CN115948228A - 一种植物外泌体提取装置及提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物外泌体提取装置及提取方法，涉及外泌体提取技术领域，第一提取液收集瓶与第二提取液收集瓶通过第一管路连接，第二提取液收集瓶与中空纤维柱的一端通过第二管路连接，第二提取液收集瓶与中空纤维柱的另一端通过第三管路连接，中空纤维柱与第一废液收集瓶通过第四管路连接，第五管路的一端与第三管路连接，第五管路的另一端与凝胶过滤层析柱的一端连接，凝胶过滤层析柱的另一端与第三提取液收集瓶通过第六管路连接，第六管路上设置有紫外吸收检测器，凝胶过滤层析柱的另一端与第二废液收集瓶通过第七管路连接。本发明结构简单，成本低，操作简捷，提取纯度高，能保证植物外泌体提取后的生物活性。

Description

一种植物外泌体提取装置及提取方法

技术领域

本发明涉及外泌体提取技术领域，特别是涉及一种植物外泌体提取装置及提取方法。

背景技术

外泌体，又称细胞外囊泡，首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。外泌体内包含复杂的RNA和蛋白质，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中。

外泌体目前有几种常用的提取方法：一是超速离心，这是提取外泌体最常用的方法，这种提取方法得到的量也是最多的，缺点是纯度不足；二是直接过滤离心，操作简单，不影响外泌体活性，缺点也是纯度不足；三是密度梯度离心，这种方法得到的外泌体纯度高，但耗时长，工作繁杂；四是免疫磁珠法，这种方法需求设备较简单，可以保证外泌体形态完整，缺点是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性不便进行下一步的实验。以上几种方法都部分存在设备成本高、操作繁杂、消耗时间长、纯度达不到理想要求等问题，为了避免上述技术问题，本发明提供的植物外泌体提取装置以克服现有技术所述的缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物外泌体提取装置及提取方法，以解决上述现有技术存在的问题，结构简单，成本低，采用植物外泌体提取装置操作简捷，提取纯度高，能保证植物外泌体提取后的生物活性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种植物外泌体提取装置，包括第一提取液收集瓶、第二提取液收集瓶、中空纤维柱、第一废液收集瓶、凝胶过滤层析柱、紫外吸收检测器、第三提取液收集瓶和第二废液收集瓶，所述第一提取液收集瓶与所述第二提取液收集瓶通过第一管路连接，所述第二提取液收集瓶与所述中空纤维柱的一端通过第二管路连接，所述第二提取液收集瓶与所述中空纤维柱的另一端通过第三管路连接，所述中空纤维柱与所述第一废液收集瓶通过第四管路连接，第五管路的一端与所述第三管路连接，所述第五管路的另一端与所述凝胶过滤层析柱的一端连接，所述凝胶过滤层析柱的另一端与所述第三提取液收集瓶通过第六管路连接，所述第六管路上设置有所述紫外吸收检测器，所述凝胶过滤层析柱的另一端与所述第二废液收集瓶通过第七管路连接。

优选地，所述第一管路上设置有第一蠕动泵和过滤器，所述第一管路的一端伸入所述第一提取液收集瓶的液面以下，所述第一管路的另一端伸入所述第二提取液收集瓶。

优选地，所述过滤器为板式过滤器，所述板式过滤器包括两层微孔滤膜和不锈钢过滤板，所述不锈钢过滤板位于两层所述微孔滤膜之间。

优选地，所述第二管路上设置有第二蠕动泵，所述第二管路的一端伸入所述第二提取液收集瓶的液面以下，所述第二管路的另一端与所述中空纤维柱的上端连接。

优选地，所述第三管路上设置有第一止水夹和第二止水夹，所述第二止水夹位于所述中空纤维柱的下端与所述第五管路的一端之间的所述第三管路上。

优选地，所述第五管路上设置有第三止水夹，所述第五管路的另一端与所述凝胶过滤层析柱的上端连接。

优选地，所述第六管路的一端与所述凝胶过滤层析柱的下端连接，所述紫外吸收检测器与所述第三提取液收集瓶之间的所述第六管路上设置有第四止水夹。

优选地，所述第七管路上设置有第五止水夹，所述第七管路的一端与所述紫外吸收检测器、所述第三提取液收集瓶之间的所述第六管路连接，所述第七管路的另一端与所述第二废液收集瓶连接。

优选地，所述第一管路、所述第二管路、所述第三管路、所述第四管路、所述第五管路、所述第六管路和所述第七管路均为硅胶软管。

本发明还提供了一种采用所述植物外泌体提取装置的提取方法，包括以下步骤：

第一步，取新鲜的目标植物，将其切片、切块，与现配的缓冲液一起按照比例进行榨汁；

第二步，将榨汁分离后的目标植物滤汁收集到第一提取液收集瓶，第一蠕动泵输送第一提取液收集瓶中的滤汁通过过滤器，最后由第二提取液收集瓶收集滤液；

第三步，在开启第二蠕动泵之前先将第一止水夹、第二止水夹打开，第三止水夹关闭，开启第二蠕动泵，滤液从第二提取液收集瓶中输送至中空纤维柱；

第四步，经过中空纤维柱后的滤液，所需要的目标产物会被中空纤维柱浓缩流回第二提取液收集瓶中，循环重复，而其他废液则由第一废液收集瓶收集；

第五步，关闭的第一止水夹，开启第二止水夹第三止水夹，第二蠕动泵将第二提取液收集瓶中的浓缩目标植物滤汁输送到凝胶过滤层析柱中；

第六步，浓缩液经过凝胶过滤层析柱后再经过紫外吸收检测器，根据分子量大小和紫外检测吸收的OD值来判断目标产物的流出时间；

第七步，根据紫外吸收检测器的目标产物吸收OD值，开启第四止水夹，将纯化分离后的目标植物外泌体收集到第三提取液收集瓶中；

第八步，根据紫外吸收检测器的非目标产物吸收OD值，开启第五止水夹，将分离后的废液收集到第二废液收集瓶中。

本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：

本发明的植物外泌体提取装置及提取方法，装置结构简单，成本低，操作简捷，提取纯度高，能保证植物外泌体提取后的生物活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的植物外泌体提取装置示意图；

其中：1为第一提取液收集瓶，2为第一蠕动泵，3为板式过滤器，4为第二提取液收集瓶，5为第二蠕动泵，6为第一止水夹，7为中空纤维柱，8为第一废液收集瓶，9为第二止水夹，10为第三止水夹，11为第三提取液收集瓶，12为第二废液收集瓶，13为第四止水夹，14为第五止水夹，15为紫外吸收检测器，16为凝胶过滤层析柱，17为铁架，18为不锈钢板底座。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是提供一种植物外泌体提取装置及提取方法，以解决上述现有技术存在的问题，结构简单，成本低，采用植物外泌体提取装置操作简捷，提取纯度高，能保证植物外泌体提取后的生物活性。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例一

如图1所示：本实施例提供了一种植物外泌体提取装置，包括铁架17、不锈钢板底座18、第一提取液收集瓶1、第二提取液收集瓶4、中空纤维柱7、第一废液收集瓶8、凝胶过滤层析柱16、紫外吸收检测器15、第三提取液收集瓶11和第二废液收集瓶12，铁架17、第一提取液收集瓶1、第二提取液收集瓶4、第一废液收集瓶8、第三提取液收集瓶11和第二废液收集瓶12均设置在长60cm、宽45cm的不锈钢板底座18上，中空纤维柱7、凝胶过滤层析柱16和紫外吸收检测器15均设置在铁架17上，第一提取液收集瓶1、第二提取液收集瓶4、第三提取液收集瓶11、第一废液收集瓶8和第二废液收集瓶12均设置有瓶盖，瓶盖与瓶体密封连接，第一提取液收集瓶1用于收集目标植物滤汁离心后的上清液，第一提取液收集瓶1与第二提取液收集瓶4通过第一管路连接，第二提取液收集瓶4与中空纤维柱7的一端通过第二管路连接，第二提取液收集瓶4与中空纤维柱7的另一端通过第三管路连接，中空纤维柱7与第一废液收集瓶8通过第四管路连接，第五管路的一端与第三管路连接，第五管路的另一端与凝胶过滤层析柱16的一端连接，凝胶过滤层析柱16的另一端与第三提取液收集瓶11通过第六管路连接，第六管路上设置有紫外吸收检测器15，凝胶过滤层析柱16的另一端与第二废液收集瓶12通过第七管路连接。

具体地，本实施例中，中空纤维柱7(材料为mPES，即改性聚醚砜；截留孔径为300KDa，体积为1000cm²)中由细管状空腔化学纤维构成；凝胶过滤层析柱16包括柱体和设置在柱体中的填料，填料根据目标物质的性质进行更换。

本实施例中，第一管路上设置有第一蠕动泵2和过滤器；过滤器为板式过滤器3，板式过滤器3包括两层微孔滤膜和不锈钢过滤板，微孔滤膜的微孔的尺寸为0.22μm，不锈钢过滤板位于两层微孔滤膜之间，两层微孔薄膜分别提供进液口和滤液出口；第一管路的一端伸入第一提取液收集瓶1的液面以下，第一管路的另一端伸入第二提取液收集瓶4。第一蠕动泵2将第一提取液收集瓶1中滤液输送到过滤器，经过0.22μm的微孔滤膜除菌除杂后收集到第二提取液收集瓶4中。

本实施例中，第二管路上设置有第二蠕动泵5，第二管路的一端伸入第二提取液收集瓶4的液面以下，第二管路的另一端与中空纤维柱7的上端连接。

本实施例中，第三管路上设置有第一止水夹6和第二止水夹9，第二止水夹9位于中空纤维柱7的下端与第五管路的一端之间的第三管路上。

本实施例中，第五管路上设置有第三止水夹10，第五管路的另一端与凝胶过滤层析柱16的上端连接。

本实施例中，第六管路的一端与凝胶过滤层析柱16的下端连接，紫外吸收检测器15与第三提取液收集瓶11之间的第六管路上设置有第四止水夹13。

本实施例中，第七管路上设置有第五止水夹14，第七管路的一端与紫外吸收检测器15、第三提取液收集瓶11之间的第六管路连接，第七管路的另一端与第二废液收集瓶12连接。

本实施例中，通过关闭第三止水夹10、开启第一止水夹6、第二止水夹9，将滤液输从第二提取液收集瓶4由中空纤维柱7的上端送入中空纤维柱7中，根据分子量大小进行浓缩分离，废液由第一废液收集瓶8进行收集，浓缩液由中空纤维柱7的下端回到第二提取液收集瓶4中；将第二止水夹9、第三止水夹10打开，第一止水夹6关闭，浓缩液通过第二蠕动泵5经中空纤维柱7泵入凝胶过滤层析柱16进行纯化，在凝胶过滤层析柱16中根据分子量大小进行分离，再经过紫外吸收检测器15根据紫外吸收的峰值进行分离，废液输送到第二废液收集瓶12中，目标产物纯化分离输送到第三提取液收集瓶11中。

本实施例中，第一管路、第二管路、第三管路、第四管路、第五管路、第六管路和第七管路均为硅胶软管。

实施例二

本实施例提供一种采用实施例一的植物外泌体提取装置的提取方法，以香圆外泌体提取为例，使用时操作步骤如下：

第一步，取新鲜香圆将其切片、切块，与现配的PBS缓冲液一起按照香圆与PBS缓冲液1：10的比例倒入榨汁机中榨汁；

第二步，将榨汁分离后的香圆滤汁收集到第一提取液收集瓶1，第一蠕动泵2输送第一提取液收集瓶1中的滤汁通过过滤器，最后由第二提取液收集瓶4收集滤液；

第三步，在开启第二蠕动泵5之前先将第一止水夹6、第二止水夹9打开，第三止水夹10关闭，开启第二蠕动泵5，滤液从第二提取液收集瓶4中输送至中空纤维柱7；

第四步，经过中空纤维柱7后的滤液，所需要的目标产物会被中空纤维柱7浓缩流回第二提取液收集瓶4中，循环重复，而其他废液则由第一废液收集瓶8收集；

第五步，关闭的第一止水夹6，开启第二止水夹9第三止水夹10，第二蠕动泵5将第二提取液收集瓶4中的浓缩香圆滤汁输送到凝胶过滤层析柱16中；

第六步，浓缩液经过凝胶过滤层析柱16后再经过紫外吸收检测器15，5根据分子量大小和紫外检测吸收的OD值来判断目标产物的流出时间；

第七步，根据紫外吸收检测器15的目标产物吸收OD值，开启第四止水夹13，将纯化分离后的香圆外泌体收集到第三提取液收集瓶11中；

第八步，根据紫外吸收检测器15的非目标产物吸收OD值，开启第五止水夹14，将分离后的废液收集到第二废液收集瓶12中。

0检测纯化分离后的香圆外泌体的纯度和浓度，记录数据并分析，明显

发现实施例一的植物外泌体提取装置比现有的一些提取外泌体的装置和方法更操作简单、成本低，提取过程中未使用超速离心，外泌体不容易破碎聚集，可有效保存外泌体生物活性，与传统提取方法相比，实施例二提供的方法纯度可达95％以上，提取量与传统超速离心相比提高了20％。。

5本说明书中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种植物外泌体提取装置，其特征在于：包括第一提取液收集瓶、第二提取液收集瓶、中空纤维柱、第一废液收集瓶、凝胶过滤层析柱、紫外吸收检测器、第三提取液收集瓶和第二废液收集瓶，所述第一提取液收集瓶与所述第二提取液收集瓶通过第一管路连接，所述第二提取液收集瓶与所述中空纤维柱的一端通过第二管路连接，所述第二提取液收集瓶与所述中空纤维柱的另一端通过第三管路连接，所述中空纤维柱与所述第一废液收集瓶通过第四管路连接，第五管路的一端与所述第三管路连接，所述第五管路的另一端与所述凝胶过滤层析柱的一端连接，所述凝胶过滤层析柱的另一端与所述第三提取液收集瓶通过第六管路连接，所述第六管路上设置有所述紫外吸收检测器，所述凝胶过滤层析柱的另一端与所述第二废液收集瓶通过第七管路连接。

2.根据权利要求1所述的植物外泌体提取装置，其特征在于：所述第一管路上设置有第一蠕动泵和过滤器，所述第一管路的一端伸入所述第一提取液收集瓶的液面以下，所述第一管路的另一端伸入所述第二提取液收集瓶。

3.根据权利要求2所述的植物外泌体提取装置，其特征在于：所述过滤器为板式过滤器，所述板式过滤器包括两层微孔滤膜和不锈钢过滤板，所述不锈钢过滤板位于两层所述微孔滤膜之间。

4.根据权利要求1所述的植物外泌体提取装置，其特征在于：所述第二管路上设置有第二蠕动泵，所述第二管路的一端伸入所述第二提取液收集瓶的液面以下，所述第二管路的另一端与所述中空纤维柱的上端连接。

5.根据权利要求1所述的植物外泌体提取装置，其特征在于：所述第三管路上设置有第一止水夹和第二止水夹，所述第二止水夹位于所述中空纤维柱的下端与所述第五管路的一端之间的所述第三管路上。

6.根据权利要求1所述的植物外泌体提取装置，其特征在于：所述第五管路上设置有第三止水夹，所述第五管路的另一端与所述凝胶过滤层析柱的上端连接。

7.根据权利要求1所述的植物外泌体提取装置，其特征在于：所述第六管路的一端与所述凝胶过滤层析柱的下端连接，所述紫外吸收检测器与所述第三提取液收集瓶之间的所述第六管路上设置有第四止水夹。

8.根据权利要求1所述的植物外泌体提取装置，其特征在于：所述第七管路上设置有第五止水夹，所述第七管路的一端与所述紫外吸收检测器、所述第三提取液收集瓶之间的所述第六管路连接，所述第七管路的另一端与所述第二废液收集瓶连接。

9.根据权利要求1所述的植物外泌体提取装置，其特征在于：所述第一管路、所述第二管路、所述第三管路、所述第四管路、所述第五管路、所述第六管路和所述第七管路均为硅胶软管。

10.一种采用权利要求1-9中任一项所述的植物外泌体提取装置的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步，取新鲜的目标植物，将其切片、切块，与现配的缓冲液一起按照比例进行榨汁；

第二步，将榨汁分离后的目标植物滤汁收集到第一提取液收集瓶，第一蠕动泵输送第一提取液收集瓶中的滤汁通过过滤器，最后由第二提取液收集瓶收集滤液；

第三步，在开启第二蠕动泵之前先将第一止水夹、第二止水夹打开，第三止水夹关闭，开启第二蠕动泵，滤液从第二提取液收集瓶中输送至中空纤维柱；

第四步，经过中空纤维柱后的滤液，所需要的目标产物会被中空纤维柱浓缩流回第二提取液收集瓶中，循环重复，而其他废液则由第一废液收集瓶收集；

第五步，关闭的第一止水夹，开启第二止水夹第三止水夹，第二蠕动泵将第二提取液收集瓶中的浓缩目标植物滤汁输送到凝胶过滤层析柱中；

第六步，浓缩液经过凝胶过滤层析柱后再经过紫外吸收检测器，根据分子量大小和紫外检测吸收的OD值来判断目标产物的流出时间；

第七步，根据紫外吸收检测器的目标产物吸收OD值，开启第四止水夹，将纯化分离后的目标植物外泌体收集到第三提取液收集瓶中；

第八步，根据紫外吸收检测器的非目标产物吸收OD值，开启第五止水夹，将分离后的废液收集到第二废液收集瓶中。

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