CN101775357A - 植物病原真菌串珠镰刀菌天然拮抗剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对串珠镰刀菌的生长具有强抑制活性的化合物的发现及制备方法，属生物农药技术领域。该化合物是由生产菌株烟色拟盘多毛孢菌SN17采用固体发酵及提取分离的方法获得，并通过应用质谱、核磁共振波谱、红外光谱等技术确定了该化合物的结构。本发明涉及的化合物为氯代拟盘多毛菌素A(Pestalachloride A)，它能有效抑制串珠镰刀菌的生长，可单独用作串珠镰刀菌的天然拮抗剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种对串珠镰刀菌具有强抑制活性的化合物氯代拟盘多毛菌素A(Pestalachloride A)的发现及制备，属生物农药技术领域。
背景技术
镰刀菌属(Fusarium Link ex Fr.)属于半知菌类真菌，包括许多危害经济植物的种，不仅能引起小麦、水稻、蔬菜等的危害，而且有些种是人和动物的致病菌，并常常引起谷物和饲料霉变并产生毒素，引起人及动物中毒。串珠镰刀菌(Fusarium moniliform Sheld)的有性阶段为藤仓赤霉[Gibberella fujikuroi(Saw.)Wollenw]，它是水稻恶苗病菌，能导致水稻恶苗病发生，并且从苗期至抽穗期都可发病。水稻恶苗病在田间最明显的症状是病苗比健苗长得高而纤弱，全株淡黄绿色，叶狭长，在枯死的苗上有淡红色或白粉状物。该病害的流行一般造成水稻减产10％～20％，严重的可减产50％以上。除水稻外也可危害玉米、高粱、大麦、小麦等农作物。
目前对该病菌的防治多以筛选抗源为主，选用抗病高产品种，辅以化学农药的使用，以达到控制病害的目的。但长期使用相同种类的化学农药，病原菌会产生抗药性，使恶苗病在一些稻区的病害有所加重，因此，有必要进一步创制高效、低毒的生物源新农药来克服病菌抗药性。氰烯菌酯(JS399-19)是一种结构新颖、作用方式独特具有自主知识产权的新型杀菌剂。由江苏省农药研究所1998年合成，2001年进入田间试验。离体抑菌活性测定表明，JS399-19对水稻恶苗病多菌灵敏感菌株和抗性菌株均有相似活性，EC50值为0.1612～0.3136μg/mL[参见，现代农药.2006，5，14-17]。利用微生物次生代谢产物为样品筛选抗菌活性物质，避免因化学农药造成的环境破坏，是农药发展的一个新亮点。本发明涉及的氯代拟盘多毛菌素A来源于真菌发酵产物，具有显著抑制串珠镰刀菌活性(IC50值为0.090μg/mL)，其抑菌活性优于JS399-19。氯代拟盘多毛菌素A的结构式如下式(I)所示：
在国内外专利文献报道中，均未涉及关于化合物氯代拟盘多毛菌素A本身以及其能够抑制串珠镰刀菌(F.moniliform)的活性的报道。本发明在真菌次生代谢产物的高通量筛选基础上，发现了烟色拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis adusta)SN17的固体发酵提取物具有抑制串珠镰刀菌生长的活性；通过活性跟踪指导下的进一步分离纯化，制备得到该活性化合物氯代拟盘多毛菌素A。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用真菌发酵制备氯代拟盘多毛菌素A的方法，以及提供氯代拟盘多毛菌素A在制备杀灭串珠镰刀菌的农用杀菌剂中的应用。
本发明的生产菌株为烟色拟盘多毛孢菌(P.adusta)SN17，该菌株分离自海南省，于2008年9月26日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏编号为2672。烟色拟盘多毛孢菌(P.adusta)属子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，炭角菌目(Xylariales)，黑盘孢科(Amphisphaeriaceae)科，拟盘多毛孢(Pestalotiopsis)属。
本发明涉及的具有抑制串珠镰刀菌活性的化合物氯代拟盘多毛菌素A是从该生产菌株的固体发酵提取物中分离得到的，其结构式为：
本发明制备的化合物氯代拟盘多毛菌素A在对串珠镰刀菌抑制活性测试中，其IC50值为0.090μg/ml。可见该化合物具有极强的抑制串珠镰刀菌活性，可单独用于制备农用杀菌剂。
因此，本发明制备的化合物氯代拟盘多毛菌素A可作为串珠镰刀菌的天然拮抗剂使用。氯代拟盘多毛菌素A可以单独或与其它杀菌剂组合使用。
在本发明的优选实施方案中，氯代拟盘多毛菌素A用于制备杀灭串珠镰刀菌的农用杀菌剂，在制备以本发明的氯代拟盘多毛菌素A作为有效成分的农用杀菌剂时，可以同样使用本领域已知的农药所通用的固相、液相即乳化分散剂等各种载体。并且能够配制成颗粒剂、粉剂、乳化剂、可湿性粉剂、片剂、油剂、喷雾剂、烟雾剂等任意的剂型。同时，在各种制剂中一般可以适当添加一些辅助剂。
本发明的农用杀菌剂还可以与其它杀菌剂、除草剂、杀虫剂、肥料物质、土壤改良剂等配合使用。
附图说明
图1显示氯代拟盘多毛菌素A的1H NMR光谱(1；400MHz，丙酮-d6)；
图2显示氯代拟盘多毛菌素A的13C NMR光谱(1；100MHz，丙酮-d6)。
具体实施方式：
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1烟色拟多毛盘孢菌(P.adusta)SN17的分离
烟色拟盘多毛孢菌(P.adusta)SN17，该菌株分离自海南省，于2008年9月26日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏编号为2672。
分离方法采用常规内生真菌分离方法，具体步骤如下：将健康的植物枝条和叶片用水洗净、晾干，用75％的酒精浸泡消毒60秒，用25％(1.3％有效氯)的次氯酸钠浸泡消毒5分钟，再用75％的酒精浸泡消毒30秒，然后用无菌水洗3次，将消毒后的组织块剪切成边长约5mm的小块，放置于PDA培养基上，置25℃培养。用稀释法作单孢纯化，对不易产孢菌株用灭过菌的康乃馨(Dianthus caryophyllus)叶片组织诱发产孢。
1.形态特征：
在PDA培养基+康乃馨叶片上，分生孢子盘黑色，半球形或球形，埋藏于表皮下，后突破表皮。分生孢子5细胞，长梭形，直立，有的稍微弯曲，17.5～22.5×4.2～5.0μm；中间3色胞长11.5～14.7μm，橄榄色，中间色胞稍深；顶端无色胞锥形，短，具顶端附属丝2～4根，长8.3～19.8μm；基部无色胞三角形，具中生式柄1根，长1.8～7.0μm。
2.在固体培养基上的生长特征：
在固体培养基上生长较快，菌丝白色，茸状。
在PDA固体培养基上，菌落白色絮状，菌丝生长较快，背面颜色淡橘黄色，无轮纹。子实体疏散，较少，黑色并且有光泽。
3.生理生化特征：
平板培养显淡橙色，固体发酵培养发酵液呈棕色。
4.碳源利用：
很好利用的碳源包括：麦芽糖和糊精。
实施例2化合物氯代拟盘多毛菌素A的分离和制备
材料：马铃薯为市售，本发明所用的其他试剂均为分析纯级别，一般的生物试剂公司均有销售。
a.烟色拟盘多毛孢菌(P.adusta)SN17的活化：
配制PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25℃培养10天；
b.烟色拟盘多毛孢菌SN17的固体发酵培养：
制备固体培养基，其制备过程为：将150mL液体培养基(含6％糊精，2％麦芽糖，0.75％棉籽粉，0.7％蛋白胨，0.25％CaCO3，0.25％MgSO4·7H2O，0.1％FeSO4·7H2O，0.001％ZnSO4，调pH至6.0)和30g蛭石加入500mL三角瓶中，配制10份，浸泡过夜，121℃，30分钟高压灭菌，冷却待用；
将制备好的菌悬液(孢子浓度为1×106个/mL)15mL接种于上述固体培养基上，自然空气状况下，湿度20％，25℃培养40天；
c.待发酵完毕，将150ml丁酮加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到3.67g粗提物；
d.将粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析，所用流动相为：石油醚∶乙酸乙酯/V∶V＝100∶0，90∶10，80∶20，70∶30，50∶50，70∶30，10∶90，0∶100；乙酸乙酯∶甲醇/V∶V＝90∶10，80∶20，0∶100，每个馏分收集800mL，减压浓缩，共收集11个馏分；
e.在活性跟踪指导下，将活性组分(石油醚：乙酸乙酯＝70：30)通过Sephdex-LH 20(购自：GE HealthcareBio-Sciences AB)柱层析，使用100％甲醇作为洗脱剂，收集馏分，浓缩，分离得到氯代拟盘多毛菌素A。
综上，3.67g粗提物经过分离纯化而得到20mg纯化合物氯代拟盘多毛菌素A，其纯度为99％以上，收率为0.5％。
实施例3氯代拟盘多毛菌素A的物化分析
实施例2中步骤e得到的氯代拟盘多毛菌素A具有下述理化性质：形状为无色片状晶体，熔点为205-207℃；分子式：C21H21Cl2NO5；分子量：437(据ESI-MS)；比旋光[α]D+5.0(c 0.4，CH3OH)，紫外UV(CH3OH)λmax＝211(ε100100)，253(ε17600)，296(ε12200)nm。氯代拟盘多毛菌素A的质谱和红外光谱数据表1，氢谱和碳谱数据见表2，1H NMR谱图见图1，13C NMR谱图见图2。
表1.氯代拟盘多毛菌素A的物化常数
表2.氯代拟盘多毛菌素A的氢谱和碳谱数据(氘代丙酮)
s-单峰；d-双峰；t-三重峰；m-多重峰
根据核磁共振波谱、质谱、红外光谱和紫外光谱确定该化合物由2个立体异构体组成，其结构式为前述式(I)。
实施例4采用Alamar Blue荧光检测法检测氯代拟盘多毛菌素A对于串珠镰刀菌(F.moniliform)的抑制活性
1.试验用试剂：
将本发明制备的氯代拟盘多毛菌素A用二甲亚砜(DMSO)作为溶剂分别配制4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL的待测溶液；
酮康唑(酮康唑片购自西安杨森制药有限公司，是)用二甲亚砜(DMSO)作为溶剂配制成浓度为4mg/mL的储液，然后同样用二甲亚砜分别稀释为4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL的待测溶液；由于目前尚没有发现有效的天然的串珠镰刀菌拮抗剂，酮康唑是本领域中已知的通用杀真菌剂，在本实验中作为阳性对照；
染色液为Alamar Blue，购自北京赛驰生物科技有限公司。
2.串珠镰刀菌(F.moniliform)的培养
将串珠镰刀菌(F.moniliform CGMCC 3.2835，该菌由中国科学院微生物研究所菌种保藏中心提供)接种在PDB培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L)上，在28℃摇床培养2天后并在显微镜下计菌丝体数，调整菌丝体数目在1×104个/mL。
3.试验方法
试验条件如表3所示。
表3.活性测试所需的各试剂的体积
| 阴性对照 | 空白对照 | 阳性对照 | 待测药液 | |
| PDB培养基 | 190μL | |||
| 串珠镰刀菌培养液 | 190μL | 190μL | 190μL | |
| 氯代拟盘多毛菌素A溶液 | 1μL | |||
| 酮康唑溶液 | 1μL | |||
| Alamar Blue染液 | 10μL | 10μL | 10μL | 10μL |
按如表3所示方法，取190μL PDB培养基和10μL Alamar Blue染液加入到96孔板中配成阴性对照组；取190μL串珠镰刀菌培养液和10μLAlamar Blue染液加入到96孔板中配成空白对照组；取190μL串珠镰刀菌培养液，10μL Alamar Blue染液和1μL的酮康唑(浓度分别为4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL)加入到96孔板中配成阳性对照组；取1μL本实施例制备的氯代拟盘多毛菌素A溶液(浓度分别为4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL)分别加入到96孔板中，再分别加入190μL串珠镰刀菌培养液，10μLAlamar Blue染液，使供试样品的最终浓度分别为20、10、5、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025和0.01μg/mL。待药液和菌悬液混和均匀后，在28℃及黑暗条件下培养48小时。
用酶标仪(Tecan公司的GENios Plus)在595nm下测试96孔板中每个测试孔的荧光吸收值(OD595值)。
计算抑制率I％：I％＝[1-(OD测试药液-OD空白对照)/(OD阴性对照-OD空白对照)]×100％
计算IC50值：IC50＝[CL(IH-50)+CH(50-IL)]/(IH-IL)
CL：低浓度值；CH：高浓度值；IH：高浓度下的I％；IL：低浓度下的I％。
4.试验结果
本发明制备的化合物氯代拟盘多毛菌素A，其IC50值为0.090μg/ml。阳性对照物酮康唑的IC50为4.09μg/mL。可见该化合物具有强的抑制串珠镰刀菌活性，其抑菌活性优于文献报道的人工合成杀菌剂JS399-19(EC50值为0.1612～0.3136μg/mL[参见，现代农药.2006，5，14-17]，可单独用于制备农用杀菌剂，或与其它杀菌剂组合使用。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，可以在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，对其进行各种形式和细节的变化。
Claims (8)
1.烟色拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis adusta)SN17 CGMCC No.2672。
2.一种具有抑制串珠镰刀菌(Fusarium moniliform)活性的化合物氯代拟盘多毛菌素A(Pestalachloride A)，其特征在于：
a.该活性化合物由2个立体异构体组成，确定该化合物结构式为下式(I)：
1a
1b(阻转异构体) (I)
b.氯代拟盘多毛菌素A的物化常数为：
形状：无色片状晶体；
熔点：205-207℃；
分子式：C21H21Cl2NO5；
分子量：437(据ESI-MS)。
3.生产权利要求2所述的氯代拟盘多毛菌素A的方法，所述方法包括下列步骤：
a)将烟色拟盘多毛孢菌(P.adusta)SN17进行固体发酵；
b)在步骤a)的固体发酵以后，向培养产物中加入有机溶剂提取，得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到粗提物；和
c)将所述粗提物进行减压硅胶柱层析和凝胶色谱分离而得到活性化合物氯代拟盘多毛菌素A。
4.权利要求3所述的方法，其中步骤b)所用的有机溶剂为丁酮。
5.权利要求2所述的氯代拟盘多毛菌素A的应用，其中氯代拟盘多毛菌素A单独用作串珠镰刀菌的天然拮抗剂，或与其它拮抗剂组合使用。
6.权利要求5所述的应用，其中氯代拟盘多毛菌素A用于制备杀灭串珠镰刀菌的农用杀菌剂。
7.权利要求5或6所述的应用，其中氯代拟盘多毛菌素A针对串珠镰刀菌的IC50值为0.090μg/ml。
8.一种农用杀菌剂，其包含有效量的氯代拟盘多毛菌素A作为活性成分。
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