CN103082090A

CN103082090A - 一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂及其制备方法

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Publication number: CN103082090A
Application number: CN2012103303736A
Authority: CN
Inventors: 张素琴; 罗永祥; 黎明; 张世敏; 康汇然; 许佳娟; 胡志鹏; 李林; 文少怀; 罗勇; 梁汉新; 唐青叶; 潘沼羽; 叶维民; 魏友岗; 康建南
Original assignee: HUNAN SUNACCORD BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HUNAN SUNACCORD BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-09-10
Filing date: 2012-09-10
Publication date: 2013-05-08

Abstract

本发明涉及饲料，特别是一种添加有草分枝杆菌Sq-1的饲料添加剂及其制备方法。该饲料添加剂为含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液，主要用于猪与禽。是一种无三致绿色饲料添加剂，添加剂量小，效果明显。具有增强动物免疫力，提高动物抗病能力，促进动物生长，提高饲料报酬的作用；在增加经济效益的同时，可以减少动物食品药物残留，提高动物食品质量。

Description

一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及饲料，特别是一种添加有草分枝杆菌Sq-1的饲料添加剂及其制备方法。

背景技术

“绿色、安全、环保”是养殖业发展的方向。为了降低饲养环境和频发的动物疾病带来的风险，在饲料中添加低于治疗剂量的抗生素，提高饲料转化率，降低动物的发病率起到一定的作用； (1)但抗生素的滥用引起动物内源性感染和多重感染；(2)畜禽对抗生素的依赖，抑制动物免疫系统的生长发育或降低了动物的免疫功能，动物的抗病力下降；(3)最终导致耐药菌株产生及动物食品中药物残留，严重阻碍着养殖业健康发展。

鉴于这些弊端，人们把目光转向天然药物研究，目前,主要有微生态制剂和中药保健制剂。中药因多年采挖，造成人类用中药已逐渐紧张，假如动物竞争用中药，势必加速中药资源枯竭。近20年，尽管中药多品种实施了种植，缓解了供求矛盾，但中药品质受地域、气候、土壤影响较大，种植中药质量是不是等同野生药材？值得深思。再者，中药有效成分提取能耗大，导致成本过高。目前，中草药饲料添加剂传统应用直接将中药打粉，用量大，动物吸收率低，因此，开发动物中药添加剂或中兽药保健任重道远。而微生态制剂近年来在饲料中应用取得了很好的效果。如：乳酸菌、双歧杆菌、芽孢杆菌得到很好的应用。研究推广绿色、环保型饲用微生物添加剂是确保畜禽产品质量、促进养殖业健康可持续发展、保障人民身体健康的重要途径。因此，筛选一种适用于畜牧养殖业、增强动物免疫力的微生物菌种及应用现代遗传工程技术与发酵工业技术制备的饲料添加剂迫在眉睫。

草分枝杆菌属于放线菌纲放线菌目分枝杆菌科，广泛分布于自然界，是一种对人与动物无三致、快生长的腐生菌,是一种宝贵的天然药物资源。草分枝杆菌是一种多功能免疫刺激剂，通过影响免疫应答刺激和激活人体免疫系统，具有直接的细胞毒以及诱导癌症细胞凋亡的作用。草分枝杆菌能抑制动物自发肿瘤、实验诱导肿瘤及移植肿瘤的生长、发展和扩散，是由于草分枝杆菌的抗原决定簇与恶性肿瘤细胞表面的抗原决定簇的相似性，而发生交叉反应的结果。因此，草分枝杆菌在医学领域广泛应用于结核、病毒和寄生虫等感染性疾病的治疗，近10年来，用途更加广泛，扩大用于恶性肿瘤、癌症、淋病的辅助治疗取得了较好的效果。但畜牧养殖与兽医领域不多见。

公告号为CN102206590A的发明专利“一种草分枝杆菌Sq-1及复合微生态制剂的制备方法”（申请号： CN201010572928.9）对该草分枝杆菌Sq-1及复合微生态制剂的制备方法进行了公布。所述的草分枝杆菌Sq-1(Mycobacterium plei Sq-1)，保藏号：CGMCC NO0916和枯草芽孢杆菌AS1.892(bacillus subtilis AS1.892)，此株菌在中国高等学校菌种目录中编号为CCTCC AB93177，分级培养，制作复合微生态制剂。生物材料样品的保藏信息为：分类命名：草分枝杆菌Mycobacterium phlei，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2003年4月1日，保藏编号：CGMCC NO.0916。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供一种含有草分枝杆菌Sq-1的饲料添加剂及其制备方法，它具有无残留，无耐药性，无致癌、致畸、致突变的效果。

本发明的目的是通过如下途径实现的：一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂，该饲料添加剂为含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液。

作为方案进一步的优化，所述的该饲料添加剂还包括辅料，构成固态的草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂，即含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液与辅料的组合物，所述的辅料为淀粉、糊精、玉米粉、玉米芯粉、麦麸、豆柏、米糠中任意一种或多种的组合。

作为方案进一步的优化，所述的饲料添加剂固态组合物按重量百分比，所述的含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液占5-10%，辅料占90-95%。

作为方案进一步的优化，所述的含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液中的草分枝杆菌Sq-1为10⁹个/ml。

作为方案进一步的优化，所述的该饲料添加剂为含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液与辅料的固态组合物中，草分枝杆菌Sq-1的含量为10⁹个/g。

作为方案进一步的优化，一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂的制备方法：

A.含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液的制备：

a.发酵：对草分枝杆菌Sq-1进行发酵，制得草分枝杆菌Sq-1及代谢产物；

b.灭活：发酵终止，升温至110℃，保温30分钟；

b.浓缩：灭菌终止，冷至60-70℃，进行膜分离浓缩，滤液分离至总体积的四分至三；

d.破壁：取上述分离剩下的菌液采用高压均质破壁，设置压力70±5Mpa，均质二次；

e.菌悬液配制：取均质液与分离得到的清液混合，搅拌20分钟；

f.取菌悬液，加适量纯化水，搅拌，配制成含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液，即液态的草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂；

B. 固态的草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂制备：

将上述液态草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液与辅料淀粉、糊精、玉米粉、玉米芯粉、麦麸、豆柏、米糠等任意一种或多种的组合进行混合、制粒、烘干，制成固态的草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂。

作为方案进一步的优化，所述b步骤中，选择膜孔0.22-0.45微米，膜面错流流速为每秒3-4米，平均膜通量大于200L/（m².h）进行膜分离浓缩。

本发明一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂及其制备方法，该饲料添加剂主要用于猪与禽。是一种无三致绿色饲料添加剂，在动物日粮中添加0.1—0.6%，最佳剂量：猪添加0.3%，鸡添加0.2%，添加剂量小，效果明显。具有增强动物免疫力，提高动物抗病能力，促进动物生长，提高饲料报酬的作用；在增加经济效益的同时，可以减少动物食品药物残留，提高动物食品质量。

本发明专利产品（以下称本专利技术）与CN201010572928.9专利（以下称现有技术）比较，存在以下区别：

一、成份：

1.现有技术：草分枝杆菌Sq-1菌体

2.本专利技术：含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液

含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液的成份分别为：

总黄酮：10.70-13.35mg/kg

VC：＜0.1 mg/kg

VE：＜0.4 mg/kg

类胡萝卜素：8.3-11.46 mg/kg

天冬氨酸ASP：23.86-30.4 mg/100ml

苏氨酸THR：15.2-18.7 mg/100ml

丝氨酸SER：21.0-28.1 mg/100ml

谷氨酸CLU：64.2-78.4 mg/100ml

甘氨酸CLY：45.1-60.1 mg/100ml

丙氨酸ALA：35.5-44.4 mg/100ml

胱氨酸CYS：1.9-2.4 mg/100ml

结氨酸VAL：24.0-30.3 mg/100ml

蛋氨酸MET：7.1-8.4 mg/100ml

异亮氨酸ILE：10.6-14.2 mg/100ml

亮氨酸LEU：22.6-30.1 mg/100ml

洛氨酸TYR：7.4-8.7 mg/100ml

苯丙氨酸PHE:15.4-19.3 mg/100ml

赖氨酸LYS：14.4-16.9 mg/100ml

组氨酸HIS：4.8-6.4 mg/100ml

精氨酸ARG：19.2-22.6 mg/100ml

脯氨酸PRO：27.4-36.5 mg/100ml

色氨酸TRP：3.1-4.0 mg/100ml

牛磺酸TAU：＜0.1 mg/100ml

γ-氨基丁酸G-ABA：3.2-3.8 mg/100ml

鸟氨酸OPN：1.1-1.3 mg/100ml

羟基脯氨酸HYPRO：19.3-24.1 mg/100ml。

二、工艺

1.现有技术：离心、洗涤、真空干燥。工艺时间长，能耗大。

2.本专利技术：膜分离。浓缩工艺时间短，能耗小。

三、产品质量

1.现有技术：被微生物污染机率大。受热时间长，受热不稳定的成分容易变性或分解。

2.本专利技术：被微生物污染机率小。受热时间短，热不稳定的成分稳定。

四、环保

1.现有技术：代谢产物不利用，造成废液量加大，增加环保压力

2.本专利技术：代谢产物利用，造成废液量明显减少，利于环保。

五、细胞

1.现有技术：完整，细胞壁是一层厚实、坚韧的外皮，要获得胞壁酰二肽(MDP)与分枝杆菌多糖(MPS)等佐剂活性片段难度较大。

2.本专利技术：破壁，细胞呈破碎状态；易获得细胞壁中的胞壁酰二肽(MDP)与分枝杆菌多糖(MPS) 等佐剂活性片段。

研究表明：胞壁酰二肽(MDP)是分支杆菌细胞壁中最有效的佐剂成分。MDP的基本结构是N一乙酰胞壁酸一L一丙氨酸一D一谷氨酰胺。MDP可刺激免疫细胞（如T细胞）的增殖，调节及活化单核巨噬细胞，吸引吞噬细胞，进一步增强吞噬细胞和淋巴细胞活性，使其易捕获抗原。分枝杆菌多糖(MPS)，其主要成分是从非致病性分枝杆菌中提取的阿拉伯-甘露聚糖。研究表明它除了有广泛的免疫调节作用外,还具有增加白细胞数量的效果。

具体实施方式

本发明一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂，该饲料添加剂可以液态，也可以是固态。

液态时，该饲料添加剂即为含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液，所述的含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液中的草分枝杆菌Sq-1为10⁹个/ml。

固态时，该饲料添加剂还包括辅料，即含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液与辅料的组合物，所述的辅料为淀粉、糊精、玉米粉、玉米芯粉、麦麸、豆柏、米糠中任意一种或多种的组合，所述的饲料添加剂固态组合物按重量百分比，所述的含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液占5-10%，辅料占90-95%。所述的该饲料添加剂为含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液与辅料的固态组合物中，草分枝杆菌Sq-1的含量为10⁹个/g。

所述的一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂的制备方法，其制备步骤如下：

A.含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液的制备：

b.灭活：发酵终止，升温至110℃，保温30分钟；

b.浓缩：灭菌终止，冷至60-70℃，选择膜孔0.22-0.45微米，膜面错流流速为每秒3-4米，平均膜通量大于200L/（m².h）进行膜分离浓缩，滤液分离至总体积的四分至三；

f.取菌悬液，加适量纯化水，搅拌。配制成含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液，即液态的草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂；

B. 固态的草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂制备：

实施例1.

1.1 试验材料

1.1.1试验动物及饲料

1.1.1.1试验用仔猪为杜长大（三元杂）。

1.1.1.2基础日粮：日粮设计参照NRC（1998）猪营养需要和中国断奶仔猪饲养标准。玉米、鱼粉、豆柏，麦麸，微量元素。购自湖南湘九阳饲料有限公司。

供试药品及试剂

1.1.2.1草分枝杆菌Sq-1菌悬液：为湖南圣雅凯生物科技有限公司研发生产。

1.1.2.2杆菌肽锌预混剂（15%）：天津新星兽药厂生产。

1.1.2.3饲用金霉素（15%）：内蒙金河生物科技有限公司生产。

试验方法

1.2.1 试验分组与处理

1.2.1.1 实验动物分组：将试验用仔猪三元杂（杜洛克、长白、大白）40头分成4个组，大小搭配均匀。

1.2.1.2 试验方式

采用单因素试验设计，将试验猪随机分为4组，具体分组处理方案如下：

a.不加药组：基础日粮

b.杆菌肽锌组：基础日粮+ 0.2%杆菌肽锌预混剂（15%）

c.金霉素组：基础日粮+0.2 %饲用金霉素（15%）

d.草分枝杆菌组：基础日粮+ 0.3 %草分枝杆菌

本试验以21日龄仔猪为实验对象，日粮设计参照NRC（1998）猪营养需要和中国断奶仔猪饲养标准。按上述分组分别饲喂。试验期30天。在试验期的开始时，对试验猪称重、打耳号，并进行同质性检验，个别调整使组间差异不显著(P>0.05)。

分组及剂量设定依据

在上述试验中设定了一个草分枝杆菌剂量和二个抗生素药物实验组，并设定了一个不用药对照，草分枝杆菌试验组剂量的设定依据是，参照前期初步预试设定了推荐剂量0.3%。

观察

试验期间，每天观察猪只的精神、食欲、活动、粪便情况，并做好记录。

试验结果：见表1。

表1： 不同处理对仔猪生长性能的影响

组别	平均只增重/g	增重相对增长率/%	料肉比	料肉比相对下降率/%
					不加药对照组	360		1.80
0.2%杆菌肽锌预混剂组	420	16.7	1.67	7.2
					0.2%饲用金霉素组	408	13.3	1.70	5.6
0.3 %草分枝杆菌组	446	23.9	1.55	13.9

结果说明: 0.3 %草分枝杆菌组、0.2%杆菌肽锌预混剂、和0.2%饲用金霉素组与不加药对照组比较，猪只日增重数据显示：草分枝杆菌d高于对照组a和实验组b、c。料肉比数据显示：草分枝杆菌组d低于对照组a和实验组b、c。说明了本发明添加剂具有促进猪只生长功能，具有可取代现有的抗生素动物饲料添加剂。

实施例2.

2.1 试验材料

2.1.1试验动物及饲料

2.1.1.1试验用仔猪为杜长大（三元杂）。

2.1.1.2基础日粮：日粮设计参照NRC（1998）猪营养需要和中国断奶仔猪饲养标准。玉米、鱼粉、豆柏，麦麸，微量元素。购自湖南湘九阳饲料有限公司。

供试药品及试剂

2.1.2.1含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液：为湖南圣雅凯生物科技有限公司研发生产。

2.1.2.2抗生素（15%）：天津新星兽药厂等企业生产。

试验方法

2.2.1 试验分组与处理

2.2.1.1 实验动物分组：将试验用仔猪三元杂（杜洛克、长白、大白）240头分成4个组，大小搭配均匀。

2.2.1.2 试验方式

采用单因素试验设计，将试验猪随机分为4组，具体分组方案如下：

抗生素对照组：基础日粮+0.2%抗生素（15%）

0.15%草分枝杆菌组：基础日粮+ 0.15%草分枝杆菌

0.3 %草分枝杆菌组：基础日粮+ 0.3 %草分枝杆菌

0.6 %草分枝杆菌组：基础日粮+ 0.6 %草分枝杆菌

本试验以25日龄仔猪为实验对象，日粮设计参照NRC（1998）猪营养需要和中国断奶仔猪饲养标准。按上述分组分别饲喂。试验期75天。在试验期的开始时，对试验猪称重、打耳号，并进行同质性检验，个别调整使组间差异不显著(P>0.05)。

分组及剂量设定依据

在上述试验中设定了三个草分枝杆菌剂量水平做平行试验，并设定了一个抗生素药物对照组。草分枝杆菌试验组剂量的设定依据是，参照前期初步预试设定了推荐剂量0.3%，然后以推荐剂量为中剂量，各增加和减少1倍，设定了高剂量0.6%和低剂量0.15%。

观察

2.3试验结果：见表2。

表2：不同处理对猪只生长性能及发病率的影响

结果说明:实验期间，添加本发明产品，不同阶段料肉比数据显示：3个剂量草分枝杆菌组均低于对照组抗生素，进一步说明了本发明添加剂具有促进猪只生长功能，具有可取代现有的抗生素动物饲料添加剂。存活率数据显示：存活率在各阶段均达到90%以上。与抗生素组无显著差异。

综上所述：各阶段料肉比与存活率数据显示，添加本发明专利产品为0.15～0.6%，具有促进猪只生长功能，提高猪只抗病力, 提高饲料报酬，是一种具有可取代现有抗生素的动物饲料添加剂。其中，以0.3%用量为最佳。

实施例3

3.1 试验材料

3.1.1试验动物及饲料

1日龄体重相差±5g的罗斯308肉鸡：按照罗斯商品肉仔鸡管理标准进行饲养。

肉鸡饲料：山东和美集团生产的肉仔鸡全价饲料。

供试药品及试剂

含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液：湖南圣雅凯生物科技有限公司科研中试产品。

试验方法

3.2.1 试验分组与处理

将450只体重相差±5g的1日龄罗斯肉鸡（未免疫），按随机分组方法分为A、B、C、D、E五组。

A组、在饮水中添加本发明产品（0.1%）含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液，

B组、在饮水中添加本发明产品（0.2%）含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液，

C组、在饮水中添加本发明产品（0.4%）含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液，

D组、在饲料中添加0.2%抗生素（将肉鸡颗粒料压碎拌入饲喂），

E组、不用任何药物。

各组按规定的免疫程序进行免疫。试验组和对照组均采取网养，自由采食，饲养管理条件相同，饲料为山东和美集团生产的肉鸡全价饲料。各组鸡饲养观察至42日龄出栏，试验结束。

分组及剂量设定依据

在上述试验中设定了三个草分枝杆菌剂量水平做平行试验，并设定了一个不用药对照和一个抗生素药物对照组。草分枝杆菌试验组剂量的设定依据是，参照前期初步预试设定了推荐剂量0.2%，然后以推荐剂量为中剂量，各增加和减少1倍，设定了高剂量0.4%和低剂量0.1%。

观察

试验期间，每天观察鸡群的精神、食欲、活动、粪便及死淘情况，并做好记录。

试验结果

3.3.1 草分枝杆菌对肉鸡生产性能的影响

3.3.1.1草分枝杆菌对肉鸡增重情况的影响

表3 各组鸡不同日龄段的体重情况单位：g

由表3结果可以看出，各阶段草分枝杆菌3个剂量组及抗生素药物对照组鸡的平均体重均高于不用药对照组。尤其是 42日龄出栏时，草分枝杆菌的低、中、高3个剂量组的平均体重较不用药对照组分别高96.07g、169.87g和167.67g，均有显著差异（P<0.01）。草分枝杆菌3个剂量组的出栏重也显著高于抗生素药物对照组（P<0.05或P<0.01）。其中草分枝杆菌的0.2%和0.4%组的出栏重均还显著高于0.1%组（P<0.01），但0.2%和0.4%组间无显著差异（P>0.05）。

草分枝杆菌对肉鸡料肉比的影响

表4 各组肉鸡出栏时的料肉比

组别	全程平均只耗料量/g	全程平均只增重/g	料肉比
				0.1%草分枝杆菌组	4478.98	2353.20	1.90
0.2%草分枝杆菌组	4346.97	2427.00	1.79
				0.4%草分枝杆菌组	4340.96	2424.20	1.79
抗生素药物对照	4421.15	2375.47	1.86
				不用药对照	4534.63	2257.13	2.01

由表4可以看出，草分枝杆菌高中低3个剂量组以及抗生素对照组的料肉比均低于不用药对照组。说明了本发明添加剂具有促进肉鸡生长功能，提高饲料报酬，是一种具有可取代现有的抗生素动物饲料添加剂。

综上所述：本发明添加剂具有促进畜禽生长功能，具有可取代现有的抗生素动物饲料添加剂。

Claims

1.一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂，其特征在于：该饲料添加剂为含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液。

2.如权利要求1所述的一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂，其特征在于：所述的该饲料添加剂还包括辅料，构成固态的草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂，即含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液与辅料的组合物，所述的辅料为淀粉、糊精、玉米粉、玉米芯粉、麦麸、豆柏、米糠中任意一种或多种的组合。

3.如权利要求2所述的一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂，其特征在于：所述的饲料添加剂固态组合物按重量百分比，所述的含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液占5-10%，辅料占90-95%。

4.如权利要求1所述的一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂，其特征在于：所述的含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液中的草分枝杆菌Sq-1为10⁹个/ml。

5.如权利要求2或3所述的一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂，其特征在于：所述的该饲料添加剂为含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液与辅料的固态组合物中，草分枝杆菌Sq-1的含量为10⁹个/g。

6.如权利要求1或2或3所述的一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂的制备方法，其特征在于：

A.含草分枝杆菌Sq-1代谢产物菌悬液的制备：

a.发酵：对草分枝杆菌Sq-1进行发酵，制得草分枝杆菌Sq-1代谢产物；

b.灭活：发酵终止，升温至110℃，保温30分钟；

B. 固态的草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂制备：

7.如权利要求6所述的一种草分枝杆菌Sq-1饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述b步骤中，选择膜孔0.22-0.45微米，膜面错流流速为每秒3-4米，平均膜通量大于200L/（m².h）进行膜分离浓缩。