CN108371270B - 黑果枸杞酵素的制备工艺及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种黑果枸杞酵素的制备工艺及其产品。所述黑果枸杞酵素原料包括黑果枸杞、玛咖、蕨麻、沙棘粉以及菊粉。本发明以黑果枸杞为主要原料生产酵素产品，产品生产中无需高温加热环节，产品中的花青素可得到有效保存，在保持水果酵素产品特点的基础上，可充分发挥黑枸杞花青素的保健功效。经过发酵，使原料中的活性物充分浸出，并使淀粉、多糖类物质得到充分转化，因此，黑枸杞酵素产品富含玛咖、蕨麻等配料的营养及活性物成分。采用发酵工艺改变产品口味特性，克服枸杞、玛咖药性味过浓，带有苦涩味的缺陷，使产品风味及口感更容易被消费者接受。本发明所述酵素产品具有抗疲劳、通便、抗氧化、美容之功效。

Description

黑果枸杞酵素的制备工艺及其产品
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，特别是涉及一种黑果枸杞酵素的制备工艺及其产品。
背景技术
黑果枸杞花青素含量居浆果之首，具有清除自由基、抗氧化功能；黑果枸杞提取物具有降血脂、降血糖、抗氧化、免疫调节、延缓衰老、预防及治疗心血管疾病和抗癌的功效。
在目前黑枸杞产品开发中，除黑枸杞原果产品外，大多数企业及研究者注重于原果压片、色素压片、果汁饮料等产品开发，但液态饮料产品在产品加工中难免采用高温杀菌环节，产品加工过程中受热程度高，产品花青素氧化降解明显，产品中最终花青素含量极低，使其保健价值大打折扣。
酵素产品采用复杂配方及复杂的微生物菌系进行发酵，产品保存中依靠高酸度，高固形物含量，有益微生物优势菌落抑制腐败微生物，低水分活度等特性延长产品保存期，特别是高酸度环境有利于花青素的稳定性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种黑果枸杞酵素，按重量份计，原料包括：黑果枸杞15～25份，玛咖2～4份，蕨麻3～5份，沙棘粉2～5份，菊粉5-10份，
其余为水、甜味剂和碳源物质。
菊粉以菊芋(洋姜)或菊苣的根状茎为原料，去除蛋白，胶质，粗纤维和矿物质，经水提取，离子交换，膜过滤，喷雾干燥等生产工艺得到粉状产品，主要成分为31个β-D-呋喃果糖和1～2个吡喃菊糖残基聚合而成，果糖残基之间能通过β-2，1-键连接而成的直链多糖，本产品研制期间采用的菊粉购自寰龙特种糖业有限公司，产地青海省。
所述碳源物质为菌种发酵提供碳源。
进一步，按重量份计，原料包括：黑果枸杞20份，玛咖3份，蕨麻5份，沙棘粉2份和菊粉5份，或，
黑果枸杞25份，玛咖2份，蕨麻5份，沙棘粉3份和菊粉7份，或，
黑果枸杞15份，玛咖4份，蕨麻3份，沙棘粉5份和菊粉10份。
进一步，所述甜味剂为蜂蜜，所述碳源物质为碳水化合物，蜂蜜为13-20份，碳水化合物为20-25份，进一步蜂蜜为13份，碳水化合物为20份。
进一步，所述黑果枸杞既可用鲜果也可用干果，果实打浆后使用，采用鲜果时鲜果加无菌水后直接打浆，采用干果时加水浸泡并杀菌然后打浆。
进一步，所述玛咖和蕨麻打浆后使用，打浆前先用水浸泡并煮制，然后过滤除去部分滤液，剩余部分打浆。
本发明还提供了黑果枸杞酵素的制备工艺，制备工艺包括如下步骤：
(1)原料打浆
黑果枸杞可采用鲜果或干果，若为鲜果，则鲜果加入无菌水直接打浆；若为干果，先将干果加入水中浸泡，并加热至90℃杀菌，然后打浆；
玛咖和蕨麻先用水浸泡，并加热至90℃杀菌，过滤除去部分滤液，剩余部分打浆；
(2)第一阶段发酵
将沙棘粉、枸杞浆、玛咖浆、蕨麻浆和四分之一重量的碳源物质混匀成浆液，并接菌种密封发酵，菌种的接种量占混合浆液重量百分比为3％～4％，发酵温度为25～28℃，进一步发酵温度为28℃，发酵时间为5-10天，进一步发酵时间为5天；
(3)第二阶段发酵
将第一阶段发酵的液体加入同等体积的无菌水并过滤除渣，然后加入菊粉、甜味剂及剩余碳源物质在步骤(2)所述条件下继续发酵15-45天；进一步发酵时间为15天；
(4)浓缩或调配。
浓缩后直接制成液态酵素饮品，或者，根据消费者口感需求，加入常规使用的配料，比如甜味剂或香精，制成不同口感的饮品。浓缩采用常规的浓缩技术，比如膜浓缩。
进一步，所述步骤(1)中鲜果与无菌水的重量比为1:2；干果与水的重量比为1:4；玛咖或蕨麻与水的重量比为1:2；加热杀菌时间为30～45min。
进一步，所述步骤(2)中接种所用菌种为植物乳杆菌、红茶菌和酵素菌的混合菌，三种菌种的重量比为1:1:1，或接种所用菌种为单一菌种植物乳杆菌或单一菌种酵素菌。
酵素菌种可采用商业发酵剂，应包含乳酸菌、酵母等微生物菌种，适用于果蔬酵素产品的生产，可加快发酵速度，有利于丰富发酵及产品中的微生物类型。本产品研发中采用的酵素菌来源于市售商业发酵剂，商品名称为“速效酵素菌剂”，生产商为西安惠可欣微生物研究中心，公司地址西安市长安区镐京工业园。
进一步，所述步骤(4)中浓缩后还有干燥的步骤。
干燥采用常规干燥技术，比如喷雾干燥，干燥后可获得固态酵素产品。
本发明还提供了黑果枸杞酵素抗疲劳、防治便秘的用途。
进一步提供了黑果枸杞酵素在降低机体血清尿素和乳酸含量，维持机体肝糖原高水平方面的应用。
玛咖，即玛卡，拉丁文名Lepidium meyenii Walp.。传统上用于强壮身体，提高生育力，改善性功能，抗抑郁，抗贫血等，还具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤的效果。
蕨麻，(拉丁学名：Potentilla anserina L.)，别称人参果。具有壮骨、利尿消肿等功效。
沙棘，(拉丁学名：Hippophae rhamnoides Linn.)，具有抗疲劳和增强机体活力及抗癌等特殊药理性能，有降减血浆胆固醇、减少血管壁中胆固醇含量的作用，能防治高血脂症和动脉粥样硬化症，并有促进伤口愈合的作用。
本发明的有益效果是：本发明以黑果枸杞为主要原料生产酵素产品，产品生产中无需高温加热环节，产品中的花青素可得到有效保存，在保持水果酵素产品特点的基础上，可充分发挥黑枸杞花青素的保健功效。经过发酵，使原料中的活性物充分浸出，并使淀粉、多糖类物质得到充分转化，因此，黑枸杞酵素产品富含玛咖、蕨麻、沙棘等配料的营养及活性物成分。采用发酵工艺改变产品口味特性，克服枸杞、玛咖药性味过浓，带有苦涩味的缺陷，使产品风味及口感更容易被消费者接受。本发明通过配方及工艺优化，保证有益微生物适应特殊的配料，使活菌数增值达到有效水平，通过配料使产品具有抗疲劳、通便、防治便秘、抗氧化、美容之功效。
具体实施方式
实施例1
一种黑果枸杞酵素，按重量份计，黑果枸杞酵素的原料包括：
黑果枸杞20份，玛咖3份，蕨麻5份，沙棘粉2份，菊粉5份，蜂蜜为13份，红糖为20份，其余为水。
黑果枸杞酵素的制备工艺，包括如下步骤：
(1)原料打浆
干净的黑果枸杞鲜果加入无菌水直接打浆；鲜果与无菌水的重量比为1:2；
干净的玛咖或蕨麻先用水浸泡，玛咖或蕨麻与水的重量比为1:2，并加热至90℃杀菌45min，过滤除去部分滤液，剩余部分打浆，打浆过程可适当加入无菌水；
(2)第一阶段发酵
将沙棘粉、枸杞浆、玛咖浆、蕨麻浆和四分之一重量的红糖混匀成浆液，并接菌种密封发酵，所用菌种为植物乳杆菌、红茶菌和酵素菌的混合菌，三种菌种的重量比为1:1:1，菌种的接种量占混合浆液重量百分比为3～4％，发酵温度为28℃，发酵时间为5天；
(3)第二阶段发酵
将第一阶段发酵的液体加入同等体积的无菌水并过滤除渣，然后加入菊粉、蜂蜜及剩余红糖在步骤(2)所述条件下继续发酵15天；
(4)膜浓缩。
浓缩后直接制成液态酵素饮品。
实施例2
一种黑果枸杞酵素，按重量份计，黑果枸杞酵素的原料包括：
黑果枸杞25份，玛咖2份，蕨麻5份，沙棘粉3份，菊粉7份，蜂蜜为17份，红糖为23份，其余为水。
黑果枸杞酵素的制备工艺，包括如下步骤：
(1)原料打浆
干净的黑果枸杞加入水中浸泡，并加热至90℃杀菌30min，然后打浆；干果与水的重量比为1:4；
干净的玛咖或蕨麻先用水浸泡，玛咖或蕨麻与水的重量比为1:2，并加热至90℃杀菌45min，过滤除去部分滤液，剩余部分打浆，打浆过程可适当加入无菌水；
(2)第一阶段发酵
将沙棘粉、枸杞浆、玛咖浆、蕨麻浆和四分之一重量的红糖混匀成浆液，并接菌种密封发酵，所用菌种为植物乳杆菌，菌种的接种量占混合浆液重量百分比为3％，发酵温度为25℃，发酵时间为10天；
(3)第二阶段发酵
将第一阶段发酵的液体加入同等体积的无菌水并过滤除渣，然后加入菊粉、蜂蜜及剩余红糖在步骤(2)所述条件下继续发酵45天；
(4)膜浓缩
(5)喷雾干燥
干燥后包装得到固体酵素产品。
实施例3
一种黑果枸杞酵素，按重量份计，黑果枸杞酵素的原料包括：
黑果枸杞15份，玛咖4份，蕨麻3份，沙棘粉5份，菊粉10份，蜂蜜20份，白糖25份，水。
黑果枸杞酵素的制备工艺，包括如下步骤：
(1)原料打浆
干净的黑果枸杞干果加入水中浸泡，并加热至90℃杀菌30min，然后打浆；干果与水的重量比为1:4；
干净的玛咖或蕨麻先用水浸泡，玛咖或蕨麻与水的重量比为1:2，并加热至90℃杀菌45min，过滤除去部分滤液，剩余部分打浆，打浆过程可适当加入无菌水；
(2)第一阶段发酵
将沙棘粉、枸杞浆、玛咖浆、蕨麻浆和四分之一重量的白糖混匀成浆液，并接菌种密封发酵，所用菌种为植物乳杆菌、红茶菌和酵素菌的混合菌，三种菌种的重量比为1:1:1，菌种的接种量占混合浆液重量百分比为4％，发酵温度为28℃，发酵时间为5天；
(3)第二阶段发酵
将第一阶段发酵的液体加入同等体积的无菌水并过滤除渣，然后加入一半重量的菊粉、四分之三重量的蜂蜜及剩余白糖在步骤(2)所述条件下继续发酵15天；
(4)调配
加入剩余蜂蜜、菊粉，以及占总重量0.5％的山梨酸钾制成液态饮品。
一、配方及工艺优化
1.玛咖原料处理方式的选择
以实施例1所述原料配方生产酵素，玛咖原料采用破碎直接发酵、原玛咖煮制过滤后打浆发酵、玛咖液发酵三种方式应用于酵素产品配料中，通过对感官质量、微生物发酵速度影响来选择玛咖在酵素产品中生产中的处理方式，试验结果如下。
表1玛咖处理方式对酵素产品及发酵产酸的影响
破碎直接发酵 玛咖煮制，除去部分滤液后打浆发酵 玛咖液发酵
口感 有明显苦味 有玛咖淡淡的香味 有明显苦味
发酵5d后pH 5.3 4.5 5.4
感官质量评分 75 88 74
玛咖的添加方式可直接影响酵素产品的风味，以原玛咖直接发酵或将玛咖水提物作为酵素原料，酵素产品的苦味过于明显，对大多数消费者来讲很难接受。玛咖的添加也会影响微生物生长速度，影响产酸，考虑到在酵素制造过程中，能被微生物转化的玛咖成分主要是碳水化合物，因此，对玛咖原料采用水煮的方式，除去一部分活性成分和带有明显药味的物质，有利于微生物生长，可以在较短时间内完成发酵过程，同时，产品的感官质量评分较高。玛咖的部分水提物可采用浓缩的方式保存，用于开发口服液等产品，也可在酵素完成发酵过程后，在酵素产品中进行强化添加，以提高玛咖活性成分的含量。因此，在酵素生产中，首先，玛咖进行水煮，除去部分一部分水煮液，以便降低产品中的苦味成分，然后适量加水打浆，并与其它原料一起发酵。反复试验结果表明玛咖与水的比例为1:3，水煮时间为45min，然后除去50％-60％的水煮液，加适量的无菌水打浆，无菌水的添加量为发酵液总体积的20％。
2.蕨麻原料处理方式的选择
以实施例1所述原料配方生产酵素，蕨麻原料采用破碎直接发酵、蕨麻煮制过滤后打浆发酵、蕨麻水提液发酵三种方式应用于酵素产品配料中，通过对感官质量、微生物发酵速度影响来选择玛咖在酵素产品中的应用，试验结果如下。
表2蕨麻处理方式对酵素产品及发酵产酸的影响
Figure BDA0001582498740000051
Figure BDA0001582498740000061
蕨麻经过水煮后，可减轻加速产品的苦涩味，经水煮打浆后用于酵素产品生产，在保证产品良好口味的基础上，能保证蕨麻中的碳水化合物得到有效转化。因此，在酵素产品生产中，蕨麻采用水煮后除去部分水煮液，然后加水打浆。蕨麻的处理方式对微生物的生长基本没有影响。蕨麻与水的比例为1:3，水煮时间为45min，然后除去50％-60％的水煮液，加适量的无菌水打浆，无菌水的添加量为发酵液总体积的20％。
3.黑果枸杞处理方式对发酵结果的影响
黑枸杞采用流水快速清洗，清洗后90℃水浴杀菌，清洗后紫外灯照射三种方式，研究对发酵结果的影响。黑枸杞原料必须进行一定程度的杀菌处理，防止黑枸杞表面的杂菌过度生长而影响发酵过程，尤其是霉菌的生长会导致发酵过程的失败。黑枸杞与水的比例采用1:4，黑枸杞复水后，打浆，并在90℃水浴杀菌30min。
表3黑枸杞处理方式对酵素产品及发酵的影响
流水快速清洗 90℃水浴杀菌 紫外灯照射
发酵状态 大量气泡，表面长霉 无明显产气，无霉菌生长 大量气泡，表面长霉
发酵5d后pH 4.3 4.5 4.2
4.黑枸杞酵素发酵方式的选择
黑枸杞酵素的生产采用了自然发酵(黑枸杞不杀菌)和杀菌后，接种特定微生物菌种的方法，试验的结果如下。结果显示，自然发酵虽然可以在一定时间内使酸度降低到4.3左右，但酵素液表面有大量霉菌生产，酵素带有明显异味，甚至腐败的味道。
表4发酵方式对酵素产品及发酵的影响
Figure BDA0001582498740000062
5.黑枸杞酵素主要配料筛选的试验结果
在单因素试验及对物料处理方式的基础上，采用正交试验探讨了黑枸杞酵素产品配方的主要原料配比，配方配比的选择主要采用感官评价，由12名食品专业的学生和教师，根据感官质量评价表，对不同配方的酵素产品进行感官评价，并给出评分。主要原料配比及评价结果见正交试验结果表，其他原料以实施例1添加量为准。
表5黑枸杞酵素产品主要配料筛选正交试验结果
试验序号 黑枸杞(％) 玛咖(％) 蕨麻(％) 红糖(％) 感官评分
1 15 2 3 20 84
2 15 3 4 22 82
3 15 4 5 24 78
4 20 2 4 24 87
5 20 3 5 20 91
6 20 4 3 22 80
7 25 2 5 22 81
8 25 3 3 24 78
9 25 4 4 20 75
根据感官评价及正交试验配方筛选试验结果，确定黑枸杞酵素的基本原料配比为黑枸杞20％，玛咖3％，红糖20％(初次发酵加5％，发酵5天过滤后加糖15％)，蕨麻5％。
6.黑枸杞酵素发酵温度的选择试验结果
以黑枸杞酵素感官质量，发酵速度，发酵状态为指标，综合评价发酵温度对黑枸杞酵素质量的影响，试验结果见下表。
表6黑枸杞酵素发酵温度对产品感官质量及产酸速度的影响试验结果
22℃ 25℃ 28℃ 31℃
酵素感官质量评分 87 88 85 76
5d后酸度(pH) 5.0 4.5 4.3 3.8
由温度试验结果可见，温度越高，发酵速度越快，产品发酵5d的酸度越低，但发酵温度过高，容易使产品过酸，同时，产品伴随有不愉快的气味，产品感官质量较差，黑枸杞酵素的发酵温度在25-28℃比较适宜。发酵温度低于18℃，微生物生长较慢，发酵过程缓慢。
二、抗疲劳实验
1、实验材料
SPF级BALB/c小鼠110只，雄性，体重18～22g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。动物饲养室温度为20～24℃，湿度为40％～65％。所有动物无病原菌，自由饮食，所食饲料为SPF级小鼠专用饲料，由北京科奥协力饲料有限公司提供。饮用灭菌水，适应期为7d。
2、实验步骤及结果
(1)剂量分组
将66只18-22g的小鼠在实验条件下适应7d后，按体重随机分为三组，A组和B组服用下述配方制得的酵素产品，阴性对照组(给予灭菌水)。每组22只。然后每天早上8:30～10:00经口灌胃，灌胃容积为0.2mL/(只.d)。连续灌胃25d后进行功能评价，试验期间自由饮食。
A组服用酵素原料配方
按重量份计，黑果枸杞10份，红果枸杞10份，玛咖3份，蕨麻5份，沙棘粉2份，蜂蜜13份，红糖20份。
B组服用酵素原料配方
按重量份计，黑果枸杞20份，玛咖3份，蕨麻5份，沙棘粉2份，蜂蜜13份，红糖20份，菊粉5份。
(2)负重游泳实验
运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间的长短可以反映动物运动疲劳的程度。
末次给予受试样品30min后，从各组随机取出5只小鼠，使其负重5％体重的铅皮置于游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温25±1.0℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。
表7酵素产品对小鼠负重游泳时间(ST)的影响
Figure BDA0001582498740000081
疲劳的最主要表现是运动耐力的下降，运动耐力是反映机体疲劳最直接、最客观的指标。负重游泳时间可反映小白鼠抗疲劳的能力。黑果枸杞酵素产品对小鼠负重游泳时间的影响见表7。由表7可知，对小鼠灌胃25d后，与对照组相比较，剂量组组小鼠负重游泳时间明显延长(p<0.05)。结果表明，黑枸杞酵素产品可以延长小鼠负重游泳时间，提高小鼠抗疲劳能力，其中A组为优势剂量组。
(3)肝糖原测定
测定原理
蒽酮可与游离糖或多糖起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。测定其光密度，可以确定糖原的含量。
测定方法
末次给予受试样品30min后，从各组随机取出8只小鼠，将其处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取100mg，加入8mL三氯醋酸，每管匀浆1min，将匀浆液倒入离心管，以3000r/min离心15min，将上清液转移至另一试管中。取1mL上清液放入10mL离心管中，加入95％乙醇4mL，用干净塞子塞上，室温下竖立放置过夜。沉淀完全后3000r/min离心15min，倒掉上清液使试管竖立放置10min。
制作试剂空白和标准管：
试剂空白：吸2mL蒸馏水到干净离心管。
标准管：吸0.5mL葡萄糖标准液(含100mg/dL葡萄糖)和1.5mL蒸馏水放入同样的管子。
此时对空白管、标准管及各测定管分别加入10mL蒽酮试剂，液流(蒽酮试剂)直接进入管子中央，保证充分混合好。从管子中注入蒽酮试剂起，将管子放在冷水龙头下冲凉。在所有管子都达到凉水温度后，将其浸于沸水浴(水浴深度略高于管子液面)15min，然后移到冷水浴。将管内液体移入比色管，在620nm波长下，用试剂空白管调零后测定吸光度。根据所称取的肝脏重量换算成肝糖原含量(以mg/g肝表示)，并进行统计分析。
肝糖原含量计算公式如下：
Figure BDA0001582498740000091
式中：
DU：样品管吸光度
DS：标准管吸光度
0.5：为0.5mL葡萄糖标准溶液中的葡萄糖含量
0.9：为将葡糖糖换算成糖原的系数
提取液体积：为8mL
肝组织克数：为0.1g
糖原的含量能说明疲劳发生的快慢或程度，肝糖原的作用主要是在饥饿或运动状态下分解进入血液，以维持血糖的稳定，这在耐力运动中尤为重要，肝糖原的储备不足可能会导致疲劳提前发生。
黑枸杞酵素产品对小鼠肝糖原含量影响的试验结果见表9。由表9可知，各组比较，试验组肝糖原水平明显高于对照组(p<0.01)。结果表明，黑枸杞酵素产品对维持肝糖原的高水平含量有十分积极的作用，其中A组为优势剂量组。
(4)血清尿素测定
测定原理：样品中尿素在氯化高铁－磷酸溶液中与二乙酰肟和硫胺脲共煮，形成一种红色的化合物Diazine，其颜色的深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准管比较，可求出尿素的含量。
测定方法：末次给予受试样品30min后，从各组随机取出8只小鼠，在温度为30℃的水中不负重游泳90min，休息60min后拔眼球采全血0.5mL。置4℃冰箱约3h，血凝固后2000pm/min离心15min，取血清备用。按照尿素试剂盒进行操作，测定尿素氮的含量。
试剂盒操作步骤按下表8进行：
表8血尿酸试剂盒操作
Figure BDA0001582498740000101
充分混匀，置于沸水浴10min，再于冷水中冷却。在520nm波长处，以蒸馏水调零，测定各管吸光度值。
尿素含量计算公式如下：
Figure BDA0001582498740000102
式中：
标准液浓度值为200mg/L。
表9酵素产品对小鼠肝糖原含量和血清尿素氮(BUN)的影响
Figure BDA0001582498740000103
Figure BDA0001582498740000111
血清尿素是蛋白质代谢的终产物，在激烈运动时血清尿素含量增高。研究表明，机体血清尿素含量随运动强度的增加而增加，机体对负荷的适应能力越差，血清尿素的增加就越明显。因此血清尿素可以灵敏的反映疲劳，是评价长时间中等强度机体疲劳最常用的的指标。在功能评价时血清尿素氮的含量直接代表了血清尿素氮水平。
黑枸杞酵素对小鼠血清尿素氮含量的影响试验结果见表9。由表9可知，各组比较，对照组与两个剂量组有显著差异(p<0.01)，剂量组组小鼠血清尿素氮水平低于对照组；两个剂量组之间无显著差异。表明黑黑枸杞酵素产品可以适当降低小鼠血清尿素水平。
(5)血乳酸测定
测定原理在铜离子催化下，乳酸与浓硫酸在沸水中反应，乳酸转化为乙醛，乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物，在波长560nm处有强烈的光吸收，故可进行定量测定。
测定方法：末次给予受试样品30min后，从各组随机取出8只小鼠，不负重在30℃水中游泳10min后停止。于游泳前、游泳结束时以及游泳后休息20min,对小鼠进行内眦取血，每次20μL。
自配试剂测定：于5mL试管中加入0.48mL1％NaF溶液，准确吸取全血20μL加入试管底部，再加入1.5mL蛋白沉淀剂，振荡混匀，于3000r/min离心10min，取上清液，按下表10操作。
表10血乳酸测定
Figure BDA0001582498740000112
上述步骤完成后，摇匀，置30℃水浴30min，取出后放入沸水浴中加热90s，取出冷却至室温，在560nm处测定吸光值。
血乳酸含量计算公式如下：
Figure BDA0001582498740000113
式中：
Au：测定管吸光度
As：标准管吸光度
剧烈运动时，由于机体缺氧，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为酸性代谢产物血乳酸。血乳酸浓度升高时可引起组织pH值下降，破坏机体内环境的平衡，影响正常代谢，并引起肌肉收缩力和运动力的下降。因此，血乳酸在机体中的蓄积是导致运动性疲劳的一个重要原因。剧烈运动后血乳酸水平反映机体的疲劳程度，减少血乳酸的产生或加快血乳酸的清除，都可延缓疲劳的发生或加速疲劳的消除。血乳酸水平可以反映有氧代谢能力、疲劳的产生和消除速度，是判断是否疲劳的一个重要因素。
表11酵素产品对血乳酸值(BLA)的影响
Figure BDA0001582498740000121
黑果枸杞酵素对小鼠血乳酸值的影响试验结果见表11。由表11可知，各组对血乳酸曲线下面积进行比较，剂量组组低于对照组(p<0.01))。结果表明，黑果枸杞酵素产品不但能减少运动过程中乳酸的产生，还能及时帮助机体快速清除体内乳酸，从而达到抗疲劳的作用。
(6)安全性评价
在功能性指标的同时，每组动物分别称体重及心脏、肝脏、肾脏、脾脏的湿重，将各试验剂量组小鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏的湿重与对照组进行比较，最后进行统计分析。
两个配方的酵素产品对小鼠体重影响的测定结果见表12。由表12可知，试验各组小鼠的初期体重均无显著差异(P>0.05)。灌胃25d后，其体重均呈增长趋势，但末期各试验剂量组小鼠的体重与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)，结果表明黑枸杞酵素产品无明显增加小鼠体重的作用。
表12酵素产品对小鼠体重(BW)的影响
Figure BDA0001582498740000122
Figure BDA0001582498740000131
表13酵素产品对小鼠脏器湿重的影响
Figure BDA0001582498740000132
两种酵素产品对小鼠脏器湿重的影响测定结果见表13。由表13可知，对所有小鼠灌胃25d后，称量各试验组小鼠的脏器，计算后各试验剂量组小鼠的脏器湿重与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)，结果表明黑果枸杞酵素产品对小鼠脏器重量的影响不大，食用黑果枸杞酵素产品无毒副作用。
二、通便功能评价试验
(1)试剂配制
75％酒精溶液：取99.9％酒精溶液375mL加125mL蒸馏水，混合后制成。
墨汁的配制：准确称取阿拉伯树胶100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，称取活性炭(粉状)50g加至上述溶液中煮沸三次，待溶液冷却后加水定容至1000mL，与冰箱中4℃保存，用前摇匀。
排便试验复方地芬诺酯混悬液的配制：取复方地芬诺酯片50mg(20片)，用研钵研碎呈粉末后加蒸馏水至100mL，临用前配制。
肠运动试验复方地芬诺酯混悬液的配制：取复方地芬诺酯片25mg(10片)，用研钵研碎呈粉末后加蒸馏水至100mL，临用前配制。
无菌水：用250mL锥形瓶装满250mL自来水放至立式压力蒸汽灭菌器中121℃灭菌30min。
受试物：实施例1所述黑果枸杞酵素产品
(2)试验动物与分组
SPF雄性小白鼠(BALB/c)100只，体重18～22g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，其中50只进行排首粒黑便时间、排粪便粒数和粪便质量的测定试验，另外50只进行小肠运动试验。以实施例1酵素产品为试验对象，试验组分为低、中、高剂量组。两项试验均设5个试验组，分别是空白对照组、模型对照组以及受试物低、中、高剂量组(分别相等于人体推荐量的1倍、5倍和10倍)。采用灌胃法给予受试物，按每只0.2mL(每天灌1次)的容量灌胃。
(3)试验方法及结果
i)排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定
三个剂量组按0.2mL/只经口给予受试物，空白对照组和模型对照组给予等量的无菌水，每天灌胃一次，每天下午4点开始灌胃，连续给予受试物8d。末次给予受试物后，各组动物禁食不禁水16h，然后灌胃给予三个剂量组和便秘模型组10mg/kg的复方地芬诺酯混悬液0.4mL/只，空白对照组给予等量的无菌水。给予复方地芬诺酯混悬液30min后，低、中、高三个剂量组灌胃给予含相应受试物的墨汁(1:1混合)0.4mL/只，空白对照组和模型对照组给予等量的空白墨汁(水与墨汁1:1混合)，动物均单笼喂养，正常饮水进食。从灌墨汁开始，观察记录每只动物首次排黑便所需时间、6h排便粒数及重量。
黑果枸杞酵素对小鼠排便试验结果见表14。由表14可知，与空白对照组比较，模型对照组小鼠首次排黑便时间显著延长，6h排便粒数及重量明显减少(P<0.01)，说明便秘模型建立成功。各组首次排黑便时间存在差异(F＝5.904，P<0.01)，各剂量组与模型对照组比较，首次排黑便时间缩短，其中，中剂量组首次排黑便时间比模型对照组明显短(F＝13.227，P<0.01)。各组6h排便粒数有差异，各剂量组排便粒数都比模型组多。各组6h排便重量有明显差异(F＝9.944，P<0.01)，各剂量组与模型组比较，6h排便重量增加，差异显著(F＝3.253，0.01<P<0.05)，其中，中剂量组与模型对照组比较，差异显著(P<0.01)。
表14含菊粉黑果枸杞酵素对小鼠排便试验结果
Figure BDA0001582498740000141
注：与模型组比较，同列中未标记表示无显著差异，**p<0.01
ii)小肠运动试验
给受试物方法同排便试验。末次给予受试物后，各组动物禁食不禁水16h，然后三个剂量组和便秘模型组灌胃给予5mg/kg的复方地芬诺酯混悬液0.4mL/只，空白对照组给予等量的无菌水。30min后，低、中、高三个剂量组灌胃给予含相应受试物的墨汁(1:1混合)0.4mL/只，空白对照组和模型对照组给予等量的空白墨汁(水与墨汁1:1混合)。给予墨汁25min后立即脱颈椎处死动物，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按下列公式计算墨汁推进率(p)，并进行数据转换(x)后再进行方差分析。试验时一并剪取心脏、肝脏、脾脏、肾脏，放在天平上称量重量并进行方差分析。
Figure BDA0001582498740000151
V、X：墨汁推进率；LT：墨汁推进长度(cm)；LZ：小肠总长度(cm)
表15含菊粉黑果枸杞酵素对小鼠小肠运动试验墨汁推进率的影响
Figure BDA0001582498740000152
注：与模型组比较，**p<0.01
黑果枸杞酵素对小鼠小肠运动试验墨汁推进率的影响结果见表15。由表15可知，与空白组比较，模型对照组小鼠墨汁推进率显著减少(P<0.01)，说明建模成功。各组墨汁推进率存在明显差异(F＝20.009，P<0.01)，其中，各剂量组与模型对照组比较，推进距离增加，推进率提高(P<0.01)。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.黑果枸杞酵素，其特征在于，按重量份计，原料包括：黑果枸杞15～25份，玛咖2～4份，蕨麻3～5份，沙棘粉2～5份，菊粉5-10份，其余为水、甜味剂和碳源物质；
所述的黑果枸杞酵素的制备工艺包括如下步骤：
(1)原料打浆
黑果枸杞采用鲜果或干果，若为鲜果，则鲜果加入无菌水直接打浆；若为干果，先将干果加入水中浸泡，并加热至90℃杀菌，然后打浆；
玛咖和蕨麻先用水浸泡，并加热至90℃杀菌，过滤除去部分滤液，剩余部分打浆；
(2)第一阶段发酵
将沙棘粉、枸杞浆、玛咖浆、蕨麻浆和四分之一重量的碳源物质混匀成浆液，并接菌种密封发酵，菌种的接种量占混合浆液重量百分比为3％～4％，发酵温度为25～28℃，发酵时间为5-10天；
(3)第二阶段发酵
将第一阶段发酵的液体加入同等体积的无菌水并过滤除渣，然后加入菊粉、甜味剂及剩余碳源物质在步骤(2)所述条件下继续发酵15-45天；
(4)浓缩或调配。
2.如权利要求1所述的黑果枸杞酵素，其特征在于，按重量份计，原料包括：黑果枸杞20份，玛咖3份，蕨麻5份，沙棘粉2份和菊粉5份，或，
黑果枸杞25份，玛咖2份，蕨麻5份，沙棘粉3份和菊粉7份，或，
黑果枸杞15份，玛咖4份，蕨麻3份，沙棘粉5份和菊粉10份。
3.如权利要求1所述的黑果枸杞酵素，其特征在于，所述甜味剂为蜂蜜，所述碳源物质为碳水化合物，蜂蜜为13-20份，碳水化合物为20-25份。
4.如权利要求1所述的黑果枸杞酵素，其特征在于，所述步骤(1)中鲜果与无菌水的重量比为1:2；干果与水的重量比为1:4；玛咖或蕨麻与水的重量比为1:2；加热杀菌时间为30～45min。
5.如权利要求1所述的黑果枸杞酵素，其特征在于，所述步骤(2)中接种所用菌种为植物乳杆菌、红茶菌和酵素菌的混合菌，三种菌种的重量比为1:1:1，或接种所用菌种为单一菌种植物乳杆菌或单一菌种酵素菌。
6.如权利要求1所述的黑果枸杞酵素，其特征在于，所述步骤(4)中浓缩后还有干燥的步骤。
7.权利要求1～3任一项所述的黑果枸杞酵素在制备抗疲劳、防治便秘的产品中的应用。
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