CN115028754A - 硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了硫酸化猴头菌子实体β‑葡聚糖、硫酸化β‑葡聚糖‑壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用，属于纳米材料技术领域。本发明提供的硫酸化猴头菌子实体β‑葡聚糖(DS)的水溶性高，DS中的硫酸基团与壳聚糖(CS)中的氨基之间具有静电相互作用，DS中羟基与CS中氨基形成氢键，使CS能很好的结合在DS上，形成纳米级颗粒，该纳米颗粒的水溶性高、分散性好、稳定性高，易被细胞吸收利用，从而显著提高了大分子猴头菌β‑葡聚糖的生物利用率，使其发挥更多的生物学功能，在制备药物递送载体时能够发挥载体和药物的双重效果；同时，硫酸化β‑葡聚糖‑壳聚糖纳米颗粒具有很高的抗炎活性，在制备抗炎药物方面具有很好的应用前景。

Description

硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米 颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，具体涉及硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
天然多糖具有较高的生物安全性、生物可降解性和良好的控释效果，是常用于递药系统的功能性载体，为药物的精准递送及可控释放提供了可行途径。这主要基于：(1)天然多糖的生物安全性高、控释效果好；(2)多糖是一种高分子化合物，可以通过共价键或非共价键与药物结合形成纳米复合物，从而发挥纳米效应；(3)多糖含有丰富的活性基团，易于根据实际需求化学修饰、改善性质，以更好地满足纳米给药系统构建的要求。
猴头菌是著名的食药两用菌，具有保肝护胃、降血糖、保护神经、增强人体免疫力、抗癌、抗氧化等功效，可治疗神经衰弱、胃炎及胃溃疡等，具有很高的食用和药用价值。猴头菌β-葡聚糖是猴头菌子实体中提取出的一种大分子活性多糖，可诱导淋巴细胞增殖，具有很强的免疫活性，其纯度高，具有药物开发的潜力。然而，虽然猴头菌β-葡聚糖具有很强的免疫生物活性，但是大分子猴头菌β-葡聚糖的水溶性差，难以进入细胞，限制了其生物活性的进一步发挥。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用，本发明提供的硫酸化猴头菌β子实体-葡聚糖和硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒的水溶性好，生物活性高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖，由猴头菌β-葡聚糖经硫酸化处理得到。
本发明提供了上述技术方案所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
将猴头菌β-葡聚糖、三氧化硫吡啶络合物和酰胺类溶剂混合，进行硫酸化处理，得到硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。
优选地，所述猴头菌β-葡聚糖与三氧化硫吡啶络合物的质量比为1：(3～6)。
优选地，所述硫酸化处理的温度为60～90℃，时间为1～3h。
本发明提供了一种硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒，包括硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖和自组装在所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖上的壳聚糖；所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖为上述技术方案所述的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖或上述技术方案所述制备方法制得的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。
优选地，所述硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒的粒径为90～360nm。
本发明提供了上述技术方案所述硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的水溶液与壳聚糖的酸性缓冲溶液混合，进行自组装，得到硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒。
优选地，所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的水溶液的浓度为0.5～2.5mg/mL；
所述壳聚糖的酸性缓冲溶液中壳聚糖的浓度为0.3～2.5mg/mL，酸性缓冲溶液的pH值为4～6；
所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖与壳聚糖的质量比为(3～7)：1。
优选地，所述自组装的时间为20～40min；所述自组装在搅拌条件下进行，所述搅拌的速度为200～1000r/min。
本发明还提供了上述技术方案所述的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、上述技术方案所述制备方法制得的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、上述技术方案所述的硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒或上述技术方案所述制备方法制得的的硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒制备药物递送载体或制备抗炎药物中的应用。
本发明提供了一种硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖，由猴头菌β-葡聚糖经硫酸化处理得到。本发明提供的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖中带负电荷的硫酸基团的存在，提高了猴头菌β-葡聚糖的极性，进而使得硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖具有很好的水溶性，容易以进入细胞，其生物活性高，在制备药物递送载体或制备抗炎药物中具有很好的应用前景。
本发明提供了上述技术方案所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：将猴头菌β-葡聚糖、三氧化硫吡啶络合物和酰胺类溶剂混合，进行硫酸化处理，得到硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。本发明提供的制备方法操作简单，生产成本低，适宜工业化生产。
本发明提供了一种硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒(记为DS-CS NPs)，包括硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖和自组装在所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖上的壳聚糖；所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖为上述技术方案所述的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖或上述技术方案所述制备方法制得的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。在本发明中，硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖中带负电荷的硫酸基团与壳聚糖中带正电荷的氨基之间的具有很强的静电相互作用，同时硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖中的羟基与壳聚糖中的氨基之间形成氢键，使得壳聚糖能够很好的结合在硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖上，形成纳米级的小颗粒，DS-CS NPs水溶性高、分散性好、稳定性高，易被细胞吸收利用，从而显著提高了大分子猴头菌β-葡聚糖的生物利用率，使其发挥更多的生物学功能，在制备药物递送载体时能够发挥载体和药物的双重效果；同时，DS-CS NPs具有很高的抗炎活性，在制备抗炎药物方面具有很好的应用前景。如实施例测试结果所示，本发明提供的DS-CS NPs的粒径小，PDI值＜0.25，说明DS-CS NPs的分散性好，不容易团聚，进而稳定性高；而且，DS-CS NPs具有较好的抗炎活性，能抑制LPS刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO的含量，150μg/ml浓度下抑制率达到49.75％，并具有浓度依赖性，活性优于猴头菌β-葡聚糖。
本发明提供了上述技术方案所述硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：将硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的水溶液与壳聚糖的酸性缓冲溶液混合，进行自组装，得到硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒。在酸性介质(酸性缓冲溶液)中，壳聚糖中的氨基带正电荷，通过与硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖中带负电荷的硫酸基团之间的静电相互作用发生自组装。本发明提供的制备方法操作简单，耗能低，生产成本低，适宜工业化生产。
附图说明
图1为猴头菌β-葡聚糖和硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的FT-IR谱图；
图2为猴头菌β-葡聚糖、硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、壳聚糖和硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒的FT-IR谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖，由猴头菌β-葡聚糖经硫酸化处理得到。在本发明中，所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的硫酸化度优选为1.59～1.74，更优选为1.69。
本发明提供了上述技术方案所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
将猴头菌β-葡聚糖、三氧化硫吡啶络合物和酰胺类溶剂混合，进行硫酸化处理，得到硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，所述猴头菌β-葡聚糖优选由猴头菌子实体分离得到，具体优选包括以下步骤：将猴头菌子实体与热水混合进行水提，将得到的水提液与醇混合进行醇沉，得到猴头菌β-葡聚糖。本发明直接从猴头菌子实体中分离猴头菌β-葡聚糖，原料来源广且稳定，不需要对菌种发酵菌丝体进行分离，能耗低，容易获得，成本低。
在本发明中，所述猴头菌子实体在使用前优选先进行干燥和粉碎，本发明对于所述干燥没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的干燥条件干燥至恒重即可。本发明对于所述粉碎没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的粉碎方式粉碎至粒径为60～100目即可。在本发明中，所述热水的温度优选为80～100℃，更优选为100℃；所述猴头菌子实体与热水的质量比优选为1：(15～25)，更优选为1:20。在本发明中，所述水提的次数优选为1～3次，更优选为2次，单次水提的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h；在本发明的具体实施例中，每次水提后优选过滤，将得到滤渣进行下一次提取，合并滤液，即为水提液。
所述提取后，本发明优选还包括浓缩，将所得浓缩液再与醇水溶液混合进出醇沉。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式浓缩至浓度约为1g/mL即可。
在本发明中，所述醇优选为乙醇。在本发明中，所述水提液与醇的混合液中醇的体积分数优选为20％。
在本发明中，所述醇沉的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；所述醇沉的时间优选为7～9h，更优选为8h；在本发明的具体实施例中，所述醇沉优选在冰箱中静置条件下进行。
完成所述醇沉后，本发明优选还包括将所得醇沉液进行固液分离，将所得固体产物进行醇洗后溶解于水中后干燥，得到猴头菌β-葡聚糖。本发明对于所述固液分离没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离，所述离心分离的速度优选为7000～8000r/min，更优选为8000r/min；所述离心分离的时间优选为15～25min，更优选为20min。在本发明中，所述醇洗优选为利用体积分数为20％的乙醇水溶液进行醇洗，所述醇洗的次数优选为2～4次，更优选为3次。本发明对于所述溶解用水的用量没有特殊限定，能够将固体产物完全溶解即可。在本发明中，所述干燥优选包括依次进行加热挥发醇和冻干，所述加热挥发醇的温度优选为80～100℃，更优选为100℃，本发明对于所述加热挥发醇的时间以没有醇味为准。在本发明中，所述冻干的温度优选为-60～-40℃，更优选为-50℃，本发明对于所述冻干的时间没有特殊限定，冻干至恒重即可。
在本发明中，所述猴头菌β-葡聚糖与三氧化硫吡啶络合物的质量比优选为1：(3～6)，更优选为1：(3.5～5.5)，进一步优选为1：(4～5)。
在本发明中，所述酰胺类溶剂优选包括无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。在本发明中，所述猴头菌β-葡聚糖的质量与酰胺类溶剂的体积之比优选为1g：40～60mL，更优选为1g：45～55mL，进一步优选为1g：50mL。
在本发明的具体实施例中，所述混合优选为：将猴头菌β-葡聚糖与酰胺类溶剂预混合，然后加入三氧化硫吡啶络合物进行再混合。在本发明中，所述预混合和再混合的温度独立地优选为60～90℃，更优选为70～80℃；所述预混合的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h；本发明对于所述再混合的时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述硫酸化处理的温度优选为60～90℃，更优选为65～85℃，进一步优选为70～80℃，所述硫酸化处理的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h。
所述硫酸化处理后，本发明还包括后处理，所述后处理优选包括：将所得硫酸化处理反应液与水混合后中和，将所得中和反应液进行醇沉后固液分离，将所得固体产物溶解于水中，离心分离，将所得上清液进行水透析，将所得透析液进行干燥，得到硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。在本发明中，所述猴头菌β-葡聚糖与水的质量比优选为1：(20～50)，更优选为1：(30～40)。在本发明中，所述中和用碱优选包括NaOH水溶液，所述NaOH水溶液的浓度优选为1～4mol/L，更优选为2～3mol/L。在本发明中，所述醇沉优选为在中和反应液中加入醇至醇的体积分数为70～90％(更优选为80％)进行醇沉；所述醇优选包括乙醇；所述醇沉的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；所述醇沉的时间优选为7～9h，更优选为8h。本发明对于所述固液分离没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离，所述离心分离的条件优选与前述离心分离条件相同，在此不再赘述。本发明对于所述溶解用水的体积没有特殊限定，溶解至固体不再减少即可。在本发明中，所述离心分离的条件优选与前述离心分离条件相同，在此不再赘述。在本发明中，所述水透析优选为蒸馏水透析；所述水透析用透析袋的截留量优选为1000～7000g/mol；所述水透析的温度优选为室温，所述水透析的时间优选为48～96h，更优选为50～80h。在本发明中，所述干燥优选为冻干，所述冻干的温度优选为-60℃～-40℃，更优选为-50℃；所述冻干的时间优选为3～5天，更优选为4天；所述冻干优选在冻干机内进行。
本发明提供了一种硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒，包括硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖和自组装在所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖上的壳聚糖；所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖为上述技术方案所述的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖或上述技术方案所述制备方法制得的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。在本发明中，所述硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒的粒径优选为90～360nm，更优选为100～200nm，更优选为105～160nm。
本发明提供了上述技术方案所述硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的水溶液与壳聚糖的酸性缓冲溶液混合，进行自组装，得到硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒。
在本发明中，所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的水溶液的浓度优选为0.5～2.5mg/mL，更优选为1～2mg/mL，进一步优选为1.5mg/mL。
在本发明中，所述壳聚糖的酸性缓冲溶液中壳聚糖的浓度优选为0.3～2.5mg/mL，更优选为0.5～2mg/mL，进一步优选为1～1.5mg/mL；所述酸性缓冲溶液的pH值优选为4～6，更优选为4～5.5，进一步优选为4～5；所述酸性缓冲溶液优选包括乙酸钠缓冲溶液；所述乙酸钠缓冲溶液的浓度优选为20～30mmol/L，更优选为22～28mmol/L，进一步优选为24～25mmol/L。在本发明中，所述壳聚糖的酸性缓冲溶液优选由壳聚糖溶解于酸性缓冲溶液中得到。
在本发明中，所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖与壳聚糖的质量比优选为(3～7)：1，更优选为(3.5～6.5)：1，进一步优选为(4～6)：1，最优选为5:1。
在本发明的具体实施例中，所述混合优选为在搅拌条件下将壳聚糖的酸性缓冲溶液滴加到硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的水溶液中，本发明对于所述滴加没有特殊限定，均速逐滴加入即可；所述搅拌的速度优选为200～1000r/min，更优选为300～800r/min，进一步优选为500～600r/min；所述混合的温度优选为室温。
在本发明中，所述自组装的温度优选为室温，所述自组装的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，进一步优选为30min；所述自组装优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的速度优选为200～1000r/min，更优选为300～800r/min，进一步优选为500～600r/min。在本发明中，硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖中的硫酸基团与壳聚糖中的氨基之间的静电相互作用以及硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖中的羟基与壳聚糖中的氨基之间的氢键作用实现自组装。
本发明还提供了上述技术方案所述的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、上述技术方案所述制备方法制得的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、上述技术方案所述硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒或上述技术方案所述制备方法制得的硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒制备药物递送载体或制备抗炎药物中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将干燥猴头菌子实体粉碎成小颗粒状，将粉碎后的猴头菌子实体粉与热水(100℃)以料液比1：20(g：mL)的比例置于热水中提取2h，过滤，得到滤液和滤渣，将滤渣再以料液比为1：20的比例置于热水中提取2h，过滤，将两次过滤得到的滤液合并，浓缩到1:1(v/v)，加入乙醇至乙醇体积分数为20％，置于4℃冰箱中静置醇沉8h，在8000r/min条件下离心分离20min，将所得固体产物20％(v/v)乙醇水溶液洗涤2次，然后置于蒸馏水中充分溶解，在100℃条件下水浴挥醇至无醇味，在-50℃条件下冻干4天，得到猴头菌β-葡聚糖(纯度为96.8％)。
将1g猴头菌β-葡聚糖置于二口瓶中，加入50ml无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，油浴70℃条件下加热，恒温搅拌1h，然后加入4.96g三氧化硫吡啶络合物，在70℃体条件下恒温反应2h，冷却至室温，加入35mL蒸馏水混合均匀，用3mol/LNaOH水溶液中和至中性，加入乙醇至乙醇体积分数为80％进行醇淀，在8000r/min条件下离心分离20min，将所得沉淀溶解于水中，在8000r/min条件下离心分离20min，在室温条件下使用截留量为3500g/mol的透析袋将所得上清液进行蒸馏水透析72h，将透析内液在-50℃条件下冻干3天，得到硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。
硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖结构表征：
硫酸化度：硫含量(S％)通过元素分析仪测定；硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的硫酸化程度按硫酸化度＝1.62×S％/(32-1.02×S％)进行计算，得到硫酸化度＝1.69。
傅里叶红外光谱(FTIR)分析：将2.0mg冻干样品放置于红外光谱仪指定位置直接扫描，光谱采集范围为500～4000cm-1，分辨率设置为4cm-1。图1为猴头菌β-葡聚糖和硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的FT-IR谱图。由图1可知，在猴头菌β-葡聚糖的红外谱图中，波数3314.77cm-1和2924.28cm-1的吸收带分别归属于猴头菌β-葡聚糖的羟基伸缩振动和C-H伸缩振动，波数1637.49cm-1附近出现的峰是由于羰基伸缩振动引起的，在波数1073.42cm-1附近出现较强的吸收峰是常见的吡喃糖环内酯和羟基的共振吸收峰，是由于糖环上C-O-O醚或酯键不对称伸缩振动，两者是葡聚糖特有光谱信号。此外，波数891.09cm-1附近出现的吸收峰是典型的吡喃糖和β-型糖苷键链接的特征吸收峰，这是β-葡聚糖的特征吸收。在硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖红外谱图中，1220.91cm-1处宽峰清楚地表明多糖中含有硫酸酯基，在800～850cm-1区域中有一至多个吸收峰，表明猴头菌β-葡聚糖中的硫酸基取代位较多。
实施例2
硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒(记为DS-CS NPs)的制备
将壳聚糖溶解于25mmol/L的乙酸钠缓冲溶液(pH为4)中，得到壳聚糖浓度为1mg/mL的壳聚糖乙酸钠缓冲溶液(CS溶液)。将硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖(DS)溶解于水中，得到浓度为1mg/mL的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖水溶液(DS溶液)。在400r/min磁力搅拌条件下，将CS溶液逐滴加入到DS溶液中，然后继续搅拌30min，得到DS-CS NPs乳光悬液。其中，硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖与壳聚糖的质量比分别为3：1、4:1、5：1、6：1和7：1。
DS-CS NPs的粒径、电位及聚合物分散系数(PDI)的测定：取1.5mL DS-CS NPs乳光悬液放入比色皿中，使用马尔文粒径仪测定其粒径、电位及PDI，测试结果如表1所示。
表1DS/CS质量比对DS-CS NPs粒径、电位和PDI的影响
Figure BDA0003722447410000091
Figure BDA0003722447410000101
由表1可知，硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖与壳聚糖质量比为(3～7)：1范围内可得到乳光悬液。当DS与CS质量比小于5：1时，DS-CS NPs的粒径随质量比增大而减小；当DS与CS质量比在(5～7)：1范围内时，DS-CS NPs的粒径随质量比增大而增大；DS与CS质量比为5：1时，DS-CS NPs的粒径最小。由于DS过量，所以纳米颗粒呈现负电位，电位绝对值随着质量比的增加而增大。DS-CS NPs的PDI值均小于0.2，表明本发明制备的DS-CS NPs具有单分散和均匀的特性。
DS-CS NPs的结构表征
傅里叶红外光谱(FT-IR)分析：将2.0mg冻干样品放置于红外光谱仪指定位置直接扫描，光谱采集范围为500～4000cm-1，分辨率设置为4cm-1。图2为猴头菌β-葡聚糖、硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、壳聚糖、实施例2制备的硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒(DS/CS质量比＝4:1)的FT-IR谱图。由图2可知，在猴头菌β-葡聚糖的红外谱图中，波数3314.77cm-1和2924.28cm-1的吸收带分别归属于猴头菌β-葡聚糖的羟基伸缩振动和C-H伸缩振动，波数1637.49cm-1附近出现的峰是由于羰基伸缩振动引起的，在波数1073.42cm-1附近出现较强的吸收峰是常见的吡喃糖环内酯和羟基的共振吸收峰，是由于糖环上C-O-O醚或酯键不对称伸缩振动，两者是葡聚糖特有光谱信号。此外，波数891.09cm-1附近出现的吸收峰是典型的吡喃糖和β-型糖苷键链接的特征吸收峰，这是β-葡聚糖的特征吸收。在硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖红外谱图中，波数1220.91cm-1处宽峰清楚地表明多糖中含有硫酸酯基，在波数800～850cm-1区域中有一至多个吸收峰，表明猴头菌β-葡聚糖中的硫酸基取代位较多。在壳聚糖的红外谱图中，在波数1590.91cm-1处观察到一个峰，这对应于酰胺Ⅱ弯曲振动。在DS-CS NPs的红外谱图中，对应酰胺Ⅱ弯曲振动的波数从1590.91cm-1转移到1567.88cm-1并且在硫酸盐伸缩振动中观察到相同的条件，峰从1220.91cm-1转移到1136.79cm-1，并且在3453.15cm-1处羟基带的吸收强度变弱，从FT-IR数据证实，DS-CS NPs是由于硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的硫酸基团和壳聚糖的氨基之间的静电相互作用以及硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的羟基与壳聚糖的氨基之间的氢键作用形成的。
实施例3
按照实施例2的方法制备DS-CS NPs乳光悬液，与实施例2的区别仅在于，硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖与壳聚糖的质量比为5：1，CS溶液中CS的浓度分别为0.3mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL和2.5mg/mL。DS-CS NPs的粒径、电位及PDI如表2所示。
表2壳聚糖浓度对DS-CS NPs粒径的影响
Figure BDA0003722447410000111
由表2可知，当壳聚糖的浓度在0.3～2.5mg/mL时，DS-CS NPs的平均粒径随CS浓度的增大而增大，壳聚糖浓度在此范围内，DS-CS NPs的电位为-36～-30V，电位变化不明显。DS-CS NPs的PDI值随壳聚糖浓度的增加呈现先减小后增大的趋势，DS-CS NPs的PDI值均小于0.2，表明本发明制备的DS-CS NPs具有单分散和均匀的特性。
实施例4
按照实施例2的方法制备DS-CS NPs乳光悬液，与实施例2的区别仅在于，硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖与壳聚糖的质量比为5：1，CS溶液中CS的浓度为1mg/mL，DS溶液中DS的浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL和2.5mg/mL。DS-CS NPs的粒径、电位及PDI如表3所示。
表3不同硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖浓度对DS-CS NPs粒径的影响
Figure BDA0003722447410000112
Figure BDA0003722447410000121
由表3可知，当硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的浓度为1.5mg/mL时，DS-CS NPs的平均粒径最小，当硫酸葡聚糖浓度大于1.5mg/mL时，DS-CS NPs的粒径是逐渐增大的，但当硫酸葡聚糖浓度增大到一定值时，粒径值在140nm处波动。硫酸葡聚糖浓度为1.5mg/mL时，DS-CS NPs的粒径最小，是比较适合制备纳米颗粒的浓度。DS-CS NPs的电位随硫酸葡聚糖浓度的变化不明显，当硫酸葡聚糖的浓度为0.5mg/mL时，电位绝对值小于30V，随着浓度的增大，电位基本在-32V上下波动。DS-CS NPs的PDI值随着硫酸葡聚糖浓度的增大逐渐减小，DS-CS NPs的PDI值均小于0.23，表明本发明制备的DS-CS NPs具有单分散和均匀的特性。
实施例5
按照实施例2的方法制备DS-CS NPs乳光悬液，与实施例2的区别仅在于，硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖与壳聚糖的质量比为5：1，CS溶液中CS的浓度为1mg/mL，DS溶液中DS的浓度为1mg/mL，搅拌速度分别为200r/min、400r/min、600r/min、800r/min和1000r/min。DS-CS NPs的粒径、电位及PDI如表4所示。
表4不同搅拌速度对DS-CS NPs粒径的影响
Figure BDA0003722447410000122
由表4可知，当磁力搅拌器的搅拌速度很低(如200r/min)时，制备的DS-CS NPs的粒径较大；随着搅拌速度的增加，其粒径相应降低；搅拌速度为600r/min时，粒径最小。DS-CS NPs的电位随搅拌速度的增大，电位绝对值先减小后增大，PDI值逐渐增大，DS-CS NPs的PDI值均小于0.22，表明本发明制备的DS-CS NPs具有单分散和均匀的特性。
实施例6
按照实施例2的方法制备DS-CS NPs乳光悬液，与实施例2的区别仅在于，硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖与壳聚糖的质量比为5：1，CS溶液中CS的浓度为1mg/mL，CS溶液的初始pH值分别为4、4.5、5、5.5、6和6.5，DS溶液中DS的浓度为1mg/mL，搅拌速度为400r/min。DS-CS NPs的粒径、电位及PDI如表5所示。
表5CS溶液初始pH值对DS-CS NPs粒径的影响
Figure BDA0003722447410000131
由表5可知，CS溶液的pH值在4.0～6.0时，DS-CS NPs的粒径先减小后增大。当pH值为6.5时，不能制备出具有纳米乳光的悬液，而是可观察到有沉淀析出。当pH值为4.5时，粒径最小，随着CS初始pH值的增大，DS-CS NPs的PDI值先增大后减小，但是其电位变化不明显，且DS-CS NPs的PDI值均小于0.14，表明本发明制备的DS-CS NPs具有单分散和均匀的特性。
测试例1
DS-CS纳米粒子的体外抗炎物活性
(1)DS-CS NPs体外抗炎实验的原理
巨噬细胞RAW264.7可在脂多糖(LPS)的刺激下释放多种因子，如一氧化氮(NO)，在炎症反应发展的过程中发挥重要作用，但NO的分泌量过高时会对细胞或组织产生副作用，从而导致了过度炎症反应的发生。
Griess试剂测定NO含量的原理：NO在体内或水溶液中极易氧化成NO2 2-和NO3 3-，NO3 3-可通过镉被还原为NO2 2-.NO2 2在碱性条件下和磺胺作用生成重氮化合物(重氮盐)再与N-1-萘基乙二胺盐酸进行偶联反应(保留氮反应)，生成有颜色的化合物。
(2)DS-CS NPs体外抗炎实验研究方法
称取一定量DS-CS NPs纳米颗粒于灭过菌的离心管中，在无菌条件下用PBS配成DS-CS NPs浓度为5mg/mL的DS-CS NPs PBS溶液，无菌操作台中经0.22μm的水相微孔膜过滤后再用PBS将样品稀释至250μg/ml、500μg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL(作用终浓度为25、50、100和150μg/mL)备用。
细胞培养：取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞株(购自上海中科院细胞所)，用DMEM完全培养基(购自Gibco公司)在37℃、含5％CO2条件下传代培养，用0.05％胰酶溶液消化，混悬液以1000r/min的转速离心3min后收集细胞，计数备用。
Griess试剂的配制：在烧杯中加入6.25mL H3PO3，加入蒸馏水250mL，分别加入2.5g的sulfanilamide(4-氨基苯磺酰胺，Sigma公司)和0.25g的naphthylethylenediaminedihydrochloride(盐酸萘乙二胺，Sigma公司)用磁力搅拌器至全部溶解，棕色试剂瓶于4℃冰箱中保存。
标准曲线绘制：配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35和40μmol/L；取100μL于96孔板孔，加入50μL Griess试剂，测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，根据吸光值绘制标准曲线。
NO释放量的测定:计算细胞个数，将RAW264.7细胞用无色1640培养液稀释成5×105个/mL的细胞悬液，每组160uL，37℃培养4-6h至细胞完全贴壁后，样品组加入20uL LPS(作用浓度0.5μg/mL)和20μL样品待测液(作用浓度25、50、100、150μg/mL)，LPS组每孔加入20uL LPS和20uL PBS，PBS组每孔加入40uL PBS，于37℃、含5％CO2条件下培养48h后吸取上清液100μL加入50uL Griess试剂，反应10min，测定NO释放量，并按照式(1)计算抑制率：
抑制率％＝(LPS组NO释放量-样品组NO释放量)/(LPS组NO释放量)×100％式(1)。
(3)结果与分析
样品对LPS刺激RAW264.7释放NO含量的影响如表6所示。
表6DS、DS-CS对LPS刺激RAW264.7释放NO的抑制率
Figure BDA0003722447410000141
由表6可知，相同浓度条件下，硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒能抑制LPS刺激RAW264.7释放NO，具有浓度依赖性，在作用浓度为150μg/mL时，对释放NO的抑制率达到49.74％，在作用浓度为25μg/mL时，抑制率达到7.33％，其抑制效果要高于硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖，高浓度下效果更加显著。说明，硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒具有较好的体外抗炎活性，也为猴头菌β-葡聚糖的应用提供了一个新思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖，由猴头菌子实体β-葡聚糖经硫酸化处理得到。
2.权利要求1所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
将猴头菌β-葡聚糖、三氧化硫吡啶络合物和酰胺类溶剂混合，进行硫酸化处理，得到硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述猴头菌β-葡聚糖与三氧化硫吡啶络合物的质量比为1：(3～6)。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸化处理的温度为60～90℃，时间为1～3h。
5.一种硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒，包括硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖和自组装在所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖上的壳聚糖；所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖为权利要求1所述的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖或权利要求2～4任一项所述制备方法制得的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖。
6.根据权利要求5所述的硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒，其特征在于，所述硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒的粒径为90～360nm。
7.权利要求5或6所述硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的水溶液与壳聚糖的酸性缓冲溶液混合，进行自组装，得到硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖的水溶液的浓度为0.5～2.5mg/mL；
所述壳聚糖的酸性缓冲溶液中壳聚糖的浓度为0.3～2.5mg/mL，酸性缓冲溶液的pH值为4～6；
所述硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖与壳聚糖的质量比为(3～7)：1。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述自组装的时间为20～40min；所述自组装在搅拌条件下进行，所述搅拌的速度为200～1000r/min。
10.权利要求1所述的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、权利要求2～4任一项所述制备方法制得的硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、权利要求5或6所述的硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒或权利要求7～9任一项所述制备方法制得的的硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒制备药物递送载体或制备抗炎药物中的应用。
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