CN114470154B - 一种甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于益生菌促进剂的技术领域，公开了一种甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂及其制备和应用。方法：1)将甜杏仁在pH7‑9缓冲液中提取，离心，上层液为甜杏仁油，下层液用弱极性大孔树脂进行吸附；将未被吸附的溶液透析，干燥，得甜杏仁糖蛋白；将吸附后的大孔树脂用乙醇水溶液洗脱，干燥，得甜杏仁酚酸；2)将脂肪酶与甜杏仁油反应，再与甜杏仁糖蛋白继续反应，得甜杏仁油糖蛋白结合物；3)在搅拌的条件下，将甜杏仁酚酸与甜杏仁油糖蛋白结合物混合，过微孔滤膜，得甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂。本发明的促进剂抑制大肠埃希菌，促进肠道乳酸杆菌和双歧杆菌的显著增殖。本发明的促进剂用于制备肠道菌群调节药物。
Description
技术领域
本发明属于益生菌促进剂的技术领域，具体涉及一种甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂及其制备方法和应用。
背景技术
肠道菌群是宿主肠道中的正常微生物，种类繁多。一般而言，健康的成年人，其肠道中的微生物约有1014个，约为人体细胞个数的10倍，能在体内形成复杂而又独特系统，调节宿主的正常生理功能，而菌群的组成和代谢等也会受到宿主周围环境的影响。其中，肠道益生菌有乳酸杆菌和双歧杆菌等，是人体健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等。通过调节肠道菌群，增加益生菌，可抑制多种致病菌所致的肠道疾病，并能调节人体代谢和免疫功能。
杏仁具有润肠通便的作用，CN104905352A和CN108208504A分别公开了一种保健饮品的制备方法，包含了杏仁原料，具有调节肠道菌群的作用，然而这些保健饮品需要将杏仁与多种原料配伍，才能达到调节肠道菌群的目的。
杏仁含有多种营养成分如杏仁油、蛋白质等，虽然目前已有从中提取分离杏仁油、蛋白质的报道，但没有将单味杏仁中功能性成分进行有效组合，并进行肠道菌群调节作用的研究报道。直接提取物许多成分在胃肠道环境中容易被破坏，因而直接口服达不到抑制肠道有害菌而促进益生菌增殖的目的。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂。
本发明的另一目的在于提供所述甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂在制备肠道菌群调节药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现。
一种甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂，是以甜杏仁油糖蛋白结合物为壳，甜杏仁酚酸为核组成的纳米制剂。
所述甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将甜杏仁在pH7-9缓冲液中进行提取处理，离心，收集上层液为甜杏仁油；将下层液用弱极性大孔树脂进行吸附，获得吸附后的大孔树脂，同时收集未被吸附的溶液；
2)将未被吸附的溶液进行透析，干燥，获得甜杏仁糖蛋白；将吸附后的大孔树脂采用乙醇水溶液进行洗脱，将洗脱液进行干燥，获得甜杏仁酚酸；
3)在pH7-9缓冲液中，将脂肪酶与甜杏仁油进行反应，加入与水不互溶的有机溶剂和甜杏仁糖蛋白，继续反应，静置，将上层液干燥，获得甜杏仁油糖蛋白结合物；
4)将甜杏仁酚酸用体积分数60-80％乙醇水溶液配成溶液，获得甜杏仁酚酸溶液；将甜杏仁油糖蛋白结合物用pH7-9缓冲液配制溶液，获得甜杏仁油糖蛋白结合物溶液；在搅拌的条件下，将甜杏仁酚酸溶液与甜杏仁油糖蛋白结合物溶液进行混合，过微孔滤膜，得甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂。
步骤1)中甜杏仁在提取处理前进行粉碎过10-30目筛；所述甜杏仁与pH7-9缓冲液的质量比为1：(10-30)；所述提取处理的条件为50-60℃提取1-3h；所述离心的条件为3000-5000转/min离心30-60min，所述吸附的时间为8-24h；
步骤2)中所述透析是指用截留分子量50-200kDa的膜透析；透析的时间为24-48h；所述干燥为冷冻干燥，是指将截留液进行干燥；干燥的时间为24-48h；所述乙醇水溶液为体积分数为50-70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液为大孔树脂质量的1-3倍；所述干燥为真空干燥，真空干燥的条件为50-60℃，0.01-0.1MPa干燥3-5h；
步骤3)中所述脂肪酶的加入量为甜杏仁油质量的5-10％；pH7-9缓冲液的用量为甜杏仁油质量的10-30倍；所述反应的条件为50-60℃反应1-3h；所述有机溶剂的用量为甜杏仁油质量5-10倍；甜杏仁糖蛋白为甜杏仁油质量0.5-1.5倍；所述继续反应的时间为1-3h；所述静置的时间为8-24h；所述干燥为真空干燥，干燥的条件为50-60℃，0.01-0.1MPa浓缩干燥3-5h；
步骤4)中所述甜杏仁酚酸与甜杏仁油糖蛋白结合物的质量比为1：(5-20)
步骤4)中所述甜杏仁酚酸溶液的质量浓度为5-10％、甜杏仁油糖蛋白结合物溶液的质量浓度为5-10％。
步骤4)中所述搅拌的转速为5000-20000转/min；所述混合为搅拌混合，混合的时间为10-60min；所述混合是指将甜杏仁酚酸溶液加入到甜杏仁油糖蛋白结合物溶液中，搅拌混合。
步骤(4)中所述微孔滤膜为是指0.1-0.5μm微孔滤膜。
步骤1)所述大孔树脂为AB-8、HPD100、HPD400、D101型、YKDH-2中的一种以上，其用量为甜杏仁质量的1-3倍。
步骤3)所述与水不互溶的有机溶剂为乙酸乙酯、叔戊醇和环已烷中的一种以上。
步骤1)、3)和4)所述缓冲液独自为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的一种。
所述甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂在制备肠道菌群调节药物中的应用，可以在口服后抑制大肠埃希菌而促进肠道乳酸杆菌和双歧杆菌的显著增殖，从而可预防因肠道有害菌导致的疾病。
本发明的原理：甜杏仁经缓冲液提取分离杏仁油后，剩余为甜杏仁糖蛋白和酚酸的混合液，经大孔树脂吸附分离得到甜杏仁酚酸，未吸附液经透析分离得到甜杏仁糖蛋白，甜杏仁油经脂肪酶水解后得到脂肪酸，与甜杏仁糖蛋白发生在两相体系中发生酯化连接，形成甜杏仁油糖蛋白结合物。甜杏仁酚酸与甜杏仁油糖蛋白结合物再经纳米乳化后，由于甜杏仁油糖蛋白结合物具有两亲性，其亲水性糖蛋白在外，疏水性脂肪酸基团在内与甜杏仁酚酸相连，形成甜杏仁糖蛋白为壳和甜杏仁酚酸为核的纳米结构。杏仁糖蛋白为酸性糖蛋白，在胃液中稳定，在肠道内水解而释放糖蛋白、脂肪酸和酚酸，糖蛋白可加强与细菌的粘附，不仅提供了肠道有益菌多种营养，而且酚酸对有害菌进行抑制，从而可促进肠道有益菌增殖，并保持人体健康。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
(1)本发明制备了一种甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米制剂，保持甜杏仁酚酸在胃液中的稳定性。
(2)本发明克服了甜杏仁多糖或甜杏仁油只能提供单一营养，且不能抑制有害菌的缺点，可同时实现肠道有益菌的增殖和有害菌的抑制。
(3)本发明反应条件温和，易于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)甜杏仁1kg粉碎过30目筛，加入10kg的50℃pH7磷酸缓冲液提取3h后，5000转/min离心30min，收集上层液为甜杏仁油，下层液用AB-8大孔树脂1kg吸附8h；
(2)将上述未被大孔树脂吸附的溶液用截留分子量50kDa的膜透析24h，截留液冷冻干燥24h(冷冻干燥的温度-50℃)，得甜杏仁糖蛋白260g；将吸附后的大孔树脂用1kg体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经50℃，0.01MPa干燥3h，得甜杏仁酚酸14g；
(3)甜杏仁油100g加入5g脂肪酶和1000g的50℃pH7磷酸缓冲液反应3h后，加入500g乙酸乙酯和50g甜杏仁糖蛋白，继续反应1h后，静置8h，上层液经50℃，0.01MPa浓缩干燥3h，得甜杏仁油糖蛋白结合物120g；
(4)将甜杏仁酚酸10g与50g的甜杏仁油糖蛋白结合物，分别用体积分数70％乙醇水溶液和pH7磷酸缓冲液配制成5％的溶液，在5000转/min搅拌下，将甜杏仁酚酸溶液加入到甜杏仁油糖蛋白结合物溶液中，搅拌10min后过0.1μm微孔滤膜，即得甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂。
实施例2
(1)甜杏仁1kg粉碎过10目筛，加入30kg的60℃pH9磷酸缓冲液提取1h后，3000转/min离心60min，收集上层液为甜杏仁油，下层液用HPD100大孔树脂3kg吸附24h；
(2)将上述未被大孔树脂吸附的溶液用截留分子量200kDa的膜透析48h，截留液冷冻干燥48h，得甜杏仁糖蛋白280g；将吸附后的大孔树脂用9kg体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经60℃，0.1MPa干燥5h，得甜杏仁酚酸12g；
(3)甜杏仁油100g加入10g脂肪酶和3000g的60℃pH9磷酸缓冲液反应3h后，加入1000g的叔戊醇和150g的甜杏仁糖蛋白，继续反应3h后，静置24h，上层液经60℃，0.1MPa浓缩干燥5h，得甜杏仁油糖蛋白结合物210g。
(4)将甜杏仁酚酸10g与200g的甜杏仁油糖蛋白结合物，分别用体积分数80％乙醇水溶液和pH10磷酸缓冲液配制成10％的溶液，在20000转/min搅拌下，将甜杏仁酚酸溶液加入到甜杏仁油糖蛋白结合物溶液中，搅拌60min后过0.5μm微孔滤膜，即得甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂。
实施例3
(1)甜杏仁1kg粉碎过15目筛，加入20kg的60℃pH8Tris-HCl缓冲液提取2h后，4500转/min离心35min，收集上层液为甜杏仁油，下层液用HPD400大孔树脂2kg吸附16h；
(2)将上述未被大孔树脂吸附的溶液液用截留分子量100kDa的膜透析36h，截留液冷冻干燥36h，得甜杏仁糖蛋白230g；将吸附后的大孔树脂用5kg体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经60℃，0.05MPa干燥4h，得甜杏仁酚酸11g；
(3)甜杏仁油100g加入8g脂肪酶和2000g的60℃pH8 Tris-HCl缓冲液反应2h后，加入800g的环已烷和120g的甜杏仁糖蛋白，继续反应2h后，静置16h，上层液经60℃，0.05MPa浓缩干燥4h，得甜杏仁油糖蛋白结合物160g；
(4)将甜杏仁酚酸10g与100g的甜杏仁油糖蛋白结合物，分别用体积分数75％乙醇水溶液和pH8Tris-HCl缓冲液配制成8％的溶液，在10000转/min搅拌下，将甜杏仁酚酸溶液加入到甜杏仁油糖蛋白结合物溶液中，搅拌40min后过0.3μm微孔滤膜，即得甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂。
实施例4
(1)甜杏仁1kg粉碎过25目筛，加入15kg的55℃pH9磷酸缓冲液提取1.5h后，3500转/min离心45min，收集上层液为甜杏仁油，下层液用D101大孔树脂1.5kg吸附12h；
(2)将上述未被大孔树脂吸附的溶液用截留分子量75kDa的膜透析30h，截留液冷冻干燥30h，得甜杏仁糖蛋白190g；将吸附后的大孔树脂用3kg体积分数为55％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经60℃，0.1MPa干燥3.5h，得甜杏仁酚酸10g；
(3)甜杏仁油100g加入7g脂肪酶和1000g的55℃pH9磷酸缓冲液反应1.5h后，加入600g的叔戊醇和70g的甜杏仁糖蛋白，继续反应1.5h后，静置12h，上层液经60℃，0.05MPa浓缩干燥3.5h，得甜杏仁油糖蛋白结合物115g；
(4)将甜杏仁酚酸10g与80g的甜杏仁油糖蛋白结合物，分别用体积分数60％乙醇水溶液和pH9磷酸缓冲液配制成6％的溶液，在6000转/min搅拌下，将甜杏仁酚酸溶液加入到甜杏仁油糖蛋白结合物溶液中，搅拌30min后过0.2μm微孔滤膜，即得甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂。
实施例5
(1)甜杏仁1kg粉碎过20目筛，加入25kg的60℃pH7.5Tris-HCl缓冲液提取2.5h后，4000转/min离心40min，收集上层液为甜杏仁油，下层液用YKDH-2大孔树脂2.5kg吸附20h；
(2)将上述未被大孔树脂吸附的溶液用截留分子量150kDa的膜透析40h，截留液冷冻干燥40h，得甜杏仁糖蛋白220g；将吸附后的大孔树脂用5kg体积分数为65％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经60℃，0.06MPa干燥4.5h，得甜杏仁酚酸13g；
(3)甜杏仁油100g加入6g脂肪酶和1500g的65℃pH7.5Tris-HCl缓冲液反应2.5h后，加入800g的环已烷和100g的甜杏仁糖蛋白，继续反应2.5h后，静置20h，上层液经60℃，0.06MPa浓缩干燥4.5h，得甜杏仁油糖蛋白结合物160g；
(4)将甜杏仁酚酸10g与160g的甜杏仁油糖蛋白结合物，分别用体积分数65％乙醇水溶液和pH7.5Tris-HCl缓冲液配制成8wt％的溶液，在12000转/min搅拌下，将甜杏仁酚酸溶液加入到甜杏仁油糖蛋白结合物溶液中，搅拌25min后过0.4μm微孔滤膜，即得甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂。
对照例1
按实施例1制备方法，但在步骤(3)中不加入甜杏仁糖蛋白，所制得的产品为对照1。
对照例2
按实施例1制备方法，但在步骤(4)中将甜杏仁油糖蛋白结合物替换为卵磷脂，所制得的产品为对照2。
对照例3
按实施例1步骤(1)制备方法，所得缓冲液提取物经冷冻干燥为对照3。
测试1实施例1-5制得的甜杏仁油糖蛋白结合物的组成分析
方法：将实施例1-5制得的甜杏仁油糖蛋白结合物，取适量按照中华人民共和国农业行业标准-食用菌中粗多糖含量的测定(NY/T1676-2008)测定样品中的糖含量，按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准-出品乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定考马斯亮蓝法(SN/T3926-2006)测定样品中的蛋白含量，按照食品安全国家标准-食品中脂肪酸的测定(GB5009.168-2016)第一法测定样品中的脂肪酸含量。
结果：实施例1-5制得的甜杏仁油糖蛋白结合物中的糖、蛋白和脂肪酸含量见表1，产品中含糖4.8-6.5％、蛋白10.8-14.6％和脂肪酸68.9-78.5％，说明该结合物中同时含有糖、蛋白和脂肪酸三种营养成分。
表1甜杏仁油糖蛋白结合物的含量组成
测试2实施例1-5制得的甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂中纳米粒径和甜杏仁酚酸载药量的测定
方法：将实施例1-5制得的甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米制剂、对照例1和对照例2，采用马尔文纳米粒度仪测定其粒径，并取适量按照T/AHFIA 005-2018植物提取物及其制品中总多酚含量的测定—分光光度法测定甜杏仁酚酸的含量，计算载药量。
结果：实施例1-5制得的甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的粒径和甜杏仁酚酸含量见表2，其粒径为163-235nm，载药量为4.5-11.8％，说明该产品为负载了甜杏仁酚酸的纳米制剂。对照例1无载药，说明杏仁油脂肪酸不具备包载能力；对照例2有少量载药，说明脂质体可包载甜杏仁酚酸，但载药量低。
表2甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的粒径和甜杏仁酚酸载药量
| 样品来源 | 平均粒径nm | 甜杏仁酚酸载药量％ |
| 实施例1 | 217 | 11.8 |
| 实施例2 | 235 | 4.5 |
| 实施例3 | 187 | 8.4 |
| 实施例4 | 163 | 9.7 |
| 实施例5 | 225 | 5.2 |
| 对照例1 | 193 | 0 |
| 对照例2 | 254 | 1.6 |
测试3实施例1-5制得的甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂在模拟胃肠液中的稳定性测定
方法：采用模拟人工胃液(含1％胃蛋白酶，pH＝1.2)和模拟人工肠液(含1％胰蛋白酶，pH＝6.8)对甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米制剂进行稳定性评价。将1mL实施例1-5制得的甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米制剂、对照例2和对照例3分别加入到4mL模拟人工胃液或肠液中，于37℃、100rpm振荡孵育，每隔1h时间间隔取样200μL，通过微柱离心法除去渗出的游离酚酸，将得到的滤液转移至5mL容量瓶中，甲醇定容，超声破乳。采用T/AHFIA 005-2018植物提取物及其制品中总多酚含量的测定—分光光度法测定酚酸的含量，以0时刻的药物浓度为100％，计算该制剂各时间点残存酚酸的百分率。
结果：实施例1-5制得的甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂在模拟胃液中4h内酚酸仍保留了80％以上，而在肠液中降解较快，结果见表3。说明该产品具有提高胃液稳定性作用，而在肠道中能够快速释放酚酸。对照例2和对照例3在胃肠液中均释药快，表明该脂质体在胃肠液中不稳定。
表3甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂在模拟胃肠液中酚酸的保留率(％)
测试4实施例1制得的甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的作用效果
方法：取250±25g雄性SD大鼠45只，随机分为9组，每组5只。第1组给予正常大鼠饲料，第2组给予高脂饲料(87.6％标准饲料、2％胆固醇、0.2％胆酸钠、10％猪油)，第3-9组在给予高脂饲料，再分别灌胃甜杏仁油、实施例1制得的甜杏仁糖蛋白、甜杏仁酚酸、甜杏仁油糖蛋白结合物、甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂、对照例2和对照例3，按1g/100g体重剂量，一日两次。分别于15天和30天，取大鼠粪便，对其进行肠道菌群及益生菌(如双歧杆菌和乳酸杆菌)的16sRNA宏基因组测序，并对各种益生菌和大肠埃希菌的丰度分析(相对百分比)。
结果：结果见表4，显示第2组模型大鼠益生菌较正常组显著下降，但大肠埃希菌增加，第3-5组和第8-9组较第二组有所改善，但与正常组差异不大；第6组有显著增加，而第7组最优，说明甜杏仁油糖蛋白结合物能提供肠道益生菌较全面的营养，促进它们增殖，而甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂不仅能提供全面营养，而且可通过甜杏仁酚酸对有害菌群大肠埃希菌的抑制，更好地促进了肠道益生菌的增殖。
表4大鼠粪便中益生菌的相对丰度(％)
实施例中所采用的脂肪酶为常规的脂肪酶，可以为脂肪酶南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶A(CALA)、南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体、Hyphozyma属脂肪酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶、假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶的能等。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将甜杏仁在pH7-9缓冲液中进行提取处理，离心，收集上层液为甜杏仁油；将下层液用弱极性大孔树脂进行吸附，获得吸附后的大孔树脂，同时收集未被吸附的溶液；
2）将未被吸附的溶液进行透析，冷冻干燥，获得甜杏仁糖蛋白；将吸附后的大孔树脂采用乙醇水溶液进行洗脱，将洗脱液进行干燥，获得甜杏仁酚酸；
3）在pH7-9缓冲液中，将脂肪酶与甜杏仁油进行反应，加入与水不互溶的有机溶剂和甜杏仁糖蛋白，继续反应，静置，将上层液干燥，获得甜杏仁油糖蛋白结合物；
4）将甜杏仁酚酸用体积分数60-80%乙醇水溶液配成溶液，获得甜杏仁酚酸溶液；将甜杏仁油糖蛋白结合物用pH7-9缓冲液配制溶液，获得甜杏仁油糖蛋白结合物溶液；在搅拌的条件下，将甜杏仁酚酸溶液与甜杏仁油糖蛋白结合物溶液进行混合，过微孔滤膜，得甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂；
步骤1）中所述提取处理的条件为50-60℃提取1-3h；
步骤1）所述大孔树脂为AB-8、HPD100、HPD400、D101型、YKDH-2中的一种以上，其用量为甜杏仁质量的1-3倍；
步骤2）中所述乙醇水溶液为体积分数为50-70%的乙醇水溶液；步骤2）中所述透析是指用截留分子量50-200kDa的膜透析；
步骤3）中所述脂肪酶的加入量为甜杏仁油质量的5-10%；步骤3）中所述反应的条件为50-60℃反应1-3h；步骤3）中甜杏仁糖蛋白为甜杏仁油质量0.5-1.5倍；步骤3）中所述继续反应的时间为1-3h；步骤3）中所述与水不互溶的有机溶剂为乙酸乙酯、叔戊醇和环己烷中的一种以上；
步骤4）中所述甜杏仁酚酸与甜杏仁油糖蛋白结合物的质量比为1：（5-20）；
步骤4）中所述搅拌的转速为5000-20000转/min；
步骤1）、3）和4）中所述缓冲液独自为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的一种。
2.根据权利要求1所述甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的制备方法，其特征在于：
步骤（4）中所述微孔滤膜为是指0.1-0.5μm微孔滤膜。
3.根据权利要求1所述甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述甜杏仁与pH7-9缓冲液的质量比为1：（10-30）；步骤1）中所述离心的条件为3000-5000转/min离心30-60min，所述吸附的时间为8-24h；
步骤4）中所述甜杏仁酚酸溶液的质量浓度为5-10%、甜杏仁油糖蛋白结合物溶液的质量浓度为5-10%。
4.根据权利要求1所述甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的制备方法，其特征在于：
步骤2）中所述冷冻干燥是指将截留液进行干燥；
步骤3）中所述pH7-9缓冲液的用量为甜杏仁油质量的10-30倍；步骤3）中所述有机溶剂的用量为甜杏仁油质量5-10倍。
5.根据权利要求1所述甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的制备方法，其特征在于：步骤2）中透析的时间为24-48h ；步骤2）中所述透析，干燥中干燥的时间为24-48h；步骤2）中乙醇水溶液为大孔树脂质量的1-3倍；步骤2）中所述洗脱液进行干燥为真空干燥，真空干燥的条件为50-60℃，0.01-0.1MPa干燥3-5h；
步骤3）中所述静置的时间为8-24h；步骤3）中所述干燥为真空干燥，干燥的条件为50-60℃，0.01-0.1MPa浓缩干燥3-5h。
6.根据权利要求1所述甜杏仁油糖蛋白酚酸纳米肠道益生菌促进剂的制备方法，其特征在于：步骤4）中所述混合为搅拌混合，混合的时间为10-60min；步骤4）中所述混合是指将甜杏仁酚酸溶液加入到甜杏仁油糖蛋白结合物溶液中，搅拌混合；
步骤1）中甜杏仁在提取处理前进行粉碎过10-30目筛。
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