CN109395105A - 一种聚氨基酸声敏剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚氨基酸声敏剂及其制备方法与应用。本发明的聚氨基酸声敏剂的主链结构为接枝了原卟啉的天冬氨酸，具有良好的生物相容性，原卟啉修饰于水溶性的聚天冬氨酸侧键极大地提高了原卟啉的溶解性，增加了声敏剂在体内的血液相容性和病灶部位的聚集量，从而产生较好的治疗效果，实现高效、安全的肿瘤治疗。本发明还提供了一种声敏剂纳米囊泡及其靶向修饰的声敏剂纳米囊泡，具有高效、低毒的效果，为发展安全、高效的声动力治疗提供性能有优良的新型声敏剂材料，并通过在其表面修饰特异性抗体或者配体，提高其在靶向部位的聚集。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，更具体地，涉及一种具有载氧功能的聚氨基酸声敏剂及其制备方法与应用。
背景技术
声动力疗法(sonodynamic therapy，SDT)是近年来发展起来的一种肿瘤治疗新方法，最初由Umemura和其他学者提出，于1989年投入使用，是一种基于光动力疗法(PDT)开发的新疗法。声动力疗法是指给肿瘤患者注射声敏剂，用低频超声波辐照肿瘤部位，激发聚集在肿瘤组织中的声敏剂获得能量，从而引起电子跃迁，出现杀死靶细胞的活性氧(ROS)，促使肿瘤细胞发生不可逆性损伤，从而达到肿瘤治疗的目的，声敏剂可选择性聚集于肿瘤组织，未经激活时无细胞毒性，一旦被超声波激活即可导致肿瘤细胞的损伤。理论上，SDT由于其独特的优势而成为疾病治疗的一种有前途的替代方案，相对于传统手术和放射疗法具有非侵入性，对病理部位的高选择性和低的全身毒性。与PDT相比，SDT可用于治疗深部和较不易接近的病变，因为它具有利用超声穿透深部组织的能力。最近的体内外实验研究表明，衍生自天然产物的超声敏化剂为治疗各种疾病(包括癌症，微生物感染和炎症)提供了有效的声动力学活性，常见声敏剂有原卟啉(Protoporphyrin，PpIX)，血卟啉(Hematoporphyrin)，ATX-70以及ICG。尽管过去几十年已经取得了一些进展，但是许多天然超声敏化剂仍有许多局限性。迄今为止开发的大多数超声敏剂也用作光敏剂，这意味着这种超声敏化剂在PDT中的皮肤敏感性和潜在的光毒性仍有待克服。此外，天然超声敏化剂的不良药代动力学特征构成了一个重要的但通常被忽视的性质：这些试剂通常在水中溶解性较低并且迅速从体内排出，因此显着降低它们暴露于病理部位，由于其不加选择的生物分布，只有极少部分的超声敏化剂可以到达目标位点，所得的细胞内浓度超声敏化剂可能不足以产生强效治疗效果。随着声动力疗法的发展和成熟，研发抗肿瘤效果好、毒副反应小的新型声敏剂成为研究的热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有声敏剂溶解性低和毒副反应大的缺陷和不足，提供一种聚氨基酸声敏剂，利用具有优秀生物相容性、稳定性和易修饰性的聚天冬氨酸材料修饰声敏剂原卟啉制备得到一种高效、低毒的聚氨基酸声敏剂。
本发明的另一目的在于提供一种聚氨基酸声敏剂的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种声敏剂纳米囊泡。
本发明的另一目的在于提供一种靶向修饰的声敏剂纳米囊泡。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种聚氨基酸声敏剂，所述聚氨基酸声敏剂的结构式为：
其中a为30～50的整数，b为7～11的整数1，n为35～80的整数。
在众多氨基酸中，天冬氨酸(Aspartate Acid)具有α-手性中心以及多种官能团，无论是自身均聚还是与其他氨基酸共聚，都保留着部分活性基团，因此具有结构可控、易于修饰的优点，可以制备成具有优秀生物相容性、稳定性和易与修饰的聚天冬氨酸材料。本发明在聚天冬氨酸材料的基础上，进一步修饰上具有声敏剂作用的原卟啉(PpIX)，制备出新型的聚氨基酸声敏剂，该声敏剂比卟啉具有更高的溶解性，及源自聚氨基酸的优越生物相容性，具有极大的应用潜力。
该声敏剂材料能够有效的发挥天冬氨酸在酸性环境下的强质子缓冲能力，帮助自身有效逃离溶酶体从而大大提高细胞摄取，同时，聚天冬氨酸主链引入聚乙二醇链段后，提高疏水性原卟啉结合后的声敏剂的溶解性，天冬氨酸单体接枝原卟啉使其具有声敏剂特性，在低频超声下可以触发声动力治疗。
本发明的聚氨基酸声敏剂为紫红色粉末状。
一种聚氨基酸声敏剂的制备方法，包括如下步骤：
S1.制备两亲性聚氨基酸：将二乙烯三胺溶液滴加至聚天冬氨酸苄酯溶液中进行胺解反应，加入酸中和透析纯化，得到聚天冬氨酸胺解产物，胺解反应温度为25～45℃，反应时间为6～12h；
S2.合成聚氨基酸声敏剂：将S1制备的聚天冬氨酸胺解产物溶于水中、原卟啉溶于二甲基亚砜中、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜中，充分混合上述溶液，采用双相反应法避光反应12h，透析纯化得到权利要求1所述聚氨基酸声敏剂，其中聚天冬氨酸胺解产物、原卟啉、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的投料摩尔比为：10：1～5：1.1～10：1.1～10。
优选地，二乙烯三胺溶液的滴加速度为1ml/min。
聚天冬氨酸苄酯溶液为将聚天冬氨酸苄酯溶解于N-甲基吡咯烷酮NMP中制备得到，二乙烯三胺(DET)溶液为通过将DET溶解于N-甲基吡咯烷酮NMP中制备得到。
本发明的制备方法通过二乙烯三胺(DET)对聚天冬氨酸苄酯进行胺解反应制备两亲性聚氨基酸PAsp(DET)，最后在天冬氨酸单体内接枝原卟啉制备出新型的聚天冬氨酸声敏剂材料PAsp(det)-PpIX。
优选地，S1中所述聚天冬氨酸苄酯的制备方法为：将天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐与引发剂混合，开环聚合反应得到聚天冬氨酸苄酯，所述引发剂为含伯胺基团的聚乙二醇，反应时间为72～96h，反应温度为15～35℃。
开环聚合反应的引发剂包括伯胺基团聚乙二醇2000、聚乙二醇5000(H2N-PEG-OCH3)等引发剂。
优选地，S1中所述中和用酸为1mol/L的盐酸，透析纯化操作为：采用3500Da的透析袋，在0.01mol/L的盐酸溶液中透析20～24h，再在超纯水中透析40～48h，冻干得到产物。
优选地，S2中所述的透析纯化操作为：采用3500Da的透析袋，在二甲基亚砜中透析10～12h，再在超纯水中透析40～48h，冻干得到产物。
一种声敏剂纳米囊泡，所述声敏剂纳米囊泡由权利要求1所述聚氨基酸声敏剂包载全氟的液碳化合物制备得到。
优选地，所述纳米囊泡粒径大小为378.3～429.7nm，此粒径下囊泡能有较好的稳定性和肿瘤内被动富集效果，表面电位为+30～+45mV。
优选地，所述包载方法为：将聚氨基酸声敏剂完全溶解于pH值为8～10的去离子水中，冰浴条件下加入全氟液碳化合物，超声得到声敏剂纳米囊泡。
超声条件为：20％～25％振幅,1～3s开,1～3s关，超声90～240s。
由于PFP具有疏水疏油的性质，会自发聚集在聚合物溶液底部形成液滴，而在超声细胞破碎仪的作用下，克服两相液体之间的界面能，使两种互不相容液体混合均匀形成分散体系呈白色乳状液
利用其与液态氟碳乳化成微泡可以有效液气相转变以此提高细胞对声敏剂载体的摄取。超声具有安全、无痛、便携以及价格低廉等优点，是外源性刺激中最具潜力的方式之一。纳米声敏剂依靠与超声造影剂乳化和接枝上的原卟啉而发挥作用，首先利用全氟液碳化合物如全氟正戊烷(PFP)、全氟己烷(PFH)与声敏剂载体乳化从而制备出一种液气相转换型声敏剂囊泡组合物，其作为微泡前体不仅粒径小、循环时间长，并且能够在超声触发下发生液气转换，增强局部超声显影，并通过超声的空化作用和声孔效应提高细胞摄取率；其次，作为常用的人造血材料，全氟液碳化合物具有极好的载氧能力，能够在体内循环期间结合氧气，在超声触发下将氧气释放出来，此时接枝在天冬氨酸单体上的原卟啉在超声作用下，发挥声动力效果，氧气的释放可以进一步提高声动力诱导细胞凋亡的效果。
优选地，所述全氟液碳化合物为全氟正戊烷和/或全氟己烷。
一种靶向修饰的声敏剂纳米囊泡，由如下方法制备得到：在权利要求7～9任意一项所述声敏剂纳米囊泡的表面通过共混孵育靶向修饰小分子特异性抗体或者配体制备得到，其中所述小分子特异性抗体或者配体包括RGD、AHNP、叶酸、透明质酸的一种或多种。
通过共混的方式将一定比例的聚谷氨酸接枝聚乙二醇(PGA-g-PEG)与等体积的声敏剂纳米囊泡(PFP-NDs)孵育，可进行表面修饰以此提高该声敏剂纳米囊泡的稳定性，共混的的PGA-g-PEG可通过目标靶向部位的不同，经氨基与羧基缩合反应或者巯基与酰胺键反应等进行化学链接，合成具有靶向基团(RGD、FA、AHNP等)的PGA-g-PEG修饰链。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种聚氨基酸声敏剂，声敏剂的主链结构为接枝了原卟啉的天冬氨酸，具有良好的生物相容性，聚合物溶解性由疏水向亲水转变，极大地提高了阳离子天冬氨酸的溶解性，增加了到达目标位点的含量，细胞内声敏剂浓度足以产生强效治疗效果，达到高效、安全的治疗效果。本发明还提供了一种声敏剂纳米囊泡及其修饰的靶向修饰的声敏剂纳米囊泡，通过和超声触发液气转换的全氟液碳化合物乳化制备成为一系列新型的高效、低毒的聚氨基酸声敏剂纳米囊泡，为发展安全、高效的声动力治疗提供性能有优良的新型声敏剂材料，并通过在其表面修饰RGD、AHNP、叶酸和透明质酸等小分子特异性抗体或者配体，提高其在靶向部位的聚集。
附图说明
图1为合成的聚合物声敏剂的示意图。
图2为实例1合成PEG-PAsp(DET)的核磁共振氢谱图。
图3为实例1合成PEG-PAsp(DET)-PpIX的核磁共振氢谱图。
图4为实例1合成PEG-PAsp(DET)、PpIX和PEG-PAsp(DET)-PpIX在相同浓度下的吸光度。
图5为实例1合成PEG-PAsp(DET)-PpIX的红外光谱图。
图6为实例2制备声敏剂纳米囊泡的TEM电镜图。
图7为实例2制备的声敏剂纳米囊泡粒径分布图。
图8为声敏剂纳米囊泡在表面修饰PGA-g-PEG-RGD后，在非超声与超声条件下的CT26细胞毒性图。
图9为实例2制备的声敏剂纳米囊泡体外单线态氧生成检测，用DPBF试剂的吸光度表征。
图10为实例2制备的声敏剂纳米囊泡体外氧气释放对比水的释放曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
一种聚氨基酸声敏剂，结构式如下：
合成途径如图1所示，由如下方法制备得到：
S1.制备两亲性聚氨基酸：称取150mg聚天冬氨酸苄酯PEG-PBLA溶于5mLNMP，吸取737.25uL二乙烯三胺(DET)溶于5mL NMP中，之后将DET溶液缓慢滴加至PBLA溶液中，在室温下搅拌反应6h；反应6h后，在冰浴条件下向反应溶液中滴加6.85mL HCl(1M)溶液，冰浴中和1h后收集至3500D透析袋，在0.01M HCl溶液中透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到淡黄色粉末状产物PEG-PAsp(DET)；
S2.合成聚氨基酸声敏剂PEG-PAsp(DET)-PpIX：称取PEG-PAsp(DET)68mg溶于1.5ml纯水中，PpIX称取8mg溶于1ml二甲基亚砜(DMSO),分别称取EDC，NHS 5.7mg和3.45mg溶于500ul DMSO。避光室温反应12h，之后用3500Da透析袋先在DMSO透析一天，后在纯水里透析一天，冻干后得到紫红色粉末状产物，其中聚天冬氨酸胺解产物、原卟啉、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的投料摩尔比为：10：1～5：1.1～10：1.1～10。
其中聚天冬氨酸苄酯PEG-PBLA的制备方法为：称取500mg BLA-NCA于反应瓶中，加入无水的DMF 2mL，搅拌使其溶解，再称取40mg聚乙二醇(PEG-NH2)于1.5mL EP管中，用1mLDMF溶解PEG-NH2后加入至BLA-NCA反应溶液中，并再用2mL DMF(分两次)清洗EP管中残留的PEG-NH2加入至反应溶液；先抽真空，再通入氮气，在氮气保护下加入除水的DCM，常温下反应3天，溶液逐渐由淡黄变橙黄；反应结束收集溶液至3500D透析袋，在DMSO溶液中避光透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到白色粉末状产物(PEG-PBLA)，聚合度为42.65，且相对分子质量为10795～13795D。
其中，制备得到的聚氨基酸声敏剂PEG-PAsp(DET)-PpIX的核磁共振氢谱图如图3所示，PEG-PAsp(DET)-PpIX的红外光谱图如图5所示，S1中的两亲性聚氨基酸PEG-PAsp(DET)的核磁共振氢谱图如图2所示。
图4为合成PEG-PAsp(DET)、PpIX和PEG-PAsp(DET)-PpIX在相同浓度下的吸光度。通过特征峰可以证明天然声敏剂PpIX成功连接到PAsp(DET)上。
实施例2
一种声敏剂纳米囊泡，由如下方法制备得到：称取5mg实施例1制备的聚合物PEG-PAsp(DET)-PpIX溶于1mL去离子水(聚合物浓度为5mg/mL)，涡旋振荡使聚合物完全溶解后将溶液置于冰浴上冷却5min，然后快速移取60uL全氟正戊烷PFP至预冷的聚合物溶液，利用超声波细胞破碎仪对预冷的溶液进行探头超声后得到负载PFP的液气转换型声敏剂纳米囊泡PFP-NDs。
制备得到的声敏剂纳米囊泡PFP-NDs的TEM电镜图如图6所示，粒径分布图如图7所示，通过动态光散射DLS检测可知这种乳化法制备的声敏剂纳米囊泡粒径分布均一，粒径大小为380～423nm，表面电位为30～45mV。
图9为制备的声敏剂纳米囊泡体外单线态氧生成检测结果，用DPBF试剂的吸光度表征。DPBF吸光度的衰减表示所制备的声敏剂具有生成单线态氧的能力。
图10为制备的声敏剂纳米囊泡体外氧气释放对比水的释放曲线。可见声敏剂与全氟碳液滴乳化后，能有较好的氧气携载和释放能力，可以进一步提高声动力效果。
实施例3
一种靶向修饰的声敏剂纳米囊泡，由如下方法制备得到：
聚天冬氨酸苄酯(PEG-PBLA)的合成制备：
称取500mg BLA-NCA于反应瓶中，加入已经除水的DMF 4mL，搅拌使其溶解，再称取25mg聚乙二醇(PEG-NH2)用1mL DMF溶解PEG-NH2后加入至BLA-NCA反应溶液中；先抽真空，再通入氮气，反复三次后在氮气保护下加入无水DCM，常温下反应3天，溶液逐渐由淡黄变橙黄；反应结束收集溶液至3500D透析袋，在DMSO溶液中避光透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到白色粉末状产物(PEG-PBLA)；
胺解产物PEG-PAsp(DET)的合成：
称取100mg PEG-PBLA溶于5mL NMP，吸取625uL二乙烯三胺(DET)溶于5mL NMP中，之后将DET溶液缓慢滴加至PBLA溶液中，在冰浴条件下搅拌反应6h；反应6h后，向反应溶液中滴加6.85mL HCl(1M)溶液，冰浴中将溶液PH中和至7.2-7.4，1h后收集溶液至3500D透析袋，先在0.01M HCl溶液中透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到淡黄色粉末状产物PEG-PAsp(DET)；
合成声敏剂载体PEG-PAsp(DET)-PpIX，结构式如下：
称取PEG-PAsp(DET)68mg溶于1.5ml纯水中，PpIX称取8mg溶于1ml二甲基亚砜(DMSO),分别称取EDC，NHS 5.7mg和3.45mg溶于500ul DMSO。避光室温反应12h，之后用3500Da透析袋先在DMSO透析一天，后在纯水里透析一天，冻干后得到紫红色粉末状产物；
包载全氟正戊烷声敏剂纳米囊泡的制备：称取6mg聚合物PEG-PAsp(DET)溶于1mL去离子水(聚合物浓度为6mg/mL)，涡旋振荡使聚合物完全溶解后将溶液置于冰浴上冷却5min，然后快速移取30uL全氟正戊烷PFP至预冷的聚合物溶液，利用超声波细胞破碎仪对预冷的溶液进行探头超声(25％amplitude，3s power on，3s power off，90s)后得到负载PFP的液气转换型声敏剂纳米囊泡；
PGA-g-PEG-RGD的制备：称取40mgγ-PGA，按照其侧链羧基摩尔数的10％称取Mal-PEG-NH2，将其共同溶解在PBS中，按照摩尔比1:1.1:1.1(PEG:EDC:NHS)称取EDC和NHS，加入上述溶解液，室温下反应过夜，将产物转移至7000D透析袋，纯水中透析1～2天；按照摩尔比1:2(PEG:RGD)投入RGD多肽，常温下反映过夜，结束反应后，将产物转移至3500D透析袋在纯水中透析1～2天，冻干，得到白色粉末状产物PGA-g-PEG-RGD。称取10mgPGA-g-PEG-RGD溶解于2mL去离子水中备用；
经靶向修饰的声敏剂纳米囊泡的制备：取31.8μL(4)中制备的负载PFP的液气转换型声敏剂纳米囊泡PFP-NDs，用去离子水分别将其稀释至体积为300μL，取89.5μL上述制备的5mg/mL的PGA-g-PEG-RGD溶液，用去离子水将其稀释至体积为600μL，与PFP-NDs共混，置于4℃冰箱中共孵育30min，得经靶向修饰的声敏剂纳米囊泡PFP-BNDs。
图8为声敏剂纳米囊泡在表面修饰PGA-g-PEG-RGD后，在非超声与超声条件下的CT26细胞毒性图。通过流式细胞实验可知，聚氨基酸声敏剂PEG-PAsp(DET)-PpIX包载PFP形成声敏剂纳米囊泡具有一定的摄取效率的提高；并且在细胞毒性结果显示，不同浓度的声敏剂聚合物PEG-PAsp(DET)-PpIX制备的空白纳米囊泡具有较好的生物相容性。
实施例4
一种声敏剂纳米囊泡，由如下方法制备得到：
聚天冬氨酸苄酯(PEG-PBLA)的合成制备：称取500mg BLA-NCA于反应瓶中，加入已经除水的DMF 4mL，搅拌使其溶解，再称取25mg聚乙二醇5000(PEG5K-NH2)用1mL DMF溶解PEG5K-NH2后加入至BLA-NCA反应溶液中；先抽真空，再通入氮气，反复三次后在氮气保护下加入无水DCM，常温下反应3天，溶液逐渐由淡黄变橙黄；反应结束收集溶液至3500D透析袋，在DMSO溶液中避光透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到白色粉末状产物(PEG5K-PBLA)；
胺解产物PEG-PAsp(DET)的合成：称取100mg PEG5K-PBLA溶于5mL NMP，吸取625uL二乙烯三胺(DET)溶于5mL NMP中，之后将DET溶液缓慢滴加至PBLA溶液中，在冰浴条件下搅拌反应6h；反应6h后，向反应溶液中滴加6.85mL HCl(1M)溶液，冰浴中将溶液PH中和至7.2-7.4，1h后收集溶液至3500D透析袋，先在0.01M HCl溶液中透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到淡黄色粉末状产物PEG5K-PAsp(DET)；
合成声敏剂载体PEG5K-PAsp(DET)-PpIX：
称取PEG5K-PAsp(DET)68mg溶于1.5ml纯水中，PpIX称取8mg溶于1ml二甲基亚砜(DMSO),分别称取EDC，NHS 5.7mg和3.45mg溶于500ul DMSO。避光室温反应12h，之后用3500Da透析袋先在DMSO透析一天，后在纯水里透析一天，冻干后得到紫红色粉末状产物；
包载全氟正戊烷声敏剂纳米囊泡的制备：称取6mg聚合物PEG5K-PAsp(DET)溶于1mL去离子水(聚合物浓度为6mg/mL)，涡旋振荡使聚合物完全溶解后将溶液置于冰浴上冷却5min，然后快速移取30uL全氟正戊烷PFP至预冷的聚合物溶液，利用超声波细胞破碎仪对预冷的溶液进行探头超声后得到负载PFP的液气转换型声敏剂纳米囊泡
实施例5
一种声敏剂纳米囊泡，由如下方法制备得到：
聚天冬氨酸苄酯(PEG-PBLA)的合成制备：称取500mg BLA-NCA于反应瓶中，加入已经除水的DMF 4mL，搅拌使其溶解，再称取40mg聚乙二醇(PEG-NH2)用1mL DMF溶解PEG-NH2后加入至BLA-NCA反应溶液中；先抽真空，再通入氮气，反复三次后在氮气保护下加入无水DCM，常温下反应3天，溶液逐渐由淡黄变橙黄；反应结束收集溶液至3500D透析袋，在DMSO溶液中避光透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到白色粉末状产物(PEG-PBLA)；
胺解产物PEG-PAsp(DET)的合成：称取100mg PEG-PBLA溶于5mL NMP，吸取625uL二乙烯三胺(DET)溶于5mL NMP中，之后将DET溶液缓慢滴加至PBLA溶液中，在冰浴条件下搅拌反应6h；反应6h后，向反应溶液中滴加6.85mL HCl(1M)溶液，冰浴中将溶液PH中和至7.2-7.4，1h后收集溶液至3500D透析袋，先在0.01M HCl溶液中透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到淡黄色粉末状产物PEG-PAsp(DET)；
合成声敏剂载体PEG-PAsp(DET)-PpIX：
称取PEG-PAsp(DET)68mg溶于1.5ml纯水中，PpIX称取8mg溶于1ml二甲基亚砜(DMSO),分别称取EDC，NHS 5.7mg和3.45mg溶于500ul DMSO。避光室温反应12h，之后用3500Da透析袋先在DMSO透析一天，后在纯水里透析一天，冻干后得到紫红色粉末状产物；
包载全氟正己烷声敏剂纳米囊泡的制备：称取5mg聚合物PEG-PAsp(DET)溶于1mL去离子水(聚合物浓度为5mg/mL)，涡旋振荡使聚合物完全溶解后将溶液置于冰浴上冷却5min，然后快速移取30uL全氟正己烷PFH至预冷的聚合物溶液，利用超声波细胞破碎仪对预冷的溶液进行探头超声后得到负载PFP的液气转换型声敏剂纳米囊泡。
实施例6应用实施例
一种声敏剂纳米囊泡，由如下方法制备得到：
聚天冬氨酸苄酯(PEG-PBLA)的合成制备：称取500mg BLA-NCA于反应瓶中，加入已经除水的DMF 4mL，搅拌使其溶解，再称取40mg聚乙二醇(PEG-NH2)用1mL DMF溶解PEG-NH2后加入至BLA-NCA反应溶液中；先抽真空，再通入氮气，反复三次后在氮气保护下加入无水DCM，常温下反应3天，溶液逐渐由淡黄变橙黄；反应结束收集溶液至3500D透析袋，在DMSO溶液中避光透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到白色粉末状产物(PEG-PBLA)；
胺解产物PEG-PAsp(DET)的合成：称取100mg PEG-PBLA溶于5mL NMP，吸取625uL二乙烯三胺(DET)溶于5mL NMP中，之后将DET溶液缓慢滴加至PBLA溶液中，在冰浴条件下搅拌反应6h；反应6h后，向反应溶液中滴加6.85mL HCl(1M)溶液，冰浴中将溶液PH中和至7.2-7.4，1h后收集溶液至3500D透析袋，先在0.01M HCl溶液中透析1天，再在超纯水中透析1～2天并冻干，得到淡黄色粉末状产物PEG-PAsp(DET)；
合成声敏剂载体PEG-PAsp(DET)-PpIX：
称取PEG-PAsp(DET)68mg溶于1.5ml纯水中，PpIX称取8mg溶于1ml二甲基亚砜(DMSO),分别称取EDC，NHS 5.7mg和3.45mg溶于500ul DMSO。避光室温反应12h，之后用3500Da透析袋先在DMSO透析一天，后在纯水里透析一天，冻干后得到紫红色粉末状产物；
包载全氟正己烷声敏剂纳米囊泡的制备：称取5mg聚合物PEG-PAsp(DET)溶于1mL去离子水(聚合物浓度为5mg/mL)，涡旋振荡使聚合物完全溶解后将溶液置于冰浴上冷却5min，然后快速移取30uL全氟正己烷PFH至预冷的聚合物溶液，利用超声波细胞破碎仪对预冷的溶液进行探头超声后得到负载PFP的液气转换型声敏剂纳米囊泡。
通过细胞毒性实验验证声动力效果：以每孔3*106/mL的密度将CT26细胞铺到96孔板内，过夜培养至细胞贴壁，之后将声敏剂囊泡按梯度浓度加入CT26细胞中，24h后施以低频超声(1-3MHz，1.0-3.0w/cm220-50％duty cycle)，再过24h加入MTT试剂测量570nm处吸光度。结果如图8，可见在合适浓度下，超声处理大大提高了囊泡对肿瘤细胞生长的抑制作用，证明该新型声敏剂的治疗效果。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种聚氨基酸声敏剂，其特征在于，所述聚氨基酸声敏剂的结构式为：
其中a为30~50的整数，b为7~11的整数1，n为35~80的整数。
2.一种聚氨基酸声敏剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 制备两亲性聚氨基酸：将二乙烯三胺溶液滴加至聚天冬氨酸苄酯溶液中进行胺解反应，加入酸中和透析纯化，得到聚天冬氨酸胺解产物，胺解反应温度为 25~45 ℃，反应时间为6~12h；
S2. 合成聚氨基酸声敏剂：将S1制备的聚天冬氨酸胺解产物溶于水中、原卟啉溶于能与水互溶的有机溶剂中（如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺）、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于与原卟啉相同有机溶剂中，充分混合上述溶液，采用双相反应法避光反应8~20h，透析纯化得到权利要求1所述聚氨基酸声敏剂，其中聚天冬氨酸胺解产物、原卟啉、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的投料摩尔比为：10：1~5 ：1.1~10 ：1.1~10。
3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，S1中所述聚天冬氨酸苄酯的制备方法为：将天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐与引发剂混合，开环聚合反应得到聚天冬氨酸苄酯，所述引发剂为含伯胺基团的聚乙二醇，反应时间为72~96h，反应温度为15~35℃。
4.如权利要求2所述制备方法，其中在于，S1中所述中和用酸为1mol/L的盐酸，透析纯化操作为：采用3500Da的透析袋，在0.01mol/L的盐酸溶液中透析20~24h，再在超纯水中透析40~48h，冻干得到产物。
5.如权利要求2所述制备方法，其中在于，S2中所述透析纯化操作为：采用3500Da的透析袋，在二甲基亚砜中透析10~12h，再在超纯水中透析40~48h，冻干得到产物。
6.一种声敏剂纳米囊泡，其特征在于，所述声敏剂纳米囊泡由权利要求1所述聚氨基酸声敏剂包载全氟的液碳化合物制备得到。
7.如权利要求6所述声敏剂纳米囊泡，其特征在于，所述纳米囊泡粒径大小为378.3~429.7nm，表面电位为30~45 mV。
8.如权利要求6所述声敏剂纳米囊泡，其特征在于，所述包载方法为：将聚氨基酸声敏剂完全溶解于pH值为8~10的去离子水中，冰浴条件下加入全氟液碳化合物，超声得到声敏剂纳米囊泡。
9.如权利要求8所述声敏剂纳米囊泡，其特征在于，所述全氟液碳化合物为全氟正戊烷和/或全氟己烷。
10.种靶向修饰的声敏剂纳米囊泡，其特征在于，由如下方法制备得到：在权利要求7~9任意一项所述声敏剂纳米囊泡的表面通过共混孵育靶向修饰小分子特异性抗体或者配体制备得到，其中所述小分子特异性抗体或者配体包括RGD、AHNP、叶酸、透明质酸的一种或多种。
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