CN102188507A - 具有抗肿瘤功能的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
具有抗肿瘤功能的组合物、制备方法及应用。该组合物是根据生物转化理论,为由乳酸菌在川乌水提取液中发酵后所成的发酵液体混合物。其中川乌水提取液为以生药川乌重量计的川乌提取物浓度为0.01~0.05g/ml,乳酸菌的接种量为1.0×104~1.0×108cfu/ml,在30℃~40℃条件下培养1~5天。该组合物与药物中可以接受的辅助成分可共同组成具有抗肿瘤功能的药物供使用。试验显示该组合物的抗肿瘤作用明显优于川乌药材,可作为新型抗肿瘤药物的原材料进行开发。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤功能的组合物,特别是一种含乳酸菌发酵液体系的组合物,以及该组合物的制备方法和在药物中的应用。
背景技术
川乌,为毛莨可植物乌头的干燥母根,是我国重要的传统中药,出自侯宁极《药谱》、《本草纲目》,具有祛风除湿,温经止痛。主治风寒湿痹,关节疼痛,心腹冷痛,麻醉止痛,寒疝作痛的功能。川乌有大毒,一般炮制后使用。
乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌,是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌,常广泛存在于人体的肠道中。生物学家目前已证实,肠道内存在的乳酸菌对人体是一类可具有重要生理功能的有益菌群,与健康长寿有着非常密切的直接关系,且能够帮助消化,有助人体肠脏的健康,因此已被视为健康食品成分用于制作成酸奶和/或进一步添加在许多食品中。
发明内容
本发明将以“生物转化理论”为指导,使川乌和乳酸菌的有益功能相结合,提供一种能具有抗肿瘤功能的组合物,以及该组合物的制备方法和在药物中的应用。
本发明具有抗肿瘤功能的组合物,是由乳酸菌在川乌水提取液中发酵后所形成的发酵液体混合物。所说的该川乌水提取液为以其生药川乌重量计的川乌提取物浓度为0.02~0.06g/ml,川乌水提取液的乳酸菌的接种量为1.0×104~1.0×108cfu/ml。试验显示,其中川乌水提取液的所说浓度优选为0.05g/ml,乳酸菌的优选接种量为1.0×106cfu/ml。
本发明上述具有抗肿瘤功能的组合物的制备方法,是先以川乌生药为原料,按常规方式用水煎煮制备得到相应的水煎提取液并除去药渣等沉淀物后,浓缩成具有所说川乌提取物浓度的川乌水提取液,然后在该川乌水提取液中按所说的接种量接种乳酸菌,在30℃~40℃及0~200rpm的条件下培养1~5天,即可得到所说目标产物的发酵液体混合物。
经试验,在上述制备方法中,尤以在所说的乳酸菌接种后于37℃和100rpm条件下培养2天的条件发酵为优选。
上述制备中所说的川乌水提取液,除可按所说的常规方式水煎煮提取外,一种较好的方式可以采用将川乌生药以其重量5~10倍的水煎煮30~60分钟后过滤,过滤的药渣(以及之后每次过滤后的剩余药渣)再以同样量的水煎煮1次或数次,合并各次水煎煮液得到的滤液并浓缩至所说的川乌提取物浓度。
上述制备方法中所说的用于在川乌水提取液中接种的乳酸菌菌种,除可采用目前已有报道和/或使用的目前由各种来源或方式培养得到的菌种,如用于制造泡菜、酸奶的乳酸菌种外,一种优选的菌种来源方式,可以采用由来源于固体培养基培养的乳酸菌再接种入液体培养基后,经37℃(特别是配合50rpm)条件下培养1天后所得到乳酸菌菌种。其中所说的液体培养基,为含有为培养基总重量0.5%~10%碳源成分、0.5%~3%氮源成分、0.01%~1%微量元素和/或无机盐成分、其余为水的乳酸菌常规发酵培养基;所说的固体培养基则可由1000ml所说的液体培养基和10~20g琼脂组成。所说乳酸菌常规发酵培养基中的碳源成分和氮源成分,可以包括如目前通用培养基中的如葡萄糖、蔗糖、淀粉等,和/或如牛肉膏、酵母膏等常用成分。
以本发明上述的川乌-乳酸菌发酵组合物与药物中可以接受的如填充剂、崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂等常用辅助成分,可以共同制成为可供方便使用的具有抗肿瘤功能的药物。例如,将本发明上述的川乌-乳酸菌发酵组合物与水溶性赋形剂、乙醇等常规辅料混合后,通过制粒、干燥、整粒、包装等过程,即得颗粒剂药物;与淀粉、乳糖混匀,按常规方法制粒并加入硬酯酸镁整粒,压片后,可以得到片剂型药物。
试验结果表明,本发明上述的乳酸菌-川乌水提取液发酵组合物在抗肿瘤方面能具有理想的药理作用和效果,且无明显毒副作用,开创了毒性药材制备和应用的新途径,具有很好的开发和应用前景。其制备方法也无其它特殊的要求和限制,易于工业化生产,
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下,根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更,均应包括在本发明的范围内。
附图说明
图1是本发明的川乌-乳酸菌发酵液对S180增殖的作用曲线。
图2是本发明的川乌-乳酸菌发酵液体外对MGC-803增殖的作用曲线。
图3是本发明的川乌-乳酸菌发酵液体外对Lovo增殖的作用曲线。
具体实施方式
实施例1 本发明组合物的制备
一、川乌水提液的制备
实验方法:
以川乌生药为原料,采用将川乌生药以其重量5~10倍的水煎煮30~60分钟后过滤,过滤的药渣再以同样量的水煎煮1次或数次,每次30~60分钟。合并各次水煎煮液得到的滤液并分别浓缩至以生药川乌重量计的川乌提取物浓度为0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml、0.05g/ml和0.06g/ml。
二、乳酸菌菌种活化
实验方法:
将乳酸菌从固体培养基上分离出来,再转接入液体培养基后,经37℃及50rpm条件下培养24h后所得到乳酸菌菌种。其中,固体培养基由蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、K2HPO4、MgSO47H2O、MnSO4组成,培养基总重量中的碳源成分为3%~5%、氮源成分为1%~2%、微量元素和无机盐成分(包括Mn元素、乙酸钠、柠檬酸二胺、K2HPO4、MgSO47H2O、MnSO4等)含量为0.1%~0.5%,其余为水,并加入琼脂10~15g/L的乳酸菌常规培养基;液体培养基的组成为仅不加入琼脂的上述固体培养基成分的乳酸菌常规发酵培养基。
三、乳酸菌对川乌水提液的生长适应性
实验方法:
(1)按1.0×106cfu/ml接种量将乳酸菌分别接种于0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml、0.05g/ml和0.06g/ml的川乌水提液(均为以生药川乌重量计的川乌提取物浓度,以下同此)中,37℃100rpm条件下培养24~72h,采用平板涂布法检测发酵液中的乳酸菌菌落数。
(2)按1.0×105、1.0×106和1.0×107cfu/ml接种量将乳酸菌分别接种于0.05g/ml的川乌水提液中,37℃100rpm条件下培养48h,采用平板涂布法检测发酵液中的乳酸菌菌落数。
实验结果:
(1)从表1可以看出,当川乌水提液的浓度为0.02~0.05g/ml时,乳酸菌的长势较佳且基本一致;当川乌水提液的浓度大于0.05g/ml以后,乳酸菌的生长受到抑制。确定本发明中川乌水提液的适宜浓度为0.05g/ml。
由表1结果还可以看出,当培养时间为24~48小时,乳酸菌的生长处于对数生长期,生长速度快;当培养时间为48~72小时,乳酸菌的生长进入衰亡期,发酵液中的活菌数降低。因此,确定本发明中乳酸菌的发酵时间为48小时。
表1 川乌水提液浓度和发酵时间对乳酸菌培养的影响
(2)接种量对乳酸菌培养的影响的试验结果如表2所示。由表2可以看出,当接种量为1.0×105和1.0×106cfu/ml时,发酵液中的活菌数随着接种量的增加而增加;当接种量大于1.0×106cfu/ml时,活菌数和接种量为1.0×106cfu/ml时一致。确定本发明中的接种量为1.0×106cfu/ml。
表2 接种量对乳酸菌培养的影响
接种量(cfu/ml) 48h的菌落数(cfu/ml)
1.0×105 4.6×109
1.0×106 5.2×1010
1.0×107 6.5×1010
实施例2 药效学试验
以上述由川乌水提液浓度为0.05g/ml和乳酸菌接种量为1.0×106cfu/ml,在37℃和100rpm条件下培养48h得到的混合物即川乌-乳酸菌发酵液为试验样品,进行下述的药效学试验。
一、本发明川乌-乳酸菌发酵液组合物对小鼠体内抑瘤效果的影响
实验动物:KM种小鼠80只,体重20±2g。
肿瘤细胞:S180肉瘤细胞。
实验方法:无菌取传代6d的S180肉瘤细胞悬液,经生理盐水稀释后调细胞数至4×107cell/mL,每只小鼠腋下接种0.2mL,24h后随机分组:对照组(生理盐水0.2ml/10g,以下各项试验的含义同此),阳性组(ip环磷酰胺0.3mg/10g,即每天每kg体重小鼠腹腔注射环磷酰胺30mg,以下各项试验的含义同此),川乌组(川乌水提液30mg/10g,即每天每kg体重小鼠灌胃的川乌水提液中川乌的含量为3g,以下各项试验的含义同此),川乌-乳酸菌组(30mg/10g,即每天每kg体重小鼠灌胃的川乌-乳酸菌发酵液中川乌的含量为3g、乳酸菌3×1012cfu,以下各项试验的含义同此)、川乌/乳酸菌混合组(将乳酸菌菌液与川乌水提液混合,30mg/10g,即每天每kg体重小鼠灌胃的混合液中川乌的含量为3g,乳酸菌3×1012cfu,以下各项试验的含义同此),每组各10只,雌雄各半。各组每日按剂量灌胃给药,每日1次,连续12日。第12日将供试小鼠以颈椎脱臼法致死,剥取瘤块、脾脏、胸腺、用电子天平称其重量。计算肿瘤抑制率、脾指数、胸腺指数,结果用下述生物统计学方法处理,结果如表3所示。
表3 川乌-乳酸菌发酵液对小鼠抑瘤效果
注:与对照组相比:*P<0.05,**P<0.01
从表3可以发现,与对照组相比,川乌-乳酸菌发酵液组合物对小鼠体内S180瘤株具有显著的抑制作用,抑瘤率达45.3%。
二、本发明的川乌-乳酸菌发酵液组合物体外抑瘤效果
1、川乌-乳酸菌发酵液组合物对S180的体外抑瘤效果试验
肿瘤细胞:小鼠肉瘤细胞株S180。
实验方法:小鼠肉瘤细胞株S180以含10%小牛血清的RPMI-1640传代培养。取对数生长期细胞,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液吹打细胞,制成细胞悬液。1500rpm×5min离心,去除上清,得到细胞沉淀。再以含10%小牛血清的RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液,显微镜下计数。
参考由其生长曲线所测得的最适细胞接种浓度,以RMPI-1640培养液配成细胞悬液,按1×105cell/孔接种于96孔平底细胞培养板,预培养。
将川乌-乳酸菌发酵液,加入已进行体外预培养24小时的96孔培养板,并以含10%小牛血清的RMPI-1640培养液补足至终体积为200μl;每种浓度设3个平行孔,共9个浓度,终浓度分别为20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml,同时做细胞对照孔(加细胞和培养液,不加药物)和空白对照孔(只加细胞培养液)。
加药后继续培养48小时,于倒置显微镜下观察细胞生长状况。于结束培养前4小时,将细胞板离心,每孔弃去培养上清100μl,加入浓度为5mg/ml的MTT 10μl,培养结束后,每孔加10%SDS(用0.01M的HCl配置)100μl,37℃下放置4小时。振荡混匀,使结晶物充分溶解。在570nm波长处用酶标仪测定每孔OD570值。
以药物浓度为横坐标,OD值平均值为纵坐标,作川乌-乳酸菌发酵液对S180细胞体外增值的抑制曲线。
镜下观察显示,添加各浓度川乌-乳酸菌发酵液对体外培养的S180细胞形态没有任何改变,细胞生长状态良好。采用MTT法对细胞增殖进行检测,发现川乌-乳酸菌发酵液在浓度为300μg/ml时,对S180增殖有明显的抑制作用如图1所示。
2、川乌-乳酸菌发酵液组合物对MGC-803的体外抑瘤效果
肿瘤细胞:人胃癌肿瘤细胞株MGC-803。
实验方法:人胃癌肿瘤细胞株MGC-803以含10%小牛血清的RPMI-1640传代培养。取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液吹打细胞,制成细胞悬液。1500rpm×5min离心,去除上清,得到细胞沉淀。再以含10%小牛血清的RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液,显微镜下计数。
参考由其生长曲线所测得的最适细胞接种浓度,以RMPI-1640培养液配成细胞悬液,按5×104个/孔接种于96孔平底细胞培养板,预培养。
将川乌-乳酸菌发酵液按实验设计,加入已进行体外预培养24小时的96孔培养板,并以含10%小牛血清的RMPI-1640培养液补足至终体积为200μl;每种浓度设3个平行孔,共9个浓度,终浓度分别为20μg/ml、50μμg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml,同时做细胞对照孔(加细胞和培养液,不加药物)和空白对照孔(只加细胞培养液)。
加药后继续培养48小时,倒置显微镜下观察细胞生长状况。于结束培养前4小时,每孔弃去培养上清100μl,加入浓度为5mg/ml的MTT10μl,培养结束后,每孔加10%SDS(用0.01M的HCl配置)100μl,37℃下放置4小时。振荡混匀,使结晶物充分溶解。在570nm波长处用酶标仪测定每孔OD值。
以药物浓度为横坐标,OD值平均值为纵坐标,作川乌-乳酸菌发酵液对MGC-803细胞体外增值的抑制曲线,如图2所示。
镜下观察显示,添加各浓度川乌-乳酸菌发酵液对体外培养的MGC-803细胞形态没有任何改变,细胞生长状态良好。采用MTT法对细胞增殖进行检测,发现浓度为300μg/ml的川乌-乳酸菌发酵液对MGC-803细胞增殖有抑制作用。
3、川乌-乳酸菌发酵液组合物对Lovo的体外抑瘤效果
肿瘤细胞:人结肠癌肿瘤细胞株Lovo。
实验方法:人结肠癌肿瘤细胞株Lovo以含10%小牛血清的RPMI-1640传代培养。取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液吹打细胞,制成细胞悬液。1500rpm×5min离心,去除上清,得到细胞沉淀。再以含10%小牛血清的RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液,显微镜下计数。
参考由其生长曲线所测得的最适细胞接种浓度,以RMPI-1640培养液配成细胞悬液,按1×105个/孔接种于96孔平底细胞培养板,预培养。
将川乌-乳酸菌发酵液按实验设计,加入已进行体外预培养24小时的96孔培养板,并以含10%小牛血清的RMPI-1640培养液补足至终体积为200μl;每种浓度设3个平行孔,共9个浓度,终浓度分别为20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml,同时做细胞对照孔(加细胞和培养液,不加药物)和空白对照孔(只加细胞培养液)。
加药后继续培养48小时,在倒置显微镜下观察细胞生长状况。于结束培养前4小时,每孔弃去培养上清100μl,加入浓度为5mg/ml的MTT10μl,培养结束后,每孔加10%SDS(用0.01M的HCl配置)100μl,37℃下放置4小时。振荡混匀,使结晶物充分溶解。在570nm波长处用酶标仪测定每孔OD值。
以药物浓度为横坐标,OD值平均值为纵坐标,作川乌-乳酸菌发酵液对Lovo细胞体外增值的抑制曲线,如图3所示。
镜下观察显示,添加各浓度川乌-乳酸菌发酵液对体外培养的Lovo细胞形态没有任何改变,细胞生长状态良好。采用MTT法对细胞增殖进行检测,发现川乌-乳酸菌发酵液在浓度为200μg/ml时对Lovo细胞增殖有明显的抑制作用。
由以上的各项实验结果可以看出,本发明提出的川乌-乳酸菌液体发酵体系及其发酵产物的应用,开创了中药材与益生菌联合产品开发的新途径。该发酵体系构建合理,参数可控,在抗肿瘤等方面具有理想的药理作用,具有很好的应用于药品的前景。
实施例3 本发明的具有抗肿瘤功能的片剂药物
称取本发明乳酸菌-川乌发酵液的干燥粉末100g、淀粉60g、乳糖30g、硬酯酸镁10g,共制成1000片,得到每片含川乌-乳酸菌发酵液的干燥粉末100mg的片剂。
实施例4 本发明的具有抗肿瘤功能的颗粒剂
将本发明乳酸菌-川乌发酵液与水溶性赋形剂、乙醇等常规颗粒剂所用辅料,通过制粒、干燥、整粒、包装等过程,即得颗粒剂。
实施例5 本发明的具有抗肿瘤功能的口服液
将本发明乳酸菌-川乌发酵液与蜂蜜、单糖浆、山梨酸、苯甲酸等口服液体制剂的常规辅料混合均匀后,分装灭菌,即得口服液。
实施例6 本发明的具有抗肿瘤功能的胶囊
将本发明乳酸菌-川乌发酵液制成固体状,打粉后与胶囊制剂中的常规辅料混合均匀,分装胶囊,即得胶囊。
Claims (8)
1.具有抗肿瘤功能的组合物,为由乳酸菌在川乌水提取液中发酵后所成的发酵液体混合物,所说的川乌水提取液为以生药川乌重量计的川乌提取物浓度为0.02~0.06g/ml,乳酸菌的接种量为1.0×104~1.0×108cfu/ml。
2.如权利要求1所述的具有抗肿瘤功能的组合物,其特征是所说川乌水提取液中的川乌提取物浓度为0.05g/ml。
3.如权利要求1或2所述的具有抗肿瘤功能的组合物,其特征是所说的乳酸菌接种量为1.0×106cfu/ml。
4.制备权利要求1至3所述具有抗肿瘤功能的组合物的方法,其特征是在具有所说川乌提取物浓度的川乌水提取液中,按所说的接种量接种乳酸菌后,在30℃~40℃条件下培养1~5天,得到目标产物的发酵液体混合物。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征是所说的乳酸菌接种后在37℃和100rpm条件下培养2天。
6.如权利要求4或5所述的制备方法,其特征是所说的川乌水提取液为分别将川乌生药或其前次煎煮后的过滤滤渣,以其生药重量5~10倍的水煎煮30~60分钟后过滤,合并各次水煎煮液的滤液并浓缩至所说的川乌提取物浓度。
7.如权利要求4或5所述的制备方法,其特征是所说的用于在川乌水提取液中接种的乳酸菌菌种,为由来源于固体培养基培养的乳酸菌再接种入液体培养基后,于37℃培养1天所得到乳酸菌菌种,所说的液体培养基为含有培养基总重量0.5%~10%碳源成分、0.5%~3%氮源成分、0.01%~1%微量元素和/或无机盐成分、其余为水的乳酸菌常规发酵培养基;所说的固体培养基由1000ml所说的液体培养基和10~20g琼脂组成。
8.将权利要求1至3所述的具有抗肿瘤功能的组合物,与药物中可以接受的辅助成分共同组成具有抗肿瘤功能的药物。
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