WO2002012446A1

WO2002012446A1 - Culture et fermentation de bacteries intestinales benefiques pour la transformation et la modification de medicaments naturels

Info

Publication number: WO2002012446A1
Application number: PCT/CN2001/000616
Authority: WO
Inventors: Bingxin Wu; Lishan Dong; Xiaolin Sun; Hong Wang
Original assignee: Bingxin Wu; Lishan Dong; Xiaolin Sun; Hong Wang
Priority date: 2000-04-26
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2002-02-14
Also published as: KR100813914B1; CN1273839A; JP2004505625A; JP5000066B2; EP1279727A1; EP1279727A4; EP1279727B1; DE60139122D1; KR20020038596A; AU6890201A

Description

肠道益生菌发酵培养物

对天然药物的转化与修饰发明所属领域

本发明涉及天然药物组合物的生产方法，特别是涉及利用仿生学原理，并借助模拟人肠道微生态环境的肠道益菌共生发酵培养物对任何植物或动物来源的天然药物进行生物学转化和修饰 , 以改善所说的天然药物的生物学活性并降低或消除其毒性的方法。本发明进一步涉及所说的方法在制备天然中草药制剂中的应用。发明背景

中草药在东方国家特别是中国的临床应用已有数千年的历史，但人类却一直无法解锋中草药药理作用的科学机理。随着人体微生态学研究的不断深入，人们认识到人肠道内菌丛的微生态学改变可能与中医学中所说 "症" 存在着十分密切地内在相互联系，一方面中草药的调理作用可以改善肠道有益和有害细菌间的平衡；另一方面，平衡的肠道微生态环境亦将有利天然药物的吸收、转化、运输及生物学作用的发挥。

中草药治病的物质基是其所含有的化学物质，这些化学物质以传统的汤剂即水提取物的形式经口进入人体之后，可表现有不同的运转途径：（1 )原型化合物被机体吸收并进入循环发挥其药理作用； ( 2 )原型化合物被机体吸收，经肝肠循环或在组织或血液内经过一系列代谢加工后发挥其药理作用；（3 )化合物不被吸收，只能随粪便排出体外；（ 4 ) 药物或其原型化合物在肠道正常菌群的作用下发生某些由肠道细菌代谢酶导致的化学改变，改善了其吸收率、运转速度及生物学活性，从而在降低毒副作用的同时更有利于其药理学功能的发挥。因此，从实验室药代动力学研究和临床应用观察两方面入手，深入研究人肠道厌氧菌对天然药物化合物的加工与代谢转化，对于阐明传统中药的作用机理具有十分重要的意义。

自十九世纪五十年代以来，已有许多研究者利用不同的动物模型和方法，研究了肠道正常菌群对天然药物或其有效成分的转化及结构修饰。许多体内和体外研究证明，肠道正常菌群对以汤剂（水提取物）形式导入的天然化合物存在一个生物转化和结构修饰的复杂代谢加工过程，从而对天然中草药的体内吸收、运输、代诸及作用的发挥起着重要作用。例如， Dooth 等人 ( Dooth AN et al. , J. Biol. Chem. , 223 :251, 1956 ) 的早期研究发现，给小鼠经口灌服槲皮素后，尿中可检出 3, 4—二羟基苯乙酸等 B环裂解产物，但预先给动物投用抗生素（如新霉素），尿中则不能检出这些槲皮素代谢产物。结果提示这些裂解产物是经肠内细菌代谢转化而产生的。 Drasar和 Hill ("Human Intestinal Flora", Academic press, 1974) 进一步发现，预先给大鼠腹腔内注射抗生素抑制肠道细菌后，再口服投用含有强毒性苦杏仁苷的中药杏仁，动物没有发生苦杏仁苷所致的毒性反应。另外，将苦杏仁苷与分离的小鼠肠道细菌一起保温，发现肠杆菌和肠球菌能够将苦杏仁苷水解成苯乙醇腈，并进而分解产生可从其排泄物检测出来的有毒性的氢腈酸（ Scheline RK, Pharmacol. Rev. , 25； 451, 1973 )„ 也已证明，真杆菌 Eubacterium sp. CLH可借助其产生的 P—葡糖醛酸酶，将甘草的主要成分苷草甜素转化成甘草次酸。小桥恭一等人（和成医药学杂志， 15 ( 1 ): 1-13, 1998 )使用限菌大鼠和无菌大鼠模型进行的实验进一步证明，口服投用的甘草甜素只有在肠道内被细菌酶水解成甘草次后才能通过肠粘膜细胞被吸收（血浆内甘草次酸水平升高），并进而在体内发挥其保肝作用（导致血清 AST和 ACT转氨酶降低 )。另外，还有的实验观察到，将羊的肠内容物与豆科植物来源的异黄酮类化合物一起保温，可导致这些化合物的结构改变，即可使 7—羟基一4—甲基异黄酮转化成大豆糖苷配基和 epuol, 同时使鹰嘴豆芽素 A转化成染料木黄酮。表明羊肠道内容物中的肠道菌群具有生物转化异黄酮类化合物的能力 ( iis sou, A, et al.， Biochem. Biophys. Acta, 148: 92, 1967 )。

上述这些及其他许多实验均提示，已知结构或未知结构的天然药物，如通过胃肠道途径摄入体内后，必须经过肠道内菌群或其代谢产物的作用，并发生某些结构改变后才能被吸收并发挥其生物学活性。然而，现在技术中尚没有关于利用已知的益生菌在人体外加工和处理某些药物，特别是未知结构的天然药物组合物，以激活、诱导、转化或修饰其中的有效成分，使之在经口摄入体内后更有效地发挥其生物学作用的报导。而且迄今为止也未见使用益生菌体外发酵处理天然药物制剂，以改善其生物活性并在临床上获得成功应用的报道。

本发明人在以前研制肠道益生菌制剂及抗肿瘤天然药物的长期实践中，依据仿生学原理，利用在人体内分布广泛并且作用确切的多种肠道益生菌与多种天然药物组合物的水提取物一起发酵，结果令人惊喜发现，所说的天然药物组合物经肠道益生菌及其代谢产物的发酵处理后，显著地提高了体内药理学活性。据此，本发明人成功地完成了本发明。发明概要

本发明的一个目的是提供一种生产天然中药药物制剂的方法，该方法包括在加有天然药物提取物的营养培养基中接种一种或多种肠道益生菌，并在适当的发酵条件下发酵培。根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的方法是首先制备一种或多种益生菌的共生发酵培养物，然后向培养物中加入预制备的一种或多种天然药物的提取物或未经泡制的天然药物粉末，并继续混合发酵培养之。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的方法是将预制备的一种或多种天然药物的提取物或其未经泡制的粉末加入到适当的营养培养基中，然后向如此得到的混合物中接种一种或多种肠道益生菌并共生发酵培养之。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的益生菌选自双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、丙酸菌属、明串珠属及芽孢杆菌属的一种或多种人肠道非致病菌。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的益生菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、嬰儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸性乳杆菌、保加利亚乳杆菌、奶酪乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、嗜柠檬酸明串珠菌、枯草芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的天然药物是具有任何预防和 /或治疗作用并含有一种或多种可被人正常肠道细菌及其代谢产物加工或修饰的任何植物或动物来源的药物或其组合物。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的天然药物是一种或多种天然药物組合物的水提取物或有机溶剂提取物，或这些药物的未经泡制的固体粉末。

根本发明这一目的的一个优选实施方案，其中是所说的有机溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、乙丙醇、甲醚、乙醚、二甲醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈或它们的混合物。根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中是所说的天然药物选自祛邪扶正药、补气善血药、健脾益肾药、软坚化瘀药、化痰祛湿药、消炎排毒药、生精补血药、利尿补气药或它们的混合物。发明的详细说明

本发明涉及天然药物组合物的生产方法，特别是涉及利用仿生学原理，并借助模拟人肠道微生态环境的肠道益菌共生发酵培养物对任何植物或动物来源的天然药物进行生物学转化和修饰，以改善所说的天然药物的生物学活性并降低或消除其生理毒性的方法。本发明进一步涉及所说的方法在制备天然中草药制剂中的应用。

众所周知，天然中草药的水煎煮工艺是中药泡制中使用最为广泛、历史最为悠久的生药加工工艺。然而，水煎煮工艺（中药汤剂生产工艺）虽然操作简单，但也存在着很严重的缺陷，即一方面很难使药物中的水溶性成分充分煎出，另一方面还可造成绝大部分脂溶性成分的丢失。近几十年来，许多基础和应用研究者汲取西方医药学的现代药品生产技术，已在传统的水提取法的基础上引入醇或其他有机溶剂提取方法，但这些方法仍存在有机溶剂的残留、药物吸收率较低及活性较差的问题。二十世纪九十年代初，有人曾提出以所谓的 "半仿生提取法" 制备中药制剂，试图模拟口服给药经胃肠道转运过程，分别用酸性水溶剂和碱性水溶剂提取中药有效成分，以期有利于小肠的吸收。然而，该方法过于简单地看待了人体的内环境，另外也忽视了中药成分的复杂性。事实上，人的胃肠道内是一个有黃差不多超过人体细胞总数 10倍的近 100种有益和有害细菌的微生态环境，而远不只是简单的偏酸或偏碱性环境。另外，每味中药几乎都是一个包括许多种化学物质的复杂的化合物库，而不是像合成药物那些只存在某种单一化合物。因此，筒单地模拟胃肠道中的酸和碱性条件体外泡制中药将很难达到预期的中草药泡制效果。

本发明人在研制微生态和中药制剂的长期实践中发现，使用适当选择的益生菌培养物处理包括多种天然药物的中药水煎剂，或者在预先制备的中药组合物水煎剂中加入所说的三株益生菌共同发酵，可使经益生菌发酵处理的中药制剂显箸地提高了预期的药理学活性，同时也在一定程序上降低其非特异性生理毒性。

本发明的目的是提供一种利用仿生学原理，并借助模拟人肠道微生态环境的肠道益菌共生发酵培养物对任何植物或动物来源的天然药物进行生物学转化和修饰，以改善所说的天然药物的生物学活性并降低或消除其毒性的方法，该方法包括：

( 1 )分别按常规方法制备植物来源和动物来源的天然药物的提取物，然后分别在減压下浓缩并混合之；

( 2 )在含有上述步骤 ( 1 ) 中制得的天然药物提取物的发酵容器内，依次接种选择的益生菌菌抹，并在适当的发酵条件下发酵培养所说的菌株；

( 3 )发酵完成并加热杀死或不杀死益生菌后，收集发酵培养物。根据本发明，其中所说的益生菌可以是人肠道中固有的任何有益无毒细菌, 其中包括选自乳杆菌属、歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属及芽孢杆菌属的一种或多种细菌。

作为举例，其中优选的菌种包括但不只限于嗜酸性乳杆菌、植物乳杆菌、德氏氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、奶酪乳丁菌或其混合物、两歧双歧杆菌、嬰儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌或其混合物、嗜热链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、嗜柠檬酸、明串珠菌 ( Leucenostoc citrovorum )、谢氏丙酸菌 ( Pro ionibacterium shermanii ). 枯草芽孢杆菌及地衣形芽孢杵菌。为本发明的目的，其中特别优选的是嗜酸性乳杆菌、歧杆菌（包括婴儿歧杆菌、两歧双歧杆功和和短歧杆菌）、嗜热链球菌和粪链球菌以及屎肠球菌。

一般说来，对益生菌菌种（或菌株）的选择没有特殊的限制，但从仿生学和生态平衡的角度考虑，最好选用两种或两种以上（甚至多达九种）分布于人正常肠道不同部位，而且具有功能互补性的一组益生细菌。作为一个具体实例，本发明选用包括嗜酸性乳杆菌、双歧杆菌（包括短双歧杆菌和两歧双歧杆菌）和屎肠球菌在内的一组三种益生菌。

众所周知，嗜酸性乳杆菌、双歧杆菌和屎肠球菌均为人肠道正常益生菌。从这三种细菌的正常体内分布来看，它们分别见于肠道的不同部位，并可在小肠和结肠的不同部位发挥其优势益生功能。例如嗜酸性乳杆菌主要定居于迥肠部位，它能够在肠道内合成维生素、辅助食物消化、促进宿主新陈代谢，并增强宿主对乳糖的耐受性。双歧杆菌是人体最重要的生理性细菌，主要分布在结肠内，它对于人体的营养、生长发育、生物拮抗及免疫功能均具有重要促进作用。屎链球菌则主要存在于盲肠部位，其具有明显地降低血胆固醇水平的作用。因此，本发明优选上述三种在人体内数量较大，总体分布广泛，而且生理学活性显著的益生菌。本发明人确信，上述三株益生菌的选择，是完全符合本发明所依据的仿生学原理的。

另外，为了更有利于益生菌的存活，亦可选用包括嗜酸性乳杆菌、谢氏丙酸菌和嗜柠檬酸明串珠菌在内的一组三种益生菌。其中（1 ) 丙酸菌可将嗜酸性乳杆菌在肠道内产生的过量乳酸转化成丙酸和二氧化碳，从而可阻止霉菌和酵母菌生长；（2 ) 丙酸菌可合成能够分解乙醛的醇脱氢酶（已知酵母在肠道中生长可产生有害的代谢产物乙醛)；（3 )嗜柠檬酸明串珠菌可利用筒单的糖和柠檬酸，并可由之产生有利于嗜酸性乳杆菌和丙酸菌生长的二氧化碳。

根据本发明，其中所说中药組合物是一味以上植物来源和动物来源的中药，并且所说的中药可以是未改变其基本组织结构的生药，或其水提取物或有机溶剂提取物。这里所说的有机溶剂包括但不只限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇等醇，甲醚、二甲醚、乙酸等醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲酸乙酯、乙酸乙酯或它们混合物。然而，从安全性和有利于发醇过程进行角度看，所说的药物最好是天然药物的水提取物。

从药理学功能上说，可依据本发明的原则和方法进行体外发酵处理的天然药物组合物包括但不只限于温中理气药、清热解毒药、祛邪扶正药、补气养血药、健脾益肾药、软坚化瘀药、化痰祛湿药、消炎排毒药、生精补血药、利尿补气药或它们的混合物。

用于培养和增殖本发明中使用的益生菌的培养基，可以是含有细菌生长所需的碳源、氮源、必要的维生素及矿物质的任何已知的常规培养基。但为了尽可能地降低大规模工业化生产的成本，简化生产工艺并补充大豆异黄酮、可溶性食物纤维及大豆寡糖（如水苏糖和棉籽糖）等有益成分，本发明优先选用由大豆芽蒸煮液、蛋白酶解牛肉肉汤、酵母浸膏、糖及矿物质组成的培养基。本发明中使用的培养基不同于常规细菌发酵培养基，其主要特征在于其中除含有基本碳源（葡萄糖和蔗糖)、氮源（酶解肉汤和酵母浸膏）及矿物质外，还特别加入了占液体培养基较大体积（约 25% ) 的大豆胚芽蒸煮液。用于本发明的典型的培养基组成如下： 2. 5%酶解牛肉肉汤、 1. 3%酵母浸膏、 25%大豆芽煎煮液、 1. 3%葡萄糖、 1. 3%蔗糖、 0. 05% MgS0₄、 0. 05% CaC0₃、 0. 03% K₂HP0₄、 0. 03% KH₂P0₄、 0. 03% NaCI。以上比例均为重量百分比（W/W)。

这里应特别指出的是，培养基中的大豆芽蒸煮液主要并不是作为氮源和 /或碳源加入的。培养基中加入大豆芽蒸煮液的目的主要在于为益生菌培养液提供或补充大豆异黄酮、可溶性纤维及大豆寡糖

(如水苏糖和棉籽糖）。已知大豆异黄酮类化合物（包括大豆甙元、染料木黄酮及大豆黄素）作为植物雌激素，具有抗自由基、降低血脂、減小心血管疾病的危险性、防止绝经期女子内分泌失调引起的骨质疏松等作用。大豆芽浸出液中所含有的可溶性食物纤维可阻止肠道内中性脂肪及胆固醇的吸收、促进胃肠蠕动、防止便秘并延緩或抑制碳水化合物的吸收。另外，大豆芽浸出液中所含有的大豆寡糖可被肠道乳酸菌分解利用，但几乎不被肠道有害菌利用，从而有利于纠正肠道菌群失调。总之，以大豆芽蒸煮液作为益生菌培养基的主要成分之一，代表了本发明技术特征的一个方面。经检测，按本发明方法制得的益生菌液体培养物中所含大豆异黄酮和可溶性纤维的浓度分别为 20-40 μ g/ml和 30-100 μ g/ml。

为了制备作为培养基主要组分的大豆芽蒸煮液，首先将新鲜的成熟大豆在约 2倍体积的温水中浸泡 5-6 小时，以使大豆組织吸水膨胀。然后置于 25- 环境下保温 60-72 小时，以使大豆生长出长约 3-8厘米的胚芽。收集发芽并吸水膨胀的大豆，按照每升斤发芽大豆加约 3升水的比例向发芽大豆中加入自来水，并在控制温度约 105-121 °C的高压蒸煮容器内加热 30分钟。加热后，通过层滤布过滤并收集如此得到的发芽大豆蒸煮液。

用于本发明的培养基中的另一个主要組分是蛋白酶处理的新鲜牛肉和牛肝組织水解物。与现有技术中所使用的常规肉汤不同的是：本发明的肉汤在材料选择上不仅使用牛肉组织，还加用了富含各种酶类的牛肝脏组织，另外肉汤制备中还使用了从猪或牛胰腺中提取的粗制胰蛋白酶制剂。因此，为了制备作为本发明所用培养成分的酶解牛肉汤，首先将仔细选择的牛肉和牛肝组织按 5: 2的重量比混合并绞碎成肉糜。向其中加入 1 - 1. 5倍体积的水搅拌均匀，并于大约 100Ό下加热约 60分钟。然后使温度下降至 38-41°C, 向其中加入约 1% ( V/V)按下述方法制备的粗胰蛋白酶制剂。在 pH 7-9条件下消化处理约 1小时。酶水解后，以 2000 rmp离心收集上清液，得到蛋白酶水解的牛肉汤。如此制得的肉汤大大增加了细菌生长所需的营养成分，减少了原料的浪费，而且明显地改善了培养基及发酵后所得细菌培养物的味道和口感。

为了制备用于水解牛肉和牛肝組织的粗胰酶提取物，可首先制备动物如牛、马、羊或猪的胰组织匀浆，并按 1: 1： 3 的比例将所得匀浆与无水乙醇和蒸榴水混合，然后持续搅拌 72小时。搅拌后离心（ 500 rpm, 10分钟）收集上清并用浓盐酸将所得上清液的 pH调至约 5. 5, 从而得到所需的粗制胰蛋白酶制剂。

可以使用按上述方法制备的营养培养基作基质材料，向其中加入按常规中药汤（煎）剂制备方法制得的中药组合物的水或有机溶剂提取物。混匀并将所说的基质原液与中药提取物的混合物加热煮沸约 10分钟，然后冷却至大约 37°C。在此温度下，依次向所说的混合物中接种一株或多株选自乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、丙酸菌属、明串珠菌属及芽孢杆菌属的人正常肠道益生菌，并于约 37°C和 pH 6. 2条件下发酵培养约 18— 24小时。发酵完成后，使体系的温度自然降至室温，过滤收集滤液即得到按本发明方法经益生菌发酵处理的溶液态天然药物组合物。

或者，也可以在按照本申请人于同一申请日提交的共同待批专利申请中所述的益生菌分级接种共生发酵完成以后（约 24小时）和升高发酵体系的温度以热杀死细菌之前，向总细菌培养物内加入适于被所说的细菌或其代谢产物加工或转化的、已知结构或未知结构的任何天然来源的一种或多种药物或其混合物。在接近生理状态的发酵条件（37Γ， ρΗ 6. 2 )下，继续发酵约 18小时。在此发酵过程中，所加入的天然药物提取物中的一种或多种成分将会在厌氧益生菌或代谢产物的作用下发生结构改变或代谢转化，使原来无活性的天然药物化合物转化成有活性的化合物，或者将某些原来活性较弱的分子修饰成具有较强生物学活性的分子或其集合体，或者使某些原来具有较强生理毒性的化合物（特别是动物来源的天然化合物）变成有较小毒性或无毒性的化合物或其集合体。

如前所述，虽然实施例中举例描述了在使用嗜酸性乳杆菌、双歧杆菌和屎链球菌作为益生菌在转化天然抗肿瘤药物中的应用。但在某些特定情况下，例如在选用其他益生菌菌种或用于发酵转化某些其他特定的天然药物组合物时，亦可使用具有不同组分但尽可能模拟肠道内环境的培养基及发酵方法。

作为在本发明基本原理和构思指导下完成的一个具体实例，本发明特别选用具有抗肿瘤活性的，由黄芪、熟地、党参、灵芝、溪黄草、黄芩、枇杷叶、芦根和七叶一枝花等植物药以及僵蚕、蝎牛、全蝎、蜈蚣和壁虎等动物药的水提取物及阿胶构成的天然药物组合物。本说明书实施例 1中详细描迷了该药物组合物的制备方法。

特别令人感兴趣的是，我们的研究发现，上述抗肿瘤天然药物组合物在未使用益生菌进一步发酵处理的情况下，直接投用于携带实验性 S₁₈₀肉瘤或 ¾₂肝癌的动物肿瘤模型，三次重复试验均未见明显地肿瘤生长抑制作用（即计算的抑瘤率小于 30% )。同样，单纯使用按上述方法制备的含有三种益生菌及由培养基提供的大豆异黄酮和可溶性植物纤维的发酵培养物本身，也没有记录到可检测的肿瘤生长抑制作用。然而，如果将上述天然植物药物水与动物药物的水煎煮提取物的 1: 1混合物加到所说的发酵培养物中，并于大约 39Π ± 1°C下持续厌氧发酵约 18- 25小时，结果令人惊异地发现，如此得到的总天然药物提取物的益生菌发酵产物对上述两种肿瘤模型表现有十分明显的肿瘤生长抑制活性（参见实施例 3和 4 )。虽然有关机理尚不明了，这一研究结果进一步证明：天然药物，特别是某些天然植物，天然植物或动物来源并且未知结构的药物或其混合物，必须在正常肠道微生物菌群的体外或体内作用下，经过某些已知或未知的化学修饰或生物转化后才能被宿主吸收，并进而发挥其生物学功能。

下文实施例 2和 3中详细举例描述了在含有多种营养素的培养基中，使用三株益生菌发酵处理由前述十三种植物来源药物和六种动物来源药物提取物組成的药物组合物的方法。另外，我们还利用活体动物肿瘤模型进一步证实，与未经处理的药物组合物相比，经肠道益生菌发酵处理的抗瘤药物组合物置著地改善了其抗肿瘤活性。所得药物组合物一方面可以作为常规抗肿瘤治疗（包括常规化学药物治疗和放射治疗）的强有力辅助治疗剂，另一方面，该制剂还可在很大程度上降低常规化学药物治疗和放射治疗对肿瘤病人的毒付作用（参见实施例 4和 5 )。在另一项使用带瘤小鼠所作的研究中，进一步证明经益生菌混合发酵处理的抗肿瘤天然药物对带瘤小鼠的免疫功能增强活性，其中包括（1 )显箸地提高带瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能；（2 ) 明显地促进带瘤小鼠淋巴细胞在 T细胞有丝分裂原 ConA作用下转化功能（数据未示出）。

因此，发明人出乎预料地发现，按本发明方法制备的中药药物組合物除有效地用于预防和治疗各种恶性组织增生性疾病外，还对人或哺乳动物的造血干细胞的增殖与发育具有良好的促进作用，尽管有关机理目前尚不清楚。我们目前已进行的初步细胞学和动物实验表明，肿瘤病人在进行化疗和放射治疗期间，持续服用本发明的药物組合物，可有效地恢复和维持外周血中粒性白细胞和红血细胞及血小板的水平；以至使病人不至于因这些血细胞过度降低而中止肿瘤的化学治疗和 /或放射治疗，从而对提高肿瘤病人的存活期和改善其生存质量发挥重要作用。再者，我们的初步实验研究结果显示，本发明的药物组合物不仅可用于緩解固肿瘤放疗和化疗引起的骨髓干细胞生成与分化抑制，而且还可用于治疗各种白血病及贫血。

最后应特别指出的是，虽然本说明佯细描述部分和实施例中举例说明了益生菌对本发明人设计并制备的天然抗肿瘤药物的体外仿生学转化与修饰，以及由之产生的积极效果，但本发明人确信本发明的方法并不只限于本文用来举例说明的特定肿瘤及所使用的特定益生菌。因此，在不背离本发明的精神和原则基础上，对本发明所作的任何平行改动或改变均将落入本发明待批权利要求范围内。实施例

实施例 1: 肠道益生菌共生发酵培养物的制备

本实施例举例说明以分级接种、共生发酵方法，在同一培养基中生产混合的嗜酸性乳杆菌、短双歧杆菌和屎肠球菌共生发酵培养物的方法。

1、益生菌菌种的选择

双歧杆菌是人或乳哺动物体内最重要的生理性细菌，主要分布于小肠下部和结肠内。已知双歧杆菌对于人体的营养、生长、发育及免疫功能均具有重要作用。嗜酸性乳杆菌是人体内分布最为广泛的益生菌。在胃肠道中，该细菌主要分布于迥肠部。嗜酸性乳杆菌参予维生素，特别是 B族维生素的生物合成，具有辅助食物消化、促进营养素代谢及提高宿主对乳糖的耐受性等功能。屎肠球菌主要分布在小肠的盲肠部分，具有帮助胆固醇分解代谢，降低血胆固醇的作用。因此，本发明选用短双歧杵菌、嗜酸性乳杆菌和屎肠球菌等的三个常见益生菌菌株，主要是基于它们在人肠道内分布的总体广泛性及其生理学活性的互补性。

可以从中国典型培养物保藏中心（CCTCC ) (中国，武汉）等菌种保藏机构购得，或者从正常人的粪便或肠粘膜组织中分离得到这些细菌菌抹。

2、培养基組成及制备

培养基组成：每升培养基含有 25ml蛋白酶水解牛肉肉汤、 15g酵母浸膏、 250ml大豆芽蒸煮液、 12g葡萄糖、 13g蒸糖、 5g MgS0₄、 3g CaC03、 3g NaCI、 3g K₂HP0₄和 3g KH₂P0₄。

基本上按照本说明详细描述部分所述的方法制备用于配制本发明特定培养基的蛋白酶水解牛肉肉汤和大豆芽（或发芽大豆）蒸煮液。将培养基各成分混合均匀后，于 121°C高压灭菌 30分钟备用。

3、分级接种共生发酵方法

将经过灭菌处理的上述培养基 100升加热至大约 40 TC , 按生物量湿重约占培养基总重量约 0. 8%的比例（W/W)在培养基中接种活化的双歧杆菌 1000g (湿重），并于39°(下厌氧发酵7. 5小时。当发酵过程中 pH降至 5. 0时，持续搅拌下向培养基中滴加适当量的 0. 5N NaOH 以将 pH调到大约 6. 2, 并再次向培养基中接种活化的屎肠球菌生物量约 950_g (湿重），并搅拌 20分钟。于同样温度下继续发酵培养 6小时。当发酵罐内 pH降至大约 5. 5时，再次向培养基中加入 0. 5N NaOH溶液以将调至 6. 2, 然后接种嗜酸性乳杵菌生物量约 850_g (湿重），并继续在同样温度下发酵。当发酵罐内总细菌浓度达到 6. 5 X 108/ml以上，并且 pH降低到大约 3. 5 - 3. 8时，通过控制循环水温度使发酵培养物的温度降低至大约 32°C，并保持约 2小时，以完成发酵产物的生物转化。发酵完成后，根据如此得到的益生菌共生发酵培养物的使用目的的不同，可以（ 1 ) 离心收集共生发酵的活的益生菌并冻干之，以制备含有冻干菌粉的固体药物或营养补充组合物； ( 2 ) 向包括培养基和活菌及其代谢产物的培养物中加入待转化的天然药物提取物，以制备具有特定生物学活性和功能的药物组合物；（3 )使发酵培养物的温度升高至大约 39°C , 热杀死增殖的活菌，离心分离培养物上清后或直接制备含有益生菌共生发酵产物及细菌碎片的营养补充组合物。

对共生发酵培养物上清的生物化学分析结果显示，培养物上清中水解氨基酸含量达 23. 322 mg/ml, 其中可以满足双歧杆菌和乳杆菌生长所需，并且含有二硫键的胱氨酸含量为 1. 8 mg/ml (水解的）和 0. 33 mg/ml (游离的）。共生发酵培上清中总糖含量约为 0. 04 mg/ml, 其中除还原糖外，还存在有双歧杆菌等益生菌生长繁殖所需的低聚糖和膳食纤维。后者在肠道内具有抑制血糖升高，阻止中性脂肪和胆固醇吸收及緩解便秘的作用。另外，用乙酸乙酯提取并用 HPLC法分析（ 255nm ) , 测得培养物上清中大豆异黄酮的细菌转化产物即大豆甙元高达 80 mg/ml。再者，培养物上清中还含有多种维生素和一定量的矿物质，其中主要是 B族维生素（约 40 mg/l ) P、 Fe、 Zn、 Mg、 K和 Na等矿物质（分别为 5. 04、 5. 36、 8. 29、 88. 83、 783、 283mg/l )。这些检测结果进一步表明共生发酵培养物上清足可作为培养基，提供细菌生长所需的全部营养素。在细菌增殖到一定程度之后，由于菌体代谢产生大量酸性产物（有机酸），故导致培养体系的 pH值下降（ 4. 0以下），进而使细菌停止生长。实施例 2: 抗肿瘤中药提取物的制备

本实施旨在举例说明根据中药制剂中所用原料来源的不同，分别制备植物来源和动物来源药物的水提取物的方法。

1、抗肿瘤天然药提取物的制备：

( 1 )植物药提取物的制备：将经过常规预处理的黄芪 12g、熟地 20g、党参 12_g、灵芝 8g、天花粉 12g、甘草 5g、溪黄草 40g、黄芩 12g、炙杷叶 12g、芦根 12g、七叶一枝花 12g、核挑皮 20g、白花蛇舌草 12g 共十三种 189g天然植物药在 5升容器内混合后，加入 1600ml水煎煮 1. 5 小时，得到植物药的第一份水提取物约 500ml。然后再向容器内加入 1200ml水并煎煮约 1小时，得到第二份约 400ml水提取物。最后再次向容器内加入水 1200ml, 加热煎煮约 0. 5小时，得到植物药的第三份水提取物约 600ml。合并植物药的三份水提取物，并于减压下将三份水提取物的总体积浓缩至 300ml。

( 2 )动物药提取物的制备：将经过常规处理的蟾皮 20g、僵蚕 8g、蜗牛 6g、全蝎 4g、蜈蚣 4g、壁虎 4g共六种 46g天然动物药混合加入 2 升容器内，首先加入水 350ml, 并于常温下浸泡 12小时。然后用组织粉碎机以 lOOOrpm搅拌约 2分钟，并将粉碎的动物药加热煎煮约 15小时。收集水提取物后再次加入水 250ml, 并煮沸约 1小时。收集并合并两份提取物后，用 4层滤布过滤。冷却至常温后，向滤液内加入 30g 阿胶，加热（约 80°C , 5分钟）使阿胶溶融后，減压浓缩至 200ml备用。实施例 3: 肠道益生菌对抗肿瘤中药提取物的生物学转化

本实施例举例说明利用肠道益生菌和 /或其发酵培养物，以两种方式生物转化天然药物提取物的方法。

1、按照实施例 1中所述的方法制备短歧杵菌、嗜酸性乳杆菌和屎肠球菌的共生发酵培养物。当培养物中细菌浓度达到 7. 0 X lOVml以上，并且在活菌存在下于 32°C保温 2小时以完成总成分的生物学转化之后，将反应体系的温度升高至大约 39 °C并保持约 6小时，以杀死细菌。在离心（lOOOO x g, 20分钟）除去或不除去热杀死的细菌及大的细菌碎片的情况下，按 5: 3： 2的比例向培养物中加入按上述方法制备的天然植物药和天然动物药提取物。重新加热至 38 - 40 °C , 并在此温度下厌氧发酵约 18小时。发酵完成后，收集发酵培养物，并离心分离上清液。

2、在按本说明书详细描述部分所述的方法制备的新鲜培养基 (每升含有 250ml大豆芽蒸煮液、 25ml胰酶解牛肉肉汤、 15g酵母浸膏、 13g 蔗糖、 12g葡萄糖、 5g MgS0₄、 3g NaCI、 3g CaC0₃、 5g K₂HP0₄、 5g KH₂P0₄ ) 中按 5: 3： 2的比例无菌加入按上述方法制备的天然植物和动物药物提取物。将物料与培养基充分混匀后，按照实施例 1中所述的方法和接种量向培养基与药物提取物的混合物中依次接种双歧杆菌、嗜酸性乳杆菌及屎肠球菌。混匀后于 38-40^：下厌氧发酵约 20小时。发酵完成后，收集发酵培养物并离心分离上清液，即得到经益生微生物转化并修饰的抗肿瘤药物组合物。实施例 4: 肠道益生菌发酵转化对抗肿瘤中药提取物之生物学活性的影响

本实施例利用肿瘤动物模型，举例描述抗肿瘤天然药物提取物在经肠道益生菌体外发酵转化后生物学活性的改善。

使用皮下接种 S180肉瘤或 H22肝癌细胞的昆明种小鼠作为肿瘤动物模型，观察大或小剂量上述经益生菌发酵培养物转化的或未转化的抗肿瘤药物提取物对肿瘤生长的抑制活性。

为此，首先对 120只体重约 18-25g的昆明种小鼠腋部皮下接种 1 X lOVml S180肉瘤或 H22肝癌细胞（ 0. 2ml/只），以造成实体瘤动物模型。将动物随机分为 12組。实验組动物每只每天口服接受 1: 1 或 1: 4倍稀释的未经发酵处理的药物提取物或经过发酵处理的药物提取物。

阴性对照组口服接受同样容量的自来水，阳性对照组按每公斤体重 60mg的剂量每天皮下注射化学合成的抗肿瘤药物环磷酰胺（ CTX)。接种肿瘤细胞后第 4天（即可触及皮下实体瘤时）开始给药。连续给药 10天后，断颈处死携带 S180和 H22实体瘤的小鼠，分別测量动物的体重和瘤体重量，并由之计算出抑制率。每种肿瘤的治疗实验均重复进行 3次。下列表 1和表 2分别给出了使用 S180肉瘤动物模型和 H22肝癌动物模型所作实验的结果。表 1 益生菌共生培养物转化的或未转化的抗肿瘤药物提取物对小鼠 S180肉瘤的抑制作用动物体重瘤体重量抑瘤率組别（n=10) P值

用药前用药后 (X土 SD) (%) 阴性对照組 20.9* 26.1 1.41 ± 0.69

阳性对照組 20.1 21.2 0.55 ± 0.19 61.0 〈0.001 经过转化的药物 20.4 23.9 0.99 ± 0.36 38.1 <0.05 大剂量組 20.4 23.9 0.99 ± 0.36 38.1 〈0.05 小剂量組 20.6 25.9 1.44± 1.18 21.3 〉0.05 未经转化的药物

大剂量組 21.0 23.8 0.93 ± 0.49 29.5 >0.05 小剂量組 20.6 24.6 1.22±0.89 -4.1 >0.05

*表中所给出的数值均为三次重复实验的平均值士标准差（X+SD)。益生菌共生培养物转化的或未转化的抗肿瘤药物提取物对小鼠 H22肝癌的抑制作用动物体重瘤体重量抑瘤率前用药后（X±SD) (%) 阴性对照組 21.2* 1.91±0.78

阳性对照組 21.2 0.72 ±0.36 62.4 〈0.001 经过转化的药物

大剂量組 20.6 1.80 ± 0.47 44.8 〈0.001 小剂量組 21.0 1.07±0.53 26.2 〈0.05 未经转化的药物

大剂量組 21.6 1.14 ±0.38 29.6 >0.05 小剂量組 21.5 1.45 ± 0.49 10.5 >0.05

*表中所给出的数值均为三次重复实验的平均值土标准差（X士 SD) 。本动物治疗实验中，抑瘤率大于 30%视为被试样品对所说的肿瘤具有抗肿瘤（或肿瘤抑制）活性，而抑瘤率小于 30%则视为无抗肿瘤 (或肿瘤抑制）活性。从表 1和表 2中所示的数据可以看出，植物和动物来源的药物提取物未经模拟肠道正常菌群及其代谢产物的益生菌共生发酵培养物的生物转化之前，基本上没有表现出统计学上有意义的抑瘤活性（抑瘤率为- 10.5至 29.5)。然而，当所说的药物提取物与多种肠道益生菌共同发酵后，由于益生菌及其代谢产物对药物的生物化学结构修饰及酶促转化作用，使之生物学活性显著提高 (抑瘤率达到 40%以上）。实施例 5: 肠道益生菌及其代谢产物转化并修饰的抗肿瘤中药制剂对常规肿瘤化疗和放疗的影响

本实施例利用肿瘤动物模型，分别观察（1 )按本发明方法制备的天然药物組合物与常规肿瘤化疗和放疗方法联合使用时，所说的经发酵处理的天然药物组合物对常规化疗和放疗的协同增效作用，以及（2 )按本发明方法制备的天然药物组合物对常规化疗和放疗所致毒性或付损伤的保护或緩解作用。

1、 80只体重约 18- 22g的昆明种小鼠（雄雌各半）分别于右腋皮下接种用生理盐水按 1: 3稀释的 H₂₂肝癌细胞悬液（ 10⁷细胞 /ml, 0. 2ml/ 只），接种瘤细胞后将动物随机分成 8组，前四组用于观察本发明的天然药物组合物对抗肿瘤化学药物氟尿嘧啶 ( 5-Fu, 15mg/kg )之治疗效果的影响，后四組用于观察本发明的天然药物组合物对抗肿瘤放射治疗（Co⁶。全身照射， 4. 5GY/曰 /只动物）的影响。接种肿瘤细胞后次日开始，分别对两大組动物进行联合治疗，连续治疗 7天。两大组中各设 1-4组，其中第 2組分别灌服本发明的中药组合物；第 4组分别给予本发明的中药制剂 +抗肿瘤化学药物或 Co⁶⁰照射（实验组）；第 3组皮下注射抗肿瘤化学药物或 Co⁶。照射（阳性对照组）；第 1组分别灌同体积的水或给予中剂量 Co⁶°照射（阴性对照組）。

治疗 7天后断颈处死动物，分别称量动物体重和肿瘤重量，并由之计算出各种治疗的抑瘤率。为了评价按本发明方法制备的中药组合物对肿瘤化疗或放射治疗的协同增效作用，将所得出的抑瘤率数据代入下列 Burgi修正公式：

Q=E ( A+B ) /EA+EB-EA χ ΕΒ

其中 Ε ( Α+Β )为联合治疗肿瘤抑制率 EA和 EB分别为单独使用本发明的中药组合物或化学治疗或放射治疗的肿瘤抑制率（以小数表示）。

结果判定：由上述公式计算出的 q值小于 0.85，视为联合治疗具有拮抗作用； q值在 0.85至 1.15之间，视为联合治疗具有相加作用； q值大于 1.15则认为联合治疗具有协同作用。结果如下列表 3和 4中所示。

表 3 按本发明方法制备的中药组合物与抗肿瘤化学药物联合应用对带瘤（¾₂肝癌）小鼠的治疗效果动物体重肿瘤重量

組别（n=10) 抑瘤率 P值

治疗前治疗后（X±SD) (%)

1 20.5 29.5 2.15 ± 0.67 一 -

2 20.9 25.9 0.72 ±0.21 66.5 〈0.001

3 20.9 27.4 1.06 ±0.31 56.7 <0.001

4 21.2 23.5 0.39 ±0.18 81.9 〈0.001*

*q值 =0.99, 故判定本发明的中药组合物与 5-Fu联合用药对 H₂₂ 肝癌小鼠表现有效果相加作用。表 4 按本发明方法制备中药組合物与 Co⁶⁰放射治疗联合应用对带瘤（H₂₂肝癌）小鼠的治疗效果动物体重肿瘤重量

組别（ n=10 ) 抑瘤率（％ ) P值治疗前治疗后（X±SD)

1 21.7 33.3 2.77 ± 0.29

2 21.4 31.1 1.31 ± 0.13 52.7 <0.01

3 21.5 24.2 0.99 ± 0.05 64.3 〈0.001

4 21.9 25.6 0.62 ± 0.06 77.6 <0.001*

*q值 =0.93, 故判定本发明的中药组合物与 C0_6Q放射治疗联合应用时丙者间表现有效果相加作用。从表 3和 4中所示结果可以看出，按本发明方法制备的抗肿瘤天然药物组合物制剂与常规肿瘤化学药物治疗或放射治疗联合使用时，可获得比单独使用任何一种疗法都更好的治疗效果（抑瘤率）。另外，依照评价联合治疗效果的 Burgi 修正公式计算，上述联合治疗的 q值均在 0.85至 1.95之间，表明联合治疗具有的效果相加作用。

2、 80只体重约 18- 22g的昆明种小鼠（雄雌各半）随机分为两大组各 4小組。治疗实验組（第 3和 4组）动物（ 1 )经灌胃投用中等剂量或小剂量按本发明方法制备的抗肿瘤天然药物组合物，每曰一次，连续投用 7 天，同时在第一天给动物一次性投用抗肿瘤化学药物环嶙酰胺（CTX, 60mg/Kg ) (表 5) ; 或者（2)动物在接受中等剂量或小剂量按本发明方法制备的抗肿瘤天然药物組合物的同时，每天接受一次 Co⁶。全身照射（ 4.5GR) , 连续照射 7天。

阴性对照组（第 1组）投用同样体积的水。阳性对照组（第 2 组）只接受上述剂量的化学药物或放射治疗。七天后，经尾静脉采集动物末稍血分别进行白细胞（ WBC；)、红细胞（ RBC )和血小板（ BPC ) 计数及血红蛋白（ Hb )含量测定。结果分别如下列表 5和 6所示。表 5 按本发明方法制备的中药组合物对肿瘤化疗后外周血象损伤的保护作用組别 WBC RBC BPC Hb

( n=10 ) ( x lOVml ) ( ^x 10⁹/ml ) ( x 10⁶/ml ) (mg/1)

1 8.78 ± 3.75 8.91± 1.50 130 CO.0O L ± 24.0

2 4.28 ± 1.48 6.70 ± 1.98 56.5 ± 2O3.0

卜

3 6.62 ± 1.44 9.90 ± 1.43 o 17.6 ± 0.7

4 5.56 ± 1.83 9.44 ± 1.22

16.9± 0.6 表 6 按本发明方法制备的中药组合物对肿瘤放疗后外周血象损伤的保护作用組别 WBC RBC BPC Hb

( n=10 ) ( x lOVml ) ( x 10⁹/ml ) ( x 10⁶/ml ) (mg/1)

1 7.64 ± 1.95 8.59 ± 1.03 158.7士 32.6 15.5± 0.6

2 0.64 ±0.34 7.65 ± 1.27 163.5土 36.4 13.8± 0.8

3 1.42± 1.14 8.08 ±1.35 165.0土 74.2 17.1 ± 1.1

4 1.25 ±0.36 7.13 ± 1.64 164.1士 64.7 16.7 ± 1.1 抗肿瘤化学药物 CTX和放射性 Co⁶°均可造成被治疗动物造血系统的功能障碍，导致 WBCf、 RBC；、 Hb及 BPC的损伤，其中放射治疗对 WBC数和 Hb含量的影响尤为明显。从表 5和表 6所示的结果可以看出，在对带瘤动物进行肿瘤化疗或放射的同时，给动物投用按本发明方法制备的经益生菌发酵处理的天然药物组合物，可使用肿瘤放疗或化疗导致的损伤得到很大程度的緩解和改善。实施例 6: 本发明的中药、药物組合物对人骨髓细胞增殖的影响本实施例举例说明本发明的肠道益生菌及其代谢产物转化并修饰的药物组合物对人骨髓细胞增殖作用的影响。

将人骨髓的非粘附细胞的， T细胞缺失的细胞培养物铺放在含有 15 %人血清白蛋白的琼脂平孤上（40, 000 个细胞 /平孤）并各加入 0. 5ml本发明的药物组合物，然后在含 5 % ∞₂和5 % 0₂的氮气环境下保温 10天。保温完成后，在倒置显微镜下计数生长的细胞集落数。结果以粒细胞、红细胞、单核细胞和巨噬细胞集落形成单位（CFU- GEMM)、粒细胞-巨噬细胞集落形成单位（CFU - GM )和红细胞集落形成单位（CFU - E )数目表示。其中，各平内均加入 1 单位红细胞生成素（ EP0 )并以所计数的红细胞集落单位数（ CFU - E ) ( 45 ± 4 ) 作为未加上述药物組合物或细胞因子（粒细胞集落刺激因子， G - CSF ) 时的本底计数。以市售 G - CSF ( lOOOpg/ml ) 和 GM - CSF ( 1200pg/ml )作为阳性对照，并以 PBS溶液（ 1ml )作为阴性对照。结果如下列表 6所示。表 6 本发明的药物組合物对人骨髓增殖的影响

细胞集落数 (平均值土 S. D. ) 试剂剂量 (pg/ml)

CFU-GEMM CFU-GM CFU—E 空白对照 2± 1 0 45 ±4 药物組合物 lml 7±0.5 20± 2 60±5

G-CSF 1000 8±1 25± 3 68 ±3

CM-CSF 1000 8.5±0.5 28 ± 1 48±2

Claims

权利要求

1、一种生产天然中药药物制剂的方法，该方法包括在加有天然药物提取物的营养培养基中接种一种或多种肠道益生菌，并在适当的发酵条件下发酵培养之。

2、根据权利要求 1的方法，其中所说的方法是首先制备一种或多种益生菌的共生发酵培养物，然后向培养物中加入预制备的一种或多种天然药物的提取物或未经泡制的天然药物粉末，并继续混合发酵培养之。

3、根据权利要求 1 的方法，其中所说的方法是将预制备的一种或多种天然药物的提取物或其未经泡制的粉末加入到适当的营养培养基中，然后向如此得到的混合物中接种一种或多种肠道益生菌并共生发酵培养之。

4、根据权利要求 1的方法，其中所说的益生菌选自歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、丙酸菌属、明串珠属及芽孢杆菌属的一种或多种人肠道非致病菌。

5、根据权利要求 1 的方法，其中所说的益生菌选自两歧歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸性乳杆菌、保加利亚乳杆菌、奶酪乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杵菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、嗜柠檬酸明串珠菌、枯草芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌。

6、根据权利要求 1 的方法，其中所说的天然药物是具有任何预防和 /或治疗作用并含有一种或多种可被人正常肠道细菌及其代谢产物加工或修饰的任何植物或动物来源的药物或其組合物。

7、根据权利要求 1 的方法，其中所说的天然药物是一种或多种天然药物组合物的水提取物或有机溶剂提取物，或这些药物的未经泡制的固体粉末。

8、根据权利要求 1 的方法，其中是所说的有机溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、乙丙醇、甲醚、乙醚、二甲醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈或它们的混合物。

9、根据权利要求 1 的方法，其中是所说的天然药物选自祛邪扶正药、补气善血药、健脾益腎药、软坚化瘀药、化痰祛湿药、消炎排毒药、生精补血药、利尿补气药或它们的混合物。