CN100363486C - 一种筛选抗稻瘟病放线菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选抗稻瘟病放线菌的方法，属农作物病害防治技术领域。本方法包括孢子萌发法初筛活性菌株及平板抑菌实验法复筛活性菌株步骤，及温室盆栽活体试验验证步骤。首先采用孢子萌发法初筛出对稻瘟病菌孢子萌发抑制率≥80%以上的活性菌株；其次用平板抑菌实验法复筛经初筛入选的活性菌株；将平板抑菌实验法筛选得到的活性菌株喷在盆栽供试水稻品种上进行活体活性验证，采用温室活体试验筛选出了具有活体抗稻瘟病活性的放线菌菌株。本方法筛选出的菌株在抗稻瘟病离体及活体筛选模型上均具有较好活性，为追踪分离活性化合物提供了可靠结果。本方法还具有操作简便、能快速有效地筛选出抗稻瘟病放线菌的优点。

Description

一种筛选抗稻瘟病放线菌的方法

技术领域：

本发明涉及一种筛选抗稻瘟病放线菌的方法，属农作物病害防治技术领域。

背景技术：

由稻瘟病菌[Pyricularia grisea(Cooke)Sacc.]引起的稻瘟病广泛分布于世界各稻区，是世界水稻生产最具毁灭性的病害之一。生物防治以其无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点在植物病虫害的防治中起着主导作用。我国微生物资源丰富，发展微生物农药具有充分的优势。

放线菌是一类很重要的农用抗生素产生菌，70％以上的农用抗生素均为放线菌产生，在植物病原真菌病害的生物防治中起着非常重要的作用。为开发抗稻瘟病放线菌杀菌剂，需建立一套有效的筛选模型对大量的放线菌菌株进行结果可靠的抗稻瘟病活性筛选。现有技术中，大多采用孢子萌发法、平板抑菌实验法等离体筛选模型对活性菌株进行筛选，由于缺乏在活体植株上的防效验证，该方法的缺陷是往往离体筛选结果与活体筛选结果不能一一对应，造成筛选结果的不可靠，使得后续研究结果不能真正服务于农业生产。将孢子萌发法、平板抑菌实验法及温室盆栽活体试验集成于有效筛选抗稻瘟病放线菌，目前尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服传统技术中的不足，而提供一种使筛选结果可靠的筛选抗稻瘟病放线菌的方法。

本发明将离体筛选模型(孢子萌发法、平板抑菌实验法)与活体筛选模型(温室盆栽活体试验)相结合，建立了一套结果可靠的抗稻瘟病放线菌的筛选方法。

本发明筛选抗稻瘟病放线菌的方法，包括孢子萌发法初筛活性菌株、平板抑菌实验法复筛活性菌株步骤，温室盆栽活体试验验证活性菌株步骤：其中：

(1)孢子萌发法初筛活性菌株步骤中：稻瘟病指示菌株(Pyricularia oryzae)在24℃下用燕麦片培养基培养的时间为6-8天，待菌丝长满培养基后用自来水洗去气生菌丝，日光灯(400nm)照射下培养产孢，待2～3天产孢后，用蒸馏水洗下孢子，并加入0.02％Tween-20制成孢子悬浮液备用，悬浮液中孢子浓度为10×10低倍显微镜下每个视野30～40个孢子；随后将菌株发酵液供试样品与孢子悬浮液等体积混合，取一滴滴加在凹玻片上，每处理3个重复。在25℃下保湿培养6h后检查空白对照孢子的萌发，当空白对照孢子的萌发率达到85％后，查看菌株发酵液对稻瘟病孢子萌发的抑制情况，初步筛选出对稻瘟病菌孢子萌发抑制率大于80％的活性菌株；

(2)采用温室盆栽活体试验步骤为：

a.供试水稻苗

水稻种子浸泡催芽后，播于装有秧田土的长宽为5×15cm，深10cm的塑料育苗盒内，每盒50苗，在温度为25-28℃的温室内育苗，按0.2克/盒追施尿素，共2～3次。试验用药前一天选择2.5～3.5叶期长势一致的盆栽稻苗，按序排放，供试验用；

b.将平板抑菌实验法复筛得到的活性菌株发酵液供试样品喷在盆栽稻苗上，在温度为25-28℃的温室内放置24小时后喷雾接种稻瘟病原菌，在24℃保湿培养箱中黑暗条件下培养20h，取出放入温度为25-28℃的温室内培育5～7天后按现有的稻瘟病分级标准进行病情分析，筛选出室内防治效果≥70％以上的抗稻瘟病活性菌株。

上述方法中平板抑菌实验法复筛活性菌株采用常规的杯碟法、打孔法、挖快法或滤纸片法。

通过本发明的方法，筛选到了一批具有较好抗稻瘟病活性的放线菌菌株，入选菌株在稻瘟病离体及活体模型上均具有较好活性，为追踪分离活性化合物提供了可靠结果。

本方法还具有操作简便、能快速有效地筛选出抗稻瘟病放线菌的优点。

具体实施方式：

一、孢子萌发法初筛活性菌株

1.稻瘟病指示菌的制备

公知的稻瘟病指示菌Pyricularia oryzae在燕麦片20.0g、微量盐溶液2.5ml、蒸馏水1000ml的燕麦片培养基中于24℃下培养6-8天，待菌丝长满培养基后，用自来水洗去气生菌丝，日光灯(400nm)照射下培养产孢，2～3天待产孢后，用蒸馏水洗下孢子，并加入0.02％Tween-20制成孢子悬浮液备用，悬浮液中孢子浓度为10×10低倍显微镜下每个视野30～40个孢子。

2.抗稻瘟病放线菌的制备

(1)放线菌菌株的制备

选用的实验菌株为334株从云南各地土壤中采集和分离得到的放线菌菌株。分别将菌株接种于斜面上，在28℃培养168小时。

斜面培养基：酵母膏4g、葡萄糖4g、麦芽膏5g、复合维生素5mg、微量盐溶液1mL、琼脂粉20g、水1000mL、pH 7.2。

(2)发酵液的制备

从生长好的斜面接种于100mL种子液中。种子液220rpm、28℃振荡培养48h后，再按10％的接种量接种于100mL发酵液中，220rpm、28℃振荡培养120h。

种子培养基：酵母膏4g、葡萄糖4g、麦芽膏5g、复合维生素5mg、微量盐溶液1mL、水1000mL、pH7.2。

发酵培养基：大豆粉20g、蛋白胨2g、葡萄糖20g、淀粉5g、酵母膏5g、NaCl4g、K₂HPO₄、0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.5g、CaCO₃ 2g、水1000mL、pH7.8。

(3)发酵液的后处理

上述发酵液加入等体积乙醇，经振荡8h后，离心(3000rpm，10min)，取上清液，并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，水相用冻干仪冻成干粉后保存备用。测定活性时用无菌水溶解

3.抗稻瘟病放线菌的筛选

将上述方法2中制得的发酵液冻干粉用无菌水溶解、稀释定容到发酵原液的浓度(供试样品)，与上述方法1中制得的孢子悬浮液等体积混合，取一滴滴加在凹玻片上，每处理3个重复。在25℃下保湿培养6h后检查空白对照孢子的萌发，当空白对照孢子的萌发率达到85％后，检查所有处理的孢子萌发率。以孢子芽管长度大于孢子长度一半者为萌发，按以下公式计算孢子萌发抑制率：

孢子萌发抑制率(％)＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/(对照孢子萌发率)×100

本实验方法初筛出了20株对稻瘟病菌孢子萌发抑制率大于80％的活性菌株。

二、平板抑菌实验法复筛活性菌株

稻瘟病指示菌的制备及抗稻瘟病放线菌的制备同孢子萌发法初筛活性菌株中的方法，不同之处在于，对抗稻瘟病放线菌活性的复筛采用平板抑菌实验法进行。

抗稻瘟病放线菌活性的复筛：

取斜面培养好的稻瘟病指示菌与10ml燕麦片培养基充分混匀，倒入内径为9cm的培养皿中制成带菌平板，采用平板抑菌实验进行操作，抑菌筛选在25℃恒温箱中培养72小时。利用此法获得了20株有较强抗稻瘟菌活性的菌株。平板抑菌实验采用常规的杯碟法、打孔法、挖快法或滤纸片法。

三、温室盆栽活体试验

采用温室盆栽活体试验步骤为：

a.供试水稻苗

本实验采用的水稻品种为蒙古稻。

蒙古稻种子浸泡催芽后，播于装有秧田土的长宽为5×15cm，深10cm的塑料育苗盒内，每盒50苗，在温度为25-28℃的温室内育苗，按0.2克/盒追施尿素，共2～3次。试验用药前一天选择2.5～3.5叶期长势一致的盆栽稻苗，按序排放，供试验用；

b.抗稻瘟病放线菌的筛选

将平板抑菌实验法复筛得到的活性菌株发酵液供试样品喷在盆栽稻苗上，在温度为25-28℃的温室1内放置24小时后喷雾接种稻瘟病原菌，在24℃保湿培养箱中黑暗条件下培养20h，取出放入温度为25-28℃的温室内培育5～7天后按现有的稻瘟病分级标准进行病情分析

抗稻瘟病药效的计算采用下列两公式：

病情指数(％)＝(∑(病级叶数×代表级数))/(叶数总数×最高代表级值)×100，

防治效果(％)＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100，

当计算出的防治效果(％)≥70％时，可认为该菌株发酵液供试样品具有较好的抗稻瘟病活性。

通过温室盆栽活体试验，筛选出了14株室内防治效果≥70％以上的抗稻瘟病活性菌株。

Claims (1)

1.一种筛选抗稻瘟病放线菌的方法，包括孢子萌发法初筛活性菌株、平板抑菌实验法复筛活性菌株步骤，其特征在于该方法还包括温室盆栽活体试验验证步骤：其中：

(1)孢子萌发法初筛活性菌株步骤中：稻瘟病指示菌株Pyricularia oryzae在24℃下用燕麦片培养基培养的时间为6-8天，待菌丝长满培养基后用自来水洗去气生菌丝，400nm日光灯照射下培养产孢，待2～3天产孢后，用蒸馏水洗下孢子，并加入0.02％Tween-20制成孢子悬浮液备用，悬浮液中孢子浓度为10×10低倍显微镜下每个视野30～40个孢子；随后将菌株发酵液供试样品与前述制备的孢子悬浮液等体积混合，取一滴滴加在凹玻片上，在25℃下保湿培养6h后检查空白对照孢子的萌发，当空白对照孢子的萌发率达到85％后，查看菌株发酵液对稻瘟病孢子萌发的抑制情况，初步筛选出对稻瘟病菌孢子萌发抑制率大于80％的活性菌株；

(2)采用温室盆栽活体试验步骤为：

a.供试水稻苗

水稻种子浸泡催芽后，播于装有秧田土的长宽为5×15cm，深10cm的塑料育苗盒内，每盒50苗，在温度为25-28℃的温室内育苗，按0.2克/盒追施尿素，共2～3次，试验用药前一天选择2.5～3.5叶期长势一致的盆栽稻苗，按序排放，供试验用；

b.将平板抑菌实验法复筛得到的活性菌株发酵液供试样品喷在盆栽稻苗上，在温度为25-28℃的温室内放置24小时后喷雾接种稻瘟病原菌，在24℃保湿培养箱中黑暗条件下培养20h，取出放入温度为25-28℃的温室内培育5～7天后按现有的稻瘟病分级标准进行病情分析，筛选出室内防治效果≥70％以上的抗稻瘟病活性菌株。