KR20210117216A - 제대혈 혈장 엑소좀 모방체 제작 및 이의 상처치료 용도 - Google Patents

제대혈 혈장 엑소좀 모방체 제작 및 이의 상처치료 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제대혈 혈장 엑소좀 모방체 또는 이의 상처치료 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 HSP72 및 PIP 단백질을 발현하는 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 모방하는 인공 엑소좀은 섬유아세포의 증식 및 이동을 향상시키고, 혈관형성을 촉진하여 상처치료 및 회복을 개선하는 효과를 제공한다.

Description

제대혈 혈장 엑소좀 모방체 제작 및 이의 상처치료 용도{Preparation of exosome mimic derived from cord-blood plasma and wound healing use of the exosome mimic}
본 발명은 제대혈 혈장 엑소좀 모방체 제작 및 이의 상처치료 용도에 관한 것이다.
인간 제대혈은 이식을 위한 조혈줄기세포의 소스로 사용되어 왔으나 면역세포, 중간엽 기질 세포 및 내피 전구체 세포 등의 다수의 세포들을 함께 포함하고 있다. 모체의 면역 시스템을 통한 태아의 면역 내성은 임신 유지에 중요한 역할을 담당한다. 태아와 모체 간의 면역학적 상호작용은 태아 항원의 제시 및/또는 모체 면역 시스템에 의한 이들 항원의 인지 및 이에 대한 반응에 의해 조절되는 양방향 커뮤니케이션 시스템을 나타낸다. 인간 제대혈 유래의 세포는 임신 유지에 기여하는 특정한 면역조절 특성들을 가지고 있다. 더욱이, 인간 제대혈은 또한 조절성 T 세포(Tregs) 및 단핵구-유래의 억제세포(MDSCs)와 같은 면역억제세포의 풍부한 소스이다.
엑소좀은 기능성 단백질의 독특한 서브세트를 탑재하여 그들의 세포 혈통을 반영하는 작은 세포막 베지클이다. 인간 제대혈 유래의 세포는 엑스 비보에서 선별 및 확장되므로, 이들 세포 유래의 엑소좀은 세포 배양 상등액에서 효율적으로 분리될 수 있다. 인간 제대혈 유래의 세포에서 방출된 엑소좀은 그들은 Tregs 및 MDSCs와 같은 순환성 면역억제세포의 분화를 유도할 수 있어 면역억제 효과를 가질 수 있다. 그러나, 인간 제대혈 유래의 세포 및 엑소좀에 대한 연구에서의 발전에도 불구하고, 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀(CBPexo)에 대한 연구는 빈약하다. CBPexo에 대한 프로테오믹스 연구 결과 엑소좀의 단백질은 T-세포 증식, 분화 및 음성적 조절; 막 투과성; 상처-치료; 아르기나아제 활성; 및 효소 조절 활성과 연관이 있었다. 인간 제대혈 유래의 세포외에도, 인간 제대혈 혈장 역시 다양한 면역조절 인자들을 포함하고 있어 IL-2 신호전달을 억제하여 T-세포 증식을 억제함에 있어 역할을 담당하고 있다. IL-2 및 이의 수용체인 IL-2R은 T 세포의 증식 및 생존 및 나이브 T 세포의 분화를 지원하는데 역할을 담당하고 있다. IL-2R 알파 체인(IL-2Rα/CD25)은 IL-2R의 필수 성분이다. 더욱이, CD4+T 세포에서의 IL-2Rα의 표면 발현 및 활성화 T 세포에서의 IL-2의 수준은 MMP-9에 의해 유의적으로 감소된다. 화학적 억제제에 의한 MMP 활성 억제는 IL-2 생산을 회복시키고, T 세포 증식을 부분적으로 회복시킨다. MMP-9 뿐만 아니라 CBP 면역조절인자들이 CBPexo에서 발견되며, 이들 엑소좀은 집중된 면역억제력을 나타낼 것이다.
한편, 우발적인 외상 후 골절과 연관된 것과 같은 피부 및 연 조직 손상이 일반적이지만, 상처치료는 몇 가지 단계, 예컨대 섬유아세포 증식, 콜라겐 합성, 침착, 혈관형성, 분화 및 면역억제세포의 이동을 요구한다. 그것은 지혈, 염증, 증식 및 리모델링과 같은 잘-편성된 일련의 세포 및 분자 사건들과 관련된 고도로 계획된 공정이다. 몇 가지 치료는 상처치료를 촉진하는 것으로 제안되어 왔으나, 최적 치료 전략은 여전히 개발 중에 있다. 인간 제대혈은 이식 가능한 상처치료를 위한 줄기세포의 매력적인 공급원이다. 제대혈 도너는 임산부이며 그들은 표준화된 절차를 통해 제대혈을 수집하므로 어떠한 질병 위험도 없다. 그러나, 치료 시 줄기세포의 이용은 종양 형성, 혈전증 및 원치않는 면역 반응과 같은 특정 위험으로 인해 제한된다. 엑소좀-기반 치료는 줄기세포-기반 치료법과 비교하여 상대적으로 위험이 낮다. 따라서, 엑소좀-기반 치료법이 전도유망한 상처치료 접근법임을 제안하나 현재까지 상처치료 목적을 위한 CBPexo의 단백질 수준에 대한 연구가 없었다. 이전의 연구들은 miRNA 수준에서의 상처치료로 제한되었다.
M. C. van Zanten et al., Plast Reconstr Surg, 2017, 139, 483-491. M. Bhandari et al., N Engl J Med, 2016, 374, 1789-1790. V. Falanga, Lancet, 2005, 366, 1736-1743. H. Kim et al., Adv Sci(Weinh), 2019, 6, 1900513. Y. Hu et al., Theranostics, 2018, 8, 169-184.
본 발명의 목적은 인간 제대혈 혈장에서 분리한 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 HSP72 및 PIP 단백질을 발현하는 엑소좀 모방체, 이의 제조방법 및 이의 상처치료 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에서 유래하고, Heat shock protein 72(HSP72) 및 Prolactin-inducible protein(PIP) 중 하나 이상을 발현하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 제공한다.
본 발명은 또한 Heat shock protein 72(HSP72) 및 Prolactin-inducible protein(PIP) 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 핵산을 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에 도입하고, 이로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 포함하는 상처치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 인간 제대혈 혈장에서 분리한 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 HSP72 및 PIP 단백질을 발현하는 엑소좀 모방체는 섬유아세포의 증식 및 이동을 향상시키고, 혈관형성을 촉진하여 상처치료 및 회복을 개선하는 효과를 제공한다.
도 1a-b는 인간 제대혈 혈장에서 정제된 엑소좀 막 베지클의 특성규명 결과로,(a) CBPexo 용해물의 도트 블롯 분석 결과이다. 상응하는 도트들은 엑소좀 항체 분석 키트를 이용하여 평가되었다. 엑소좀-특이 항체 스팟은 다양한 강도의 신호를 나타냈다. 도시된 값은 3회 독립 실험으로부터 계산된 평균 값이다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다. "블랭크"는 음성 대조군을 나타내고(Φ), 및 GM130은 세포 부스러기를 나타낸다. 평균 강도는 ImageJ을 이용하여 분석되었다.
(b) CBP로부터 방출된 엑소좀의 크기 분포의 DLS 평가 결과이다(CBPexo 크기는 127.59 ± 57.87 nm임).
도 2a-b는 CBPexo가 섬유아세포에 의해 내재화되며, 세포 증식을 유도함을 나타내는 도면이다.
(a) 적색 표지된 CBPexo(100 ㎍/mL)는 HSF에서 3-24시간에 걸쳐 유의하게 발현되었다. 적색 표지된 엑소좀은 녹색 표지된 HSF 세포 상에서 보인다.
(b) 적색 표지된 CBPexo는 HSF 상에서 0-24시간에 걸쳐 유의적으로 발현되었다.
도 3a-d는 스크레치 상처 분석에 의해 도시된 바와 같이 CBPexo가 ABPexo와 비교하여 HSF의 운동성을 유의적으로 증가시킴을 나타내는 도면이다.
(a) CBPexo 또는 ABPeox의 유무에 따른 상처 봉합 시 HSF 영역을 나타낸다. 이 측정은 0-24시간에 걸쳐 시행되었다. 큰 영역의 섬유아세포는 CBPex가 첨가된 경우 24시간째에 완전히 봉합되었다. 이때, CBPexo 및 ABPexo의 농도는 100 ㎍/mL이었다.
(b) 스크레치 상처 분석 결과를 이용한 CBPexo 및 ABPexo의 통계 분석을 나타낸다. 이 분석은 CBPexo가 ABPexo보다 훨씬 더 높은 상처치료 효과를 나타냄을 보여준다.
(c) CFSE-표지된 섬유아세포의 플로우 사이토메트리이다. 24시간 동안 MMC, PBS, ABPexo 및 CBPexo의 다양한 조합이 처리된 섬유아세포의 증식율은 ModFitLT 4.1 소프트웨어를 이용하여 측정되었다.
(d) 세포사멸은 아넥신 V/프로피디움 아이오다이드 이중 염색으로 평가되었다. 세포를 24시간 동안 MMC, PBS, ABPexo 및 CBPexo의 다양한 조건에 노출시켰다. 세포사멸율은 플로우 사이토메트리를 통해 측정되었다. 총 기록된 세포사멸 세포의 통계 분석이 수행되었고, 결과는 막대 그래프로 도시된다.
도 4a-c는 CBPexo에 의한 M2 Mφ의 향상된 내피세포 맥관 형성 및 분극화를 나타내는 도면이다.
(a) 20 ㎍/mL의 CBPexo가 있거나 없는(대조군) HUVEC 상등액을 이용하여 24시간 후에 얻은 마트리젤에서 인 비트로 HUVEC 맥관 형성의 대표 사진도이다(10배 확대). 음성 대조군은 배지 또는 ABPexo 단독에서 얻었다.
(b) CBPexo 처리 24시간 및 72시간 후 제대혈 단핵세포를 이용한 콜로니-형성 단위(CFU) 분석 결과이다. 막대는 2개의 도너 샘플에서 CFU 수±SD를 나타낸다. 이들 값은 3회 실험 진행 후 얻었다. 콜로니는 광학 현미경을 이용하여 CFU-erythroid(CFU-E), burst-forming unit-erythroid(BFU-E), CFU-GM, CFUgranulocyte(CFU-G), CFU-M 및 CFU-GEMM로 분화되었다. 통계적 의의는 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 및 ****p < 0.0001에서 확립되었다.
(c) M1 및 M2 분극 마커에서 CBPexo의 효과를 나타낸다. M1- 및 M2-분극화된 대식세포는 CBPexo의 유무에 따라 IL-4로 자극된 GM-CSF 처리된 프라이머리 단핵구로부터 생성되었다. 표면 마커 및 사이토카인 발현: CD80, CD86, CD206, IL-12 및 IL-10 표면 수준은 플로우 사이토메트리를 이용하여 비교되었다. 산점도는 평균값을 나타내는 수평선과 함께 3개의 상이한 도너(도트)로부터 양성 세포의 비율을 나타낸다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
도 5a-e는 H1ME-5 세포주에서 GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7을 향상시켜 인공 엑소좀을 생성하는 렌티바이러스 형질도입을 나타내는 도면이다.
(a) H1ME-5에서 방출된 엑소좀의 크기 분포를 나타낸다. CBPexo는 145.61 ± 75.89 nm의 크기를 갖는다.
(b) H1ME-5 세포주를 확립하여 상처치료 효과가 없는 엑소좀을 생성하였다. 0-24h에 걸쳐 CBPexo 및 H1ME-5-exo의 존재에서 HSF의 상처 봉합 영역을 측정하였다. CBPexo 및 H1ME-5-exo의 처리 농도는 100 ㎍/mL에서 유지되었다.
(c) 스크레치 상처 분석 결과의 통계 분석을 나타낸다.
(d) GAL-3-, GAL-7-, PIP-, HSP72- 및 S100-A7-형질도입된 H1ME-5 세포에서 CBPexo의 발현을 나타낸다. 형질도입 후 6일에, 각 분자-양성 세포를 MoFlo XDP Cell Sorter를 이용하여 소팅하였다.
(e) GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7 항체가 코팅된 라텍스 비드에 결합된 CBPexo 또는 인공 엑소좀은 플로우 사이토메트리를 이용하여 분석되었다. 신호 강도는 상응하는 비드 단독 대조군과 함께 GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7 항체에 대해 평가되었다.
도 6a-b는 인공 엑소좀이 선택된 타겟 분자들을 발현하여 상처치료를 촉진함을 나타내는 도면이다.
(a) 상처치료 효과는 CBPeox가 첨가되는 경우 증가하였다. CBPexo에서 중요한 역할을 담당하는 GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7를 발현하는 엑소좀은 섬유아세포의 조절을 유도하였다. HSP72- 또는 PIP-발현된 엑소좀은 GAL-3, GAL-7 및 S100-A7에 의해 발현된 것들과는 달리 상처치료 효과를 나타낸다. 스크래치 상처 분석은 3회 수행되었고, 통계 분석은 GraphPad 7.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
(b) HSP72, PIP, GAL-3, GAL-7, 및 S100-A7에서 발현된 엑소좀은 섬유아세포 증식을 향상시켰다. 이들 중 PIP-exo는 최대 섬유아세포 증식을 나타냈다.
도 7a-d는 HSP72 및 PIP에서 발현된 인공 엑소좀이 농도의존적 상처치료 및 두 단백질이 HSP72/PIP-exo에 의해 M2 Mφ인 경우 더 높은 상처치료 효과를 나타냄을 도시하는 도면이다.
(a) 형질도입 후 6일에, PIP 및 HSP72를 동시에 발현하는 세포를 MoFlo XDP cell sorter를 이용하여 소팅하고, 단일 세포로 배양하여 PIP 및 HSP72를 갖는 클론을 얻었다.
(b) HSP72- 및 PIP-발현된 엑소좀은 농도 의존적 방식으로 상처치료 효과를 나타냈다. 함께 사용되는 경우 HSP72 및 PIP-exo는 CBPexo와 유사한 상처치료 효과를 나타냈다. HSP72 및 PIP를 동시에 발현하는 엑소좀은 HSP72- 및 PIP-exo를 함께 사용하는 경우와 유사한 상처치료 효과를 나타낸다.
(c) HSP72 및 PIP를 발현하는 엑소좀의 조합은 CBPexo와 유사한 상처치료 효과를 나타낸다. HSP72 및 PIP를 발현하는 엑소좀의 조합은 HSP72 및 PIP를 각각 사용하는 경우보다 더 유의한 효과를 보여주었다. CFSE 증식 분석의 통계 분석(ANOVA test): *p < 0.1, **p < 0.05, ***p < 0.01 및 ****p < 0.001.
(d) CFSE-표지된 섬유아세포의 플로우 사이토메트리. 24시간 동안 CBPexo 및 인공 엑소좀이 처리된 섬유아세포의 증식율은 ModFitLT 4.1 소프트웨어를 이용하여 측정되었다.
도 8a-b는 HSP72/PIP-exo에 의한 증강된 내피세포 맥관 형성 및 M2 Mφ의 분극화를 나타내는 도면이다.
(a) 20 ㎍/mL의 CBPexo가 있거나 없는(대조군) HUVEC 상등액을 이용하여 24시간 이후에 얻은 마트리젤에서 인 비트로 HUVEC 맥관 형성의 대표 사진도이다(10배 확대). 음성 대조군은 배지 또는 ABPexo 만 포함한다.
(b) M1 및 M2 분극화 마커에 대한 CBPexo의 효과. M1 및 M2 분극화된 대식세포는 CBPexo가 있거나 없이 IL-4로 자극된 GM-CSF 처리된 프라이머리 단핵세포로부터 생성되었다. 표면 마커 및 사이토카인 발현. CD80, CD86 및 IL-10 발현의 플로우 사이토메트리 분석. 산점도는 각 그룹에 대한 평균값을 나타내는 수평선과 함께 3개의 상이한 도너(도트)로부터 양성 세포의 비율을 나타낸다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에서 유래하고, Heat shock protein 72(HSP72) 및 Prolactin-inducible protein(PIP) 중 하나 이상을 발현하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 Heat shock protein 72(HSP72) 및 Prolactin-inducible protein(PIP) 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 핵산을 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에 도입하고, 이로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체의 제조방법을 제공한다.
초기 염증기에서 증식기로의 전환은 상처치료 과정의 결과를 결정하는데 있어 중요한 조절 포인트이다. 증식기로 들어가지 못하면 정상적인 치료 과정을 방해할 수 있으며, 결과적으로 만성의 치료되지 않은 흉터를 초래한다. 상처 면역 세포 중 대식세포(Mφ)는 염증 및 증식을 촉진하는데 중요하다. 특정 시간 대에 M1에서 M2로의 Mφ 표현형 스위치를 조절하는 것은 상처 회복 동안 염증기에서 증식기로의 전환을 위한 전도유망한 해결책을 제공한다. 특정 조건 하에서, 전염증성 M1 Mφ은 상처 염증을 증가시키는 것으로 간주되는 그들의 항-염증성 표현형 M2로의 전환 없이 유지한다.
본 발명자들은 CBPexo의 프로테오믹스 프로파일에서 상처치료와 연관된 GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7 단백질이 포함되어 있음을 확인하였다. 그러나, 제대혈 혈장으로부터 충분한 엑소좀을 분리하기 어려우므로 면역억제효과가 없으면서 상처치료 능력을 갖는 않는 H1ME-5(HLA 클래스 I 및 MIC 편집 클론-5 세포주) 세포주에 상처치료와 연관된 GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하고, 이로부터 엑소좀(GAL-3 exo, GAL-7 exo, PIP exo, HSP72 exo 및 S100-A7 exo)을 분리 정제하고, 상기 엑소좀의 섬유아세포 증식 및 이동 분석, 스크래치 상처 분석 등을 수행하였다.
그 결과, PIP exo만이 섬유아세포 증식을 촉진하였으며, PIP exo 및 HSP72 exo는 섬유아세포의 이동을 유의적으로 개선하였다. 또한, HSP72 및 PIP를 동시에 발현하는 엑소좀(HSP72 & PIP dual exo)의 상처치료 효과는 PIP exo 및 HSP72 exo 단독보다 농도 의존적으로 더 높았으며, PIP exo 및 HSP72 exo를 동시에 첨가하는 것보다 더 좋았다. 또한, HSP72 & PIP dual exo는 PIP exo 및 HSP72 exo 단독보다 혈관형성이 더 우수하였고, M1 Mφ의 M2 Mφ로의 분화를 촉진함으로써 상처치료 및 회복을 개선할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 HSP72 및 PIP를 둘 다 발현하는 것일 수 있다. 아울러, 상기 제대혈 혈장에서 분리한 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 모방체는 상처치료에 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "제대혈 혈장 유래의 엑소좀(exosome)" 또는 "CBPexo"은 제대혈 혈장에서 유래된 세포막 입자이다. 상기 엑소좀(exosome)은 당업계에서, 미세소포체, 순환 미세소포체 또는 미세소낭과 동일한 의미를 갖으며, 세포로부터 탈락된 50 ㎚ 내지 200 ㎚, 또는 70 nm 내지 180 nm, 또는 50 nm 내지 100 nm의 원형질막을 갖는 프래그먼트를 말한다. 미세소포체는 세포 간의 mRNA, miRNA 및 단백질을 운송을 매개하고 세포 내의 상호 작용에 중요한 역할을 한다. 미세소포체는 유래한 세포, 세포의 수, 세포의 크기 및 항원의 구성에 따라 비균질한 집단을 나타낸다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 제대혈 혈장 유래의 엑소좀은 FLOT-1, ICAM, ALIX, CD81, TSG101, EpCAM 및 ANXA5에 대해 높은 발현 수준을 보이지만, CD63에 대해 낮은 발현 수준을 보여준다.
또한, 본 명세서에서, 용어 "제대혈 혈장 엑소좀 모방체"는 제대혈 혈장에서 분리한 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 엑소좀을 지칭하며, 특히 특정한 목적으로 상기 엑소좀에서 과발현되는 단독 또는 복수의 단백질을 유전자 재조합 기술을 이용하여 과발현되도록 제조된 면역억제효과 및 상처치료 효과가 없는 세포주 유래의 엑소좀을 지칭한다. 본 발명에서는 이러한 엑소좀 모방체로 HSP72 exo, PIP exo, HSP72 & PIP dual exo 등을 포함한다. 상기 엑소좀 모방체의 크기는 60 nm 내지 250 nm, 또는 70 nm 내지 230 nm의 직경을 가질 수 있다.
상기 면역억제효과가 없으면서 상처치료 능력이 없는 세포주로 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주를 사용한다. 예컨대, CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HLAA-A, HLA-B, HLA-C 및 MICA/B 각각의 엑손 2와 3 사이를 결실시켜 HLAA-A, HLA-B, HLA-C 및 MICA/B 유전자가 유전체 상에서 완전히 제거된 HLA 및 MICA/B 결핍 293T 세포주인 H1ME-5(기탁번호: KCTC 13602BP)를 사용할 수 있다.
상기 H1ME-5 세포주에 HSP72 및 PIP를 발현하는 벡터로 트랜스펙션시키고, HSP72 및 PIP를 발현하는 H1ME-5 세포주를 선별한 후 엑소좀(CBPexo 모방체)을 분리한다.
상기 트랜스펙션은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란 처리(DEAE-dextran treatment), 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 원생동물에서 PEG-매개 트랜스펙션 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드란 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주세포로 도입될 때 이 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포로 도입될 때 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA, IVT mRNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태로 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터)와 IVT mRNA와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다. 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 상술한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 포함하는 상처치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 섬유아세포의 이동을 유의적으로 개선하며, HSP72 및 PIP를 동시에 발현하는 엑소좀(HSP72 & PIP dual exo) 모방체의 상처치료 효과는 PIP exo 및 HSP72 exo 단독보다 농도 의존적으로 더 높았으며, PIP exo 및 HSP72 exo를 동시에 첨가하는 것보다 더 좋았다. 또한, HSP72 & PIP dual exo는 PIP exo 및 HSP72 exo 단독보다 혈관형성이 더 우수하였고, M1 Mφ의 M2 Mφ로의 분화를 촉진함으로써 상처치료 및 회복을 개선할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 상기 제대혈 혈장 유래 엑소좀을 모방하는 HSP72 및 PIP를 동시에 발현하는 엑소좀 모방체는 상처치료를 위한 유효성분으로 사용할 수 있다.
용어, "유효성분"은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 지칭한다.
본 발명의 상처치료용 조성물은 인 비트로, 인 비보 또는 엑스 비보에서 진단적 또는 치료적 용도에 적합한 조성물을 이루는 활성성분 및 활성 또는 무활성 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충화된 염수 용액, 인간 혈청 알부민(HSA) 등의 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함하는 단백질 부형제와 같이, 엑소좀 모방체와 혼용가능한 임의의 약학적 담체를 포함한다. 담체, 안정화제 및 보강제의 예는, Martin REMINGTON'S PHARM. SCI, 18th Ed.(Mack Publ. Co., Easton(1995)) 및 the "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 58nd Ed., Medical Economics, Montvale, NJ.(2004)를 참조한다. 용어 "담체"는 완충액 또는 pH 조정제를 포함할 수 있으며, 전형적으로 완충액은 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충액으로는 시트르산의 염, 아스코르브산의 염, 글루콘산의 염, 카본산의 염, 타르타르산의 염, 숙신산의 염, 아세트산의 염 또는 프탈산의 염 등의 유기산 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액을 포함한다. 추가적인 담체로, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(폴리머 당), 덱스트레이트(예, 사이클로덱스트린, 예컨대 2-하이드록시프로필-쿼드러셔(quadrature), -사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 항산화제, 항-대전제, 계면활성제(예, "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80" 등의 폴리소르베이트), 지질(예, 인지질, 지방산), 스테로이드(예, 콜레스테롤) 및 킬레이트제(예, EDTA) 등의 폴리머성 부형제/첨가제를 포함한다. 빙결 방지제 또는 강하제도 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 적정 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 종양내, 동맥내(관절에서), 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 결절내(intranodal) 및 피하 경로와 같은 비경구 투여에 적합한 제형과 담체는 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제형을 목적하는 수용자의 혈액과 등장으로 만들어 줄 용질, 및 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 현탁액을 포함한다. 정맥내 또는 복강 투여가 바람직한 방법이다. 개체에게 투여된 세포의 투여량은 시간의 경과에 따라 개체에서 목적하는 유익한 치료적 반응을 달성하기에 유효한 양, 또는 세포의 성장 억제에 유효한 양 또는 감염의 억제에 유효한 양이다. 예컨대, 주입 전에 개체로부터 혈액시료를 수득한 후 보관하여 후속적인 분석 및 비교에 사용하는 방식으로 실시될 수 있다. 일반적으로, 적어도 약 104 내지 106 및 전형적으로 1×108 내지 1×1010개의 세포를 70 kg의 환자에게 대략 60분 내지 120분에 걸쳐 정맥내 또는 복강내로 주입할 수 있다. 투여의 경우, 개체의 전반적 건강상태 및 체중을 고려하면서, 본 발명의 엑소좀을 세포의 유형에 따른 LD-50(또는 기타 독성 측정 방법) 및 다양한 농도에서의 세포의 유형에 따른 부작용에 의해 결정된 비율로 투여한다. 투여는 한번에 또는 여러 회 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 엑소좀 모방체는 세포독성제, 뉴클레오타이드 유사체 및 생물학적 반응 변형제를 포함하는 공지된 통상의 치료법을 사용하여 다른 특정 증상에 대한 치료를 보충할 수 있다. 유사하게, 생물학적 반응 변형제는 본 발명의 엑소좀 모방체에 의한 치료에 선택적으로 추가될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 제대혈 혈장 유래 엑소좀의 제조 및 특성 규명
1. 샘플 제조
인간 말초혈액단핵구와 인간 제대혈(UCB)은 건강한 기증자 또는 정상적인 만삭의 임산부에게서 서면 동의서를 받은 후 카톨릭 조혈모세포 은행(Catholic Hematopoietic Stem Cell Bank)에서 제공받았다. 모든 인간 피험자에 관한 실험은 헬싱키 선언의 권고에 따라 수행하였다. 프로토콜은 가톨릭대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인되었다. 모든 피험자는 헬싱키 선언에 따라 샘플 기증에 대한 서면 동의를 받았다.
2. 엑소좀 분리
인간 제대혈 혈장을 순차적으로 400g에서 5분간, 2,000g에서 10분간 원심분리하여 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 그런 다음 제대혈 혈장을 0.45-㎛ 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Nalgene™ Rochester, NY)으로 여과하였다. 단백질 용출은 나노드롭 분광기(Thermo Scientific, San Diego, CA)을 사용하여 280nm에서 각 분획의 흡광도를 판독하여 검사하였다. CBP를 100,000g에서 2시간 동안 초원심분리하고, 제대혈 혈장 펠렛을 비교 실험에 사용하였다. 대조군으로 성인 혈액의 혈장을 분리하고 동일한 엑소좀 분리 절차를 따랐다. 모든 분획물은 4℃에서 보관하고 인 비트로 실험을 위해 24시간 이내에 사용하거나 -80℃에서 동결시켰다. CBPexos는 배치(batch) 당 총 10명의 건강한 기증자로부터 CBP 샘플을 지속적으로 수집하여 얻었다. Exo-Check Exosome Antibody Array(System Biosciences, Palo Alto, CA) 또는 PE-컨쥬게이트 된 항-인간 CD9(e-Bioscience, San Diego, CA), 항-인간 CD63(BD Biosciences, San Jowe, CA), 또는 항-인간 CD82(Biolegend, San Diego, CA), 또는 항-인간 HSP70/HSP72(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) FACS 항체를 이용하여 각 배치에 대해 엑소좀의 특성 분석을 수행하였다. 배치 간 엑소좀의 특성 차이는 없었다.
3. 세포 배양
인간 피부 섬유아세포(HSF, 가톨릭 조혈모세포 은행)를 10% FBS가 보충된 고-포도당 Dulbecco's modified Eagle medium(Gibco BRL, Grand Island, USA)에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2의 가습 환경 하에서 유지하였다.
4. 엑소좀 이동 효율
섬유아세포 및 내피세포로의 CBPexo 이동을 측정하기 위해, 적색 형광 염료(PKH26; Sigma)로 엑소좀을 표지하고 녹색 형광 염료(PKH67; Sigma)로 HSF를 염색하여 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다.
5. 콜로니-형성 단위(Colony-forming unit(CFU)) 분석
가톨릭 조혈모세포 은행의 제대혈 팀은 인간 제대혈을 이용하여 신선한 샘플에서 수행하는 경우 CFU에 대한 현 실험실 관행을 평가하였다. 실험은 UCB에서 조혈 전구 세포의 분화를 평가하도록 설계되었다. CFU-C 분석은 MethoCult? H4435 Enriched medium(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)를 사용하여 수행되었다. 간단히 말해, 1Х105 cells/mL의 세포를 24-웰 플레이트 내 2개의 웰(1 mL/well)에 플레이팅하고, 인큐베이터에 정치하여 37 ℃, 5% CO2 및 >85% 습도에서 유지하였다. 콜로니는 >40 세포의 응집으로 정의하였다. 클러스터는 4-40 세포로 구성되었다. 도립 현미경을 이용하여 colony-forming unit-erythroids(CFU-E)는 7일 후에 계수하고, burst-forming unit-erythroids(BFU-E)는 14일 후에 계수하였다. CFU-granulocyte/macrophage(CFU-G/M) 및 cluster-G/M은 14일 후에 계수하였다. 콜로니 수는 105 플레이트된 단핵 세포에 조정된 2개의 웰의 평균으로서 보고되었다.
6. 이동 분석
스크래치 상처 분석을 위해, 5Х105 cells/well(그룹 당 3반복)를 12-웰 플레이트에 플레이팅하고 컨플루언스에 도달할 때까지 인큐베이션 하였다. 팁을 이용하여 단일층을 흠집을 내고 무혈청 배지로 세척하여 탈착된 세포를 제거하였다. 이어서 세포를 CBPexo(100 ㎍/well) 및 GAL-3-, GAL-7-, PIP-, HSP72-, S100-A7-발현 엑소좀이 보충되거나 그렇지 않은 완전 배지에서 배양하였다. HSF는 상처 후 0 h, 12 h, 및/또는 24 h에 사진을 찍었다. 상처의 봉합 영역은 이동 영역으로 계산되었다(㎛2). 이동 수준은 Lionheart FX(BioTek Instruments, Inc) 하에서 관찰되었다.
7. 섬유아세포의 마이토마이신 C 처리
단일 세포 현탁액은 섬유아세포에 0.125% 트립신을 처리하여 제조되었다. 180 ㎕ 배지 당 5000 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 24h 동안 인큐베이션 하였다. 24h 동안 배양에서, 섬유아세포는 10 ㎍/mL의 농도의 마이토마이신 C(MMC)가 처리되었다. 4개의 웰 그룹이 있다: 대조군으로서 PBS 또는 MMC 단독 처리된 섬유아세포의 2개의 실험군, MMC 및 CBP 또는 ABP 엑소좀이 처리된 섬유아세포의 2개의 실험군.
8. 맥관 형성 분석
희석되지 않은 기저막 매트릭스(250 ㎕; Matrigel, BD Biosciences)를 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 하여 응고시켰다. HUVECs(1Х105)을 상이한 유형의 엑소좀(CBP EXO, HSP72 EXO, PIP EXO)을 포함하는 각 마트리젤-코팅된 웰에 플레이팅하고 나서, 37℃, 5% CO2에서 12h 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거한 후, 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하여 고정시키고, 세포는 광학 현미경을 사용하여 시각화하였으며, 맥관 구조의 형성은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
9. 대식세포 분화
M1 활성화를 위해, 세포를 40 ng/mL IFN-γ(Peprotech)와 함께 2일 동안 유지시키고, M2 활성화를 위해, 세포에 20 ng/mL IL-4(Peprotech)로 2일 동안 처리하였다.
10. 렌티바이러스 생산 및 형질도입
각 분자(GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7)를 인코딩하는 렌티바이러스의 생산을 위해 5Х106 293T cells/10 mL를 T75 플라스크에 씨딩하였다. 24시간 후, 10 mg의 클로닝된 pCDH plasmid(#CD523A-1; SBI, Palo Alto, CA) 및 렌티바이러스 패키징 플라스미드(5 mg pMD2.G 및 5 mg psPAX2, cat nos. #12259, #12260; Addgene)를 리포펙타민 시약(Invitrogen)을 사용하여 293T 세포에 함께 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 48시간 후 렌티바이러스 상등액을 수확하고, 0.45 mM 필터를 통해 여과하였다. 각 렌티바이러스의 형질도입을 위해, 5Х105 293T cells/mL를 6-웰 플레이트에 씨딩하였다. 24시간 후 500 mL의 렌티바이러스 상등액 및 8 mg/mL의 폴리브렌을 293T 세포 배양액에 첨가하였다. 형질도입 48시간 후, 세포를 배양하고 플로우 사이토메트리로 분석하였다.
11. 트랜스펙션 및 세포 소팅
HEK 293T 세포를 항생제가 없는 Dulbecco's modified Eagle's medium(Lonza)에서 2Х106 cells/10 mL 로 씨딩하였다. 24시간 후, 4개의 타겟 각각에 특이적인 6개 각각의 올인온 플라스미드의 혼합물을 리포펙타민 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 293T 세포주로 옮겼다. 48시간 후 플로우 사이토메트리로 분석하였다. 트랜스펙션 6일 후, GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7에 대해 양성인 세포를 Moflo XDP cell sorters(Beckman)를 이용하여 소팅하고, 클론을 확립하였다.
12. 통계 분석
모든 실험은 그룹당 적어도 3반복으로 수행하였고, 인 비트로 실험은 최소 3회 반복하였다. 데이터는 이들 실험의 대표값이며, 평균 ± 표준편차(SEM)로 도시하였다. 복수의 그룹의 평균은 일원 분산 분석(ANOVA)로 비교되었다. 독립-샘플 t-test는 두 개의 상이한 그룹의 평균을 비교하는데 사용되었다. 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였고, P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
(1) CBPexo의 분자적 특성 규명
엑소좀의 순도는 ICAM, CD63, ALIX, TSG101, EpCAM, FLOT-1과 같은 잘-규명된 엑소좀 단백질 마커 및 세포 오염 모니터링을 위한 cis-Golgi 마커 GM130을 포함하는 엑소좀 항체 분석 키트를 사용하여 확인하였다. 엑소좀 항체 분석 키트는 양성 대조군인 표준 엑소좀 단백질 및 음성 대조군인 블랭크로 구성된다. CBPexo는 FLOT-1, ICAM, ALIX, CD81, TSG101, EpCAM 및 ANXA5에 대해 높은 발현 수준을 보이지만, CD63에 대해 낮은 발현 수준을 보여준다. GM130에 대한 음성 염색에 의해 입증된 바와 같이 분리된 엑소좀은 세포 부스러기 및 다른 오염원들이 없다. ImageJ 소프트웨어와 함께 엑소좀 항체 분석 키트를 이용한 밀도 분석에서 얻은 결과의 그래프 대표도는 특이 엑소좀 마커들의 양성 발현을 나타냈다. 이들 결과는 CBP 및 CBPexo로부터 분리된 엑소좀이 상이한 배치에서 유사한 산물을 보여줌을 나타냈다(도 1a). 게다가, CBP로부터 방출된 엑소좀의 크기 분포는 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 특성 규명되었고, 관찰된 엑소좀의 크기는 127.59 ± 57.87 nm이었다(도 1b).
(2) CBPexo의 이동 및 섬유아세포 증식에 대한 효과
상처치료 동안 그들의 재생 효과를 확인하기 위해 인간 CBP로부터 엑소좀을 수집하였다. CBPexo는 적색 형광 염료(PKH26)를 사용하여 표지되었고, 녹색 형광 염료-표지된(PKH67) HSF와 함께 인큐베이션 하였다. 이어서, PKH67-표지된 HSF 주변에 분포한 PKH26-표지된 CBPexo의 형광 현미경 검사를 수행하였다(도 2a). 이들 형광 표지된 엑소좀은 인큐베이션 12시간 후 녹색-표지된 HSF 세포 주변에 분포하였다(도 2a). 적색 표지된 CBPexo는 0-24시간 동안 인큐베이션 하는 동안 HSF로 유의적으로 이동하였다(도 2b).
세포 증식에 대한 CBPexo의 효과는 스크래치 분석 및 CFSE 증식 분석을 통해 확인되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 인 비트로에서 CBPexo가 이동하고 섬유아세포 내에 내재화되어 증식을 촉진할 수 있음을 입증하였다. 게다가, 이들 엑소좀은 혈장 기능의 필수 매개자이며, 상처치료를 위한 새로운 치료적 나노입자 전달 시스템으로 사용될 수 있음을 관찰하였다.
(3) CBPexo의 상처치료 효과
엑소좀 단백질 전달을 위한 필요 조건인 CBPexo가 HSF 내에 내재화될 수 있는지를 측정하였다. CBPexo는 컨플루언스에 도달할 때 까지 7일 동안 HSF와 함께 인큐베이션 하였다. 이어서, 상처치료를 위한 섬유아세포 이동에 대한 CBPexo 및 ABPexo의 기능적 효과를 시험하고자 하였다. CBPexo가 섬유아세포 이동에 영향을 주는지를 평가하기 위해 스크래치 상처 분석을 수행하였다. 이를 위해 섬유아세포를 포함하는 상처 영역을 흠집을 내고 CBPexo가 있거나 없이 이들 섬유아세포를 24시간 동안 배양하고, 이어서, 상처 영역을 평가하였다. 이 분석 결과는 CBPexo가 대조군 및 ABPexo 그룹과 비교하여 섬유아세포의 이동을 유의적으로 증가시킴을 나타냈다(도 3a).
게다가, CBPexo가 처리 시간 대에 섬유아세포 이동을 증가시키는지를 통계적으로 분석하였다(도 3b).
카르복시플루오레신 석시니미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE) 분석 결과, CBPexo 또는 ABPexo가 처리된 경우 섬유아세포의 증식 반응은 상처-봉합 분석에서 관찰된 것과 유사함을 보여주었다(도 3c). 추가로, 이동 자극 및 HSF 증식 동안 주요 메커니즘을 측정하기 위해, HSF에 항-증식제로 사용되는 MMC로 전처리한 후 시험을 수행하였다. 결과적으로, 섬유아세포의 증식은 MMC에 의해 억제됨에도 불구하고, CBPexo가 첨가된 그룹에서 ABPexo가 처리된 다른 대조군과 비교하여 증식은 증가됨을 확인하였다(도 3c). 게다가, CBPexo가 첨가된 그룹에서, 증식능이 MMC에 의해 억제되더라도 세포사멸은 대조군과 비교하여 감소되었다(도 3d).
이들 결과는 상처치료 동안 CBPexo가 HSF 이동 자극 및 섬유아세포의 증식을 촉진할 수 있음을 입증하였다. 섬유아세포는 연조직 상처치료를 담당하는 주요 효과기 세포이며, 그들의 증식 및 이동은 상처치료, 상처 수축, 콜라겐 합성 및 조직 리모델링에 필수적이다. 이 결과는 이들 CBPexo가 이동하여 섬유아세포 내에 내재화됨으로써 CBPexo는 ABPexo와 비교하여 섬유아세포의 증식 및 이동을 유의적으로 향상시킬 수 있음을 보여주었다.
(4) CBPexo에 의한 향상된 내피세포 맥관 형성 및 M2 Mφ의 분극화
증식기로 알려진 2차 상처치료 동안, 대안으로 활성화된 M2 Mφ이 섬유아세포의 증식 및 이동 및 혈관형성에 관여함으로써 염증을 줄이고 상처를 복구할 수 있다.
도 4a는 각 그룹에 대한 HUVEC 맥관 형성의 대표 이미지를 도시한다. 따라서, 혈관형성을 상향조절하는 CBPexo의 능력을 평가하였다. CBPexo는 colony-forming unit-granulocytes, -erythrocytes, -monocytes, 및 -megakaryocytes(CFU-GEMMs); 및 대식세포 분화와 관련된 CFUgranulocytes, -monocytes(CFU-GMs), 및 CFU-monocytes(CFU-Ms)의 수를 증가시켰다(도 4b). CBPexo는 대식세포 증식을 촉진하고 전염증성 M1 표현형을 항-염증성 M2 표현형으로의 분화를 유도하였다. CBPexo가 첨가되고 고전적으로 활성화된 M1 Mφ, CD80 및 CD86과 인큐베이션되는 경우, IL-12 발현은 강하게 하향조절되는 반면, CD163, CD206, 및 IL-10 발현은 상향조절되었다(도 4c). 이들 결과는 고전적으로 활성화된 M1 Mφ이 CBPexo-유도된 표현형 전환을 통해 M2 Mφ로 성공적으로 분극화되었음을 제안한다.
<실시예 2> 인공 엑소좀(엑소좀 모방체)의 제조 및 특성 규명
상처치료는 몇몇 세포 유형들, 성장 인자, 사이토카인 및 세포외 기질(ECM) 성분들이 관여하는 복잡한 과정이다. 상처치료가 시작되면, 죽은 세포 및 부스러기를 제거하고, 콜라겐 생산, 혈관형성, 및 재생피화(re-epithelization)를 촉진하는 것이 중요하다.
CBPexo의 프로테오믹스 분석 결과 엑소좀 단백질(PIP, HSP72, GAL-7, GAL-3 및 S100-A7)이 상처치료와 연관되어 있음을 나타냈다. MHC 및 MICA/B는 내피세포 증식을 유도하고 상처치료 효과에 영향을 미쳤다. 따라서, HLA 클래스 I 및 MICA/B를 발현하는 HEK 293T 세포(H1ME-5)는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 제거함으로써 상처치료 효과가 없는 세포를 생산하였다. 따라서, H1ME-5 세포주에서 유래된 엑소좀은 HLA 클래스 I 분자 및 MICA/B를 발현하지 않는다. H1ME-5에서 방출된 엑소좀의 크기 분포는 DLS를 이용하여 특성규명하였고, 관찰된 엑소좀의 입자 크기는 145.61±75.89 nm 였다(도 5a). H1ME-5 세포는 H1ME-5 세포에서 유래된 엑소좀이 상처치료 효과가 없기 때문에 인공 엑소좀을 생산하는데 적당하다(도 5b 및 c). 상기 실시예 1의 방법에 따라 PIP, HSP72, GAL-7, GAL-3 및 S100-A7 유전자를 인코딩하는 렌티바이러스는 H1ME-5 세포에서 형질도입되었다. 형질도입 6일 후, PIP, HSP72, GAL-7, GAL-3 및 S100-A7 양성 세포를 소팅하였다. 플로우 사이토메트리는 H1ME-5가 90% 이상의 비율로 PIP, HSP72, GAL-7, GAL-3 및 S100-A7를 발현함을 나타냈다. 이어서, 10개의 양성 단일 세포 클론을 각 단백질에 대해 얻었으며, 최대 단백질 발현을 갖는 세포주를 선별하였다(도 5d).
추가로, 이들 세포주에서 유래된 엑소좀은 타겟 단백질 분자, 즉, PIP, HSP72, GAL-7, GAL-3 및 S100-A7를 발현하였다(도 5e).
<실시예 3> CBPexo의 섬유아세포의 증식 및 이동에 대한 효과
CBPexo의 이전 프로테오믹스 분석 결과는 표 1에 요약된다. CBPexo에서 단백질의 차등 발현 수준은 표 1에서 유색으로 강조하였다. 적색은 상처치료에 유의적으로 영향을 주는 CBPexo 단백질이고, 청색은 상처치료 효과가 없는 단백질이다.
PIP, HSP72, GAL-7, GAL-3 및 S100-A7의 역할을 확인하기 위해 HSF는 특정 타겟 단백질을 발현하는 인공 엑소좀으로 자극되었다. 섬유아세포 증식에 대한 이들 단백질의 효과를 평가하기 위해, CBPexo 또는 인공 엑소좀을 같은 농도로 이들 HSF에 처리함으로써 일련의 인 비트로 기능 분석을 수행하였다. 상기 실시예 1의 방법에 따라 스크래치 상처 분석을 수행하여 HSF 이동에 대한 CBPeox 또는 인공 엑소좀의 효과를 평가하였다. HSP72-exo 및 PIP-exo는 이동 영역에 의해 측정된 바와 같이 HSF의 이동을 유의적으로 개선하였다(도 6a). 타겟 단백질 중에서, PIPexo 만이 섬유아세포 증식을 촉진하였다(도 6b). GAL-7, GAL-3 및 S100-A7을 발현하는 엑소좀은 상처치료 효과를 보이지 않았을 뿐만 아니라 섬유아세포를 증식하지도 않았다.
Figure pat00001
<실시예 4> HSP72 및 PIP를 동시 발현하는 엑소좀의 섬유아세포 증식 및 이동에 대한 효과
상기 실시예 1의 방법에 따라, 형질도입후 6일에, MoFlo XDP 세포 소터를 사용하여 PIP 및 HSP72를 발현하는 세포를 동시에 선별하고, 배양하였다(도 7a). HSP72-exo 및 PIP-exo를 함께 첨가한 경우, 상처치료 효과는 CBPexo과 유사하고, PIP 또는 HSP72만 발현하는 엑소좀보다 더 높았다. 이들 엑소좀은 농도 의존적 방식으로 상처치료 효과를 보여주었다(도 7b). 게다가, HSP72 및 PIP를 동시에 발현하는 엑소좀은 HSP72-exo 및 PIP-exo를 동시에 첨가한 경우 관찰된 것보다 더 좋은 상처치료 효과를 보여주었다(도 7c). 섬유아세포는 CFSE로 표지되어 대조군으로 사용되었고, 24시간 동안 배양되었다. 배양 후, 세포를 수확하고, 플로우 사이토메트리를 통해 분석되었다. 세포 분열은 CFSE 형광이 순차적으로 반으로 나뉘고, 로그 스케일 상에 동일한 간격의 피크를 가지는 것으로 규명되었다. 이들 피크는 분열 사이클 수를 나타냈다. 유사한 상처 봉합 결과는 CFSE 방법을 이용하여 얻었으며, 다양한 유형의 인공 엑소좀으로 정상 HSF의 증식율을 확인하였다(도 7d).
HSP72 및 PIP를 발현하는 엑소좀을 생산하였고, 그들은 함께 첨가하거나 농도 의존적 방식으로 첨가하여 그들의 상처치료 효과를 확인하였다. 그 결과, HSP72 및 PIP는 상처치료를 촉진하는데 있어서 가장 효과적인 단백질이었다(CBPexo에 의해 발현된 것들 중에서).
<실시예 5> 인공 엑소좀에서 HSP72/PIP의 기능의 확인
엑소좀은 그들의 부모 세포를 나타내는 다양한 신호전달 분자를 포함한다. 단백질, 핵산, 지질 및 대사체를 포함하는 상이한 엑소좀 조성에서 분극화 인자를 연구하기 위해, 풍부한 함량으로 존재하는 CBPexo 카고 단백질에 초점을 맞추었다. 추가로, 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 인공 엑소좀의 효과를 측정하기 위해, 상기 실시예 1의 방법에 따라 맥관 형성 분석을 수행하였다. 우선, 엑소좀이 없이 배양된 것들과 비교하여 HSP72-exo 및 PIP-exo는 네트워크 구조에서 노드의 수 및 총 맥관 길이를 증가시켰고, 이는 인공 엑소좀의 전-혈관형성 능력을 나타내는 것이다. 각 그룹에 대한 HUVEC 맥관 형성의 대표 이미지는 도 8a에 도시된다. 추가 분석 결과, HSP72/PIPexo과 배양된 HUVEC은 다른 엑소좀과 배양된 것들과 비교하여 더 나은 혈관 형성 능력을 나타냈다(도 8a). 추가로, 상이한 유형의 엑소좀 성분 중, M1 Mφ의 M2 Mφ로의 분화는 HSP72/PIP 단백질에 의해 촉진됨을 확인하였다(도 8b).
상기 결과로부터 HSP72 및 PIP를 발현하는 인공 엑소좀은 혈관형성을 향상시킴으로써 상처치료 및 회복을 개선할 수 있다. 우리가 알기로는, 본 발명은 HSP72 및 PIP를 발현하는 인공 엑소좀이 고전적으로 활성화된 M1 Mφ를 분극화된 M2-유사 표현형으로의 인 시츄 직접 전환을 유도함으로써 피부 상처 회복을 촉진할 수 있음을 최초로 입증하였다.

Claims (7)

  1. HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에서 유래하고, Heat shock protein 72(HSP72) 및 Prolactin-inducible protein(PIP) 중 하나 이상을 발현하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
  2. 제1항에 있어서,
    제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 HSP72 및 PIP를 발현하는 것인, 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
  3. 제1항에 있어서,
    제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 HSP72 및 PIP 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 핵산을 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에 도입하고, 상기 세포주로부터 분리 정제한 것인, 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
  4. 제3항에 있어서,
    HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주는 H1ME-5(기탁번호: KCTC 13602BP)인, 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
  5. Heat shock protein 72(HSP72) 및 Prolactin-inducible protein(PIP) 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 핵산을 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에 도입하고, 이로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주는 H1ME-5(기탁번호: KCTC 13602BP)인, 제대혈 혈장 엑소좀 모방체의 제조방법.
  7. 제1항의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 포함하는 상처치료용 조성물.
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