CN103396958A - 草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法，所述草分枝杆菌是通过以下步骤培养得到的：采用斜面培养基活化草分枝杆菌；采用种子培养基培养上述活化菌种得到种子液；按照3-6%的接种量（v/v）将上述种子液接种到发酵培养基中，通气培养48-50h，得到发酵液；所述免疫增强剂是将草分枝杆菌发酵液灭活，离心收集菌体，用PBS清洗2-3次，计算离心得到的菌体干重，再与适量PBS、0.5-1%SDS混合均匀，进行高压均质破碎，离心超滤制备后制备得到的。本发明所提供的草分枝杆菌生产方法工艺简单，培养周期短，有效降低生产成本。本发明制备的免疫增强剂既可单独使用，也可与其他疫苗、药物配伍使用来提高机体免疫力，且无毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物制品技术领域，具体地说，本发明涉及一种草分枝杆菌的培养方法及免疫增强剂的制备。
背景技术
免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强机体免疫应答的物质。目前佐剂的品种较多，按其作用的先决条件可分为三类：（1）免疫替代剂，用来代替某些具有免疫增强作用的生物因子的药物；（2）免疫恢复剂，能增强被抑制的免疫功能，但对正常免疫功能作用不大；（3）免疫佐剂，又称非特异性剌激剂。常用的免疫增强剂有卡介苗、短小棒状杆菌、内毒素、免疫核糖核酸、胸腺素、转移因子、双链聚核苷酸、氢氧化铝铝胶佐剂等。
上述佐剂中，有的虽然已经研究成功应用于人类如胸腺素，但是价格较为昂贵，不可能用于动物。目前动物用疫苗所用佐剂如氢氧化铝铝胶佐剂，通过延长疫苗在注射部位的停留时间发挥佐剂效应，还没有直接通过增强动物机体自身的免疫应答能力的佐剂来提高免疫效果，致使动物免疫效果较差，影响了畜禽养殖业的快速健康发展。因此，研发新型的免疫增强剂，改善动物免疫效果，成为畜禽养殖业亟待解决的问题之一。
草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)属于放线菌纲放线菌目分枝杆菌科，是一种非致病性微生物。草分枝杆菌中的分枝杆菌胞壁酰二肽(MDP)具有很强的免疫治疗作用，草分枝杆菌多糖MPS在免疫调节、抑制病毒复制方面有很好效果(周莉婷，赵晶晶等，分枝杆菌多糖免疫调节剂研究进展，药物生物技术，2011.18(2)：176-179)。公开号为CN102764434A的中国发明专利申请，也公开了一种动物用免疫增强剂的制备方法及应用：将草分枝杆菌在37℃通气培养，pH7.0，发酵培养5天后细菌浓度为5×107cfu/mL（发酵培养基为酵母提取粉5g～10g，浓缩麦芽汁5.0g～20g，葡萄糖20g～100g，磷酸氢二铵1.0g～4.0g，磷酸氢二钾0.5g～1.0g，注射用水加至1000mL），再通过灭活、浓缩、提纯、均质等工序制备成一种动物用免疫增强剂。这种培养方法耗时长、菌浓度低。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种草分枝杆菌的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用斜面培养基活化草分枝杆菌；
（2）将活化的草分枝杆菌采用种子培养基进行种子培养，得到种子液；
（3）按照3-6%的接种量（v/v）将上述种子液接种到发酵培养基中，通气培养48-50h，得到草分枝杆菌的发酵液；
所述斜面培养基的配方为：大豆蛋白胨5-10g/L，酵母膏5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.4-0.6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，氯化钙0.4-0.6g/L，琼脂15-20g/L，pH7.3-7.5；
所述种子培养基的配方为：大豆蛋白胨5-10g/L，酵母膏5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.4-0.6g/L，氯化钙0.4-0.6g/L，甘油1-5g/L，pH7.3-7.5；
所述发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨5-10g/L，酵母膏5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.4-0.6g/L，氯化钙0.4-0.6g/L，甘油5-10g/L，pH7.3-7.5。
优选地，步骤（1）中，在28-37℃，静置培养72-96h进行活化。
优选地，步骤（2）中，在28-37℃，转速200rpm条件下进行种子培养。
优选地，步骤（3）中，在28-37℃，转速150rpm，通气比为1：0.8-1.2的条件下进行发酵培养。
一种草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法，将上述任一项所述的草分枝杆菌的制备方法制备得到的草分枝杆菌的发酵液灭活，离心收集菌体，用PBS清洗2-3次，计算离心得到的菌体干重，再与适量PBS、0.5-1%SDS混合均匀，进行高压均质破碎，离心超滤即制成免疫增强剂。
优选地，所述草分枝杆菌免疫增强剂的浓度为10-20%。
优选地，向所述草分枝杆菌免疫增强剂中添加0.01%的硫柳汞（v/v）。
一种上述任一项草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法制备的草分枝杆菌免疫增强剂。
SDS即十二烷基硫酸钠属阴离子表面活性剂。易溶于水，与阴离子、非离子复配伍性好，具有良好的乳化、发泡、渗透、去污和分散性能。SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它可用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳，它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸：蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，导致蛋白质变性，使DNA释放出来。在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。使用SDS处理菌体，比使用吐温等非离子表面活性剂处理菌体效果更好。吐温不破坏蛋白的结构，只是减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。SDS的用量以0.5-1%为宜，使用量量过高（如2%）会增加草分枝杆菌免疫增强剂后续处理的困难。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1．本发明所提供的草分枝杆菌生产方法工艺简单、操作方便。
2．本发明所提供的草分枝杆菌生产方法，使用的培养基非常适合于草分枝杆菌的生长，培养时间仅48h左右，菌落数即达到109cfu/mL，活性强，同时菌株同步性较好，相比专利CN102764434A中长达5d的培养时间，能大大缩短培养周期，节约了水电及人力，有效降低生产成本。
3．本发明所提供的草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法确保各种活性成分能释放出来、有效地保护了活性成分、使免疫增强剂的免疫效果明显，并延长免疫增强剂的使用期限。
4．本发明制备的免疫增强剂既可单独使用，也可与其他疫苗、药物配伍使用来提高机体免疫力，且无毒副作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中草分枝杆菌的生长曲线图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例作进一步说明。本发明中的草分枝杆菌来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为CGMCC4.1180。
实施例1：草分枝杆菌的制备
（1）斜面培养
斜面培养基（g/L）：大豆蛋白胨8，酵母膏5，葡萄糖5，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.5，氯化钙0.4，琼脂15，蒸馏水余量，pH7.3，l2l℃湿热灭菌30min。
将菌种接种斜面培养基后，将其放在37℃生化培养箱中，静置72-96h进行菌种活化。
（2）种子培养
种子培养基（g/L）：大豆蛋白胨8，酵母膏5，葡萄糖5，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.5，氯化钙0.4，甘油3，蒸馏水余量，pH7.3，l2l℃湿热灭菌30min。
将活化的草分枝杆菌采用种子培养基在37℃，转速200rpm条件下进行种子培养48h以上，得到种子液。
（3）发酵培养
发酵培养基（g/L）：大豆蛋白胨8，酵母膏5，葡萄糖5，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.5，氯化钙0.4，甘油8，蒸馏水余量，pH7.3，l2l℃湿热灭菌30min。
按照3%的接种量（v/v）将上述种子液接种到发酵培养基中，在37℃，转速150rpm，通气比1：1的条件下通气培养48-50h，培养至OD600检测变化不大，停止发酵，得到草分枝杆菌的发酵液。
在培养过程中，定时取样测定发酵液的OD600。由图1可知，培养10h内草分枝杆菌生长缓慢，10h左右进入快速增殖期，于培养后48h左右进入稳定期OD600值达到2.5以上，菌落数达到109cfu/mL以上。
实施例2：草分枝杆菌的制备
（1）斜面培养
斜面培养基（g/L）：大豆蛋白胨10，酵母膏8，葡萄糖10，硫酸镁0.4，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.5，氯化钙0.5，琼脂20，蒸馏水余量，pH7.4，l2l℃湿热灭菌30min。
将菌种接种斜面培养基后，将其放在30℃生化培养箱中，静置72-96h进行菌种活化。
（2）种子培养
种子培养基（g/L）：大豆蛋白胨5，酵母膏10，葡萄糖8，硫酸镁0.6，磷酸氢二钾0.4，磷酸二氢钾0.4，氯化钙0.6，甘油1，蒸馏水余量，pH7.4，l2l℃湿热灭菌30min。
将活化的草分枝杆菌采用种子培养基在30℃，转速200rpm条件下进行种子培养48h以上，得到种子液。
（3）发酵培养
发酵培养基（g/L）：大豆蛋白胨5，酵母膏8，葡萄糖10，硫酸镁0.4，磷酸氢二钾0.6，磷酸二氢钾0.6，氯化钙0.5，甘油5，蒸馏水余量，pH7.4，l2l℃湿热灭菌30min。
按照4%的接种量（v/v）将上述种子液接种到发酵培养基中，在30℃，转速150rpm，通气比1：1的条件下通气培养48-50h，培养至OD600检测变化不大，停止发酵，得到草分枝杆菌的发酵液。
实施例3：草分枝杆菌的制备
（1）斜面培养
斜面培养基（g/L）：大豆蛋白胨5，酵母膏10，葡萄糖8，硫酸镁0.6，磷酸氢二钾0.4，磷酸二氢钾0.4，氯化钙0.6，琼脂18，蒸馏水余量，pH7.5，l2l℃湿热灭菌30min。
将菌种接种斜面培养基后，将其放在35℃生化培养箱中，静置72-96h进行菌种活化。
（2）种子培养
种子培养基（g/L）：大豆蛋白胨10，酵母膏8，葡萄糖10，硫酸镁0.4，磷酸氢二钾0.6，磷酸二氢钾0.6，氯化钙0.5，甘油5，蒸馏水余量，pH7.5，l2l℃湿热灭菌30min。
将活化的草分枝杆菌采用种子培养基在35℃，转速200rpm条件下进行种子培养48h以上，得到种子液。
（3）发酵培养
发酵培养基（g/L）：大豆蛋白胨10，酵母膏10，葡萄糖8，硫酸镁0.6，磷酸氢二钾0.4，磷酸二氢钾0.4，氯化钙0.6，甘油10，蒸馏水余量，pH7.5，l2l℃湿热灭菌30min。
按照6%的接种量（v/v）将上述种子液接种到发酵培养基中，在35℃，转速150rpm，通气比1：1的条件下通气培养48-50h，培养至OD600检测变化不大，停止发酵，得到草分枝杆菌的发酵液。
实施例4：草分枝杆菌免疫增强剂的制备
将实施例1制备的发酵液经0.2%甲醛灭活，离心收集菌体，用PBS洗2-3次，计算离心得到的菌体干重，再与适量PBS、0.5%SDS混合均匀，90℃处理0.5小时后，进行高压均质破碎，离心除去沉淀，进行纯化浓缩即制成20%的免疫增强剂。制成后于4℃保存，如需较长时间保存，可向免疫增强剂中加入0.01%的硫柳汞（v/v）。该制备方法安全且能把菌体中的有效免疫成分提取出来，去除多余组分使免疫效果显著。
实施例5：草分枝杆菌免疫增强剂的制备
将实施例1制备的发酵液经0.2%甲醛灭活，离心收集菌体，用PBS洗2-3次，最后离心得到的菌体烘干称重后与适量PBS、1%SDS混合均匀，90℃处理0.5小时后，进行高压均质破碎，离心除去沉淀，进行纯化浓缩即制成10%的免疫增强剂。制成后于4℃保存，如需较长时间保存，可向免疫增强剂中加入0.01%的硫柳汞（v/v）。
实施例6：草分枝杆菌免疫增强剂的制备
将实施例1制备的发酵液经加热灭活，离心收集菌体，用PBS洗2-3次，最后离心得到的菌体烘干称重后与适量PBS、0.8%SDS混合均匀，90℃处理0.5小时后，进行高压均质破碎，离心除去沉淀，进行纯化浓缩即制成15%的免疫增强剂。制成后于4℃保存，如需较长时间保存，可向免疫增强剂中加入0.01%的硫柳汞（v/v）。
实施例7：不同草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法比较
选取40头生长状况一致健康的28日龄的断奶仔猪，进行草分枝杆菌免疫增强剂后处理方法效果对比试验。将这40头猪随机分成A、B、C、D四组，每组各10头。其中A组为对照组，B组、C组、D组为试验组,其中C组采用实施例4制备的草分枝杆菌制剂，D组采用的草分枝杆菌制剂为菌体烘干称重后与适量PBS、0.2%吐温80混合均匀后进行高压均质所得。各试验组中每头猪注射的猪瘟疫苗的含量相同。具体实验设计见表1。
表1不同草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法比较的实验设计
| 组别 | 实验处理 |
| 对照组A | 不注射猪瘟疫苗和草分枝杆菌制剂 |
| 试验组B | 注射猪瘟疫苗 |
| 试验组C | 注射猪瘟疫苗+0.1mg草分枝杆菌制剂(SDS) |
| 试验组D | 注射猪瘟疫苗+0.1mg草分枝杆菌制剂(吐温80) |
所有试验仔猪于首免前1d、首免后14d前腔静脉采血，制备血清，使用IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒测定每个血清样本的阻断率。结果判定：如果被检样本的阻断率大于或等于40％，该样本被判定为阳性（有CSFV抗体存在），并记录下阳性头数；如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本被判定为阴性（无CSFV抗体存在），并记录下阴性头数；如果被检样本阻断率在30～40％之间，该样本被判定为不确定，并记录下不确定头数。
表2首免后14d猪瘟抗体检测结果
首免前1d检测结果均为阴性。首免猪瘟抗体水平的测定结果见表2。从表2可知，首免后14d采血测抗体状况，B组抗体检测阳性率只有40%，而添加了草分枝杆菌制剂的C组、D组抗体检测阳性率为100%。其中C组的抗体水平明显高于D组，说明本方法制备的草分枝杆菌制剂免疫效果更显著。
实施例8：单独使用草分枝杆菌免疫增强剂在饲养肉鸡上的应用
选择200只7日龄肉鸡，均分为实验组和对照组两组。实验组注射实施例4制备得到的草分枝杆菌菌体免疫增强剂0.1mg/kg，且每21天注射1次。同时实验组与对照组饲养管理、免疫程序、投药程序都按常规肉鸡饲养办法和免疫程序进行，64日出栏。其中试验组每只药费只有0.43元，对照组每只药费0.65元，说明草分枝杆菌免疫增强剂有明显的增强免疫力的作用。
实施例9：草分枝杆菌免疫增强剂与猪瘟疫苗的使用效果
选取50头生长状况一致健康的28日龄的断奶仔猪进行草分枝杆菌免疫增强剂与猪瘟疫苗的使用效果试验。将这50头猪随机分成A、B、C、D、E五组，每组各10头。其中A组为对照组，B组、C组、D组、E组为试验组，各试验组中每头猪注射的猪瘟疫苗的含量相同，选用实施例4制备得到的草分枝杆菌免疫增强剂进行试验。具体实验设计见表3。
表3草分枝杆菌免疫增强剂与猪瘟疫苗实验设计
| 组别 | 实验处理（每头） |
| 对照组A | 不注射猪瘟疫苗和草分枝杆菌免疫增强剂 |
| 试验组B | 注射猪瘟疫苗 |
| 试验组C | 注射猪瘟疫苗+0.03mg草分枝杆菌免疫增强剂 |
| 试验组D | 注射猪瘟疫苗+0.05mg草分枝杆菌免疫增强剂 |
| 试验组E | 注射猪瘟疫苗+0.08mg草分枝杆菌免疫增强剂 |
所有试验仔猪于首免后14d进行二免，首免前1d、首免后14d及二免后14d前腔静脉采血，制备血清，使用IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒测定每个血清样本的阻断率。结果判定：如果被检样本的阻断率大于或等于40％，该样本被判定为阳性（有CSFV抗体存在），并记录下阳性头数；如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本被判定为阴性（无CSFV抗体存在），并记录下阴性头数；如果被检样本阻断率在30～40％之间，该样本被判定为不确定，并记录下不确定头数。
首免前1d检测结果均为阴性。首免、二免猪瘟抗体水平的测定结果见表4、表5。
表4首免后14d猪瘟抗体检测结果
从表4可知，首免后14d采血测抗体状况，B组的抗体检测阳性率只有30%。而添加了草分枝杆菌免疫增强剂的C组、D组、E组的抗体检测阳性率已经全部达到100%。说明添加了草分枝杆菌免疫增强剂，能很快提高机体的免疫能力。
表5二免后14d猪瘟抗体检测结果
从表5可知，二免后14d采血测抗体状况，添加了草分支杆菌免疫增强剂的C组、D组、E组的抗体水平明显高于未添加草分支杆菌免疫增强剂的B组。
实施例10：草分枝杆菌免疫增强剂与猪伪狂犬病弱毒疫苗的使用效果
选取30头生长状况一致健康的28天龄断奶仔猪进行草分枝杆菌免疫增强剂与猪伪狂犬病灭活疫苗使用的效果试验。将这30头猪随机分成A、B、C三组，每组各10头。其中A组为对照组，B组、C组为试验组，各试验组中每头猪注射的猪瘟疫苗的含量相同，选用实施例4制备得到的草分枝杆菌免疫增强剂进行试验。具体实验设计见表6。
表6草分枝杆菌免疫增强剂与猪伪狂犬病弱毒疫苗实验设计
| 组别 | 实验处理（每头） |
| 对照组A | 不注射猪伪狂犬病弱毒疫苗和草分枝杆菌免疫增强剂 |
| 试验组B | 注射猪伪狂犬病弱毒疫苗 |
| 试验组C | 注射猪伪狂犬病弱毒疫苗+0.05mg草分枝杆菌免疫增强剂 |
所有试验仔猪于免疫前1d、免疫14d及21d前腔静脉采血,制备血清，使用BioChek猪伪狂犬gB抗体检测试剂盒检测。结果判定：如果被检样本的S/P大于或等于0.500，该样本被判定为阳性（有PRV gB抗体存在），并记录下阳性头数。如果被检样本的S/P大于或等于0.499，该样本被判定为阴性（无PRV gB抗体存在），并记录下阴性头数。
免疫前1d检测结果均为阴性。免疫14d及21d猪伪狂犬抗体水平的测定结果见表7、表8。
表7免疫14d猪伪狂犬抗体gB检测结果
表8免疫21d猪伪狂犬抗体gB检测结果
从表7和表8可知：免疫14d采血测抗体状况：B组的抗体检测阳性率只有20%。而添加了草分枝杆菌免疫增强剂的C组的抗体检测阳性率达到60%；免疫21d采血测抗体状况：B组的抗体检测阳性率只有60%。而添加了草分枝杆菌免疫增强剂的C组的抗体检测阳性率已经全部达到100%。这两个表的数据说明添加了草分枝杆菌免疫增强剂，能很快提高机体的免疫能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种草分枝杆菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）采用斜面培养基活化草分枝杆菌；
（2）将活化的草分枝杆菌采用种子培养基进行种子培养，得到种子液；
（3）按3-6%的接种量（v/v）将上述种子液接种到发酵培养基中，通气培养48-50h，得到草分枝杆菌发酵液；
所述斜面培养基的配方为：大豆蛋白胨5-10g/L，酵母膏3-8g/L，葡萄糖2-5g/L，硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.4-0.6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，氯化钙0.4-0.6g/L，琼脂15-20g/L，pH7.3-7.5；
所述种子培养基的配方为：大豆蛋白胨5-10g/L，酵母膏5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.4-0.6g/L，氯化钙0.4-0.6g/L，甘油1-5g/L，pH7.3-7.5；
所述发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨5-10g/L，酵母膏5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.4-0.6g/L，氯化钙0.4-0.6g/L，甘油5-10g/L，pH7.3-7.5。
2.根据权利要求1所述的草分枝杆菌的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，在28-37℃，静置培养72-96h进行活化。
3.根据权利要求1所述的草分枝杆菌的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，在28-37℃，转速200rpm条件下进行种子培养。
4.根据权利要求1所述的草分枝杆菌的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，在28-37℃，转速150rpm，通气比为1：0.8-1.2的条件下进行发酵培养。
5.一种草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法，其特征在于：将权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的草分枝杆菌的发酵液灭活，离心收集菌体，用PBS清洗2-3次，再与适量PBS、0.5-1%SDS混合均匀，进行高压均质破碎，离心超滤即制成免疫增强剂。
6.根据权利要求5所述的草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述草分枝杆菌免疫增强剂的浓度为10-20%。
7.根据权利要求5所述的草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法，其特征在于：向所述草分枝杆菌免疫增强剂中添加0.01%的硫柳汞（v/v）。
8.一种权利要求5-7任一项所述制备方法制备的草分枝杆菌免疫增强剂。
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