TW202021599A - 具有抗癌、抗病毒、抗發炎、促進成骨細胞增生、促進腸道幹細胞增生的多醣醱酵組合物及其製備方法 - Google Patents

具有抗癌、抗病毒、抗發炎、促進成骨細胞增生、促進腸道幹細胞增生的多醣醱酵組合物及其製備方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種組合物含多醣蔬菜、菇類、藻類作為原料，經特殊醱酵製備方法，將多醣分子(β葡聚醣、α葡聚醣)轉化、分割形成小分子形態醣類，其為分子量約在300道爾頓的多醣醱酵組合物，其結構不同於一般多醣分子，為有機形態，經醱酵後支鏈上多餘的葡萄醣結構被菌體利用代謝，去除多餘葡萄醣分子，可使醣分子具有親合力，成為包覆材料的多醣醱酵組合物，具有抗癌、抗病毒、抗發炎、促進成骨細胞增生、促進腸道幹細胞增生的功效。

Description

具有抗癌、抗病毒、抗發炎、促進成骨細胞增生、促進 腸道幹細胞增生的多醣醱酵組合物及其製備方法
本發明提供一種組合物含多醣蔬菜、菇類、藻類(如：蓮藕、山藥、蘆薈、香菇、木耳、銀耳、海木耳、石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻)作為原料，經特殊醱酵製備方法，將多醣分子(β葡聚醣、α葡聚醣)轉化、分割形成小分子形態醣類，其為分子量約在300道爾頓的多醣醱酵組合物，其結構不同於一般多醣分子，為有機形態，經醱酵後支鏈上多餘的葡萄醣結構被菌體利用代謝，去除多餘葡萄醣分子，可使醣分子具有親合力，成為包覆材料，具有抗癌、抗病毒、抗發炎、促進成骨細胞增生、促進腸道幹細胞增生的功效。
多醣體即是葡萄醣以其特殊接合方式(1-3)-β鍵結連接之葡聚醣(glucan)，又稱β-1,3.D葡聚醣，其他還有β-1,6.D葡聚醣。人體腸道中的消化酵素能切開澱粉之(1-4)-α鍵結鏈，將其水解成葡萄醣，以利腸道吸收利 用；但是消化酵素對於β-1,3.D以及β-1,6.D葡聚醣鍵結起不了作用，因此龐大體積的多醣體並無法穿透腸壁細胞。
常見多醣研究如：靈芝(Ganoderma lucidum)：台灣以赤芝和松杉靈芝為主，除了含有多醣體外，還含有有機鍺、三萜類、免疫調節蛋白、腺苷、油酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、靈芝酸等物質，可以改善肝發炎狀態；冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)：其內含有蟲草酸、蟲草素(cordycepin)、微量元素硒、鋅、各類胺基酸、脂肪酸等。其內含的有機物質在抗腫瘤上都扮演著一定角色；牛樟芝(Taiwanofungus camphoratus)：又稱為牛樟菇、神明菇，是一種台灣獨特的藥用真菌，含有三萜類、β葡聚醣、抗氧化酵素SOD、多醣體等，具有調節免疫系統、抗癌等作用，可以促進癌細胞凋亡、提升自然殺手細胞活性、調降NF-κB、抗血管新生、增加化療藥物的敏感性，以及對於癌幹細胞的促凋亡；藻類萃取物：如褐藻醣膠(fucoidan)或是藻褐素(fucoxanthin)皆是，具有增加自然殺手細胞活性、促進癌細胞凋亡、增加免疫力之功效、抑制血管新生、抗發炎等作用；巴西蘑菇(Agaricus blazei)：在巴西又稱之為神菇(God of mushroom)，其富含葡聚醣多醣體，對於許多癌症如子宮頸癌、骨肉瘤等具有促進癌細胞凋亡效果。
另依據文獻Extracts from New Zealand Undaria pinnatifida Containing Fucoxanthin as Potential Functional Biomaterials against Cancer in Vitro，該研究在抗癌活性使用九種人類癌細胞系中測試含有岩藻黃素的新西蘭海藻裙帶菜的萃取物和純的岩藻黃素，與純的岩藻黃素相比，我們發現含有低水平岩藻黃質的萃取物可更有效地抑制肺癌、結腸腺癌和神經母細胞瘤的生長。該研究結果新西蘭海藻裙帶菜含有岩藻黃素，其對多種類 型的癌細胞，特別是黑素瘤和子宮頸鱗狀細胞癌具有生長抑製作用，在低濃度下，岩藻黃質對一種惡性黑素瘤細胞系顯示出選擇性細胞毒性，用於治療或預防這兩種類型的癌症，岩藻黃素也可以在與其他細胞毒性抗癌藥物的聯合化療中以相對低的劑量使用，因為在低濃度下，它對癌細胞表現出選擇性癌細胞生長抑製作用，但需要進一步的研究來鑑定這種化合物。
依目前研究證實菇類、藻類富含豐富多醣，該多醣成分具有許多抗癌、抗病毒、抗發炎等功效，但由萃取方式取得之多醣成分分子量約在6,000道爾頓，且根據文獻指出多醣成分具有功效性，其分子量需大於6,000道爾頓，或小於500道爾頓，但對於癌症病患而言，化療副作用會導致食慾不振、腸胃吸收率變差等副作用，若以大分子形態多醣作為輔助食品，是否能被患者吸收或腸道利用仍是個疑問。
且目前所知多醣成分的提取以水萃取或有機溶劑萃取為主，其功效性為天然擁有，並不能有效提升作用性，其分子量約在6,000道爾頓以上，對於患者存在吸收率差的問題，吸收前還需要水解酵素的作用，若在攝取前已將分子量縮小為500道爾頓以下，就能解決不易吸收的缺點。
且在另一藻類研究中藻類中的多醣及多酚物質具有抗氧化、抗癌、抗凝血、抗發炎、抗病毒、抗高脂血症等功效，為了取得這些活性物質，產業界通常使用熱水、溶劑、酸水解、酵素水解等萃取法，但這些萃取方式通常伴隨著一些限制因子，包括：高成本、流程複雜及溶劑殘存毒性問題。另有研究發現藻類醱酵過程能釋放出更多的藻類活性成分，如：一般萃取法不易取得的特有海藻胜肽、胺基酸、多酚類化合物都可透過醱酵過程充分釋出，讓產品中的營養素更豐富，且經長時間醱酵作 用，可將海藻中的營養素分解成小分子狀態，更利於生物吸收利用。
因此發展出適合一般大眾使用、更利於生物吸收和腸道利用的多醣醱酵組合物，且具有抗癌、抗病毒、抗發炎、促進成骨細胞增生、促進腸道幹細胞增生的功效是現階段最重要急需解決的問題。
為解決上述的問題，本發明提供一種多醣組合物，含有蔬菜、菇類、藻類(如：蓮藕、山藥、蘆薈、香菇、木耳、銀耳、海木耳、石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻)作為多醣原料，經特殊製備方法，將多醣分子(β葡聚醣、α葡聚醣)轉化、分割形成小分子形態醣類之多醣醱酵組合物。
本發明一實施例中一種多醣醱酵組合物，包括：一原料係選自由一蔬菜、一菇類和一藻類所組成之群組，經一製備方法取得的一多醣分子，該多醣分子包含一分子量小於等於500道爾頓之多醣，該多醣分子包含多醣支鏈上的葡萄醣被去除之多醣分子。
本發明一實施例中，所述之多醣醱酵組合物，其中該多醣分子包含一分子量小於等於300道爾頓之多醣。
本發明一實施例中，所述之多醣醱酵組合物，其中該分子量小於等於300道爾頓之多醣占該多醣醱酵組合物的總多醣乾重80~99%。
本發明一實施例中，所述之多醣醱酵組合物，其中該藻類係選自由石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻及其混合物所組成之群組。
本發明一實施例中，所述之多醣醱酵組合物，其中該蔬菜係選自由鳳梨、木瓜、蘋果、蓮藕、山藥、蘆薈及其混合物所組成之群組。
本發明一實施例中，所述之多醣醱酵組合物，其中該菇類係選自由香菇、木耳、銀耳、海木耳及其混合物所組成之群組。
本發明一實施例中，所述之多醣醱酵組合物，其中該多醣分子為β葡聚醣或α葡聚醣。
本發明一實施例中，所述之多醣醱酵組合物，其中該多醣分子結構不同於一般多醣分子，為有機形態，經醱酵過程透過微生物所產生的水解酵素，將該多醣分子支鏈上的部分葡萄醣去除，可使該多醣分子與多種物質(如蛋白質胺基酸、益菌菌體、植物化合物、病毒體、病原菌體、重金屬汙染物)具有親合力，可做為包覆材料。
本發明一實施例中一種製備專利範圍1之多醣醱酵組合物之製備方法，包括：(1)基質醱酵步驟：將一蔬菜、一菇類和一藻類其總質量占50~80%，加入一蔬果液20%~50%和一醣類0.2%~20%至一醱酵筒中，該醱酵筒二氧化碳控制在1000ppm以下，溫度設定為25~28℃，醱酵30~60天，取得一基質醱酵液；(2)乳酸菌醱酵步驟：將該基質醱酵液加入一乳酸菌和一醣類0.2~20%，二氧化碳控制在1000ppm以下，溫度設定為25~28℃，pH值調整至5~7之間，醱酵30~60天，取得一乳酸菌醱酵液；(3)酵母菌醱酵步驟：將該乳酸菌醱酵液加入一酵母菌和一醣類0.2~20%，二氧化碳控制在1000ppm以下，溫度設定為25~28℃， pH值調整至5~7之間，醱酵30~60天，取得一酵母菌醱酵液；以及(4)分離步驟：將該酵母菌醱酵液經300Da、1000Da尺寸濾膜進行分離，取得分子量小於等於300Da之多醣醱酵組合物，該多醣醱酵組合物用於製備抗癌、抗病毒、抗發炎、促進成骨細胞增生、促進腸道幹細胞增生之藥物的用途。
本發明一實施例中所述之製備方法，其中該蔬果液係選自由鳳梨、木瓜和蘋果所組成之群組。
本發明一實施例中所述之製備方法，其中該醣類係選自由果醣、葡萄醣、乳醣、木醣和黑糖所組成之群組。
本發明一實施例中所述之製備方法，其中該乳酸菌係選自由Lactobacillus plantarum、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcuslactis、Lactococcusacidophillus和Bifidobacterium bifidum所組成之群組。
本發明一實施例中所述之製備方法，其中該乳酸菌的混合比例為Lactobacillus plantarum菌種濃度範圍3×108CFU/g~5×108CFU/g、Lactobacillus delbrueckii菌種濃度範圍3×108CFU/g~5×108CFU/g、Lactococcuslactis菌種濃度範圍3×108CFU/g~5×108CFU/g、Lactococcusacidophillus菌種濃度範圍3×108CFU/g~5×108CFU/g和Bifidobacterium bifidum菌種濃度範圍3×108CFU/g~5×108CFU/g，接種體積為1~3%，最佳條件為1×107CFU/ml，添加比例為1.5%，醱酵溫度控制在26-32℃。
本發明一實施例中所述之製備方法，其中該酵母菌係選自由Saccharomycopsisfibufigera、Pichia membramefaciens、 Schizosaccharomyespombe和Saccharomyces cerevisiae所組成之群組。
本發明一實施例中所述之製備方法，其中該酵母菌的混合比例為Saccharomycopsisfibufigera菌種濃度範圍3×108CFU/g~5×108CFU/g、Pichia membramefaciens菌種濃度範圍3×108CFU/g~5×108CFU/g、Schizosaccharomyespombe菌種濃度範圍3×108CFU/g~5×108CFU/g和Saccharomyces cerevisiae菌種濃度範圍3×108CFU/g~5×108CFU/g，接種體積為1~3%，最佳條件為1×107CFU/ml，添加比例為1.5%，醱酵溫度控制在26-32℃。
本發明一最佳實施例中將一蔬菜、一菇類和一藻類(包括：蓮藕、山藥、蘆薈、香菇、木耳、銀耳、海木耳、石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻)，加入一蔬果液(以鳳梨、木瓜、蘋果為基質)和2株菌(如：酵母菌：Saccharomyces cerevisiae、乳酸菌：Lactobacillus plantarum)至一醱酵筒中，經90-180天醱酵生成，醱酵液以等比例混合，以乙醇萃取醣類化合物，再將沉澱之醣類化合物冷凍乾燥。
本發明一實施例中之多醣醱酵組合物用於製備抗癌、抗病毒、抗發炎、促進成骨細胞增生、促進腸道幹細胞增生之藥物的用途。
第1圖顯示多醣醱酵組合物，該多醣分子包覆特性可包覆蛋白胺基酸、益菌菌體、植物化合物、病毒體、病原菌體或重金屬汙染物。
第2圖顯示多醣醱酵組合物的抗病毒試驗-24小時後的 細胞保護能力，實驗分成四組：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)、(3)攻毒組(Virus)和(4)未攻毒組(Control)，數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)病毒組相比，其24小時後的細胞保護能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其24小時後的細胞保護能力有顯著差異。
第3圖顯示多醣醱酵組合物的抗病毒試驗-24小時後抗病毒能力，實驗分成四組：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)、(3)攻毒組(Virus)和(4)未攻毒組(Control)，數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)病毒組相比，其24小時後的抗病毒能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其24小時後的抗病毒能力有顯著差異。
第4圖顯示多醣醱酵組合物的抑制肺腺癌細胞能力試驗-24小時的抑制肺癌細胞(LCC-1)能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其24小時的抑制LCC-1肺癌能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其24小時的抑制肺癌細胞(LCC-1)能力有顯著差異。
第5圖顯示多醣醱酵組合物的抑制肺腺癌細胞能力試驗-48小時的抑制肺癌細胞(LCC-1)能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其48小時的抑制LCC-1肺癌能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其48小時的抑制肺癌細胞(LCC-1)能力有顯著差異。
第6圖顯示多醣醱酵組合物的抑制結腸癌細胞能力試驗-24小時的抑制結腸癌細胞(WiDr)能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其24小時的抑制WiDr結腸癌能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其24小時的抑制結腸癌細胞(WiDr)能力有顯著差異。
第7圖顯示多醣醱酵組合物的抑制結腸癌細胞能力試驗-48小時的抑制結腸癌細胞(WiDr)能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其48小時的抑制WiDr結腸癌能力有顯著差異；b.p<0.05表 示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其48小時的抑制結腸癌細胞(WiDr)能力有顯著差異。
第8圖顯示多醣醱酵組合物的抑制乳癌細胞能力試驗-24小時的抑制乳腺癌細胞(MCF-7)能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其24小時的抑制乳腺癌細胞(MCF-7)能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其24小時的抑制乳腺癌細胞(MCF-7)能力有顯著差異。
第9圖顯示多醣醱酵組合物的抑制乳癌細胞能力試驗-48小時的抑制乳腺癌細胞(MCF-7)能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其48小時的抑制乳腺癌細胞(MCF-7)能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其48小時的抑制乳腺癌細胞(MCF-7)能力有顯著差異。
第10圖顯示多醣醱酵組合物的成骨細胞增生試驗-24小時的成骨細胞(7F2)的增生能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表 示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其24小時的成骨細胞(7F2)的增生能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其24小時的成骨細胞(7F2)的增生能力有顯著差異。
第11圖顯示多醣醱酵組合物的成骨細胞增生試驗-48小時的成骨細胞(7F2)的增生能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其48小時的成骨細胞(7F2)的增生能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其48小時的成骨細胞(7F2)的增生能力有顯著差異。
第12圖顯示多醣醱酵組合物的腸道幹細胞增生試驗-24小時的腸幹細胞(ISCs)的增生能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其24小時的腸幹細胞(ISCs)的增生能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其24小時的ISCs(腸幹細胞)的增生能力有顯著差異。
第13圖顯示多醣醱酵組合物的腸道幹細胞增生試驗-48小時的腸幹細胞(ISCs)的增生能力，實驗分成三組樣本，分別 為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(Control)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(Control)相比，其48小時的腸幹細胞(ISCs)的增生能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其48小時的腸幹細胞(ISCs)的增生能力有顯著差異。
第14圖顯示多醣醱酵組合物的抗發炎能力試驗-IL-6抗發炎能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(LPS)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(LPS)相比，其IL-6抗發炎能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其IL-6抗發炎能力有顯著差異。
第15圖顯示多醣醱酵組合物的抗發炎能力試驗-TNF-α抗發炎能力，實驗分成三組樣本，分別為：(1)該多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)、(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)和(3)對照組(LPS)。數值表示為平均值±標準差，a.p<0.05表示與(3)對照組(LPS)相比，其TNF-α抗發炎能力有顯著差異；b.p<0.05表示與(2)水萃取多醣組(Polysacchride extract)相比，其TNF-α抗發炎能力有顯著差異。
實施例1：多醣醱酵組合物的製備方法
以一種或多種含多醣蔬菜、菇類、藻類作為原料(蓮藕、山藥、蘆薈、香菇、木耳、銀耳、海木耳、石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻)，經特殊醱酵技術，將多醣分子(β葡聚醣、α葡聚醣)轉化、分割形成小分子形態醣類化合物，分子量約在300道爾頓，其結構不同於一般多醣分子，為有機形態，經醱酵後支鏈上多餘的葡萄醣結構被菌體利用代謝，去除多餘葡萄醣分子，可使醣分子具有親合力，成為可包覆的多醣醱酵組合物，並具有強抗癌特性、抗病毒特性、抗發炎特性、對成骨細胞、腸道幹細胞具有增生效果；多醣醱酵組合物的醱酵製程為：
1.基質醱酵步驟：
蔬果液(如鳳梨、木瓜、蘋果)當中含有消化酵素或消化物質(如鳳梨酵素、木瓜酵素、果酸)，利用消化酵素作用將植株進行初步分解，破壞細胞壁，使細胞內營養物質釋放。
製成時以獨立醱酵筒，取用蓮藕、山藥、蘆薈、香菇、木耳、銀耳、海木耳、石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻共12種植株，以等比例混合。取完整植株質量至少占50~80%，加入特定蔬果液至少占20~50%，醣類(如：果醣、葡萄醣、乳醣、木醣、黑糖)0.2~20%，二氧化碳控制在1000ppm以下，溫度設定25~28℃，醱酵天數30~60天。
2.乳酸菌醱酵步驟：
對初步分解之醱酵液營養物質進行小分子化，利用消化酵素或水解酵素，同時對營養物質結構進行修飾，乳酸菌醱酵過程中，分解營養物質結構上多餘的單醣分子進行利用，修飾後營養物質可具有較高的黏 附特性，利於後續進階修飾(如醣基化)。
製成時以獨立醱酵筒，將完整植株質量至少占50~80%，加入乳酸菌1~5株(Lactobacillus plantarum、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcuslactis、Lactococcusacidophillus、Bifidobacterium bifidum)，醣類(如：果醣、葡萄醣、乳醣、木醣)0.2~20%，二氧化碳控制在1000ppm以下，溫度設定25~28℃，pH值調整至5~7之間，醱酵天數30~60天。
3.酵母菌醱酵步驟：
對初步分解之醱酵液營養物質進行小分子化，利用消化酵素或水解酵素，同時對營養物質結構進行修飾，酵母菌醱酵過程中，分解營養物質結構上多餘的單醣分子進行利用，修飾後營養物質可具有較高的黏附特性，利於後續進階修飾(如醣基化)。
製成時以獨立醱酵筒，將完整植株質量至少占50~80%，加入酵母菌1~4株(Saccharomycopsisfibufigera、Pichia membramefaciens、Schizosaccharomyespombe、Saccharomyces cerevisiae)，醣類(如：果醣、葡萄醣、乳醣、木醣、黑糖)0.2~20%，二氧化碳控制在1000ppm以下，溫度設定25~28℃，pH值調整至5~7之間，醱酵天數30~60天。
分離沉澱步驟：
將該酵母菌醱酵經過300道爾頓、1000道爾頓尺寸濾膜進行分離，取得醱酵液分子量小於等於300道爾頓，再以乙醇沉澱進行該多醣分子萃取。
實施例2：多醣醱酵組合物與多醣水萃取液成分比較
本發明原料取用蓮藕、山藥、蘆薈、香菇、木耳、銀耳、海木耳、石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻共12種植株，以等比例混合，各項原料以獨立醱酵方式，與鳳梨、木瓜、蘋果作為基質，經90~180天醱酵，共2株菌(酵母菌：Saccharomyces cerevisiae；乳酸菌：Lactobacillus plantarum)醱酵生成，醱酵液以等比例混合，以乙醇萃取醣類化合物，再將沉澱之醣類化合物冷凍乾燥。
以下實驗分為2組：
(1)多醣醱酵組合物(Polysacchride fermented liquid)
(2)多醣水萃取液(Polysacchride extract)：取用蓮藕、山藥、蘆薈、香菇、木耳、銀耳、海木耳、石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻共12種植株，以等比例混合，各項原料以樣本：水=1：60比例混合，加熱至90℃，持續4小時，冷卻後過濾取得各項原料熱水萃取液，萃取時為不同種類蔬菜獨立萃取，等比例混合萃取液後，以乙醇萃取醣類化合物，再將沉澱之醣類化合物冷凍乾燥。
(a)總醣含量測定：量取1000ml醱酵液/萃取液，加入3000ml乙醇，沉澱24小時後離心，將沉澱總醣冷凍乾燥後秤重。
(b)醣類組成分析：將萃取液及醱酵液經300道爾頓、1000道爾頓尺寸濾膜進行分離，取得三種不同區間之多醣水萃取液或多醣醱酵組合物，再以乙醇沉澱進行多糖萃取，冷凍乾燥後秤重。下表顯示多醣醱酵組合物組成以300道爾頓以下之多醣分子為主，占總醣約80%；多醣水萃取液則皆為1,000道爾頓以上之大分子多醣，占總醣80%。
表1. 多醣水萃取液和多醣醱酵組合物的多醣分子量組成比例
Figure 107145295-A0101-12-0016-1
實施例3：多醣醱酵組合物的抗病毒試驗
將以下實驗分為4組：
(1)多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)：以萃取後300道爾頓以下醣構物為樣本進行試驗。
(2)水萃取多醣(Polysacchride extract)：以萃取後300道爾頓以下醣類為樣本進行試驗。
(3)攻毒組(Virus)：未加入任何樣本。
(4)未攻毒(Control)：未加入任何樣本。
分為兩種途徑進行試驗：1.對細胞的保護作用：veto細胞與各樣品共培養4小時後，加入腸病毒71型病毒培養24小時；2.對病毒的抵抗作用：病毒與樣品混合後4小時後，加入細胞培養24小時。後續以MTT assay進行細胞存活率檢驗。細胞濃度為5×104cell/well。
1.對細胞的保護作用結果：結果(如圖2所示)顯示水萃取多醣保護細胞能力約50%，且保護細胞及抵抗病毒能力IC50≒1μg/ml；多醣醱酵 組合物保護細胞能力將近90%，可保護細胞免受病毒感染造成死亡，且保護細胞能力IC50≒0.425μg/ml，使用量為55μl/70kg人。
2.對病毒的抵抗作用結果：結果(如圖3所示)顯示水萃取多醣抵抗病毒能力約50%；多醣醱酵組合物抵抗病毒能力約70%且其抵抗病毒能力IC50≒0.55μg/ml，使用量為70μl/70kg人。
實施例4：多醣醱酵組合物的抑制癌細胞能力試驗
將以下實驗分為3組：
(1)多醣醱酵組合物(Polysacchride structure extract)：以萃取後300道爾頓以下醣構物為樣本進行試驗。
(2)水萃取多醣(Polysacchride extract)：以萃取後300道爾頓以下醣類為樣本進行試驗。
(3)控制組(Control)：未加入任何樣本。
1.抑制肺腺癌細胞(LCC-1)能力試驗：
以肺腺癌細胞(LCC-1)作為模型，肺腺癌細胞(LCC-1)的細胞數為5×104 cell/well，與(1)多醣醱酵組合物、(2)水萃取多醣和(3)控制組的樣品濃度各為1、5、10、15、20μM(此為換算含有醣構物濃度)，分別培養24與48小時，肺腺癌細胞(LCC-1)與樣品共培養後以MTT assay檢驗抑制癌細胞生長能力。
抑制肺腺癌細胞(LCC-1)能力結果：結果(如圖5所示)顯示水萃取多醣在48小時，肺腺癌細胞(LCC-1)存活率仍高於70%，另根據文獻研究指出，水萃取多醣抑制肺腺癌細胞(LCC-1)的IC50≒44.7μM。多醣醱酵組 合物在48小時，抑制肺腺癌細胞的生長抑制率達到約80%，且多醣醱酵組合物抑制肺腺癌細胞(LCC-1)的IC50≒7.85μM，使用量為0.335ml/70kg人。
2.抑制結腸癌細胞(WiDr)能力試驗：
以結腸癌細胞(WiDr)作為模型，結腸癌細胞(WiDr)的細胞數為5×104 cell/well，與(1)多醣醱酵組合物、(2)水萃取多醣和(3)控制組的樣品濃度各為1、5、10、15、20μM(此為換算含有醣構物濃度)，分別培養24與48小時，結腸癌細胞(WiDr)與樣品共培養後以MTT assay檢驗抑制癌細胞生長能力。
抑制結腸癌細胞(WiDr)能力結果：結果(如圖7所示)顯示水萃取多醣在48小時，結腸癌細胞存活率仍高於80%，另根據文獻研究指出，水萃取多醣抑制結腸癌細胞(WiDr)的IC50≒39.6μM。多醣醱酵組合物在48小時，抑制結腸癌細胞(WiDr)的生長，抑制率達到約80%，且多醣醱酵組合物抑制結腸癌細胞(WiDr)的IC50≒9.55μM，使用量為0.408ml/70kg人。
3.抑制乳癌細胞(MCF-7)能力試驗：
以乳癌細胞(MCF-7)作為模型，乳癌細胞(MCF-7)的細胞數為5×104 cell/well，與(1)多醣醱酵組合物、(2)水萃取多醣和(3)控制組的樣品濃度各為1、5、10、15、20μM(此為換算含有醣構物濃度)，分別培養24與48小時，乳癌細胞(MCF-7)與樣品共培養後以MTT assay檢驗抑制癌細胞生長能力。
抑制乳癌細胞(MCF-7)能力結果：結果(如圖9所示)顯示水萃取多醣在48小時，乳癌細胞(MCF-7)存活率仍高於80%，另根據文獻研究指出，水萃取多醣抑制乳癌細胞(MCF-7)的IC50≒44μM。多醣醱酵組合物在 48小時，抑制乳癌細胞(MCF-7)的生長，抑制率達到約80%，且多醣醱酵組合物抑制乳癌細胞(MCF-7)的IC50≒9.4μM，使用量為0.4ml/70kg人。
4.成骨細胞(7F2)增生試驗：
以成骨細胞(7F2)作為模型，成骨細胞(7F2)的細胞數為5×104 cell/well，與(1)多醣醱酵組合物、(2)水萃取多醣和(3)控制組的樣品濃度各為10、20、30、40、50μM(此為換算含有醣構物濃度)，分別培養24與48小時，成骨細胞(7F2)與樣品共培養後以MTT assay檢驗成骨細胞增生能力。
成骨細胞(7F2)增生能力結果：結果(如圖11所示)顯示水萃取多醣在48小時，成骨細胞(7F2)存活率約120%，具有20%增生率，另根據文獻研究指出，水萃取多醣增生成骨細胞(7F2)的EC50≒2000μg/ml。多醣醱酵組合物在48小時，成骨細胞(7F2)存活率超過180%，增生率達到80%，且多醣醱酵組合物對成骨細胞(7F2)增生能力EC50≒9.4μg/ml；使用量為1.329ml/70kg人。
5.腸道幹細胞(ISCs)增生試驗：
以腸幹細胞(ISCs)作為模型，腸幹細胞(ISCs)的細胞數為5×104 cell/well，與(1)多醣醱酵組合物、(2)水萃取多醣和(3)控制組的樣品濃度各為10、20、30、40、50μM(此為換算含有醣構物濃度)，分別培養24與48小時，腸幹細胞(ISCs)與樣品共培養後以MTT assay檢驗腸幹細胞(ISCs)能力。
腸幹細胞(ISCs)增生能力結果：結果(如圖13所示)顯示水萃取多醣在48小時後，腸幹細胞(ISCs)存活率約120%，具有20%增生率。而多醣醱酵組合物在48小時後，腸幹細胞(ISCs)存活率超過180%，增生率達到 80%。
6.抗發炎能力試驗：
以RAW264.7(小鼠巨噬細胞)作為模型，RAW264.7(小鼠巨噬細胞)細胞數為5×104 cell/well，與(1)多醣醱酵組合物、(2)水萃取多醣和(3)控制組的樣品濃度各為10、20、30、40、50μM(此為換算含有醣構物濃度)，先以1μg/ml LPS誘導巨噬細胞產生發炎反應，培養24小時後加入樣品，樣品濃度分別為10、20、30、40、50μM，培養24小時以ELISA kit檢驗IL-6與TNF-α，檢驗樣本是否能降低發炎因子的產生。
抗發炎能力結果：結果(如圖14和圖15所示)顯示發炎巨噬細胞經(2)水萃取多醣培養後，可降低約20%之IL-6與TNF-α發炎因子的表達。而發炎巨噬細胞經(1)多醣醱酵組合物培養後，能大幅降低發炎因子表達，具有極顯著差異，可改善發炎反應。
本專利能有效減少使用劑量，達到良好功效，下表彙整預估達到各功效需要的濃度和劑量
Figure 107145295-A0101-12-0020-2
Figure 107145295-A0101-12-0021-3

Claims (31)

  1. 一種多醣醱酵組合物，包括：一原料係選自由一蔬菜、一菇類和一藻類所組成之群組，經一製備方法取得的一多醣分子，該多醣分子包含一分子量小於等於300道爾頓之多醣，該多醣分子包含多醣支鏈上的葡萄醣被去除之多醣分子。
  2. 如申請專利範圍第1項所述該多醣醱酵組合物，其中該分子量小於等於300道爾頓之多醣占該多醣醱酵組合物的總多醣乾重80~99%。
  3. 如申請專利範圍第1項所述該多醣醱酵組合物，其中該多醣分子為β葡聚醣或α葡聚醣。
  4. 如申請專利範圍第1項所述該多醣醱酵組合物，其中該藻類係選自由石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻及其混合物所組成之群組。
  5. 如申請專利範圍第1項所述該多醣醱酵組合物，其中該蔬菜係選自由鳳梨、木瓜、蘋果、蓮藕、山藥、蘆薈及其混合物所組成之群組。
  6. 如申請專利範圍第1項所述該多醣醱酵組合物，其中該菇類係選自由香菇、木耳、銀耳、海木耳及其混合物所組成之群組。
  7. 如申請專利範圍第1項所述該多醣醱酵組合物，其中該製備方法包含一醱酵步驟，其中該醱酵步驟包括透過一微生物的一水解酵素，使該原料之分子量1,000道爾頓以上之多醣轉變為分子量小於等於300道爾頓之多醣。
  8. 如申請專利範圍第7項所述該多醣醱酵組合物，其中該醱酵步驟將該多醣分子的支鏈上的葡萄醣去除。
  9. 如申請專利範圍第7項所述該多醣醱酵組合物，其中該微生物為一乳酸菌或一酵母菌。
  10. 如申請專利範圍第7項所述該多醣醱酵組合物，其中該水解酵素為一葡聚醣水解酶。
  11. 如申請專利範圍第9項所述該多醣醱酵組合物，其中該乳酸菌係選自由Lactobacillus plantarum、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcuslactis、Lactococcusacidophillus和Bifidobacterium bifidum所組成之群組。
  12. 如申請專利範圍第9項所述該多醣醱酵組合物，其中該酵母菌係選自由Saccharomycopsisfibufigera、Pichia membramefaciens、Schizosaccharomyespombe和Saccharomyces cerevisiae所組成之群組。
  13. 一種製備專利範圍1之多醣醱酵組合物之製備方法，包括：(1)基質醱酵步驟：配置該蔬菜、該菇類或該藻類(50~80wt%)，加入一蔬果液(20~50wt%)和一醣類(0.2~20wt%)至一醱酵筒中，該醱酵筒二氧化碳控制在1000ppm以下，溫度設定為25~28℃，醱酵30~60天，取得一基質醱酵液；(2)乳酸菌醱酵步驟：將該基質醱酵液加入一乳酸菌和該醣類(0.2~20wt%)，二氧化碳控制在1000ppm以下，溫度設定為25~28℃，pH值調整至5~7之間，醱酵天數為30~60天，取得一乳 酸菌醱酵液；(3)酵母菌醱酵步驟：將該乳酸菌醱酵液加入一酵母菌和該醣類(0.2~20wt%)，二氧化碳控制在1000ppm以下，溫度設定為25~28℃，pH值調整至5~7之間，醱酵天數為30~60天，取得一酵母菌醱酵液；以及(4)分離沉澱步驟：將該酵母菌醱酵液經過一尺寸濾膜進行分離，取得含有該多醣分子之醱酵液，再以乙醇沉澱進行該多醣分子萃取，取得該多醣醱酵組合物。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，其中該蔬菜係選自由鳳梨、木瓜、蘋果、蓮藕、山藥、蘆薈及其混合物所組成之群組。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，其中該該菇類係選自由香菇、木耳、銀耳、海木耳及其混合物所組成之群組。
  16. 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，其中該藻類係選自由石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄、葛仙米藻及其混合物所組成之群組。
  17. 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，其中該蔬果液係選自由鳳梨、木瓜和蘋果所組成之群組。
  18. 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，其中該醣類係選自由果醣、葡萄醣、乳醣、木醣和黑糖所組成之群組。
  19. 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，其中該乳酸菌係選自由Lactobacillus plantarum、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcuslactis、Lactococcusacidophillus和Bifidobacterium bifidum所組成之群組。
  20. 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，其中該酵母菌係選自由Saccharomycopsisfibufigera、Pichia membramefaciens、Schizosaccharomyespombe和Saccharomyces cerevisiae所組成之群組。
  21. 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，其中該尺寸濾膜係為300道爾頓或1000道爾頓尺寸濾膜。
  22. 一種如專利範圍1之多醣醱酵組合物用於製備抗癌症之藥物的用途。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之用途，其中所述癌症係為肺癌、結腸癌及乳腺癌。
  24. 一種如專利範圍1之多醣醱酵組合物用於製備抗病毒之藥物的用途。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中所述病毒係為腸病毒71型。
  26. 一種如專利範圍1之多醣醱酵組合物用於製備抗發炎之藥物的用途。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之用途，其中所述抗發炎係指降低發炎因子的產生，所述發炎因子係為IL-6或TNF-α。
  28. 一種如專利範圍1之多醣醱酵組合物用於製備促進成骨細胞增生之藥物的用途。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之用途，其中所述成骨細胞係為7F2細胞。
  30. 一種如專利範圍1之多醣醱酵組合物用於製備促進腸道幹細胞增生之藥物的用途。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之用途，其中所述腸幹細胞係為7F2細胞。
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