CN103356716A - 多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物及制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物及制备和应用，涉及多种药食两用真菌经复合酶酶解提取的复合多糖提取物，经多株肠道益生菌共生发酵后制得的发酵组合物，以及该发酵组合物在制备用于预防和治疗肿瘤的保健品或药品中的应用。本发明使用的药食两用真菌选自灵芝、姬松茸、香菇、金针菇中的任意三种或三种以上，经粉碎、浸泡、酶解，加入双歧杆菌和乳杆菌共同发酵制成。经过肠道益生菌共生发酵以后，药食两用真菌复合多糖分子量明显减小，抑制肿瘤细胞的活性明显提高，抑制效果明显增强。

Description

多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物及制备和应用

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，特别是涉及灵芝、姬松茸、香菇、金针菇其中三种或者三种以上经复合酶酶解提取的药食两用真菌复合多糖提取物，经多株肠道益生菌共生发酵后制得的发酵组合物，以及该发酵组合物在制备用于预防和治疗肿瘤的保健品或药品中的应用。 

背景技术

 药食两用的真菌具有抗癌活性，1968 年，日本学者千原吴朗首先使用热水从香菇子实体中分离出能抑制肿瘤的物质，并对其进行了分析测定，证实此类物质主要是一些高分子多糖。从此，世界各国的科学家对从食用菌中分离能抑制肿瘤、提高免疫能力的多糖类物质开展了大量的研究，证实多种食用菌多糖均有抑制肿瘤、提高免疫能力的生物活性。现有研究结果证明，多糖单用有一定抑瘤效果，但多糖复合后有协同效应，疗效会更高。Lonseny T.（Lonseny T. 复合食用菌多糖抗肿瘤作用的研究. 中国食品学报[J].2005，5(2）:90-93)等以香菇、灵芝、灰树花多糖以一定比例复合后的多糖的抑瘤作用进行了研究。结果显示，能显著抑制小鼠的肉瘤S₁₈₀和Lewis 肺癌，最高抑瘤率分别达42.2%和49.3%。推测3 种多糖复合后，不同多糖之间能相互补充，起协同作用，从而大大提高了抑瘤率。同时证明复合食用菌多糖不仅有较高的抑瘤率，同时也能提高小鼠的NK 和腹腔巨噬细胞的活性，说明复合食用菌多糖能显著提高小鼠的细胞免疫功能。 

灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr．)Karst．或紫芝Granoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体，含有多种有效成分，如灵芝多糖、有机锗、三萜类化合物等成分。用于冠心病心绞痛，高脂血症，糖尿病等症的治疗。灵芝多糖能升高白细胞-诱导或促进巨噬细胞的吞噬作用，增强T细胞及自然杀伤细胞的活性，提高淋巴细胞的转化率，促进免疫球蛋白的形成．使机体免疫调控能力增强，提高机体自身的抗病能力。同时灵芝还可增强机体对放疗、化疗的耐受性，从而达到抗肿瘤的效果。 

香菇是众所周知的优质食用菌，具有很高的食疗保健作用。现代医学研究证实，香菇能提高机体的免疫力。能阻止癌细胞发生，对已诱发的癌细胞亦有抑制作用。有人通过香菇多糖对小鼠腹水性S₁₈₀、H₂₂两种细胞系的作用观察了解其抑瘤情况，实验证明其具有明显的抗肿瘤作用，在延长小鼠生存期及抑瘤效果方面均具有显著作用（马占好等．香菇多糖对小鼠腹水型S₁₈₀、H₂₂抑瘤作用的实验研究[J]．实用肿瘤学杂志．1996，10(4)：7-8）。 

姬松茸又名巴西菇，是原产于巴西的珍贵而稀少的富含糖和蛋白质的药食兼用真菌。有研究证明，姬松茸具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗疲劳及保肝等作用。 

金针菇味鲜，因其具有多种药效作用而被广泛用于药膳，是世界上著名的食药两用菌。研究发现在金针菇中存在着丰富的抗肿瘤活性成份。日本医学家用培养的金针菇菌丝用于癌症治疗。分析发现金针菇中含有金针菇素，该物质是一种特殊的碱性蛋白质，能增强机体免疫系统防御功能，对癌细胞有明显的抑制作用（Gong F , C hen Y .Crystallization and some characterization of Flammulin purified from the fruit bodies of Flammulina veluti pes[J].Bioresource Technology,1998,64:153-156.）。日本大家重远等同从金针菇的发酵液中提取出一种称为KM-45的抗癌精多糖。该物质对小白鼠S₁₈₀的抑制率为70%，对腹水瘤的抑制率为80%，并大大缩短显放时间且无副作用（大家重远.朴菇抗癌剂的制造法.特许公报日本，昭-52；44636:171）。Leung等将从金针菇细胞壁中得到的强碱性多糖注人到小白鼠腹中，发现小白鼠会出现脾淋巴细胞增殖、血管扩大、出血等反应，表明了该多糖有抗肿瘤功效，能在活体内抑制S₁₈₀肉瘤的生长（Leung .The isolation and characterization of an immunomodulatory and anti-tumor polysaccharide preparation from Flammulina v elutipes[J]. Immunopharma-cology, 1997, 35: 255-263.）。 

多糖类化合物是药用真菌的主要活性成分之一，但是多糖化合物活性与其多糖的结构以及分子量大小分布密切相关。当归多糖是传统中药当归的主要药用成分之一。随着中药多糖增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗辐射作用的发现，近年来，当归多糖也引起了愈来愈多的关注。前期的研究表明：当归总多糖对实体性肿瘤S₁₈₀无明显的抑制作用；但低分子量的当归多糖组分对S₁₈₀实体瘤的抑瘤率却可达36％。此结果提示：当归多糖的抗肿瘤作用与其结构密切相关。中国专利（申请号 201110125221.8）公开了一种由银耳中制备的低分子量银耳多糖的方法以及低分子量银耳多糖用于慢性萎缩性胃炎的治疗及其作为肿瘤治疗辅助药物方面的用途。魏小龙等（魏小龙，茹祥斌．低分子量地黄多糖对p53基因表达的影响[J]．中国药理学报，1997,18(5)：471-474．）对地黄多糖抗肿瘤功能系统研究时发现，低分子量地黄多糖可诱导Lewis肿瘤细胞内的p53基因表达，引发Lewis肺癌细胞的程序性凋亡，这是多糖抗肿瘤作用的又一类新途径。 

发明内容

现有技术中的许多实验结果均提示，已知结构或未知结构的天然药物，如通过胃肠道途径摄入体内后，将会发生某些结构上的改变，从而可以更容易地被吸收并在人或动物体内发挥更大的生物学活性。因此本发明中，我们试图模拟正常人的肠道微生态环境，利用在人体内分布广泛并且作用确切的多种肠道益生菌与本发明使用的三种以上的天然药食两用真菌灵芝、姬松茸、香菇、金针菇提取物一起发酵，以实现肠道益生菌对他们的修饰。结果令人惊奇地发现，经与肠道益生菌共同发酵处理后，复合药食两用真菌多糖提取物分子量明显降低，其抗肿瘤等生物学活性得到了显著提高和改善。 

本发明的一个目的是提供一种多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物。本发明使用的药食两用真菌选自灵芝、姬松茸、香菇、金针菇，将其中的任意三种或三种以上经复合酶酶解提取的药食两用真菌复合多糖提取物，经多株益生菌共同发酵制成。经过肠道益生菌共生发酵以后，药食两用真菌复合多糖分子量明显减小，体外抑制肿瘤细胞的活性明显提高。 

为了提高复合真菌多糖的提取率，药食两用真菌子实体粉碎后加水浸泡，在浸提液中加入复合酶（纤维素酶、果胶酶、蛋白酶），可以使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶质、蛋白质等物质降解，破坏细胞壁的致密构造，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障的传质阻力，使多糖易于从细胞内释放出来。 

本发明所述酶解所用的复合酶为纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=1:2:1，泰安信得利生物工程有限公司生产。 

本发明发酵所用的益生菌为双歧杆菌和乳杆菌。 

所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌中的一种或两种及以上；所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌中的一种或两种及以上。 

本发明的一个优选实施方案，其中用于发酵真菌复合多糖提取物所述的双歧杆菌最好选自两歧双歧杆菌和短双歧杆菌；所述的乳杆菌最好选自植物乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌。 

菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC 中国，北京）或者从正常人的粪便或肠粘膜组织中分离得到这些细菌菌株。 

本发明的另一个目的是提供一种多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物的制备方法，包括以下步骤： 

1）粉碎：将灵芝、姬松茸、香菇、金针菇中的任意三种或三种以上药食两用真菌子实体进行粉碎，菌粉粉碎细度在65目以上，得到复合真菌菌粉。

通常采用普通的粉碎技术制备灵芝、姬松茸、香菇、金针菇的菌粉，经粉碎后，菌粉的比表面积增加, 从而更有利于药物有效成分的溶出, 大大增加了药材有效成分的提取率。 

2）制备发酵底物：取复合真菌菌粉，加入适量水浸泡，然后加入由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成的复合酶酶解，向过滤去除残渣或者留有残渣的酶解多糖提取液中添加一定量的葡萄糖和无机盐，灭菌后得到益生菌发酵底物。 

3）发酵：在益生菌发酵底物中接种预培养的各约0.5%（体积/体积）一种或两种及以上双歧杆菌菌液。常规培养约2~6小时后，再次接种预培养的各约0.5%（体积/体积）的一种或两种及以上乳杆菌菌液，继续发酵20~22小时。当pH值降至4.0以下时，结束发酵。留有残渣的发酵液离心去除残渣，即得到多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物。 

上述制备方法中所述的药食两用真菌由灵芝、姬松茸、香菇、金针菇中的任意三种或三种以上真菌组成，其重量g/体积ml比为灵芝0-1.0%、姬松茸0-5.0%、香菇0-9.0%、金针菇0-5.0%。 

上述制备方法中，所述的复合酶按照酶与菌粉的比例3%（体积ml/重量g )加入，复合酶为纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=1:2:1，泰安信得利生物工程有限公司生产；所述的葡萄糖加入量为0.5%（重量g/体积ml）；所述的无机盐为硫酸亚铁·7H₂O 5.0mg/100ml、硫酸锌·7H₂O 4.4mg/100ml、硫酸镁·7H₂O 50mg/100ml、磷酸二氢钾 100mg/100ml、磷酸氢二钾·3H₂O 100mg/100ml。 

上述制备方法中，所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌；所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌。 

为了制备益生菌发酵底物，可在复合真菌菌粉中，加入相当于复合菌粉重量约60倍的饮用水，并浸泡30分钟以上。然后于100℃下加热1小时，温度冷却至40℃左右时，按照酶与菌粉的比例3%（体积ml/重量g )加入由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶构成的复合酶，37℃~50℃酶解3小时后，煮沸10分钟灭酶，过滤，收集滤液，并减压浓缩至复合菌粉的浓度为3.0—20%（重量g/体积ml），得到去除残渣的酶解多糖提取液，然后加入葡萄糖和无机盐，调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟后，即得到益生菌发酵底物（参见实施例1）。 

为了制备益生菌发酵底物，还可以直接利用复合真菌菌粉，取复合菌粉总量为3.0—20%（重量g/体积ml），加饮用水浸泡1.0小时后，100℃下加热1小时，温度冷却至40℃左右时，按照酶与菌粉的比例3%（体积ml/重量g )加入由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶构成的复合酶，37℃~50℃酶解3小时后，煮沸10分钟灭酶，得到留有残渣的酶解多糖提取液，然后加入葡萄糖和无机盐，调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟后，即得到益生菌发酵底物（参见实施例2）。 

当按上述方法制备的益生菌发酵底物温度降至39℃左右时，接种预培养的各约0.5%（体积/体积）一种或者两种及以上双歧杆菌的菌液，常规培养约2~6小时后，再次接种预培养的各约0.5%（体积/体积）的一种或者两种及以上乳杆菌的菌液，继续发酵20~22小时，pH值降至4.0以下时结束发酵，留有残渣的发酵液离心去除残渣，即得到多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物（参见实施例1和2）。 

本发明的再一个目的是提供本发明的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物在提高机体免疫力、预防和治疗肿瘤的药物或者保健品中的应用。 

有益效果：为了揭示益生菌发酵对灵芝、姬松茸、香菇、金针菇分子的化学修饰作用，通过基础研究实验证实，经益生菌发酵处理，得到的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物经过分级醇沉和分布醇沉以后，与未经发酵的灵芝、姬松茸、香菇、金针菇复合多糖组合物分子量比较，高浓度的乙醇浓度沉淀出的多糖含量明显提高。这一结果提示：经益生菌发酵处理后，由于灵芝、姬松茸、香菇、金针菇多糖分子的裂解，致使低分子量多糖含量显著增加。（具体见实施例3）。具体试验结果参见附图1和附图2。 

 为检测本发明的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物与未通过益生菌转化发酵的真菌复合多糖组合物的抑瘤效果，实验观察了两试验样品对HeLa细胞(人宫颈癌细胞)系的体外增殖的抑制作用。本发明的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物对肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用。发酵组合物与未发酵组合物相比，对实验用肿瘤细胞抑制效果明显增强，差异显著（p<0.01）。且发酵组合物对试验用肿瘤细胞的抑制效果随作用时间延长，作用浓度增加而增强。（具体见实施例4）。研究结果证明，灵芝、姬松茸、香菇、金针菇真菌多糖在肠道有益菌群的体外作用下，经过某些化学修饰或生物转化后，对肿瘤细胞具有更高的抑制活性（参见实施例4）。 

附图说明

图1为实施例3中的分级醇沉的试验结果。 

图2 为实施例3中的分步醇沉的试验结果。 

具体实施方式

本发明中，由灵芝、姬松茸、香菇、金针菇其中三种或者三种以上药食两用真菌复合多糖提取物经多株益生菌发酵处理后得到的发酵产物常常被简称为发酵组合物。 

实施例1 ：益生菌发酵灵芝、姬松茸、香菇、金针菇的发酵组合物的制备 

取干燥的灵芝、姬松茸、香菇、金针菇子实体，采用普通粉碎技术将以上药食两用的真菌粉碎，灵芝、姬松茸、香菇、金针菇菌粉粉碎细度在65目以上。取真菌菌粉：灵芝4.0g、姬松茸30 g、香菇40 g、金针菇10 g，向菌粉中加入相当于复合菌粉重量60倍的饮用水浸泡30分钟，并于100℃加热1小时, 温度冷却至40℃左右时，按照3%（体积ml/重量g）的酶与复合菌粉的比例加入复合酶（纤维素酶：果胶酶：蛋白酶=1：2：1，泰安信得利生物工程有限公司生产），37℃~50℃酶解3小时后，煮沸10分钟灭酶，过滤，滤液减压浓缩至1000ml。即得到去除残渣的酶解复合多糖提取液。向去除残渣的酶解复合多糖提取液中加入葡萄糖0.5%（重量g/体积ml）、无机盐（硫酸亚铁·7H₂O 5.0mg/100ml、硫酸锌·7H₂O 4.4mg/100ml、硫酸镁·7H₂O 50mg/100ml、磷酸二氢钾 100mg/100ml、磷酸氢二钾·3H₂O 100mg/100ml），调整pH7.0左右，115℃下加热40分钟灭菌。当温度降至39℃左右时，接入预培养好的两歧双歧杆菌（正常人体分离，经中国科学院微生物研究所鉴定）和短双歧杆菌（AS 1.2213）菌液，接种量均为0.5%（体积/体积）。发酵6小时后，再接入预培养的德氏乳杆菌（AS 1.1480）、嗜酸乳杆菌（AS 1.1854）菌液各 0.5%（体积/体积）。发酵培养温度为37℃左右，继续发酵20~22小时。pH值降至4.0以下时，结束发酵，即得到多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物。

实施例2：益生菌发酵姬松茸、香菇、金针菇复合真菌菌粉的发酵组合物的制备 

取干燥的姬松茸、香菇、金针菇子实体，粉碎，要求菌粉能通过65目筛，取真菌菌粉：姬松茸20 g、香菇20 g、金针菇10 g，加饮用水1000ml浸泡1小时，100℃下加热1小时，温度冷却至40℃左右时，按照3%（体积ml/重量g）的酶与复合菌粉的比例加入复合酶（纤维素酶：果胶酶：蛋白酶=1：2：1，泰安信得利生物工程有限公司生产），37℃~50℃酶解3小时后，煮沸10分钟灭酶，得到留有残渣的酶解复合多糖提取液。然后加入葡萄糖0.5%（重量/体积）、无机盐（硫酸亚铁·7H₂O 5.0mg/100ml、硫酸锌·7H₂O 4.4mg/100ml、硫酸镁·7H₂O 50mg/100ml、磷酸二氢钾 100mg/100ml、磷酸氢二钾·3H₂O 100mg/100ml），调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟。当温度降至39℃左右时，接入预培养好的两歧双歧杆菌（正常人体分离，经中国科学院微生物研究所鉴定）和短双歧杆菌（AS 1.2213）菌液，接种量均为0.5%（体积/体积）。发酵6小时后再接入预培养的德氏乳杆菌（AS 1.1480）和植物乳杆菌（AS 1.19）菌液，接种量均为0.5%（体积/体积）。37℃继续发酵20~22小时，当pH值降至4.0时，结束发酵，经过离心去除残渣后，即得到多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物。

实施例3：肠道益生菌发酵姬松茸、香菇、金针菇真菌菌粉复合多糖发酵组合物与未发酵组合物多糖分子量分布变化 

选用实施例2制备的样品，并以未经益生菌发酵的组合物为对照。

试验的目的是检验经过益生菌发酵转化后，复合药食两用真菌的多糖分子量分布情况。在多糖的提取实验中，醇沉是多糖分离纯化的第一步操作，而醇沉是依据分子量大小进行分离纯化的。在醇沉浓度较小时，能够沉淀下来的多糖往往是分子量较大的多糖。醇沉浓度不同，多糖分子量的组成和得率不同，可以了解多糖分子量的分布范围。 

多糖含量测定：按照“NY/T 1676 食用菌中粗多糖含量的测定”规定的方法进行。 

分级醇沉：取真菌菌粉复合多糖发酵组合物与未发酵组合物样品离心上清液各5份,每份1.00ml,乙醇沉淀多糖，最终醇浓度为20% 、40%、60% 、80%和90% ，总体积25ml。将沉淀用蒸馏水溶解，并定容至25ml，按照“NY/T1676 食用菌中粗多糖含量的测定”规定的方法测定各样品多糖含量。 

分级醇沉：取益生菌发酵姬松茸、香菇、金针菇真菌菌粉复合多糖发酵组合物样品离心上清液各5份,每份1.00ml,乙醇沉淀多糖，最终醇浓度为20% 、40%、60% 、80%和90% ，总体积25ml。将沉淀用蒸馏水溶解，并定容至25ml，按照“NY/T1676 食用菌中粗多糖含量的测定”规定的方法测定各样品多糖含量。 

附图1是本实施例分级醇沉的试验结果。从图中可以看出，真菌菌粉复合多糖发酵组合物与未发酵组合物样品，其分级醇沉的试验结果呈现出基本相同的变化趋势， 即各级醇沉对应的多糖提取率随醇浓度的升高而呈增加的趋势； 当醇浓度为20％ ，只能沉淀出少量多糖，随着乙醇浓度的增加，各级醇沉对应的多糖得率随醇浓度的升高而呈增加的趋势。但是在乙醇浓度80％ 时，真菌菌粉复合多糖发酵组合物样品多糖含量明显低于真菌菌粉复合多糖未发酵组合物样品，而在乙醇浓度为90％ 时，真菌菌粉复合多糖发酵组合物样品多糖含量显著高于未发酵组合物样品，提示真菌菌粉复合多糖发酵组合物中的多糖分子量较小，在乙醇浓度较高时，才能够沉淀出来。 

分步醇沉：取真菌菌粉复合多糖发酵组合物与未发酵组合物离心上清液各1份,每份1.00ml，分别加乙醇调醇浓度为20％ 进行醇沉淀， 总体积为25ml,收集沉淀；用蒸馏水溶解并定容至25ml，检测多糖含量。将上清液水浴蒸干，用1.0ml蒸馏水溶解后，醇沉，使最终酒精浓度为40%，总体积为25ml。依此类推至醇浓度为90％ 进行醇沉， 收集沉淀，用蒸馏水溶解并定容至25ml，按照“NY/T1676 食用菌中粗多糖含量的测定”规定的方法测定各样品多糖含量。 

附图2 是本实施例分步醇沉的试验结果。从图中可以看出，真菌菌粉复合多糖发酵组合物样品与未发酵组合物样品，其分步醇沉的试验结果显示，在乙醇浓度为20%时，沉淀出的真菌多糖较少，酒精浓度为40%和60%时，沉淀出的多糖较多，但是真菌菌粉复合多糖发酵组合物样品多糖的含量低于未发酵组合物样品，提示真菌菌粉复合多糖发酵组合物样品分布在20％～60％ 醇沉浓度范围的较大分子量的多糖所占比例低于未发酵组合物样品大分子量的多糖含量。在酒精浓度为80%和90%时，沉淀出的多糖较少，但是真菌菌粉复合多糖发酵组合物样品多糖的含量高于未发酵组合物样品，提示真菌菌粉复合多糖发酵组合物样品分布在80％～90％ 醇沉浓度范围的较小分子量的多糖所占比例高于未发酵组合物样品小分子量的多糖含量。 

通过对益生菌发酵姬松茸、香菇、金针菇真菌菌粉复合多糖发酵组合物与未发酵组合物分级醇沉和分步醇沉试验，结果显示，真菌菌粉复合多糖发酵组合物样品与未发酵组合物样品比较，多糖分子量分布发生了明显的变化，其大分子量多糖含量明显降低，小分子量多糖含量明显提高。 

实施例4 益生菌发酵灵芝、姬松茸、香菇、金针菇发酵组合物与未发酵组合物体外抑制肿瘤细胞增殖试验 

选用实施例1制备的样品，并以未经益生菌发酵的组合物为对照。

取对数生长期HeLa(人宫颈癌细胞)系细胞，在96孔培养板中接种细胞，每孔加含5000个细胞的培养液100μl，预培养24h后，加各浓度的益生菌发酵灵芝、姬松茸、香菇、金针菇的发酵组合物与未发酵组合物（将两个样品均进行对倍稀释）。每个浓度及空白对照均设3个复孔。分别培养24、48和72h后，加10μl CCK-8液，再培养2h。然后，用酶联免疫测定仪测定各孔于450nm下的A值，计算对肿瘤细胞增殖抑制率。结果见下表： 

与对照组相比，p值均<0.01。

未发酵组与发酵组同时间点同浓度相比，*p<0.01，**p<0.001。 

抑制率(％)=(对照组A值一实验组A值)／对照组A值x100％。 

由上表可以看出，益生菌发酵灵芝、姬松茸、香菇、金针菇发酵组合物与未发酵组相比，对实验用肿瘤细胞抑制效果明显增强，差异显著（p<0.01）。且发酵组对试验用肿瘤细胞的抑制效果随作用时间延长，作用浓度增加而增强。由于益生菌的发酵代谢作用，使复合真菌多糖分子量变小，增强了对肿瘤细胞的抑制作用。  

Claims (10)

1.一种多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物，其特征在于：将灵芝、姬松茸、香菇、金针菇中的任意三种或三种以上经由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成的复合酶酶解提取的药食两用真菌复合多糖提取物，利用双歧杆菌和乳杆菌共生发酵制成。

2.根据权利要求1所述的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物，其特征在于：所选用的药食两用真菌灵芝、姬松茸、香菇、金针菇其重量g/体积ml比为：灵芝0-1.0%、姬松茸0-5.0%、香菇0-9.0%、金针菇0-5.0%。

3.根据权利要求1或2所述的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物，其特征在于：所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌中的一种或两种及以上；所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌中的一种或两种及以上。

4.根据权利要求1或2所述的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物，其特征在于：所述的双歧杆菌为两歧双歧杆菌和短双歧杆菌；所述的乳杆菌选自植物乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌。

5.一种多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物的制备方法，按照以下步骤进行：

1）粉碎：将灵芝、姬松茸、香菇、金针菇中的任意三种或三种以上药食两用真菌子实体进行粉碎，菌粉粉碎细度在65目以上，得到复合真菌菌粉；

2）制备发酵底物：取复合真菌菌粉，加入适量水浸泡，然后加入由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成的复合酶酶解，添加一定量的葡萄糖和无机盐，灭菌，得到益生菌发酵底物；

3）发酵：在益生菌发酵底物中接种预培养的各约体积百分比为0.5%的一种或两种及以上双歧杆菌菌液，常规培养约2~6小时后，再次接种预培养的各约体积百分比为0.5%的一种或两种及以上乳杆菌菌液，继续发酵20~22小时，当pH值降至4.0以下时，结束发酵，即得到多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物。

6.根据权利要求5所述的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的葡萄糖含量为重量g/体积ml比0.5%；所述的无机盐为硫酸亚铁·7H₂O 5.0mg/100ml、硫酸锌·7H₂O 4.4mg/100ml、硫酸镁·7H₂O 50mg/100ml、磷酸二氢钾 100mg/100ml、磷酸氢二钾·3H₂O 100mg/100ml。

7.根据权利要求5所述的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌；所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌。

8.根据权利要求5-7任一项所述的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物的制备方法，其特征在于：

所述步骤2）的制备发酵底物中，在复合真菌菌粉中加入相当于复合真菌菌粉重量60倍的饮用水，并浸泡30分钟以上，然后于100℃下加热1小时，温度冷却至40℃左右时，按照体积ml/重量g比 3%的酶与复合菌粉的比例加入复合酶， 37℃~50℃酶解3小时后，煮沸10分钟灭酶，过滤，收集滤液，并减压浓缩至复合真菌菌粉的浓度为重量g/体积ml比3.0-20%，得到去除残渣的酶解多糖提取液；加入葡萄糖和无机盐，调整pH值至7.0左右，于115℃灭菌40分钟，得到益生菌发酵底物；

所述的复合酶为纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=1:2:1，泰安信得利生物工程有限公司生产；

当益生菌发酵底物的温度降至39℃左右时，按照步骤3）发酵，得到多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物。

9.根据权利要求5-7任一项所述的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物的制备方法，其特征在于：

所述步骤2) 的制备发酵底物中，在复合真菌菌粉中加饮用水，使复合菌粉总量为重量g/体积ml比3.0-20%，浸泡1小时后，100℃下加热1小时，温度冷却至40℃左右时，按照体积ml/重量g比 3%的酶与复合菌粉的比例加入复合酶， 37℃~50℃酶解3小时后，煮沸10分钟灭酶，得到留有残渣的酶解多糖提取液；再加入葡萄糖和无机盐，调整pH值至7.0左右，115℃灭菌40分钟，得到益生菌发酵底物；

所述的复合酶为纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=1:2:1，泰安信得利生物工程有限公司生产；

当益生菌发酵底物的温度降至39℃左右时，按照步骤3）发酵，得到留有残渣的发酵液，经过离心去除残渣后，即得到多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物。

10.一种权利要求1所述的多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物在提高机体免疫力、预防和治疗肿瘤的药物或者保健品中的应用。

Images