1.5Hz)，8.14(1H，dt，J＝8.0，1.0Hz)，7.94-7.86(2H，m)，7.64(1H，t，J＝7.9Hz)，7.35(1H，dt，J＝10.1，2.6Hz)，7.17(1H，dt，J＝8.5，2.6Hz).MS(ES+)：m/e 302(17)，301(100)。MS(ES-)：m/e 300(19)，299(100)。
化合物104
4-[4-(2，4-二氟苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点291-293℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.04(1H，br s)，9.01(1H，s)，8.23(1H，d，J＝1.7Hz)，8.06(2H，d，J＝6.7Hz)，8.02(2H，d，J＝6.7Hz)，7.92-7.84(1H，m)，7.40-7.32(1H，m)，7.22-7.15(1H，m).MS(ES+)：m/e 302(21)，301(100)。MS(ES-)：m/e 300(21)，299(100)。
化合物107
3-[4-(4-二氟甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点118-120℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.18(1H，br s)，9.15(1H，s)，8.42(1H，t，J＝1.9Hz)，8.26(1H，s)，8.13(1H，dt，J＝8.2，2.3Hz)，7.86(1H，dd，J＝8.8，1.2Hz)，7.80(2H，d，J＝8.8Hz)，7.65(1H，t，J＝7.9Hz)，7.25(1H，t，J＝74.2Hz)，7.22(2H，d，J＝8.8Hz).MS(ES+)：m/e 332(20)，331(100)。MS(ES-)：m/e 330(20)，329(100)。
化合物108
3-[4-(4-氨基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点209-210℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.85(1H，s)，8.39(1H，q，J＝2.0Hz)，8.11-8.06(1H，m)，8.05(1H，s)，7.82(1H，dt，J＝8.2，1.3Hz)，7.61(1H，t，J＝8.0Hz)，7.38(2H，d，J＝8.4Hz)，6.58(2H，d，J＝8.4Hz).MS(ES+)：m/e 281(32)，280(100)。MS(ES-)：m/e 279(18)，278(100).
化合物109
4-[4-(3-甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点222-223℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.03(1H，br s)，9.14(1H，s)，8.31(1H，s)，8.07(2H，d，J＝9.0Hz)，8.01(2H，d，J＝9.0Hz)，7.34-7.29(3H，m)，6.85-6.80(1H，m)，3.80(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(18)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(19)，293(100)。
化合物110
3-[4-(4-二甲基氨基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点224-225℃。TLC RF0.41(乙酸乙酯).1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.27(1H，br s)，8.93(1H，s)，8.40(1H，t，J＝1.8Hz)，8.12(1H，s)，8.11(1H，ddd，J＝8.2，2.3，1.1Hz)，7.83(1H，dd5J＝8.0，1.2Hz)，7.62(1H，t，J＝7.9Hz)，7.55(2H，d，J＝8.8Hz)，6.75(2H，d，J＝8.8Hz)，2.90(6H，s).MS(ES+)：m/e 309(48)，308(100)。MS(ES-)：m/e 307(23)，306(100)。
化合物111
3-(4-苯并[1，3]二氧环戊烯-5-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点264-265℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.12(1H，br s)，9.04(1H，s)，8.40(1H，t，J＝1.9Hz)，8.19(1H，s)，8.10(1H，ddd，J＝8.2，2.3，0.9Hz)，7.85(1H，dt，J＝7.6，1.2Hz)，7.63(1H，t，J＝7.9Hz)，7.36(1H，d，J＝1.8Hz)，7.23(1H，dd，J＝7.9，1.8Hz)，6.94(1H，d，J＝7.9Hz)，6.02(2H，s).MS(ES+)：m/e310(18)，309(100)。MS(ES-)：m/e 308(22)，307(100)。
化合物112
3-[4-(3-甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点157-158℃。TLC RF 0.20(50∶50乙酸乙酯-己烷)。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.27(1H，br s)，9.15(1H，s)，8.43(1H，t，J＝1.9Hz)，8.27(1H，s)，8.13(1H，ddd，J＝8.2，2.4，1.2Hz)，7.86(1H，dt，J＝7.6，1.2Hz)，7.64(1H，t，J＝7.9Hz)，7.33-7.27(3H，m)，6.80(1H，dt，J＝6.4，2.8Hz)，3.80(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(18)，295(100)MS(ES-)：m/e 294(20)，293(100)。
化合物205
4-(4-苯并[1，3]二氧环戊烯-5-基-吡唑-1-基)苯甲酸：熔点286-288℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.03(1H，s)，8.22(1H，s)，8.05(2H，d，J＝8.5Hz)，7.96(2H，d，J＝8.5Hz)，7.33(1H，s)，7.22(1H，d，J＝8.3Hz)，6.95(1H，d，J＝8.3Hz)，6.02(2H，s).MS(ES+)：m/e 310(30)，309(100)。MS(ES-)：m/e 308(20)，307(100)。
化合物206
4-[4-(3-羟基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点273-275℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.47(1H，s)，9.05(1H，s)，8.20(1H，s)，8.06(2H，d，J＝8.8Hz)，8.00(2H，d，J＝8.8Hz)，7.17(2H，m)，7.09(1H，s)，6.66(1H，dd，J＝8.6，1.2Hz).MS(ES+)：m/e 282(10)，281(100)。MS(ES-)：m/e 280(2O)5279(100)。
化合物207
3-[4-(3-羟苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点272-274℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.45(1H，s)，9.06(1H，s)，8.43(1H，s)，8.15(2H，m)，7.86(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，7.63(1H，t，J＝7.7Hz)，7.20(2H，m)，7.11(1H，s)，6.66(1H，m).MS(ES+)：m/e 282(20)，281(100)。MS(ES-)：m/e280(20)，279(100)。
化合物208
4-[4-(3-三氟甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点225-227℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.26(1H，s)，8.39(1H，s)，8.08(2H，d，J＝8.8Hz)，8.00(2H，d，J＝8.8Hz)，7.78(2H，m)，7.53(1H，t，J＝8.0Hz)，7.22(1H，m).MS(ES+)：m/e 350(20)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(20)，347(100)。
化合物209
3-[4-(3-三氟甲氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点166-168℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.28(1H，s)，8.43(1H，s)，8.36(1H，s)，8.14(1H，dd，J＝8.0，1.1Hz)，7.88(1H，dd，J＝7.7，0.8Hz)，7.80(2H，m)，7.66(1H，t，J＝7.7Hz)，7.53(1H，t，J＝7.8Hz)，7.21(1H，m).MS(ES+)：m/e 350(30)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(20)，347(100)。
化合物210
3-[4-(3-氯苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点178-180℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.25(1H，s)，8.43(1H，s)，8.33(1H，s)，8.13(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，7.87(2H，m)，7.72(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，7.67(1H，t，J＝8.0Hz)，7.43(1H，t，J＝8.0Hz)，7.26(1H，dd，J＝8.0，0.9Hz).MS(ES+)：m/e301(60)，299(100).MS(ES-)：m/e 299(30)，297(100).
化合物211
4-[4-(3-氯苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点252-255℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.23(1H，s)，8.36(1H，s)，8.07(2H，d，J＝8.8Hz)，7.99(2H，d，J＝8.8Hz)，7.84(1H，s)，7.70(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，7.43(1H，t，J＝8.0Hz)，7.29(1H，dd，J＝8.0Hz).MS(ES+)：m/e 301(30)，299(100)。MS(ES-)：m/e 299(30)，297(100)。
化合物212
4-[4-(3-氟苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点261-265℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.21(1H，s)，8.36(1H，s)，8.08(2H，d，J＝8.8Hz)，8.00(2H5d，J＝8.8Hz)，7.59(2H，m)，7.46(1H，m)，7.05(1H，m).MS(ES+)：m/e 284(20)，283(100)。MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物213
3-[4-(3-氟苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点228-230℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.22(1H，s)，8.43(1H，s)，8.32(1H，s)，8.12(1H，dd，J＝9.1，2.2Hz)，7.87(1H，dd，J＝7.7，0.9Hz)，7.62(3H，m)，7.41(1H，m)，7.05(1H，m).MS(ES+)：m/e 284(30)，283(100)。MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物214
4-[4-(3-三氟甲氧基苯基)-吡唑-1-基]苯甲酸：熔点220-222℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.21(1H，s)，8.35(1H，s)，8.07(2H，d，J＝8.8Hz)，7.99(2H，d，J＝8.8Hz)，7.59(2H，m)，7.45(1H，t，J＝8.0Hz)，7.28(1H，s)，7.05(1H，m).MS(ES+)：m/e 332(20)，331(100)。MS(ES-)：m/e330(20)，329(100)。
化合物215
4-[4-(3-苯氧基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸：熔点211-213℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.16(1H，s)，8.31(1H，s)，8.05(2H，d，J＝9.1Hz)，7.99(2H，d，J＝9.1Hz)，7.51(2H，m)，7.39(3H，m)，7.12(1H，m)，7.05(2H，m)，6.85(1H，m).MS(ES+)：m/e 358(25)，357(100)。MS(ES-)：m/e 356(25)，355(100)。
化合物216
3-[4-(3-苯氧基-苯基)-吡唑-1-基]苯甲酸：熔点164-165℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.18(1H，s)，8.43(1H，t，J＝1.2Hz)，8.27(1H，s)，8.13(1H，dd，J＝8.0，1.3Hz)，7.86(1H，dd，J＝7.7，0.9Hz)，7.63(1H，t，J＝8.0Hz)，7.56(2H，m)，7.12(1H，m)，7.02(2H，m)，6.84(1H，dd，J＝8.0，2.5Hz).MS(ES+)：m/e 359(10)，358(60)，357(100)。MS(ES-)：m/e 356(25)，355(100)。
3-(4，5-二氢苯并[e]吲唑3-基)苯甲酸(化合物135)的制备
2-四氢萘酮(2.00mL，14.7mmol)和二甲基甲酰胺二甲基缩醛(2.10mL，15.0mmol)的混合物加热回流14小时。混合物冷却并蒸发，大约一半的残余物溶于乙酸(10mL)中并用3-肼苯甲酸(750mL，4.93mmol)处理。溶液加热回流12小时，然后冷却并倒入水中(100mL)。通过过滤收集得到的沉淀，用水洗涤，高度真空蒸发，得到为棕褐色固体的标题化合物(900mg，3.10mmol，63％)，熔点273-275℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.30(1H，br)，8.15(1H，s)，8.10(1H，t，J＝1.9Hz)，7.95(1H，dt，J＝7.6，1.3Hz)，7.82(1H，ddd，J＝8.0，2.2，1.0Hz)，7.66(1H，t，J＝7.9Hz)，7.53(1H，dd，J＝7.6，1.2Hz)，7.26-7.22(2H，m)，7.10(1H，dt，J＝7.3，1.2Hz)，3.05-3.02(2H，m)，3.00-2.87(2H，m).MS(ES+)：m/e 292(21)，291(100)。MS(ES-)：m/e 290(20)，289(100)。
使用这些过程，可以制得以下化合物。
化合物136
3-(8H-茚并[2，1-c]吡唑-1-基)苯甲酸：熔点241-243℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.40(1H，t，J＝1.7Hz)，8.08(1H，dd，J＝8.2，1.4Hz)，8.01(1H，s)，7.88(1H，dt，J＝7.9，1.2Hz)，7.67(1H，t，J＝7.9Hz)，7.57(1H，d，J＝7.3Hz)，7.52(1H，d，J＝8.4Hz)，7.31(1H，dt，J＝7.9，0.9Hz)，7.18(1H，dt，J＝7.6，1.1Hz)，4.21(2H，s).MS(ES+)：m/e 278(19)，277(100)。MS(ES-)：m/e 276(19)，275(100)。
化合物141
3-(4，5-二氢苯并[e]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点233-234℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.22(1H，br)，8.99(1H，s)，8.38(1H，t，J＝1.8Hz)，8.07(1H，dd，J＝7.9，2.0Hz)，7.82(1H，d，J＝7.6Hz)，7.61(1H，t，J＝7.9Hz)，7.58(1H，d，J＝7.6Hz)，7.26(1H，d，J＝7.6Hz)，7.23(1H，d，J＝7.9Hz)，7.13(1H，dt，J＝7.9，1.0Hz)，3.00-2.95(2H，m)，2.89-2.84(2H，m).MS(ES+)：m/e 292(18)，291(100)。MS(ES-)：m/e 290(19)，289(100)。
化合物146
3-(8H-茚并[2，1-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点246-248℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.24(1H，br)，8.75(1H，s)，8.39(1H，t，J＝1.8Hz)，8.10(1H，dd，J＝8.0，2.2Hz)，7.82(1H，d，J＝7.6Hz)，7.62(1H，t，J＝7.9Hz)，7.56(1H，d，J＝7.3Hz)，7.51(1H，d，J＝7.6Hz)，7.33(1H，t，J-7.8Hz)，7.22(1H，t，J＝7.2Hz)，3.85(2H，s).MS(ES+)：m/e 278(18)，277(100)。MS(ES-)：m/e 276(21)，275(100)。
化合物183
3-(6-二氟甲氧基-4，5-二氢苯并[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点235-237℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.27(1H，br)，8.47(1H，s)，8.40(1H，t，J＝1.8Hz)，8.09(1H，ddd，J＝8.2，2.3，1.2Hz)，7.84(1H，dt，J＝8.2，1.3Hz)，7.75(1H，dd，J＝7.6，1.1Hz)，7.62(1H，t，J＝7.9Hz)，7.36(1H，t，J＝7.9Hz)，7.22(1H，t，J＝74.1Hz)，7.15(1H，dd，J＝8.2，0.9Hz)，2.96-2.90(2H，m)，2.82-2.77(2H，m).19F NMR(300MHz，DMSOd6)：δ-81.44(2F，d，J＝74.1Hz).MS(ES+)：m/e 358(18)，357(100)。MS(ES-)：m/e 356(23)，355(100)。
化合物184
3-(5-甲氧基-4H-茚并[1，2-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点277-278℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.24(1H，br)，8.53(1H，s)，8.42(1H，t，J＝1.9Hz)，8.10(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz)，7.82(1H，d，J＝7.6Hz)，7.61(1H，t，J＝7.9Hz)，7.41(1H，d，J＝8Hz)，7.37(1H，d，J＝8Hz)，7.03-6.97(1H，m)，3.87(3H，s)，3.62(2H，s).MS(ES+)：m/e 308(24)，307(100)。MS(ES-)：m/e 306(19)，305(100)。
化合物185
3-(5-二氟甲氧基-4H-茚并[1，2-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点240-241℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.27(1H，br)，8.60(1H，s)，8.44(1H，t，J＝1.9Hz)，8.13(1H，ddd，J＝8.2，2.3，0.9Hz)，7.84(1H，dt，J＝7.9，1.3Hz)，7.69(1H，d，J＝7.4Hz)，7.62(1H，t，J-7.9Hz)，7.48(1H，t，J＝7.9Hz)，7.34(1H，t，J＝74.1Hz)，7.19(1H，dd，J＝7.9，0.6Hz)，3.77(2H，s).19FNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ-81.57(2F，d，J＝74.1Hz).MS(ES+)：m/e344(23)，343(100)。MS(ES-)：m/e 342(21)，341(100)。
化合物186
4-(6-二氟甲氧基-4，5-二氢苯并[g]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点282-283℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.00(1H，br)，8.48(1H，s)，8.05(2H，d，J＝9.0Hz)，7.99(2H，d，J＝9.0Hz)，7.74(1H，dd，J-7.6，0.9Hz)，7.38(1H，t，J＝7.9Hz)，7.23(1H，t，J＝74.2Hz)，7.16(1H，d，J＝8.2Hz)，2.96-2.91(2H，m)，2.83-2.77(2H，m).19F NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ-81.48(2F，d，J＝74.2Hz).MS(ES+)：m/e 358(17)，357(100)。MS(ES-)：m/e 356(23)，355(100)。
化合物187
4-(5-甲氧基-4H-茚并[1，2-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点311-313℃。1HNM[R(300MHz，DMSOd6)：δ12.97(1H，br)，8.54(1H，s)，8.04(2H，d，J＝9.0Hz)，7.99(2H，d，J＝9.0Hz)，7.43-7.35(2H，m)，7.01(1H，dd，J＝7.0，1.8Hz)，3.87(3H，s)，3.63(2H，s).MS(ES+)：m/e 308(19)，307(100)。MS(ES-)：m/e 306(22)，305(100)。
化合物188
4-(5-二氟甲氧基-4H-茚并[1，2-c]吡唑-2-基)苯甲酸：熔点277-278℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.00(1H，br)，8.60(1H，s)，8.05(2H，d，J＝9.4Hz)，8.01(2H，d，J＝9.4Hz)，7.66(1H，d，J＝7.4Hz)，7.49(1H，t，J＝7.9Hz)，7.34(1H，t，J＝74.0Hz)，7.20(1H，d，J＝7.6Hz)，3.77(2H，s).19F NMR(300MHz，DMSOd6)：δ-81.60(2F，d，J＝74.0Hz).MS(ES+)：m/e 345(13)，344(33)，343(100)。MS(ES-)：m/e 342(22)，341(100)。
化合物253
3-(8-甲氧基-4，5-二氢苯并[e]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点239-241℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.01(1H，s)，8.35(1H，t，J＝1.8Hz).8.06(1H，ddd，J＝8.0，2.3，0.9Hz)，7.82(1H，dt，J＝7.6，1.3Hz)，7.61(1H，t，J＝7.9Hz)，7.21(1H，d，J＝2.9Hz)，7.16(1H，d，J＝8.4Hz)，6.70(1H，dd，J＝8.4，2.9Hz)，3.77(3H，s)，2.93-2.80(4H，m).MS(ES+)：m/e 322(21)，321(100)。MS(ES-)：m/e 320(23)，319(100)。
化合物254
3-(8-甲氧基-4，5-二氢苯并[e]吲唑-2-基)苯甲酸：熔点269-271℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.18(1H，s)，8.09(1H，t，J＝1.9Hz)，7.94(1H，dt，J＝7.9，1.3Hz)，7.81(1H，ddd，J＝8.2，2.3，1.2Hz)，7.66(1H，t，J＝7.9Hz)，7.16(1H，d，J＝8.5Hz)57.15(1H，d，J＝2.6Hz)，6.67(1H，dd，J＝8.5，2.6Hz)，3.76(3H，s)，3.05-2.99(2H，m)，2.91-2.85(2H，m).MS(ES+)：m/e 322(23)，321(100)。MS(ES-)：m/e 320(21)，319(100)。
E.3，1-吡唑的制备
本发明的3，1-吡唑可以如下制备。
3-[1-(4-二氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸(化合物124)的制备
A部分.3-乙酰基苯并腈(40.0g，276mmol)和二甲基甲酰胺二甲基缩醛(321mL)的混合物在100℃下加热搅拌72小时。将挥发性物质蒸馏掉，将粗制产物(55g)放入乙酸中(250mL)。添加水合肼(42.6mL)，混合物在100℃下加热36小时。混合物冷却并倒入乙酸乙酯中(500mL)。用1M HCl溶液(1L)和饱和盐水(250mL)洗涤。水相依次用乙酸乙酯(3×500mL)提取，提取物合并，用硫酸镁干燥，蒸发。残余物质过滤，得到橙色固体产物3-(1H-吡唑-3-基)-苯并腈(45.0g)，通过HPLC分析，纯度为88％。
B部分.4-二氟甲氧基-1-碘苯(1.50g，5.56mmol)和三异丙基硼酸酯(2.06mL，8.89mmol)在四氢呋喃(50mL)中的溶液冷却至-78℃，在搅拌下逐滴添加正丁基锂(9.8mL，1.6M己烷溶液，6.11mmol)。20分钟，去除冷却槽，溶液升温至室温。蒸发溶剂，残余物质放在1M HCl溶液中(100mL)。用乙酸乙酯(100mL)提取，提取物用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。HPLC分析表明产物4-二氟甲氧基苯硼酸(1.02g)的纯度对下个步骤是足够的。
C部分.3-(1H-吡唑-3-基)苯并腈(400mg，2.36mmol)和4-二氟甲氧基苯硼酸(1.02g，5.44mmol)在二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液用铜(II)乙酸酯(472mg)、吡啶(0.36mL)和粉末化的活性4A分子筛(1g)处理。得到的混合物在35℃加热3小时，冷却，部分蒸发。残余物隔开在1M HCl溶液和乙酸乙酯(各200mL)，提取物用盐水(100mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。残余物用柱色谱法(硅凝胶，1∶1CH2Cl2-己烷)分离，得到3-[1-(4-二氟甲氧基-苯基)-1H-吡唑-3-基]-苯并腈(200mg，23％)。
D部分.3-[1-(4-二氟甲氧基-苯基)-1H-吡唑-3-基]-苯并腈和浓盐酸(5mL)在醋酸(5mL)中的溶液加热回流16小时。混合物冷却并倒入水中(100mL)。用乙酸乙酯提取，提取物用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。残余物用柱色谱法(硅凝胶，1∶25∶74乙酸-CH2Cl2-己烷)分离，蒸发后得到做作为粉末的题目化合物(12mg，11％)(熔点182-183℃)。1H NMR(300MHz，acetone-d6)：δ11.35(1H，br s)，8.64(1H，dt5J＝1.6，0.5Hz)，8.44(1H，dd，J＝2.6，1.4Hz)，8.22(1H，ddd，J＝7.8，1.9，1.1Hz)，8.06-7.99(3H，m)，7.60(1H，t，J＝8Hz)，7.38(2H，d，J＝9.1Hz)，7.09(1H，d，J＝2.6Hz)，7.07(1H，t，J＝74.0Hz).MS(ES+)：m/e 332(20)，331(100)。MS(ES-)：m/e330(20)，329(100)。
此方法可以按稍微修改的形式制备以下化合物。
化合物86
3-[1-(2-氟-苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点157-158℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.46(1H，t，J＝1.6Hz)，8.28(1H，t，J＝2.6Hz)，8.13(1H，dt，J＝8.0，1.4Hz)，7.93-7.86(2H，m)，7.57(1H，t，J＝7.7Hz)，7.53-7.34(3H，m)，7.13(1H，d，J＝2.6Hz).MS(ES+)：m/e 284(20)，283(100)。MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物57
3-(1-苯基-1H-吡唑-3-基)苯并腈：熔点78-80℃。MS(ES+)：m/e 246(100)。
化合物58
3-[1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯并腈：熔点110-112℃。MS(ES+)：m/e 276(100)。
化合物59
3-[1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]-苯并腈：熔点100-101℃。MS(ES+)：m/e 276(100)。
化合物60
3-(1-苯并[1，3]二氧环戊烯-5-基-1H-吡唑-3-基)苯并腈：熔点144-147℃。MS(ES+)：m/e 290(100)。
化合物61
3-[1-(4-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯并腈：熔点83-84℃。MS(ES+)：m/e 330(100)。
化合物62
3-[1-(4-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯并腈：熔点70-74℃。MS(ES+)：m/e 314(100)。
化合物63
3-[1-(3，4-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]苯并腈：熔点142-145℃。MS(ES+)：m/e 282(100)。
化合物64
3-[3-(3-氰基苯基)吡唑-1-基]苯甲酸甲酯：熔点143-145℃。MS(ES+)：m/e 304(100)。
化合物65
3-(1-苯基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸：熔点202-204℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.59(1H，d，J＝2.5Hz)，8.47(1H，t，J＝1.7Hz)，8.14(1H，dt，J＝8.0，1.5Hz)，7.93(1H，t，J＝1.5Hz)，7.91-7.88(1H，m)，7.57(1H，t，J＝7.8Hz)，7.54-7.48(1H，m)，7.32(1H，tt，J＝7.4，1.1Hz)，7.11(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 266(20)，265(100)。MS(ES-)：m/e 264(20)，263(100)。
化合物74
3-[1-(4-羟基-苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点228-230℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.63(1H，s)，8.44(1H，t，J-1.7Hz)，8.38(1H，d，J＝2.5Hz)，8.10(1H，dt，J-8.0，1.5Hz)，7.88(1H，dt，J＝7.7，1.4Hz)，7.67(2H，d，J＝9.0Hz)，7.55(1H，t，J＝7.7Hz)，7.03(1H，d，J＝2.5Hz)，6.86(2H，d，J＝9.0Hz).MS(ES+)：m/e 282(20)，281(100)。MS(ES-)：m/e 280(20)，279(100)。
化合物75
3-[1-(3-羟基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点178-190℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.80(1H，s)，8.51(1H，d，J＝2.5Hz)，8.48(1H，s)，8.12(1H，d，J＝7.7Hz)，7.90(1H，d，J＝7.7Hz)，7.57(1H，t，J＝7.7Hz)，7.36-7.25(3H.m)，7.08(1H，d，J＝2.5Hz)，6.70(1H，dt，J＝6.9，2.2Hz).MS(ES+)：m/e 282(20)，281(100)。MS(ES-)：m/e 280(20)，279(100)。
化合物66
3-[1-(4-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点171-174℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.63(1H，t，J＝2.6Hz)，8.48(1H，m)，8.15(1H，d，J＝8.0Hz)，8.04(2H，dd，J＝9.0，2.5Hz)，7.91(1H，d，J＝7.7Hz)，7.58(1H，dd，J＝7.7，2.2Hz)，7.53(2H，d，J＝9.0Hz)，7.15(1H，t，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 350(20)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(20)，347(100)。
化合物67
3-[1-(4-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点225-227℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.75(1H，d，J＝2.5Hz)，8.50(1H，t，J＝1.5Hz)，8.20-8.17(3H，m)，7.94(1H，dt，J＝8.2，1.4Hz)，7.88(2H，d，J＝8.5Hz)，7.59(1H，t，J＝7.6Hz)，7.21(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 334(20)，333(100)。MS(ES-)：m/e 332(20)，331(100)。
化合物68
3-[1-(3，4-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点240-244℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.62(1H，d，J＝2.5Hz)，8.47(1H，t，J＝1.7Hz)，8.15(1H，dt，J-8.2，1.5Hz)，8.05(1H，ddd，J＝12.1，7.1，2.6Hz)，7.92(1H，dt，J＝8.0，1.4Hz)，7.84-7.78(1H，m)，7.66-7.55(2H，m)，7.15(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 302(20)，301(100)。MS(ES-)：m/e 300(20)，299(100)。
化合物69**
1，3-双(3-羧基苯基)-1H-吡唑：熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.71(1H，d，J＝1.7Hz)，8.48(1H，s)，8.44(1H，s)，8.16(2H，d，J＝7.2Hz)，7.93-7.85(2H，m)，7.64(1H，t，J＝8.0Hz)，7.57(1H，t，J＝8.2Hz)，7.14(1H，d，J＝2.7Hz).MS(ES+)：m/e 310(20)，309(100)。MS(ES-)：m/e 308(20)，307(100)。
化合物76
3-[1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点160-161℃。1H NMR(300MHz，acetone-d6)：δ11.40(1H，br s)，8.63(1H，t，J＝1.5Hz)，8.33(1H，d，J＝2.5Hz)，8.21(1H，d，J＝7Hz)，8.02(1H，d，J＝7Hz)，7.86(2H，d，J＝9.1Hz)，7.59(1H，t，J＝7.7Hz)，7.09(2H，d，J＝9.1Hz)，7.03(1H，d，J＝2.5Hz)，3.87(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(20)，295(100)。MS(ES-)：m/e294(20)，293(100)。
化合物77
3-[1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点153-154℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.60(1H，dd，J＝2.5，1.5Hz)，8.45(1H，d，J＝1.1Hz)，8.14(1H5dd，J＝7.9，1.3Hz)，7.90(1H，dd，J＝7.7，1.1Hz)，7.60-7.38(4H，m)，7.11(1H，dd，J＝2.5，1.4Hz)，6.89(1H，d，J＝8.0Hz)，3.83(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(20)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(20)，293(100)。
化合物87
3-(1-苯并[1，3]二氧环戊烯-5-基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸：熔点210-215℃。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)：δ8.61(1H，dt，J＝1.7，0.5Hz)，8.32(1H，d，J＝2.5Hz)，8.21(1H，ddd，J＝7.7，1.7，1.1Hz)，8.02(1H，dt，J＝8.3，1.5Hz)，7.59(1H，dt，J＝7.7，0.6Hz)，7.49(1H，d，J＝2.2Hz)，7.41(1H，dd，J＝8.5，2.2Hz)，7.03(1H，d，J＝2.7Hz)，6.98(1H，d，J＝8.3Hz)，6.11(2H，s).MS(ES+)：m/e 310(20)，309(100)。MS(ES-)：m/e 308(10)，307(100)。
化合物96
3-[1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点245-246℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.57(1H，d，J＝2.5Hz)，8.47(1H，t，J＝1.8Hz)，8.14(1H，dt，J＝7.7，1.5Hz)，7.98-7.88(3H，m)，7.57(1H，t，J＝7.7Hz)，7.36(2H，t，J＝8.8Hz)，7.11(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 284(20)，283(100)。MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物4
3-[1-(4-异丙基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.62(1H，s)，8.21(1H，d，J＝8Hz)，8.08(1H，d，J＝8Hz)，7.95(1H，d，J-2Hz)，7.69(2H，d，J＝8Hz)，7.55(1H，t，J＝8Hz)，7.33(2H，d，J＝8Hz)，6.84(1H，d，J＝2Hz)，2.97(1H，heptet，J＝7Hz)，1.27(6H，d，J＝7Hz).MS(ES+)：m/e 308(22)，307(100)。
如本发明的其他地方所述，下面的化合物可以通过3-(碳甲氧基苯基)-1H-吡唑与芳基碘化物试剂的碘化铜催化交叉耦合，然后用甲酸酯水解而制得：
化合物160
4-[1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点190-191℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ12.99(1H，br)，8.63(1H，d，J＝2.6Hz)，8.05(2H，d，J＝8.5Hz)，7.99(2H，d，J＝8.5Hz)，7.53-7.48(2H，m)，7.42(1H，t，J＝7.9Hz)，7.14(1H，d，J＝2.6Hz)，6.90(1H，ddd，J＝8，2.2，1.2Hz)，3.84(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(21)，295(100)。
化合物164
3-[1-(3-二甲基氨基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点180-183℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.56(1H，d，J＝2.7Hz)，8.44(1H，t，J＝1.7Hz)，8.13(1H，dt，J＝7.9，1.5Hz)，7.90(1H，dt，J＝7.7，1.5Hz)，7.56(1H，t，J＝7.8Hz)，7.28(1H，t，J＝8.5Hz)，7.16(1H，s)，7.16-7.13(1H，m)，7.07(1H，d，J＝2.5Hz)，6.68-6.64(1H，m)，2.97(6H，s).MS(ES+)：m/e 309(20)，308(100)。MS(ES-)：m/e 307(15)，306(100)。
化合物165
3-[1-(3-溴苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点180-183℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.68(1H，d，J＝2.5Hz)，8.47(1H，s)，8.18-8.15(2H，m)，7.98-7.90(2H，m)，7.58(1H，t，J＝7.7Hz)，7.54-7.44(2H，m)，7.16(1H，d，J-2.5Hz).MS(ES+)：m/e 345(100)，343(95).MS(ES-)：m/e 343(98)，341(100)。
化合物166
3-(1-p-甲苯基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸：熔点192-193℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.54(1H，d，J＝2.5Hz)，8.47(1H，t，J＝2Hz)，8.13(1H，dm，J＝7.7Hz)，7.90(1H，dm，J＝8.0Hz)，7.80(2H，d，J＝8.3Hz)，7.57(1H，t，J＝7.7Hz)，7.32(2H，d，J＝8.5Hz)，7.09(1H，d，J＝2.5Hz)，2.34(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(20)，279(100)。MS(ES-)：m/e 278(20)，277(100)。
化合物167
3-(1-m-甲苯基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸：熔点162-164℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.56(1H，d，J＝2.5Hz)，8.47(1H，t，J＝2Hz)，8.14(1H，d，J＝7.7Hz)，7.91(1H，d，J-8.0Hz)，7.76(1H，s)，7.70(1H，d，J＝8.0Hz)，7.57(1H，t，J＝7.7Hz)，7.39(1H，t，J＝7.8Hz)，7.13(1H，d，J＝7.2Hz)，7.10(1H，d，J＝2.5Hz)，2.40(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(23)，279(100)。MS(ES-)：m/e 278(20)，277(100)。
化合物168
3-[1-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点280-281℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.83(1H，d，J＝2.7Hz)，8.52(1H，s)，8.39(2H，d，J＝9.3Hz)，8.22(2H，d，J＝9.3Hz)，8.18(1H，d，J＝8Hz)，7.95(1H，d，J＝8.0Hz)，7.60(1H，t，J＝8Hz)，7.27(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 311(30)，310(100)。MS(ES-)：m/e309(20)，308(100).
化合物175
3-[1-(3-苄氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点152-153℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.61(1H，d，J＝2.7Hz)，8.47(1H，t，J＝1.6Hz)，8.15(1H，dt，J＝7.7，1.2Hz)，7.91(1H，dt，J＝7.7，1.2Hz)，7.60-7.30(9H，m)，7.12(1H，d，J＝2.7Hz)，6.97(1H，dd，J＝7.7，2.2Hz)，5.20(2H，s).MS(ES+)：m/e 372(25)，371(100)。MS(ES-)：m/e 370(20)，369(100)。
化合物176
3-[1-(4-苄氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点210-212℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.47(1H，d，J＝2.5Hz)，8.45(1H，t，J＝1.8Hz)，8.12(1H，dt，J＝7.9，1.3Hz)，7.89(1H，dt，J＝7.7，1.3Hz)，7.82(2H，d，J＝9.1Hz)，7.56(1H，t，J＝7.8Hz)，7.49-7.30(5H，m)，7.15(2H，d，J＝9.1Hz)，7.07(1H，d，J＝2.5Hz)，5.15(2H，s).MS(ES+)：m/e 372(20)，371(100)。MS(ES-)：m/e 370(25)，369(100)。
化合物217
4-[1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点252-253℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.49(1H，d，J＝2.5Hz)，8.03(2H，d，J＝8.7Hz)，7.99(2H，d，J＝8.7Hz)，7.82(2H，d，J＝9.0Hz)，7.09(1H，d，J＝2.5Hz)，7.07(2H，d，J＝9.0Hz)，3.79(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(20)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(20)，293(100)。
化合物218
4-[1-(4-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点214-215℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.66(1H，d，J＝2.5Hz)，8.06-8.01(6H，m)，7.54(2H，d，J＝8.5Hz)，7.18(1H，d，J＝2.5Hz).MS(ES+)：m/e 350(20)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(20)，347(100)。
化合物255
3-[1-(4-乙酰基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点215-216℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ12.99(1H，br)，8.75(1H，d，J＝2.6Hz)，8.50(1H，t，J＝1.6Hz)，8.17(1H，dt，J＝8.2，1.5Hz)，8.10(2H，d，J＝9.3Hz)，8.07(2H，d，J＝9.3Hz)，7.93(1H，dt，J＝7.9，1.5Hz)，7.59(1H，t，J＝7.9Hz)，7.20(1H，d，J＝2.6Hz)，2.60(3H，s).MS(ES+)：m/e 308(19)，307(100)。MS(ES-)：m/e 306(20)，305(100)。
化合物256
4-[1-(4-乙酰基苯基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点278-279℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.00(1H，br)，8.76(1H，d，J＝2.6Hz)，8.10(2H，d，J＝9.3Hz)，8.08(2H，d，J＝9.3Hz)，8.07(2H，d，J＝8.8Hz)，8.01(2H，d，J＝8.8Hz)，7.22(1H，d，J＝2.6Hz)，2.60(3H，s)。MS(ES+)：m/e 308(23)，307(100)。MS(ES-)：m/e 306(20)，305(100)。
化合物257
4-[1-(1H-吲哚-5-基)-1H-吡唑-3-基]苯甲酸：熔点281-282℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ12.90(1H，br)，11.27(1H，br)，8.49(1H，d，J＝2.6Hz)，8.04(2H，d，J＝8.8Hz)，8.03-8.00(1H，m)，7.99(2H，d，J＝8.8Hz)，7.64(1H，dd，J＝8.8，2.3Hz)，7.50(1H，d，J＝8.8Hz)，7.44(1H，t，J＝2.8Hz)，7.08(1H，d，J＝2.6Hz)，6.52-6.49(1H，m).MS(ES+)：m/e 305(19)，304(100)。MS(ES-)：m/e 303(22)，302(100)。
化合物258
3-(1-噻吩-2-基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸：熔点198-199℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.12(1H，br)，8.48(1H，d，J＝2.4Hz)，8.42(1H，s)，8.09(1H，d，J＝7.6Hz)，7.91(1H，d，J＝7.9Hz)，7.57(1H，t，J＝7.9Hz)，7.36(1H，dd，J＝3.8，1.1Hz)，7.31(1H，d，J-5.2Hz)，7.11(1H，d，J＝2.4Hz)，7.03(1H，dd，J＝5.2，3.8Hz).MS(ES+)：m/e 273(8)，272(21)，271(100)。MS(ES-)：m/e 271(6)，270(16)，269(100)。
化合物259
4-(1-噻吩-2-基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸：熔点200-202℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ12.97(1H，br)，8.50(1H，d，J＝2.6Hz)，8.00(2H，d，J＝9.3Hz)，7.97(2H，d，J＝9.3Hz)，7.38(1H，dd，J＝3.8，1.4Hz)，7.32(1H，dd，J＝5.6，1.5Hz)，7.13(1H，d，J＝2.6Hz)，7.03(1H，dd，J＝5.6，3.8Hz).MS(ES+)：m/e 273(5)，272(15)，271(100)。MS(ES-)：m/e 271(5)，270(16)，269(100)。
化合物260
3-(1-吡啶-3-基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸；熔点235-236℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.12(1H，br)，9.18(1H，d，J＝2.6Hz)，8.69(1H，d，J＝2.6Hz)，8.53(1H，dd，J＝4.7，1.2Hz)，8.49(1H，t，J＝1.6Hz)，8.31(1H，ddd，J＝8.5，2.6，1.5Hz)，8.17(1H，dt，J＝8.2，1.6Hz)，7.93(1H，dt，J＝7.9，1.6Hz)，7.59(1H，t，J＝7.9Hz)，7.56(1H，ddd，J＝8.2，4.7，0.6Hz)，7.19(1H，d，J＝2.6Hz).MS(ES+)：m/e 267(34)，266(100)。MS(ES-)：m/e 265(17)，264(100)。
化合物261
4-(1-吡啶-3-基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸；熔点280-282℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ12.99(1H，br)，9.21(1H，br)，8.71(1H，d，J＝2.6Hz)，8.56(1H，br)，8.32(1H，br d，J＝9.0Hz)，8.07(2H，d，J＝8.8Hz)，8.01(2H，d，J＝8.8Hz)，7.60-7.55(1H，brm)，7.21(2H，d，J＝2.6Hz).MS(ES+)：m/e267(30)，266(100).MS(ES-)：m/e 265(20)，264(100)。
F.4，1-吡唑的制备
本发明的4，1-吡唑可以如下制备。
6-[1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]-吡啶-2-羧酸(化合物53)的制备
6-(二甲酸基甲基)-吡啶-2-羧酸(315mg，1.63mmol)、4-甲氧基苯基肼氢氧化物(285mg，1.63mmol)和醋酸钠(134mg，1.63mmol)在醋酸(5
mL)中的溶液在110℃下加热18小时。，冷却后将溶液过滤。固体产物用乙酸乙酯和二乙醚洗涤，真空干燥，得到浅褐色的标题产物(294mg，0.99mmol，61％)，熔点122-123℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.11(1H，s)，8.38(1H，s)，7.99(2H，d，J＝4.7Hz)，7.86(1H，t，J＝4.4Hz)，7.80(2H，d，J＝9.1Hz)，7.08(2H，d，J＝9.1Hz)，3.80(3H，s)，1H missing.MS(ES+)：m/e 297(18)，296(100)。MS(ES-)：m/e 295(14)，294(100)。
可稍微修改上述方法以制备下列化合物。
化合物54
6-[1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-羧酸：熔点：194-196℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.25(1H3s)，8.45(1H，s)，8.01-7.86(5H，m)，7.59(2H，d，J＝8.5Hz)，1H missing.MS(ES+)：m/e 302(36)，301(16)，300(100)。MS(ES-)：m/e 300(36)，299(16)，298(100)。
化合物55
3-[1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]-4-硝基苯甲酸：熔点249-250℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.68(1H，br s)，8.81(1H，s)，8.20(1H，s)，8.02(2H，s)，7.79(2H，d，J＝9.1Hz)，7.79(1H，s)，7.06(2H，d，J＝9.1Hz)，3.79(3H，s).MS(ES+)：m/e 341(20)，340(100)。MS(ES-)：m/e 339(21)，338(100)。
化合物56
3-[1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-4-基]-4-硝基苯甲酸：熔点270-271℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.70(1H，br s)，8.96(1H，s)，8.20(1H，s)，8.03(2H，s)，7.92(2H，d，J＝8.8Hz)，7.86(1H，s)，7.57(2H，d，J＝8.8Hz).MS(ES+)：m/e 346(37)，345(14)，344(100)。MS(ES-)：m/e 344(42)，343(15)，342(100)。
3-[1-(4-氯苯基)-1H-吡唑4-基]苯甲酸(化合物83)的制备
A部分.4-氯苯基肼氢氯化物(2.02g，11.3mmol)、1，1，3，3-四甲氧基丙烷(2.00niL，12.1mmol)和醋酸钠(1.00g，12.2mmol)在醋酸(25mL)中的溶液加热温和地回流过夜。溶液冷却并倒入水中(125mL)。部分加入固体碳酸氢钠直到混合物pH为弱碱性。然后用乙酸乙酯(125mL)提取两次，提取物用盐水洗涤，合并，用无水硫酸镁干燥，过滤，蒸发，得到两批1-(4-氯苯基)吡唑(1.13g+0.24g，7.65mmol，68％)。熔点50-53℃。TLC RF 0.19(10∶90乙酸乙酯-己烷).1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.89(1H，dd，J＝2.4，0.6Hz)，7.72(1H，d，J＝1.5Hz)，7.64(2H，d，J＝8.7Hz)，7.42(2H，d，J＝8.7Hz)，6.47(1H，dd，J＝2.4，1.8Hz).MS(ES+)：m/e 182(3)，181(34)，180(6)，179(100)。
B部分.1-(4-氯苯基)吡唑(834mg，4.67mmol)在醋酸中(10mL)的溶液用溴(0.26mL，5.08mmol)处理。搅拌18小时后，溶液用40mL水稀释，加入饱和NaHSO3水溶液，直到溴色消散。然后加入固体碳酸氢钠，直到pH为中性。该混合物用乙酸乙酯(2×50mL)提取，提取物用盐水洗涤，合并，用无水硫酸镁干燥，过滤，蒸发。固体残留物用环己烷重结晶，得到纯的产物4-溴-1-(4-氯苯基)-吡唑(797mg，3.10mmol，66％)。熔点75-76℃环己烷).1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.89(1H，s)，7.66(1H，s)，7.57(2H，d，J＝9.0Hz)5 7.41(2H，d，J＝9.0Hz).MS(ES+)：m/e 261(26)，259(100)，257(77).
C部分.4-溴-1-(4-氯苯基)吡唑(422mg，1.64mmol)、3-羧基苯硼酸(326mg，1.96mmol)、醋酸钯(20mg，0.089mmol)、三苯基膦(93mg，0.355mmol)和Na2CO3水溶液(2.50mL，2.0M，5.00mmol)在二甲氧基乙烷(25mL)中的溶液通过三次真空抽气/氮吹洗而脱气。然后将溶液加热回流18小时。得到的黑色混合物冷却，通过塞里塑料(celite)过滤，倒入到120mL HCl(0.5N)中。用乙酸乙酯(2×120mL)提取，提取物用盐水洗涤，合并，用无水硫酸镁干燥，过滤，蒸发。通过过滤收集到少量(50mg)固体产物，通过光谱分析为纯的标题化合物，熔点205-206℃。1H NMR(300MHz，acetone-d6)：δ9.03(1H，s)，8.32(1H，t，J＝1.6Hz)，8.26(1H，s)，8.01(2H，d，J＝9.0Hz)，7.97-7.87(2H，m)，7.56(2H，d，J＝9.0Hz)，7.53(1H，t，J＝8.2Hz)，1H missing.MS(ES+)：m/e 302(4)，301(31)，300(19)，299(100)。MS(ES-)：m/e 300(2)，299(31)，298(23)，297(100)。
可稍微修改上述方法以制备下列化合物。
化合物97
3-[1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点223-225℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ13.07(1H，s)，9.01(1H，s)，8.24(1H，s)，8.22(1H，s)，7.94(1H，d，J＝7.6Hz)，7.82(2H，d，J＝9.9Hz)，7.81(1H，d，J＝7.8Hz)，7.52(1H，t，J＝7.7Hz)，7.06(2H，d，J＝9.9Hz)，3.79(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(19)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(17)，293(100)。
化合物133
3-[1-(4-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点213-215℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.18(1H，s)，8.32(1H，s)，8.26(1H，s)，7.99(3H，m)，7.81(1H，d，J＝6.3Hz)，7.53(3H，m).MS(ES+)：m/e 350(20)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(20)，347(100)。
化合物134
4-[1-(4-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点246-248℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.18(1H，s)，8.35(1H，s)，8.01(2H，d，J＝8.9Hz)，7.96(2H，d，J＝8.2Hz)，7.83(2H，d，J＝8.2Hz)，7.55(2H，d，J＝8.9Hz).MS(ES+)：m/e 350(20)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(20)，347(100)。
化合物171
4-[1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点211-212℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.16(1H，s)，8.31(1H，s)，7.95(2H，d，J＝8.5Hz)，7.83(2H，d，J-8.5Hz)，7.44(3H，m)，6.90(1H，m)，3.84(3H，s).MS(ES+)：m/e 297(5)，296(45)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(20)，293(100)。
化合物172
3-[1-(3-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点179-181℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.21(1H，s)，8.33(1H，s)，8.27(1H，s)，7.95(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，7.80(3H，m)，7.55(2H，m)，7.35(1H，s)，7.12(1H，m).MS(ES+)：m/e 332(60)，331(100)。MS(ES-)：m/e 330(20)，329(100)。
化合物173
4-[1-(3-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点255-257℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.20(1H，s)，8.34(1H，s)，7.96(2H，d，J＝8.5Hz)，7.82(2H，d，J＝8.5Hz)，7.77(1H，m)，7.73(1H，m)，7.57(1H，m)，7.36(1H，s)，7.14(1H，m).MS(ES+)：m/e 333(10)，332(60)，331(100)。MS(ES-)：m/e 330(20)，329(100)。
化合物174
3-[1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点156-157℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.15(1H，s)，8.27(2H，s，overlapping)，7.96(1H，dd，J-7.7，1.1Hz)，7.81(1H，dd，J＝7.4，1.1Hz)，7.50(3H，m)，7.43(1H，m)，6.88(1H，dd，J＝8.0，1.1Hz)，3.83(3H，s).MS(ES+)：m/e 296(20)，295(100)。MS(ES-)：m/e 294(20)，293(100)。
化合物177
3-(1-p-甲苯基-1H-吡唑-4-基)苯甲酸：熔点229-231℃。1H NMR(300
MHz，DMSOd6)：δ9.07(1H，s)，8.25(2H，s，重叠)，7.94(1H，d，J＝7.4Hz)，7.78(3H，m)，7.51(1H，t，J＝7.4Hz)，7.30(2H，d，J＝8.0Hz)，2.33(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(20)，279(100)。MS(ES-)：m/e 278(20)，277(100)。
化合物178
4-(1-p-甲苯基-1H-吡唑-4-基)苯甲酸：熔点280-282℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.08(1H，s)，8.28(1H，s)，7.95(2H，d，J＝8.3Hz)，7.83(2H，d，J＝8.3Hz)，7.77(2H，d，J＝8.6Hz)，7.32(2H，d，J＝8.6Hz)，2.33(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(20)，279(100)。MS(ES-)：m/e 278(20)，277(100)。
化合物179
3-[1-(2，4-二氟苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点200-202℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.74(1H，d，J＝1.9Hz)，8.32(1H，s)，8.21(1H，s)，7.87(3H，m)，7.58(2H，m)，7.28(1H，m).MS(ES+)：m/e 302(20)，301(100)。MS(ES-)：m/e 300(20)，299(100)。
化合物180
4-[1-(2，4-二氟苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点258-260℃，1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.76(1H，d，J＝2.2Hz)，8.36(1H，s)，7.94(2H，d，J＝8.3Hz)，7.88(1H，m)，7.83(2H，d，J＝8.3Hz)，7.61(1H，m)，7.29(1H，m).MS(ES+)：m/e 302(20)，301(100)。MS(ES-)：m/e 300(20)，299(100)。
化合物181
3-[1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点235-237℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.11(1H，s)，8.26(2H，d，J＝6.3Hz)，7.94(3H，m)，7.81(1H，d，J＝7.7Hz)，7.52(1H，t，J＝7.7Hz)，7.36(2H，m).MS(ES+)：m/e284(40)，283(100)。MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物182
4-[1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点266-268℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.11(1H，s)，8.31(1H，s)，7.95(2H，d，J＝8.4Hz)，7.92(2H，m)，7.83(2H，d，J＝8.4Hz)，7.38(2H，m).MS(ES+)：m/e 284(40)，283(100)。MS(ES-)：m/e 282(20)，281(100)。
化合物223
3-[1-(3-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点143-145℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.30(1H，s)，8.21(1H，s)，8.03(2H，m)，7.76(1H，dd，J＝6.9，1.0Hz)，7.65(2H，m)，7.49(2H，m)，7.17(1H，dd，J＝8.3，1.3Hz).MS(ES+)：m/e 350(30)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(20)，347(100)。
化合物224
4-[1-(3-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点230-231℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.24(1H，s)，7.90(1H，s)，7.86(2H，m)，7.53(2H，m)，7.45(2H，m)，7.33(1H，m)，6.98(1H，m).MS(ES+)：m/e 350(30)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(20)，347(100)。
化合物225
3-[1-(2，3-二氢苯并[1，4]二氧芑-6-基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点201-203℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.01(1H，s)，8.23(1H，s)，8.20(1H，s)，7.91(1H，dd，J＝7.7，1.1Hz)，7.79(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，7.50(1H，t，J＝7.7Hz)，7.36(2H，m)，6.97(1H5d，J＝8.8Hz)，4.28(4H，t，J＝1.2Hz).MS(ES+)：m/e 324(20)，323(100)。MS(ES-)：m/e 322(20)，321(100)。
化合物226
4-[1-(2，3-二氢苯并[1，4]二氧芑-6-基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点238-240℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.01(1H，s)，8.23(1H，s)，7.93(2H，d，J＝8.3Hz)，7.75(2H，d，J＝8.3Hz)，7.36(2H，m)，6.98(1H，d，J＝8.8Hz)，4.28(4H，t，J＝1.9Hz).MS(ES+)：m/e 324(20)，323(100)。MS(ES-)：m/e 322(20)，321(100)。
化合物227
4-(1-苯并[1，3]二氧芑-5-基-1H-吡唑-4-基)苯甲酸：熔点266-268℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.00(1H，s)，8.25(1H，s)，7.94(2H，d，J＝8.2Hz)，7.80(2H，d，J＝8.2Hz)，7.47(1H，d，J＝2.2Hz)，7.35(1H，dd，J＝8.5，2.2Hz)，7.04(1H，d，J＝8.5Hz)，6.09(2H，s)。MS(ES+)：m/e 310(20)，309(100)。MS(ES-)：m/e 308(15)，307(70)，242(100).
化合物228
3-[1-(4-异丙基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点212-215℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.06(1H，s)，8.25(1H，t，J＝2.2Hz)，8.24(1H，s)，7.94(1H，dd，J＝7.1，1.1Hz)，7.81(2H，d，J＝8.6Hz)，7.79(1H，s)，7.51(1H，m)，7.36(2H，d，J＝8.6Hz)，2.91(1H，heptet(七重峰)，J＝6.9Hz)，1.21(6H，d，J＝6.9Hz).MS(ES+)：m/e 308(20)，307(100)。MS(ES-)：m/e 306(20)，305(100)。
化合物229
4-[1-(4-异丙基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点215-218℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.08(1H，s)，8.28(1H，s)，7.94(2H，d，J＝8.3Hz)，7.83(2H，d，J＝8.3Hz)，7.79(2H，d，J＝8.5Hz)，7.38(2H，d，J＝8.5Hz)，2.93(1H，heptet，J＝6.9Hz)，1.21(6H，d，J＝6.9Hz).MS(ES+)：m/e 308(20)，307(100)。MS(ES-)：m/e 306(20)，305(100).
化合物230
3-[1-(3-氯-4-甲基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点209-211℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.16(1H，s)，8.33(1H，s)，7.93(3H，m)，7.85(2H，m)，7.58(2H，m)，2.31(3H，s).MS(ES+)：m/e 315(30)，313(100)。MS(ES-)：m/e 313(30)，311(100)，277(10).
化合物231
4-[1-(3-氯-4-甲基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点285-288℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.17(1H，s)，8.31(1H，s)，7.97(1H，s)，7.94(2H，d，J＝8.3Hz)，7.81(2H，d，J-8.3Hz)，7.77(1H，d，J＝8.5Hz)，7.49(1H，d，J＝8.3Hz)，2.34(3H，s).MS(ES+)：m/e 315(30)，313(100)。MS(ES-)：m/e 313(30)，311(100)。
化合物232
3-[1-(3，4-二氯苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点135-138℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.24(1H，s)，8.34(1H，s)，8.27(1H，s)，8.23(1H，d，J＝2.5Hz)，7.93(2H，m)，7.80(2H，m)，7.51(1H，t，J＝7.7Hz).MS(ES+)：m/e 337(10)，335(60)，333(100)。MS(ES-)：m/e 335(10)，333(60)，331(100)。
化合物233
4-[1-(3，4-二氯苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点286-289℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.23(1H，s)，8.36(1H，s)，8.19(1H，d，J＝1.1Hz)，7.95(2H，d，J＝7.2Hz)，7.90(1H，m)，7.82(2H，d，J＝7.2Hz)，7.80(1H，s).MS(ES+)：m/e 337(10)，335(50)，333(100)。MS(ES-)：m/e 335(10)，333(60)，331(100)。
化合物234
4-[1-(4-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点259-261℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.16(1H，s)，8.33(1H，s)，7.95(2H，d，J＝7.6Hz)，7.91(2H，d，J＝8.5Hz)，7.82(2H，d，J＝7.6Hz)，7.58(2H，d，J＝8.5Hz).MS(ES+)：m/e 301(30)，299(100)。MS(ES-)：m/e 299(30)，297(100)。
化合物235
3-[1-(4-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点218-220℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.30(1H，s)，8.38(1H，s)，8.30(1H，s)，8.15(2H，d，J＝8.1Hz)，7.96(1H，dd，J＝7.7，1.1Hz)，7.89(2H，d，J＝8.1Hz)，7.83(1H，dd，J＝7.8，1.2Hz)，7.53(1H，m).MS(ES+)：m/e 334(20)，333(100)。MS(ES-)：m/e 332(20)，331(100)。
化合物236
4-[1-(4-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点271-273℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.28(1H，s)，8.40(1H，s)，8.10(2H，d，J＝7.7Hz)，7.96(2H5d，J＝7.7Hz)，7.89(4H，m).MS(ES+)：m/e 334(20)，333(100)。MS(ES-)：m/e 332(20)，331(100)，287(10).
化合物237
3-[1-(3，4-二甲基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点196-197℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.03(1H，s)，8.25(1H，s)，8.22(1H，s)，7.91(1H，d，J＝7.4Hz)，7.80(1H，dd，J＝7.2，1.1Hz)，7.72(1H，s)，7.60(1H，dd，J＝8.3，2.2Hz)，7.49(1H，m)，7.23(1H，d，J＝8.0Hz)，2.29(3H，s)，2.23(3H，s).MS(ES+)：m/e 294(20)，293(100)。MS(ES-)：m/e 292(20)，291(100)。
化合物238
4-[1-(3，4-二甲基苯基)-1H-吡唑-4-基]苯甲酸：熔点254-256℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.05(1H，s)，8.25(1H，s)，7.93(2H，d，J＝6.9Hz)，7.88(2H，d，J＝6.9Hz)，7.68(1H，s)，7.57(1H，d，J＝8.0Hz)，7.25(1H，d，J＝8.0Hz)，2.28(3H，s)，2.23(3H，s).MS(ES+)：m/e 294(20)，293(100)。MS(ES-)：m/e 292(20)，291(100)，247(10).
化合物239
3-(1-苯并[1，3]二氧环戊烯-5-基-1H-吡唑-4-基)苯甲酸：熔点221-223℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.01(1H，s)，8.23(1H，t，J＝1.7Hz)，8.22(1H，s)，7.92(1H，d，J＝7.7Hz)，7.79(1H，dd，J＝7.7，1.1Hz)，7.53-7.48(2H，m)，7.37(1H，dd，J＝8.3，2.2Hz)，7.03(1H，d，J＝8.3Hz)，6.09(2H，s).MS(ES+)：m/e 310(20)，309(100)。MS(ES-)：m/e 308(20)，307(100)。
G.1，2，4-三唑的制备
3-[1-(4-甲氧基苯基)-lH-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸(化合物12)的制备
A部分.甲基3-氰基苯甲酸酯(1.06g，6.58mmol)在甲醇(8mL)中的溶液冷却至0℃，用氯化乙酰(10.0mL，140mmol)逐滴处理。得到的混合物搅拌6小时，升温至室温。溶液的挥发性组分蒸发掉，得到的白色固体用二乙醚洗涤而净化。真空干燥后，该固体直接用于下个步骤。
B部分.4-甲氧基苯基肼氢氯化物(1.30g，7.44mmol)用饱和碳酸氢钠饱和水溶液(15mL)处理，并搅拌10分钟。用二氯乙烷(2×20mL)洗涤，提取物用盐水洗涤，合并，用无水硫酸镁干燥，过滤，蒸发，得到为白色粉末的游离碱。悬浮在1，4-二噁烷(10mL)中，加入以上A部分中制得的亚胺酯盐。得到的溶液在110℃下加热3.5小时，冷却。混合物用二乙醚稀释，通过过滤收集得到的白色沉淀，真空干燥，得到3-[亚氨基(2-(4-甲氧基)苯基肼基)甲基]苯甲酸甲酯(0.48g，21％)。MS(ES+)：m/e 300(100)。
C部分.3-[亚氨基-(2-(4-甲氧基)苯基肼基)甲基]苯甲酸甲酯(0.28g，0.94mmol)的溶液用浓甲酸(3.5mL)处理。溶液加热回流12小时，冷却，倒入水中，搅拌1小时。形成白色固体(3-[1-(4-甲氧基-苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸甲酯)，通过过滤收集，用水和己烷洗涤，真空干燥(0.22g，76％)。MS(ES+)：m/e 310.
D部分.3-[1-(4-甲氧基苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸甲酯(0.21g，6.8mmol)和NaOH水溶液(5mL)在THF(5mL)中的混合物加热回流5小时。溶液冷却并蒸发，残余物用1N HCl处理，直到pH为弱酸性。这使得白色固体沉淀，用乙醇/水重结晶，得到标题产物(0.13g，65％)。熔点230-232℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.26(1H，s)，8.64(1H，s)，8.29(1H，d，J＝8Hz)，8.00(1H，d，J＝8Hz)，7.84(2H，d，J＝8.8Hz)，7.63(1H，t，J＝8Hz)，7.12(2H，d，J＝8.8Hz)，3.82(3H，s).MS(ES+)：m/e297(20)，296(100)。MS(ES-)：m/e295(20)，294(100)。
该过程可以用来合成下列化合物。
化合物8
3-(3-苯基-[1，2，4]三唑-1-基)苯甲酸：熔点268-271℃。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)：δ9.27(1H，s)，8.57(1H，t，J＝1.9Hz)，8.26-8.19(3H，m)，8.09(1H，dt，J＝7.9，1.3Hz)，7.75(1H，t，J＝7.9Hz)，7.54-7.43(3H，m).MS(ES+)：m/e 267(18)，266(100)。MS(ES-)：m/e 265(17)，264(100)。分析计算C15H11N3O2·1.52H2O：C，61.57；H，4.83；N，14.36；发现：C，62.79；H，4.27；N，13.00.
化合物9
3-[3-(4-羟基苯基)-[1，2，4]三唑-1-基)苯甲酸：熔点307-311℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.41(1H，s)，8.41(1H，s)，8.16(1H，dd，J＝7.9，2.0Hz)，7.95-7.84(3H，m)，7.68(1H，t，J＝7.9Hz)，6.87(2H，d，J＝8.5Hz).MS(ES+)：m/e 283(18)，282(100)。MS(ES-)：m/e 281(18)，280(100)。分析计算C15H11N3O3·2.03H2O：C，56.69；H，4.78；N，13.22；发现：C，56.38；H，3.66；N，13.02.
化合物10
3-[3-(4-苄氧基苯基)-[1，2，4]三唑-1-基]苯甲酸：熔点259-261℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.37(1H，br s)，9.42(1H，s)，8.42(1H，s)，8.16(1H，ddd，J＝8.1，2.3，1.2Hz)，8.03(2H，d，J＝9.2Hz)，7.95(1H，dt，J＝7.9，1.0Hz)，7.69(1H，t，J＝7.8Hz)，7.48-7.32(5H，m)，7.13(2H，d，J＝9.2Hz)，5.16(2H，s).MS(ES+)：m/e 373(21)，372(100)。MS(ES-)：m/e371(23)，370(100)。分析计算C22H17N3O3·0.18H2O：C，70.54；H，4.67；N，11.22；发现：C，70.55；H，4.46；N，11.07.
化合物11
3-[3-(4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑-1-基]苯甲酸：熔点268-270℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.36(1H，br s)，9.42(1H，s)，8.42(1H，s)，8.17(1H，dt，J＝8.1，1.1Hz)，8.03(2H，d，J＝8.2Hz)，7.94(1H，dd，J＝7.8，1.1Hz)，7.69(1H，t，J＝7.6Hz)，7.05(2H，d，J＝8.2Hz)，3.81(3H，s).MS(ES+)：m/e 297(23)，296(100)。MS(ES-)：m/e 295(17)，294(100)。分析计算C16H13N3O3·0.17H2O：C，64.42；H，4.51；N，14.08；发现：C，64.69；H，4.43；N，13.77.
化合物13
3-[1-(4-氟苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点＞310℃。1H NMR(300M[Hz，DMSO-d6)：δ9.31(1H，s)，8.60(1H，s)，8.25(1H，d，J＝6.6Hz)，8.00-7.90(3H，m)，7.59(1H，t，J＝7.5Hz)，7.42-7.36(2H，m).MS(ES+)：m/e 285(25)，284(100)。MS(ES-)：m/e 283(20)，282(100)。
化合物14
3-(1-p-甲苯基-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸：熔点263-265℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.26(1H，d)，8.57(1H)，8.21(1H)，7.91(1H)，7.73(1H)，7.55(1H，d)，7.29(2H)，2.30(3H，s).MS(ES+)：m/e 281(25)，280(100)。MS(ES-)：m/e 279(20)，278(100)。
化合物16
3-[1-(2，4-二氟苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点290-292℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.09(1H，t，J＝1.9Hz)，8.63(1H，d，J＝1.4Hz)，8.28(1H，d，J＝6.3Hz)，8.03-7.90(2H，m)，7.71-7.61(2H，m)，7.34(1H，t，J＝7Hz).MS(ES+)：m/e 303(20)，302(100)。MS(ES-)：m/e 301(20)，300(100)。
化合物15
3-[1-(4-异丙基苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点173-175℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.25(1H)，8.58(1H)，8.22(1H)，7.92(1H)，7.75(2H)，7.56(1H)，7.34(2H)，2.89(1H)，1.15(6H).MS(ES+)：m/e 309(40)，308(100)。MS(ES-)：m/e 307(20)，306(100)。
化合物17
3-[1-(2-氟苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点239-241℃。1HNMR(300MHz5DMSOd6)：δ9.12(1H，s)，8.66(1H，s)，8.31(1H，d，J＝7.4Hz)，8.03(1H，d，J＝7.1Hz)，7.91(1H，t，J＝7.5Hz)，7.64(1H，t，J＝7.7Hz)，7.60-7.50(2H，m)，7.43(1H，br)。MS(ES+)：m/e 285(20)，284(100)。MS(ES-)：m/e 283(20)，282(100)。
化合物18
3-[1-(4-三氟甲基苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点141-143℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.55(1H，s)，8.67(1H，s)，8.32(1H，d，J＝7.7Hz)，8.19(2H，d，J＝8.5Hz)，8.02(1H5d，J＝7.7Hz)，7.95(2H5d，J＝8.5Hz)，7.65(1H，t，J＝7.7Hz).MS(ES+)：m/e 335(20)，334(100)。MS(ES-)：m/e 333(20)，332(100)。
化合物19
3-[1-(4-三氟甲氧基苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点219-221℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.43(1H，s)，8.66(1H5s)，8.28(1H，d，J＝7.4Hz)，8.13-8.00(3H，m)，7.67-7.58(3H，m).MS(ES+)：m/e 351(15)，350(100)。MS(ES-)：m/e 349(15)，348(100)。
化合物20
3-[1-(3，5-双三氟甲基苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点271-273℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.68(1H，s)，8.65(1H，s)，8.62(2H，s)，8.34(1H，d，J＝7.7Hz)，8.16(1H，s)，8.02(1H，d，J＝7.7Hz)，7.63(1H，t，J＝7.7Hz).MS(ES+)：m/e 403(25)，402(100)。
化合物21
3-[1-(2-乙基苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点176-178℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.96(1H，s)，8.64(1H，s)，8.28(1H，dd，J＝7.7，1.1Hz)，8.01(1H，dd，J＝7.7，1.1Hz)，7.63(1H，t，J＝7.7Hz)，7.52-7.40(4H，m)，2.55(2H，q，J＝7.7Hz)，1.06(3H，t，J＝7.7Hz).MS(ES+)：m/e 295(30)，294(100)。
化合物22
3-[1-(4-溴苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸：熔点＞310℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.39(1H，s)，8.65(1H，s)，8.03-7.93(4H，m)，7.76(2H，d，J＝8.2Hz)，7.40(1H，t，J＝7.3Hz).MS(ES+)：m/e 347(15)，346(100)，345(15)，344(100)。
化合物23
3-[1-(4-硝基苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点284-286℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.41(1H，s)，8.65(1H，s)，8.31(1H，d，J＝7.7Hz)，8.30-8.25(1H，m)，8.05-7.95(2H，m)，7.70-7.60(3H，m).MS(ES+)：m/e 312(20)，311(100)。
化合物25
3-[1-(3-氯-4-氟苯基)-1H-[1，2，4][1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点270-272℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.42(1H，s)，8.65(1H，s)，8.31(1H，dd，J-7.7，1.1Hz)，8.25-8.22(1H，m)，8.04-7.95(2H5m)，7.68-7.61(2H，m).MS(ES+)：m/e 320(35)，318(100)。
化合物29
3-[1-(3-氟苯基)-1H-[1，2，4][1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸：熔点266-268℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.45(1H，s)，8.66(1H，s)，8.31(1H，d，J＝7.8Hz)，8.02(1H，d，J＝7.6Hz)，7.89-7.80(2H，m)，7.66-7.58(2H，m)，7.28(1H，t，J＝8.3Hz).MS(ES+)：m/e 285(20)，284(100)。
化合物30
3-[1-(2-溴苯基)-1H-[1，2，4][1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸：熔点245-247℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.04(1H，s)，8.62(1H，d，J-1.2Hz)，8.27(1H，dd，J＝7.8，1.2Hz)，8.00(1H，dd，J-7.8，1.3Hz)，7.90(1H，dt，J＝8.0，2.2Hz)，7.74-7.49(4H，m).MS(ES+)：m/e 2＞A1(20)，346(100)，345(20)，344(100)。
化合物31
4-[3-(3-羧基苯基)-[1，2，4]三唑-1-基]苯甲酸：熔点＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.53(1H，s)，8.67(1H，s)，8.32(1H，d，J＝7.6Hz)，8.10(4H，s)，8.02(1H5d，J＝7.6Hz)，7.65(1H，t，J＝7.6Hz).MS(ES+)：m/e 311(20)，310(100)。
化合物35
3-[1-(3-溴苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸：熔点253-255℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.48(1H，s)，8.67(1H，s)，8.33(1H，d，J＝7.8Hz)，8.22(1H，s)，8.05-7.97(2H，m)，7.68-7.62(2H，m)，7.54(1H，t，J＝7.8Hz).MS(ES+)：m/e 347(20)，346(100)，345(20)，344(100)。MS(ES-)：m/e 345(15)，344(95)，343(15)，342(100)。
化合物36
3-(1-吡啶-2-基-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸：熔点241-244℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.47(1H，s)，8.68(1H，s)，8.56(1H，br)，8.34(1H，d，J＝7.3Hz)，8.10-7.98(3H，m)，7.66(1H，t5J＝7.3Hz)，7.50(1H，br)。MS(ES+)：m/e 268(25)，267(100)。MS(ES-)：m/e 266(20)，265(100)。
化合物37
3-(1-苯基-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸：熔点257-259℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.41(1H，s)，8.68(1H，s)，8.33(1H，d，J＝7.6Hz)，8.03(1H，d，J＝7.6Hz)，8.01-7.93(2H，m)，7.68-7.55(3H，m)，7.44(1H，t，J＝7.1Hz).MS(ES+)：m/e 267(25)，266(100)。MS(ES-)：m/e 265(20)，264(100)。
化合物38
3-[1-(3-氯-4-甲基-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点269-272℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.43(1H，s)，8.66(1H，s)，8.32(1H5d，J＝6.8Hz)，8.06(1H，s)，8.02(1H，d，J＝7.5Hz)，7.85(1H，t，J＝7.6Hz)，7.65(1H，t，J＝7.5Hz)，7.57(1H，d，J＝8.5Hz)，2.39(3H，s).MS(ES+)：m/e314(100)。MS(ES-)：m/e 312(100)。
化合物39
3-(1-m-甲苯基-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸：熔点223-225℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.37(1H，s)，8.66(1H，s)，8.31(1H，d，J＝7.5Hz)，8.01(1H，d，J＝7.5Hz)，7.78(1H，s)，7.73(1H，d，J＝8.3Hz)，7.64(1H，t，J＝7.5Hz)，7.45(1H，t，J＝7.8Hz)，7.24(1H，d，J＝7.5Hz)，2.41(3H，s).MS(ES+)：m/e 281(30)，280(100)。MS(ES-)：m/e 279(20)，278(100)。
化合物40
3-(1-o-甲苯基-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸：熔点209-211℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.98(1H，s)，8.64(1H，s)，8.29(1H，d，J-7.3Hz)，8.01(1H，d，J＝7.3Hz)，7.63(1H，t，J＝7.3Hz)，7.53-7.41(4H，m)，2.27(3H，s).MS(ES+)：m/e 280(100)。
化合物45
4-[1-(3-甲氧基苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点203-205℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.43(1H，s)，8.21(2H，d，J＝8Hz)，8.06，2H，d，J＝8Hz)，7.51-7.47(3H，m)，7.02-6.99(1H，m)，3.85(3H，s).MS(ES+)：m/e 297(20)，296(100)。MS(ES-)：m/e 295(20)，294(100)。
3-(1-联苯-4-基-lH-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸(化合物24)的制备
在带有搅拌棒的10mL玻璃试管中加入3-[1-(4-溴-苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸甲酯(265mg，0.74mmol)、苯硼酸(90.2mg，0.74mmol)、碳酸钠(235mg)、四丁基碘化铵(273mg)，palladium acetate(0.8mg)和6mL水。容器密封并放到微波反应器的反应腔中。在150℃下用60W的功率反应，用LC/MS监控。确定反应完成后，混合物通过塞里塑料过滤，并使用1N HCl酸化，直至介质pH小于7。通过过滤收集得到的固体，用THF-己烷重结晶纯化，得到为白色粉末的标题产物(200mg，79％)，熔点263-265℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.47(1H，s)，8.69(1H，s)，8.34(1H，d，J＝7.5Hz)，8.05-7.39(HH，m).MS(ES+)：m/e 343(30)，342(100)。
使用上述过程制备以下实施例，如果需要可以稍微改动。
化合物26
3-[1-(4-苯并呋喃-2-基-苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点293-295℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.50(1H，s)，8.69(1H，s)，8.34(1H，d，J＝7.8Hz)，8.14-7.99(4H，m)，7.66(2H，t，J＝7.8Hz)，7.56(1H，s)，7.36-7.24(4H，m).MS(ES+)：m/e 383(25)，382(100)。
化合物27
3-[1-(4-甲氧基联苯-4-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点243-246℃。1U NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.44(1H，s)，8.68(1H，s)，8.29(1H，d，J＝7.5Hz)，8.01(1H，d，J＝7.7Hz)，7.99(2H，d，J＝8.8Hz)，7.82(2H，d，J＝8.8Hz)，7.68(2H，d，J＝8.8Hz)，7.61(1H，t，J＝7.7Hz)，7.04(2H，d，J＝8.8Hz)，3.80(3H，s).MS(ES+)：m/e 373(30)，372(100)。
化合物28
3-[1-(4-异丙基联苯-4-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点225-228℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.44(1H，s)，8.69(1H，s)，8.26(1H，d，J＝7.3Hz)，8.01(2H，d，J＝8.0Hz)，8.00(1H，obscurred)，7.84(2H，d，J＝8.5Hz)，7.64(2H，d，J＝8.1Hz)，7.62(1H，t，J＝7.7Hz)，7.34(2H，d，J＝7.8Hz)，2.95(1H，heptet，J＝6.6Hz)，1.22(6H，d，J＝6.6Hz).MS(ES+)：m/e 385(25)，384(100)。
化合物32
3-[1-(4-氟联苯-4-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点272-275℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.46(1H，s)，8.68(1H，s)，8.33(1H，d，J＝7.8Hz)，8.05-7.60(9H，m)，7.31(1H，t，J＝8.7Hz).MS(ES+)：m/e 361(25)，360(100)。MS(ES-)：m/e 359(25)，358(100)。
3-[1-(3-氟苯基)-5-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸(化合物34)的制备
3-[亚氨基-2-(3-氟苯基肼基)甲基]苯甲酸甲酯(0.43g，1.50mmol)和原乙酸三乙酯(6.07g，37.4mmol)在乙醇(8mL)中的溶液加热回流过夜。冷却后，将溶液倒入水中，通过过滤收集得到的固体。然后对该酯化合物(230mg，0.73mmol)进行水解(3mL 1N氢氧化钠水溶液在3mL THF中，回流3小时)。将反应混合物蒸发、酸化后，通过过滤收集得到的残余物，真空干燥，得到固体产物(153mg，70％)，熔点236-238℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.61(1H，s)，8.24(1H，d，J＝7.6Hz)，7.99(1H，d，J＝7.6Hz)，7.68-7.53(4H，m)，7.39(1H，t，J-7.6Hz)，2.57(3H，s).
下列化合物可以通过该方法制备。
化合物33
3-[1-(4-溴苯基)-5-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点295-298℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.60(1H，s)，8.24(1H，d，J＝7Hz)，7.98(1H，d，J＝7Hz)，7.78(2H，d，J＝8Hz)，7.66(2H，d，J＝8Hz)，7.64(1H，t，J＝7Hz)，2.55(3H，s).MS(ES+)：m/e 361(15)，360(100)，359(15)，358(100)。MS(ES-)：m/e 359(15)，358(100)，357(15)，356(95).
3-(5-氧-1-o-甲苯基-4，5-二氢-1H-[1，2，4]三唑-3-基)-苯甲酸(化合物41)的制备
A部分.3-[亚氨基-2-(2-甲基苯基肼基)甲基]苯甲酸甲酯(1.13g，36.4mmol)在甲苯(8mL)中溶液用N，N′-羰基二咪唑(0.61g，37.6mmol)。在搅拌和用TLC监控的条件下，溶液加热回流14小时。冷却后，反应混合物倒入水中(50mL)，用乙酸乙酯(2×50mL)提取。提取物合并，用硫酸镁干燥，过滤，蒸发。残留的固体悬浮在二乙醚中，通过过滤收集，真空干燥，得到白色粉末3-(5-氧-1-o-甲苯基-4，5-二氢-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸甲酯(92.0mg)。
B部分.3-(5-氧-1-o-甲苯基-4，5-二氢-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸甲酯(92mg，0.30mmol)和碘化锂(478mg，3.57mmol)在吡啶(3mL)中的溶液加热回流12小时。冷却的反应混合物倒入水中，并通过添加1N HCl进行酸化。通过过滤收集得到的固体，用水和醚洗涤，真空干燥，得到为白色粉末的标题产物(72.8mg，83％)，熔点＞310℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.80(1H，br)，8.44(1H，s)，8.29(1H，t，J＝7.7Hz)，8.15-8.05(2H，m)，7.85-7.75(1H，m)，7.64(1H，t，J＝7.8Hz)，7.42-7.30(3H，m)，2.25(3H，s).MS(ES+)：m/e 297(20)，296(100)。MS(ES-)：m/e 295(29)，294(100)。
上述方法可以用于制备下列化合物。
化合物42
3-[1-(3-氟苯基)-5-氧-4，5-二氢-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸：熔点＞310℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ8.68(1H，s)，8.03(2H，d，J＝7.5Hz)，7.86(2H，d，J＝7.3Hz)，7.56-7.46(2H，m)，7.04(1H，t，J＝8.0Hz).MS(ES+)：m/e 301(15)，300(100)。MS(ES-)：m/e 299(15)，298(100)。
3-{l-[4-(2-氧吡啶-1-基)-苯基]-1H-[1，2，4]三唑-3-基}-苯甲酸(化合物43)的制备
A部分.含有3-[1-(4-溴苯-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸甲酯(407mg，1.14mmol)、铜(I)碘化物(10.8mg，0.057mmol)、吡啶-2-酮(121mg，1.42mmol)和碳酸钾(138mg，2.28mmol)的50毫升培养试管抽真空，然后充入氮气。加入N-N′-二甲基乙二胺(10mg，0.12mmol)和甲苯(5mL)，试管用PTFE盖密封，反应混合物在110℃下加热搅拌12小时。冷却的反应混合物分割在水和乙酸乙酯之间，有机提取物用水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，蒸发。残留物质用柱色谱法(硅凝胶，1∶20甲醇-二氯甲烷)分离，得到棕褐色固体3-{1-[4-(2-氧吡啶-1-基)-苯基]-1H-[1，2，4]三唑-3-基}-苯甲酸甲酯(380mg，92％)。
B部分.3-{1-[4-(2-氧吡啶-1-基)-苯基]-1H-[1，2，4]三唑-3-基}-苯甲酸甲酯(101.6mg，0.28mmol)和碘化锂(451mg，3.37mmol)在吡啶(3mL)中的溶液在干燥的氮气气氛下加热回流6小时，然后冷却并倒入1N HCl水溶液中。通过过滤收集得到的固体，用水和醚洗涤，真空干燥，得到为棕褐色固体的标题产物(75.3mg，77％)，熔点270-273℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.36(1H，s)，8.66(1H，s)，8.31(1H，d，J＝7.6Hz)，8.02(1H，d，J＝7.1Hz)，7.93(2H，d，J＝8.5Hz)，7.86(2H，d，J＝8.5Hz)，7.64(1H，t，J-7.8Hz)，3.88(2H，m)，2.53(2H，m)，2.08(2H，m).MS(ES+)：m/e350(30)，349(100)。MS(ES-)：m/e 348(25)，347(100)。
下列化合物可以使用上述过程的微小改动而制备。
化合物44
3-{1-[4-(2-氧-吖啶-1-基)-苯基]-1H-[1，2，4]三唑-3-基}苯甲酸：熔点295-297℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.33(1H，s)，8.65(1H，s)，8.31(1H，d，J＝7.8Hz)，8.01(1H，d，J＝6.8Hz)，7.93(2H，d，J＝8.0Hz)，7.64(1H，t，J＝7.3Hz)，7.51(2H，d，J＝8.0Hz)，3.68(2H，br)，3.11(2H，br)。MS(ES+)：m/e 336(30)，335(100)。MS(ES-)：m/e 334(20)，333(100)。
3-[1-(4-吡啶-l-基苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸(化合物45)的制备
A部分.3-{1-[4-(2-氧吡啶-1-基)-苯基]-1H-[1，2，4]三唑-3-基}-苯甲酸甲酯(278mg，0.77mmol)在THF(5mL)中的溶液用硼烷-四氢呋喃络合物(3.85mmol)在室温下处理。得到的溶液搅拌16小时，通过添加6N HCl水溶液淬灭。搅拌30分钟后，通过添加1N氢氧化钠水溶液将混合物变为碱性。混合物部分蒸发，直到形成沉淀，通过过滤收集沉淀，用水洗涤，真空干燥，得到226mg(84％)3-[1-(4-吡啶-1-基-苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸甲酯。
B部分.使用上述的碘化锂-吡啶酯裂解法，将3-[1-(4-吡啶-1-基-苯基)-1H-[1，2，4]三唑-3-基]苯甲酸甲酯转化成标题化合物，熔点263-265℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)：δ9.14(1H，s)，8.64(1H，s)，8.28(1H，d，J＝7.3Hz)，7.98(1H，d，J＝6.9Hz)，7.68-7.59(3H，m)，6.64(2H，d，J＝8.5Hz)，3.26(4H，s)，1.96(4H，s).MS(ES+)：m/e 336(40)，335(100)。MS(ES-)：m/e 334(30)，333(100)。
3-(5H-4-氧-13，9b-三氮-环戊[a]萘-2-基)苯甲酸(化合物46)的制备
A部分.将3-(5-氧-1-o-甲苯基-4，5-二氢-1H-[1，2，4]三唑-3-基)苯甲酸甲酯(0.58g，1.88mmol)、N-溴琥珀酰亚胺(368mg，2.07mmol)和氮杂异丁腈(5mg)在2∶1 CCl4/CHCl3(23mL)中的悬浮体加热回流3天。冷却后，溶液分割在水和乙酸乙酯之间，有机提取物用水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，蒸发。残余物质(0.62g)放在四氢呋喃(6mL)中，用氢化钠处理(7mg 60％重量/重量的矿物油悬浮体，0.29mmol)。得到的混合物加热回流6小时，冷却，蒸发。残余物质用柱色谱法(5∶95乙酸乙酯-己烷)分离，得到环化的化合物(66mg)。
B部分.将上述A部分的酯化合物(66mg)在1∶1四氢呋喃水溶液(6mL)中的溶液用氢氧化锂(7.7mg)处理，得到的混合物加热回流1小时。溶液冷却并倒入1N HCI中。得到的固体通过过滤来收集并用柱色谱法分离，得到标题产物(2.2mg)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.50(1H，s)，8.00(1H，d，J＝7.8Hz)，7.80(1H，d，J＝7.5Hz)，7.43(1H，d，J＝7.8Hz)，7.28-7.21(2H，m)，7.03-6.99(2H，m)，5.31(2H，s).MS(ES+)：m/e 295(30)，294(100)。MS(ES-)：m/e 293(20)，292(100)。
H.1，2，3-三唑
本发明的三唑如下制备。
4-[4-(3-甲氧基苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸(化合物204)的制备
向1-乙炔基-3-甲氧基苯(396mg，3.00mmol，Aldrich)在50％叔丁醇/水(4.0mL)中的溶液中，加入300μL(0.30mmol)抗坏血酸钠水溶液(594mg在3mL水中)、100μL(0.030mmol)CuSO4.5H2O水溶液(75mg在1mL水中)，接着加入4-叠氮苯甲酸(489mg，3mmol)。得到的混合物搅拌7天，得到的悬浮体过滤，用水(3×30mL)、乙醚(2×15mL)和己烷(3×30mL)洗涤。固体真空干燥(70℃，10torr)，得到880mg(99％)为浅黄色粉末的4-[4-(3-甲氧基-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点276-277℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.44(s，1H)，8.16(d，J＝8.5Hz，2H)，8.08(d，J＝8.3Hz，2H)，7.52(m，2H)，7.40(t，J＝7.8Hz，1H)，6.95(ddd，J＝8.3，2.5，0.8Hz，1H)，3.82(s，3H).MS m/z 296.29，计算C16Hj3N3O3(M+H+)296.
该方法可以用于合成下列化合物。
化合物201
4-(4-p-甲苯基-[1，2，3]三唑-1-基)苯甲酸：熔点302-303℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)δ9.40(s，1H)，8.15(d，J＝8.5Hz，2H)，8.08(d，J＝8.5Hz，2H)，7.82(d，J＝8.0Hz，2H)，7.30(d，J＝8.0Hz，2H)，2.33(s，3H).MS(ES+)：m/e 280.36(100)。
化合物202
4-[4-(4-三氟甲基-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点305-306℃。1H NMR(300MHz，DMSOd6)δ9.60(s，1H)，8.14(m，6H)，7.87(m，2H).MS(ES+)：m/e 334.30(100)。
化合物203
4-[4-(4-甲氧基-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点294-295℃。1HNMR(300MHz，DMSOd6)δ9.30(s，1H)，8.11(m，4H)，7.86(d，J＝8.5Hz，2H)，7.05(d，J＝8.3Hz，2H)，3.79(s，3H).MS(ES+)：m/e 296.35(100)。
化合物264
4-[4-(2-氟-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点292-294℃。1H NMR(DMSOd6)：δ9.17(1H，s)，8.15(5H，m)，7.90(3H，m).MS(ES+)m/e284.20(100)。
化合物265
4-[4-(3-氟-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点327-328℃。1H NMR(DMSOd6)：δ9.49(1H，s)，8.16(2H，d，J＝8.5Hz)，8.07(2H，d，J＝8.5Hz)，7.76(2H，m)，7.54(1H，m)，7.22(1H，tm，J＝7.6Hz).MS(ES+)m/e 284.22(100)。
化合物266
4-[4-(4-氟-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点321-323℃。1H NMR(DMSO-de)：δ9.41(1H，s)，8.16(2H，d，J＝8.5Hz)，8.07(2H，d，J＝8.5Hz)，7.97(2H，m)，7.34(2H，t，J＝8.8Hz).MS(ES+)m/e 284.26(100)。
化合物267
4-[4-(4-溴-2-氟-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点327-328℃。1HNMR(DMSO-d6)：δ9.21(1H，s)，8.14(5H，m)，7.76(1H，dm，J＝9.9Hz)，7.57(1H，dm，J＝7.4Hz).MS(ES+)m/e 366(100)，364.15(100)。
化合物268
4-[4-(2，4-二氟-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点312-313℃。1HNMR(DMSOd6)：δ9.17(1H，s)，8.14(5H，m)，7.97(2H，tm，J＝9.5Hz)，7.25(1H，m).MS(ES+)m/e 302.19(100)。
化合物269
4-[4-(4-氯-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点313-314℃。1H NMR(DMSOd6)：δ9.46(1H，s)，8.16(2H，d，J＝8.4Hz)，8.07(2H，d，J-8.4Hz)，7.95(2H，d，J＝8.4Hz)，7.56(2H，d，J＝8.4Hz).MS(ES+)m/e 300.29(100)。
化合物270
4-[4-(2-溴-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点261-262℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.32(1H，s)，8.14(4H，m)，7.90(1H，d，J＝6.6Hz)，7.78(1H，d，J＝7.7Hz)，7.52(1H，t，J＝7.5Hz)，7.37(1H，t，J＝7.7Hz).MS(ES+)m/e 346.11(100)，348(100)。
化合物271
4-(4-萘-1-基-[1，2，3]三唑-1-基)苯甲酸：熔点265-266℃。1H NMR(DMSOd6)：δ9.38(1H，s)，8.53(1H，m)，8.18(4H，m)，8.00(2H，m)，7.86(1H，m)，7.59(3H，m).MS(ES+)m/e 316.23(100)。
化合物272
4-[4-(3，4-二甲氧基-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点253-254℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.33(1H，s)，8.15(1H，d，J＝8.0Hz)，8.07(1H5d，J＝8.0Hz)，7.48(2H，m)，7.06(1H，d，J＝8.3Hz)，3.83(3H5s)，3.78(3H，s).MS(ES+)m/e 326.23(100)。
化合物273
4-[4-(4-乙氧基-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点310-311℃。MS(ES+)m/e 310(100)。
化合物274
4-[4-(4-甲氧基-2-甲基-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]苯甲酸：熔点244-245℃。1H NMR(DMSOd6)：δ9.04(1H5s)，8.16(4H5m)，7.71(2H5d，J＝8.0Hz)56.89(2H5m)，3.77(3H，s)，2.48(3H，s).MS(ES+)m/e 310.26(100)。
化合物275
4-[4-(4-异丙基-苯基)-[1，2，3]三唑-1-基]-苯甲酸：熔点311-312℃。1HNMR(DMSO-d6)：δ9.36(1H，s)，8.15(2H，d，J＝8.5Hz)，8.09(2H，d，J＝8.5Hz)，7.85(2H，d，J＝8.0Hz)，7.36(2H，d，J＝8.2Hz)，2.91(1H，heptet，J＝6.9Hz)，1.21(6H，d，J＝6.9Hz).MS(ES+)m/e 308.26(100)。
I.噁二唑酮(Oxadiazolone)的制备
本发明的噁二唑酮可以如下制备。
4-[5-(3-氰基苯基)-2-氧-1，3，4-噁二唑-3(2H)-基]苯甲酸(化合物280)的制备
A部分.在0℃，往3-氰基苯甲酸(0.62g，4.2mmol)在二氯甲烷(15mL)中的悬浮体中逐滴加入THF，直到体系变得均一，然后加入1-羟基苯并三唑(0.57g，4.2mmol)和二环己基碳二亚胺(0.87g，4.2mmol)。混合物缓慢升至室温并搅拌半小时。往混合物中添加4-肼基苯甲酸甲酯(0.63g，3.8mmol)，将混合物搅拌2小时。通过过滤移去沉淀并用二氯甲烷洗涤。滤出液用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，之后弃去硫酸钠。除去溶剂而得到的粗制产物用柱色谱法(硅凝胶，1∶19乙酸乙酯-二氯甲烷)分离，得到中间体4-[2-(3-氰基苯甲酰)肼基]苯甲酸甲酯(0.68g，61％)。MS(ES+)m/z：296.
B部分.4-[2-(3-氰基苯甲酰)肼基]苯甲酸甲酯(0.59g，2.0mmol)和羰基二咪唑(0.49g，3.0mmol)在80℃下在二氯甲烷(20mL)中搅拌过夜，然后直接对混合物进行色谱处理(硅凝胶，1∶9乙酸乙酯-二氯甲烷)，得到4-[5-(3-氰基苯基)-2-氧-1，3，4-噁二唑-3(2H)-基]苯甲酸甲酯(0.63g，98％)。MS(ES+)m/z：322.
C部分.4-[5-(3-氰基苯基)-2-氧-1，3，4-噁二唑-3(2H)-基]苯甲酸甲酯(0.60g，1.87mmol)然后用三溴化硼(1M在二氯甲烷中，5.6mL，5.6mmol)在二氯甲烷中(20mL)在室温下处理过夜。真空除去挥发性成分，残留物用水处理。粗制产物用柱色谱法(硅凝胶，1∶9甲醇-二氯甲烷)，以得到想要的产物4-[5-(3-氰基苯基)-2-氧-1，3，4-噁二唑-3(2H)-基]苯甲酸(0.46g，81％)。熔点294-295℃(decomp.).1H NMR(CDCl3，300MHz)δ(ppm)7.47(t，1H)，7.77(d，2H)，7.88-8.00(m，4H).(ES+)m/z：307.
下列化合物可以用与上述类似的方式制备。对于硫代-1，3，4-oxadizolone类似物，可以使用硫代羰基二咪唑代替羰基二咪唑。化合物276还可以用4-甲氧基羰基苯甲酸和4-异丙基苯基肼作为原料类似地制得。
化合物276
4-[4-(4-异丙基-苯基)-5-氧-4，5-二氢-[1，3，4]噁二唑-2-基]苯甲酸：熔点263-267℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.15(d，2H)，2.80-2.88(m，1H)，7.20(d，2H)，7.69(d，2H)，7.87(d，2H)，8.05(d，2H).MS(ES-)：m/e323.
化合物277
4-[5-(4-异丙基-苯基)-2-氧-[1，3，4]噁二唑-3-基]苯甲酸：熔点252-254℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.19(d，2H)，2.82-2.96(m，1H)，7.25(d，2H)，7.76(d，2H)，7.93(d，2H)，8.04(d，2H).MS(ES-)：m/e 323.
化合物279
3-[5-(4-异丙基-苯基)-2-氧-[1，3，4]噁二唑-3-基]苯甲酸：熔点218-220℃(分解).1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.31(d，2H)，2.93-3.08(m，1H)，7.37(d，2H)，7.60(t，1H)，7.89(d，2H)，8.00-8.05(m，1H)，8.27-8.31(m，1H)，8.66(t，1H).MS(ES-)：m/e 323.
化合物283
3-[5-(4-异丙基-苯基)-2-硫代氧-[1，3，4]噁二唑-3-基]苯甲酸：熔点215-217℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.31(d，2H)，2.95-3.05(m，1H)，7.40(d，2H)，7.66(t，1H)，7.97(d，2H)，8.14-8.19(m，1H)，8.55-8.60(m，1H)，8.90(t，1H).MS(ES-)：m/e 339.
化合物285
4-[5-(4-异丙基-苯基)-2-硫代氧-[1，3，4]噁二唑-3-基]苯甲酸：熔点239-240℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.30(d，2H)，2.96-3.05(m，1H)，7.41(d，2H)，7.96(d，2H)，8.28(d，2H)，8.46(d，2H).MS(ES-)：m/e 339.
4-[5-(4-异丙基苯基)-2-氧-1，3，4-噻重氮-3(2H)-基]苯甲酸(化合物281)的制备
A部分.往4-[2-(4-异丙基苯基)肼基]苯甲酸甲酯(0.94g，3.0mmol)的甲苯(25mL)溶液中加入劳氏试剂(1.82g，4.5mmol)，其中4-[2-(4-异丙基苯基)肼基]苯甲酸甲酯是使用上述的交叉耦合技术由4-甲氧基羰基苯基肼和4-苯甲酸异丙酯制得。混合物在120℃下搅拌10小时，冷却至室温。除去沉淀，将滤出液浓缩，色谱处理(硅凝胶，1∶9乙酸乙酯-己烷)，得到中间体化合物，MS(ES+)：m/e 496.该中间体然后用NaOH(1.25N，2.63mL，3.3mmol)在THF(20mL)中在65℃下处理1小时。然后溶剂替换为醚(50mL)，混合物用水洗涤，干燥，色谱处理，得到硫代酰肼，4-{2-[(4-异丙基苯基)碳硫基]肼基}苯甲酸甲酯(0.82g，81％).MS(ES+)：m/e 329.
B部分.4-{2-[(4-异丙基苯基)碳硫基]肼基}苯甲酸甲酯(0.26g，0.8mmol)和羰基二咪唑(0.19g，1.2mmol)在80℃下在二氯乙烷(20mL)中搅拌过夜，直接对混合物进行色谱处理(硅凝胶，4∶1乙酸乙酯-己烷)，得到4-[5-(4-异丙基苯基)-2-氧-1，3，4-噻重氮-3(2H)-基]苯甲酸甲酯(0.21g，75％)。MS(ES+)：m/e 355.
C部分.4-[5-(4-异丙基苯基)-2-氧-1，3，4-噻重氮-3(2H)-基]苯甲酸甲酯(0.20g，0.56mmol)然后在二氯甲烷(10mL)中在室温下用三溴化硼(1M在二氯甲烷中，1.7mL，1.7mmol)处理过夜。真空除去挥发性成分，残留物用水处理。收集沉淀并用水彻底洗涤，得到想要的产物，4-[5-(4-异丙基苯基)-2-氧-1，3，4-噻重氮-3(2H)-基]苯甲酸(0.19g，100％)，熔点205-208℃。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ(ppm)1.30(d，6H)2.92-3.06(m，1H)，7.35(d，2H)，7.70(d，2H)，8.11-8.23(m，4H).(ES+)m/z：341.
下列化合物可以用与上述类似的方式制备。对于硫-1，3，4-噻二唑酮(thiadiazolone)类似物，可以使用硫代羰基二咪唑代替羰基二咪唑。
化合物282
4-[5-(4-异丙基-苯基-2-硫代氧-[1，3，4]噻二唑-3-基]苯甲酸：熔点176-179℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.19(d，2H)，2.83-2.92(m，1H)，7.24(d，2H)，7.55(d，2H)，7.87(d，2H)，8.01(d，2H)，12.35(s，1H).MS(ES-)：m/e 355.
化合物284
3-[5-(4-异丙基-苯基)-2-氧-[1，3，4]噻二唑-3-基]苯甲酸：熔点220-221℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.29(d，2H)，2.93-3.03(m，1H)，7.34(d，2H)，7.59(t，1H)，7.71(d，2H)，8.05-8.08(m，1H)，8.21-8.25(m，1H)，8.63(t，1H).MS(ES-)：m/e 339
4-{[5-(4-异丙基苯基)-2-氧-1，3，4-噁二唑-3(2H)-基]甲基}苯甲酸(化合物278)的制备
A部分.在0℃，往4-异丙基苯甲酸(3.28g，20.0mmol)、三乙胺(2.12g，2.93niL，21.0mmol)在二氯甲烷/THF(15mL/5mL)中的溶液中加入氯甲酸异丁酯(2.87g，2.72mL，21.0mmol)。混合物在0℃下搅拌20分钟，在2小时内升至室温，然后用肼基乙酸乙酯(2.18g，21.0mmol)处理，并搅拌过夜。然后混合物用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥。去除溶剂后得到的粗制产物进行色谱处理(硅凝胶，5∶1二氯甲烷-乙酸乙酯)，得到[2-(4-异丙基苯甲酰)肼基]乙酸乙酯(4.85g，97％).MS(ES+)：m/e 251.
B部分.[2-(4-异丙基苯甲酰)肼基]乙酸乙酯(4.85g，19.4mmol)用氯氧化磷(50mL)处理，加热回流3小时，然后倒在冰上。收集沉淀，用水彻底洗涤，在空气中干燥得到5-(4-异丙基苯基)-1，3，4-噁二唑-2(3H)-酮(2.30g，58％)MS(ES+)：m/e 205.
C部分.5-(4-异丙基苯基)-1，3，4-噁二唑-2(3H)-酮(0.41g，2.0mmol)溶入二氯甲烷中(5mL)，用4-溴甲基苯甲酸甲酯(0.50g，2.2mmol)在氢氧化钠(1.25N，1.76mL，2.2mmol)和四正丁基溴化铵(0.07g，0.022mmol)在室温下剧烈搅拌过夜。真空除去溶剂，残余物用水洗涤。通过过滤收集沉淀，用己烷彻底洗涤，在空气中干燥，得到4-{[5-(4-异丙基苯基)-2-氧-1，3，4-噁二唑-3(2H)-基]甲基}苯甲酸甲酯(0.65g，93％)。(ES+)：m/e 353.
D部分.4-{[5-(4-异丙基苯基)-2-氧-1，3，4-噁二唑-3(2H)-基]甲基}苯甲酸甲酯(50mg，0.14mmol)用碘化锂(0.19g，1.4mmol)在吡啶中(5mL)回流48小时，冷却至室温后用水(30mL)稀释混合物。通过过滤收集沉淀，用二氯甲烷彻底洗涤，在空气中干燥，得到想要的产物4-{[5-(4-异丙基苯基)-[2-氧-1，3，4-噁二唑-3(2H)-基]甲基}苯甲酸(31mg，66％)，熔点217-219℃。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ(ppm)1.13(d，6H)2.70-2.90(m，1H)，4.86(s，2H)，7.17(d，2H)，7.30(d，2H)，7.59(d，2H)，7.89(d，2H).MS(ES+)：m/e 339.
3-[4-(2，4-二氟-苯基)-5-氧-4，5-二氢-[1，3，4]噁二唑-2-基]苯甲酸(化合物286)的制备
A部分.异酞酸单苄酯(根据J.Med.Chem.2001，44，1491-1508公开的方法制得)(1.72g，6.71mmol在二乙醚(30mL)中的悬浮体用吡啶(550μL，6.80mmol)处理，然后氰尿酰氟(1当量)在乙醚(10mL)中的溶液通过套管在15分钟内逐滴加入。形成粘性沉淀，通过蒸发掉部分醚并添加二氯甲烷(50毫升)而使得到的混合物均一。3小时后，溶液用二氯甲烷稀释并倒在冰上。有机层用盐水洗涤。水层用二氯甲烷提取，有机提取物合并，用硫酸镁干燥，过滤，蒸发，得到苄基间苯二甲酰氟(1.68g，97％)，直接用于下个步骤。
B部分.含有2，4-二氟苯基肼(41.5mg，0.29mmol)、聚苯乙烯-NMM树脂(0.303g，2当量)和无水二甲基甲酰胺(5mL)的16×100mm螺旋盖试管用苄基间苯二甲酰氟(0.289mmol)在二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液处理。将试管密封，在室温下混合5.5天。试管的内容物过滤到另一试管中，树脂用额外的二甲基甲酰胺洗涤。溶液加热至80℃用部分羰基二咪唑(各100mg)处理，直到LC/MS分析表明原料完全消耗掉。试管冷却并蒸发掉溶剂。残余物质通过硅凝胶短柱用梯度10∶90至40∶60乙酸乙酯-氯仿洗脱，收集含有产物的部分并蒸发，3-[4-(2，4-二氟-苯基)-5-氧-4，5-二氢-[1，3，4]噁二唑-2-基]苯甲酸苯甲酯。
C部分.B部分的3-[4-(2，4-二氟-苯基)-5-氧-4，5-二氢-[1，3，4]噁二唑-2-基]苯甲酸苯甲酯用45％溴化氢溶液处理。1小时后，加入醚(5mL)，得到的溶液再搅拌1小时。蒸发掉溶剂，残余物质的LC/MS分析表明存在未转化的原料。残余物放在氯仿中(10mL)，冷却至0℃，用三溴化硼溶液(1mL，1.0M)处理。搅拌17小时后，溶液蒸发，残余物悬浮在10mL冷水中。混合物进行声波处理，得到均一的悬浮体，过滤。得到的溶液用HPLC分离，得到纯的标题产物。MS(ES+)：m/e 320(20)，319.13(100)。
总之，本发明的特定优选化合物可以按照与上述类似的方式制得。
表1
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 1 | 279-282 | 322 |
| 2 | 248-250 | 307 |
| 3 | 225-226 | 307 |
| 4 | 307 | |
| 5 | 215-216 | 307 |
| 6 | 210-215 | 306 |
| 8 | 268-271 | 266 |
| 9 | 307-311 | 282 |
| 10 | 259-261 | 372 |
| 11 | 268-270 | 296 |
| 12 | 230-232 | 296 |
| 13 | ＞310 | 284 |
| 14 | 263-265 | 280 |
| 15 | 173-175 | 308 |
| 16 | 290-291 | 302 |
| 17 | 239-241 | 284 |
| 18 | 141-143 | 334 |
| 19 | 219-221 | 350 |
| 20 | 271-273 | 402 |
| 21 | 176-178 | 294 |
| 22 | ＞310 | 344 |
| 23 | 284-286 | 311 |
| 24 | 263-265 | 342 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 25 | 270-272 | 318 |
| 26 | 293-295 | 382 |
| 27 | 243-246 | 372 |
| 28 | 225-228 | 384 |
| 32 | 272-275 | 360 |
| 33 | 295-298 | 358 |
| 34 | 236-238 | |
| 41 | ＞310 | 296 |
| 42 | ＞310 | 300 |
| 43 | 270-273 | 349 |
| 44 | 295-297 | 335 |
| 45 | 263-265 | 335 |
| 46 | 294 | |
| 47 | 238-239 | 295- |
| 48 | 208-209 | 279 |
| 49 | 253-254 | 299 |
| 50 | 289-290 | 295 |
| 51 | 298-299 | 279 |
| 52 | 300-302 | 299 |
| 53 | 122-123 | 296 |
| 54 | 194-196 | 300 |
| 55 | 249-250 | 240 |
| 56 | 270-271 | 244 |
| 57 | 78-80 | 246 |
| 58 | 110-112 | 276 |
| 59 | 100-101 | 276 |
| 60 | 144-147 | 290 |
| 61 | 83-84 | 330 |
| 62 | 70-74 | 314 |
| 63 | 142-145 | 282 |
| 64 | 143-145 | 304 |
| 65 | 202-204 | 265 |
| 66 | 171-174 | 349 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 67 | 225-227 | 333 |
| 68 | 240-244 | 301 |
| 74 | 228-230 | 281 |
| 75 | 178-179 | 281 |
| 76 | 160-161 | 295 |
| 77 | 153-154 | 295 |
| 78 | 164-166 | 290 |
| 79 | 180-182 | 265 |
| 80 | 230-235 | 299 |
| 81 | 210-211 | 295 |
| 82 | 230-235 | 350 |
| 83 | 205-206 | 299 |
| 84 | 225-226 | 283 |
| 85 | 260-261 | 281(ES-) |
| 86 | 157-158 | 283 |
| 87 | 210-215 | 309 |
| 88 | 177-178 | 343 |
| 89 | 247-248 | 343 |
| 90 | 181-182 | 279 |
| 91 | 251-252 | 279 |
| 92 | 237-240 | 283 |
| 93 | 173-174 | 283 |
| 94 | 225-227 | 333 |
| 95 | 191-194 | 349 |
| 96 | 245-246 | 283 |
| 97 | 223-225 | 295 |
| 98 | 225-226 | 265 |
| 99 | 267-269 | 265 |
| 100 | 282-284 | 281 |
| 101 | 274-276 | 308(ES-) |
| 102 | 276-277 | 308(ES-) |
| 103 | 283-285 | 301 |
| 104 | 291-293 | 301 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 105 | 315-317 | 332 |
| 106 | 240-243 | 306 |
| 107 | 118-120 | 331 |
| 108 | 209-210 | 280 |
| 109 | 222-223 | 295 |
| 110 | 224-225 | 308 |
| 111 | 264-265 | 309 |
| 112 | 157-158 | 295 |
| 113 | 243-245 | 266 |
| 114 | 260-262 | 266 |
| 115 | 300-302 | 266 |
| 116 | ＞350 | 266 |
| 117 | 297-299 | 267 |
| 118 | ＞350 | 267 |
| 119 | 310-311 | 267 |
| 120 | 319-321 | 267 |
| 121 | 331-333 | 306 |
| 122 | 325-326 | 317 |
| 123 | 250-252 | 316 |
| 124 | 182-183 | 331 |
| 125 | 190-192 | 292 |
| 126 | 178-180 | 294 |
| 127 | 231-233 | 300 |
| 128 | 209-211 | 332 |
| 129 | 278-280 | 292 |
| 130 | 239-241 | 264 |
| 131 | 318-320 | 348 |
| 132 | 203-205 | 296 |
| 133 | 213-215 | 349 |
| 134 | 246-248 | 249 |
| 135 | 273-275 | 291 |
| 136 | 241-243 | 277 |
| 137 | 191-192 | 291 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 138 | 249-250 | 277 |
| 139 | 272-273 | 307 |
| 140 | 225-227 | 307 |
| 141 | 233-234 | 291 |
| 142 | 217-218 | 321 |
| 143 | 192-193 | 321 |
| 144 | 227-228 | 293 |
| 145 | 290-292 | 321 |
| 146 | 246-248 | 277 |
| 147 | 232-233 | 321 |
| 148 | 288-290 | 321 |
| 149 | 304-306 | 307 |
| 150 | 273-276 | 321 |
| 151 | 202-204 | 282 |
| 152 | 211-213 | 282 |
| 153 | 243-245 | 300 |
| 154 | 224-226 | 332 |
| 155 | 211-213 | 282 |
| 156 | 178-181 | 278 |
| 157 | 201-202 | 348 |
| 158 | 348 | |
| 159 | 278 | |
| 160 | 190-191 | 295 |
| 161 | 288-290 | 291 |
| 162 | 308-310 | 293 |
| 163 | 279-280 | 321 |
| 164 | 180-183 | 308 |
| 165 | 180-183 | 343 |
| 166 | 192-193 | 279 |
| 167 | 162-164 | 279 |
| 168 | 280-281 | 310 |
| 169 | 166-167 | 283 |
| 170 | 180-182 | 279 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 171 | 211-212 | 295 |
| 172 | 179-181 | 331 |
| 173 | 255-257 | 331 |
| 174 | 156-157 | 295 |
| 175 | 152-153 | 371 |
| 176 | 210-212 | 371 |
| 177 | 229-231 | 279 |
| 178 | 280-282 | 279 |
| 179 | 200-202 | 301 |
| 180 | 258-260 | 301 |
| 181 | 235-237 | 283 |
| 182 | 266-268 | 283 |
| 183 | 235-237 | 357 |
| 184 | 277-278 | 307 |
| 185 | 240-241 | 343 |
| 186 | 282-283 | 357 |
| 187 | 311-313 | 307 |
| 188 | 277-278 | 344 |
| 193 | 200-202 | 294 |
| 194 | 212-213 | 278 |
| 195 | 208-209 | 278 |
| 196 | ＞350 | 298 |
| 197 | 200-202 | 298 |
| 198 | 198-200 | 298 |
| 199 | 164-165 | 348 |
| 200 | ＞350 | 294 |
| 201 | 302-303 | 280 |
| 202 | 305-306 | 334 |
| 203 | 294-295 | 296 |
| 204 | 276-277 | 296 |
| 205 | 286-288 | 309 |
| 206 | 273-275 | 281 |
| 207 | 272-274 | 281 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 208 | 225-227 | 349 |
| 209 | 166-168 | 349 |
| 210 | 178-180 | 299 |
| 211 | 252-255 | 299 |
| 212 | 261-265 | 283 |
| 213 | 228-230 | 283 |
| 214 | 220-222 | 331 |
| 215 | 211-213 | 357 |
| 216 | 164-165 | 357 |
| 217 | 252-253 | 295 |
| 218 | 214-215 | 349 |
| 219 | 268-270 | 295 |
| 220 | 179-180 | 295 |
| 221 | 200-202 | 295 |
| 222 | 244-245 | 265 |
| 223 | 143-145 | 349 |
| 224 | 230-231 | 349 |
| 225 | 201-203 | 323 |
| 226 | 238-240 | 323 |
| 227 | 266-268 | 309 |
| 228 | 212-215 | 307 |
| 229 | 215-218 | 307 |
| 230 | 209-211 | 313 |
| 231 | 285-288 | 313 |
| 232 | 135-138 | 333 |
| 233 | 286-289 | 333 |
| 234 | 259-261 | 299 |
| 235 | 218-220 | 333 |
| 236 | 271-273 | 333 |
| 237 | 196-197 | 293 |
| 238 | 254-256 | 293 |
| 239 | 221-223 | 309 |
| 240 | 161-163 | 278 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 241 | 205-208 | 296 |
| 242 | 193-194 | 300 |
| 243 | 199-201 | 298 |
| 244 | 264-268 | 296 |
| 245 | 215-218 | 300 |
| 246 | 142-144 | 370 |
| 247 | 177-180 | 308 |
| 253 | 239-241 | 321 |
| 254 | 269-271 | 321 |
| 255 | 215-216 | 307 |
| 256 | 278-279 | 307 |
| 257 | 281-282 | 304 |
| 258 | 198-199 | 271 |
| 259 | 200-202 | 272 |
| 260 | 235-236 | 266 |
| 261 | 280-282 | 266 |
| 262 | 277-279 | 263 |
| 263 | 263-265 | 263 |
| 264 | 292-294 | 284 |
| 265 | 327-328 | 284 |
| 266 | 321-323 | 284 |
| 267 | 327-328 | 364 |
| 268 | 312-313 | 302 |
| 269 | 313-314 | 300 |
| 270 | 261-262 | 346 |
| 271 | 265-266 | 316 |
| 272 | 253-254 | 326 |
| 273 | 310-311 | 310 |
| 274 | 244-245 | 310 |
| 275 | 311-312 | 308 |
| 276 | 263-267 | 323 |
| 277 | 252-254 | 323 |
| 278 | 217-219 | 339 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 279 | 218-220 | 323 |
| 280 | 294-295 | 307 |
| 281 | 205-208 | 341 |
| 282 | 176-179 | 355(ES-) |
| 283 | 215-217 | 339(ES-) |
| 284 | 220-221 | 339(ES-) |
| 285 | 239-240 | 339(ES-) |
| 286 | 319-320 | |
| 287 | 244-245 | 306.22 |
| 288 | ||
| 289 | ||
| 290 | ||
| 291 | ||
| 292 | 230-232 | |
| 293 | ＞310 | |
| 294 | 263-265 | |
| 295 | 173-175 | |
| 296 | 290-292 | |
| 297 | 239-241 | |
| 298 | 141-143 | |
| 299 | 219-221 | |
| 300 | 271-273 | |
| 301 | 176-178 | |
| 302 | ＞300 | |
| 303 | 284-286 | |
| 304 | 263-265 | |
| 305 | 270-272 | |
| 306 | 293-295 | |
| 307 | 243-246 | |
| 308 | 225-228 | |
| 309 | 266-268 | |
| 310 | 245-247 | |
| 311 | ＞330 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 312 | 272-275 | |
| 313 | 295-298 | |
| 314 | 236-238 | |
| 315 | 253-255 | |
| 316 | 241-244 | |
| 317 | 257-259 | |
| 318 | 269-272 | |
| 319 | 223-225 | |
| 320 | 209-211 | |
| 321 | ＞310 | |
| 322 | ＞310 | |
| 323 | 270-273 | |
| 324 | 295-297 | |
| 325 | 263-265 | |
| 326 | ||
| 327 | 203-205 | |
| 328 | 223-225 | |
| 329 | 220-223 | |
| 330 | 221-223 | |
| 331 | 250-253 | |
| 332 | 169-170 | |
| 333 | 276-278 | |
| 334 | 203-206 | |
| 335 | 255-258 | |
| 336 | 165-168 | |
| 337 | 188-191 | |
| 338 | 209-211 | |
| 339 | 252-255 | |
| 340 | 225-227 | |
| 341 | 280-282 | |
| 342 | 296-298 | |
| 343 | 193-194 | |
| 344 | ＞320 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 345 | 191-193 | |
| 346 | 282.40 | |
| 347 | 205-208 | |
| 348 | 195-199 | |
| 349 | 163-165 | |
| 350 | 184-187 | |
| 351 | 183-186 | |
| 352 | 188-189 | |
| 353 | 204-205 | |
| 354 | 200-204 | |
| 355 | 239-240 | |
| 356 | 249-250 | |
| 357 | 237-239 | |
| 358 | 212-214 | |
| 359 | 230-232 | |
| 360 | 173-178 | |
| 361 | 180-185 | |
| 362 | 193-195 | |
| 363 | 230-235 | |
| 364 | 169-170 | |
| 365 | 210-212 | |
| 366 | 246-247 | |
| 367 | 275-246 | |
| 368 | 215-216 | |
| 369 | 266-268 | |
| 370 | 274-276 | |
| 371 | 259-260 | |
| 372 | 251-252 | |
| 373 | 259-260 | |
| 374 | 205-207 | |
| 375 | 274-276 | |
| 376 | 171-172 | |
| 377 | 176-177 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 378 | 330-332 | |
| 379 | 295-296 | |
| 380 | 305-307 | |
| 381 | 271-272 | |
| 382 | 291-292 | |
| 383 | 238-240 | |
| 384 | 251-252 | |
| 385 | 266.5-267.5 | |
| 386 | 277-278 | |
| 387 | 256-257 | |
| 388 | 225-226 | |
| 389 | 216-217 | |
| 390 | 276-277 | |
| 391 | 262-263 | |
| 392 | 235.5-237 | |
| 393 | 211-213 | |
| 394 | 275-277 | |
| 395 | 158-160 | |
| 396 | 162-164 | |
| 397 | 197-199 | |
| 398 | 241-243 | |
| 399 | 295-298 | |
| 400 | 247-249 | |
| 401 | ＞300 | |
| 402 | 187-189 | |
| 403 | 257-259 | |
| 404 | 233-235 | |
| 405 | 127-129 | |
| 406 | 142-144 | |
| 407 | 199-200 | |
| 408 | 175-177 | |
| 409 | 172-173 | |
| 410 | 202-204 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 411 | 283-285 | |
| 412 | 284-285 | |
| 413 | 217-219 | |
| 414 | 155-157 | |
| 415 | 167-169 | |
| 416 | 290-292 | |
| 417 | 292-293 | |
| 418 | 223-225 | |
| 419 | 283-285 | |
| 420 | 153-154 | |
| 421 | 156-158 | |
| 422 | 220-223 | |
| 423 | 208-210 | |
| 424 | 269-270 | |
| 425 | 247-249 | |
| 426 | 207-209 | |
| 427 | 273-275 | |
| 428 | 241-243 | |
| 429 | 297-299 | |
| 430 | 207-209 | |
| 431 | 257-259 | |
| 432 | 268-270 | |
| 433 | 174-176 | |
| 434 | 210-211 | |
| 435 | 251-252 | |
| 436 | 212-213 | |
| 437 | 227-228 | |
| 438 | 192-193 | |
| 439 | ＞320 | |
| 440 | 272-273 | |
| 441 | 212-213 | |
| 442 | 263-265 | |
| 443 | 226-227 |
| 化合物 | 熔点 | 质谱数据 |
| 444 | 262-263 | |
| 445 | 247-248.5 | |
| 446 | 285-287 | |
| 447 | 291-292 | |
| 448 | 245-250 | |
| 449 | 203-205 | |
| 450 | 165-170 | |
| 451 | 280-283 | |
| 452 | 282-284 | |
| 453 | 286-287 | |
| 454 | ||
| 455 | 177-180 | |
| 456 | 171-174 | |
| 457 | 246-250 | |
| 458 | 183-186 | |
| 459 | 135-138 | |
| 460 | 209-211 | |
| 461 | 267-270 | |
| 462 | 286-289 | |
| 463 | 256-258 | |
| 464 | 260-262 | |
| 465 | 250-252 | |
| 466 | 283-285 | |
| 467 | 265-267 | |
| 468 | 253-255 | |
| 469 | 263-265 | |
| 470 | 267-269 | |
| 471 | 269-271 | |
| 472 | 271-273 | |
| 473 | 291-293 | |
| 474 | 293.28 |
实施例2：无义抑制活性
以荧光素酶介导的化学发光为基础的基于细胞翻译的功能性测定(于2003年7月23日提交的国际申请PCT/US2003/023185一并引入作为参考)可以评价mRNA中正常终止密码子的翻译通读。在含有胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培养基中培养人胚肾细胞(293细胞)。这些细胞稳定转染有在氨基酸190位点含有提前终止密码子的荧光素酶基因，代替荧光素酶基因在该位点正常存在的苏氨酸密码子(ACA)。通过定点诱变引入3个可能的无义密码子(TAA、TAG或TGA)之一，以及紧接在所述无义密码子之后的重要下游+1位点的4个可能的核苷酸(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤)之一。照此，荧光素酶基因中的氨基酸190含有的提前终止密码子为TAA、TAG或TGA。对于每一个终止密码子，在含有的提前终止密码子的荧光素酶基因中的氨基酸190之后的核苷酸被腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤(A、T、C、G)之一取代，这样所述诱变不会改变荧光酶基因的阅读框。在图1中展示了这些构建体的示意图。
如上所述，来自本发明的基于细胞的荧光素酶报告子测定的无义抑制活性如下(表2)所示。人胚肾293细胞与含有UGA无义突变密码子的荧光素酶报告子构建体在190位点稳定转染，其接着符合阅读框的腺苷酸(UGAA)。
在含有UGA提前终止密码子的本发明构建体的基于细胞的荧光素酶报告子分析中，测定表2中活性测量结果，所述UGA提前终止密码子接着符合阅读框的腺苷酸(UGAA)。
已知氨基糖甙抗生素庆大霉素允许提前终止密码子的通读，用作内标。活性测量基于所需在细胞内产生给定蛋白的化合物最小浓度与在该浓度下细胞产生的蛋白的量的定性比。发现具有非常高效能和非常高蛋白质合成效率任一或两者的化合物分类为“*****”。发现具有中等的效能和/或蛋白质合成效率的化合物分类为“****”、“***”或“**”。类似地，发现具有较低的效能和/或蛋白质合成效率的化合物分类为“*”。
表2
| 化合物 | UGAA |
| 1 | * |
| 2 | ** |
| 3 | *** |
| 4 | **** |
| 5 | **** |
| 6 | **** |
| 8 | * |
| 9 | * |
| 10 | * |
| 11 | ** |
| 12 | *** |
| 13 | *** |
| 14 | **** |
| 15 | **** |
| 16 | ** |
| 17 | *** |
| 18 | **** |
| 19 | ***** |
| 20 | *** |
| 21 | *** |
| 22 | ***** |
| 23 | **** |
| 24 | **** |
| 25 | **** |
| 26 | **** |
| 27 | ** |
| 28 | ** |
| 29 | ***** |
| 30 | *** |
| 31 | * |
| 32 | *** |
| 化合物 | UGAA |
| 33 | * |
| 34 | * |
| 35 | **** |
| 36 | *** |
| 37 | *** |
| 38 | **** |
| 39 | ***** |
| 40 | *** |
| 41 | * |
| 42 | * |
| 43 | * |
| 44 | * |
| 45 | *** |
| 46 | **** |
| 47 | *** |
| 48 | *** |
| 49 | *** |
| 50 | *** |
| 51 | ***** |
| 52 | *** |
| 53 | ** |
| 54 | ** |
| 55 | * |
| 56 | * |
| 57 | ** |
| 58 | ** |
| 59 | ** |
| 60 | ** |
| 61 | ** |
| 62 | ** |
| 63 | * |
| 化合物 | UGAA |
| 64 | * |
| 65 | **** |
| 66 | **** |
| 67 | **** |
| 68 | **** |
| 69 | * |
| 70 | ** |
| 71 | ** |
| 72 | ** |
| 73 | * |
| 74 | **** |
| 75 | **** |
| 76 | ***** |
| 77 | **** |
| 78 | *** |
| 79 | *** |
| 80 | *** |
| 81 | **** |
| 82 | *** |
| 83 | **** |
| 84 | **** |
| 85 | ***** |
| 86 | **** |
| 87 | **** |
| 88 | *** |
| 89 | ** |
| 90 | **** |
| 91 | *** |
| 92 | *** |
| 93 | *** |
| 94 | *** |
| 化合物 | UGAA |
| 95 | *** |
| 96 | *** |
| 97 | **** |
| 98 | *** |
| 99 | ***** |
| 100 | *** |
| 101 | **** |
| 102 | *** |
| 103 | **** |
| 104 | **** |
| 105 | ***** |
| 106 | ***** |
| 107 | *** |
| 108 | *** |
| 109 | ***** |
| 110 | *** |
| 111 | *** |
| 112 | *** |
| 113 | *** |
| 114 | * |
| 115 | * |
| 116 | * |
| 117 | * |
| 118 | * |
| 119 | * |
| 120 | * |
| 121 | ** |
| 122 | *** |
| 123 | *** |
| 124 | **** |
| 125 | ***** |
| 化合物 | UGAA |
| 126 | ***** |
| 127 | *** |
| 128 | *** |
| 129 | ***** |
| 130 | *** |
| 131 | **** |
| 132 | ***** |
| 133 | **** |
| 134 | ** |
| 135 | ** |
| 136 | * |
| 137 | *** |
| 138 | **** |
| 139 | **** |
| 140 | *** |
| 141 | *** |
| 142 | *** |
| 143 | * |
| 144 | ** |
| 145 | * |
| 146 | **** |
| 147 | *** |
| 148 | **** |
| 149 | * |
| 150 | ***** |
| 151 | ** |
| 152 | ** |
| 153 | ** |
| 154 | **** |
| 155 | ***** |
| 156 | **** |
| 化合物 | UGAA |
| 157 | **** |
| 158 | *** |
| 159 | **** |
| 160 | *** |
| 161 | ** |
| 162 | ** |
| 163 | * |
| 164 | **** |
| 165 | **** |
| 166 | ***** |
| 167 | **** |
| 168 | *** |
| 169 | *** |
| 170 | **** |
| 171 | *** |
| 172 | *** |
| 173 | ** |
| 174 | **** |
| 175 | *** |
| 176 | **** |
| 177 | ***** |
| 178 | **** |
| 179 | ***** |
| 180 | ** |
| 181 | **** |
| 182 | ** |
| 183 | *** |
| 184 | *** |
| 185 | *** |
| 186 | *** |
| 187 | **** |
| 化合物 | UGAA |
| 188 | *** |
| 189 | * |
| 190 | ** |
| 191 | * |
| 192 | ** |
| 193 | *** |
| 194 | ***** |
| 195 | *** |
| 196 | ***** |
| 197 | **** |
| 198 | **** |
| 199 | *** |
| 200 | **** |
| 201 | **** |
| 202 | **** |
| 203 | *** |
| 204 | *** |
| 205 | **** |
| 206 | **** |
| 207 | *** |
| 208 | *** |
| 209 | *** |
| 210 | *** |
| 211 | **** |
| 212 | **** |
| 213 | **** |
| 214 | **** |
| 215 | * |
| 216 | ** |
| 217 | *** |
| 218 | **** |
| 化合物 | UGAA |
| 219 | *** |
| 220 | **** |
| 221 | ** |
| 222 | * |
| 223 | *** |
| 224 | ** |
| 225 | **** |
| 226 | ***** |
| 227 | *** |
| 228 | **** |
| 229 | **** |
| 230 | **** |
| 231 | *** |
| 232 | **** |
| 233 | ** |
| 234 | *** |
| 235 | **** |
| 236 | *** |
| 237 | ***** |
| 238 | *** |
| 239 | ***** |
| 240 | **** |
| 241 | ***** |
| 242 | **** |
| 243 | ** |
| 244 | ***** |
| 245 | *** |
| 246 | **** |
| 247 | **** |
| 248 | ** |
| 249 | **** |
| 化合物 | UGAA |
| 250 | **** |
| 251 | * |
| 252 | * |
| 253 | * |
| 254 | * |
| 255 | **** |
| 256 | *** |
| 257 | *** |
| 258 | ***** |
| 259 | * |
| 260 | **** |
| 261 | * |
| 262 | * |
| 263 | * |
| 264 | * |
| 265 | * |
| 266 | *** |
| 267 | *** |
| 268 | ** |
| 269 | *** |
| 270 | * |
| 271 | *** |
| 272 | *** |
| 273 | **** |
| 274 | *** |
| 275 | **** |
| 276 | *** |
| 277 | **** |
| 278 | * |
| 279 | *** |
| 280 | * |
| 化合物 | UGAA |
| 281 | ** |
| 282 | ** |
| 283 | *** |
| 284 | **** |
| 285 | *** |
| 286 | * |
| 287 | * |
| 288 | * |
| 289 | * |
| 290 | * |
| 291 | * |
| 292 | **** |
| 293 | *** |
| 294 | **** |
| 295 | **** |
| 296 | ** |
| 297 | ** |
| 298 | **** |
| 299 | ***** |
| 300 | *** |
| 301 | *** |
| 302 | **** |
| 303 | *** |
| 304 | *** |
| 305 | *** |
| 306 | **** |
| 307 | * |
| 308 | ** |
| 309 | ***** |
| 310 | **** |
| 311 | * |
| 化合物 | UGAA |
| 312 | *** |
| 313 | * |
| 314 | * |
| 315 | **** |
| 316 | ** |
| 317 | *** |
| 318 | **** |
| 319 | **** |
| 320 | *** |
| 321 | * |
| 322 | * |
| 323 | * |
| 324 | * |
| 325 | *** |
| 326 | **** |
| 327 | ***** |
| 328 | *** |
| 329 | ***** |
| 330 | * |
| 331 | **** |
| 332 | **** |
| 333 | * |
| 334 | *** |
| 335 | *** |
| 336 | **** |
| 337 | * |
| 338 | *** |
| 339 | * |
| 340 | **** |
| 341 | *** |
| 342 | ***** |
| 化合物 | UGAA |
| 343 | ** |
| 344 | * |
| 345 | ** |
| 346 | **** |
| 347 | **** |
| 348 | **** |
| 349 | *** |
| 350 | **** |
| 351 | ** |
| 352 | ***** |
| 353 | ***** |
| 354 | ***** |
| 355 | ***** |
| 356 | **** |
| 357 | **** |
| 358 | **** |
| 359 | ***** |
| 360 | **** |
| 361 | **** |
| 362 | **** |
| 363 | ** |
| 364 | *** |
| 365 | **** |
| 366 | ** |
| 367 | *** |
| 368 | ** |
| 369 | *** |
| 370 | *** |
| 371 | *** |
| 372 | *** |
| 373 | *** |
| 化合物 | UGAA |
| 374 | ** |
| 375 | *** |
| 376 | **** |
| 377 | *** |
| 378 | * |
| 379 | * |
| 380 | ** |
| 381 | *** |
| 382 | ** |
| 383 | * |
| 384 | **** |
| 385 | *** |
| 386 | *** |
| 387 | *** |
| 388 | *** |
| 389 | ** |
| 390 | *** |
| 391 | ** |
| 392 | ** |
| 393 | ***** |
| 394 | ***** |
| 395 | * |
| 396 | * |
| 397 | ***** |
| 398 | ** |
| 399 | *** |
| 400 | ** |
| 401 | |
| 402 | **** |
| 403 | * |
| 404 | **** |
| 化合物 | UGAA |
| 405 | **** |
| 406 | **** |
| 407 | * |
| 408 | * |
| 409 | * |
| 410 | * |
| 411 | **** |
| 412 | * |
| 413 | * |
| 414 | *** |
| 415 | **** |
| 416 | * |
| 417 | *** |
| 418 | **** |
| 419 | * |
| 420 | * |
| 421 | *** |
| 422 | **** |
| 423 | ** |
| 424 | *** |
| 425 | ** |
| 426 | **** |
| 427 | ** |
| 428 | **** |
| 429 | **** |
| 430 | **** |
| 431 | ** |
| 432 | *** |
| 433 | ** |
| 434 | *** |
| 435 | **** |
| 化合物 | UGAA |
| 436 | **** |
| 437 | **** |
| 438 | **** |
| 439 | * |
| 440 | *** |
| 441 | *** |
| 442 | **** |
| 443 | *** |
| 444 | *** |
| 445 | *** |
| 446 | ** |
| 447 | *** |
| 448 | *** |
| 449 | *** |
| 450 | *** |
| 451 | * |
| 452 | * |
| 453 | * |
| 454 | *** |
| 455 | *** |
| 456 | *** |
| 457 | *** |
| 458 | **** |
| 459 | *** |
| 460 | ** |
| 461 | **** |
| 462 | * |
| 463 | **** |
| 464 | * |
| 465 | *** |
| 466 | ***** |
| 化合物 | UGAA |
| 467 | **** |
| 468 | **** |
| 469 | **** |
| 470 | **** |
| 471 | ***** |
| 472 | **** |
| 473 | **** |
| 474 | **** |
在上述分析中的无义抑制活性示于下文表3中，用于构建190位点的UGA无义突变，继之以胞嘧啶核苷酸阅读框(UGAC)；用于构建190位点的UAG无义突变，继之以腺嘌呤核苷酸阅读框(UAGC)；用于构建190位点的UAA无义突变，继之以腺嘌呤核苷酸阅读框(UAAC)；以及用于构建190位点的UAA无义突变，继之以胞嘧啶核苷酸阅读框(UAAC)。还包括在表3中的是一列(“蛋白质印迹”)，指示是否用指示的化合物处理的细胞抑制在荧光素酶中的特定的密码子区(UGAA、UGAC、UAAA和UAAC)的无义突变并导致作为蛋白质印迹的正信号所确定的荧光素酶蛋白的产生。蛋白质印迹分析中的正结果由“+”和被抑制的无义密码子和密码子区指示。
表3
| 化合物编号. | UGAC | UAAA | UAAC | UAGA | 蛋白质印迹 |
| 47 | * | * | |||
| 48 | * | * | |||
| 65 | ** | *** | |||
| 66 | ** | *** | +UGAC；UAAC | ||
| 67 | **** | **** | |||
| 68 | *** | **** | |||
| 76 | **** | **** | |||
| 81 | *** | *** | |||
| 83 | *** | * | |||
| 84 | * | * |
| 化合物编号. | UGAC | UAAA | UAAC | UAGA | 蛋白质印迹 |
| 85 | * | * | +；UGAC | ||
| 86 | * | * | |||
| 90 | * | * | |||
| 91 | * | * | |||
| 92 | * | * | |||
| 93 | * | * | |||
| 95 | * | * | |||
| 96 | *** | ** | |||
| 97 | *** | ** | |||
| 98 | *** | ||||
| 99 | * | * | |||
| 100 | * | ||||
| 101 | * | ||||
| 102 | * | ||||
| 103 | * | ** | |||
| 104 | * | * | |||
| 105 | * | *** | +；UGAA；UGAC；UAAA | ||
| 106 | ***** | *** | **** | ||
| 109 | ***** | * | * | ||
| 131 | * | * | |||
| 133 | * | * | |||
| 135 | * | * | |||
| 136 | *** | * | |||
| 137 | *** | * | |||
| 138 | ***** | * | ** | * | |
| 139 | ***** | * | * | * | |
| 140 | ***** | ** | * | *** | |
| 141 | *** | * | |||
| 142 | *** | * | *** | *** | |
| 143 | * | * | |||
| 144 | ** | * | |||
| 145 | * | * | |||
| 146 | ***** | * | ** | * | |
| 147 | *** | ** | |||
| 148 | *** | * | * | *** | |
| 149 | * | * | |||
| 150 | * | * | |||
| 154 | * | *** | |||
| 155 | ** | *** | |||
| 156 | * | * | |||
| 157 | ** | * | |||
| 159 | * | * | |||
| 164 | ** | ** | |||
| 177 | ** | ** | |||
| 179 | * | ** | |||
| 196 | * | * |
| 化合物编号. | UGAC | UAAA | UAAC | UAGA | 蛋白质印迹 |
| 198 | * | * | |||
| 205 | * | * | |||
| 214 | * | * | |||
| 225 | ** | *** | |||
| 228 | ** | ** | |||
| 230 | ** | ** | |||
| 232 | * | * | |||
| 235 | ** | ** | |||
| 237 | *** | ** | +；UGAC | ||
| 239 | * | * | |||
| 241 | *** | ** | |||
| 242 | ** | ** | |||
| 249 | * | * | |||
| 255 | ** | ** |
实施例3：通读测定
以荧光素酶介导的化学发光为基础的基于细胞翻译的功能性测定(于2003年7月23日提交的国际申请PCT/US2003/023185一并引入作为参考)可以评价mRNA中正常终止密码子的翻译通读。在含有胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培养基中培养人胚肾细胞(293细胞)。这些细胞稳定转染有在氨基酸190位点含有提前终止密码子的荧光素酶基因，代替荧光素酶基因在该位点正常存在的苏氨酸密码子(ACA)。通过定点诱变引入3个可能的无义密码子(TAA、TAG或TGA)之一，以及紧接在所述无义密码子之后的重要下游+1位点的4个可能的核苷酸(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤)之一。照此，荧光素酶基因中的氨基酸190含有的提前终止密码子为TAA、TAG或TGA。对于每一个终止密码子，在含有的提前终止密码子的荧光素酶基因中的氨基酸190之后的核苷酸被腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤(A、T、C、G)之一取代，这样所述诱变不会改变荧光酶基因的阅读框。在图1中展示了这些构建体的示意图。
本发明的另一测定可以评估促进无义突变抑制的化合物。图1中展示的荧光素酶构建体，在荧光素酶蛋白的氨基端设计带有两个抗原表位标签。基于荧光素酶蛋白的产生，所述构建体定量地评价翻译-通读的水平。通过免疫沉淀被抑制的荧光素酶蛋白(使用抗His标签的抗体)后，使用抗第二抗原表位(the XpressTM epitope；Invitrogen；Carlsbad，California)抗体进行蛋白质印迹(western blotting)来测定通过所述提前终止密码子的抑制而产生的全长荧光素酶蛋白的存在。所述构建体在图2中展示。
带有图2构建体的细胞当用本发明化合物处理时，显示出全长蛋白产量增加。在处理20小时后，收集含有图2构建体的细胞，并使用识别His抗原表位的抗体免疫沉淀荧光素酶蛋白。免疫沉淀后，使用XpressTM抗原表位的抗体(Invitrogen；Carlsbad，California)进行蛋白质印迹以检测截短的荧光素酶(当没有无义抑制发生时产生)，并检测全长蛋白(由无义密码子抑制产生)。用被测化合物处理的细胞产生全长蛋白，并且不产生通读蛋白。如果正常终止密码子的抑制发生时，产生所述通读蛋白。本发明的化合物抑制提前终止密码子即无义突变，但并不抑制荧光素酶mRNA中的正常终止密码子。
本发明的化合物任选地作用于哺乳动物中的提前终止密码子，而不作用于正常终止密码子。
通过强饲法(口服)给予大暑和犬高剂量化合物(达1800毫克/千克)，每天一次，共14天。治疗之后，收集组织，制备溶胞产物并进行蛋白质印迹。用于评价正常终止密码子通读的蛋白的选择，主要基于相应的在3’非翻译区内具有第二终止密码子的mRNA符合正常终止密码子阅读框。在该两个终止密码子之间，每一被选蛋白都具有核苷酸插入序列，该序列编码第一个终止密码子的核糖体通读事件中蛋白的延长。如果所述化合物具有诱导非特异性、核糖体通读的能力，延长的蛋白得以用蛋白质印迹与野生型蛋白区分开。收集大鼠的组织，并分析波形蛋白mRNA中正常终止密码子(UAA)的抑制。没有迹象表明发生抑制。收集用本发明化合物治疗的犬的组织。没有证据表明带有UAG终止密码子的β-肌动蛋白的正常终止密码子受抑制。
在健康人志愿者中，口服给予单次剂量(200毫克/千克)本发明化合物。收集血液样本，制备血浆，并用来自女性和男性受试者的血浆样本进行蛋白质印迹。使用带有UGA终止密码子的C-反应性蛋白(C-reactive protein，CRP)检测用本发明化合物治疗的受试者是否导致了CRP mRNA中正常终止密码子的抑制。荧光素酶测定结合提前终止测定表明了提前终止密码子而不是正常终止密码子的选择性抑制。
实施例4：动物模型
动物模型系统还能用于指示本发明化合物的安全和有效。用感兴趣的疾病、状态或综合征的动物模型测试本发明的化合物生物学活性。所述动物模型包括设计含有靶RNA元件配对功能性读出系统的动物，例如转基因小鼠。
囊性纤维化病
囊性纤维化病的动物模型实例包括但不限于：cftr(-/-)小鼠(参见例如，Freedman等人，2001，Gastroenterology 121(4)：950-7)、cftr(tmlHGU/tmlHGU)小鼠(参见例如，Bernhard等人，2001，Exp LungRes 27(4)：349-66)、伴随缺陷环磷腺苷介导Cl(-)转导(Cl(-)conductance)的囊性纤维化跨膜转导调节因子缺陷小鼠(参见例如，Stotland等人，2000，Pediatr Pulmonol 30(5)：413-24)和C57BL/6-Cftr(mlUNC)/Cftr(mIUNC)敲除小鼠(参见例如，Stotland等人，2000，Pediatr Pulmonol30(5)：413-24)。
肌营养不良
肌营养不良的动物模型实例包括但不限于：小鼠、仓鼠、猫、犬及线虫(C.elegans)。肌营养不良的小鼠模型实例包括但不限于：dy-/-(参见例如，Connolly等人，2002，J Neuroimmunol 127(1-2)：80-7)、肌营养不良伴随肌炎(muscular dystrophy with myositis，mdm)小鼠突变(参见例如，Garvey等人，2002，Genomics 79(2)：146-9)、mdx小鼠(参见例如，Nakamura等人，2001，Neuromuscul Disord 11(3)：251-9)、utrophin-抗肌萎缩蛋白敲除(utrophin-dystrophin knockout，dko)小鼠(参见例如，Nakamura等人，2001，Neuromuscul Disord 11(3)：251-9)、dy/dy小鼠(参见例如，Dubowitz等人，2000，Neuromuscul Disord 10(4-5)：292-8)、mdx(Cv3)小鼠模型(参见例如，Pillers等人，1999，Laryngoscope 109(8)：1310-2)以及肌强直的ADR-MDX突变小鼠(参见例如，Kramer等人，1998，Neuromuscul Disord 8(8)：542-50)。肌营养不良的仓鼠模型实例包括但不限于：肌聚糖-缺陷(sarcoglycan-deficient)仓鼠(参见例如，Nakamura等人，2001，Am J Physiol Cell Physiol 281(2)：C690-9)和BIO14.6营养不良仓鼠(参见例如，Schlenker & Burbach，1991，JAppl Physiol71(5)：1655-62)。肌营养不良的猫模型实例包括但不限于猫肥大性肌营养不良模型(参见例如，Gaschen & Burgunder，2001，Acta Neuropathol(Berl)101(6)：591-600)。肌营养不良的犬模型实例包括但不限于金毛寻回犬(golden retriever)肌营养不良(参见例如，Fletcher等人，2001，Neuromuscul Disord 11(3)：239-43)和犬X-lmked肌营养不良(参见例如，Valentine等人，1992，Am J Med Genet 42(3)：352-6)。肌营养不良的线虫模型在Chamberlain&Benian，2000，Curr Biol 10(21)：R795-7以及Culette&Sattelle，2000，Hum MoI Genet 9(6)：869-77中描述。
家族性高胆固醇血症
家族性高胆固醇血症的动物模型实例包括但不限于缺乏功能性低密度脂蛋白受体报告基因的小鼠(参见例如，Aji等人，1997，Circulation95(2)：430-7、Yoshida大鼠(参见例如，Fantappie等人，1992，Life Sci50(24)：1913-24)、JCR：LA-cp大鼠(参见例如，Richardson等人，1998，Atherosclerosis 138(1)：135-46)、猪(参见例如，Hasler-Rapacz等人，1998，Am J Med Genet 76(5)：379-86)和Watanabe遗传性高脂血症兔(参见例如，Tsutsumi等人，2000，Arzneimittelforschung 50(2)：118-21；Harsch等人，1998，Br J Pharmacol 124(2)：227-82；和Tanaka等人，1995，Atherosclerosis 114(1)：73-82)。
人类癌症
人类癌症动物模型实例一般包括但不限于：伴生动物(companionanimals)的自发性产生肿瘤(参见例如，Vail&MacEwen，2000，CancerInvest 18(8)：781-92)。肺癌的动物模型实例包括但不限于：Zhang和Roth描述的肺癌动物模型(1994，In Vivo 8(5)：755-69)以及p53功能中断的转基因小鼠(参见例如，Morris等人，1998，JLa State Med Soc 150(4)：179-85)。乳腺癌的动物模型实例包括但不限于：过度表达细胞周期蛋白Dl的转基因小鼠(参见例如，Hosokawa等人，2001，Transgenic Res10(5)：471-8)。结肠癌的动物模型实例包括但不限于：TCRβ和p53双敲除小鼠(参见例如，Kado等人，2001，Cancer Res 61(6)：2395-8)。胰腺癌的动物模型实例包括但不限于：Panc02鼠胰腺癌转移性模型(参见例如，Wang等人，2001，Int J Pancreatol 29(1)：37-46)和产生皮下胰腺肿瘤的裸小鼠(参见例如，Ghaneh等人，2001，Gene Ther 8(3)：199-208)。非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)的动物模型实例包括但不限于：重度联合免疫缺陷症(severe combined immunodeficiency，″SCID″)小鼠(参见例如，Bryant等人，2000，Lab Invest 80(4)：553-73)以及IgHmu-HOX11转基因小鼠(参见例如，Hough等人，1998，Proc Natl AcadSci USA 95(23)：13853-8)。食管癌的动物模型实例包括但不限于：转有人乳头瘤病毒属型16E7致癌基因的转基因小鼠(参见例如，Herber等人，1996，J Virol 70(3)：1873-81)。结肠直肠癌的动物模型实例包括但不限于：Ape小鼠模型(参见例如，Fodde&Smits，2001，Trends MoI Med7(8)：369-73和Kuraguchi等人，2000，Oncogene 19(50)：5755-63)。多发性神经纤维瘤的动物模型实例包括但不限于：突变体NF1小鼠(参见例如，Cichowski等人，1996，Semin Cancer Biol 7(5)：291-8)。成视网膜细胞瘤的动物模型实例包括但不限于：在视网膜内表达猿猴病毒40移植抗原转基因小鼠(参见例如，Howes等人，1994，Invest Ophthalmol Vis Sci35(2)：342-51和Windle等人，1990，Nature 343(6259)：665-9)和近亲交配大鼠(参见例如，Nishida等人，1981，Curr Eye Res 1(1)：53-5和Kobayashi等人，1982，Acta Neuropathol(Berl)57(2-3)：203-8)。维尔姆斯氏肿瘤(Wilm′s tumor)的动物模型实例包括但不限于：WT1敲除小鼠(参见例如，Scharnhorst等人，1997，Cell Growth Differ 8(2)：133-43)、具有肾胚细胞瘤高发病率的大鼠亚系(参见例如，Mesfin & Breech，1996，LabAnim Sci 46(3)：321-6)和具有维尔姆斯氏肿瘤Wistar/Furth大鼠(参见例如，Murphy等人，1987，Anticancer Res 7(4B)：717-9)。
视网膜色素变性
视网膜色素变性的动物模型实例包括但不限于：皇家外科医师学会(Royal College of Surgeons，″RCS″)大鼠(参见例如，Vollrath等人，2001，Proc Natl Acad Sci USA 98(22)；12584-9和Hanitzsch等人，1998，Acta Anat(Basel)162(2-3)：119-26)、视紫红质敲除大鼠(参见例如，Jaissle等人，2001，Invest Ophthalmol Vis Sci 42(2)：506-13)和Wag/Rij大鼠(参见例如，Lai等人，1980，Am J Pathol 98(1)：281-4)。
肝硬化
肝硬化的动物模型实例包括但不限于：四氯化碳暴露(CCl4-exposed)大鼠(参见例如，Kloehn等人，2001，Horm Metab Res33(7)：394-401)以及细菌细胞成分或大肠炎引发的啮鼠动物模型(参见例如，Vierling，2001，Best Pract Res Clin Gastroenterol 15(4)：591-610)。
血友病
血友病的动物模型实例包括但不限于：血友病A的啮鼠动物模型(参见例如，Reipert等人，2000，Thromb Haemost 84(5)：826-32；Jarvis等人.，.1996，Thromb Haemost 75(2)：318-25；以及Bi等人，1995，Nat Genet10(1)：119-21)、血友病A的犬模型(参见例如，Gallo-Penn等人，1999，HumGene Ther 10(11)：1791-802和Connelly等人，1998，Blood91(9)；3273-81)、血友病B的鼠类模型(参见例如，Snyder等人，1999，NatMed 5(1)：64-70；Wang等人，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94(21)：11563-6；以及Fang等人，1996，Gene Ther 3(3)：217-22)、血友病B的犬模型(参见例如，Mount等人，2002，Blood 99(8)：2670-6；Snyder等人，1999，NatMed 5(1)：64-70；Fang等人，1996，Gene Ther 3(3)：217-22)；以及Kay等人，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91(6)：2353-7)和血友病B的猕猴模型(参见例如，Lozier等人，1999，Blood 93(6)：1875-81)。
冯·维勒布兰德病
冯·维勒布兰德病的动物模型实例包括但不限于：近亲交配鼠品系RIIIS/J (参见例如，Nichols等人，1994，83(11)：3225-31和Sweeney等人，1990，76(11)：2258-65)、美洲矛头蝮毒蛋白的大鼠(参见例如，Sanders等人，1988，Lab Invest 59(4)：443-52)以及冯·维勒布兰德病的猪模型(参见例如，Nichols等人，1995，Proc Natl Acad Sci USA 92(7)：2455-9；Johnson&Bowie，1992，J Lab Clin Med 120(4)：553-8)；以及Brinkhous等人，1991，Mayo Clin Proc 66(7)：733-42)。
β地中海贫血症
β地中海贫血症的动物模型实例包括但不限于：珠蛋白基因突变的鼠类模型(参见例如，Lewis等人，1998，Blood 91(6)：2152-6；Raja等人，1994，BrJ Haematol 86(1)：156-62；Popp等人，1985，445：432-44；和Skow等人，1983，Cell 34(3)：1043-52)。
肾结石
肾结石的动物模型实例包括但不限于：遗传性高钙尿大鼠(genetichypercalciuric rats)(参见例如，Bushinsky等人，1999，Kidney Int55(1)：234-43and Bushinsky等人，1995，Kidney Int 48(6)：1705-13)、化学处理大鼠(参见例如，Grases等人，1998，Scand J Urol Nephrol 32(4)：261-5；Burgess等人，1995，Urol Res 23(4)：239-42；Kumar等人，1991，J Urol146(5)：1384-9；Okada等人，1985，Hinyokika Kiyo 31(4)：565-77；和Bluestone等人，1975，Lab Invest 33(3)：273-9)、高草酸尿的大鼠(参见例如，Jones等人，1991，J Urol 145(4)：868-74)、单侧退行性可曲肾镜检查(flexible nephroscopy)的猪(参见例如，Seifmah等人，2001，57(4)：832-6)以及上泌尿道梗阻的兔(参见例如，Itatani等人，1979，Invest Urol17(3)：234-40)。
共济失调性毛细血管扩张症
共济失调性毛细血管扩张症的动物模型实例包括但不限于：共济失调性毛细血管扩张症的鼠类模型(参见例如，Barlow等人，1999，ProcNatl Acad Sci USA 96(17)：9915-9和Inoue等人，1986，Cancer Res46(8)：3979-82)。
溶酶体贮积症
溶酶体贮积症的动物模型实例包括但不限于：粘多糖增多症VII型小鼠模型(参见例如，Brooks等人，2002，Proc Natl Acad Sci USA.99(9)：6216-21；Monroy等人，2002，Bone 30(2)：352-9；Vogler等人，2001，Pediatr Dev Pathol 4(5)：421-33；Vogler等人，2001，Pediatr Res.49(3)：342-8；以及Wolfe等人，2000，MoI Ther.2(6)：552-6)、异染性脑白质营养不良小鼠模型(参见例如，Matzner等人，2002，Gene Ther.9(1)：53-63)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)小鼠模型(参见例如，Sango等人，2002，Neuropathol Appl Neurobiol 28(1)：23-34)、粘多糖增多症III A型小鼠模型(参见例如，Bhattacharyya等人，2001，Glycobiology 11(1)：99-10和Bhaumik等人，1999，Glycobiology 9(12)：1389-96.)、酰基硫酸酯酶A(arylsulfataseA，ASA)缺陷小鼠(参见例如，D′Hooge等人，1999，BrainRes.847(2)：352-6和D′Hooge等人，1999，Neurosci Lett.273(2)：93-6)、天冬氨酰葡糖胺尿症的突变小鼠(参见例如，Jalanko等人，1998，HumMoI Genet.7(2)：265-72)、粘多糖增多症VI型猫模型(参见例如，Crawley等人，1998，J Clin Invest.101(1)：109-19和Norrdin等人，1995，Bone17(5)：485-9)、尼-皮病C型猫模型(参见例如，March等人，1997，ActaNeuropathol(Berl).94(2)：164-72)、酸性鞘磷脂酶缺陷小鼠(参见例如，Otterbach&Stoffel，1995，Cell 81(7)：1053-6)和甘露糖苷过多症牛(参见例如，Jolly等人，1975，Birth Defects Orig Arctic Ser.11(6)：273-8)。
结节性硬化症(Tuberous Sclerosis)
结节性硬化症的动物模型实例包括但不限于：TSCl小鼠模型(参见例如，Kwiatkowski等人，2002，Hum MoI Genet.11(5)：525-34)、Tsc1(TSC1同系物)敲除小鼠(参见例如，Kobayashi等人，2001，Proc NatlAcad Set USA.2001JuI 17；98(15)：8762-7)、TSC2基因突变体(Eker)大鼠模型(参见例如，Hino 2000，Nippon Rinsho 58(6)：1255-61；Mizuguchi等人，2000，J Neuropathol Exp Neurol.59(3)：188-9；以及Hino等人，1999，Prog Exp Tumor Res.35：95-108)和Tsc2(+/-)小鼠(参见例如，Onda等人，1999，J Clin Invest.104(6)：687-95)。
实施例5：mdx小鼠动物模型研究
引起427kDa抗肌萎缩蛋白多肽翻译提前终止的mdx小鼠中的突变，已经表现出在外显子23中3185位置上C到T的转变(Sicinski等人，Science 244(4912)：1578-1580(1989))。得自2天龄mdx小鼠的原代骨骼肌培养物按照以前记载的方法(Barton-Davis等人，J.Clin.Invest.104(4)：375-381(1999))制备。细胞在本发明化合物存在下培养10天。每四天更换细胞培养基，并且通过以前记载的免疫染色法(Barton-Davis等人，J.Clin.Invest.104(4)：375-381(1999))测定成肌细胞培养物中抗肌萎缩蛋白的存在。使用未经稀释的抗肌萎缩蛋白羧基端的第一单克隆抗体，结合抗鼠IgG的若丹明用作第二抗体。所述抗体检测通过抑制无义密码子产生的全长蛋白。用Leica DMR显微镜、数码相机并联合图像软件观察染色。
如以前记载(Barton-Davis等人，J.Clin.Invest.104(4)：375-381(1999))，通过Alzet渗透泵植入麻醉小鼠皮下来传递化合物。本发明的每种化合物给药两个剂量。庆大霉素作为阳性对照，并且满泵溶剂只作为阴性对照。泵中装载适量的化合物，这样计算暴露给组织的剂量为10mM和20mM。计算所述庆大霉素的浓度达到组织暴露大约200mM。在试验初期，治疗小鼠14天，之后用开他敏(ketamine)麻醉动物并放血。然后离体分离、冷冻实验动物的胫骨前肌(tibialisanterior，TA)，并用于免疫荧光分析横纹肌中的抗肌萎缩蛋白的掺入。通过以前记载的免疫染色(Barton-Davis et ah，J.Clin.Invest.104(4)：375-381(1999))检测TA肌肉中抗肌萎缩蛋白的存在。
蛋白印迹分析
使用商业上可供的抗肌萎缩蛋白抗体，通过蛋白印迹分析得自本发明化合物治疗4周的mdx小鼠的四头肌。提取自野生小鼠四头肌的蛋白作为阳性对照。观察在受治疗小鼠中全长抗肌萎缩蛋白的产生。全长抗肌萎缩蛋白产生的量，作为无义抑制的结果但不限于此理论，大约为野生表达水平的10％。
免疫荧光
用本发明不同的化合物(对于每一种化合物至少n＝2)治疗雄性mdx小鼠(9-11周龄)。每天注射一次25毫克/千克的适量所述化合物，注射两周。在两周治疗后，处死小鼠移出肌肉检测抗肌萎缩蛋白通读效率。
使用抗肌萎缩蛋白抗体，在10微米冷冻切片上完成免疫荧光(Immunofluorescence，IF)。所述抗体识别mdx小鼠中发现的提前终止突变体羧基端抗原表位。图像分析以同样的方式在所有切片上分析。分析来自治疗或未治疗小鼠的图像，信号强于未治疗对照上的信号认为阳性，表明提前终止密码子抑制在抗肌萎缩蛋白mRNA中发生。
肌肉力学
离体全面肌肉力学在来自动物的长伸肌(extensor digitorum longus，EDL)肌肉上进行。最适肌肉长度(Optimum muscle length，Lo)定义为产生最大颤搐张力(twitch tension)的长度。最适肌肉长度处的最大强直性张力使用120赫兹、500毫秒脉冲在超大电压下测量。监视通过一系列5个偏心性阳极期间强直诱导的抗机械性损伤的保护。所述测量利用700毫秒兴奋周期完成，在该期间内肌肉最初500毫秒保持等长收缩，然后以0.5Lo/秒的速率伸长8％或10％的Lo。抗机械性损伤的保护在80赫兹刺激频率下评定。以在第一次和最后一次偏心性收缩之间的力量损失测定损伤。
实施例6：p53基因中的无义突变抑制
为动物模型系统，将CAOV-3细胞(1×107)注射到裸小鼠(nude/nude mice)的侧腹。12天后，小鼠随机分组(每组10只小鼠)，并用3毫克/千克本发明化合物皮下治疗(每周5天)，或用30毫克/千克本发明化合物腹膜内治疗(每周1天)。每周测量肿瘤体积。通过本发明的化合物在p53基因中的无义突变抑制能抑制癌症在体内生长。
实施例7：本发明化合物能修饰特异性核苷酸28S rRNA的方法
以前的研究已经证明庆大霉素以及其他氨基糖甙家族的成员降低结合16S rRNA的A位点的翻译忠实度。通过化学足迹法(chemicalfootprinting)、紫外交联以及核磁共振，庆大霉素已经显示在核苷酸1406、1407、1494和1496处结合所述16S rRNA的A位点(包括E.coli编号1400-1410和1490-1500的核苷酸)(Moazed&Noller，Nature327(6121)：389-394(1978)；Woodcock等人，EMBO J.10(10)：3099-3103(1991)；以及Schroeder等人，EMBOJ.19：1-9(2000))。
从海拉细胞制备的核糖体，与小分子孵育(在100mM浓度下)，然后用化学修饰剂(二甲基硫醚(DMS)和乙氧丁酮醛(KE))处理。化学修饰后，rRNA得以用酚-氯仿提取，并用乙醇沉淀，在引物延伸反应中使用末端标记的杂交三种rRNA不同区域的寡聚核苷酸，并在6％聚丙烯酰胺凝胶上分析。引物延伸探针覆盖全部18S(7寡聚核苷酸引物)、28S(24寡聚核苷酸引物)和5S(一个引物)的rRNA。这些实验中的对照包括二甲亚砜(二甲亚砜诱导的rRNA中趋近性的变化对照)、巴龙霉素(18S rRNA结合标记)以及茴香霉素(28S rRNA结合标记)。
这里引用的所有出版物以及专利申请在此以相同的程度一并引入作为参考，既使每一单独出版物或专利申请得到清楚且个别地简述以引入参考。
虽然确定的实施方式已在上文详细描述，本领域普通技术人员能够清楚地理解实施方式中许多可能的不背离其教导的变化。所有这些变化确定包含在本发明的权利要求内。
Claims (64)
1、一种治疗或预防由体细胞突变引起的疾病的方法，所述方法包括向需要其的病人给药有效量的式1的化合物或者所述式1的化合物的药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物：
其中：
A1为C、CH或N；
V和X独立地选自N或C；
W选自N、C或CH；
其中至少V、W或X之一为N，且其中如果W为N，则至少V或X之一也为N；
Y和Z独立地选自N、C、C-Rc、C＝O、C＝S，其中Rc为H、CH3或NH2；条件是当Y或Z之一为C＝O或C＝S时，则另一个也可选自NH、S或O；
R1为羧基、氰基或任选地被C1-C4烷氧基取代的羰基；
R2不存在或者为硝基；
Ar1为任选地被R基取代的C1-C4烷基；任选地被一个、两个或三个独立选择的R基取代的C6至C10芳基；任选地被一个、两个或三个独立选择的R基取代的5至10元杂环；与Ar2和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；或与Ar3和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar2不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；
Ar3不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar4不存在；或者为其中任意一种与A1共同形成4至7元碳环或杂环的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4硫代烷基；
R为氢；-Ra基或两个R基，其中R也可包括氧基，与跟其相连的苯基或杂环共同形成选自RR的环结构；
其中：
Ar1-2和Ar1-3选自任选地被一个或多个以下基团取代的11至14元杂三环的环结构：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、任选地被卤素或C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或者任选地被用C1-C4烷基取代的羰基取代的氨基；
RR为任选地被一个或多个以下基团取代的9至10元双环的环结构：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、氧代基团或C1-C4卤代烷氧基；
Ra选自：羟基；卤素；任选地被一个或多个独立选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地被一个或多个独立选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的4至6元杂环；具有两个环结构的9至10元杂环；任选地被羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地被一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫代；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；或任选地被一个或两个独立选择的C1-C4烷基、磺酰基或羰基取代的氨基，其中氨基磺酰基任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代且其中氨基羰基任选地被任选地用-Rb基取代的C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酰氧基或氨基取代；
其中-Rb为任选地被下列基团中的一种或多种取代的C6-C8芳基：羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或者任选地被一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物多晶型物、外消旋物、立体异构体或多晶型物以含有所述化合物和药学可接受的载体或稀释剂的组合物给药。
3、根据权利要求1所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
4、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-A的化合物：
其中A1、A2、A3、A4和A5独立地选自N、C和CH；Ar3不存在或者为氢且n为0、1或2。
5、根据权利要求4所述的方法，其中R2不存在且A1、A2、A3、A4和A5独立地选自C和CH。
6、根据权利要求4所述的方法，其中R1为羧基。
7、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-B的化合物：
8、根据权利要求7所述的方法，其中R1为羧基。
9、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-C的化合物：
10、根据权利要求9所述的方法，其中Ar1为噻吩基。
11、根据权利要求9所述的方法，其中R1为羧基。
12、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-D的化合物：
13、根据权利要求12所述的方法，其中Ar2不存在。
14、根据权利要求12所述的方法，其中Ar3为氢。
15、根据权利要求12所述的方法，其中R1为羧基。
16、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-E的化合物：
17、根据权利要求16所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
18、根据权利要求17所述的方法，其中所述一个或两个R基独立地选自C1-C4烷基和卤素。
19、根据权利要求16所述的方法，其中R1为羧基。
20、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-F的化合物：
21、根据权利要求20所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
22、根据权利要求21所述的方法，其中所述一个或两个R基独立地选自C1-C4烷基、卤素、C1-C4卤代烷基和甲磺酰基，或者两个R基共同形成喹啉基。
23、根据权利要求20所述的方法，其中R1为羧基。
24、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-G的化合物：
25、根据权利要求24所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
26、根据权利要求25所述的方法，其中所述一个或两个R基独立地选自C1-C4烷基和氰基。
27、根据权利要求24所述的方法，其中R1为羧基。
28、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-H的化合物：
29、根据权利要求28所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
30、根据权利要求29所述的方法，其中所述一个或两个R基为C1-C4烷基。
31、根据权利要求28所述的方法，其中R1为羧基。
32、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-I的化合物：
33、根据权利要求32所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
34、根据权利要求33所述的方法，其中所述一个或两个R基为C1-C4烷基。
35、根据权利要求32所述的方法，其中R1为羧基。
36、根据权利要求1所述的方法，其中所述式1的化合物为式1-J的化合物：
37、根据权利要求36所述的方法，其中Ar1为任选地被一个或两个R基取代的苯基。
38、根据权利要求37所述的方法，其中所述一个或两个R基为C1-C4烷基。
39、根据权利要求36所述的方法，其中R1为羧基。
40、一种治疗或预防自身免疫性疾病、血液病、胶原病、糖尿病、神经变性疾病、心血管疾病、肺部疾病、炎症性疾病或中枢神经系统疾病的方法，所述方法包括向需要其的病人给药有效量的式1的化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物。
41、根据权利要求40所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
42、根据权利要求40所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
43、根据权利要求40所述的方法，其中所述炎症性疾病为关节炎。
44、根据权利要求40所述的方法，其中所述中枢神经系统疾病为多发性硬化、肌营养不良、迪谢纳肌营养不良、阿尔茨海默病、神经变性疾病或帕金森症。
45、根据权利要求40所述的方法，其中所述血液病为血友病、冯·维勒布兰德病或β地中海贫血。
46、根据权利要求40所述的方法，其中所述胶原病为成骨不全或硬化。
47、一种治疗或预防家族性红细胞增多症、免疫缺陷、肾疾病、囊性纤维化病、家族性高胆固醇血症、视网膜色素变性、淀粉样变、血友病、阿尔茨海默病、泰-萨病、尼-皮病、帕金森症、动脉粥样硬化、巨人症、侏儒症、甲状腺功能亢进、衰老、肥胖症、迪谢纳肌营养不良或马方综合征的方法，所述方法包括向需要其的病人给药有效量的式1的化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物。
48、根据权利要求47所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
49、一种治疗或预防人类癌症的方法，所述方法包括向需要其的人给药有效量的式1的化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物。
50、根据权利要求49所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
51、根据权利要求49所述的方法，其中所述癌症为头与颈、眼、皮肤、口、咽、食道、胸、骨、血、肺、结肠、乙状结肠、直肠、胃、前列腺、乳房、卵巢、肾、肝、胰腺、脑、肠、心脏或肾上腺的癌症。
52、根据权利要求49所述的方法，其中所述化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物或立体异构体包括药学可接受的载体或稀释剂。
53、根据权利要求49所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。
54、根据权利要求49所述的方法，其中所述癌症为肉瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、血液产生的肿瘤或多发性骨髓瘤。
55、根据权利要求49所述的方法，其中所述癌症为急性成淋巴细胞性白血病、B细胞型急性淋巴细胞白血病、T细胞型急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性成单核细胞性白血病、急性红白血病、急性成巨核细胞白血病、急性粒单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病或多发性骨髓瘤。
56、一种治疗或预防与p53基因突变相关的疾病的方法，所述方法包括向需要其的病人给药有效量的式1的化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物。
57、根据权利要求56所述的方法，其中所述给药是静脉内的。
58、根据权利要求56所述的方法，其中所述疾病为肉毒瘤、癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤或成视网膜细胞瘤。
59、一种抑制癌细胞生长的方法，所述方法包括使所述癌细胞与有效量的式1的化合物或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物接触。
60、一种在哺乳动物中选择性地产生蛋白质的方法，所述方法包括：
在所述哺乳动物中转录含有无义突变的基因；并
将有效量的本发明的化合物提供给所述哺乳动物，其中所述蛋白质通过所述含有无义突变的基因产生。
61、一种式1的化合物或所述式1的化合物的药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋物、立体异构体或多晶型物：
其中：
A1为C、CH或N；
V和X独立地选自N或C；
W选自N、C或CH；
其中至少V、W或X之一为N，且其中如果W为N，则至少V或X之一也为N；
Y和Z独立地选自N、C、C-Rc、C＝O、C＝S，其中Rc为H、CH3或NH2；条件是当Y或Z之一为C＝O或C＝S时，则另一个也可选自NH、S或O；
R1为羧基、氰基或者任选地被C1-C4烷氧基取代的羰基；
R2不存在或者为硝基；
Ar1为任选地被R基取代的C1-C4烷基；任选地被一个、两个或三个独立选择的R基取代的C6至C10芳基；任选地被一个、两个或三个独立选择的R基取代的5至10元杂环；与Ar2和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；或与Ar3和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar2不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar2相连的杂环共同形成选自Ar1-2的环结构；
Ar3不存在或者与Ar1和跟Ar1及Ar3相连的杂环共同形成选自Ar1-3的环结构；
Ar4不存在；或者为其中任意一种与A1共同形成4至7元碳环或杂环的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4硫代烷基；
R为氢；-Ra基或两个R基，其中R也可包括氧基，与跟其相连的苯基或杂环共同形成选自RR的环结构；
其中：
Ar1-2和Ar1-3选自任选地被一个或多个以下基团取代的11至14元杂三环的环结构：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、任选地被卤素或C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或者任选地被用C1-C4烷基取代的羰基取代的氨基；
RR为任选地被一个或多个以下基团取代的9至10元双环的环结构：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、氧代基团或C1-C4卤代烷氧基；
Ra选自：羟基；卤素；任选地被一个或多个独立选择的卤素或羟基取代的C1-C4烷基；任选地被一个或多个独立选择的卤素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基取代的C4-C8环烷基；-Rb基；-O-Rb基；任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的4至6元杂环；具有两个环结构的9至10元杂环；任选地被羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任选地被一个或两个C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫代；任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；或任选地被一个或两个独立选择的C1-C4烷基、磺酰基或羰基取代的氨基，其中氨基磺酰基任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基取代且其中氨基羰基任选地被任选地用-Rb基取代的C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、苯甲酰氧基或氨基取代；
其中-Rb为任选地被如下基团中的一种或多种取代的C6-C8芳基：羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或者任选地被一个或多个C1-C4烷基取代的氨基。
62、根据权利要求61所述的化合物，其中Ar4不存在。
63、根据权利要求61所述的化合物，其中所述化合物选自表X的化合物。
64、一种具有下式的化合物(化合物编号：1)
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