CN103695365A - 一种提高荞麦细胞同步化的荞麦细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高荞麦细胞同步化的荞麦细胞培养方法，该方法采用先对荞麦愈伤组织细胞进行预处理，再将预处理后的荞麦愈伤组织细胞接入不同的培养基中，在不同的培养条件下进行多环节的同步化诱导处理，可使处于不同分裂时期的细胞调整到特定的细胞分裂期，从而可有效提高诱导子的使用效率，促进培养细胞中的次生代谢物的合成。
Description
技术领域
本发明涉及一种荞麦细胞的培养方法，特别是涉及一种提高荞麦细胞同步化的荞麦细胞培养方法。
背景技术
荞麦(Fagopyrum esculentum)是蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum Mill.)的双子叶作物，有苦荞和甜荞两种，是一种药食同源的植物。苦荞其籽粒、根、茎、叶及花等多种器官中都含有大量黄酮类物质，荞麦中的生物类黄酮物质具有调节毛细血管的通透性和脆性、调节血脂、调节血压、抗血栓等方面的作用。
目前，利用植物细胞原生质体融合技术是获得植物同源和异源多倍体的重要途径之一，该技术不仅能克服远源杂交不亲和的障碍，还能克服通过有性杂交诱导多倍体植物的麻烦，可有效地实现将目的基因导入到栽培植物中去，从而可获得具有多种优良性状的栽培植物新品种。但如果进行融合的两个亲本细胞是处于不同的细胞分裂时期，常常会造成原生质体不易产生融合体。另一方面，在利用细胞培养方法生产细胞次生代谢物的过程中，通过采取添加适宜的诱导子可显著提高培养细胞中的次生代谢物的合成；目前研究表明，处于不同分裂时期的细胞，对其添加的诱导子敏感性不同，因此在利用细胞培养方法生产其次生代谢物的过程中，需采用将培养的细胞调整到特定的细胞分裂期，再实施诱导子的添加，不仅可有效地提高对诱导子的使用效率，还可明显地促进培养细胞中的次生代谢物的合成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可提高荞麦细胞同步化的荞麦细胞的培养方法。
本发明提供的提高荞麦细胞同步化的荞麦细胞培养方法包括如下步骤：
（1）荞麦愈伤组织细胞的预处理：选取产生15～25天、生长良好的荞麦愈伤组织，以10～25g/L的接种量接入改良的Nitsch+2,4-D1.0～3.0mg/L+水解络蛋白50～150mg/L+谷氨酰胺100～500mg/L的液体培养基中进行悬浮培养，每培养25天继代一次，连续继代2～4次，悬浮培养的条件为：摇床转速120～140r/min、温度20～28℃、每天光照6～10小时和光照强度为500～800lx，所述改良Nitsch培养基是指肌醇浓度为150～300mg/L的Nitsch培养基；
（2）荞麦细胞同步化的诱导：将步骤（1）培养的荞麦悬浮细胞接入1/2～1/4MS+2,4-D1.0～3.0mg/L+6-BA0.1～0.3mg/L+L+蔗糖50～100g/L+矮壮素0.5～1.0mg/L的液体培养基中，在温度为1～3℃、摇床转速为60～100r/min和无光照的条件下振荡培养12～24h，然后再转接到1/2MS+NAA0.5～2.0mg/L+6-BA0.1～0.3mg/L+蔗糖10～50g/L+甘露醇1～3g/L的培养基中，在5～10℃、无光照和摇床转速为60～100r/min的条件下振荡培养18～24h，最后转接到B5+NAA1.0～3.0mg/L+6-BA0.1～0.3mg/L+蔗糖20～40g/L的培养基中，在20～25℃、无光照和摇床转速为60～100r/min的条件下振荡培养24～48h，将培养的细胞用显微观察并计算出细胞的分裂指数。
（3）细胞分裂指数的测定：取步骤（2）中培养的细胞，用滴管反复吹打混匀后，滴在冷冻干燥后的载玻片上，用改良的席夫式染液染色，并经显微观察计算出细胞的分裂指数。
上述荞麦愈伤组织的诱导培养步骤是：选取当年收获的荞麦种子，去掉种皮后放在超净工作台上，先用0.1%的升汞消毒3～5min，然后用无菌水冲洗5次后接种于MS+2,4-D1.0～4.0mg/L+KT0.5～2.0mg/L+琼脂5.5～7.5g/L+蔗糖25～35g/L的愈伤组织培养基中，在温度25±3℃、每天光照6～10小时、光照强度为800～1200lx的条件下诱导培养荞麦愈伤组织。
本发明采用先对荞麦愈伤组织细胞进行预处理，再将预处理后的荞麦愈伤组织细胞接入不同的培养基中，在不同的培养条件下进行多环节的同步化诱导处理，可使处于不同分裂时期的细胞调整到特定的细胞分裂期，从而可有效促进培养细胞中次生代谢物的合成。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
（1）荞麦愈伤组织的诱导培养：选取当年收获的荞麦种子，去掉种皮后放在超净工作台上，先用0.1%的升汞消毒3min，然后用无菌水冲洗5次后，接种于MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.5mg/L+琼脂5.5g/L+蔗糖25g/L的愈伤组织培养基中，在温度22℃、每天光照6小时、光照强度为800lx的条件下培养，获得荞麦愈伤组织；
（2）荞麦愈伤组织细胞的预处理：选取步骤（1）中产生15天、生长良好的荞麦愈伤组织，以10g/L的接种量接入肌醇浓度为150mg/L的改良Nitsch+2,4-D1.0mg/L+水解络蛋白50mg/L+谷氨酰胺100mg/L的液体培养基中进行悬浮培养，每培养25天继代一次，连续继代2次，悬浮培养的条件为：摇床转速120r/min、温度20℃、每天光照6小时和光照强度为500lx；
（3）荞麦细胞同步化的诱导：将步骤（2）中培养的荞麦悬浮细胞接入1/4MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA0.1mg/L+L+蔗糖50g/L+矮壮素0.5mg/L的液体培养基中，置于温度为1℃、摇床转速为60r/min的无光照振荡培养箱中培养12h，然后再转接到1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖10g/L+甘露醇1g/L的培养基中，在5℃、摇床转速为60r/min的无光照振荡培养箱中培养18h，最后转接到B5+NAA1.0mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L的培养基中，在20℃、摇床转速为60r/min的无光照振荡培养箱中培养24h；
（4）细胞分裂指数的测定：取步骤（3）中培养的细胞，用滴管反复吹打混匀后，滴在冷冻干燥后的载玻片上，用改良的席夫式染液染色后，用显微观察并计算出细胞的分裂指数为61.84%。
实施例2
（1）荞麦愈伤组织的诱导培养：选取当年收获的荞麦种子，去掉种皮后放在超净工作台上，先用0.1%的升汞消毒4min，然后用无菌水冲洗5次后，接种于MS+2,4-D3.0mg/L+KT1.0mg/L+琼脂6.0g/L+蔗糖30g/L的愈伤组织培养基中，在温度25℃、每天光照8小时、光照强度为1000lx的条件下培养，获得荞麦愈伤组织；
（2）荞麦愈伤组织细胞的预处理：选取步骤（1）中产生20天、生长良好的荞麦愈伤组织，以20g/L的接种量接入肌醇浓度为200mg/L的改良Nitsch+2,4-D2.0mg/L+水解络蛋白100mg/L+谷氨酰胺300mg/L的液体培养基中进行悬浮培养，每培养25天继代一次，连续继代3次，悬浮培养的条件为：摇床转速130r/min、温度25℃、每天光照8小时和光照强度为700lx；
（3）荞麦细胞同步化的诱导：将步骤（2）中培养的荞麦悬浮细胞接入1/3MS+2,4-D2.0mg/L+6-BA0.2mg/L+L+蔗糖70g/L+矮壮素0.8mg/L的液体培养基中，置于温度为2℃、摇床转速为80r/min的无光照振荡培养箱中培养20h，然后再转接到1/2MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.2mg/L+蔗糖20g/L+甘露醇2g/L的培养基中，在6℃、摇床转速为80r/min的无光照振荡培养箱中培养20h，最后转接到B5+NAA2.0mg/L+6-BA0.2mg/L+蔗糖30g/L的培养基中，在22℃、摇床转速为80r/min的无光照振荡培养箱中培养36h；
（4）细胞分裂指数的测定：取步骤（3）中培养的细胞，用滴管反复吹打混匀后，滴在冷冻干燥后的载玻片上，用改良的席夫式染液染色后，用显微观察并计算出细胞的分裂指数为84.12%。
实施例3
（1）荞麦愈伤组织的诱导培养：选取当年收获的荞麦种子，去掉种皮后放在超净工作台上，先用0.1%的升汞消毒5min，然后用无菌水冲洗5次后，接种于MS+2,4-D4.0mg/L+KT2.0mg/L+琼脂7.5g/L+蔗糖35g/L的愈伤组织培养基中，在温度28℃、每天光照10小时、光照强度为1200lx的条件下培养，获得荞麦愈伤组织；
（2）荞麦愈伤组织细胞的预处理：取步骤（1）中产生25天、生长良好的荞麦愈伤组织，以25g/L的接种量接入肌醇浓度为300mg/L的改良Nitsch+2,4-D3.0mg/L+水解络蛋白150mg/L+谷氨酰胺500mg/L的液体培养基中进行悬浮培养，每培养25天继代一次，连续继代4次，悬浮培养的条件为：摇床转速140r/min、温度28℃、每天光照10小时和光照强度为800lx；
（3）荞麦细胞同步化的诱导：将步骤（2）培养的荞麦悬浮细胞接入1/2MS+2,4-D3.0mg/L+6-BA0.3mg/L+L+蔗糖100g/L+矮壮素1.0mg/L的液体培养基中，置于温度为3℃、摇床转速为100r/min的无光照振荡培养箱中培养24h，然后再转接到1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L+蔗糖50g/L+甘露醇3g/L的培养基中，在10℃、摇床转速为100r/min的无光照振荡培养箱中培养24h，最后转接到B5+NAA3.0mg/L+6-BA0.3mg/L+蔗糖40g/L的培养基中，在25℃、摇床转速为100r/min的无光照振荡培养箱中培养48h；
（4）细胞分裂指数的测定：取步骤（3）中培养的细胞，用滴管反复吹打混匀后，滴在冷冻干燥后的载玻片上，用改良的席夫式染液染色后，用显微观察并计算出细胞的分裂指数为68.16%。
实施例4
在实施例2步骤（2）中，将荞麦愈伤组织细胞改接入肌醇浓度为250mg/L的改良Nitsch+2,4-D1.0mg/L+水解络蛋白50mg/L+谷氨酰胺450mg/L的液体培养基中进行悬浮培养，每培养25天继代一次、连续继代2次；其它步骤同实施例2，测得荞麦细胞的分裂指数为72.76%。
实施例5
在实施例2步骤（3）中，将荞麦悬浮细胞改接入1/2MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA0.3mg/L+蔗糖90g/L+矮壮素0.5mg/L的悬浮培养液中，并在温度为3℃的恒温振荡培养箱中培养，其它步骤同实施例2，测得荞麦细胞的分裂指数为70.13%。
比较实施例1
将实施例2步骤（2）中所述肌醇的浓度改为50mg/L，并去掉培养基中的水解络蛋白和谷氨酰胺，其它步骤同实施例2，测得荞麦细胞的分裂指数为34.25%。
比较实施例2
将实施例2步骤（2）中继代培养这一环节取消，其它步骤同实施例2，测得荞麦细胞分的裂指数为39.24%。
比较实施例3
在实施例2步骤（3）中，取消荞麦细胞在1/2MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.2mg/L+L+蔗糖20g/L+甘露醇2g/L的培养基中培养这一环节，其它步骤同实施例2，测得的荞麦细胞分裂指数为28.75%。
Claims (2)
1.一种提高荞麦细胞同步化的荞麦细胞培养方法，包括荞麦愈伤组织的诱导培养步骤，其特征在于还包括如下步骤：
（1）荞麦愈伤组织细胞的预处理：选取产生15～25天、生长良好的荞麦愈伤组织，以10～25g/L的接种量接入改良的Nitsch+2,4-D1.0～3.0mg/L+水解络蛋白50～150mg/L+谷氨酰胺100～500mg/L的液体培养基中进行悬浮培养，每培养25天继代一次，连续继代2～4次，悬浮培养的条件为：摇床转速120～140r/min、温度20～28℃、每天光照6～10小时和光照强度为500～800lx，所述改良Nitsch培养基是指肌醇浓度为150～300mg/L的Nitsch培养基；
（2）荞麦细胞同步化的诱导：将步骤（1）培养的荞麦悬浮细胞接入1/2～1/4MS+2,4-D1.0～3.0mg/L+6-BA0.1～0.3mg/L+L+蔗糖50～100g/L+矮壮素0.5～1.0mg/L的液体培养基中，在温度为1～3℃、摇床转速为60～100r/min和无光照的条件下振荡培养12～24h，然后再转接到1/2MS+NAA0.5～2.0mg/L+6-BA0.1～0.3mg/L+蔗糖10～50g/L+甘露醇1～3g/L的培养基中，在5～10℃、无光照和摇床转速为60～100r/min的条件下振荡培养18～24h，最后转接到B5+NAA1.0～3.0mg/L+6-BA0.1～0.3mg/L+蔗糖20～40g/L的培养基中，在20～25℃、无光照和摇床转速为60～100r/min的条件下振荡培养24～48h，将培养的细胞用显微观察并计算出细胞的分裂指数。
2.根据权利要求1所述的一种提高荞麦细胞同步化的荞麦细胞培养方法，其特征在于所述荞麦愈伤组织的诱导培养步骤是：选取当年收获的荞麦种子，去掉种皮后放在超净工作台上，先用0.1%的升汞消毒3～5min，然后用无菌水冲洗5次后接种于MS+2,4-D1.0～4.0mg/L+KT0.5～2.0mg/L+琼脂5.5～7.5g/L+蔗糖25～35g/L的愈伤组织培养基中，在温度25±3℃、每天光照6～10小时、光照强度为800～1200lx的条件下诱导培养荞麦愈伤组织。
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Patent Citations (3)
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|---|
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