ES2328194T3

ES2328194T3 - Composiciones y procedimientos de modulacion de una respuesta inmunitaria frente a un antigeno mediante la administracion de celulas recubiertas con citocina.

Info

Publication number: ES2328194T3
Application number: ES99930120T
Authority: ES
Inventors: Andrew Segal
Original assignee: Genitrix LLC
Current assignee: Genitrix LLC
Priority date: 1998-05-26
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 2009-11-10
Anticipated expiration: 2019-05-26
Also published as: WO1999061051A1; US20100297154A1; IL139601A0; ATE428441T1; EP1079854A4; AU4672499A; JP5546084B2; AU765529B2; CA2328604A1; EP1079854A1; EP1079854B1; DE69940731D1; JP2002516290A

Abstract

Composición de vacuna que comprende una célula recubierta con citocina que puede obtenerse mezclando una citocina con una célula, en la que la citocina se introduce desde o se produce fuera de la célula y comprende un resto heterólogo de unión a la membrana celular que puede unirse a dicha célula cuando se mezcla con dicha célula.

Description

Composiciones y procedimientos de modulación de una respuesta inmunitaria frente a un antígeno mediante la administración de células recubiertas con citocina.

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Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al sistema inmunitario y en particular a composiciones y procedimientos de modulación de una respuesta inmunitaria frente a un antígeno.

Antecedentes de la invención

Las citocinas son moléculas de polipéptido que regulan las reacciones inmunitarias y/o inflamatorias mediante la unión a receptores de la superficie celular en leucocitos. Son activas como hormonas que pueden difundir, extracelulares, aunque algunas citocinas también se producen de manera natural en una forma transmembrana. Pueden aumentar, atenuar o cambiar el carácter de una respuesta inmunitaria o inflamatoria. Ejemplos de propiedades de leucocitos que pueden modular citocinas seleccionadas incluyen el estado proliferativo, el perfil de transcripción y la propensión a migrar.

Algunas citocinas puede agruparse en familias basándose en las similitudes de estructura y/o función. Ejemplos de tales familias incluyen interleucinas, interferones, quimiocinas y factores estimuladores de colonias (CSF). Una citocina puede pertenecer a más de una familia.

Una interleucina es una citocina que se produce por un leucocito. Entre las interleucinas están aquellas citocinas que se denominan "interleucina-" o "IL-" seguidas por un número que indica el orden en el que se produjo su denominación. Hasta la fecha se han descrito de la L-1 a la IL-18. Además, la mayoría de las otras citocinas conocidas las producen los leucocitos y, por tanto, pueden considerarse interleucinas.

Los interferones se agrupan partiendo de la base de su capacidad para inhibir la replicación viral. Los interferones incluyen interferones (IFN) \alpha, \beta y \gamma.

Las quimiocinas inducen la quimiotaxis de leucocitos. En otras palabras, en un gradiente de concentración de quimiocina, un leucocito migrará hacia la concentración superior. Las quimiocinas comprenden dos subfamilias denominadas quimiocinas C-C, en las que están contiguas dos cisteínas conservadas, y las quimiocinas C-X-C, en las que las dos cisteínas conservadas están separadas por otro aminoácido. Las quimiocinas C-C generalmente atraen monocitos y linfocitos de la manera más potente, mientras que las quimiocinas C-X-C generalmente atraen neutrófilos de la manera más potente. Ejemplos de quimiocinas C-C incluyen el factor quimiotáctico y activador de macrófagos (MCAF), las proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP) 1a y b, y RANTES. Ejemplos de quimiocinas C-X-C incluyen la IL-8, la proteína activadora de neutrófilos 2 (NAP-2) y el factor de plaquetas 4 (PF-4).

Los factores estimuladores de colonias (CSF) se agrupan debido a sus capacidades para potenciar la diferenciación de las células de la médula ósea en tipos seleccionados de leucocitos. La mayoría de los CSF también modulan las funciones de los leucocitos maduros, periféricos. Ejemplos de CSF incluyen el CSF de macrófagos (M-CSF), el CSF de granulocitos (G-CSF) y el CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).

Las citocinas pueden asimismo clasificarse según los tipos de receptores a los que se unen. Ejemplos de tales tipos de receptores incluyen los receptores de hematopoyetina (también conocidos como receptores de citocina de clase I), los receptores de interferón (también conocidos como los receptores de citocina de clase II), los receptores de superfamilia de inmunoglobulinas, los receptores de TNF y los receptores de quimiocina.

Los receptores de hematopoyetina comprenden dos motivos de aminoácidos conservados en sus dominios extracelulares. Uno de éstos consiste en cuatro cisteínas conservadas en cuanto a su posición, mientras que el otro consiste en la secuencia Trp-Ser-X-Trp-Ser, en la que "X" es un aminoácido no conservado. Muchos receptores en esta familia comprenden múltiples cadenas de polipéptido, siendo algunas de las cadenas comunes a más de un miembro de la familia. La presencia de ciertas cadenas comunes define subfamilias de receptores de hematopoyetina. Por ejemplo, todos los miembros de la subfamilia de receptores de GM-CSF, que incluyen los receptores para GM-CSF, IL-3 e IL-5, comprenden una cadena \beta de transducción de señales idéntica. De manera similar, todos los miembros de la subfamilia de receptores de IL-6, que incluyen los receptores para IL-6, IL-11, IL-12, factor inhibidor de la leucemia (LIF), oncostatina M y factor de crecimiento neurotrófico ciliar (CNTF) comprenden la cadena de transducción de señales gp130. La subfamilia de receptores de IL-2 se define por la presencia de una cadena de transducción de señales \gamma. Los miembros de esta subfamilia incluyen los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15.

Los receptores de interferón se caracterizan por la presencia de cuatro cisteínas extracelulares conservadas en cuanto a su posición, como en los receptores de hematopoyetina, y por la ausencia de un motivo Trp-Ser-X-Trp-Ser. Los miembros de esta familia incluyen los receptores para interferones \alpha, \beta y \gamma.

Los receptores de la superfamilia de inmunoglobulinas presentan dominios globulares que son homólogos a los dominios globulares de las regiones constantes y variables de las inmunoglobulinas. Los receptores de citocina que pertenecen a esta familia incluyen los receptores para IL-1, M-CSF y c-kit.

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Los receptores de quimiocina pertenecen al gran grupo de receptores de siete dominios transmembrana acoplados a proteínas G que contienen siete segmentos de alfa-hélice hidrófobos que atraviesan la membrana. Estos receptores forman un grupo relacionado estructuralmente dentro de la superfamilia de los receptores acoplados a proteínas G que median en la señalización a través de proteínas G heterotriméricas.

Se conoce en la materia que el extremo carboxilo terminal de algunas citocinas, tal como GM-CSF (Brown et al, Eur J Biochem 1994,225: 873-880), es importante para la interacción con un receptor cognado. Dado que los restos de GPI se unen a los extremos carboxilo terminales de las proteínas, un experto en la materia esperaría que un resto de GPI heterólogo pudiera interferir con la unión de una citocina tal como GM-CSF a su receptor. Además, dado que se sabe que las citocinas solubles tales como las quimiocinas ejercen sus actividades a través de gradientes de concentración, un experto en la materia no esperaría que las versiones de unión a la membrana de tales moléculas pudieran ayudar en la modulación de una respuesta inmunitaria. El documento WO 97/49421 se refiere a un procedimiento para inhibir el crecimiento de células de tumor cerebral en un paciente; comprendiendo el procedimiento; coadministrar al paciente GM-CSF con antígeno tumoral.

CD40 es un polipéptido de la superficie celular transmembrana expresado en ciertos leucocitos, incluyendo en las células presentadoras de antígeno (APC) tales como las células B, los macrófagos y las células dendríticas. El ligando nativo para CD40, conocido como ligando de CD40 (CD40L) o CD 154, también es un polipéptido de la superficie celular transmembrana que se expresa, por ejemplo, en células T cooperadoras CD4+. El acoplamiento de CD40 en las células B que expresan IgM en presencia de IL-4 permite que estas células comiencen a secretar IgG e IgE (Splawski et al, 1993, J Immunol 150: 1276-1285). Además, el acoplamiento de CD40 en ciertas APC permite que estas APC estimulen las células T citotóxicas (Ridge et al, 1998, Nature 393: 474478; Bennett et al, 1998, Nature 393: 478-480; Schoenberger et al, 1998, Nature 393: 480-483). Por otra parte, la unión de CD40 en células dendríticas disminuye su capacidad para captar antígeno exógeno (Sallusto et al, 1995, J Exp Med 182: 389-400; Ruedl et al, 1997, Eur J Immunol 27: 1325-1330).

Mendoza et al (1997, J Immunol 159: 5777-5781) demostraron que coinyectando un plásmido que codifica para CD40L con un plásmido que codifica para un antígeno indicador se modulaba la respuesta inmunitaria del sujeto frente al antígeno. Dullforce et al (1998, Nature Medicine 4: 88-91) demostraron que administrando anticuerpos anti-CD40 con antígeno de polisacárido se estimulaba la respuesta de anticuerpos independiente de células T frente al antígeno. Grossmann et al (1997, Human Gene Ther 8: 1935-1943) transfirieron el gen que codifica para CD40L en células tumorales y utilizaron esas células para vacunar a ratones contra células tumorales de tipo natural. Kato et al (1998, J Clin Invest 101: 1133-1141) transdujeron células de leucemia - células B con un gen que codifica para CD40L y demostraron que las células transducidas presentaban función de APC in vitro. Couderc et al (1998, Cancer Gene Ther 5: 163-75) también introdujeron el gen para CD40L en células tumorales y demostraron que la vacunación con estas células inducía una respuesta inmunitaria antitumoral. El documento WO 99/06544 se refiere a una vacuna, que comprende una célula que presenta una proteína de fusión de tipo membrana que comprende una molécula de inmunología distinta a un anticuerpo operativamente unida a un dominio heterólogo de unión a la membrana.

Sumario de la invención

La invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que las células recubiertas con citocina, es decir, las células que se han modificado de tal manera que portan una citocina asociada a la superficie celular, modulan la respuesta inmunitaria en el receptor contra un antígeno o antígenos seleccionado(s) contenido(s) en o unido(s) a las células.

Por tanto, la invención comprende un procedimiento de vacunación de un mamífero contra un antígeno seleccionado, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero una composición de vacuna que comprende una célula recubierta con citocina, en la que la célula recubierta con citocina comprende el antígeno seleccionado.

Preferentemente, la célula recubierta con citocina se mezcla con una citocina exógena obtenida mediante ingeniería genética. Además se prefiere que la citocina obtenida mediante ingeniería genética comprenda un resto lipídico. Se prefiere que el resto lipídico comprenda glicosilfosfatidilinositol (GPI) y/o un ácido graso, por ejemplo, palmitato.

En un procedimiento preferido de la invención, la composición de vacuna comprende además células mejoradas en opsonina, es decir, células que se han 1) modificado para expresar una opsonina a partir de un ácido nucleico recombinante, 2) modificado para expresar niveles superiores de una opsonina endógena, o 3) mezclado con una opsonina exógena. Si las células mejoradas en opsonina se mezclan con una opsonina exógena, la opsonina puede ser una opsonina obtenida mediante ingeniería genética que comprende un resto lipídico.

En una forma de realización de la invención, la vacunación con células recubiertas con citocina provoca una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos contra un antígeno que está comprendido por las células. En otra forma de realización de la invención, la vacunación con células recubiertas con citocina provoca una respuesta inmunitaria mediada por células T CD4+ que reconocen un antígeno que está comprendido por las células. Todavía en otra forma de realización de la invención, la vacunación con células recubiertas con citocina provoca una respuesta inmunitaria mediada por células T CD8+ que reconocen un antígeno que está comprendido por las células. Naturalmente, en el caso de las células T, el antígeno se reconoce en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad.

Preferentemente, la célula recubierta con citocina es también una célula mejorada en opsonina. También se prefiere que una célula de la invención sea cada una de una célula recubierta con citocina y una célula mejorada en opso-
nina.

La invención también comprende una composición de vacuna que comprende una célula recubierta con citocina para vacunar a un mamífero contra un antígeno seleccionado, en la que la célula recubierta con citocina comprende el antígeno seleccionado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "poner en contacto" se refiere a mezclar in vitro.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "tiempo suficiente para permitir la internalización" se refiere a un periodo de tiempo que es de una duración suficiente para permitir la internalización del antígeno seleccionado por la APC (por ejemplo, no más de aproximadamente catorce días, o siete días, o cinco o tres días, o tan sólo aproximadamente 24, 12, 6, 3, 2 ó 1 hora, o incluso tan sólo aproximadamente 30, 20, 10, 5 ó 1 minuto).

Preferentemente, la célula recubierta con citocina comprende una opsonina exógena y/o una opsonina obtenida mediante ingeniería genética.

Preferentemente, la citocina es un ligando para un receptor para GM-CSF, IL-4, IL-2, IL-6, IL-12, IL-10 o TNF-\alpha.

Se prefiere que la citocina sea una "citocina antitumoral". Según la invención, una "citocina antitumoral" es una citocina que puede limitar el crecimiento o la metástasis de células tumorales in vitro o in vivo, o que puede prolongar la supervivencia de un animal que porta tumor, en comparación con animales control que no portan tumores, cuando se mezcla con las células o se administra al animal. En una forma de realización preferida, una citocina antitumoral puede limitar el crecimiento o la metástasis de células tumorales in vitro o in vivo, en por lo menos el 5%, o por lo menos el 10-50%, o por lo menos el 50-100% o por lo menos el 100% o superior, o puede prolongar la supervivencia de un animal que porta tumor en por lo menos el 5%, o por lo menos el 10-50%, o por lo menos el 50-100% o por lo menos el 100% o superior, en comparación con animales control que no portan tumores, cuando se mezcla con las células o se administra al animal.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "expresado" se refiere a que se está produciendo a un nivel que es detectable mediante procedimientos incluyendo pero sin limitarse a ELISA, inmunotransferencia, inmunoprecipitación, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia o microscopía láser confocal. Preferentemente, en el procedimiento y las composiciones de la invención una proteína útil según la invención, (por ejemplo, una opsonina o antígeno) se expresa a un nivel que es por lo menos aproximadamente el 5% superior, de manera preferible aproximadamente el 10-25% superior y más preferentemente superior al 50-100 del nivel de expresión de la forma nativa de una proteína útil cuando se presenta o se expresa de manera natural en una célula.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia de ácido nucleico recombinante" se refiere a una secuencia de ácido nucleico construida mediante procedimientos de ADN recombinante bien conocidos en la materia y descritos en la presente memoria.

Preferentemente, en los procedimientos y las composiciones inventivos, la célula recubierta con citocina sustancialmente no puede dividirse in vitro. "Sustancialmente no puede dividirse in vitro" significa que las células recubiertas con citocina se dividen a una tasa que es inferior a aproximadamente el 50% que la tasa de división de las células correspondientes que no se tratan para prevenir la división celular. En una forma de realización preferida, sustancialmente no puede dividirse in vitro significa que las células recubiertas con citocina se dividen a una tasa que es inferior a aproximadamente el 30-50% de la tasa de división de las células correspondientes que no se tratan para prevenir la división celular.

También se prefiere que la composición de vacuna esté atenuada y, por tanto, que no pueda producir una enfermedad que producen las células en su forma patogénica. Tal como se utiliza en la presente memoria, "atenuado" se refiere a un estado en el que las células que comprenden la vacuna no pueden producir enfermedad, por ejemplo, mediante la exposición a radiación ionizante, agentes antiproliferativos o eliminándolas con o sin fijación.

En una forma de realización de la invención, se prefiere que una citocina comprendida por una composición de la invención potencie una respuesta inmunitaria de Th1, es decir, la generación de células T que expresan citocinas de Th1 tales como IL-2 e IFN-\gamma. En otra forma de realización, se prefiere que una citocina comprendida por una composición de la invención potencie una respuesta inmunitaria de Th2, es decir, la generación de células T que expresan citocinas de Th2 tales como IL-4 y IL-10.

La citocina es una citocina obtenida mediante ingeniería genética. Se prefiere que la citocina no se produzca de manera natural de una forma asociada a la membrana, o que no se produzca de manera natural de una forma unida a lípidos. Se prefiere que la citocina sea bioactiva. Se prefiere además que la citocina sea sumamente bioactiva. Se prefiere incluso más que la citocina sea extremadamente bioactiva. Lo que más se prefiere es que la citocina sea bioactiva o suprabioactiva de manera nativa.

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Se prefiere que la citocina sea una citocina obtenida mediante ingeniería genética que comprende un resto de GPI en su extremo carboxilo terminal, y que el extremo carboxilo terminal contribuya a la unión a y/o a la señalización a través de un receptor para la citocina. La contribución del extremo carboxilo terminal puede delinearse mediante la construcción de mutantes recombinantes en los que la forma nativa o que se produce de manera natural (es decir, no obtenida mediante ingeniería genética) de la citocina está truncada en su extremo carboxilo terminal en aproximadamente de cinco a cincuenta aminoácidos. Si la unión a un receptor o la lectura en un ensayo de bioactividad disminuyen en por lo menos aproximadamente el 20% en comparación con la forma de la citocina nativa no truncada o que se produce de manera natural, entonces el extremo carboxilo terminal contribuye a la unión a y/o a la señalización a través de un receptor para la citocina. Alternativamente, se mezcla un anticuerpo monoclonal específico para el extremo carboxilo terminal (es decir, hasta aproximadamente 50 aminoácidos) con la citocina en un ensayo de unión al receptor o bioensayo. Si disminuye la unión a un receptor o la lectura en un ensayo de bioactividad en por lo menos aproximadamente el 20% en comparación con la citocina en ausencia del anticuerpo, entonces el extremo carboxilo terminal contribuye a la unión a y/o a la señalización a través de un receptor para la citocina. Un experto en la materia conoce bien ambas metodologías

Preferentemente, la opsonina de una célula mejorada en opsonina es una de cadena alfa de C3b o proteína de unión a manosa.

Si la opsonina es un fragmento de C3, se prefiere que se una a CR1 con una afinidad superior que a CR2. Se prefiere además que el fragmento de C3 no sea un ligando para CR2. Preferentemente, la opsonina no es ni C3bi ni C3d ni C3dg.

Preferentemente, el antígeno de una composición de la invención es una célula patogénica, que puede ser una célula tumoral que es maligna. Tal como se utiliza en la presente memoria, "maligno" se refiere a un derivado de un tumor que comprende células que presentan la capacidad para invadir el tejido circundante.

Células tumorales que son útiles según la invención incluyen pero no se limitan a células B16 y células de fibrosarcoma murino CMS-5, y células derivadas de tumores incluidos en la sección titulada tumores para los que la invención es útil.

La invención comprende asimismo una célula recubierta con citocina patogénica que contiene un antígeno seleccionado y un ácido nucleico recombinante que codifica para una opsonina, en la que la célula expresa la opsonina codificada, en la que la opsonina se selecciona de entre el grupo constituido por: vitronectina, fibronectina, componentes del complemento C1q, cadena de C1qA, cadena de C1qB, cadena de C1qC, fragmentos del complemento C3b, C3bi, C3d, C3dg y C4b, proteína de unión a manosa, conglutinina, proteínas tensioactivas A y D, alfa-2-macroglobulina, e inmunoglobulinas y opsoninas obtenidas mediante ingeniería genética.

Preferentemente, la célula patogénica es una célula tumoral que puede ser maligna.

Se prefiere que la célula patogénica se seleccione de entre el grupo constituido por: una bacteria patogénica, un hongo patogénico, un virus patogénico, una célula de un parásito patogénico, una célula de un artrópodo patogénico. Cuando la invención comprende una composición de vacuna que comprende un patógeno bacteriano mejorado en opsonina, se prefiere que las células administradas comprendan células patogénicas mejoradas en opsonina.

Preferentemente, la célula huésped es cualquier célula recubierta con citocina que puede actuar como un vehículo para el antígeno, y por tanto puede ser una célula nucleada o una célula procariota. En este aspecto de la invención, no es necesario que la célula huésped sea patogénica, sino que puede ser cualquier célula en la que se introduce artificialmente ácido nucleico. Tales células incluyen, pero no se limitan a, un fibroblasto, incluyendo una célula mesenquimatosa especializada tal como un sinoviocito; un queratinocito, una célula epitelial, una célula endotelial, un leucocito, una célula tumoral, una célula bacteriana, una célula de un hongo, una célula de un parásito.

La invención comprende una composición que comprende una célula mezclada con una citocina obtenida mediante ingeniería genética.

Preferentemente, la célula es una célula patogénica.

Se prefiere que las composiciones de la invención comprendan además células mejoradas en opsonina, tal como se describe en el documento de Segal, WO 9735619.

Preferentemente, la composición está sustancialmente libre de medio de cultivo. Tal como se utiliza en la presente memoria, "medio de cultivo" se refiere a un medio que se utiliza en cultivo celular que contiene por lo menos el 2% suero de animal, tal como suero bovino fetal.

La invención comprende asimismo una composición que comprende una célula recubierta con citocina, mezclada con una opsonina, en la que la célula sustancialmente no puede dividirse in vitro.

Preferentemente, la composición está sustancialmente libre de medio de cultivo.

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La invención comprende asimismo una composición que comprende una célula recubierta con citocina que comprende un antígeno heterólogo, mezclado con una opsonina exógena que puede unirse a la célula recubierta con citocina o bien a través de unión covalente o bien a través de una interacción de unión receptor-ligando, por ejemplo, una interacción entre un dominio de lectina de una opsonina colectina y un hidrato de carbono en la superficie de una célula que contiene antígeno (por ejemplo, una célula recubierta con citocina).

Preferentemente, la célula no puede dividirse en un huésped mamífero.

Las composiciones de la invención pueden incluir asimismo una segunda citocina, que se mezcla preferentemente con la célula o se expresa por la célula. También se prefiere que la segunda citocina sea una citocina obtenida mediante ingeniería genética.

La invención también comprende una composición de vacuna que comprende células recubiertas con citocina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, la composición comprende además células mejoradas en opsonina.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "vacunación" se refiere a modular una respuesta inmunitaria contra un antígeno seleccionado de manera que la respuesta sea más o menos eficaz, más o menos rápida, superior o inferior en magnitud y/o más o menos fácilmente inducida que la respuesta obtenida a partir de la administración de una muestra repetida de células correspondientes que son idénticas en todos los aspectos, excepto en que no son células de la presente invención por ejemplo, células recubiertas con citocina y/o mejoradas en opsonina o APC que presentan internalizada una célula recubierta con citocina. En una forma de realización preferida, vacunación se refiere a modular una respuesta inmunitaria contra un antígeno seleccionado de manera que la respuesta sea entre aproximadamente el 5 y el 100%, o preferentemente entre aproximadamente el 5 y el 50% o más preferentemente entre aproximadamente el 5 y el 25% más o menos eficaz, más o menos rápida, superior o inferior en magnitud y/o más o menos fácilmente inducida que la respuesta obtenida a partir de la administración de una muestra repetida de células correspondientes que son idénticas en todos los aspectos, excepto en que no son células de la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "composiciones de vacuna" se refiere a una composición cuya administración constituye la vacunación (tal como se define en la presente memoria) del sujeto. En una forma de realización preferida, una composición de vacuna se refiere a una composición que comprende una célula recubierta con citocina; una célula recubierta con citocina, mejorada en opsonina; una célula APC que se ha puesto en contacto o bien con una célula recubierta con citocina o bien con una célula recubierta con citocina, mejorada en opsonina que puede modular una respuesta inmunitaria contra un antígeno seleccionado de manera que la respuesta sea aproximadamente entre el 5 y el 100%, o de manera preferida aproximadamente entre el 5 y el 50%, o de manera más preferible aproximadamente entre el 5 y el 25% más o menos eficaz, más o menos rápida, superior o inferior en magnitud y/o más fácilmente inducida que la respuesta obtenida a partir de la administración de células correspondientes que son idénticas en todos los aspectos, excepto en que no son células recubiertas con citocina; células recubiertas con citocina, mejoradas en opsonina; o células APC que se han puesto en contacto o bien con una célula recubierta con citocina o bien con células recubiertas con citocina, mejoradas en opsonina.

La expresión "modular la respuesta inmunitaria" puede referirse a la estimulación/activación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno seleccionado o puede referirse a la supresión, eliminación o atenuación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno seleccionado. En una forma de realización preferida, modular la respuesta inmunitaria se refiere a la estimulación/activación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno seleccionado en aproximadamente por lo menos el 5%, o preferentemente entre el 5 y el 50% o más preferentemente entre el 50 y el 100%, en comparación con una respuesta inmunitaria en ausencia de vacunación, o puede referirse a la supresión, eliminación o atenuación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno seleccionado en aproximadamente por lo menos el 5%, o preferentemente entre el 5 y el 50% o más preferentemente entre el 50 y el 100%, en comparación con una respuesta inmunitaria en ausencia de vacunación.

Una célula "patogénica" es una célula que, en una forma que se produce de manera natural, puede producir enfermedad, por ejemplo, una célula tumoral, una célula T autorreactiva, una bacteria patogénica, un hongo patogénico o una célula de un parásito patogénico. Para los fines de la invención, un virus patogénico es una célula patogénica. Una célula patogénica puede modificarse mediante atenuación, inactivación o eliminación de la bacteria, el hongo, el parásito o el virus patogénicos.

"Opsonina", "antígeno" o "citocina" exógenos, se refiere a una opsonina, antígeno o citocina que se introduce desde o se produce fuera de la célula.

"Opsonina", "antígeno" o "citocina" endógenos, se refiere a una opsonina, antígeno o citocina, que es la forma nativa de una opsonina, antígeno o citocina que se expresa o se presenta de manera natural en una célula.

"Opsonina", "antígeno" o "citocina" heterólogos, se refiere a una opsonina, antígeno o citocina, que no se expresa de manera natural en una célula.

Una opsonina de una célula mejorada en opsonina puede expresarse como una molécula citoplasmática, de la superficie celular o secretada. Sin embargo, se prefiere que la opsonina se exprese como una molécula de la superficie celular o secretada.

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Se prefiere que el antígeno y la opsonina no sean idénticos. También se prefiere que el antígeno y la citocina no sean idénticos. Se prefiere además que la citocina y la opsonina no sean idénticas.

En otra forma de realización preferida, la citocina es una citocina obtenida mediante ingeniería genética que contiene un segmento transmembrana. Tal como se utiliza en la presente memoria, "segmento transmembrana" se refiere a la región hidrófoba de una proteína transmembrana que pasa a través de la membrana celular e interacciona con las colas hidrófobas de la molécula lipídica en el interior de la bicapa de la membrana celular.

En otra forma de realización preferida, la citocina es una citocina obtenida mediante ingeniería genética y comprende un lípido. Todavía en otra forma de realización preferida, el lípido está unido a la citocina a través de un resto de glicosilfosfatidilinositol.

En una forma de realización preferida, la opsonina es una opsonina obtenida mediante ingeniería genética y comprende un lípido. En una forma de realización preferida adicional, la opsonina, por ejemplo, una colectina, puede unirse a las células de manera no covalente. Las células pueden procesarse, por ejemplo, mediante el tratamiento con una glicosiltransferasa o una glicosidasa, para facilitar una unión no covalente de este tipo.

Si la opsonina puede inactivarse por una molécula comprendida por la célula, como por ejemplo, C3b puede inactivarse por CD46, puede incluirse en la composición un inhibidor del inactivador, por ejemplo, un anticuerpo.

Pueden utilizarse estructuras de "tipo célula", es decir, estructuras que comprenden una membrana lipófila que secuestra un compartimento hidrófilo interno, en lugar de, es decir, como equivalente de, las células en los procedimientos y las composiciones de la invención. Los liposomas son estructuras de tipo célula particularmente útiles. Por tanto, la invención comprende un liposoma que contiene un antígeno y que se mezcla con una citocina obtenida mediante ingeniería genética unida a lípidos.

El término "citocina" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de polipéptido que se secreta de manera natural por células de mamífero y que se une a un receptor de la superficie celular en un leucocito, induciendo un cambio (por ejemplo, un cambio en el estado proliferativo, un cambio en el perfil de transcripción o un cambio en la propensión a migrar) en el leucocito (distinto a la mera ocupación de los receptores del leucocito para la citocina). "Cambio" se refiere por lo menos a aproximadamente un aumento o una disminución del 5% en comparación con en ausencia de una citocina. El término "citocina" también se refiere en la presente memoria a una molécula de polipéptido que es un ligando para un receptor para una citocina que se produce de manera natural. A diferencia de una opsonina, una citocina no se une al mismo tiempo de manera natural a un antígeno y a un receptor de la superficie celular.

Ejemplos de citocinas que son útiles en los procedimientos y las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitarse a las siguientes: GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, ligandos para receptores de hematopoyetina, ligandos para receptores de la superfamilia de inmunoglobulinas, ligandos para receptores de interferón, ligandos para receptores de TNF y ligandos para receptores de quimiocina. Un anticuerpo contra un receptor de citocina también puede ser una citocina.

La expresión "Citocinas obtenidas mediante ingeniería genética" tal como se describe en la presente memoria se refiere a citocinas que comprenden un resto heterólogo de unión a la membrana celular.

El término "opsonina" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a moléculas que se producen de manera natural y que no se producen de manera natural que pueden actuar, en virtud de estar asociadas o unidas al mismo tiempo tanto a una célula que contiene antígeno como a una célula presentadora de antígenos (APC), como un agente ligador o de acoplamiento (un adaptador) entre el antígeno y la APC para permitir una unión, envolvimiento e internalización más eficaz de la célula que contiene antígeno por la APC. Una opsonina útil según la invención, también incluye opsoninas que no se producen de manera natural que pueden unirse a APC a través de receptores que pueden unirse a opsoninas que se producen de manera natural.

El término "opsonina" tal como se utiliza en la presente memoria también puede referirse a moléculas que pueden procesarse de manera que por lo menos un producto de la etapa o etapas de procesamiento puede actuar, en virtud de estar asociadas o unidas al mismo tiempo tanto a una célula que contiene antígeno como a una APC, como un agente ligador o de acoplamiento para permitir una unión, envolvimiento e internalización más eficaz de otras células que contienen antígeno por la APC. Una opsonina también puede ser cualquier cadena de polipéptido de una opsonina de múltiples cadenas.

Ejemplos de opsoninas que son útiles en los procedimientos y las composiciones de la invención incluyen las siguientes: vitronectina, fibronectina, componentes del complemento tales como C1q (incluyendo cualquiera de sus cadenas de polipéptido componentes A, B y C), fragmentos del complemento tales como C3d, C3b y C4b, proteína de unión a manosa, conglutinina, proteínas tensioactivas A y D, proteína reactiva C (CRP), alfa-2-macroglobulina, e inmunoglobulinas, por ejemplo, la parte Fc de una inmunoglobulina.

Las "Opsoninas innatas" son opsoninas del sistema inmunitario innato y se conocen en la materia como moléculas de polipéptido secretadas del sistema inmunitario innato y se cree que se unen al mismo tiempo a un antígeno y a la superficie de una APC. Por tanto, pueden actuar como "puentes" y se cree, en virtud de esta propiedad, que potencian la internalización de antígenos por las APC. El modo en el que las opsoninas se unen a los antígenos varía entre las opsoninas, y puede ser covalente o no covalente. En general, los restos unión a antígeno de las opsoninas innatas difieren de los restos unión a antígeno de las inmunoglobulinas en que los primeros son relativamente invariables entre miembros de la misma especie y no experimentan diversificación durante la ontogenia de un individuo.

Una molécula que contiene un resto de unión a APC que se produce de manera natural se considerará una opsonina si contiene un resto a través del cual puede asociarse o unirse establemente a una célula de manera que el resto de unión a APC esté situado en el espacio extracelular, contenga o no la molécula de opsonina su dominio de unión a antígeno natural.

Las "Opsoninas obtenidas mediante ingeniería genética", tal como se describe en la presente memoria, incluyen moléculas en las que un resto de unión a la membrana celular se sustituye por el dominio de unión a antígeno natural de una opsonina o cuando un resto de unión a la membrana celular se une a la opsonina sin modificación ni eliminación del dominio de unión a antígeno natural de la opsonina.

Un "resto de unión a la membrana celular" de una opsonina obtenida mediante ingeniería genética, una citocina obtenida mediante ingeniería genética, es decir, un resto a través del cual puede unirse establemente una molécula a una célula, incluye pero sin limitarse a restos de reticulación y restos lipídicos. Se prefiere que el resto de unión a la membrana celular se una a una célula mediante un medio distinto a la interacción de un polipéptido con su polipéptido de la superficie celular cognado. Se prefiere además que el resto de unión a la membrana celular sea un resto no polipeptídico. En una forma de realización preferida, un resto lipídico se une a la molécula obtenida mediante ingeniería genética a través de un resto de glicosilfosfatidilinositol (GPI). En otra forma de realización preferida, el lípido comprende un ácido graso, por ejemplo, palmitato. Todavía en otra forma de realización preferida de la invención, el resto de unión a la membrana celular se une a la opsonina o a la opsonina truncada en el dominio de unión a antígeno en el extremo de unión a antígeno de la opsonina. En otra forma de realización preferida, la opsonina obtenida mediante ingeniería genética comprende una parte idiotípica de una inmunoglobulina que puede unirse a una APC.

Se prefiere que las opsoninas se unan a receptores que desencadenan la fagocitosis y que no son clonotípicos y, por tanto, que no varían de una célula a otra como, por ejemplo, lo hacen los receptores clonotípicos. Los receptores no clonotípicos están presentes en células que desempeñan un papel en la inmunidad innata e incluyen, por ejemplo, los receptores no idiotípicos. Ejemplos de tales receptores incluyen el receptor de CR1, CR2, CR3, CR4 y C1q, los receptores que contienen un componente del receptor de C1q, los receptores de colectina, los receptores para \alpha2m, los receptores para CRP y los receptores de Fc para inmunoglobulinas.

El término "antígeno" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula que puede iniciar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular en un receptor del antígeno. Los antígenos pueden ser cualquier tipo de molécula biológica incluyendo, por ejemplo, metabolitos intermediarios simples, azúcares, lípidos y hormonas así como macromoléculas tales como hidratos de carbono complejos, fosfolípidos, ácidos nucleicos y proteínas. Las categorías comunes de antígenos incluyen, pero sin limitarse a, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, protozoos y otros antígenos parasitarios, antígenos tumorales, antígenos implicados en la enfermedad autoinmunitaria, la alergia y el rechazo de injertos y otros antígenos variados. En las composiciones y los procedimientos de la invención, se prefiere que el antígeno sea un polipéptido, por ejemplo, uno que comprende por lo menos siete aminoácidos.

Las células recubiertas con citocina de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, para modular una respuesta inmunitaria en un ser humano frente a un antígeno o antígenos contenidos en las células. Las células se administran a un mamífero, preferentemente a un ser humano, y se captan (es decir, se ingieren o se fagocitan) por las células presentadoras de antígeno o se ponen en contacto mediante otros leucocitos, por ejemplo, linfocitos o granulocitos. Alternativamente, las células se ponen en contacto con células presentadoras de antígeno in vitro que condiciones que permiten la fagocitosis.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "célula presentadora de antígenos" o "APC" se refiere a células que ingieren y presentan el antígeno a las células T. Estas células incluyen leucocitos, monocitos, macrófagos y células dendríticas fagocíticas (por ejemplo, células de Langerhans de la piel), linfocitos B y células endoteliales. Una "APC profesional" es una APC que puede activar constitutivamente un linfocito T. Las células APC profesionales normalmente expresan constitutivamente moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II y moléculas coestimuladoras tales como B7-1 y/o B7-2.

Las composiciones de vacuna de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, para modular una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como un ser humano.

Descripción

La invención también se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente e inesperado de que las células que portan una citocina de la superficie celular pueden, cuando se administran a un sujeto, modular la respuesta inmunitaria en el receptor frente a un antígeno o antígenos contenidos en o unidos a las células. Por tanto, la invención se refiere a versiones unidas a la membrana de tales moléculas. Además, tales células ofrecen ventajas sorprendentes con respecto a las células que expresan la misma citocina en una forma soluble o a las células que se mezclan con la misma citocina en forma soluble. La invención proporciona resultados inesperados porque la técnica anterior enseña que el extremo carboxilo terminal de algunas citocinas, tal como GM-CSF, es importante para la interacción con un receptor cognado, y porque los restos de GPI se unen a los extremos carboxilo terminales de las proteínas, y por tanto la expectativa de que una proteína heteróloga unida a GPI interfiera con la unión de una citocina tal como GM-CSF a su receptor. Además, la técnica anterior enseña que muchas citocinas, tales como las quimiocinas, ejercen sus actividades a través de gradientes de concentración.

Las citocinas unidas a la membrana ofrecen varias ventajas con respecto a las citocinas solubles. Las citocinas unidas a la membrana no difunden hacia la circulación sistémica en un grado tan grande como las citocinas solubles y, por tanto, plantean menos riesgo de toxicidad sistémica. Además, la yuxtaposición próxima de una citocina unida a la membrana a una célula, en comparación con una citocina soluble mezclada, permite la modulación superior de una respuesta inmunitaria frente a un antígeno comprendido por la célula. Además, las células recubiertas con citocinas que comprenden citocina exógena obtenida mediante ingeniería genética pueden prepararse más rápidamente y con menos esfuerzo que las células transducidas con un gen de citocina heterólogo.

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Citocinas útiles según la invención

El término "citocina" tal como se define anteriormente en la presente memoria se refiere a una molécula de polipéptido que se secreta de manera natural por células de mamífero y que se une a un receptor de la superficie celular en un leucocito. El término "citocina" también se refiere en la presente memoria a una molécula de polipéptido que es un ligando para un receptor para una citocina que se produce de manera natural. A diferencia de una opsonina, una citocina no se une de manera natural al mismo tiempo a un antígeno y a un receptor de la superficie celular.

Los leucocitos que portan receptores para citocinas incluyen, por ejemplo, monocitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, plaquetas, linfocitos, linfocitos T, linfocitos B, células citolíticas, células de mieloma, células de linfoma y células leucémicas.

Sin querer restringirse a ningún mecanismo, se cree que las citocinas asociadas a la superficie celular proporcionan una ventaja con respecto a las citocinas que pueden difundir libremente permitiendo la yuxtaposición estable de la citocina a la célula, por tanto, aumentando la concentración de la citocina en las proximidades de la célula.

Las citocinas preferidas son citocinas que no son de roedores, por ejemplo, de primate, por ejemplo, las citocinas humanas.

Puede considerarse que algunas citocinas pertenecen a una o más familias de citocinas basándose en las propiedades estructurales y/o funcionales. Una de tales familias consiste en las interleucinas. Las interleucinas son estructuralmente diversas, pero comparten la propiedad tanto de expresarse como de actuar en los leucocitos. Ejemplos de interleucinas incluyen IL-1 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank M15330, M28983, E04743, M15131), IL-2 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank E01108, K02797), IL-3 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank A02046, M14743), IL-4 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por M13982, M25892), IL-5 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por X06270, J03478), IL-6 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por E02772, M20572), IL-7 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por J04156, M29054-29057), IL-8 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por M28130), IL-9 (por ejemplo, las secuencias dadas a conocer en Kelleher et al, Blood. 1991; 77: 1436-1441, Immunogenetics 1990;31(4):265-270), IL-10 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por M84340, U16720), IL-11 (por ejemplo, las secuencias dadas a conocer en Paul et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87: 7512-7516, Morris et al, Exp Hematol. 1996; 24: 1369-1376), IL-12 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank M86671, S82412; las proteínas de Genbank P29459, P29460), IL-13 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por U31120, L13028), IL-14 (por ejemplo, las secuencias dadas a conocer en Ambrus et al, Proceedings of the National Academy of Science (USA) 1993; 90: 6330-4), IL-15 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por AF031167, U22339), IL-16 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por AF006001, M90391), IL-17 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por U32659, U43088), IL-18 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por D49949, D49950), TNF-\alpha (por ejemplo, los polipéptidos codificados por M16441, Y00467) y GM-CSF (por ejemplo, los polipéptidos codificados por X03019, M11220) y sus homólogos entre especies. Las secuencias de nucleótidos que codifican para los homólogos hibridarán entre sí en condiciones de rigurosidad de moderada a alta.

Otra familia consiste en las hematopoyetinas. Los miembros de esta familia comprenden cuatro regiones de \alpha-hélice, conocidas como hélices A, B, C y D. Las hélices A y B y las hélices C y D discurren aproximadamente paralelas entre sí, respectivamente. Ejemplos de hematopoyetinas incluyen IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, G-CSF (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank E01219, M13926), oncostatina M (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank D31942, las secuencias dadas a conocer en Malik et al, Mol Cell Biol 1989;9: 2847-2853), LIF (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank X13967, X06381), CNTF (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank U05342, X60542) y sus homólogos entre especies. Las secuencias de nucleótidos que codifican para los homólogos hibridarán entre sí en condiciones de rigurosidad de moderada a alta.

La IL2 humana es una proteína de 133 aminoácidos (15,4 kDa) con un pI ligeramente básico. La IL2 murina y humana presentan una homología de aproximadamente el 65%. La IL2 se sintetiza como una proteína precursora de 153 aminoácidos con los primeros 20 aminoácidos amino terminales que funcionan como una secuencia señal de secreción hidrófoba. La proteína contiene un único puente disulfuro (posiciones Cys58/105) esencial para la actividad biológica.

La IL2 está O-glicosilada en la treonina en la posición 3. Las variantes con diferentes masas moleculares y cargas se deben a glicosilación variable. La IL2 no glicosilada también es biológicamente activa. La glicosilación parece potenciar la eliminación del factor por los hepatocitos.

Se ha demostrado que una forma dimérica de la IL2 humana, producida por la acción de una transglutaminasa aislada de nervios ópticos de peces en regeneración, es un factor citotóxico para oligodendrocitos de cerebro de rata en cultivo.

El gen de la IL2 humana contiene cuatro exones. El gen de la IL2 mapea en el cromosoma humano 4q26-28 (cromosoma murino 3). La homología de la IL2 murina y humana es del 72% a nivel de nucleótidos en la región de codificación.

Las actividades biológicas de IL2 están mediadas por un receptor de membrana que se expresa casi exclusivamente en las células T activadas, pero no en las que están en reposo, a densidades de 4-12x10^{3} receptores/célula. Las células B activadas y los leucocitos mononucleares en reposo raramente expresan este receptor. La expresión del receptor de IL2 está modulada por IL5 e IL6. Se distinguen tres tipos diferentes de receptores de IL2 que se expresan diferenciada e independientemente. La alta afinidad del receptor de IL2 (Kdis \sim 10 pM) constituye aproximadamente el 10% de todos los receptores de IL2 expresados por una célula. Este receptor es un complejo receptor de membrana que consiste en dos subunidades IL2R-alfa (antígeno TAC = antígeno de activación de células T; p55) y IL2R-beta (p75; CD122) como los dominios de unión a ligando y una cadena gamma como componente de señalización. p75 se expresa constitutivamente en linfocitos T, células citolíticas en reposo y varios de otros tipos de células, mientras que la expresión de p55 normalmente sólo se observa tras la activación celular. Sin embargo, p55 se sintetiza constitutivamente por varias células tumorales y por células infectadas por HTLV-1.

La expresión del receptor de IL2 de los monocitos está inducida por el IFN-gamma, de modo que estas células se vuelven citotóxicas para los tumores. En las células T puede reducirse la expresión de p75 por la IL3. Un receptor de IL2 de afinidad intermedia (Kdis =100 pM) consiste en la subunidad p75 y una cadena gamma (véase más adelante) mientras que un receptor de baja afinidad (Kdis =10 nM) está formado por p55 solo.

p55 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por el número de registro de Genbank X01057) presenta una longitud de 251 aminoácidos con un dominio extracelular de 219 aminoácidos y un dominio citoplasmático muy corto de 13 aminoácidos. El gen de p55 mapea en el cromosoma humano 10p14-p15.

p75 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank M26062, M28052) presenta una longitud de 525 aminoácidos con un dominio extracelular de 214 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 286 aminoácidos. El gen de p75 contiene 10 exones y presenta una longitud de aproximadamente 24 kb. Mapea en el cromosoma humano 22q11. 2-q12 y en el cromosoma murino 15 (banda E).

Se ha descrito una tercera subunidad de 64 kDa del receptor de IL2, denominada gamma (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank D13821, D11086). Las subunidades gamma murina y humana del receptor presentan aproximadamente un 70% de identidad de secuencia a los niveles de nucleótido y aminoácido. Se requiere esta subunidad para la generación de receptores de IL2 de afinidad alta e intermedia pero no se une a la IL2 por sí misma. Estos dos tipos de receptor consisten en un heterotrímero alfa-beta-gamma y en un heterodímero beta-gamma, respectivamente. El gen que codifica para la subunidad gamma del receptor de IL2 mapea en el cromosoma humano Xq13, abarca aproximadamente 4,2 kb y contiene ocho exones. Recientemente se ha demostrado que la subunidad gamma del receptor de IL2 es un componente de los receptores para IL4 e IL7. También se cree que es un componente del receptor de IL13.

Los aminoácidos en las posiciones 267-317 que se sitúan directamente adyacentes a la región transmembrana de p75 están implicados en la transducción de señales mediada por IL2. Además, el receptor de IL2 está asociado con varias de otras proteínas (p22, p40, p100) que se cree que están implicadas en la mediación de cambios conformacionales en las cadenas del receptor, en la endocitosis mediada por receptor y además en los procesos de transducción de señales. Una de las proteínas identificadas es la molécula de adhesión celular de 95 kDa, ICAM-1, que probablemente se centra en los receptores de IL2 en las regiones de contactos célula-célula y, por tanto, puede mediar en actividades paracrinas, por ejemplo, durante la estimulación de células T mediada por IL2. Otra proteína asociada con p75 es una proteína cinasa específica de tirosina denominada lck. La observación de que la proliferación de células inducida por IL2 se inhibe por inhibidores específicos de proteínas tirosina cinasas en una línea celular negativa para lck sugiere que otras cinasas también pueden asociarse con receptores de IL2. Se han identificado dos de tales cinasa, denominadas fyn y lyn. Además, la señalización del receptor de IL2 también puede estar mediada por
vav.

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Los linfocitos activados secretan continuamente un fragmento de 42 kDa del antígeno TAC. Este fragmento circula en el suero y el plasma y funciona como un receptor de IL2 soluble (sIL2R). Las concentraciones de este receptor soluble varían marcadamente en diferentes situaciones patológicas, por ejemplo, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, leucemias o tras el transplante de órganos. Los niveles pueden aumentar hasta 100 veces. Los niveles de sIL2R parecen correlacionarse con la gravedad de las enfermedades inducidas por el VIH y también pueden ser de valor diagnóstico en otros entornos.

La IL2 de ratón y humana producen ambas la proliferación de células T de las especies homólogas con alta eficacia. La IL2 humana también estimula la proliferación de células T de ratón a concentraciones similares, mientras que la IL2 de ratón estimula las células T humanas con una eficacia inferior (de seis a 170 veces).

La IL2 es un factor de crecimiento para todas las subpoblaciones de linfocitos T. Es un factor de proliferación no específico de antígeno para células T que induce la progresión del ciclo celular en células en reposo y por tanto permite la expansión clonal de linfocitos T activados. Este efecto está modulado por hormonas tales como prolactina.

La IL2 también potencia la proliferación de células B activadas, esto también requiere la presencia de factores adicionales, por ejemplo, IL4.

Debido a sus efectos sobre las células T y las células B, la IL2 es un regulador fundamental de las respuestas inmunitarias. También desempeña un papel en las reacciones antiinflamatorias, en la hematopoyesis y en la vigilancia tumoral. La IL2 estimula la síntesis de IFN-gamma en los leucocitos periféricos y también induce la secreción de IL1, TNF-alfa y TNF-beta.

Se cree que la inducción de la secreción de citocinas tumoricidas aparte de la actividad en la expansión de células LAK (células citolíticas activadas por linfocinas) probablemente son los factores principales responsables de la actividad antitumoral de IL2.

La IL2 puede someterse a ensayo en bioensayos que emplean líneas celulares que responden al factor (por ejemplo, ATH8, CT6, CTLL-2, FDCPmix, HT-2, NKC3, TALL-103). También están disponibles ensayos ELISA específicos para IL2 e inmunoensayos de enzimas para el receptor soluble. El receptor soluble también puede detectarse empleando IL2 biotinilada y citometría de flujo o ensayos ELISA.

La IL2 presenta actividad antitumoral significativa para una variedad de tipos de células tumorales dado que soporta la proliferación y la expansión clonal de las células T que atacan específicamente a ciertos tumores. La IL2 se utiliza cada vez más para tratar pacientes con cánceres que no responden al tratamiento convencional. La terapia de combinación con IL2 administrada sistémicamente ha dado como resultado remisiones a largo plazo en el 30% de los pacientes con carcinoma metastásico de células renales, para el que no hay tratamiento convencional. También se han documentado respuestas clínicas objetivo y de larga duración en una proporción de pacientes con melanoma o leucemia mielocítica aguda.

La terapia con IL2 sistémica de dosis alta también está asociada con un gran número de efectos secundarios tóxicos no deseados. La IL2 tiene efectos adicionales sobre otros componentes del sistema inmunitario celular, incluyendo células B y macrófagos, e induce la secreción de otros mediadores solubles, incluyendo TNF-alfa, TNF-beta e IFN-gamma. Estos efectos pueden contribuir a la actividad antitumoral de IL2, así como a su toxicidad relacionada con la dosis.

Se ha demostrado que la transducción de células tumorales murinas con un gen funcional de IL2 conduce al rechazo de las células genéticamente modificadas mediante huéspedes singénicos. Las células tumorales alteradas que expresan IL2 también aumentan la inmunidad sistémica.

La IL4 humana es una proteína de 129 aminoácidos (20 kDa) que se sintetiza como un precursor que contiene una secuencia señal de secreción hidrófoba de 24 aminoácidos. La IL4 está glicosilada en dos residuos de arginina (las posiciones 38 y 105) y contiene seis residuos de cisteína implicados en la formación de puentes disulfuro. Los puentes disulfuro son esenciales para la actividad biológica. Se han descrito algunas variantes de glicosilación de IL4 que difieren en sus actividades biológicas. Una comparación de la IL4 murina y humana muestra que ambas proteínas sólo divergen en las posiciones 91-128.

Una variante de IL4, Y124D, en la que la Tyr124 de la proteína humana recombinante está sustituida por un residuo de ácido aspártico, se une con alta afinidad al receptor de IL4 (Kd = 310 pM). Esta variante es un potente antagonista para el sistema de receptor de IL4. No conserva actividad proliferativa detectable para las células T e inhibe competitivamente la proliferación de células T dependiente de IL4 (K(i) = 620 pM). La existencia de este mutante de muestra que la unión de alta afinidad y la generación de señales pueden desacoplarse eficazmente en un ligando. Y124D también actúa como un antagonista poderoso para el receptor de IL13.

El gen de la IL4 humano contiene cuatro exones y presenta una longitud de aproximadamente 10 kb. Mapea en el cromosoma 5q23-31. El gen murino mapea en el cromosoma 11. El gen de IL4 está en proximidad cercana con otros genes que codifican para factores de crecimiento hematopoyéticos (por ejemplo, GM-CSF, M-CSF, IL3, IL5). La distancia entre el gen de IL4 y el de IL5 es de aproximadamente 90-240 kb.

A nivel de nucleótidos, el gel de IL4 humano y murino presentan aproximadamente un 70% de homología. La región en 5' de la IL4 contiene varios elementos de secuencia, denominados CLE (elemento de linfocina conservado), que son sitios de unión para factores de transcripción que controlan la expresión de éste y otros genes. Un motivo de secuencia, denominado secuencia P (CGAAAATTTCC) en la región de 5' del gen de IL4 humano (posiciones -79 - - 69) es el sitio de unión para un factor nuclear, denominado NF(P), que media en la respuesta a señales de activación de las células T. Las actividades biológicas de IL4 están mediadas por un receptor específico (Kdis =20-100 pM) que se expresa a densidades de 100-5000 copias/célula (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank M29854, X52425). El dominio extracelular del receptor de IL4 está relacionado con los receptores para eritropoyetina (Epo), IL6 y la cadena beta del receptor de IL2. Se le ha dado el nombre CD124.

El ADNc para el receptor de IL4 murino codifica para una proteína transmembrana de 810 aminoácidos (incluyendo una secuencia señal de secreción). Este receptor presenta un gran dominio intracelular de 553 aminoácidos. El receptor humano presenta un dominio extracelular de 207 aminoácidos, un dominio transmembrana de 24 residuos y un gran dominio intracelular de 569 aminoácidos.

Recientemente, se ha demostrado que el receptor de IL4 contiene la subunidad gamma del receptor de IL2 como un componente de señalización. Esta subunidad gamma también está asociada con los receptores para IL4 e IL7 y probablemente también de IL13. Se han descrito dos formas del receptor, uno de los cuales se secreta. El receptor secretado sólo contiene el dominio de unión a IL4 extracelular y puede bloquear las actividades de IL4. También se ha demostrado que una proteína de unión a IL4 (IL4-BP) que se une a IL4 con la misma afinidad que el receptor de IL4 es un receptor soluble de la variante de IL4. Estos receptores solubles probablemente funcionan como reguladores fisiológicos de actividades de citocina inhibiendo la unión a receptor o actuando como proteínas transportadoras. También se han descrito receptores solubles o proteínas de unión para IL1 (antagonista del receptor de IL1), IL2, IL6, IL7, TNF-alfa, IGF e IFN-gamma.

Las actividades biológicas de IL4 son específicas de especie; la IL4 de ratón es inactiva en células humanas y la IL4 humana es inactiva en células murinas. La IL4 potencia la proliferación y la diferenciación de las células B activadas, la expresión de los antígenos del MHC de clase II y de los receptores de IgE de baja afinidad en las células B en reposo. La IL4 estimula la expresión de los antígenos del MHC de clase II en las células B. Puede potenciar su capacidad para responder a otros estímulos de las células B y para presentar antígenos para las células T. Esto puede ser una forma de potenciar la expansión clonal de las células B específicas y, por tanto, el sistema inmunitario puede responder a concentraciones muy bajas de antígenos. La producción de IL4 por células distintas a las B y las T se estimula si estas células interaccionan con otras células a través de sus receptores de Fc para IgE o IgG. Este efecto puede estimularse mediante IL3. La IL2 y el PAF (factor activador de plaquetas) inducen la síntesis de IL4, mientras que TGF-beta la inhibe.

La IL3 antagoniza los efectos inducidos por IL2 en las células B y produce una lenta disminución de la expresión de los receptores de IL2, inhibiendo por tanto la proliferación de las células B humanas estimulada por IL2. En las células B activadas, IL4 estimula la síntesis de IgG1 e IgE e inhibe la síntesis de IgM, IgG3, IgG2a e IgG2b. Este cambio de isotipo inducido por IL4 en las células B se antagoniza por IFN-gamma. El crecimiento de mielomas múltiples puede suprimirse mediante IL4 que inhibe la síntesis de IL6, un factor de crecimiento de mielomas. La IL4 también inhibe la síntesis de IL6 en macrófagos alveolares humanos.

El pretratamiento de macrófagos con IL4 previene la producción de IL1, TNF-alfa y prostaglandinas en respuesta a la activación de las células por endotoxinas bacterianas o IFN-gamma.

La IL4 sinergiza con Epo y G-CSF/Epo en la generación de colonias que contienen células progenitoras eritroides o granulocitos en un ensayo de formación de colonias.

El procedimiento de detección clásico para IL4 es un ensayo de coestimulación de células B que mide la proliferación estimulada de células B purificadas estimuladas. La IL4 también puede detectarse en bioensayos, empleando células que responden a IL4 (por ejemplo, BALM-4; BCL1; CT.4S; CTL44; CTLL-2; Da; FDCPmix; HT-2; L4; L138.8A; MO7E; MC/9; NFS-60; Ramos, Sez627, TF-1; TS1). Un procedimiento de detección específico para la IL4 humana es la inducción de CD23 en varias líneas de células B, detectándose CD23 o bien mediante citometría de flujo o bien mediante un inmunoensayo de fluorescencia. Un inmunoensayo que permite la rápida determinación de la tasa de producción de IL4 en condiciones que previenen el consumo/degradación es el inmunoatrapamiento de citocina.

La IL4 inhibe el crecimiento de carcinomas mamarios y de colon. Se ha demostrado que aumenta el desarrollo de células LAK. Se ha demostrado que la transducción de células tumorales murinas con un gen de IL4 funcional conduce al rechazo de las células genéticamente modificadas por los huéspedes singénicos. Las células tumorales alteradas que expresan IL4 también aumentan la inmunidad sistémica. Ratones vacunados con células transducidas rechazan una exposición posterior de células no transducidas y, en algunos casos, un tumor preexistente.

La IL6 humana es una proteína de 185 aminoácidos glicosilada en las posiciones 73 y 172. Se sintetiza como una proteína precursora de 212 aminoácidos. Los monocitos expresan por lo menos cinco formas moleculares diferentes de IL6 con masas moleculares de 21,5-28 kDa. Difieren principalmente en las alteraciones postraduccionales tales como la glicosilación y la fosforilación.

La IL6 aislada de diversos tipos celulares muestra cierta microhetereogeneidad en su extremo N-terminal. Se ha observado una forma de 42-45 kDa en plasma que probablemente se compleja con una proteína transportadora, alfa-2-macroglobulina (\alpha2M). La IL6 murina y humana muestran un 65% de homología de secuencia a nivel del ADN y un 42% de homología a nivel de proteína. La IL6 es un miembro de una familia de citocinas que también incluye LIF, CNTF, oncostatina M, IL11 y CT-1. Todos los miembros conocidos de la familia de citocinas IL6 inducen la expresión hepática de proteínas en fase aguda.

Se ha utilizado una citocina de diseño estable y sumamente bioactiva que consiste en una proteína de fusión entre IL6 y un receptor de IL6 soluble, denominada H-IL6, para la expansión de células progenitoras hematopoyéticas humanas y que es útil en casos en los que las células no responden a IL6 pero requieren un complejo estable que consiste en IL6 y un receptor de IL6 soluble.

El gen de IL6 humano presenta una longitud de aproximadamente 5 kb y contiene cinco exones. Mapea en el cromosoma humano 7p21-p14 entre los marcadores D7S135 y D7S370. El gen murino mapea en el cromosoma 5. Las secuencias de nucleótidos de los genes de IL6 y G-CSF se asemejan entre sí de una forma que sugiere una posible relación evolutiva.

El receptor de IL6 (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank M20566, E03515) se expresa en células T, células B activadas por mitógeno, monocitos periféricos y algunos tipos de células tumorales derivados de macrófagos y células B. No se expresa en células B en reposo pero está en células T en reposo. En los hepatocitos, se estimula la expresión del receptor de IL6 tras el tratamiento con IL6 o IL1. En varios tipos celulares, la expresión del receptor de IL6 también se estimula por glucocorticoides. El gen del receptor de IL6 mapea en el cromosoma humano 1q21.

El receptor de IL6 es una proteína fuertemente glicosilada de 80 kDa y una longitud de 449 aminoácidos. Se ha denominado CD 126. Se sintetiza como un precursor de 468 aminoácidos. La estructura molecular se asemeja a la de los receptores para M-CSF, PDGF e IL1 en que el receptor contiene un dominio de secuencia de tipo inmunoglobulina en la región amino terminal del dominio de receptor extracelular.

El dominio intracelular del receptor de IL6 presenta una longitud de aproximadamente 82 aminoácidos y no muestra ninguna homología con otras proteínas implicadas en la transducción de señales intracelulares. Se han descrito dos formas diferentes del receptor que se unen a IL6 con diferentes afinidades (Kdis =10^{-9} y 10^{-11} M) y que lo más probablemente surgen mediante la modificación postraduccional de la misma proteína receptora. Las actividades biológicas de IL6 también se han encontrado a concentraciones de 10^{-13} -10^{-15} M lo que sugiere o bien la existencia de otras conformaciones de receptor de alta afinidad o bien la existencia de moléculas de receptor adicionales con afinidades superiores.

La transducción de señales mediada por el receptor de IL6 implica a la proteína cinasa C y también a la adenilato ciclasa.

El complejo formado entre la IL6 y su receptor se asocia con una glicoproteína transmembrana, gp130 (918 aminoácidos; dominio citoplasmático de 277 aminoácidos), que está implicado en la transducción de señales. La unión de IL6 a su receptor conduce a la homodimerización unida mediante puentes disulfuro de gp130 y a la activación asociada de una tirosina cinasa como la primera etapa de la transducción de señales. gp130 también se expresa en células que no expresan receptores de IL6. Se ha encontrado que es un componente de otros receptores, incluyendo los de IL11, LIF, oncostatina M y CNTF, y CT-1. Esto explica porqué LIF, CNTF e IL6 comparten muchas actividades biológicas aunque los propios factores no están relacionados entre sí. Se ha encontrado que un factor que se asemeja a las proteínas STAT, denominado factor LIL, está implicado en las rutas de señalización de IL6, y también de IL1 y los lipopolisacáridos bacterianos.

Asimismo, se ha descrito que una forma soluble del receptor de IL6 (IL6R-SUP (proteína urinaria soluble del receptor de IL6)) interacciona con gp130. Estos receptores solubles probablemente funcionan como reguladores fisiológicos de las actividades de citocina inhibiendo la unión al receptor o actúan como proteínas transportadoras. También se han descrito proteínas de unión o receptores solubles similares para IL1 (IL1ra, antagonista del receptor de IL1), IL2, IL4, IL7, TNF-alfa, IGF e IFN-gamma.

Algunas células, incluyendo células progenitoras hematopoyéticas y células neuronales, sólo son responsables hacia una combinación de IL6 y el receptor de IL6 soluble pero no para IL6 sola.

La IL6 humana es biológicamente activa en monos, ratas y ratones. La IL6 murina no es activa en células humanas. La plétora de actividades biológicas se muestra a modo de ejemplo mediante los muchos acrónimos diferentes bajo los que se ha descrito la IL6. La IL6 es una citocina pleiotrópica que influye en las reacciones inflamatorias y las respuestas inmunitarias específicas de antígeno. Es uno de los principales mediadores fisiológicos de la reacción de fase aguda. En los hepatocitos, la IL6 en combinación con glucocorticoides induce la síntesis de metalotioneínas y aumenta los niveles de zinc intracelular, previniendo por tanto la hepatotoxicidad inducida por CCL4.

La IL6 es un factor neurotrófico para las neuronas colinérgicas que potencia su supervivencia en cultivo. Puede inducirse que algunas líneas celulares neuronales se diferencien mediante la IL6.

La IL6, al igual que la IL1, estimula la síntesis de ACTH (corticotropina) en la hipófisis. Los glucocorticoides sintetizados en respuesta a la ACTH inhiben la producción de IL6, IL1 y TNF in vivo, estableciendo por tanto una especie de bucle de retroalimentación negativa entre el sistema inmunitario y las funciones neuroendocrinas. En los astrocitos, la IL6 induce la síntesis del factor de crecimiento nervioso (NGF).

La IL6 es un factor de diferenciación de células B in vivo e in vitro y un factor de activación para células T. En presencia de IL2, IL6 induce la diferenciación de células T maduras e inmaduras en células T citotóxicas. La IL6 también induce la proliferación de timocitos y probablemente desempeña un papel en el desarrollo de células T tímicas.

La IL6 puede inducir la maduración final de las células B en células plasmáticas que secretan inmunoglobulina si las células se han activado previamente por IL4. En las células B, IL6 estimula la secreción de anticuerpos en un grado tal que los niveles séricos de IgG1 pueden aumentar 120-400 veces.

La IL6 a concentraciones de sólo 0,002 ng/mL es uno de los principales moduladores de crecimiento autocrinos para muchos mielomas humanos. El crecimiento de estas células puede inhibirse mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL6. También pueden inhibirse mediante la introducción de oligonucleótidos antisentido contra IL6 o mediante IL4. Los efectos inhibidores del crecimiento de los corticosteroides sobre células de mieloma probablemente se deben a la reducción inducida por esteroides en la expresión de IL6. El crecimiento de las células de mieloma dependiente de la IL6 humana también puede inhibirse por el IFN-gamma. La IL6 también puede funcionar como un modulador de crecimiento autocrino para otros tipos de tumores, algunos de los cuales se ha encontrado que secretan IL6 constitutivamente. Se ha demostrado que la IL6 es un modulador autocrino del crecimiento para el crecimiento de células tumorales de cuello uterino in vitro. Por otra parte, la IL6 bloquea el crecimiento de algunos tumores sólidos tales como carcinomas mamarios, carcinomas de cuello uterino, líneas celulares de cáncer de pulmón humanas, linfomas histiocíticos y melanomas.

La IL6 y IL3 sinergizan in vitro en la potenciación de la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas multipotentes. La IL6 también es una trombopoyetina que induce la maduración de megacariocitos in vitro y aumenta los recuentos de plaqueta in vivo. En cultivos de médula ósea murinos, pero no en humanos, la IL6 muestra actividades que se asemejan a las del GM-CSF.

Las células de plasmacitoma producen IL6 y también el receptor de IL6. Se ha sugerido que estas células se estimulan de una forma autocrina. También se ha descrito un mecanismo paracrino que implica la presencia de dos poblaciones de células diferentes, una que produce el factor y otra que expresa el receptor.

La IL6 puede detectarse en bioensayos que emplean líneas celulares que responden a IL6 (por ejemplo, 7TD1; B9; CESS, KPMM2, KT-3; M1, MH60-BSF-2, MO7E; Mono Mac 6; NFS-60; PIL-6; SKW6-C14; T1165; XG-1). La IL6 también puede someterse a ensayo determinando su actividad como un factor de crecimiento de hibridomas. También se dispone de pruebas colorimétricas e inmunoensayos sensibles. Existe un ensayo de ELISA para detectar la proteína gp130 asociada con el receptor.

En combinación con otras citocinas (por ejemplo, IL2), la IL6 puede ser útil en el tratamiento de algunos tipos de tumores. Se ha demostrado que la transducción de células tumorales murinas con un gen de IL6 funcional conduce al rechazo de las células modificadas genéticamente por los huéspedes singénicos. Las células tumorales alteradas que expresan IL6 también aumentan la inmunidad sistémica. Ratones vacunados con células transducidas rechazan una exposición posterior de células no transducidas y, en algunos casos, un tumor preexistente.

La IL10 humana es una proteína homodimérica con subunidades que presentan una longitud de 160 aminoácidos. La IL10 humana muestra una homología de aminoácidos del 73% con la IL10 murina. La IL10 humana contiene cuatro exones. Está estrechamente relacionada con el producto del gen de BCRF-1 (marco de lectura hacia la derecha del fragmento C de BamH1) del virus de Epstein-Barr (84% de homología a nivel de proteína). Estas dos proteínas están más estrechamente relacionadas entre sí que la IL10 humana y murina. BCRF-1 se ha denominado, por tanto, IL10 viral (vIL10). El gen de la IL10 humana mapea en el cromosoma 1. La IL10 humana muestra un 81% de homología con la IL10 murina a nivel de nucleótidos.

Se ha identificado un receptor en las células murinas y humanas mediante la utilización de IL10 radiomarcada (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank L12120, U00672). La IL10 de ratón puede bloquear la unión de la IL10 humana a las células de ratón pero no a las humanas. Se ha clonado el receptor de IL10 murino. Este receptor es una proteína de aproximadamente 110 kDa que se une específicamente a la IL10 murina. Este receptor está relacionado estructuralmente con los receptores para IFN.

La IL10 inhibe la síntesis de varias citocinas tales como IFN-gamma, IL2 y TNF-beta en subpoblaciones de células T Th1 pero no de células Th2. Esta actividad está antagonizada por la IL4. El efecto inhibidor sobre la producción de IFN-gamma es indirecto y parece ser el resultado de una supresión de la síntesis de IL12 por células auxiliares. En el sistema humano, la IL10 se produce mediante, y regula por disminución, la función de células Th1 y Th2. En los macrófagos estimulados por lipopolisacáridos bacterianos, la IL10 inhibe la síntesis de IL1, IL6 y TNF-alfa potenciando, entre otras cosas, la degradación de ARNm de citocina. También conduce a una inhibición de la presentación de antígenos. En los monocitos humanos, IFN-gamma e IL10 antagonizan entre sí en la producción y la función. También se ha demostrado que IL10 es un antagonista fisiológico de IL12.

La IL10 inhibe asimismo la proliferación de células T inducida por mitógeno o anticuerpos anti-CD3 en presencia de células auxiliares y reduce la producción de IFN-gamma e IL2. IL2 e IL4 exógenas inhiben el efecto inhibidor de la proliferación pero no influyen en la producción de IFN-gamma. En macrófagos estimulados por LPS, IFN-gamma aumenta la síntesis de IL6 inhibiendo la producción de IL10. La IL10 parece ser responsable de la mayoría o de toda la capacidad de los sobrenadantes de Th2 para inhibir la síntesis de citocina por las células.

La IL10 inhibe la secreción de Ig por antígenos independientes de células T inducida por IL5 pero no la inducida por IL2.

Las células B Ly-1 murinas son la principal fuente de IL10. A diferencia de otras células B, las células B Ly-1 expresan niveles constitutivos e inducibles enormemente elevados de IL10. Estas células también presentan la propiedad distintiva reabastecimiento continuo. El tratamiento continuo de ratones recién nacidos con anticuerpos anti-IL10 conduce a una reducción de las células B Ly-1 mientras que se mantiene una población normal de células B esplénicas. Estos ratones también contienen niveles de inmunoglobulina M sérica enormemente reducidos y también tienen afectadas las respuestas de anticuerpos frente a antígenos específicos. La IL10 es, por tanto, un regulador del desarrollo de las células B Ly-1. El mecanismo de reducción de células B Ly-1 parece implicar el aumento de producción de IFN-gamma, ya que la coadministración de anticuerpos anti-IFN-gamma neutralizantes restaura sustancialmente el número de células B Ly-1 residentes en el peritoneo en estos ratones.

La IL10 también es un coestimulador para el crecimiento de timocitos maduros e inmaduros (junto con IL2, IL4 e IL7) y funciona como un factor de diferenciación de células T citotóxicas, potenciando que un número superior de precursores de linfocitos T citotóxicos activados por IL2 proliferen y se diferencien en células efectoras citotóxicas. La IL10 mantiene la viabilidad de las células B in vitro y también estimula a las células B y potencia su diferenciación. Estimula la expresión de antígenos del MHC de clase II en células B mientras que inhibe la expresión del MHC de clase II en monocitos. En las células B activadas a través de sus receptores de antígeno o a través de CD40, la IL10 induce la secreción de IgG, IgA e IgM. Este efecto se sinergiza mediante IL4, mientras que la síntesis de inmunoglobulinas inducida por IL10 se antagoniza mediante TGF-beta. La activación de macrófagos puede evitarse mediante IL10.

Se ha demostrado que la IL10 humana es un factor quimiotáctico potente y específico para linfocitos T humanos. La actividad quimiotáctica está dirigida hacia células que expresan CD8 y no hacia células CD4 (+). La IL10 también inhibe la respuesta quimiotáctica de células CD4 (+), pero no la de las células CD8 (+), hacia IL8.

La IL10 puede detectarse con un ensayo de ELISA sensible. La línea de mastocitos murinos D36 puede utilizarse para someter a bioensayo la IL10 humana. El factor intracelular también puede detectarse mediante citometría de flujo.

La introducción de un vector de expresión de IL10 en células CHO se ha utilizado para analizar las consecuencias de la producción de IL10 local in vivo. Estas células alteradas dejaron de ser tumorigénicas en ratones atímicos o en ratones SCID inmunodeficientes combinados graves y también con crecimiento suprimido de números iguales de células CHO normales coinyectadas. Aunque normalmente los tumores CHO normales se infiltran sustancialmente por macrófagos, éstos estaban prácticamente ausentes dentro de tejidos tumorales CHO-IL10, lo que sugiere que IL10 suprime indirectamente el crecimiento tumoral de ciertos tumores inhibiendo la infiltración de macrófagos que pueden proporcionar actividad de potenciación del crecimiento tumoral.

La IL12 humana es una glicoproteína heterodimérica de 70 kDa que consiste en una subunidad de 40 kDa (p40, 306 aminoácidos; 10% de hidrato de carbono) y una subunidad de 35 kDa (p35, 197 aminoácidos; 20% de hidrato de carbono) unidas mediante puentes disulfuro que son esenciales para la actividad biológica de la IL12. p40 contiene 10 cisteínas y un sitio de unión para heparina; p35 contiene 7 cisteínas.

Las dos subunidades de IL12 no están relacionadas con ninguna otra proteína conocida. p40 muestra cierta homología con el dominio extracelular del receptor para IL6, y p35 parece ser un homólogo de IL6.

Se han descrito proteínas de fusión de IL2 murinas y humanas bioactivas que combinan las dos subunidades de IL12 en una única molécula. Esta citocina de diseño conserva actividad antitumoral in vivo. También se ha descrito Flexi 12, una proteína monocatenaria que conserva todas las características biológicas de IL12 recombinante dimérica.

El gen que codifica para la subunidad p40 de IL12 (IL12B) mapea en el cromosoma humano 5q31-q33 en la misma región que también alberga otros genes de citocina. El gen que codifica para la subunidad p35 de IL12 (IL12A) mapea en el cromosoma humano 3p12-q13.2. La expresión de los dos genes se regula independientemente entre sí.

El receptor de IL12 parece ser una única proteína de aproximadamente 110 kDa (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank U03187, U23922, U64198, U64199). Se expresan hasta 1000-9000 receptores/célula de IL12 de alta afinidad en las células mononucleares de sangre periférica activadas por diversos mitógenos de células T o por IL2. Los receptores de IL12 están presentes en células T activadas que expresan CD4 y CD8 y en células citolíticas positivas para CD56 activadas. Las células mononucleares de sangre periférica en reposo, las células B amigdalinas o las células B amigdalinas activadas por anti-IgM/Dx, anti-IgM/Dx +IL2, o SAC +IL2 no expresan el receptor. Los receptores de IL12 de alta afinidad se expresan constitutivamente en una línea celular transformada de tipo citolítico de tití, HVS.SILVA 40.

La unión de IL12 a su receptor puede prevenirse mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra la subunidad p40 que, por tanto, contiene el sitio de unión. La subunidad p40 de IL12 muestra homología con el dominio extracelular del receptor de IL6. Un homólogo codificado por virus de la subunidad 40 es el gen 3 inducido por el VEB.

La IL12 humana no es activa en linfocitos murinos. Los heterodímeros híbridos que consisten en las subunidades p35 murina y p40 humana conservan bioactividad sobre las células murinas; sin embargo, la combinación de p35 humana y p40 murina es completamente inactiva sobre células murinas. La IL12 murina es activa tanto en linfocitos murinos como humanos. Se ha demostrado que la subunidad p40 de la subunidad p40 de la IL12 murina (IL12p40) antagoniza específicamente los efectos del heterodímero de IL12 en diferentes sistemas de ensayo y que funciona como un inhibidor específico endógeno para el heterodímero de IL12.

La IL12 estimula la proliferación de linfoblastos humanos activados por fitohemaglutinina. La IL12 activa las células citolíticas positivas para CD56 y esta actividad se bloquea por anticuerpos específicos para TNF-alfa. La IL12 potencia reacciones de CTL alogénicas específicas. La IL12 sinergiza también con anticuerpos anti-CD3 y con estimulación alogénica en cultivos mixtos de linfocitos en la inducción de la proliferación de células T.

En los linfocitos periféricos de tipo Th1, la IL12 induce la síntesis de IFN-gamma e IL2, y TNF. El TNF-alfa también parece estar implicado en la medicación de los efectos de la IL12 sobre las células citolíticas, dado que los efectos de la IL12 están inhibidos por un anticuerpo dirigido contra el TNF-alfa. La IL12 y el TNF-alfa son coestimuladores para la producción de IFN-gamma, maximizando la IL12 la respuesta del IFN-gamma; la producción de IL12, TNF e IFN-gamma está inhibida por la IL10. En las células cooperadoras Th2, la IL12 reduce la síntesis de IL4, IL5 e IL10.

La IL12 sinergiza con cantidades inferiores a las óptimas de IL2 en la potenciación de la proliferación de células mononucleares en la sangre periférica y en la potenciación de la generación de células LAK (células citolíticas activadas por linfocinas). Concentraciones picomolares de IL12 son tan eficaces como concentraciones nanomolares de IL2 en el aumento de la actividad citolítica de las células citolíticas expandidas in vivo por la IL2. La IL12 también actúa como comitógeno y potencia la proliferación de células periféricas en reposo inducidas por IL2.

La IL12 estimula la mielopoyesis de células progenitoras primitivas de la médula ósea inducidas por el SCF (factor de células madre) y sinergiza con factores estimuladores de colonias para inducir proliferación. La IL12 también presenta efectos sinérgicos en progenitores de médula ósea más comprometidos, sinergizando con IL3, IL11 o IL3 más SCF.

La IL12 es de interés clínico potencial puesto que permite la reducción de las dosis de IL2 requeridas para la generación de células LAK (células citolíticas activadas por linfocinas). También se ha demostrado que la IL12 inhibe el crecimiento de una variedad de tumores experimentales in vivo y que tiene efectos antiangiogénicos in vivo, que están, por lo menos en parte, mediados por el IFN-gamma. La IL12, por consiguiente, también parece ser un candidato potencial para el tratamiento de cánceres dependientes de angiogénesis.

Los miembros de la superfamilia de ligandos de TNF (TNF-alfa, TNF-beta, LT beta, ligando de CD27, ligando de CD30, ligando de CD40, ligando de CD95, 4 1BB, ligando de OX40, TRAIL) comparten actividades biológicas comunes, pero algunas propiedades sólo se comparten por algunos ligandos, mientras que otras son únicas. El TNF-alfa humano es una proteína no glicosilada de 17 kDa y una longitud de 157 aminoácidos. El TNF-alfa murino está N-glicosilado. La homología con el TNF-beta es de aproximadamente el 30%. El TNF-alfa forma dímeros y trímeros. La forma de 17 kDa del factor se produce mediante el procesamiento de una proteína precursora de 233 aminoácidos. Se ha demostrado que una enzima conversora del TNF-alfa media en esta conversión. También se ha descrito una forma transmembrana de 26 kDa.

El TNF-alfa contiene un único puente disulfuro que puede destruirse sin alterar la actividad biológica del factor. Las mutaciones de Ala84 a Val y de Val91 a Ala reducen la actividad citotóxica del factor casi completamente. Estos sitios están implicados en la unión al receptor. La deleción de 7 aminoácidos N-terminales y la sustitución de Pro8Ser9Asp10 por ArgLysArg proporciona un factor mutado con una actividad antitumoral mejorada en aproximadamente 10 veces y una unión al receptor mejorada, tal como se demuestra mediante el ensayo celular L-M, mientras que al mismo tiempo se reduce la toxicidad.

El gen presenta una longitud de aproximadamente 3,6 kb y contiene cuatro exones. El transcrito primario presenta una longitud de 2762 nucleótidos y codifica para una proteína precursora de 233 aminoácidos. Los 78 aminoácidos amino terminales funcionan como una pre-secuencia. El gen humano mapea en el cromosoma 6p23-6q12. Está ubicado entre la región del HLA de clase I para HLA-B y el gen que codifica para el factor C del complemento. El gen que codifica para TNF-beta está situado aproximadamente 1,2 kb en el sentido de 3' del gen de TNF-alfa. Sin embargo, ambos genes están regulados independientemente. Los dos genes también se encuentran próximos entre sí en el cromosoma murino 17.

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Aproximadamente se expresan 500-10000 receptores de alta afinidad (Ka =2,5 x 10^{-9} M) para el TNF-alfa en todos los tipos de células somáticas con la excepción de los eritrocitos. Se han descrito dos receptores de 55 kDa (TNF-R1; nueva denominación: CD120a) (por ejemplo, los polipéptidos codificados por el número de registro de Genbank X55313) y 75 kDa (TNF-R2; nueva denominación: CD120b) (por ejemplo, tal como se describe en Goodwin RG et al (1991) Molecular Cellular Biology 11: 3020-6). Un receptor es una proteína glicosilada de 455 aminoácidos que contiene un dominio extracelular de 171 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 221 aminoácidos. Las homologías de secuencia en los dominios ricos en cisteína de la parte extracelular revelan que el receptor está relacionado con el receptor de baja afinidad de NGF y con el antígeno de la superficie celular humana CD40.

El análisis de deleción en la región intracelular C-terminal del receptor de 55 kDa, TNF-R1, ha revelado la existencia de un denominado dominio de muerte, que está implicado en procesos de señalización que conducen a la muerte celular programada. El dominio de muerte de TNF-R1 interacciona con una variedad de otras moléculas adaptadoras de señalización, incluyendo TRADD y RIP.

Los dos receptores conocidos se unen tanto a TNF-alfa como a TNF-beta. p55 se expresa particularmente en células sensibles a la acción citotóxica de TNF. p75 también está presente en muchos tipos celulares, especialmente en aquellos de origen mieloide (un homólogo codificado por virus de la subunidad del receptor es el gen-6 inducido por el VEB). Se expresa fuertemente en linfocitos B y células T estimuladas. Las actividades diferenciales del TNF en los diversos tipos de células, es decir, actividades de potenciación del crecimiento y de inhibición de crecimiento, probablemente están mediadas por la expresión y/o la regulación diferenciales de múltiples receptores en combinación con otras proteínas distintas asociadas a receptor. p55 parece desempeñar un papel crítico en las defensas del huésped contra microorganismos y sus factores patogénicos.

Un tercer subtipo de receptor se expresa en el hígado humano normal. Se une a TNF-alfa pero no a TNF-beta. Algunos virus contienen genes que codifican para proteínas secretadas con propiedades de unión a TNF que son estrechamente homólogas a los receptores de TNF, p55 y p75. También se han encontrado efectos diferenciales de los dos subtipos de receptores en la adhesión mediada por TNF de leucocitos al endotelio. Parece que el acoplamiento del receptor p55 conduce específicamente a la inducción de las moléculas de adhesión celular ICAM-1, E-selectina, V-CAM-1 y CD44, mientras que el acoplamiento tanto del receptor p55 como del p75 induce la expresión de la integrina alfa-2.

Asimismo, se han encontrado formas solubles truncadas del receptor. Las formas solubles, en particular el dominio extracelular soluble del receptor p60, bloquean los efectos antiproliferativos del TNF y, por consiguiente, pueden modular los efectos perjudiciales del TNF.

Las densidades del receptor se reducen por la IL1 y potenciadores tumorales tales como ésteres de forbol. La expresión de la densidad del receptor del TNF-alfa está inducida por el IFN-alfa, IFN-beta e IFN-gamma.

Los transductores de señales que se asocian con los dominios citoplasmáticos de miembros de la superfamilia del receptor del TNF comprenden TRAF (factores asociados al receptor del factor de necrosis tumoral).

El TNF-alfa humano es activo en células murinas con actividad específica ligeramente reducida. En general, TNF-alfa y TNF-beta presentan espectros similares de actividades biológicas en los sistemas in vitro, aunque el TNF-beta a menudo es menos potente o presenta actividad agonista parcial aparente.

El TNF-alfa muestra un amplio espectro de actividades biológicas. Produce la citólisis y citostasis de muchas líneas celulares tumorales in vitro. Las células sensibles mueren en el plazo de horas tras la exposición a concentraciones picomolares del factor y esto implica, por lo menos en parte, moléculas de segundo mensajero derivadas de mitocondrias que sirven como mediadores comunes de las rutas de señalización reguladas por genes y citotóxicas de TNF. El factor induce necrosis hemorrágica de tumores transplantados. En el plazo de horas tras la inyección, el TNF-alfa conduce a la destrucción de pequeños vasos sanguíneos dentro de tumores malignos. El factor también estimula la fagocitosis y la citotoxicidad en granulocitos neutrófilos y también modula la expresión de otras muchas proteínas, incluyendo fos, myc, IL1 e IL6.

La forma de 26 kDa del TNF se encuentra predominantemente en células T y monocitos activados. También es biológicamente activa y media en la destrucción celular mediante contactos directos célula-célula.

El TNF-alfa estimula las propiedades quimiotácticas de fMLP (Formil-Met-Leu-Phe) para los neutrófilos. El TNF-alfa induce la síntesis de varias citocinas quimiotácticas, incluyendo IP-10, JE, KC, de una manera específica del tejido y del tipo celular.

El TNF-alfa es un factor de crecimiento para fibroblastos diploides humanos normales. Potencia la síntesis de colagenasa y prostaglandina E2 en fibroblastos. También puede funcionar como un modulador de crecimiento autocrino para células de leucemia linfocítica crónica humanas in vivo y se ha descrito que es un modulador de crecimiento autocrino para células de neuroblastoma. La actividad autocrina de potenciación del crecimiento está inhibida por la IL4.

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En los macrófagos en reposo, el TNF induce la síntesis de IL1 y prostaglandina E2. También estimula la fagocitosis y la síntesis de superóxido dismutasa en macrófagos. El TNF activa los osteoclastos y, por tanto, induce la resorción ósea.

En progenitores de leucocitos y linfocitos, el TNF estimula la expresión de antígenos de diferenciación y de HLA de clase I y II y la producción de IL1, factores estimuladores de colonias, IFN-gamma y el metabolismo del ácido araquidónico. También estimula la biosíntesis de colagenasas en células endoteliales y células sinoviales.

La IL6 suprime la síntesis de IL1 inducida por endotoxinas bacterianas y TNF, y la síntesis de TNF inducida por endotoxinas.

El neurotransmisor SP (sustancia P) induce la síntesis de TNF e IL1 en macrófagos. La IL1, al igual que la IL6, estimula la síntesis de ACTH (corticotropina) en la hipófisis. Los glucocorticoides sintetizados en respuesta a ACTH, a su vez, inhiben la síntesis de IL6, IL1 y TNF in vivo, estableciendo por tanto un bucle de retroalimentación negativo entre el sistema inmunitario y las funciones neuroendocrinas.

El TNF-alfa estimula la proliferación de células T inducida por diversos estímulos en ausencia de IL2. Algunas subpoblaciones de células T sólo responden a la IL2 en presencia de TNF-alfa. En presencia de IL2, el TNF-alfa potencia la proliferación y la diferenciación de células B.

Las capacidades funcionales de las células de Langerhans de la piel también resultan influidas por el TNF-alfa. Estas células no pueden iniciar las respuestas inmunitarias primarias tales como la sensibilización por contacto. Se convierten en células dendríticas inmunoestimuladoras mediante el GM-CSF y también la IL1. Por consiguiente, estas células constituyen un depósito para células dendríticas linfoides inmunológicamente inmaduras. La capacidad mejorada de las células de Langerhans maduras para procesar antígenos se reduce significativamente por el
TNF-alfa.

Aunque también se requiere el TNF-alfa para las respuestas inmunitarias normales, la sobreexpresión tiene consecuencias patológicas graves. El TNF-alfa es el principal mediador de caquexia observado en pacientes con tumores (de ahí su nombre, caquectina). El TNF también es responsable de algunos de los graves efectos durante la septicemia producida por bacterias Gram negativas.

El TNF-alfa puede detectarse en bioensayos que implican líneas celulares que responden a (por ejemplo, BT-20, CT6, EL4; PK15; L929; L-M; MO7E; T1165; WEHI-3B). El TNF-alfa también puede detectarse mediante un inmunoensayo enzimático de intercalación sensible, ELISA, un ensayo inmunorradiométrico (IRMA) y mediante un ensayo denominado RELAY (ensayo de transferencia de marcador mediado por receptor). El factor intracelular se detecta mediante dos citometrías de flujo de inmunofluorescencia de color. Higuchi et al han descrito un ensayo basado en la liberación de timidina tritiada de células que experimentan apoptosis tras el tratamiento o bien con TNF-alfa o bien con TNF-beta. Se ha demostrado que IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, TGF-beta, IL4, LIF y GM-CSF no interfieren con este ensayo.

A diferencia de los fármacos quimioterápicos, el TNF ataca específicamente las células malignas. Estudios preclínicos amplios han documentado un efecto citostático y citotóxico directo del TNF-alfa contra xenoinjertos humanos subcutáneos y metástasis del nódulo linfático en ratones atímicos, así como una variedad de efectos inmunomoduladores sobre diversas células efectoras inmunitarias, incluyendo neutrófilos, macrófagos y células T. Estudios de fase I de dosis única y múltiple han confirmado que el TNF puede administrarse de manera segura a pacientes con cánceres avanzados en un intervalo de dosis asociado con un efecto anticancerígeno sin toxicidades concomitantes graves, tales como choque y caquexia. Sin embargo, hasta ahora los ensayos clínicos sobre el conjunto desgraciadamente no han demostrado mejoras significativas en el tratamiento contra el cáncer, siendo la toxicidad sistémica inducida por el TNF una limitación principal para la utilización del TNF como un agente antineoplásico en la mayoría de los casos. La utilización combinada de TNF y agentes inmunomoduladores o citotóxicos, particularmente IFN-gamma y posiblemente IL2, puede ser ventajosa en el tratamiento de algunos tumores. En algunos casos, se ha encontrado que la aplicación intratumoral del TNF es ventajosa en el control tumoral.

Recientemente se han descrito algunas formas mutantes de TNF-beta con actividad selectiva sobre el receptor p55. También se ha demostrado que la activación del receptor p55 es suficiente para desencadenar actividad citotóxica hacia las células transformadas. Se ha descrito que algunos de estos mutantes conservan su actividad antitumoral en ratones atímicos que llevan tumores humanos trasplantados.

El TNF también puede utilizarse para aumentar la capacidad de ataque de las células citolíticas activadas por linfocinas.

Estudios con un modelo experimental de metástasis de fibrosarcoma han demostrado que el TNF induce una mejora significativa del número de metástasis en el pulmón. Se ha sugerido que dosis bajas de TNF endógeno o la administración de TNF durante la terapia con citocina pueden mejorar el potencial metastásico de las células tumorales circulantes. Se ha demostrado que la transducción de células tumorales murinas con un gen de TNF-alfa funcional conduce al rechazo de las células genéticamente modificadas por los huéspedes singénicos.

Los interferones son una familia de citocinas que inducen un estado antiviral no específico de virus en células diana. La unión de un interferón a su receptor induce una nueva síntesis de proteínas que, a su vez, da como resultado la inactivación del factor de iniciación eIF-2. Se cree que la inactivación contribuye al estado antiviral inducido por los interferones. Los interferones también inducen rutas que activan endonucleasas intracelulares que degradan el ARNm viral. Muchos interferones también poseen actividades inmunomoduladoras, tales como activación de macrófagos y linfocitos. Ejemplos de interferones incluyen IFN-\alpha (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank K01900, J00209, M12350, J00213, J00216, J00214, M11003, M11026, M34913, M54886, X01974, L38698, M13710, K01238, M13660, M68944, X01972, X01971, X01973, X01969), IFN-\beta (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank M28622, X14029, X14455, K00020, J00218, E00171, X04430, A09363, M27327, M16656, M25460, K03196), IFN-\gamma (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank A34532, X87308, E00756, K00083), IFN-\omega (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank X58822, A12140), proteína trofoblástica bovina 1 (IFN-\tau) (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank M31556, M31557, M31558) y sus homólogos entre especies. Se cree que el IFN-\alpha y el IFN-\beta humanos se unen a un receptor común (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank X60459, M89641) que es distinto del receptor para IFN-\gamma (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank J03143, M28233).

Por lo menos se conocen 23 variantes diferentes del IFN-alfa. Las proteínas individuales presentan masas moleculares de entre 19-26 kDa y consisten en proteínas con longitudes de 156-166 y 172 aminoácidos. Todos los subtipos de IFN-alfa poseen una región de secuencia conservada común entre las posiciones de aminoácidos 115-151, mientras que los extremos amino terminales son variables. Muchos subtipos de IFN-alfa difieren en sus secuencias en sólo una o dos posiciones. Las variantes que se producen de manera natural también incluyen proteínas truncadas en 10 aminoácidos en el extremo carboxilo terminal. Se forman puentes disulfuro entre cisteínas en las posiciones 1/98 y 29/138. El puente disulfuro 29/138 es esencial para la actividad biológica, mientras que el puente 1/98 puede reducirse sin afectar a la bioactividad.

El IFN-beta humano es una glicoproteína (aproximadamente el 20% de restos de azúcar) de 20 kDa y presenta una longitud de 166 aminoácidos. No se requiere la glicosilación para la actividad biológica in vitro. La proteína contiene un puente disulfuro (Cys31/141) requerido para la actividad biológica. A nivel del ADN, el IFN-beta presenta un 34% de homología de secuencia con IFN-beta-2 y aproximadamente un 30% de homología con otros subtipos de IFN-alfa. A diferencia del IFN-gamma, el IFN-beta es estable a pH2.

El IFN-gamma humano es una proteína dimérica con subunidades de 146 aminoácidos. La proteína está glicosilada en dos sitios. El pI es de 8,3-8,5. El IFN-gamma se sintetiza como una proteína precursora de 166 aminoácidos incluyendo una secuencia señal de secreción de 23 aminoácidos. Se han descrito dos formas moleculares de la proteína biológicamente activa de 20 y 25 kDa. Ambas están glicosiladas en la posición 25. La forma de 25 kDa también está glicosilada en la posición 97. Las diferencias observadas del IFN-gamma natural con respecto a la masa molecular y la carga se deben a patrones de glicosilación variables. Las formas de 40-60 kDa observadas en condiciones no desnaturalizantes son dímeros y tetrámeros del IFN-gamma.

Los miembros de la familia del CSF de citocinas permiten el crecimiento y la diferenciación de células de médula ósea inmovilizadas en agar blando o metilcelulosa. Aunque las células progenitoras hematopoyéticas sólo pueden mantenerse durante cortos periodos de tiempo en ausencia de tales factores, su presencia permite el desarrollo de colonias que contienen células eritroides, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos y/o megacariocitos, dependiendo del factor particular. El análisis bioquímico de diversas actividades que estimulan la formación de colonias que apoyan el crecimiento y el desarrollo de estos tipos celulares reveló que existían muchos factores diferentes y distintos de este tipo.

Muchos de estos factores están o bien N-glicosilados o bien O-glicosilados. Se ha demostrado que la glicosilación mejora la solubilidad, la estabilidad y la resistencia a enzimas proteolíticas. No parece requerirse para todo el espectro de actividades biológicas de estos factores. Se han clonado y mapeado los genes que codifican para muchos de los factores estimuladores de colonias humanos. Algunos de los genes están en proximidad cercana, pero no muestran gran homología entre sí con la excepción de algunas regiones conservadas.

Los factores estimuladores de colonias se producen por muchos tipos de células diferentes, incluyendo, por ejemplo, linfocitos B, células epiteliales, fibroblastos, células endoteliales, macrófagos, línea celular del estroma, linfocitos T. Se sintetizan como moléculas precursoras que contienen una secuencia señal de secreción hidrófoba clásica de aproximadamente 25-32 aminoácidos. Los factores secretados presentan una actividad biológica específica extremadamente alta y son activos a concentraciones muy bajas (1-100 pM). Estos factores se requieren absolutamente para la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas. Las concentraciones requeridas para el mero mantenimiento de la viabilidad normalmente son órdenes de magnitud inferiores a las requeridas para inducir la proliferación celular y para provocar actividades funcionales específicas de las células.

Los nombres de los factores individuales normalmente indican los tipos celulares que responden a estos factores. Los factores estimuladores de colonias clásicos incluyen M-CSF (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank E03235, M64592, U22386, X05010) (específico de macrófagos), G-CSF (específico de granulocitos), GM-CSF (específico de macrófagos/granulocitos), IL3 (multifuncional) y MEG-CSF (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank D86370, U70136) (específico de megacariocitos). Los G-CSF y los M-CSF son específicos de linaje, mientras que los GM-CSF y la IL3 son factores de crecimiento hematopoyéticos multifuncionales que actúan en las etapas iniciales de diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas.

El GM-CSF humano es una proteína monomérica de 127 aminoácidos con dos sitios de glicosilación. La proteína se sintetiza como un precursor de 144 aminoácidos, que incluye una secuencia señal de secreción hidrófoba en el extremo amino terminal. No se requiere el resto de azúcar para todo el espectro de actividades biológicas. Los GM-CSF glicosilado y no glicosilado muestran las mismas actividades in vitro. El GM-CSF completamente glicosilado es biológicamente más activo in vivo que la proteína no glicosilada. Las formas de diferente peso molecular de GM-CSF (14 kDa, 35 kDa) descritas en la bibliografía son el resultado de diversos grados de glicosilación. El GM-CSF contiene cuatro residuos de cisteína (posiciones 54/96 y 88/121).

Una comparación de la secuencia de proteínas del GM-CSF con las de los otros factores estimuladores de colonias revela que no son fuertemente homólogos entre sí. Los GM-CSF humano y murino presentan un 60% de homología a nivel de proteínas y un 70% a nivel de nucleótidos. Sin embargo, los dos factores no presentan una reacción cruzada inmunológicamente. El GM-CSF puede asociarse con la matriz extracelular de las células como un complejo con proteoglicanos de heparán sulfato. Esto permite el almacenamiento del factor en la forma biológicamente inactiva. No se conoce el mecanismo exacto por el que se libera finalmente el factor de estos depósitos.

El gen humano presenta una longitud de aproximadamente 2,5 kb y contiene cuatro exones. La distancia entre el gen de GM-CSF y el gen de IL3 es de aproximadamente 9 kb. El gen de GM-CSF humano mapea en el cromosoma 5q22-31 en la proximidad de otros genes que codifican para factores de crecimiento hematopoyéticos (M-CSF, IL3, IL4, IL5) y el gen que codifica para el receptor de M-CSF. La región en 5' del gen de GM-CSF contiene varios elementos de secuencia conocidos como CLE (elemento de linfocina conservado). Funcionan como sitios de unión para factores de transcripción, modulando la expresión del gen de GM-CSF.

Los receptores de GM-CSF se expresan a densidades de varios 100 a varios 1000 de copias/célula en la superficie celular de células mieloides. El receptor también se expresa en células no hematopoyéticas tales como células endoteliales y células de carcinoma de pulmón de células pequeñas. En linajes de células positivos para el receptor, la densidad de receptores disminuye con el aumento de los grados de maduración.

El receptor muestra homologías significativas con otros receptores para factores de crecimiento hematopoyéticos, incluyendo IL2-beta, IL3, IL6, IL7, Epo y los receptores de prolactina. Una subunidad clonada del receptor de GM-CSF (GM-R alfa, 45 kDa) se une a GM-CSF con baja afinidad (por ejemplo, los polipéptidos codificados por el número de registro de Genbank SEG_HUMGRAS). La segunda subunidad (GM-R beta, 120 kDa) no se une a GM-CSF. GM-R alfa es una proteína de 400 aminoácidos que contiene sólo un corto dominio citoplasmático de 54 aminoácidos. El receptor de alta afinidad de GM-CSF se forma mediante la agregación de las dos subunidades del receptor. La subunidad GM-R beta del receptor (por ejemplo, los polipéptidos codificados por los números de registro de Genbank SEG_MUSAIC2B, M59941) también es un constituyente de los otros sistemas de receptores de citocina. Es un componente de los receptores de alta afinidad para IL3 e IL5, conteniendo también ambos una subunidad específica de citocina (AIC2A).

El GM-CSF humano no es activo en células murinas y viceversa. El GM-CSF se aisló inicialmente como un factor que estimula el crecimiento de colonias que contienen macrófagos/granulocitos en cultivos de agar blando (ensayo de formación de colonias). El GM-CSF es indispensable para el crecimiento y el desarrollo de células progenitoras de granulocitos y macrófagos. Estimula a los mieloblastos y los monoblastos y desencadena la diferenciación irreversible de estas células. El GM-CSF sinergiza con Epo en la proliferación de células progenitoras eritroides y megacariocíticas. En combinación con otro factor estimulador de colonias, el M-CSF, se observa el fenómeno de supresión sinérgica, es decir, la combinación de estos dos factores conduce a una supresión parcial de la generación de colonias de células que contienen macrófagos.

Para algunos tipos de blastocitos de pacientes con leucemia mielocítica aguda, el GM-CSF actúa como un mediador autocrino del crecimiento. El GM-CSF es un fuerte factor quimiotáctico para neutrófilos. Estimula la actividad microbicida, el metabolismo oxidativo y la actividad fagocítica de los neutrófilos y los macrófagos. También mejora la citotoxicidad de estas células.

El GM-CSF presenta una especificidad menos pronunciada que, por ejemplo, G-CSF. Estimula la proliferación y la diferenciación de linajes neutrófilos, eosinófilos y monocíticos. También activa funcionalmente las formas maduras correspondientes, potenciando, por ejemplo, la expresión de ciertas proteínas de adhesión de superficie celular (CD-11A, CD-11C). La sobreexpresión de estas proteínas puede ser una explicación para la acumulación local observada de granulocitos en sitios de inflamación. Además, GM-CSF también potencia la expresión de receptores para fMLP (formil-Met-Leu-Phe) que es un estimulador de actividad de neutrófilos.

A concentraciones de pico a nanomolares, el GM-CSF es quimiotáctico para eosinófilos y también influye en el comportamiento quimiotáctico de estas células en respuesta a otros factores quimiotácticos.

En granulocitos, el GM-CSF estimula la liberación de metabolitos del ácido araquidónico y el aumento de la generación de especies de oxígeno reactivo. La activación del sistema de antiportador Na+/H+ conduce a una rápida alcalinización del citosol. Las actividades fagocitóticas de granulocitos neutrófilos y la citotoxicidad de eosinófilos también se potencian considerablemente por GM-CSF. Ya que el GM-CSF se produce por células (linfocitos T, macrófagos tisulares, células endoteliales, mastocitos) presentes en sitios de respuestas inflamatorias, puede suponerse que es un mediador importante para reacciones inflamatorias.

El estado funcional de células de Langerhans de la piel también se ve influido por GM-CSF. Estas células no pueden iniciar respuestas inmunitarias primarias, por ejemplo, sensibilización por contacto. Se convierten en células dendríticas inmunoestimulantes sumamente potentes por GM-CSF (y también IL1). Por consiguiente, las células de Langerhans forman un depósito in situ para células dendríticas linfoides inmunológicamente inmaduras. La maduración de estas células que se observa como un aumento de la capacidad para procesar antígenos, puede regularse por disminución mediante TNF-alfa.

A concentraciones nanomolares, el GM-CSF induce la expresión de receptores del complemento C3a en basófilos. Las células que normalmente no responden a C3a y que se han activado mediante GM-CSF se desgranulan en respuesta al estímulo de C3a. Esto viene acompañado por la liberación de histamina y leucotrieno C4. Este proceso puede ser significativo en reacciones de hipersensibilidad asociadas con respuestas inflamatorias (linfocitos T, macrófagos tisulares, células endoteliales, mastocitos). También se ha demostrado que el GM-CSF es un potente inductor de interferón de trofoblasto (TP-1).

El GM-CSF actúa sinérgicamente con algunas otras citocinas, incluyendo IL1, IL3 y G-CSF. El GM-CSF y el G-CSF deben actuar conjuntamente para permitir el desarrollo de colonias que contienen neutrófilos in vitro.

La IL3 por sí misma sólo expande de manera despreciable el número de células sanguíneas circulantes; sin embargo, una dosis posterior de GM-CSF, aumenta significativamente los números de células, probablemente porque la IL3 conduce en primer lugar a una expansión de las células que pueden responder a GM-CSF. Las observaciones de que la mayor parte de las líneas celulares dependientes de IL3 también pueden crecer en presencia de GM-CSF e IL4 y de que se observan varios efectos sinérgicos entre GM-CSF y IL4, sugieren que estos tres factores realizan funciones similares en el control del crecimiento de células. Hay algunas indicaciones de que el mecanismo de transducción de señales contiene por lo menos algunos factores comunes.

Experimentos con proteína cinasas específicas de tirosina codificadas por un oncogén han demostrado que la expresión de esta actividad cinasa en células dependientes de factor elimina su dependencia de GM-CSF, IL3 e IL4. Todavía se desconoce el mecanismo exacto mediante el cuál estos factores regulan la proliferación y diferenciación de células.

Se han estudiado las consecuencias de una expresión desregulada de GM-CSF en ratones transgénicos que albergan un gen de GM-CSF expresado constitutivamente. La sobreexpresión del transgén que codifica para GM-CSF conduce a alteraciones patológicas en la retina y provoca ceguera y también provoca deterioro muscular. Estos ratones se caracterizan por un aumento muy pronunciado en los macrófagos activados. Además, la sobreexpresión de GM-CSF conduce a la activación de macrófagos maduros que secretan grandes cantidades de IL1 y TNF, lo que sugiere que estas citocinas pueden ser responsables de algunos aspectos de la enfermedad del ratón transgénico.

El examen histopatológico demuestra un aumento pronunciado en la población de células progenitoras del linaje monocítico. Los animales transgénicos para GM-CSF mueren normalmente en el plazo de meses debido al daño tisular masivo resultante de la sobreexpresión de estos factores. Se han obtenido resultados similares con ratones que presentan una médula ósea manipulada para sobreexpresar GM-CSF mediante transformación con vectores de retrovirus adecuados. No obstante, estos hallazgos no parecen ser de significación clínica. El tratamiento a largo plazo de primates y ratones con GM-CSF ha mostrado que no se producen complicaciones potencialmente mortales.

Las consecuencias biológicas de la alteración del gen de GM-CSF se han estudiado en ratones generados a partir de células ES que llevan una deleción seleccionada como diana del gen. Ratones homocigóticos para una alteración seleccionada como diana del gen de GM-CSF se caracterizan por una hematopoyesis de estado estacionario no afectada, lo que demuestra que el GM-CSF no es esencial para mantener niveles normales de los tipos principales de células hematopoyéticas maduras y sus precursores en la sangre, la médula y el bazo.

La mayor parte de los ratones deficientes para GM-CSF están superficialmente sanos y son fértiles pero desarrollan pulmones anómalos. Los ratones deficientes para GM-CSF desarrollan una acumulación progresiva de proteínas y lípidos tensioactivos en el espacio alveolar, características que definen el trastorno humano idiopático proteinosis alveolar pulmonar. También se encuentra hiperplasia linfoide extensa asociada con vasos sanguíneos y vías respiratorias pulmonares. Estos resultados demuestran un papel crítico, inesperado, para GM-CSF en la homeostasis pulmonar.

Ratones transgénicos homocigóticos para mutaciones nulas del gen que codifica para la subunidad beta común (beta C) de los complejos de receptor de GM-CSF, IL3 e IL5 muestran desarrollo normal y supervivencia hasta la vida adulta joven. Desarrollan infiltrados linfoides peribroncovasculares pulmonares y zonas que se parecen a proteinosis alveolar. Se reducen los números de eosinófilos en sangre periférica y médula ósea de mutantes de deleción homocigóticos, mientras que otros parámetros hematológicos son normales. Las células de la médula ósea de mutantes de deleción homocigóticos no muestran unión de alta afinidad de GM-CSF, mientras que las células de animales heterocigóticos muestran un número intermedio de receptores de alta afinidad. En cultivos clonales de células de la médula ósea derivadas de mutantes de deleción homocigóticos, incluso las altas concentraciones de GM-CSF e IL5 no estimulan la formación de colonias en el ensayo de formación de colonias. No se observan diferencias en la distribución y aclaración sistémica de GM-CSF entre crías de la misma camada mutantes y de tipo natural.

Nishinakamura et al han cruzado ratones mutantes beta-c con ratones deficientes para IL3. Los ratones mutantes dobles que carecen de todas las funciones de IL3, GM-CSF e IL5 son aparentemente fértiles de manera normal. Los animales muestran el mismo número reducido de eosinófilos y una carencia de respuesta eosinófila a parásitos como los ratones mutantes beta-c. La respuesta inmunitaria de los ratones mutantes dobles a Listeria monocytogenes es normal. La recuperación hematopoyética tras el tratamiento con fluorouracilo también es normal. Estos hallazgos sugieren la existencia de mecanismo alternativo para producir células sanguíneas que no depende de la presencia de IL3, GM-CSF e IL5.

Puede someterse a ensayo el GM-CSF en un ensayo de formación de colonias mediante el desarrollo de colonias que contienen macrófagos, neutrófilos, eosinófilos y megacariocitos. El GM-CSF también se detecta en bioensayos específicos con líneas celulares cuyo crecimiento depende de la presencia de GM-CSF o responde a este factor (por ejemplo, AML-193; B6SUt-A; BAC1.2F5; BCL1; Da; FDCP1; GF-D8; GM/SO; IC-2; MO7E; NFS-60; PT-18; TALL-103; TF-1; UT-7).

El GM-CSF puede emplearse para la reconstitución fisiológica de hematopoyesis en todas las enfermedades caracterizadas por una maduración aberrante de células sanguíneas o mediante una producción reducida de leucocitos. La aplicación clínica principal y más importante de GM-CSF es probablemente el tratamiento de neutropenia potencialmente mortal tras quimioterapia y/o radioterapia, que se reduce notablemente con tratamiento con GM-CSF. El GM-CSF también puede utilizarse para corregir citopenias inducidas por quimioterapia y para contrarrestar la predisposición relacionada con la citopenia a infecciones y hemorragias.

Con el fin de evitar posibles complicaciones tras la administración de GM-CSF se requiere monitorización clínica cuidadosa en ciertos grupos de pacientes, por ejemplo aquéllos con síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide aguda, enfermedad inflamatoria, trombocitopenia autoinmunitaria o disfunción de la sensibilidad inmunológica.

Varios estudios han demostrado que la utilización de GM-CSF potencia la tolerancia al tratamiento con fármacos citotóxicos y puede utilizarse para prevenir reducciones de la dosis requeridas por los efectos secundarios del tratamiento con fármacos citotóxicos. El tratamiento con GM-CSF permite con frecuencia aumentar las dosis de fármacos citotóxicos por ciclo. Estos estudios también han revelado una morbilidad significativamente reducida con el tratamiento con GM-CSF.

Se ha mostrado que la transducción de células tumorales murinas con un gen de GM-CSF funcional conduce al rechazo de las células genéticamente modificadas por huéspedes singénicos. Asimismo, la vacunación con células tumorales transducidas con GM-CSF evita el crecimiento de un inóculo posterior de células tumorales singénicas de tipo natural.

La familia de quimiocina de citocinas consiste en polipéptidos relativamente pequeños, estructuralmente similares, que inducen quimiotaxis en leucocitos. Las quimiocinas presentan masas moleculares de 8-10 kDa y muestran una homología de secuencia de aproximadamente el 20-50% entre sí a nivel de proteínas. Las proteínas también comparten estructuras terciarias y estructuras génicas comunes. Todas las quimiocinas presentan un número de residuos de cisteína conservados implicados en la formación de puente de disulfuro intramolecular.

Según las ubicaciones cromosómicas de genes individuales se distinguen dos subfamilias diferentes de quimiocinas. A los miembros de las alfa-quimiocinas también se les denomina la familia de la quimiocina 4q porque los genes que codifican para miembros de esta familia mapean en el cromosoma humano 4q12-21. Los dos primeros residuos de cisteína de los miembros de esta familia están separados por un único aminoácido y, por consiguiente, a estas proteínas también se les denomina quimiocinas C-X-C. Esta subfamilia incluye 9E3 (por ejemplo, proteína de Genbank P08317), AMCF (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank M99367, M99368), beta-tromboglobulina (por ejemplo, tal como se da a conocer en Begg GS et al (1978), Biochemistry 17: 1739-44), miembros de la familia CINC (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank D21095), ENA-78 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X78686), eotaxina (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U46572, U40672), GCP-2 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank Y08770, U83303), IL8, IP-10 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank L07417, X02530), KC (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank J04596), LIX (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U27267), mig (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank M34815, Z24725), MGSA (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X12510), mob-1 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U17035), NAP-2 (tal como se describe en Clark-Lewis I et al (1991) Biochemistry 30: 3128-35, Cohen AB et al (1992) American Journal of Physiology 263: L249-56), NAP-3 (tal como se describe en: Schröder JM et al (1991) Journal of Experimental Medicine 171: 1091-100), NAP-4 (tal como se describe en Schröder JM et al (1990) Biochemical and Biophysical Research Communications 172: 898-904), PBSF (SDF) (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank D21072, U16752, D50645) y PF4 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank M25897).

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IL8, MGSA, KC de ratón, MIP-2 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X65647 y tal como se describe en Blum S et al Three human homologues of a murine gene encoding an inhibitor of stem cell proliferation. DNA Cell Biol. 9: 589-602 (1990); Clements JM et al Biological and structural properties of MIP-1 alpha expressed in yeast. Cytokine 4: 76-82 (1992); Devatelis G et al Cloning and characterization of a cDNA for murine macrophage inflammatory protein (MIP), a novel monokine with inflammatory and chemokinetic properties. Journal of Experimental Medicine 167: 1939-44 (1988) (errata en el JEM 170: 2189 (1989)); Farber JM A macrophage mRNA selectively induced by gamma-interferon encodes a member of the platelet factor 4 family of cytokines. Proceedings of the National Academy of Science (USA) 87: 5238-42 (1990); Haskill S et al Identification of three related human GRO genes encoding cytokine functions. Proceedings of the National Academy of Science (USA) 87: 7732-6 (1990); Poltorak AN et al (1995) Journal of Inflammation 45(3): 207-19; Rossi DL et al (1997) Journal of Immunology 158(3): 1033-1036; Sherry B et al (1988) Journal of Experimental Medicine 168: 2251-9; Tekamp-Olson P et al (1990) Journal of Experimental Medicine 172: 911-9; Wolpe SD et al (1989) Proceedings of the National Academy of Science (USA) 86: 612-16; Wolpe SD et al (1989) FASEB Journal 3: 2565-73), NAP-2, ENA-78 y GCP comprenden un subgrupo de las quimiocinas C-X-C humanas definido por el motivo de secuencia ELR conservado (ácido glutámico-leucina-arginina) que precede inmediatamente al primer residuo de cisteína cerca del extremo amino-terminal. Se ha encontrado que las quimiocinas con un motivo de secuencia ELR son quimioatrayentes para, y activan principalmente neutrófilos. Las quimiocinas sin el motivo de secuencia ELR parecen ser quimioatrayentes para, y activar monocitos, células dendríticas, células T, células citolíticas, linfocitos B, basófilos y eosinófilos.

Miembros de la familia de beta-quimiocinas o quimiocina 17q mapean en el cromosoma humano 17q11-32 (cromosoma 11 murino). Los dos primeros residuos de cisteína son adyacentes y, por consiguiente, estas proteínas también se denominan quimiocinas C-C. Esta subfamilia incluye ACT-2 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank J04130), C10 (por ejemplo, tal como se describe en Berger MS et al (1993) DNA Cell Biol. 12: 839-47; Berger MS et al (1996) 8: 439-447), CCF18 (por ejemplo, tal como se describe en Hara T et al (1995) Journal of Immunology 155: 5352-8), DC-CK1 (por ejemplo, tal como se describe en Adema GJ et al (1997) Nature 387: 713-717), ELC (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank AB000887, AF059208), Eotaxina-2 (por ejemplo, tal como se describe en Forssmann U et al (1997) Journal of Experimental Medicine 185: 2171-2176), Exodus (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U64197, U88320, U88321, U88322), FIC (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank L04694), GDCF y GDCF-2 (por ejemplo, tal como se describe en Kuratsu J et al (1989) Journal of the National Cancer Institute 81: 347-51; Yoshimura T et al (1989) Journal of Experimental Medicine 169: 1449-59; Yoshimura T et al (1989) Journal of Immunology 142: 1956-62), HC-21 (por ejemplo, tal como se describe en Chang HC & Reinherz EL (1989) European Journal of Immunology 19:1045-1051), HCC-1 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank Z49270), I-309 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank M57502), JE (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank AF058786, M28226), LAG-1 (gen de activación de linfocitos 1) (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X53683), LARC D86955), LD78 E03130, E03131, MARC (por ejemplo, tal como se describe en Thirion S et al (1994) Biochemical and Biophysical Research Communications 201: 493-499), MCAF M24545 y tal como se describe en Apella E et al (1990) Progress in Clinical and Biological Research 349: 405-17), MCP-1 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X14768), MCP-2 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank Y16645), MCP-3 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X72308, S71251), MCP-4 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X98306), MCP-5 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U50712), MIP (proteína inflamatoria de macrófagos) (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U77180, U77035, U49513, M35590), MRP-2 (por ejemplo, tal como se describe en Youn BS et al (1995) Journal of Immunology 155: 2661-7), RANTES SDF (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank M21121, M77747), TARC (por ejemplo, nº de registro de proteína Genbank Q92583).

Además hay varios otros factores que están relacionados con las quimiocinas pero que o bien aún no se han asignado a uno de los dos grupos de quimiocinas o bien que no presentan las características clásicas de ninguno de los dos grupos de quimiocina (por ejemplo, ATAC (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X86474), Ltn (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U15607, U23772), SCM-1 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank D63789, D63790, D43769). Se les ha denominado quimiocinas de tipo C o gamma-quimiocinas.

Se ha identificado aún otro grupo de quimiocinas que comprende neurotactina (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank AF010586, que se caracteriza por un motivo de firma de cisteína CX(3)C. La existencia de subgrupos de quimiocinas claramente definidos partiendo de la base de propiedades estructurales y funcionales ilustra la importancia de la diversidad de quimioatracción en la regulación del movimiento de leucocitos a través del organismo.

Las actividades biológicas de quimiocinas están mediadas por receptores específicos y también por receptores con especificidades de ligandos solapantes que se unen a varias de estas proteínas que siempre pertenecen o bien a las quimiocinas C-C o bien al grupo de quimiocinas C-X-C. Los receptores de quimiocina pertenecen al gran grupo de siete receptores de dominio transmembrana acoplados a proteína G que contienen siete segmentos hidrófobos de hélice alfa que atraviesan la membrana. Estos receptores forman un grupo relacionado estructuralmente dentro de la superfamilia de receptores acoplados a proteína G que median la señalización por medio de proteínas G heterotri-
méricas.

Los receptores que se unen a quimiocinas C-X-C se designan CXCR seguido por un número (por ejemplo, CXCR-1 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank L19591),CXCR-2 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank M94582), CXCR-3 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X95876), CXCR-4 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank D87747, AF025375) mientras que los que se unen a quimiocinas C-C se designan CCR seguido por un número (por ejemplo, CCR-1 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank L09230, U29678), CCR-2 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U29677, U95626), CCR-3 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U51241), CCR-4 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank X90862, X85740), CCR- 5 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U54994, U83327), CCR-6 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank U95626), CCR-7 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank L31581), CCR-8 (por ejemplo, polipéptidos codificados por el nº de registro Genbank Z98206, U45983). Homólogos de receptores de quimiocina virales incluyen ECRF-3, EBI-1 (gen 1 inducido por VEB) y US28.

A continuación, se asume que los efectos de combinación de múltiples quimiocinas y otros mediadores son responsables de la composición celular en sitios inflamatorios. Además, muchas quimiocinas también activan directamente células. Algunas de ellas activan granulocitos y/o monocitos y provocan explosiones respiratorias, desgranulación y la liberación de enzimas lisosómicas. Otras sensibilizan células inmunitarias para responder a cantidades inferiores a las óptimas de otros mediadores inflamatorios. Se ha mostrado que aún otras son potentes factores de liberación de histamina para basófilos. Se ha propuesto que los eritrocitos mediante su receptor de quimiocina promiscuo desempeñan un papel importante en la regulación de la red de quimiocina. Se sabe que las quimiocinas unidas al receptor de eritrocitos están inaccesibles para sus células diana normales. Esto parece proporcionar un sumidero para quimiocinas superfluas y puede servir para limitar los efectos sistémicos de estos mediadores sin alterar procesos localizados que tienen lugar en el sitio de la inflamación.

Ciertas quimiocinas C-C muestran actividades biológicas distintas de la simple quimiotaxis. Se ha mostrado que algunas quimiocinas pueden inducir la proliferación y la activación de linfocitos citolíticos conocidos como CHAK (linfocito citolítico activado por quimiocina C-C), que son similares a las células activadas por IL2.

Otra citocina particularmente útil según la invención es el ligando flt-3 (por ejemplo, polipéptidos codificados por los números de registro Genbank U04806, U04807, U03858, L23636, U29874, U29875, U44024). Esta citocina se une a la flt-3 tirosina cinasa (por ejemplo, polipéptidos codificados por los números de registro Genbank Z26652, X59398). El ligando flt-3 humano también estimula la proliferación de células que expresan receptores murinos de
flt-3.

Los efectos del ligando flt-3 son sinérgicos con la coexpresión de G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL3, PIXY-321 y SCF. En combinación con SCF e IL3, el ligando flt-3 puede provocar la expansión de células con la gama de marcadores CD34 (+) CD38 (-). El ligando flt-3 solo apoya la supervivencia de tipos de células precursoras en el linaje de células formadoras de sangre tales como CFU-GM, CFU-GEMM, y las células formadoras de colonias de alto potencial proliferativo muy primitivas. El ligando flt-3 sólo presenta efectos marginales sobre células progenitoras de megacariocitos y eritroides.

En el ratón, el ligando flt-3 potencia posiblemente el crecimiento de diversos tipos de células progenitoras/precur-
soras en sinergia con G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL3, IL6, IL7, IL11, IL12 y SCF. El ligando flt-3 apoya el crecimiento de LTC-IC (células de inicio de cultivo a largo plazo). La capacidad del ligando flt-3 para promover la supervivencia de células progenitoras hematopoyéticas se ve derogado por TGF-beta y contrarrestado por TNF-alfa.

Un estudio de la expresión del receptor de flt-3 funcional y las respuestas al ligando en AML (leucemia mieloide aguda) y ALL (leucemia linfoblástica aguda) muestra una heterogenicidad considerable. En particular BCP-ALL no logra proliferar en presencia de ligando flt-3 a pesar de la fuerte expresión de receptor de flt-3 de superficie.

Se ha demostrado que en pacientes con anemia aplásica y en pacientes con cáncer con supresión de hematopoyesis transitoria inducida por la quimioterapia, los niveles séricos de ligando flt-3 fluctúan en una relación inversa con respecto al grado de fallo de la médula ósea. Los niveles de ligando flt-3 en suero se correlacionan de manera inversa con la capacidad de formación de colonias in vitro de precursores de la médula ósea de pacientes con anemia aplásica. Se ha demostrado que el tratamiento con ligando flt-3 de ratones expuestos a células de fibrosarcoma singénicas da como resultado una regresión completa del tumor y una disminución de las tasas de crecimiento del tumor.

Las citocinas antitumorales son especialmente útiles en los procedimientos y las composiciones de la invención. Según la invención, una "citocina antitumoral" es una citocina que puede limitar el crecimiento o la metástasis de células tumorales in vitro o in vivo, o puede prolongar la supervivencia de un animal que porta un tumor, cuando o bien se mezcla con las células o bien se administra al animal. La citocina puede formularse como una disolución en un tampón biológicamente compatible, por ejemplo, PBS, y mezclarse con células tumorales in vitro. La concentración de citocina puede ser desde aproximadamente el intervalo picomolar hasta aproximadamente el intervalo micromolar. Por ejemplo, una citocina antitumoral reducirá la tasa de crecimiento de las células, por ejemplo, en por lo menos un 10% en comparación con tampón solo, o inhibirá las propiedades metastásicas de las células, tal como puede demostrarse, por ejemplo, mediante el aumento de la adhesividad celular o mediante la disminución de la capacidad para invadir un sustrato de matriz extracelular, tal como una membrana basal artificial. Alternativamente, una citocina antitumoral puede inhibir el crecimiento o la metástasis de un tumor in vivo, o puede prolongar la supervivencia de un animal que porta un tumor. Para evaluar los efectos antitumorales in vivo de una citocina, la citocina puede formularse en un vehículo farmacéuticamente aceptable y administrarse, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intratumoral o intraperitoneal. La citocina también puede administrarse en asociación con células, tales como células tumorales que expresan o están recubiertas con la citocina.

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Ensayos para determinar la bioactividad

Según la invención, se prefiere que una citocina sea "bioactiva", "sumamente bioactiva", "extremadamente bioactiva", "bioactiva de manera nativa" o "suprabioactiva". Diferentes niveles de bioactividad se refieren a la capacidad para inducir un cambio en un leucocito (distinto de la simple ocupación de los receptores del leucocito para la citocina). Según la invención, todas las citocinas que se producen de manera natural son bioactivas de manera nativa. Muchos tipos de ensayos pueden demostrar la bioactividad de una citocina que no se produce de manera natural. Por ejemplo, puede demostrarse que una citocina induce supervivencia y/o proliferación de un tipo de célula particular. Como otro ejemplo, una citocina puede cambiar la concentración de un mensajero secundario intracelular, tales como AMPc, ácido araquidónico, iones calcio o trifosfato de inositol. Los siguientes son ejemplos de ensayos para determinar la bioactividad:

Ensayo 1

Se carga cada pocillo de una o más bandejas de microtitulación Lux de 60 pocillos con 200 células FDC-P1 en 10 ul de medio de Eagle modificado por Dulbecco con una concentración final del 10% de suero de ternero recién nacido. Se añade citocina en una concentración como mucho en el intervalo micromolar a cada pocillo en un volumen de 5 ul. Se incuba la bandeja durante 48 h a 37ºC en CO_{2} al 10%. Se realizan recuentos de células viables. Se cuenta el número promedio de células viables/pocillo. Este ensayo es útil, por ejemplo, para identificar la bioactividad mediada mediante un receptor murino de GM-CSF.

Ensayo 2

Se diluyen en serie cada uno de una muestra de citocina y un patrón recombinante idéntico a una citocina que se produce de manera natural en RPMI-10 completo en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. Se coloca en placas cada dilución por triplicado. Se recogen células CT.4S en crecimiento en fase logarítmica activa, se lavan por lo menos dos veces en RPMI-10 completo y se resuspenden en RPMI-10 completo a 1 x 10^{5} células/ml. Se añaden 50 ul de la suspensión de células a cada pocillo de la placa, que después se incuban durante 24 h a 37ºC en CO_{2} al 5%. Se añade timidina tritiada a cada pocillo y se incuba la placa durante otras 24 h. Entonces se recogen las células y se mide la incorporación de tritio mediante recuento de centelleo líquido. Este ensayo es útil, por ejemplo, para identificar la bioactividad mediada mediante un receptor de IL-4.

Ensayo 3

Ensayo de formación de colonias

Se funde agar (4% p/v) en agua estéril hirviendo durante 3 min. Entonces se enfría el agar hasta 42ºC y se añade a RPMI-15 a 42ºC hasta una concentración final del 0,4%. Se mantiene la disolución a 42ºC. Se extraen fémures de ratones jóvenes utilizando una técnica estéril. Se recoge la médula haciendo pasar por los extremos abiertos de los huesos solución salina equilibrada de Hank (HBSS) estéril utilizando una jeringuilla equipada con una aguja 23G. Se coloca la médula en un tubo de cultivo tisular de 15 ml y se agita con vórtex hasta dar una suspensión celular. Se deja que sedimenten fragmentos de hueso durante 5 min., y se retira la suspensión sobrenadante. Se ajusta la suspensión hasta 7,5 x 10^{6} células nucleadas/ml y se diluye a 1:100 añadiendo el RPMI a 42ºC con agar al 0,4%. Se añaden diluciones en serie de dos veces de citocina a placas de cultivo tisular de 35 mm en un volumen < = 0,2 ml. A las placas de control no se les añade citocina. Se añade 1 ml de suspensión celular caliente a cada placa y se deja que el agar sedimente a temperatura ambiente. Se incuban los cultivos durante 5-7 días a 37ºC en CO_{2} al 5%. Entonces se evalúa la formación de colonias mediante microscopía. Se cuenta el número promedio de colonias de un tipo dado (o número agregado de colonias de tipos diferentes dados) sobre las placas de citocina y el número promedio sobre las placas
de control. Este ensayo es útil, por ejemplo, para identificar la bioactividad mediada mediante receptores de CSF.

Ensayo 4

Se diluye en serie citocina en RPMI 1640/HEPES 25 mm/BSA al 1%. Se colocan en placas 25 ul de cada dilución por triplicado en un fondo de cámara de quimiotaxia de múltiples pocillos. Los pocillos que sólo contienen medio sirven como controles negativos y los pocillos que contienen citocina que se produce de manera natural que induce quimiotaxia sirven como controles positivos. Se coloca una membrana de policarbonato sobre el fondo de la cámara y se monta la cámara. Se añaden 50 ul de células mononucleares de sangre periférica a 1,5 x 10^{6} células/ml en el RPMI/HEPES/BSA a cada uno de los pocillos superiores de la cámara. Se incuba la cámara durante 90 min. a 37ºC en CO_{2} al 5%. Se retira la membrana, se lava y se tiñe. Se cuentan mediante microscopía las células que migran en 3-5 campos al azar de cada pocillo.

Ensayo 5

Se diluye el patrón de referencia de citocina que se produce de manera natural hasta 2 ng/ml en un tubo de 17 x 100 mm utilizando medio complementado. También se preparan otras 3 diluciones en serie de 5 veces. Se preparan diluciones en serie de citocina en tubos de 17 x 100 mm desde 2 ng/ml hasta 20 pg/ml. Se añaden 50 ul de linfoblastos humanos activados por PHA, 4 x 10^{5} células/ml, en medio complementado a cada pocillo de una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. Se añaden 50 ul de cada dilución de patrón de referencia o citocina a pocillos por triplicado. Los pocillos de control negativo reciben 50 ul de medios complementados solos. Se incuba la placa durante 48 h a 37ºC en CO_{2} al 5% y se marcan las células con timidina tritiada. Se mide la incorporación mediante recuento de centelleo líquido. Este ensayo es útil, por ejemplo, para identificar la bioactividad mediada mediante un receptor de IL-12.

Ensayo 6

En otro ensayo para determinar la bioactividad, se vacuna un animal inmunocompetente con del orden de 10^{4}-10^{8} células tumorales recubiertas con citocina o transducidas con citocina irradiadas, y se expone a del orden de 10^{4}-10^{8} células tumorales de tipo natural vivas (en cualquier secuencia temporal). Las lecturas del ensayo son supervivencia, aparición del tumor o número de metástasis.

Ejemplos adicionales de ensayos de citocina pueden encontrarse, por ejemplo, en: Callard RE et al Assay for human B cell growth and differentiatiaton factors. En: Clemens MJ et al (eds) Lymphokines and Interferons. A practical Approach, págs. 345-64, IRL Press, Oxford 1987; Coligan JE et al Current protocols in immunology. Grene and Wiley-Interscience, Nueva York 1991); Dotsika EN Assays for mediators affecting cellular immune functions. Current Opinion in Immunology 2: 932-5 (1989); Feldmann M et al Cytokine assays: role in evaluation of the pathogenesis of autoimmunity. Immunological Reviews 119: 105-123 (1991); Guiguet M et al Misinterpretation of the biological activity of cytokine-containing preparations attributable to unrecognized interacting components. Analytical Biochemistry 247(2): 441-442 (1997); Hamblin AS & O'Garra A Assays for interleukins and other related factors. En: Lymphocytes, a practical approach, Klaus GGB (edt), págs. 209-28, IRL Press, Oxford, (1987); Laska EM & Meisner MJ Statistical methods and applications of bioassay. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 27: 385-97 (1987); Mosman TR & Fong TAT Specific assays for cytokine production by T cells Journal of Immunological Methods 116: 151-8 (1989); Newton RC & Uhl J Assays relevant to the detection and quantitation of cytokines and their inhibitors. Modem Methods in Pharmacol. 5: 83-99 (1989); Thorpe R et al Detection and measurement of cytokines. Blood Rev. 6: 133-48 (1992); van Zoelen EJ The use of biological assays for detection of polypeptide growth factors. Progress in Growth Factor Research 2: 131-52 (1990); Winstanley FP Cytokine bioassay. En: Gallagher G et al (eds) Tumor Immunobiology, A practical Approach. Oxford University Press, págs. 179-303 (1993); Wadha M et al Quantitative biological assays for individual cytokines. En: Balkwill FR (edt) Cytokines, A practical approach. Oxford University press, págs. 309-330 (1991).

Según la invención, si una citocina que no se produce de manera natural da una lectura en un ensayo para determinar la bioactividad que es por lo menos del 10% pero no más del 29% (al 1% más próximo) de la lectura proporcionada por una cantidad equimolar de una citocina que se produce de manera natural (dando esta última un resultado positivo en el ensayo), entonces la citocina que no se produce de manera natural es "bioactiva". Según la invención, si una citocina que no se produce de manera natural da una lectura en un ensayo para determinar la bioactividad que es por lo menos del 30% pero no más del 49% (al 1% más próximo) de la lectura proporcionada por una cantidad equimolar de una citocina que se produce de manera natural (dando esta última un resultado positivo en el ensayo), entonces la citocina que no se produce de manera natural es "sumamente bioactiva". Según la invención, si una citocina que no se produce de manera natural da una lectura en un ensayo para determinar la bioactividad que es por lo menos del 50% pero no más del 69% (al 1% más próximo) de la lectura proporcionada por una cantidad equimolar de una citocina que se produce de manera natural (dando esta última un resultado positivo en el ensayo), a continuación la citocina que no se produce de manera natural es "extremadamente bioactiva". Según la invención, si una citocina que no se produce de manera natural da una lectura en un ensayo para determinar la bioactividad que es por lo menos del 70% pero no más del 100% (al 1% más próximo) de la lectura proporcionada por una cantidad equimolar de una citocina que se produce de manera natural (dando esta última un resultado positivo en el ensayo), entonces la citocina que no se produce de manera natural es "bioactiva de manera nativa". Según la invención, si una citocina que no se produce de manera natural da una lectura en un ensayo para determinar la bioactividad que es superior al 100% de la lectura proporcionada por una cantidad equimolar de una citocina que se produce de manera natural (dando esta última un resultado positivo en el ensayo), entonces la citocina que no se produce de manera natural es "suprabioactiva".

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Opsoninas útiles según la invención

Tal como se definió anteriormente en la presente memoria, el término "opsonina" se refiere a moléculas que se producen de manera natural y que no se producen de manera natural que se unen tanto a antígenos como a células presentadoras de antígeno (APC), tales como, por ejemplo, leucocitos fagocíticos (incluyendo monocitos y macrófagos), células dendríticas (por ejemplo, células de Langerhans de la piel), linfocitos B y, en seres humanos, células endoteliales, o moléculas que pueden procesarse de tal manera que por lo menos un producto de la etapa o las etapas de procesamiento puede unirse tanto a antígenos como a células presentadoras de antígeno (APC), tales como, por ejemplo, leucocitos fagocíticos, células dendríticas, linfocitos B y, en seres humanos, células endoteliales.

Sin limitarse a ningún mecanismo de acción, se cree que células mejoradas en opsonina proporcionan un efecto beneficioso según la invención porque la parte de opsonina actúa como un agente de unión o acoplamiento entre el antígeno y la APC para permitir una unión, un envolvimiento y una internalización más eficaz del antígeno. Además, la propia opsonina puede internalizarse con el antígeno. La "internalización" se refiere a la captación celular de una molécula de tal manera que se lleva al citoplasma o un compartimento dentro del citoplasma de la célula. La fagocitosis es un proceso mediante el cual una célula internaliza una molécula.

Opsoninas preferidas son opsoninas no de roedores, por ejemplo, opsoninas de primate, por ejemplo, humanas. Las opsoninas útiles según la invención se unen a receptores sobre APC (por ejemplo, leucocitos fagocíticos, por ejemplo, macrófagos y otras células del sistema fagocítico) tales como receptores sobre células que desempeñan un papel en la inmunidad innata, tal como se describe en la presente memoria.

Algunos conjuntos de opsoninas pueden considerarse estructural y funcionalmente similares. Por ejemplo, una familia comprende fragmentos de componentes de complemento C3 y C4. Estos dos componentes son sumamente homólogos de manera estructural, y cada uno presenta un enlace tioléster intramolecular que se rompe cuando se escinde proteolíticamente un péptido (C3a o C4a respectivamente) de la molécula nativa. La rotura del tioléster hace que quede disponible una estructura química que puede formar un enlace éster con un antígeno. El resto de C3 sobre el cual se encuentra este enlace éster, es decir, el resto que no es C3a, se designa C3b, y C4b es el producto análogo de la escisión de C4. C3b puede someterse a proteolisis adicional mediante proteínas tales como factor I para dar fragmentos tales como C3bi y C3d, que también permanecen unidos al antígeno por medio del enlace éster.

Hay cuatro proteínas estructuralmente únicas que se sabe que funcionan como receptores de alta afinidad para fragmentos unidos a membrana, biológicamente activos, de C3 y/o C4. CR1 es el receptor principal para el fragmento C3b de C3 y el fragmento C4b de C4. Se expresa sobre monocitos y APC derivadas de monocitos, entre otros tipos de células. CR2 es el receptor principal para el fragmento de C3 conocido como C3d, y se expresa, por ejemplo, en linfocitos B maduros, pero no en células de linaje monocítico. Se cree que el papel principal de CR2 en linfocitos B es la coestimulación directa de células B en concierto con sus antígenos relacionados.

CR3 se expresa principalmente por neutrófilos y monocitos y también se expresa en FDC, células Kupffer y células citolíticas. CR3 es un receptor de fragmentos de C3 con una especificidad primaria por C3bi. Se ha propuesto CR3 como un organizador importante de acontecimientos citoesqueléticos necesarios para interacciones adhesivas y reorganización de membrana durante procesos tales como la fagocitosis.

CR4 es un miembro de la familia de de la beta-2-integrina, y su cadena alfa es estructuralmente similar a la cadena alfa de CR3 y LFA-1. Se cree que sus ligandos fisiológicos primarios son C3d y C3d,g; sin embargo, sus actividades biológicas se entienden peor que las de CR3.

Otro ejemplo de una familia de opsoninas innatas son las colectinas, un grupo de lectinas de tipo C de colágeno que comprende el componente de complemento C1q, proteína de unión a manosa, proteínas tensioactivas A y D y conglutinina. Cada molécula comprende un dominio de lectina que puede unirse a un antígeno, y un dominio colagenoso que puede unirse a receptores en células mononucleares fagocíticas, incluyendo receptores que son total o parcialmente idénticos al receptor de C1q (Nepomuceno et al, Immunity 6:119-29; Tenner et al, Immunity 3:485-93; Guan et al, J Immunol 152:4005-16; Geertsma et al, Am J Physiol 267: L578-84; Miyamura et al, Biochem J 300:237-42; Malhotra et al, J Exp Med 172:955-9; Malhotra et al, Biochem J 293:15-19). La mayoría de las colectinas conocidas comprenden múltiples cadenas polipeptídicas, en algunos casos homoméricas y en otros heteroméricas, que se ensamblan tras la traducción, en parte mediante reticulación covalente de residuos de hidroxiprolina y de hidroxilisina. Se demuestra que las colectinas son opsoninas, por ejemplo, en Pikaar et al, J Infect Dis 172:481-9; Alvarez-Dominguez et al, Infection & Immunity 61:3664-72; Kuhlman et al, J Exp Med 169:1733-45; y Geertsma et al, ya
citado.

Entre las otras opsoninas innatas útiles según la invención están la proteína C reactiva (CRP), alfa-2-macroglobulina y fibronectina. CRP, un miembro de la familia de moléculas de la pentraxina, se une a receptores en células de linaje monocítico y se ha demostrado que es una opsonina (Tebo y Mortenson, J Immunol 144:231-8; Holzer et al, J Immunol 133:1424-30). La alfa-2-macroglobulina, al igual que C3 y C4, comprende un enlace tioléster interno que puede romperse cuando se somete la molécula a proteolisis. Tal rotura permite la unión covalente de la molécula a un antígeno, y la unión de alfa-2-macroglobulina a una APC puede potenciar la captación del conjugado. La fibronectina se une a la alfa-5-beta-1-integrina y también puede unirse a diversos antígenos, permitiéndola funcionar como una opsonina (Cosio, J Lab Clin Med 103:613-9; Czop y Austen, J Immunol 129:2678-81).

Las inmunoglobulinas (anticuerpos) pueden funcionar como opsoninas uniéndose a antígenos mediante sus regiones variables y a APC mediante sus regiones constantes. Normalmente, una inmunoglobulina comprende dos cadenas pesadas que se unen covalentemente entre sí y cada una de las cuales se une a una cadena ligera. Estos heterotetrámeros pueden ensamblarse adicionalmente para dar estructuras de orden superior, tales como los pentámeros de IgM. Las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera pueden contribuir a la estructura del sitio de unión a antígeno, mientras que el sitio de unión a APC está situado en la región constante de cadena pesada. También se han descrito anticuerpos de una única cadena recombinantes. Los receptores de APC para inmunoglobulinas incluyen receptores Fc alfa, Fc gamma, Fc epsilon y Fc mu para IgA, IgG, IgE e IgM, respectivamente.

Se secretan las opsoninas que se expresan de manera natural por microorganismos eucariotas multicelulares. Esta última característica distingue las opsoninas de las moléculas de adhesión. Una molécula que no se produce de manera natural que contiene un resto de unión a APC que se produce de manera natural debe considerarse una opsonina si contiene un resto mediante el cual puede unirse o fijarse de manera estable a una célula de tal manera que el resto de unión a APC está situado en el espacio extracelular, tanto si la molécula contiene un resto de unión a antígeno de un antígeno que se produce de manera natural como si no. Restos mediante los cuales las moléculas pueden unirse de manera estable a una célula incluyen restos de reticulación, secuencias transmembrana y restos lipídicos. La preparación de proteínas que contiene estas secuencias o restos la conoce bien un experto en la materia.

Un "resto de unión a APC de una opsonina" es una secuencia o un dominio de una opsonina que cuando se incluye en una molécula quimérica permite la unión de la molécula quimérica a un receptor que se expresa fisiológicamente en una APC con una afinidad por lo menos en el intervalo nanomolar.

Hay varios ejemplos de fragmentos de opsonina que comprenden restos de unión a APC. Un fragmento de este tipo puede presentar cualquier longitud siempre que conserve una función de unión a APC; por ejemplo, puede presentar aproximadamente 40 aminoácidos, 100 aminoácidos, 150 aminoácidos, 500 aminoácidos, 800 aminoácidos o incluso hasta 3000 aminoácidos. Por ejemplo, Las Holtet et al, 1994, FEBS Lett 344:242 describe un fragmento carboxilo terminal de \alpha2m humana (val1299-ala1451) que se une con alta afinidad al receptor de \alpha2m. Fragmentos que comprenden los aminoácidos 1314-1451 de la \alpha2m humana y el correspondiente dominio de \alpha2m de rata también se unen a receptores de \alpha2m, aunque con el 1-2% de la afinidad de la \alpha2m nativa (Van Leuven et al, 1986, J Biol Chem 261:11369; Enghild et al, 1989, Biochemistry 28:1406; Salvesen et al, 1992, FEBS Lett 313: 198; Sottrup-Jensen et al, 1986, FEBS Lett 205:20).

Becherer y Lambris, 1988, J Biol Chem 263:14586 describen fragmentos de C3b que se unen a CR1, por ejemplo, C3c, fragmentos de C3 generados mediante tratamiento con elastasa y que comprenden el extremo N-terminal de la cadena alfa de C3b, y un péptido sintético que comprende los 42 aminoácidos N-terminales de la cadena alfa de C3b. También se ha descrito una secuencia de unión en C3 para CR3 (Wright et al, 1987, PNAS 84:4235).

"Tallos de colágeno" de C1q, que son fragmentos N-terminales obtenidos mediante digestión con pepsina, se unen al receptor de C1q (Reid, 1981, Methods Enzymol 80:16; Malhotra et al, 1993, Biochem J 293:15). Malhotra et al, ibid., también proporcionan evidencias de que un resto de unión a APC de conglutinina está comprendido en sus 55 aminoácidos N-terminales. Ezekowitz (patente US 5.270.199) ofrece un posible sitio de unión a APC en la proteína de unión a manosa humana que consiste en los nucleótidos 370-438 de la figura 2 en la patente '199. Además, por homo-
logía con la conglutinina, el exón 1 dado a conocer en la patente '199 puede comprender un resto de unión a APC.

Un resto de unión a APC de la IgG comprende el dominio CH2 y la región de bisagra inferior, incluyendo los residuos 234-237, tal como se describe por Canfield y Morrison, 1991, J Exp Med 173:1483-91; Lund et al, 1991, J Immunol 147: 2657-62; y Sarmay et al, 1992, Mol Immunol, 29:633-9.

Ejemplos de opsoninas que pueden utilizarse en las composiciones y los procedimientos de la invención incluyen fibronectina (por ejemplo, números de registro de Genbank X02761, K00799, K02273, X82402, X00307, X00739), CRP (por ejemplo, números de registro de Genbank X17496, M11880, M11881, M11882), componentes de complemento tales como C1q (por ejemplo, números de registro de Genbank X66295, M22531, X03084, X58861, y números de registro de Swiss-Prot P02747, P02745), fragmentos de complemento tales como C3b y C3d (por ejemplo, números de registro de Genbank K02782, K02765), proteína de unión a manosa (por ejemplo, números de registro de Genbank S42292, S42294, X15422), conglutinina (por ejemplo, número de registro de Genbank X71774), alfa-2-macroglobulina (por ejemplo, números de registro de Genbank M93264, M11313) y proteínas tensioactivas A (por ejemplo, números de registro de Genbank M68519, S48768) y D (por ejemplo, números de registro de Genbank L40156, X65018, S38981), inmunoglobulinas y sus homólogos entre especies.

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TABLA 1

1

TABLA 1 (continuación)

2

Determinación de opsonicidad según la invención

Se considera que una opsonina dada que se produce de manera natural es útil según la invención si se determina que presenta opsonicidad según uno o más de los siguientes ensayos, y si es una molécula secretada.

Ensayo 1

En un ensayo de opsonicidad, tal como se describe por O'Rear y Ross en Current Protocols in Immunology, 1994, John Wiley & Sons, págs. 13.4.5-9, se obtienen SRBC unidas por medio de un enlace que se produce de manera fisiológica a la molécula de opsonina candidata. Se suspenden APC de la especie de la que es nativa la opsonina candidata a 4 x 10^{6}/ml en HBSS helada con el 1%(p/v) de fracción de Cohn de BSA. Si la opsonina candidata es un fragmento de C3, las APC son monocitos de sangre periférica sin cultivar, recién extraídos. Se suspenden SRBC unidas a la opsonina candidata o SRBC control (idénticas a las anteriores pero no unidas a la opsonina candidata) en la misma disolución a 2 x 10^{8}/ml. Se mezclan 100 ul de suspensión de SRBC y 100 ul de suspensión de APC en un tubo de plástico de 10 x 75 mm. Se hace girar el tubo a 40 rpm a 37ºC durante 2-20 min. Se coloca una pequeña gota de la suspensión en un portaobjetos, se cubre con un cubreobjetos y se deja reposar durante 5-10 min. Puede retirarse el fluido en exceso mediante presión sobre el cubreobjetos, y puede sellarse el cubreobjetos al portaobjetos, por ejemplo, con laca de uñas transparente. Se examina el portaobjetos al microscopio, y se determina el porcentaje de las APC visiblemente adherentes a 4 o más SRBC. Si el porcentaje es del 50% o superior cuando hay hasta 4 x 10^{4} moléculas de opsonina candidatas/SRBC, la opsonina candidata puede ser una opsonina.

Ensayo 2

Para opsonina candidata activada por proteasa

Se trata opsonina candidata u opsonina candidata radiomarcada con un exceso molar de 1,5-3 veces de proteasa (trietanolamina 0,05 M-NaCl 0,1 M, pH 8,0, temperatura ambiente durante la noche). En este ensayo, la proteasa puede servir como el antígeno o puede añadirse un exceso de otro antígeno. Antes de los estudios de unión, se dializa el complejo opsonina candidata-antígeno contra HBSS (4ºC).

Se mide la unión del complejo opsonina candidata-antígeno a monocitos incubando ligando marcado a una concentración de hasta 1,0 M con (1,5-4,0) x 10^{6} monocitos en un volumen de 200 ml sobre hielo. Se determina la unión no específica de ligandos radiomarcados en presencia de un exceso molar de 100 veces de complejo opsonina candidata-antígeno marcado. Se separa el ligando no unido de las células y el ligando unido a células mediante una filtración rápida a vacío sobre filtros de fibra de vidrio. Se realizan estudios sobre hielo para evitar posibles complicaciones debidas a la endocitosis. Se determinan las constantes de unión y el número de sitios por célula mediante análisis y mediante ajuste de curva no lineal. Si la afinidad del complejo opsonina candidata-antígeno para un sitio de unión a monocito está por lo menos en el intervalo nanomolar, la opsonina candidata es una opsonina.

Ensayo 3

Parte I

Para evaluar directamente si una opsonina candidata está unida a la superficie de P. carinii, se realiza microscopía inmunoelectrónica. Se aíslan P. carinii de lavado broncoalveloar (BAL) de ratas infectadas moribundas utilizando TBS con calcio 1 mm para conservar la opsonina candidata unida a la superficie. Se fijan microorganismos aislados en tampón de peryodato-lisina-paraformaldehído y se incrustan en medio de montaje Lowacryl (Ted Pella, Inc., Redding, CA). Se obtienen secciones ultradelgadas, se bloquean con suero de cabra normal (2%) durante 1 h y se incuban o bien con anticuerpo de conejo anti-opsonina candidata o bien con IgG de conejo no inmunitaria (25 mg/ml) durante la noche. Tras lavarlas, se incuban posteriormente las secciones con conjugado de IgG de conejo y cabra con oro coloidal 15 nM (Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Se lavan las secciones de nuevo y se examinan en un microscopio electrónico de transmisión (modelo 6400: JEOL USA, Inc., Peabody, MA).

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Parte II

La fijación de P. carinii a macrófagos alveolares cultivados en presencia o en ausencia de anticuerpo frente a la opsonina candidata o con la adición de candidato purificado se cuantifica tal como sigue. Se somete a ensayo la adherencia de P. carinii a macrófagos alveolares marcando con ^{51}Cr los microorganismos. Se aíslan P. carinii de ratas infectadas con TBS que contiene calcio 1 mm para prevenir la pérdida de opsonina candidata unida a la superficie. Se radiomarcan los microorganismos mediante incubación durante 8 h a 37ºC en 2 ml de DME que contiene FCS al 20% y 200 mCi de ^{51}Cr-cromato de sodio (New England Nuclear). Se extraen mediante lavado macrófagos alveolares normales a partir de ratas sanas y se colocan en placas de cultivo tisular (1 X 10^{5} células/pocillo) que se habían recubierto previamente con IgG de rata normal (100 mg/ml X 60 min.) con el fin de garantizar una adherencia firme de los macrófagos. Tras 1 h, se lavan suavemente los macrófagos con HBSS para eliminar las células no adherentes. > 95% de los macrófagos son adherentes tras este lavado. Se añaden ^{51}Cr-P. carinii (1 X 10^{6}) que contienen opsonina candidata asociada a la superficie a los macrófagos y se incuban a 37ºC durante una hora adicional. Posteriormente, se eliminan mediante lavado los P. carinii no adherentes. Se solubilizan las monocapas de macrófago que contienen P. carinii adherentes en NaOH 1 N y se cuantifican. La adherencia de P. carinii se define como: porcentaje de adherencia =
(A/A+ B) X 100, en la que A = ^{51}Cr-P. carinii asociados con la monocapa, y B = ^{51}Cr-P. carinii no fijados. Para evaluar el efecto de la opsonina candidata sobre la fijación de P. carinii a células pulmonares de macrófagos alveolares en cultivo, se realizan ensayos de adherencia de P. carinii en presencia o ausencia de un anticuerpo de conejo policlonal generado contra la opsonina candidata (100 mg/ml).

Si la unión de la opsonina candidata a P. carinii es evidente en la parte I y si, en la parte II, el % de adherencia disminuye en presencia de anticuerpo anti-opsonina candidata con significación estadística de P < 0,05, la opsonina candidata es una opsonina.

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Ensayo 4

La asociación de bacterias con monocitos adherentes se mide tal como sigue. El nivel de endotoxina en la PBS modificada y en todos los tampones es inferior a 50 pg/ml según se determina mediante el ensayo de Limulus. Se deja que se adhieran 5 x 10^{3} monocitos en PBS modificada a los pocillos de una placa Terasaki durante 2 h a 37ºC. Tras retirar las células no adherentes mediante tres lavados con PBS, se añaden 5 X 10^{4} bacterias marcadas con FITC en 0,5 ml de tampón con o sin 10-50 microgramos/ml de opsonina candidata. Se utiliza una razón de bacterias con respecto a monocito de 10:1 a 50:1. Tras 30 min. de incubación a 37ºC en la oscuridad, se retiran las bacterias no adherentes mediante cinco lavados con PBS caliente. Se realizan ensayos por cuadruplicado; en cada pocillo, se cuenta el número de bacterias asociadas con ^{3} 100 monocitos bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un aumento de x 400. Los resultados se expresan como el número de bacterias asociadas con 100 monocitos. Si este número con la opsonina candidata puede ser por lo menos dos veces el de sin opsonina candidata, la opsonina candidata es una
opsonina.

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Ensayo 5

Parte I

Se incuban aproximadamente de 1 x 10^{7} a 6 x 10^{7} bacterias por ml (20 min., 0ºC) con 10 mcg/ml de ^{125}I-opsonina candidata en un volumen total de 0,7 ml. Se colocan en capas alícuotas de PBS, 100 ml, de las mezclas de reacción sobre 150 ml de un cojín de aceite (60% de ftalato de dibutilo, 40% de ftalato de dioctilo [Eastman Kodak Co., Rochester, N.Y.]) y se centrifugan las mezclas (10.000 x g, 60 s, 4ºC). Se corta la punta del tubo, que contiene el sedimento celular, con una cuchilla Mozart y se cuenta la radioactividad.

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Parte II

Se colocan en placa las APC en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Costar, Cambridge, Mass.) a 2 x 14^{5} células por ml la tarde antes de su utilización. Se añaden 2 x 10^{6} bacterias por pocillo (0,1 ml por pocillo) a las placas de cultivo con o sin 100 mcg/ml de opsonina candidata. Entonces se centrifugan las placas a 1.000 x g durante 7 min. Tras 15 min. a 37ºC para permitir la captación de bacterias, se retiran las bacterias libres mediante varios lavados con PBS frío. Entonces se incuban (45 min., 37ºC) en RPMI 1640 más una cantidad de antibiótico que, cuando está presente en el cultivo durante 45 min., elimina a todas las bacterias extracelulares. El final de este periodo de incubación se considera el tiempo cero. Se lavan las monocapas tres veces con solución salina equilibrada de Hank, y se añade el mismo volumen de RPMI 1640 (R0). Se someten a lisis las células utilizando varios ciclos de congelación descongelación. Se determina el número (CFU) de bacterias viables por pocillo mediante recuentos de placa cuantitativos sobre placas de agar sangre (Columbia blood agar; Becton Dickinson, San Jose, Calif.) tras 24 h de incubación. Cada resultado se facilita como la media de tres determinaciones.

Si, en la parte I, el sedimento de bacterias tratadas con opsonina candidata presenta >75 KCPM y esta incorporación puede inhibirse mediante opsonina candidata no marcada, y si en la parte II las CFU con opsonina candidata son mayores que sin ella (P<0,05), la opsonina candidata puede ser una opsonina.

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Ensayo 6

Se preparan 200 \mul de GHBSS (solución salina equilibrada de Hank) + 0,1% de gelatina que contiene 10 mmoles de CaCl_{2}) que contiene 10^{7} bacterias. Entonces se incuban las bacterias a 4ºC con 20-100 \mug/ml de opsonina candidata. Se realizan ensayos de unión en presencia o ausencia de un inhibidor competitivo. Tras la incubación durante 30 minutos, se lavan las bacterias cinco veces en una GHBSS + 10 de mmoles de CaCl_{2} a temperatura ambiente en una microcentrifugadora a 1.300 g durante 3 minutos. Posteriormente, se incuba una dilución 1:1.000 de antisuero de conejo anti-opsonina candidata con las bacterias durante 1 h en PBS + FCS al 5% y 10 mmoles de CaCl_{2} y después se lavan las bacterias tres veces en GHBSS + 10 mmoles de CaCl_{2} más Tween 20 al 0,05%. Se detecta la unión de anti-suero a bacterias mediante una dilución 1:1.000 de IgG de cabra anti-conejo conjugada con rodamina (Fisher Pharmaceuticals, Orangeburg, NY). Tras la incubación, se lavan las bacterias cinco veces en GHBSS + 10 mmoles de CaCl_{2} más Tween 20 al 0,05%, se extienden sobre portaobjetos de vidrio y se dejan secar al aire. Posteriormente se fijan bacterias con metanol helado al 100% durante 5 minutos. Los controles negativos incluyeron ausencia de opsonina candidata y ningún anticuerpo de primera etapa. Se examinan numerosos campos de ensayos por triplicado mediante microscopía de fluorescencia.

Parte II

Asociación de bacterias radiomarcadas con células

Vuelven a suspenderse 10^{7} bacterias radiomarcadas en 200 \mul de GHBSS + 10 mmoles de CaCl_{2} y se incuban con o sin opsonina candidata que oscila desde 2 \mug/ml hasta 40 \mug/ml a 4ºC durante 30 min. Entonces se lavan las bacterias tres veces en GHBSS + 10 mmoles de CaCl_{2} durante 3 min. a temperatura ambiente en una microcentrifugadora a 1.300 g, se resuspenden en 50 \mul de GHBSS y se añaden a una suspensión de 1 ml que contiene del orden de 10^{6} APC (GHBSS). Se agitan con balanceo suavemente las bacterias y las APC a 37ºC durante 20 min. y posteriormente se eliminan las bacterias no fijadas mediante cinco lavados utilizando una centrifugación diferencial a 82 g en una microcentrifugadora. Antes del último lavado, se coloca en placa una alícuota de cada muestra sobre un portaobjetos Labtek y se adhieren células durante 10 min., se fijan en metanol, se tiñen con Giemsa y se puntúan mediante microscopía óptica. Para puntuar las células colocadas en placas sobre los portaobjetos Labtek, se cuentan por lo menos 400 células. El índice fagocigótico representó el número de partículas fijadas o ingeridas por 100 PMN. Entonces se somete a lisis el sedimento anterior que contiene células y bacterias radiomarcadas en 100 \mul de PBS + Triton X-100 al 0,5% y se mide la radiactividad en un contador de centelleo. Si, en la parte I, la unión específica de opsonina candidata a bacterias es evidente, y en la parte II la captación específica de bacterias, en cpm, es más de tres veces superior con opsonina candidata que sin ella, la opsonina candidata puede ser una opsonina.

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Ensayo 7

Parte I

Para investigar la unión a L donovani promastigotes, se siembran cultivos a 5 x 10^{5} parásitos ml^{-1}. En puntos de tiempo regulares hasta 9 días, se cuenta una fracción de parásitos, se lava y se resuspende en BSA al 1%, Ca^{2+} 0,5 mm, NaN_{3} al 0,05%, solución salina tamponada con Tris (TBS), (Tris-HCl 10 mm, NaCl 0,15 M, pH 8,0) (diluyente) hasta 2 x 10^{5} ml^{-1}. Entonces se añaden cincuenta microlitros de esta suspensión a tubos de microcentrifugadora de 200 \mul que contienen 70 \mul de opsonina candidata radiomarcada 5 \mug/ml (0,12 \muCi/\mug) en diluyente sin EDTA, que se había colocado en capas sobre 150 \mul de una mezcla de aceite de ftalato de dinonilo/ftalato de dibutilo (40:60 v/v). Se incuban parásitos durante 1 h y se centrifugan a través de la capa de aceite, se corta el sedimento celular y se detecta el candidato asociado mediante recuento gamma. Cada ensayo se realiza por triplicado. Asimismo, se mide la dependencia de la concentración de la unión de candidato a promastigotos tal como anteriormente, utilizando una actividad de 0,045 \muCi/\mug y una serie de diluciones de dos veces desde 60 hasta 0,015 \mug/ml de candidato.

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Parte II

Se colocan en placas APC a 1 x 10^{6} células/pocillo sobre cubreobjetos de vidrio en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. Se incuban células en RPMI 1640 (Life Technologies) complementado con PCS al 10%, glutamina 1 mm, penicilina 200 U/ml y estreptomicina 200 \mug/ml en un incubador humidificado a 37ºC. Tras 24 h, se retiran las células no adherentes y se utilizan las células restantes tras 6 días. Se incuban promastigotos con o sin candidato a 30 \mug/ml en RPMI 1640 durante 1 h y entonces se lavan tres veces antes de añadirlos a los cultivos de APC a 10^{6}/pocillo. Se deja que los promastigotos infecten las APC durante 1 h, entonces se lavan las células, se fijan con metanol y se tiñen con Geimsa (BDH, Poole, Dorset, R.U.) antes de realizar el recuento. Se determina el porcentaje de APC infectadas y el número de parásitos/100 macrófagos a partir de cultivos por cuadruplicado.

Si en la parte I la afinidad de opsonina candidata por los parásitos está por lo menos en el intervalo nanomolar y en la parte II el número de parásitos captados/100 APC es, con opsonina candidata, por lo menos dos veces el de sin opsonina candidata, la opsonina candidata puede ser una opsonina.

Ensayo 8

Parte I

Se incuban porciones (0,5 ml) de medio de cultivo marcado con [^{35}S]metionina que contiene suero de ternero fetal al 5 por ciento y la opsonina candidata durante 30 minutos a temperatura ambiente con 0,1 ml o 0,2 ml de una suspensión al 10 por ciento de un microorganismo). Los microorganismos sometidos a prueba pueden incluir, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. Se liberan las proteínas unidas mediante ebullición en tampón que contiene SDS al 2 por ciento y ditiotreitol 0,1 M y se analizan en un gel de SDS al 5 por ciento.

Parte II

Se incuban bacterias fijadas (0,1 ml; 10 por ciento en volumen; 10^{10} microorganismos por mililitro), marcadas con [^{3}H]timidina, con 0,1 ml de suero con o sin depleción de la opsonina candidata. Tras lavarlas con PBS, se incuban las bacterias con del orden de 1 x 10^{7} APC en un volumen final de 0,9 ml de PBS que contiene cationes divalentes. A intervalos se retiran 0,2 ml a PBS helado con N-etilmaleimida (2 mm) para bloquear la endocitosis adicional y se lavan las células (a aproximadamente 100 g durante 10 segundos).

Si en la parte I una banda correspondiente a la opsonina candidata es evidente, y si en la parte II el CPM tras 6-10 min. de incubación es por lo menos tres veces superior para muestras sin depleción con suero que con depleción de suero, la opsonina candidata puede ser una opsonina.

En lugar de los resultados de las partes I de los ensayos 3, 5, 6, 7, 8, una opsonina candidata que satisface la parte II de un ensayo puede ser una opsonina si puede unirse al antígeno del ensayo con una afinidad por lo menos en el intervalo nanomolar.

Ensayo 9

Se preparan SRBC recubiertas con por lo menos 1,2 x 10^{4} moléculas/célula de un fragmento de C3 tal como se describe por O'Rear y Ross en Current Protocols in Immunology, 1994, John Wiley & Sons, págs. 13.4.5-9. Se añaden 250 ul de monocitos a 2 x 10^{5} células/ml de RPMI con suero de ternero fetal al 10% a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de vidrio de 8 pocillos y se incuban a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 3 h. Se lavan dos veces los monocitos con HBSS y se añaden 50 ul de SRBC a 1,5 x 10^{8}/ml de DVBS^{2+} a cada pocillo. Se centrifuga la placa a 50 g durante 5 min. y entonces se incuba a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 3 h. Se lavan dos veces los pocillos con HBSS, se fijan con glutaraldehído al 0,5% y se tiñen con tinción Giemsa. Si >40% de los monocitos forman rosetas con por lo menos 1 SRBC según se determina mediante microscopía óptica, el candidato puede ser una opsonina.

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Opsoninas, o citocinas, obtenidas mediante ingeniería genética, que contienen un lípido

La fijación de un lípido, por ejemplo un ácido graso de cadena larga, a una molécula, por ejemplo, un polipéptido, puede permitir que el complejo se asocie de manera estable con la membrana plasmática cuando se mezcla el complejo con una célula (Nagarajan et al, 1995, J Immunol Methods 184:241-51; McHugh et al, 1995, PNAS 92:8059-63; van den Berg et al, 1995, J Cell Biol, 131:669-77). Se cree que esto se produce mediante la intercalación del lípido en la membrana. Un procedimiento conveniente de producción de un polipéptido asociado a lípidos comprende expresar, en una célula huésped adecuada, un ácido nucleico que codifica para, en parte, una secuencia señal que dirige la adición postraduccional de un resto GPI. Utilizando tecnología de ADN recombinante, puede expresarse una proteína no unida a GPI de manera natural como una proteína unida a GPI construyendo un ácido nucleico que codifica para la proteína unida a una secuencia señal de GPI heteróloga. Las secuencias de nucleótidos que codifican para secuencias señal de GPI útiles para este fin incluyen, por ejemplo, las comprendidas por factor acelerador de la degradación (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "22" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32; secuencias que codifican para secuencias señal dadas a conocer en Caras et al, patente US 5.109.113); brevicano (por ejemplo, nt 1982-2047 del número de registro de Genbank X86406), mesotelina (por ejemplo, nt 1858-1983 de Genbank U40434), antígeno 2 de Coccidioides immitis (por ejemplo, secuencias que codifican para los aminoácidos 172-194 del nº de registro de la base de datos de proteínas NCBI Entrez 1256444, Zhu et al, 1996, Gene 181: 121-5), acetilcolinesterasa (por ejemplo, secuencias que codifican para el péptido "HC" tal como se describe en Duval et al, 1992, EMBO J 11:3255-61; (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "19" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32)), receptores alfa y beta de folato humanos (por ejemplo, secuencias que codifican para los aminoácidos 230-257 del nº de registro de la base de datos de proteínas NCBI Entrez 182416 o los aminoácidos 228-255 del nº de registro de la base de datos de proteínas NCBI Entrez 1655592, Yan y Ratnam, 1995, Biochemistry 34:14594-600), 5'-nucleotidasa (por ejemplo, secuencias que codifican para los aminoácidos 547-570 ó 547-574 del nº de registro de la base de datos de proteínas NCBI Entrez 404502, Furukawa et al, 1994, Biochim Biophys Acta 1190:273-8; (por ejemplo, secuencias que codifican para las secuencias de aminoácidos "5" ó "6" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32)), CD59 (por ejemplo, codificado por los nt 393-473 de Genbank U48255; secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "20" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32; secuencias que codifican para los aminoácidos 74-101 de la figura 2 de Powell et al, 1997, J Immunol 158:1692-1702), T-caderina (por ejemplo, secuencias que codifican para los 76 aminoácidos C-terminales de la T-caderina de pollo tal como se describe por Koller y Ranscht, 1996, J Biol Chem 271:30061-7), aminopeptidasa P (por ejemplo, secuencias que codifican para los aminoácidos 649-673 del nº de registro de la base de datos de proteínas NCBI Entrez 1517942, Hyde et al, 1996, Biochem J 319:197-201), carboxipeptidasa M, CD16B, Thy 1, anhidrasa carbónica IV (por ejemplo, secuencias que codifican para los aminoácidos 284-312 del nº de registro de la base de datos de proteínas NCBI Entrez 179791, Okuyama et al, 1995, Arch Biochem Biophys 320:315-22), fosfatasa alcalina de placenta (por ejemplo, secuencias que codifican para los aminoácidos 498-529 del nº de registro de la base de datos de proteínas NCBI Entrez 178464, Oda et al, 1994, Biochem J 301:577-83), glicoproteína F3 neuronal, antígeno carcinoembrionario (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "28" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), MRC-OX45 (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "2" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), RT 6.2 (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "3" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), antígeno específico de preesporas de D. discoideum (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "4" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), dipeptidasa microsómica (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "8" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), CAMPATH-1 (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "9" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292: 223-32), PARP de T. brucei (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "10" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), VSG Mit 118a de T. brucei (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "11" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), VSG Mit 117a T. brucei (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "12" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292: 223-32), VSG MITat 1.1000 BC de T. brucei (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "13" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), VSG MITat 1.5b de T. brucei (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "14" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), VSG ILTat 1.1 de T. brucei (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "15" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), VSG TxTat 1 de T. brucei (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "16" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), VSG Mit 221 de T. brucei (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "17" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), proteínas priónicas (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "18" en la tabla I de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), receptor de urocinasa (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "21" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), VSG YNat 1.1 de T. congolense (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "23" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), GAS-1 de S. cerevesiae (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "24" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), Thy-1 (por ejemplo, secuencias que codifican para las secuencias de aminoácidos "25" ó "26" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), PSP de L. major (por ejemplo, secuencias que codifican para la secuencia de aminoácidos "29" en la tabla 1 de Bucht y Hjalmarsson, 1996, Biochim Biophys Acta 1292:223-32), glicoproteína A de sitio de contacto de D. discoideum (por ejemplo, secuencias que codifican para los 25 aminoácidos C-terminales tal como se describe en Barth et al, 1996, Biochem J 317:533-40) CD24, y secuencias sintéticas (por ejemplo, tal como se describe por Coyne et al, 1993, J Biol Chem 268:6689-93).

Pueden extraerse polipéptidos unidos a GPI a partir de células utilizando el siguiente procedimiento. Se separan por centrifugación 5 x 10^{6} células y se congelan a -80ºC. Se descongela el sedimento en 14 ml de NaCl 0,15 M/Tris 10 mm, primaquina/Trito X-114 al 2% 7,4/0,1 mm con agitación a 0ºC durante 1 h, entonces se centrifugan a 8800 g a 0ºC durante 10 min. Se mantiene el sobrenadante a -20ºC durante la noche, se descongela a temperatura ambiente y entonces se coloca a 32ºC durante 12 min. Entonces se centrifuga a 3000 g durante 3 min. a 32ºC. Se decanta la fase superior y se añaden 11 ml de tampón A frío (NaCl 0,15 M/Tris 10 mm, primaquina/Triton X-114 al 0,06% 7,4/0,1 mm) a la fase inferior. Esto se incuba sobre hielo durante 10 min. Se repiten la incubación durante 12 min. a 32ºC, la centrifugación a 32ºC a 3000 g, la decantación de la fase superior y la adición de 11 ml de tampón A frío a la fase inferior. Se centrifuga la disolución a 18000 g durante 10 min. a 0ºC. Se repiten la incubación durante 12 min. a 32ºC, la centrifugación a 32ºC a 3000 g y la decantación de la fase superior. Se añaden 3 vol. de acetona fría a la fase inferior final. Se centrifuga la disolución a 12.000 RPM durante 30 min., se retira el sobrenadante y se seca a vacío el sedimento proteico que contiene la fracción de GPI. Pueden purificarse proteínas específicas mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, purificación mediante inmunoafinidad.

Otro procedimiento de producción de citocina, u opsonina, obtenida mediante ingeniería genética unida a lípidos, es unir químicamente el polipéptido a un ácido graso tal como palmitato. Se suspenden 1,5 mg/ml del polipéptido en PBS, pH 7,8, que contiene ácido desoxicólico al 0,3%, bicarbonato de sodio al 0,1% y azida de sodio al 0,1%. El pH final óptimo de la disolución es de 7,6-8,0. Se calienta la mezcla hasta 37ºC y se añade el éster N-hidroxisuccinimídico del ácido palmítico (Research Organics, Cleveland, OH) a una concentración final de 0,1 mg/ml. Se incuba la disolución durante la noche a temperatura ambiente. Se purifica el polipéptido mediante paso a través de una columna de cromatografía Sephadex G-75 de 16 x 250 mm equilibrada con ácido desoxicólico al 0,15% en PBS, pH 7,6.

Restos de reticulación útiles según la invención

Otro procedimiento conveniente de unir una citocina, o una opsonina, a una célula o una estructura de tipo celular es utilizar un agente de reticulación. Un "agente de reticulación" es una entidad química que puede reaccionar con grupos funcionales en por lo menos otras dos moléculas, por ejemplo, dos polipéptidos o un polipéptido y un lípido, de tal manera que tras la reacción con el agente de reticulación las dos moléculas quedan unidas covalentemente.

En la materia se conoce una amplia variedad de agentes de reticulación, tanto bifuncionales como polifuncionales, y están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Sigma (St. Louis, MO). Éstos incluyen, por ejemplo, anhídrido S-acetilmercaptosuccínico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido S-acetiltioglicólico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido S-acetiltiopropiónico, dihidrazida de ácido adípico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-azidobenzoico, N-(5-azido-2-nitrobenciloxi)succinimida, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 6-(4-azido-2-nitrofenilamino)hexanoico, bromuro de p-azidofenacilo, N-(4-azidofeniltio)ftalimida, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-azidosalicílico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido bromoacético, 1,4-butanodiol diglicidil éter, carbonil-bis(éster p-nitrofenílico de L-metionina), éster p-nitrofenílico del ácido 2-diazo-3,3,3-trifluoropropiónico, malonimidato de dietilo, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno, ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, adipimidato de dimetilo, 3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo, pimelimidato de dimetilo, suberimidato de dimetilo, azida de 4,4'-ditiobisfenilo, ditiobis(éster N-hidroxisuccinimídico del ácido propiónico), etilenglicol-bis-(éster N-hidroxisuccinimídico del ácido succínico), azida de 4-fluoro-3-nitrofenilo, bis-(4-fluoro-3-nitrofenil)sulfona, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido p-formilbenzoico, glutaraldehído, 2-iminotiolano, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 6-(yodoacetamido)caproico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido yodoacético, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 3-malemidoacético, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 3-malemidobenzoico, 4-(N-malemido)benzofenona, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido gamma-malemidobutírico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido epsilon-malemidocaproico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-(N-malemidometil)ciclohexanocarboxílico, éster 3-sulfo-N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-(N-malemidometil)ciclohexanocarboxílico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido beta-malemidopropiónico, N,N'-bis(3-malemidopropionil)-2-hidroxi-1,3-propanodiamina, diisotiocianato de 1,4-fenileno, N,N'-o-fenilendimalemida, N,N'-p-fenilendimalemida, polioxietilen-bis(glicidil éter), bis(polioxietilen-bis(glicidil éter)), polioxietilen-bis(imidazolilcarbonilo), bis(polioxietilen-bis(imidazolilcarbonilo)), polioxietilen-bis(carbonato de p-nitrofenilo), éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico, éster bis(N-hidroxisuccinimídico) del ácido subérico, éster malemidoetil-N-hidroxisuccinimídico del ácido succínico, 1,5-bis(succinimidooxicarboniloxi)-pentano y carbonato de bis(N-succinimidilo).

Determinación de la unión de opsonina, o citocina, unida a GPI, a células según la invención

En ciertas formas de realización de la invención, una opsonina, o citocina, se diseña mediante ingeniería genética para contener GPI o un resto de GPI que contiene un lípido y por tanto permite la unión del polipéptido modificado a una célula mediante intercalación del grupo lipídico en la membrana plasmática de la célula. Para los restos de GPI que consisten en más o menos que el GPI convencional, un experto en la materia puede determinar fácilmente si un resto de este tipo permitirá la unión del polipéptido a la membrana celular. El siguiente ensayo es útil para determinar si una molécula unida a GPI puede unirse a una célula.

Para cuantificar la incorporación, en primer lugar se marca el polipéptido unido a GPI con ^{125}I. Se carga una columna Sephadex G-25 con 0,1 mg de la proteína relevante en 1 ml de PBS, seguido por 20-30 ml de PBS. Se añaden 2 mCi de Na[^{125}I] y 20 ul de lactoperoxidasa 10 uM en PBS a 2 ml de una disolución 1 mg/ml de la proteína relevante en PBS. Se agitan 4 ul de peróxido de hidrógeno al 0,03% en tampón fosfato 0,025 M, pH 7,4, en la disolución de proteína. Se repite la adición de peróxido de hidrógeno tres veces más a intervalos de 1 min. Se añade 1 ml de NaI 15 nM en PBS. Se coloca en capas la disolución sobre la columna Sephadex y se eluye con 20 ml de PBS. Se monitoriza el eluyente mediante recuento Geiger y se recoge el primer pico de radioactividad, que contiene la proteína marcada. Se determina la actividad específica mediante recuento gamma (suponiendo una recuperación del 100%). Se diluye la disolución de proteína hasta 40 ug/ml y se utiliza para el procedimiento de incorporación a la membrana plasmática descrito a continuación en la presente memoria. Tras lavarlas, se someten a recuento gamma alícuotas de 1 ul de células. Para determinar si la asociación es mediante el resto de GPI, se incuban las células con fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol de B. Thuringiensis (Sigma) a 37ºC durante 3 h, se centrifugan y se lavan antes del recuento. Esto libera las proteínas unidas a GPI de la superficie celular.

Antígenos útiles según la invención 1. Antígenos virales

Los ejemplos de antígenos virales incluyen, pero no se limitan a, antígenos retrovirales tales como antígenos retrovirales a partir de antígenos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tales como productos génicos de los genes gag, pol y env, la proteína Nef, transcriptasa inversa y otros componentes del VIH; antígenos del virus de la hepatitis tales como las proteínas S, M y L del virus de la hepatitis B, el antígeno pre-S del virus de la hepatitis B, y otras hepatitis, por ejemplo, hepatitis A, B y C, componentes virales tales como ARN del virus de la hepatitis C; antígenos del virus influenza tales como hemaglutinina y neuraminidasa y otros componentes del virus de influenza; antígenos del virus del sarampión tales como la proteína de fusión del virus del sarampión y otros componentes del virus del sarampión; antígenos del virus de la rubéola tales como las proteínas E1 y E2 y otros componentes del virus de la rubéola; antígenos de rotavirus tales como VP7sc y otros componentes de rotavirus; antígenos de citomegalovirus tales como glicoproteína B de la envuelta y otros componentes de antígeno de citomegalovirus; antígenos del virus respiratorio sincitial tales como la proteína de fusión del VRS, la proteína M2 y otros componentes de antígeno del virus respiratorio sincitial; antígenos del virus del herpes simple tales como proteínas tempranas inmediatas, glicoproteína D y otros componente de antígeno del virus del herpes simple; antígenos del virus de la varicela-zoster tales como gpI, gpII y otros componentes de antígeno del virus de la varicela-zoster; antígenos del virus de la encefalitis japonesa tales como proteínas E, M-E, M-E-NS 1, NS 1, NS 1-NS2A, 80%E y otros componentes de antígeno del virus de la encefalitis japonesa; antígenos del virus de la rabia tales como glicoproteína de la rabia, nucleoproteína de la rabia y otros componentes de antígeno del virus de la rabia. Véase Fundamental Virology, segunda edición, e's. Fields, B.N. y Knipe, D.M. (Raven Press, Nueva York, 1991) para ejemplos adicionales de antígenos virales.

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2. Antígenos bacterianos

Los antígenos bacterianos que pueden utilizarse en las composiciones y los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, antígenos de bacteria pertussis tales como toxina pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina, FIM2, FIM3, adenilato ciclasa y otros componentes de antígeno de bacteria pertussis; antígenos de la bacteria de la difteria tales como toxoide o toxina diftérica y otros componentes de antígeno de la bacteria de la difteria; antígenos de la bacteria del tétanos tales como toxoide o toxina del tétanos y otros componentes de antígeno de la bacteria del tétanos; antígenos de bacterias estreptocócicas tales como proteínas M y otros componentes de antígeno de bacterias estreptocócicas; antígenos bacterianos de bacilos gram-negativos tales como lipopolisacáridos y otros componentes de antígeno de bacterias gram-negativas; antígenos bacterianos de Mycobacterium tuberculosis tales como ácido micólico, proteína de choque térmico 65 (HSP65), la proteína secretada principal de 30 kDa, antígeno 85A y otros componentes de antígeno de micobacterias; componentes de antígeno bacteriano de Helicobacter pylori; antígenos de bacterias neumocócicas tales como neumolisina, polisacáridos capsulares neumocócicos y otros componentes de antígeno de bacterias neumocócicas; antígenos bacterianos de Hemophilus influenza tales como polisacáridos capsulares y otros componentes de antígeno bacteriano de Hemophilus influenza; antígenos de la bacteria del ántrax tales como antígeno protector del ántrax y otros componentes de antígeno de la bacteria del ántrax; antígenos de bacterias rickettsiae tales como romps y otros componentes de antígeno de bacterias rickettsiae. También se incluyen con los antígenos bacterianos descritos en la presente memoria cualquier otro antígeno de bacterias, micobacterias, micoplasmas, rickettsias o clamidias.

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3. Antígenos fúngicos

Los antígenos fúngicos que pueden utilizarse en las composiciones y los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, componentes de antígeno fúngico de cándida; antígenos fúngicos de histoplasma tales como proteína de choque térmico 60 (HSP60) y otros componentes de antígeno fúngico de histoplasma; antígenos fúngicos de criptococos tales como polisacáridos capsulares y otros componentes de antígeno fúngico de criptococos; antígenos fúngicos de coccidios tales como antígenos de esférulas y otros componentes de antígeno fúngico de coccidios; y antígenos fúngicos de la tiña tales como tricofitina y otros componentes de antígeno fúngico de coccidios.

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4. Antígenos de parásitos

Los ejemplos de protozoos y otros antígenos de parásitos incluyen, pero no se limitan a, antígenos de Plasmodium falciparum tales como antígenos de superficie de merozoito, antígenos de superficie de esporozoito, antígenos de circumsporozoito, antígenos de superficie de gametocito/gameto, antígeno en sangre pf 1 55/RESA y otros componentes de antígeno de plasmodio; antígenos de toxoplasmas tales como SAG-1, p30 y otros componentes de antígeno de toxoplasmas; antígenos de esquitosomas tales como glutatión-S-transferasa, paramiosina y otros componentes de antígeno de esquitosomas; Leishmania major y otros antígenos de leishmanias tales como gp63, lipofosfoglicano y su proteína asociada y otros componentes de antígeno de leishmanias; y antígenos de Trypanosoma cruzi tales como el antígeno de 75-77 kDa, el antígeno de 56 kDa y otros componentes de antígeno de tripanosomas.

5. Antígenos tumorales

Los antígenos tumorales que pueden utilizarse en las composiciones y los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, componentes de telomerasa; proteínas de resistencia a múltiples fármacos tales como P-glicoproteína; MAGE-1, alfa-fetoproteína, antígeno carcinoembrionario, p53 mutante, antígenos del virus del papiloma, gangliósidos u otros componentes que contienen hidratos de carbono de melanoma u otras células tumorales. Se contempla por la invención que pueden utilizarse antígenos de cualquier tipo de célula tumoral en las composiciones y los procedimientos descritos en la presente memoria.

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6. Antígenos relacionados con la autoinmunidad

Pueden utilizarse antígenos implicados en enfermedades autoinmunitarias, alergia y rechazo de injerto en las composiciones y los procedimientos de la invención. Por ejemplo, en la presente invención puede utilizarse un antígeno implicado en una cualquiera o más de las siguientes enfermedades o trastornos autoinmunitarios: diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriásica), esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmuntaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), psoriasis, síndrome de Sjogren, incluyendo queratoconjuntivitis seca producida por el síndrome de Sjögren, alopecia areata, respuestas alérgicas debidas a reacciones por mordeduras de artrópodos, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, asma, asma alérgico, lupus eritematoso cutáneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, erupciones farmacológicas, reacciones de reversión de la lepra, eritema nodular leproso, uveitis autoinmunitaria, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida de audición neurosensorial progresiva bilateral idiopática, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos pura, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens-Johnson, esprue idiopático, liquen plano, enfermedad de Crohn, oftalmopatía de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveítis posterior y fibrosis pulmonar intersticial. Los ejemplos de antígenos implicados en enfermedades autoinmunitarias incluyen ácido glutámico descarboxilasa 65 (GAD 65), ADN nativo, proteína básica de mielina, proteína proteolipídica de mielina, componentes de receptor de acetilcolina, tiroglobulina y el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSH). Los ejemplos de antígenos implicados en alergias incluyen antígenos del polen tales como antígenos del polen del cedro japonés, antígenos del polen de la ambrosía, antígenos del polen del centeno, antígenos derivados de animales tales como antígenos de ácaros del polvo y antígenos de felinos, antígenos de histocompatibilidad, y penicilina y otros fármacos terapéuticos. Los ejemplos de antígenos implicados en rechazo de injerto incluyen componentes antigénicos del injerto que va a trasplantarse en el receptor del injerto tales como componentes de injerto de corazón, pulmón, hígado, páncreas, riñones y neurológicos. Un antígeno también puede ser un ligando peptídico alterado útil en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.

Los ejemplos de antígenos varios que pueden utilizarse en las composiciones y los procedimientos de la invención incluyen hormonas endógenas tales como hormona leuteinizante, hormona estimuladora de folículo, testosterona, hormona del crecimiento, prolactina y otras hormonas, drogas de adicción tales como cocaína y heroína, y fragmentos idiotípicos de receptores antigénicos tales como partes que contienen Fab de un anticuerpo anti-receptor de leptina.

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Preparación de una célula que contiene un ácido nucleico recombinante según la invención

Se transfectan células, tal como se enseña en la presente memoria, mediante procedimientos convencionales bien conocidos en la materia. Pueden encontrarse procedimientos adecuados para transformar o transfectar células huésped en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) y otros manuales de laboratorio. A continuación se describen ejemplos adicionales de procedimientos de introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican para ligandos para CD40, citocinas u opsoninas. Las células que contienen las moléculas de ácido nucleico introducidas que codifican para, por ejemplo, una opsonina, una citocina, un ligando para CD40 y/o un antígeno, pueden administrarse ellas mismas a un sujeto (como el antígeno) según los procedimientos de la invención, por ejemplo, en una composición de vacuna.

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A. Introducción de ácido nucleico desnudo en células

1.: Transfección mediada por DEAE-dextrano: Puede introducirse ácido nucleico desnudo en células formando una mezcla del ácido nucleico y DEAE-dextrano e incubando la mezcla con las células. Puede añadirse una etapa de choque de dimetilsulfóxido o cloroquina para aumentar la cantidad de captación de ácido nucleico. La transfección con DEAE-dextrano sólo es aplicable a la modificación de células in vitro y puede utilizarse para introducir ácido nucleico de manera transitoria en células pero no se prefiere para crear células transfectadas de manera estable. Por tanto, este procedimiento puede utilizarse para la producción a corto plazo de un producto génico pero no es un procedimiento de elección para la producción a largo plazo de un producto génico. Pueden encontrare protocolos para la transfección mediada por DEAE-dextrano en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (e's.) Greene Publishing Associates, (1989), sección 9,2 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), secciones 16.41-16.46 u otros manuales de laboratorio convencionales.

2.: Electroporación: Asimismo, puede introducirse ácido nucleico desnudo en células incubando las células y el ácido nucleico juntos en un tampón apropiado y sometiendo las células a un pulso eléctrico de alto voltaje. La eficacia con la que se introduce ácido nucleico en células mediante electroporación se ve influida por la fuerza del campo aplicado, la duración del pulso eléctrico, la temperatura, la conformación y la concentración del ácido nucleico y la composición iónica de los medios. La electroporación puede utilizarse para transfectar de manera estable (o de manera transitoria) una amplia variedad de tipos de células y sólo es aplicable para la modificación de células in vitro. Pueden encontrarse protocolos para la electroporación de células en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (e's.) Greene Publishing Associates, (1989), sección 9.3 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), secciones 16.54-16.55 u otros manuales de laboratorio convencionales.

3.: Transfección mediada por liposomas ("lipofección"): Puede introducirse ácido nucleico desnudo en células mezclando el ácido nucleico con una suspensión de liposomas que contiene lípidos catiónicos. Entonces se incuba el complejo ácido nucleico/liposomas con células. La transfección mediada por liposomas puede utilizarse para transfectar de manera estable (o de manera transitoria) células en cultivo in vitro. Pueden encontrarse protocolos en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (e's.) Greene Publishing Associates, (1989), sección 9.4 y otros manuales de laboratorio convencionales. Adicionalmente, se ha logrado la administración génica in vivo utilizando liposomas. Véanse por ejemplo Nicolau et al. (1987) Meth. Enz. 149:157-176; Wang y Huang (1987) Proc. Natl. Acad Sci. SA 84:7851-785S; Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278; y Gould-Fogerite et al. (1989) Gene 84:429-438.

4.: Inyección directa: Puede introducirse ácido nucleico desnudo en células inyectando directamente el ácido nucleico en las células. Para un cultivo in vitro de células, puede introducirse ácido nucleico mediante microinyección. Ya que a cada célula se le microinyecta individualmente, este enfoque es muy laborioso cuando se modifica un gran número de células. Sin embargo, una situación en la que la microinyección es un procedimiento de elección es en la producción de animales transgénicos (tratado con mayor detalle a continuación). En esta situación, el ácido nucleico se introduce de manera estable en un ovocito fertilizado que entonces se deja que se desarrolle para dar un animal. El animal resultante contiene células que llevan el ácido nucleico introducido en el ovocito. También se ha utilizado la inyección directa para introducir ácido nucleico desnudo en células in vivo (véanse por ejemplo, Acsadi et al. (1991) Nature 332: 815-818; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468). Puede utilizarse un aparato de administración (por ejemplo, una "pistola génica") para inyectar ADN en células in vivo. Un aparato de este tipo está disponible comercialmente (por ejemplo, de BioRad).

5.: Captación de ADN mediada por receptor: También puede introducirse ácido nucleico desnudo en células complejando el ácido nucleico con un catión, tal como polilisina, que se acopla a un ligando para un receptor de superficie celular (véanse por ejemplo Wu, G. y Wu, C.H. (1988) J. Biol. Chem 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; y patente US nº 5.166.320). La unión del complejo ácido nucleico-ligando al receptor facilita la captación del ácido nucleico mediante endocitosis mediada por receptor. Los receptores a los que se ha dirigido un complejo ácido nucleico-ligando incluyen el receptor de transferrina y el receptor de asialoglicoproteína. Puede utilizarse un complejo ácido nucleico-ligando unido a cápsidas de adenovirus que rompen de manera natural los endosomas, liberando así el material en el citoplasma, para evitar la degradación del complejo por lisosomas intracelulares (véanse por ejemplo Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:2122-2126). Puede utilizarse la captación de ácido nucleico mediada por receptor para introducir ácido nucleico en células o bien in vitro o bien in vivo y, adicionalmente, se ha añadido la característica de que puede dirigirse selectivamente el ácido nucleico a un tipo de célula particular mediante la utilización de un ligando que se une a un receptor expresado de manera selectiva sobre una célula diana de interés.

Generalmente, cuando se introduce ácido nucleico desnudo en células en cultivo (por ejemplo, mediante una de las técnicas de transfección descritas anteriormente), sólo una pequeña fracción de células (aproximadamente 1 de cada 10^{5}) integra normalmente el ácido nucleico transfectado en sus genomas (es decir, el ácido nucleico se mantiene en la célula de manera episomal). Por tanto, con el fin de identificar las células que han captado el ácido nucleico exógeno, es ventajoso transfectar ácido nucleico que codifica para un marcador seleccionable en la célula junto con el/los ácido(s)
nucleico(s) de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a fármacos tales como G418, higromicina y metotrexato. Pueden introducirse marcadores seleccionables en el mismo plásmido que el/los gen(es) de interés o pueden introducirse en un plásmido separado.

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B. Transferencia génica mediada por virus

Un enfoque preferido para introducir ácido nucleico que codifica para un producto génico en una célula es mediante la utilización de un vector viral que contiene ácido nucleico, por ejemplo, un ADNc, que codifica para el producto génico. La infección de células con un vector viral presenta la ventaja de que una gran proporción de células recibe el ácido nucleico, lo que puede evitar la necesidad de la selección de células que han recibido el ácido nucleico. Adicionalmente, las moléculas codificadas dentro del vector viral, por ejemplo, mediante un ADNc contenido en el vector viral, se expresan eficazmente en células que han captado ácido nucleico de vector viral y pueden utilizarse sistemas de vectores virales o bien in vitro o bien in vivo.

1.: Retrovirus: Los retrovirus defectuosos están bien caracterizados para su utilización en la transferencia génica para fines de terapia génica (para una revisión, véase Miller, A.D. (1990) Blood 76:271). Puede construirse un retrovirus recombinante que presenta un ácido nucleico que codifica para un producto génico de interés insertado en el genoma retroviral. Adicionalmente, pueden eliminarse partes del genoma retroviral para hacer que el retrovirus sea defectuoso para la replicación. Entonces se empaqueta el retrovirus defectuoso para la replicación en viriones que pueden utilizarse para infectar una célula diana mediante la utilización de un virus auxiliar mediante técnicas convencionales. Pueden encontrarse protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio convencionales. Los ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que se conocen bien por los expertos en la materia. Ejemplos de líneas de virus de empaquetamiento adecuadas incluyen \gammaCrip, \gammaCre, 2, y Am. Se han utilizado retrovirus para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, incluyendo células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de la médula ósea, in vitro y/o in vivo (véanse por ejemplo Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos y Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-115; patente US nº 4.868.116; patente US nº 4.980.286; solicitud PCT WO 89/07136; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT WO 89/05345 y solicitud PCT WO 92/07573). Los vectores retrovirales requieren la división de la célula diana con el fin de que el genoma retroviral (y el ácido nucleico foráneo insertado en el mismo) se integre en el genoma huésped para introducir de manera estable el ácido nucleico en la célula. Por tanto, puede ser necesario estimular la replicación de la célula diana.

2.: Adenovirus: Puede manipularse el genoma de un adenovirus de tal manera que codifique y exprese un producto génico de interés pero sea inactivo en cuanto a su capacidad para replicarse en un ciclo de vida lítico normal. Véase por ejemplo Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d1324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Adz, Ad3, Ad7, etc.) se conocen bien por los expertos en la materia. Los adenovirus recombinantes son ventajosos porque no requieren células que se dividan para ser vehículos de administración de genes eficaces y pueden utilizarse para infectar una amplia variedad de tipos de células, incluyendo epitelio de las vías respiratorias (Rosenfeld et al. (1992) mencionado anteriormente), células endoteliales (Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486), hepatocitos (Herz y Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) y células musculares (Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584). Adicionalmente, el ácido nucleico adenoviral introducido (y ADN foráneo contenido en el mismo) no se integra en el genoma de una célula huésped sino que permanece episomal, evitando así posibles problemas que pueden producirse como resultado de mutagénesis de inserción en situaciones en las que el ácido nucleico introducido se integra en el genoma huésped (por ejemplo, ADN retroviral). Además, la capacidad de transporte del genoma adenoviral para ADN foráneo es grande (hasta 8 kilobases) en comparación con otros vectores de administración génica (Berkner et al. mencionado anteriormente; Haj-Ahmand y Graham (1986) J. Virol. 57:267). La mayoría de los vectores adenovirales defectuosos para la replicación utilizados actualmente se someten a deleción de todo o parte de los genes virales E1 y E3 pero conservan hasta el 80% del material genético adenoviral.

3.: Virus adenoasociados: El virus adenoasociado (VAA) es un virus defectuoso que se produce de manera natural que necesita otro virus, tal como un adenovirus o un virus del herpes, como un virus auxiliar para una replicación eficaz y un ciclo de vida productivo. (Para una revisión, véase Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129). También es uno de los pocos virus que pueden integrar su ADN dentro de células que no se dividen, y muestra una gran frecuencia de integración estable (véase por ejemplo Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828; y McLaughlin et al. (1989) J. Virol 62:1963-1973). Pueden empaquetarse e integrarse vectores que contienen tan sólo 300 pares de bases VAA. El espacio para ácido nucleico exógeno está limitado a aproximadamente 4,5 kb. Puede utilizarse un vector de VAA tal como el descrito en Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 para introducir ácido nucleico en células. Se ha introducido una variedad de ácidos nucleicos en diferentes tipos de células utilizando vectores de VAA (véase por ejemplo Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol.51:611 - 619; y Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790).

La eficacia de un sistema de vector de expresión particular y procedimiento de introducción de ácido nucleico en una célula puede evaluarse mediante enfoques convencionales utilizados de manera rutinaria en la materia. Por ejemplo, puede detectarse ácido nucleico introducido en una célula mediante una técnica de hibridación en filtro (por ejemplo, transferencia de tipo Southern) y puede detectarse ARN producido mediante transcripción de ácido nucleico introducido, por ejemplo, mediante transferencia de tipo Northern, protección de ARNasa o reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). Puede detectarse el producto génico mediante un ensayo apropiado, por ejemplo mediante detección inmunológica de una proteína producida, tal como con un anticuerpo específico, o mediante un ensayo funcional para detectar una actividad funcional del producto génico, tal como un ensayo enzimático. Si el producto génico de interés que va a expresarse por una célula no puede someterse a ensayo fácilmente, puede optimizarse en primer lugar un sistema de expresión utilizando un gen indicador unido a los elementos reguladores y vector que van a utilizarse. El gen indicador codifica para un producto génico que puede detectarse fácilmente y, por tanto, puede utilizarse para evaluar la eficacia del sistema. Genes indicadores convencionales utilizados en la materia incluyen genes que codifican para beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, luciferasa y hormona del crecimiento humana.

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Células útiles según la invención

La invención proporciona células recubiertas con citocina. Células útiles para preparar células recubiertas con citocina incluyen, pero no se limitan a, las siguientes.

Pueden prepararse células recubiertas con citocina a partir de células huésped según la invención, en las que una célula huésped puede ser cualquier célula que puede actuar como portadora para un antígeno según la invención y por tanto puede ser una célula nucleada o una célula procariota en la que puede introducirse artificialmente ácido nucleico. Células procariotas útiles según la invención incluyen células bacterianas y levadura. Células eucariotas (nucleadas) útiles según la invención incluyen células de un hongo, células de un parásito y células de mamífero. Células de mamífero útiles según la invención incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, incluyendo células mesenquimatosas especializadas tales como sinoviocitos; queratinocitos, células epiteliales, células endoteliales, leucocitos y células tumorales.

Líneas celulares útiles según la invención incluyen, pero no se limitan a, B 16, células de fibrosarcoma CMS-5, células Cos1 y células CHO, TS/A, carcinoma de pulmón de Lewis, RENCA, carcinoma de próstata de rata Dunning y líneas celulares incluidas en el catálogo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA).

Pueden prepararse células recubiertas con citocina a partir de células patogénicas según la invención. Células patogénicas incluyen células tumorales (por ejemplo células B16, células de fibrosarcoma CMS-5 y células derivadas de los tumores incluidos en la sección titulada "Tumores para los que la invención es útil"), y células derivadas de bacterias patogénicas, hongos patogénicos, virus patogénicos, parásitos patogénicos o un artrópodo patogénico.

La invención también proporciona células recubiertas con citocina que no pueden dividirse en un huésped mamífero.

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Preparación de células en mezcla con una citocina, (y opcionalmente una opsonina) según la invención

La invención también contempla una preparación de células que se mezcla con una citocina y opcionalmente una opsonina. Por tanto, la célula puede expresar ya un antígeno, por ejemplo, un antígeno de célula tumoral (ya sea un antígeno expresado de manera endógena o un antígeno heterólogo), y puede mezclarse con una citocina obtenida mediante ingeniería genética, tal como se definió anteriormente en la presente memoria, y considerarse que la preparación es "células recubiertas con citocina", según la invención. En esta mezcla, la preparación consistirá en aproximadamente 10^{4} - 10^{8} células mezcladas con 1 ug-100 ug/ml de ligando en un tampón de sal fisiológica convencional.

Cuando la invención comprende una preparación de células en mezcla con una citocina, y opcionalmente una opsonina, se prepara en primer lugar la citocina (y opcionalmente una opsonina) según procedimientos convencionales y después se mezcla con las células. La citocina (y opcionalmente una opsonina) puede prepararse mediante técnicas de ADN recombinante mediante transfección de una línea o cepa de células huésped y aislamiento de la proteína recombinante.

Puede utilizarse una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped eucariota en cultivo, para producir (es decir, expresar) polipéptidos de la invención. Por ejemplo, puede cultivarse una célula huésped transfectada (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica para un polipéptido de la invención) en un medio adecuado hasta que se produce el polipéptido, y aislarse del medio o de la célula huésped.

Transfección mediada por CaPO4: Puede introducirse ácido nucleico desnudo en células formando un precipitado que contiene el ácido nucleico y fosfato de calcio. Por ejemplo, puede mezclarse una solución salina tamponada con HEPES con una disolución que contiene cloruro de calcio y ácido nucleico para formar un precipitado y entonces se incuba el precipitado con células. Puede añadirse una etapa de choque de glicerol o dimetilsulfóxido para aumentar la cantidad de ácido nucleico captado por ciertas células. Puede utilizarse la transfección mediada por CaPO4 para transfectar células de manera estable (o de manera transitoria) y sólo es aplicable para la modificación de células in vitro. Pueden encontrarse protocolos para la transfección mediada por CaPO4 en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), sección 9.1 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), secciones 16.32-16.40 u otros manuales de laboratorio convencionales.

Procedimientos de detección de la expresión a partir de una secuencia de ácido nucleico recombinante introducida artificialmente

Se proporcionan procedimientos de detección de una proteína (por ejemplo, citocina o una opsonina) que se expresa a partir de una molécula de ácido nucleico recombinante que se ha introducido artificialmente en una célula.

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Preparación de anticuerpos

Los anticuerpos específicos para una proteína (por ejemplo, una opsonina) son útiles para la purificación de proteínas y para la detección de la expresión de estas proteínas a partir de células en las que se ha introducido artificialmente una molécula de ácido nucleico recombinante que expresa estas proteínas. Por anticuerpo, se incluyen construcciones que utilizan la región de unión (variable) de tal anticuerpo, y otras modificaciones de anticuerpo. Por tanto, un anticuerpo útil en la invención puede comprender un anticuerpo completo, un fragmento de anticuerpo, un agregado de anticuerpo polifuncional o en general una sustancia que comprende uno o más sitios de unión específicos de un anticuerpo. El fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento tal como un fragmento Fv, Fab o F(ab')_{2} o un derivado de los mismos, tal como un fragmento Fv de cadena sencilla. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser no recombinante, recombinante o humanizado. El anticuerpo puede ser de un isotipo de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgM, etc. Además, un agregado, polímero, derivado y conjugado de una inmunoglobulina o un fragmento de los mismos puede utilizarse cuando sea apropiado.

Aunque un producto proteico (o fragmento u oligopéptido del mismo) de una proteína (por ejemplo, una opsonina) que es útil para la producción de anticuerpos no requiere actividad biológica, debe ser antigénico. Los péptidos utilizados para inducir anticuerpos específicos pueden presentar una secuencia de aminoácidos que consiste en por lo menos cinco aminoácidos y preferentemente por lo menos 10 aminoácidos. Preferentemente, deben ser idénticos a una región de la proteína natural y pueden contener la secuencia de aminoácidos entera de una molécula pequeña que se produce de manera natural. Tramos cortos de aminoácidos que corresponden al producto proteico de un ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína (por ejemplo, una opsonina) pueden fusionarse con aminoácidos de otras proteínas tales como hemocianina de lapa o GST, y se producirá un anticuerpo contra la molécula quimérica. Pueden utilizarse procedimientos bien conocidos en la materia para la producción de anticuerpos frente a los productos proteicos de ácidos nucleicos recombinantes.

Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos huéspedes que incluyen cabras, conejos, ratas, ratones, etc. mediante inyección con los productos proteicos (o cualquier parte, fragmento u oligonucleótido de los mismos que conserve las propiedades inmunogénicas) de las moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican para proteínas (por ejemplo, una opsonina). Dependiendo de la especie huésped pueden utilizarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen pero no se limitan a adyuvante de Freund, geles minerales tal como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de lapa y dinitrofenol. Los BCG (bacilos Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son adyuvantes humanos potencialmente útiles.

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1. Anticuerpos policlonales

La proteína antigénica puede conjugarse con un vehículo convencional con el fin de aumentar su inmunogenicidad, y se generará un antisuero frente al conjugado péptido-vehículo. El acoplamiento de un péptido a una proteína vehículo e inmunizaciones pueden realizarse tal como se describe (Dymecki et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 4815). El suero puede titularse contra antígenos de proteína mediante ELISA (a continuación) o alternativamente mediante transferencia puntual o por puntos (Boersma y Van Leeuwen, 1994, J. Neurosci. Methods, 51: 317). Al mismo tiempo, el antisuero puede utilizarse en secciones de tejido preparadas tal como se describe. Un suero útil reaccionará intensamente con los péptidos apropiados mediante ELISA, por ejemplo, siguiendo los procedimientos de Green et al., 1982, Cell, 28: 477.

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2. Anticuerpos monoclonales

Las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales son muy conocidas y los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando un antígeno candidato cuyo nivel ha de medirse o que ha de o bien inactivarse o bien purificarse por afinidad, preferentemente unido a un vehículo, tal como describe Arnheiter et al., 1981, Nature, 294;278.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen normalmente a partir de cultivos de tejido de hibridoma o a partir de fluido ascíticos obtenido de animales en los que se introdujo el tejido de hibridoma.

Pueden examinarse los hibridomas (o sueros policlonales) que producen anticuerpos monoclonales para determinar la unión de los anticuerpos a la proteína diana.

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3. Procedimientos de detección de anticuerpos

Las pruebas inmunológicas particularmente preferidas se basan en la utilización de anticuerpos o bien monoclonales o bien policlonales e incluyen inmunoensayos ligados a enzima (ELISA), inmunotransferencia e inmunoprecipitación (véanse Voller, 1978, Diagnostic Horizons, 2:1, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller et al., 1978, J. Clin. Pathol., 31: 507; nueva publicación de la patente US nº 31.006; patente UK 2.019.408; Butler, 1981, Methods Enzymol., 73: 482; Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL) o radioinmunoanálisis (RIA) (Weintraub, B., Principles of radioimmunoassays, Séptimo curso de formación sobre técnicas de ensayo con radioligandos, The Endocrine Society, marzo de 1986, págs. 1-5, 46-49 y 68-78). Para analizar tejidos para determinar la presencia o ausencia de una proteína producida por un ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína (por ejemplo, una opsonina) pueden utilizarse técnicas de inmunohistoquímica. Resultará evidente para un experto en la materia que la molécula de anticuerpo puede tener que marcarse para facilitar una fácil detección de una proteína diana. Los expertos en la materia conocen bien las técnicas para marcar moléculas de anticuerpo (véase Harlow y Lane, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory).

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Determinar si una respuesta inmunitaria se modula según la invención

Las células recubiertas con citocina son útiles según la invención para modular una respuesta inmunitaria en un mamífero, preferentemente un ser humano, frente a un antígeno o antígenos contenidos en las células. Las células se administran y se captan (es decir, se ingieren o fagocitan) por las células presentadoras de antígeno. Alternativamente, las células entran en contacto con las células presentadoras de antígeno in vitro en condiciones que permiten la fagocitosis.

Una "respuesta inmunitaria" se refiere a la estimulación/activación de una respuesta seleccionada que implica el sistema inmunitario, o la supresión, eliminación o atenuación de una respuesta seleccionada. En una forma de realización preferida, una respuesta inmunitaria se refiere a la estimulación/activación de una respuesta seleccionada que implica el sistema inmunitario en aproximadamente por lo menos el 5%, o preferentemente entre el 5 y el 50% o más preferentemente entre el 50 y el 100% o por lo menos el 100% o superior, o la supresión, eliminación o atenuación de una respuesta seleccionada en aproximadamente por lo menos el 5%, o preferentemente entre el 5 y el 50% o más preferentemente entre el 50 y el 100% o por lo menos el 100% o superior, en comparación con células control que son células no recubiertas con citocina. Por tanto, modular una respuesta inmunitaria significa que la respuesta deseada es más eficaz, más rápida, mayor en magnitud y/o se induce más fácilmente que cuando las células, idénticas en todos los aspectos excepto en que son células no recubiertas con citocina, se administran de un modo idéntico. Las diferentes respuestas inmunitarias en el sujeto pueden modularse de manera diferenciada, por ejemplo, la respuesta inmunitaria celular puede potenciarse selectivamente mientras que la respuesta humoral puede atenuarse selectivamente, y viceversa.

Los ensayos in vitro e in vivo siguientes son útiles para determinar si una respuesta inmunitaria se modula según la invención. Los ensayos descritos en detalle a continuación miden la estimulación o supresión de respuestas inmunitarias celulares o humorales frente a un antígeno. Los antígenos a los que se hace referencia en los ensayos siguientes son representativos. Resultará evidente para un experto en la materia que una respuesta inmunitaria contra un antígeno seleccionado útil según la invención puede medirse utilizando uno o más de los ensayos siguientes adaptando el ensayo a ese antígeno.

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I. Detección de fagocitosis aumentada

El ensayo siguiente puede utilizarse con el fin de determinar si las células mejoradas en opsonina, o células recubiertas con citocina, estimulan la fagocitosis mediante células presentadoras de antígeno.

La fagocitosis se examina utilizando monocitos que se han adherido a 37º durante 30 min. en RPMI sin FCS añadido. Los eritrocitos de oveja se incuban con una opsonina, un ligando para CD40, una citocina o su precursor, en condiciones tales que no más de 300 de tales moléculas, en promedio, se depositan sobre cada eritrocito. Si se utiliza un precursor, entonces se procesan los eritrocitos recubiertos para convertir todos los precursores para dar la molécula candidata real (por ejemplo, véase Carlo et al., J. Immunol. 123:523-8 (1979)). Se aíslan monocitos nuevos del sujeto y se suspenden 5 x 10^{4} - 1 x 10^{5} de estas células en 0,25 - 0,5 ml de medio RPMI con BSA al 1%. Se coloca esta alícuota en un pocillo de cultivo de tejido y se incuba durante 30 min. a 37ºC. Un exceso de eritrocitos recubiertos, suspendidos a 1,2 x 10^{8} células/ml, se extiende sobre los monocitos, se centrifuga la placa durante 5 min. a 50 g y se incuba durante 30 min. a 37ºC. Se retira el material no ingerido en dos etapas de lisis hipotónica utilizando tampón de lisis helado antes de fijar y teñir las células adherentes, y examinar las células con microscopía óptica. Se cuantifica la fagocitosis determinando el porcentaje de los 100 monocitos que ingieren una o más células diana y se registra el número total de monocitos E/100 ingeridos (PI). La estimulación de la fagocitosis según la invención se indica mediante un índice fagocítico igual a o mayor que 40.

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II. La amplificación de la respuesta inmunitaria implica normalmente la proliferación de subpoblaciones particulares de células linfoides que están normalmente en estado de reposo

Los ensayos proliferativos presentan las siguientes aplicaciones en estudios clínicos: (1) Valoración de la competencia inmunológica global de células T o células B según se manifiesta en su capacidad para responder a señales de proliferación policlonal tales como mitógenos o anticuerpos anti-CD3. Los defectos en la proliferación pueden indicar un defecto inmunológico celular fundamental. Una baja proliferación se encuentra a menudo como un efecto secundario no específico de enfermedad crónica. (2) Valoración de la respuesta de un individuo frente a antígenos específicos, en la que respuestas bajas indican un defecto inmunológico general o específico. (3) Determinación de la compatibilidad del MHC mediante la reacción mixta de linfocitos (MLR).

Además, los ensayos proliferativos son útiles para estimar la producción de linfocina, para investigar la transducción de señales y para evaluar los requisitos de factor de crecimiento (por ejemplo, linfocinas) para células T o B. El procedimiento explicado resumidamente en la presente memoria mide la incorporación de [^{3}H]timidina en ADN, que normalmente se correlaciona bien con el crecimiento celular medido mediante los cambios en el número de células. Sin embargo, cuando el estímulo de activación es tóxico, como con activadores químicos tales como ionomicina más miristato-acetato de forbol (PMA), el arranque de la síntesis de ADN nuevo tras la activación puede no ir acompañado de un aumento neto en las células viables y, de hecho, puede observarse una disminución en el número de células. En este caso, la incorporación de [^{3}H]timidina en ADN es más indicativo de la estimulación inicial de las células que de la estimación del número de células. Además, la incorporación de [^{3}H]timidina proporciona información sobre las poblaciones celulares, no sobre células individuales. Pueden utilizarse procedimientos alternativos, tales como citometría de flujo, para estudios que requieren ese tipo de información.

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Ensayo para determinar la proliferación de células T inducida por antígenos

Este protocolo está diseñado para someter a prueba la proliferación de células T en respuesta a un antígeno específico - el toxoide del tétanos. Puede modificarse para someter a prueba la proliferación de células T en respuesta cualquier antígeno de polisacárido o proteína. Materiales: (suspensión de células T, suspensión de células (células no T) que presentan antígeno autólogo, disolución de toxoide del tétanos (Connaught o State Laboratory Institute of Massachusetts)). (1) Contar las células T y ajustar a 1 x 10^{6} células/ml con RPMI-10 AB completo. (2) Tratar las células presentadoras de antígeno con mitomicina C (o irradiar con 2500 rad) tal como en la etapa 2 del protocolo de MLR unidireccional. Ajustar la concentración de las células presentadoras de antígeno a 2 x 10^{5} células/ml. Las células presentadoras de antígeno pueden consistir en células no T autólogas o monocitos/macrófagos autólogos. (3) Añadir 100 ul de suspensión de células T y 50 ul de una población de células presentadoras de antígeno a pocillos; mezclar justo antes de dispensar. (4) Añadir 50 ul de disolución de toxoide del tétanos para dar concentraciones finales de 0, 1, 5, 10 y 20 ug/ml. Preparar tres pocillos para cada dilución. (5) Incubar 6 días en una incubadora con CO_{2} al 5%, a 37ºC, humidificada. (6) Pulsar con [^{3}H]timidina y recoger tal como se describe en el protocolo de apoyo.

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Ensayo para determinar la proliferación celular dependiente de linfocina

Este protocolo somete a ensayo la proliferación dependiente de linfocina de una población de linfocitos, en este caso, la proliferación dependiente de la IL-4 de células B. Materiales: (suspensión de células B amigdalinas, anti-IgM reticulada a perlas de Sepharose (Bio-Rad), 10.000 U/ml de rIL-4 humana (Genzyme) en RPMI-10 completo). (1) Contar las células B amigdalinas y ajustar la concentración a 1 x 10^{6} células/ml con RPMI-10 completo. (2) Dispensar 100 ul de células B amigdalinas en cada pocillo. Preparar tres pocillos para cada condición experimental. (3) Diluir 10,000 U/ml de disolución de rIL-4 1:10, 1:100 y 1:1000. Añadir 20 ul de la disolución madre o dilución a pocillos apropiados para proporcionar 1000 U/ml, 100 U/ml, 10 U/ml y 1U/ml. Incluir un pocillo control sin rIL-4. (4) Pipetear perlas de anti-IgM en pocillos apropiados.

Determinar la concentración óptima de las perlas con experimentos piloto. Lo mejor es incluir diversas concentraciones de perlas en cada experimento para "catalogar" la dosis óptima. Preparar pocillos con células B amigdalinas y diluciones de IL-4 solas, perlas de anti-IgM solas, medio de cultivo solo y todas las combinaciones de diluciones de perlas de anti-IgM e IL-4. (5) Aumentar el volumen de cada pocillo hasta 200 ul con RPMI-10 completo según sea necesario. (6) Cultivar 5 días en una incubadora con CO_{2} al 5%, a 37ºC, humidificada. (7) Pulsar con [^{3}H]timidina y recoger tal como se describe en el protocolo de apoyo.

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Pulso de [^{3}H]timidina y recogida de cultivos celulares

Este protocolo se utiliza junto con los protocolos anteriores para completar el ensayo de incorporación de [^{3}H]timidina. (1) Añadir 20 ul de [^{3}H]timidina 50 uCi/ml a cada cultivo (1,0 uCi) en un momento fijado antes de terminar el cultivo (normalmente 6 ó 18 h). (2) Recoger los cultivos celulares utilizando un colector de múltiples pocillos automatizado que aspira las células, lisa las células y transfiere el ADN a papel de filtro, mientras permite que la [^{3}H]timidina no incorporada se elimine por lavado. Llenar y aspirar cada fila de la placa de microtitulación diez veces para garantizar una transferencia completa de las células y una eliminación completa de la timidina no incorporada. Lavar cada tira de filtro con un 100% de etanol para facilitar el secado. Transferir a viales de centelleo. Para un colector semiautomatizado, transferir puntos de filtro para cada pocillo en viales de recuento de centelleo. Para una transferencia manual, secar filtros bajo una lámpara y transferir los viales de centelleo con fórceps. Añadir fluido de centelleo a cada vial. (3) Contar las muestras en el contador de centelleo hasta que la desviación estándar es inferior al 2%. Calcular las cpm medias para los cultivos de referencia y para cada condición experimental. Debe haber una variación inferior al 20% en los cultivos por duplicado.

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III. Inducción y medición de respuestas de anticuerpo in vitro

La capacidad del sistema inmunitario humano para preparar una respuesta de anticuerpos tras una inmunización in vivo con un antígeno de polisacárido o proteína es un indicativo revelador de la integridad global de ambas ramas de células B y T del sistema inmunitario. Como tal, la inmunización in vivo seguida de la medición de la respuesta de anticuerpos es una prueba apropiada de la función inmunitaria en las diversas inmunodeficiencias adquiridas y congénitas y en una cantidad de otras condiciones que afectan al sistema inmunitario. Los procedimientos siguientes son para la inmunización in vivo y para la medición de la respuesta inmunitaria posterior utilizando una técnica de ELISA.

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Ensayo inmunoenzimétrico para determinar citocinas utilizando anticuerpos marcados con NIP y HRPO

Este protocolo describe un ensayo inmunoenzimétrico para citocinas utilizando una reacción de inmunoensayo no competitivo, heterogéneo, en la que se inmoviliza la citocina mediante un anticuerpo de recubrimiento unido a una placa de microtitulación. El material no unido se elimina por lavado y se lleva a cabo la detección utilizando un anticuerpo anti-citocina diferente marcado con el hapteno nitroyodofenilo (NIP). Éste se detecta a su vez por un conjugado de peroxidasa del rábano (HRPO) de un anticuerpo anti-NIP, que se revela con el sustrato cromogénico ABTS. En este inmunoensayo no competitivo, la señal de inmunoensayo (A405) aumenta como una función directa de la cantidad de citocina presente en la muestra. Se preparan los anticuerpos tal como se describe en Current Protocols in Immunology, 1995, 6.20.2 - 6.20.10.

Placa de ensayo de recubrimiento. (1) Utilizando un pipeteador de múltiples canales, transferir 100 ul de una dilución apropiada de anticuerpo de recubrimiento en todos los pocillos de la placa de ensayo que van a utilizarse. (2) Sellar las placas con sellador de placas de microtitulación o Parafilm e incubar 2 h a 37ºC. Preparar muestras y patrones en la placa de preparación. (3) Diluir cada muestra (o alícuota de medio acondicionado) que va a someterse a ensayo con un volumen igual de diluyente de inmunoensayo. (4) Pipetear menos de o igual que 1 ml de cada muestra diluida que va a someterse a ensayo en la cámara superior de un dispositivo de microfiltración Spin-X separado. Microcentifugar 5 min. a 10.000 rpm y guardar los filtrados que se recogen en las cámaras inferiores. (5) Añadir 65 ul de cada muestra diluida al pocillo apropiado de una placa de preparación (es decir, una placa de microtitulación de 96 pocillos separada). (6) Descongelar una alícuota de patrón de citocina a temperatura ambiente y asegurarse de que se mezcla bien. Pipetear 130 ul en el pocillo de la placa de preparación que representa la concentración más alta en la curva patrón. Transferir 65 ul desde este pocillo al siguiente, después continuar realizando diluciones en serie 1:1 en diluyente para inmunoensayo de modo que se colocan 65 ul de cada concentración representada en la curva patrón en el pocillo apropiado de la placa de preparación. (7) Descongelar una alícuota de calibrador a temperatura ambiente (si se utiliza). Diluir con un volumen igual de diluyente para inmunoensayo, después pipetear 65 ul de calibrador diluido en un pocillo o pocillos apropiados de la placa de preparación.

Incubar con anticuerpo de recubrimiento. (8) Retirar la placa de ensayo recubierta de la incubadora. Sumergir en un vaso de precipitados de 2 litros lleno con 1 x tampón de lavado, después invertir sobre el fregadero y sacudir para eliminar el líquido. Repetir dos veces más, después secar dando golpes sobre una toalla de papel. (9) Transferir 50 ul de disolución de cada pocillo de la placa de preparación al pocillo correspondiente de la placa de ensayo utilizando un pipeteador de múltiples canales. (10) Sellar la placa con sellador de placas de microtitulación o Parafilm e incubar 2 h a temperatura ambiente.

Incubar con anticuerpo de detección. (11) Diluir el anticuerpo de detección marcado con NIP específico para la citocina de interés hasta 1 ug/ml en el tampón de detección. (12) Lavar la placa de ensayo tal como en la etapa 8. (13) Añadir 75 ul de anticuerpo de detección diluido de la etapa 11 a todos los pocillos de la placa de ensayo, incluyendo paredes externas no utilizadas. (14) Volver a sellar la placa con sellador de placas de microtitulación o Parafilm e incubar 1 h a temperatura ambiente.

Incubar con anticuerpo anti-NIP conjugado con HRPO. (15) Diluir el Acm anti-NIP conjugado con HRPO 1:3000 en tampón de detección. (16) Lavar la placa de ensayo tal como en la etapa 8. (17) Añadir 75 ul de anticuerpo anti-NIP marcado con HRPO de la etapa 15 a todos los pocillos de la placa de ensayo. (18) Volver a sellar la placa con sellador de placas de microtitulación o Parafilm e incubar 1 h a temperatura ambiente.

Incubar con sustrato cromogénico. (19) Lavar la placa de ensayo tal como en la etapa 8. (20) Añadir 100 ul de disoluciones de trabajo de sustrato ABTS a todos los pocillos de la placa de ensayo. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente hasta que el desarrollo de color alcanza el nivel deseado (generalmente hasta A_{405} para los pocillos que contienen la mayor concentración de patrón está entre 1,5 y 2). Este protocolo produce normalmente un ensayo que puede leerse tras de 30 a 60 min.

Leer la placa y analizar los datos. (21) Utilizar el lector de placas de microtitulación con interfaz de ordenador, medir la absorbancia en todos los pocillos a 405 nm en un modo de longitud de onda individual o a 405 y 650 nm en modo de longitud de onda dual. (22) Ajustar los datos patrón a una curva descrita por una función matemática de primer grado (lineal), de segundo grado (cuadrática) o de cuatro parámetros (no lineal) utilizando un software de ajuste de curvas. (23) Interpolar los datos de absorbancia de muestras de citocina desconocidas a la curva patrón ajustada y calcular las concentraciones de citocina.

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IV. La inducción de una respuesta de anticuerpos in vivo proporciona una aproximación a la evaluación de la integridad global del sistema inmunitario

En los protocolos presentados en la presente memoria, se utilizan toxoides de tétanos y difteria como antígenos de proteína representativos y se utilizan polisacáridos pneumocócicos como antígenos de polisacárido representativos debido a su seguridad y disponibilidad. Sin embargo, debe observarse que las respuestas provocadas por estos antígenos es probable que sean respuestas secundarias debido a una vacunación pasada o exposición natural. Para obtener una respuesta primaria debe utilizarse un antígeno poco habitual tal como la hemocianina de lapa.

Cuando se administran antígenos por la vía intramuscular o subcutánea, tal como en este caso, se induce una respuesta inmunitaria "sistémica" y lo más apropiado es la medición de los anticuerpos circulantes. Sin embargo, en algunas ocasiones es de interés evaluar las respuestas inmunitarias "locales" o mucosas. En este caso, se proporciona el antígeno o bien por vía intranasal para estimular el tejido linfoide respiratorio o bien por vía oral para estimular el tejido linfoide gastrointestinal y se someten a ensayo lavados bronquiales o fluidos intestinales, más que la sangre, para determinar el contenido en anticuerpos; además se utilizan antígenos que son más apropiados para la estimulación de la respuesta local/mucosa (es decir, antígeno del virus influenza para respuestas respiratorias y toxina de cólera para respuestas gastrointestinales).

Al someter a ensayo la respuesta de anticuerpos in vivo, es importante determinar las respuestas a antígenos tanto de proteína como de polisacárido porque estos antígenos estimulan diferentes componentes del sistema inmunitario. A este respecto, la respuesta de anticuerpos principal a antígenos de proteína está compuesta de anticuerpos de la subclase IgG1 e IgG3, mientras que la respuesta de anticuerpos principal a antígenos de polisacárido está compuesta por anticuerpos de la subclase IgG2.

Se han utilizado una variedad de técnicas de inmunoensayo para medir las respuestas de anticuerpo en materiales obtenidos tras la inmunización in vivo. De éstos, el ensayo ELISA es quizás el más útil porque proporciona una lectura estable, fácilmente medible, reproducible y segura.

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Inducción de respuestas de anticuerpos in vivo a antígenos de proteína/polisacárido

En este protocolo, se administran antígenos por la vía intramuscular o subcutánea y se recoge suero para la medición de las respuestas. (1) Extraer una muestra de sangre antes de la inmunización, permitir que la sangre coagule y separar el suero del coágulo mediante centrifugación. Almacenar el suero a de -20ºC a -70ºC en tubos de plástico etiquetados apropiadamente. (2) Inyectar 0,5 ml de mezcla de toxoides en un sitio intramuscular preparado apropiadamente (deltoides o muslo), teniendo cuidado de no inyectar el material por vía intravenosa. (3) Inyectar 0,5 ml de vacuna pneumocócica polivalente en un sitio subcutáneo preparado apropiadamente, teniendo cuidado de no inyectar material por vía intravenosa. (4) Extraer muestras de sangre tras la inmunización a intervalos deseados, normalmente a 1, 2 y 3 semanas. Separar el suero y almacenarlo a de -20ºC a -70ºC. (5) Tras recoger todas las muestras de suero, someter a ensayo las muestras para determinar la presencia de anticuerpos utilizando ELISA.

ELISA ofrece un procedimiento rápido, sensible, reproducible, no radiactivo, para medir las respuestas de anticuerpo in vivo frente a una variedad de antígenos, incluyendo los antígenos de proteína y polisacárido en sueros obtenidos de individuos vacunados con inmunizaciones de recuerdo para el tétanos y la difteria y la vacuna de polisacárido pneumocócica polivalente. Ensayos específicos para el tétanos, la difteria y los tipos I, II, y III de polisacárido pneumocócico se detallan en Current Protocols in Immunology, 1995, vols. 6 y 7.

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Ensayo que utiliza el rechazo de tumores

En otro ensayo para determinar la inmunomodulación se vacuna un animal inmunocompetente con del orden de 10^{4}-10^{8} células tumorales recubiertas con citocina irradiadas y se exponen a del orden de 10^{4}-10^{8} células tumorales de tipo natural vivas (en cualquier secuencia temporal). Si la supervivencia o la aparición de tumores en estos animales difieren de la de los animales vacunados, utilizando parámetros idénticos, con células no recubiertas con citocina irradiadas en lugar de células recubiertas con citocina, se ha producido inmunomodulación. Por ejemplo, si por lo menos el 10% de los animales en el grupo de prueba sobrevive un 100% más de tiempo que la supervivencia media en el grupo control, la prueba es positiva. Como otro ejemplo, la aparición de tumores en el 20% de los animales de prueba puede ser el 50% más tardío que la aparición media en los animales control.

Utilización Tumores para los que la invención es aplicable

La invención contempla el tratamiento de tumores que incluyen pero sin limitarse a los siguientes: melanomas, tumores de células escamosas, carcinomas de células basales, astrocitomas, gliomas, glioblastoma multiforme, meningiomas, ependimomas, schwannomas, neuroblastomas, retinoblastomas, meningiomas, tumores glómicos, sarcomas, que incluyen, por ejemplo, osteosarcomas, sarcomas de Ewing, condrosarcomas, miosarcomas, sarcomas de células sinoviales, fibrosarcomas, tumores de células fusiformes, angiosarcomas, tumores de células neuroectodérmicas primitivas, y sarcomas de Kaposi, linfomas, leucemias agudas y crónicas, tumores de la cabeza y el cuello, carcinomas nasofaríngeos, carcinomas de la faringe, carcinomas laríngeos, carcinomas de la tiroides, carcinomas de la paratiroides, timomas, carcinomas esofágicos, carcinomas gástricos, tumores del intestino delgado, carcinomas del colon y el recto, mesoteliomas, carcinomas de pulmón, incluyendo adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, carcinomas broncoalveolares, y tumores de células pequeñas, carcinomas pancreáticos, tumores de células de los islotes y de células no de los islotes, carcinomas de mama, mixomas cardiacos, tumores de la hipófisis, tumores carcinoides, hepatomas, colangiocarcinomas, hepatoblastomas, carcinomas de células renales, nefroblastomas, tumores de Wilms, carcinomas adrenales, feocromocitomas, tumores de células germinales, coriocarcinomas, carcinomas ováricos, tumores testiculares, seminomas, tumores endometriales, carcinomas de próstata, carcinomas de las vesículas seminales, tumores vaginales, carcinomas de pene, molas hidatiformes, carcinomas de la vesícula biliar y carcinomas de la vejiga urinaria.

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Animales transgénicos según la invención

Una molécula de ácido nucleico que codifica para una citocina obtenida mediante ingeniería genética tal como se describe en la presente memoria puede utilizarse para producir animales transgénicos no humanos, y pueden aislarse células de tales animales transgénicos y utilizarse en una formulación de vacuna en vacunación animal o
humana.

Por ejemplo, en una forma de realización se introduce una molécula de ácido nucleico en un ovocito fertilizado o una célula madre embrionaria. Tales células pueden utilizarse entonces para crear animales transgénicos no humanos en los que se han introducido en su genoma moléculas de ácido nucleico exógeno que codifican para los polipéptidos de la invención o animales recombinantes homólogos en los que se han alterado moléculas de ácido nucleico endógeno. Tales animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de las moléculas de la invención y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad de las moléculas de la invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ratón, en el que una o más de las células del animal incluyen un transgén. Un transgén es ácido nucleico exógeno que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que se conserva en el genoma del animal maduro, dirigiendo de ese modo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tejidos o tipos celulares del animal transgénico.

Puede crearse un animal transgénico de la invención introduciendo moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos descritos en la presente memoria en los pronúcleos macho de un ovocito fertilizado, por ejemplo, mediante microinyección, y permitiendo que el ovocito se desarrolle en un animal de acogida hembra pseudoembarazada. Las secuencias intrónicas y las señales de poliadenilación también pueden incluirse en el transgén para aumentar la eficacia de expresión del transgén. Una(s) secuencia(s) reguladora(s) específica(s) de tejido pueden unirse operativamente al transgén para dirigir la expresión de un polipéptido de la invención a células particulares. Procedimientos para generar animales transgénicos por medio de microinyección y manipulación de embriones, particularmente animales tales como ratones, han pasado a ser convencionales en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes US nº 4.736.866 y nº 4.870.009, ambas de Leder et al., en la patente US nº 4.873.191 de Wagner et al. y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Procedimientos similares se utilizan para la producción de otros animales transgénicos. Un animal fundador transgénico puede identificarse basándose en la presencia de la molécula de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, el transgén en su genoma y/o la expresión del ARNm del transgén en tejidos o células de los animales. Un animal fundador transgénico puede utilizarse entonces para criar animales adicionales que portan el transgén. Además, los animales transgénicos que portan un transgén que codifica para los polipéptidos de la invención pueden cruzarse adicionalmente con otros animales transgénicos que portan otros transgenes.

La invención se ilustra asimismo mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como adicionalmente limitativos.

Ejemplos Construcción de ligandos obtenidos mediante ingeniería genética para CD40 (sólo para referencia) Ejemplo 1 Construcción de CD154-GPI humano

Se prepara un constructo de CD 154-GPI humano mediante procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los parámetros de la PCR y los oligonucleótidos descritos a continuación.

Se utilizan los siguientes oligonucleótidos para amplificar cualquiera de dos partes de CD 154 a partir de ADNc total de células T CD4+ humanas:

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3

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Los parámetros de la PCR son:

: 4

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La PCR se realiza utilizando Pfu polimerasa para el último número de ciclos que proporciona una banda visible sobre un gel de agarosa. Tras la finalización de la PCR, se deja enfriar la reacción a 4º durante 10 minutos. Se purifica el producto de PCR tras electroforesis a través de un gel de agarosa al 1,2%. Se corta la banda de ADN y se purifica el fragmento de ADN utilizando un kit adquirido de Qiagen.

Se digiere el fragmento de ADN purificado con EcoRI y NgoM1. Tras la digestión, se extrae la mezcla de reacción con fenol:cloroformo (1:1) seguido de cloroformo. Se ajusta la fase acuosa a acetato de sodio 0,3 M pH 5,2 y se precipita el ADN con 2 volúmenes de etanol a 80º durante 2 horas.

Se sedimenta el ADN mediante centrifugación, se elimina el etanol y se enjuaga el sedimento con etanol al 70%. Se seca el sedimento a vacío.

Se resuspende el ADN en agua estéril y se liga a pUC19-GPI 21 (tal como se describe a continuación en la presente memoria) que se ha digerido previamente con EcoRI-NgoM1. El ligamiento es durante hora a temperatura ambiente. Se utiliza PUC19 GPI 21 ligado al ADN amplificado para transformar células AG-1 competentes. Se seleccionan células AG-1 transformadas en placas de LB que contienen ampicilina. Se aísla el ADN de plásmido y se analiza tal como se explica a continuación. Se realizan digestiones de restricción para confirmar el constructo quimérico de pUC 19 CD154-GPI 2. Se aísla el ADN de un clon positivo y se secuencia para confirmar su
identidad.

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Ejemplo 2

(Sólo para referencia)

Construcción de CD154-GPI de ratón

Se prepara un constructo CD154-GPI murino mediante procedimientos de PCR utilizando los parámetros de la PCR y los oligonucleótidos descritos a continuación.

Se usan los siguientes oligonucleótidos para amplificar cualquiera de dos partes de CD 154 a partir de ADNc total de células T CD4+ de ratón:

5

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Los parámetros de la PCR son:

: 6

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La PCR se realiza utilizando Pfu polimerasa para el último número de ciclos que proporciona una banda visible en electroforesis en gel de agarosa. Tras la PCR, se deja enfriar la reacción a 4º durante 10 minutos. Se purifica el producto de PCR tras electroforesis a través de un gel de agarosa al 1,2%. Se corta la banda de ADN y se purifica el fragmento de ADN utilizando un kit adquirido de Qiagen.

Se digiere el fragmento de ADN purificado con EcoRI y NgoM1. Tras la digestión, se extrae la mezcla de reacción con fenol:cloroformo (1:1) seguido de cloroformo. Se ajusta la fase acuosa a acetato de sodio 0,3 M pH 5,2 y se precipita el ADN con 2 volúmenes de etanol a -80º durante 2 horas.

Se resuspende el ADN en agua estéril y se liga con pUC19-GPI 21 (tal como se describe a continuación en la presente memoria) que se ha digerido previamente con EcoRI-NgoM1. El ligamiento es durante una hora a temperatura ambiente. Se utiliza PUC19 GPI 21 ligado con el ADN amplificado para transformar células AG-1 competentes. Se seleccionan células AG-1 transformadas en placas de LB con ampicilina. Se aísla el ADN de plásmido y se analiza tal como se explica a continuación. Se obtuvieron digestos de restricción para confirmar el constructo quimérico de pUC 19 CD154-GPI 21. Se aísla el ADN de un clon positivo y se secuencia para confirmar su identidad. Para medir la expresión de la proteína quimérica, se clona el fragmento en un vector de expresión que coloca una secuencia señal de secreción, por ejemplo, la de IL-2 de ratón, en marco con, e inmediatamente en el sentido de 5' del fragmento de CD154.

Construcción de citocinas obtenidas mediante ingeniería genética Ejemplo 3 Construcción de GM-CSF-GPI

Se preparó un constructo de GM-CSF-GPI tal como se describe a continuación.

Se adquirieron los siguientes dos oligonucleótidos de Midland Certified Reagent Company (Midland, TX): GTX-5

GTX-5

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GTX-5 comprende:

a.: Secuencias en el extremo 5' adecuadas para ligarse con un sitio EcoRI (bases 1-5)

b.: Un sitio NgoM1 para crear una secuencia codificante quimérica en marco (bases 9-14)

c.: La secuencia codificante para la secuencia de modificación de GPI de Thy-1 humano (número de registro de Genbank M11749) (bases 15-137)

d.: Un codón de terminación (bases 138-140)

e.: Secuencias en el extremo 3' para ligarse a un sitio KpnI (bases 144-148)

También se adquirió el oligonucleótido complementario a GTX-5, excepto para los extremos sucesivos, denominado GTX-6 (a continuación).

GTX-6:

8

Se disolvieron GTX-5 y GTX-6 en tubos individuales en agua estéril a una concentración final de 1 microgramo/lambda. Se mezclaron GTX-5 y GTX-6 a una concentración final de 100 ng/lambda y se dejaron hibridar durante 60 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, se clonó el oligonucleótido bicatenario GTX-5:GTX-6 (Thy-GPI) en el plásmido pUC 19. Se digirieron cuatro (4) microgramos de ADN de pUC19 con EcoRI y KpnI. Tras la electroforesis, se purificó el ADN lineal en un gel de agarosa al 0,7% utilizando un kit de purificación en gel de Qiagen (Santa Clarita, CA) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se ligaron 100 ng del oligonucleótido GTX-5:GTX-6 con 200 ng del pUC19 digerido con EcoRI-KpnI en un volumen final de 20 microlitros a temperatura ambiente durante 60 minutos.

Se transformó el plásmido en células AG-1 competentes, que se adquirieron de Stratagene. Se inocularon E. coli transformadas en placas de LB-amp. Se tomaron colonias bacterianas en crecimiento sobre placas de LB que contenían ampicilina (100 microgramos/ml) y se inocularon en un ml de LB con amp y se hicieron crecer durante la noche a 37º con agitación.

Se aisló el ADN de plásmido utilizando un protocolo de miniprep de lisis alcalina convencional. Se digirió el ADN de plásmido con EcoRI y KpnI. Se sometió a electroforesis el ADN sobre geles de agarosa al 1,6% teñidos con bromuro de etidio, y por tanto se identificaron las colonias que contenían un fragmento de EcoRI-KpnI de aproximadamente 148 pb. Se inocularon las colonias positivas en 100 ml de LB con ampicilina y se hicieron crecer durante la noche. Se purificó el ADN de plásmido utilizando kits adquiridos de Qiagen.

Se secuenció la secuencia de nucleótidos de un clon positivo para Thy-GPI, denominada ahora pUC-GPI 21, para confirmar su identidad.

Se amplificó la secuencia codificante de GM-CSF a partir de una biblioteca de ADNc de pulmón de ratón adquirida de Clontech (Palo Alto, CA). Los cebadores para PCR fueron tal como sigue:

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Los parámetros de la PCR fueron:

: 10

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Se realizó la PCR durante 30 ciclos utilizando Taq polimerasa. Tras la finalización de la PCR, se dejó enfriar la reacción a 4º durante 10 minutos.

Se purificó el producto GM-CSF de PCR tras la electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%. Se cortó la banda de ADN y se purificó el fragmento de ADN utilizando un kit adquirido de Qiagen.

A continuación, se digirió el GM-CSF purificado de ADN con EcoRI y NgoM1. Tras la digestión, se extrajo la mezcla de reacción con fenol:cloroformo (1:1) seguido de cloroformo. Se ajustó la fase acuosa con acetato de sodio 0,3 M pH 5,2 y se precipitó el ADN con 2 volúmenes de etanol a -80º durante 2 horas. Se sedimentó el ADN mediante centrifugación, se eliminó el etanol y se enjuagó el sedimento con etanol al 70%. Se secó el sedimento a vacío.

Se resuspendió el ADNc de GM-CSF en agua estéril y se ligó con pUC19-GPI 21 que se había digerido con EcoRI-NgoM1. El ligamiento fue durante una hora a temperatura ambiente. Se utilizó PUC 19 GPI 21 ligado con GM-CSF para transformar células AG-1 competentes. Se inocularon células AG-1 transformadas sobre placas de LB-amp. Se inocularon las colonias transformadas individualmente en un ml de LB que contenía 100 microgramos/ml de ampicilina. Se aisló el ADN de plásmido mediante el procedimiento de lisis alcalina rápida. Se obtuvieron digestos de restricción para confirmar el constructo quimérico pUC 19 GM-CSF-GPI 21. Se aisló el ADN de un clon positivo y se secuenció para confirmar su identidad.

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Ejemplo 4 Construcción de IL-4-GPI

Se construye un plásmido que codifica para la IL-4 murina unida a GPI tal como sigue. Se amplifica un ADNc que codifica para la IL-4 murina (número de registro de Genbank M25892) mediante PCR (tal como se describió anteriormente) a partir de una biblioteca de bazo de ratón utilizando los siguientes cebadores:

11

Se aísla el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa tal como anteriormente, se digiere con EcoRI y NgoM1 y se purifica tal como anteriormente. Se liga el ADNc en pUC19-GPI 21, y se transforma el plásmido en células E. coli competentes. Se aíslan los clones de plásmido positivos tal como anteriormente. Se clona el gen quimérico en un vector de expresión tal como se describe a continuación.

Ejemplo 5 Construcción de IL-12 p40-GPI

Se construye un plásmido que codifica para la subunidad p40 de la IL-12 murina unida a GPI tal como sigue. Se amplifica un ADNc que codifica para la subunidad p40 de IL-12 murina (número de registro de Genbank M86671) a partir de una biblioteca de bazo de ratón mediante PCR (tal como se describió anteriormente) utilizando los siguientes cebadores:

12

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Se aísla el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa tal como anteriormente, se digiere con EcoRI y NgoM1 y se purifica tal como anteriormente. Se liga el ADNc en pUC19-GPI 21, y se transforma el plásmido en células de E. coli competentes. Se aíslan los clones de plásmido positivos tal como anteriormente. Se clona el gen quimérico en un vector de expresión tal como se describe a continuación.

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Ejemplo 6 Construcción de IL-12 p35-GPI

Se construye un plásmido que codifica para la subunidad p35 de la IL-12 murina unida a GPI tal como sigue. Se amplifica un ADNc que codifica para la subunidad p35 de la IL-12 murina (número de registro de Genbank M86672) mediante PCR a partir de una biblioteca de bazo de ratón utilizando los siguientes cebadores:

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p35 y p40 de IL-12 unida a GPI pueden expresarse de manera conjunta en una célula huésped, o cualquier constructo unido a GPI puede expresarse de manera conjunta con una versión no unida a GPI del otro constructo.

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Clonación de proteínas quiméricas de GPI en un vector de expresión de célula de mamífero Ejemplo 7

Se digirió PUC 19 GM-CSF-GPI 21 con EcoRI y KpnI, para liberar el fragmento de ADN de GM-CSF-GPI 21. Se purificó el fragmento de ADN tras electroforesis en gel de agarosa utilizando un kit adquirido de Qiagen según el protocolo del fabricante.

Para la expresión transitoria en células Cos 1, se clonó el gen de GM-CSF-GPI quimérico en el vector de expresión de mamíferos pSVK3 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Para la expresión estable en células tumorales murinas y células CHO, se clonó el gen en el vector de expresión de mamífero pCI (Promega, Madison, WI). En ambos casos, se ligó el fragmento de ADN con el plásmido que se había digerido con EcoRI y KpnI.

Se utilizó cada mezcla de ligamiento para transformar AG-1 células. Se seleccionaron las células transformadas mediante crecimiento en placas de LB que contenían 100 microgramos/ml de ampicilina. Se tomaron las colonias transformadas y se inocularon en un ml de LB con ampicilina. Se aisló el ADN de plásmido mediante el procedimiento de lisis alcalina rápida. Se digirió ADN de plásmido con enzimas de restricción para confirmar la presencia de los insertos. Se seleccionaron clones que contenían pSVK3 GM-CSF-GPI y pCI GM-CSF-GPI. Se aisló el ADN de plásmido a partir de cultivos de 100 ml de cada clon para electroporación en células Cos 1, células CHO o de melanoma murino B16.

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Electroporación de GM-CSF-GPI en células Cos 1, B16 o CHO Ejemplo 8 Expresión transitoria en células Cos-1

Se hicieron crecer células Cos-1 en DMEM-FBS al 10% con Pen-Strep. Se recogieron las células a aproximadamente el 75% de confluencia mediante tripsinización. Se diluyeron las células tripsinizadas en DMEM-FBS al 10% con Pen-Strep y se sedimentaron mediante centrifugación a 1500 rpm (aproximadamente 1500 g) durante 3 minutos en una centrífuga Heraeus Biofuge 15R. Se separó el sobrenadante y se resuspendieron las células en DMEM-FBS al 10% con Pen-Strep, a una concentración final de aproximadamente 6 x 10^{6} células/ml.

Para la electroporación, se sometieron a electroporación 0,6 ml de células resuspendidas con 10 microgramos (a 1 microgramo/microlitro) de pSVK3 GM-CSF-GPI 21.

Se realizó la electroporación utilizando un Gene Pulser de BioRad. Las condiciones fueron las recomendadas por el fabricante. Tras la electroporación se enjuagaron las células con DMEM-FBS al 10% con Pen-Strep (P-S) y se sembraron en placa en frascos de cultivo tisular.

Se recogieron las células tras 48 horas. Se eliminó el medio y se enjuagaron las células con PBS estéril. Entonces se rasparon las células del frasco de cultivo tisular y se sedimentaron las células mediante microcentrifugación durante 4 minutos a temperatura ambiente.

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Expresión estable de GM-CSF-GPI en células de melanoma B16

Se linealizó el plásmido pCI GMCSF-GPI con la enzima de restricción Bgl II. Para seleccionar para la integración estable de GM-CSF-GPI en células de melanoma B16, se sometió a electroporación pCI GMCSF-GPI en células B16 junto con el gen que confería resistencia a G418 (neo^{r}) en razones molares de 20:1 respectivamente. Las condiciones para la electroporación fueron 250 V, 750 uF, en una cubeta de separación de electrodos de 0,4 cm utilizando un Gene Pulser II de BioRad con un Capacitance Extender Plus. Tras la electroporación, se hicieron crecer las células durante 2 días en DMEM, FCS al 10%, P-S, en ausencia de G418. Tras dos días, se alimentaron las células con DMEM, FCS al 10%, P-S, complementado con G418 2 mg/ml (Clontech). Tras la selección, las células B16 resistentes a G418 que se habían sometido a electroporación con pCI GMCSF-GPI se propagaron en DMEM, FCS al 10%, P-S, complementado con G418 1 mg/ml.

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Expresión estable de GM-CSF-GPI en células CHO

Se linealizó el plásmido pCI GMCSF-GPI con la enzima de restricción Bgl II. Para seleccionar para la expresión estable del gen de GMCSF-GPI en células CHO, se sometió pCI GMCSF-GPI a electroporación en células junto con el gen para la dihidrofolato reductasa (DHFR). Se sometieron a electroporación células CHO DG44 (obtenidas del Dr. Chasin, Universidad de Columbia) con pCI GMCSF-GPI junto con pSV2 DHFR digerido con EcoRI (ATCC) en una razón molar de 20:1, respectivamente. Las condiciones para la electroporación de las células CHO DG44 fueron 250 V, 1050 uF, en una cubeta de separación de electrodos de 0,4 cm utilizando un Pulser II BioRad Gene con un Capacitance Extender Plus. Se hicieron crecer las células durante 2 días en medio alfa MEM (Gibco BRL), FCS dializado al 7%, con complemento de HT (Gibco BRL). Tras dos días, se colocaron las células en medio selectivo que comprendía medio alfa MEM, FCS dializado al 7% sin complemento de HT. Se mantuvo un conjunto estable de células transfectadas. Para amplificar las secuencias de GMCSF-GPI, se hicieron crecer las células transfectadas en concentraciones crecientes de manera gradual (0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM y 1,0 uM) de metotrexato. Se propagó un conjunto de células CHO, sometidas a electroporación con pCI GM-CSF-GPI (y pSV2 DHFR) y resistentes a metotrexato 1,0 uM.

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Vacunación utilizando células recubiertas con citocina y demostración de la eficacia de células recubiertas con citocina Ejemplo 9 Vacunación utilizando células recubiertas con citocina

Se comparó la capacidad de células B16 transfectadas con pCI-GM-CSF-GPI y neo^{r} para funcionar como vacuna preventiva contra la formación de tumores con la de las células control, a saber, células B16 transfectadas sólo con pCI "vacío" (es decir, plásmido sin ningún inserto) y neo^{r}. Se vacunaron cuatro ratones C57BL/6 por vía subcutánea en el abdomen con 5 x 10^{5} células control irradiadas (3500 rads), y se vacunaron cinco ratones con 5 x 10^{5} células de GM-CSF-GPI irradiadas. Siete días más tarde, se expusieron todos los ratones a 1 x 10^{6} células de tipo natural vivas inyectadas por vía subcutánea en el cuello. Se detectaron tumores en el grupo control de ratones en los días tras la exposición 7, 11 (2 ratones), y 15. Se detectaron tumores en el grupo de GM-CSF-GPI de ratones en los días tras la exposición 11, 12, 15 (2 ratones), y 16. Los resultados mostraron un periodo de supervivencia en el grupo control de ratones de hasta 15 (2 ratones), 16 y 20 días; y un periodo de supervivencia considerablemente más largo en los ratones tratados con GM-CSF-GPI, es decir, hasta días 16, 19, 21 (2 ratones), y 32 días.

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Ejemplo 10

(Sólo para referencia)

Vacunación utilizando célula mejoradas en ligando de CD40

Se irradian células B16 tumorales y se recubren con CD154 murino unido a GPI utilizando el procedimiento descrito a continuación en la presente memoria. Se vacunan ratones C57BL/6 en el pliegue inguinal con 5 x 10^{5} células recubiertas con CO154-GPI irradiadas. A los ratones control se les inyecta una muestra por duplicado de células irradiadas que no están recubiertas con CD154. Una semana más tarde, se exponen los ratones a 1 x 10^{6} células B16 de tipo natural no irradiadas, no mejoradas en CD154 mediante una inyección en el cuello. Los ratones vacunados con células mejoradas en CD154 tendrán o bien un periodo de supervivencia media de 60 días que es por lo menos un 20% superior al periodo de supervivencia de los ratones control, o bien a los 60 días tras la etapa de exposición (descrita anteriormente), por lo menos un 20% más de ratones de los que recibieron células recubiertas con CD154-GPI estarán vivos en comparación con los ratones control.

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Ejemplo 11

(Sólo para referencia)

Construcción de quimeras de GPI-opsonina y vacunación utilizando células mejoradas en opsonina, mejoradas en ligando de CD140

Se amplificó la secuencia codificante de proteína de unión a manosa (MBP) murina de una biblioteca de ADNc de hígado de ratón adquirida de Clontech. Los cebadores para PCR fueron tal como sigue:

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Los parámetros de la PCR fueron:

: 15

Se realizó la PCR durante 30 ciclos utilizando Vent polimerasa. Tras la finalización de la PCR, se dejó enfriar la reacción a 4º durante 10 minutos. Se purificó el producto de MBP de la PCR tras la electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%. Se cortó la banda de ADN y se purificó el fragmento de ADN utilizando un kit adquirido de Qiagen.

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Construcción de MBP-GPI 21 quimérico

Se digirió el fragmento de fragmento de ADN de MBP purificado con EcoRI y NgoMl. Tras la digestión, se extrajo la mezcla de reacción con fenol:cloroformo (1:1) seguido de cloroformo. Se ajustó la fase acuosa con acetato de sodio 0,3 M pH 5,2 y se precipitó el ADN con 2 volúmenes de etanol a -80º durante 2 horas. Se sedimentó el ADN mediante centrifugación, se eliminó el etanol, y se enjuagó el sedimento con etanol al 70%. Se secó el sedimento a vacío.

Se resuspendió el ADN de MBP en agua estéril y se ligó con pUC19-GPI 21 que se había digerido con EcoRI-NgoM1. El ligamiento fue durante una hora a temperatura ambiente. Se utilizó PUC19 GPI 21 ligado con MBP para transformar células AG-1 competentes. Se aisló el ADN de plásmido y se analizó tal como anteriormente. Se aisló el ADN de un clon positivo y se secuenció para confirmar su identidad.

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Construcción de cadena alfa de C3b-GPI 21 quimérico

Se amplificó la secuencia codificante de la cadena alfa de C3b mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc de hígado de ratón adquirida de Clontech. Los cebadores para PCR fueron tal como sigue:

16

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Los parámetros de la PCR fueron:

: 17

Se realizó la PCR durante 35 ciclos utilizando Pfu polimerasa. Tras la finalización de la PCR, se dejó enfriar la reacción a 4º durante 10 minutos.

Se purificó el producto de PCR de la cadena alfa de C3b tras la electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%. Se cortó la banda de ADN y se purificó el fragmento de ADN utilizando un kit adquirido de Qiagen.

Se digirió el fragmento de ADN de la cadena alfa de C3b purificado con EcoRI y NgoM1. Tras la digestión, se extrajo la mezcla de reacción con fenol:cloroformo (1:1) seguido de cloroformo. Se ajustó la fase acuosa con acetato de sodio 0,3 M pH 5,2 y se precipitó el ADN con 2 volúmenes de etanol a -80º durante 2 horas. Se sedimentó el ADN mediante centrifugación, se eliminó el etanol y se enjuagó el sedimento con etanol al 70%. Se secó el sedimento a vacío.

Se resuspendió el ADN de la cadena alfa de C3b en agua estéril y se ligó con pUC19-GPI 21 que se había digerido con EcoRI-NgoM1. El ligamiento fue durante una hora a temperatura ambiente. Se utilizó PUC19 GPI 21 ligado con ADN de la cadena alfa de C3b para transformar células AG-1 competentes. Se seleccionaron las células AG-1 transformadas en placas de LB con ampicilina. Se aisló el ADN de plásmido y se analizó tal como anteriormente. Se realizaron digestos de restricción para confirmar el constructo quimérico pUC 19 cadena alfa de C3b-GPI 21. Se aisló el ADN de un clon positivo y se secuenció para confirmar su identidad.

Estos constructos pueden introducirse artificialmente en una célula huésped y las proteínas recombinantes pueden purificarse mediante procedimientos conocidos en la materia, por ejemplo purificación por inmunoafinidad.

Vacunación utilizando células mejoradas en opsonina, mejoradas en CD154

Se exponen ratones C57BL/6 a 1 x 10^{6} células B16 de tipo natural, no mejoradas, no irradiadas, detrás del cuello. Una semana más tarde, se vacunan los ratones con 5 x 10^{5} células B16 irradiadas mezcladas, tal como se describe a continuación en la presente memoria, con CD154 murino unido a GPI y una opsonina unida a GPI, por ejemplo, la cadena alfa de C3b o MBP. Se vacunan los ratones control con células idénticas que no están mejoradas con GPI-CD 154 u opsonina unida a GPI. Los ratones vacunados con células mejoradas en CD 154/mejoradas en opsonina tendrán o bien un periodo de supervivencia media de 60 días que es por lo menos un 20% superior al periodo de supervivencia de los ratones control, o bien a los 60 días tras la etapa de exposición (descrita anteriormente) por lo menos un 20% más de los ratones que recibieron células B16 irradiadas mezcladas con CD154 unido a GPI y opsonina unida a GPI estarán vivos en comparación con los ratones control.

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Ejemplo 12

(Sólo para referencia)

Vacunación utilizando células mejoradas en Acm frente a CD40, mejoradas en opsonina

Se acopla un anticuerpo monoclonal frente a CD40 con palmitato (Colsky et al, 1989, J. Immunol Methods, 124:179-87). Entonces se utiliza el anticuerpo unido a lípido en lugar de GPI-CD154 en la vacunación y los procedimientos descritos en el ejemplo 10 y 11 (anteriores).

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Ejemplo 13

(Sólo para referencia)

Vacunación utilizando células mejoradas en CD154 e IL-4

Se prepara IL-4 unida a GPI tal como se describe en el ejemplo 4 y se realizan los procedimientos de vacunación descritos en el ejemplo 10 con IL-4 unida a GPI añadida a las vacunas recubiertas con GPI-CD154.

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Ejemplo 14 Vacunación utilizando células recubiertas con GMCSF

Se irradian células tumorales B16 y se recubren con GM-CSF unido a GPI utilizando el procedimiento descrito a continuación en la presente memoria. Se vacunan ratones C57BL/6 con 5 x 10^{5} células recubiertas con GPI-GMCSF en el pliegue inguinal. A los ratones control se les inyectan células idénticas que no están recubiertas con GPI-GM-CSF. Una semana más tarde, se exponen los ratones a 1 x 10^{6} células B16 de tipo natural, no recubiertas, no irradiadas mediante una inyección detrás del cuello. Los ratones vacunados con células recubiertas con citocina tendrán un periodo de supervivencia media de 60 días que es por lo menos un 20% superior al periodo de supervivencia de los ratones control, o a los 60 días tras la etapa de exposición (descrita anteriormente) por lo menos un 20% más de los ratones que recibieron células recubiertas con GPI-GMCSF estarán vivos en comparación con los ratones de control.

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Ejemplo 15 Vacunación utilizando GPI-GMCSF, células mejoradas en GPI-opsonina

Se exponen ratones C57BL/6 a 1 x 10^{6} células B16 de tipo natural no recubiertas, no irradiadas mediante una inyección detrás del cuello. Una semana más tarde, se vacunan los ratones con 5 x 10^{5} células B16 irradiadas recubiertas con GM-CSF unido a GPI y una opsonina unida a GPI, por ejemplo, cadena alfa de C3b o MBP. Se vacunan los ratones control con una muestra por duplicado de células irradiadas que no están recubiertas con GPI-GM-CSF u opsonina unida a GPI. Los ratones vacunados con células recubiertas con citocina tendrán un periodo de supervivencia media de 60 días que es por lo menos un 20% superior al periodo de supervivencia de los ratones control, o a los 60 días tras la etapa de exposición (descrita anteriormente) por lo menos un 20% más de los ratones que recibieron GMCSF y células recubiertas con opsonina estarán vivos en comparación con los ratones control.

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Ejemplo 16

Se acopla IL-12 recombinante con palmitato utilizando el protocolo descrito anteriormente en la presente memoria. A continuación, se añade la IL-12 unida a lípido a las vacunas y los procedimientos descritos en los ejemplos 14 y 15, o sustituye a GM-CSF en esos ejemplos.

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Ejemplo 17

Se realizan los procedimientos de los ejemplos 15 y 16 con IL-4 unida a GPI (preparada tal como se describe en el ejemplo 4) añadida a las vacunas recubiertas con GPI-GM-CSF.

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Preparación de una opsonina obtenida mediante ingeniería genética transmembrana Ejemplo 18

En otro ejemplo, se prepara una opsonina obtenida mediante ingeniería genética transmembrana que comprende un resto de unión a APC de C3b. Se amplifica una parte del fragmento C3b del complemento murino C3 mediante PCR a partir de ADNc de hígado de ratón utilizando un cebador en el sentido de 5' correspondiente a los nucleótidos 2304-2324 de la secuencia que comprende el número de registro de Genbank K02782 más un "ATG" en 5' y un cebador en el sentido de 3' complementario a los nucleótidos 2429-2453 de la secuencia que comprende el número de registro de Genbank K02782. Se amplifica la región transmembrana de IgG3 de ratón a partir de ADNc de bazo de ratón utilizando un cebador en el sentido de 5' que corresponde a los nucleótidos 100-125 de la secuencia que comprende el número de registro de Genbank V01526 y contiene 12 bases en el extremo 5' que son complementarias al extremo 5' de la hebra antisentido del fragmento C3b, y un cebador en el sentido de 3' que complementa los nucleótidos 823-846 de la secuencia que comprende el número de registro de Genbank V01526, e incorpora un codón de parada en el sentido de 3' más una extensión que contiene un sitio de restricción apropiado. Se aíslan ambos productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 1,2% para ambos), se eluyen de las bandas de agarosa cortadas utilizando perlas de vidrio (perlas de vidrio Geneclean, Instrucciones del fabricante, Bio 101, Inc., Vista, CA), y se cuantificaron mediante espectrofotometría. Se fusionan las dos secuencias amplificadas entre sí en marco utilizando el procedimiento de PCR solapante (Horton et al., 1989, Gene, 77:61-8). En resumen, se utilizan cantidades equimolares de los dos fragmentos en una reacción de PCR con cantidades en exceso del cebador de C3b en el sentido de 5' y el cebador de IgG3 en el sentido de 3'.

Los productos anteriores pueden clonarse en vectores de expresión adecuados, en presencia o ausencia de una señal de secreción en el sentido de 5' si fuera necesario, y expresarse en las células que comprenden antígeno apropiadas, por ejemplo, células tumorales malignas. Las células transfectadas pueden mezclarse con un ligando obtenido mediante ingeniería genética unido a lípido para CD40 y/o una citocina obtenida mediante ingeniería genética unida a lípido y luego utilizarse como vacuna contra un antígeno comprendido por las células.

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Utilización de moléculas obtenidas mediante ingeniería genética para preparar células mejoradas Ejemplo 19

Pueden prepararse células recubiertas con citocina o mejoradas en opsonina introduciendo un ácido nucleico que codifica para una opsonina o una citocina obtenida mediante ingeniería genética en las células, tal como se describe anteriormente en la presente memoria. Las opsoninas o citocinas obtenidas mediante ingeniería genética unidas a lípido pueden utilizarse también para preparar células recubiertas con citocina o mejoradas en opsonina utilizando el siguiente procedimiento (McHugh et al, ya citado). Se suspenden células en un tampón adecuado, por ejemplo, HBSS, solución salina tamponada con fosfato, o medios de cultivo celular a una concentración en el orden de 1 x 10^{5} a 1 x 10^{8} células/ml. Se añade una molécula unida a lípido, por ejemplo, GM-CSF unido a palmitato, a en el orden de 10-200 ug/ml, y se incuba la mezcla a 37ºC durante entre 2 y 20 h. Se lavan las células en tampón tres veces antes de su utilización.

Alternativamente, en un procedimiento que es particularmente útil para moléculas unidas a palmitato, se suspenden células a 5x10^{6}/ml de DMEM libre de suero. Entonces se dispensan alícuotas de 0,9 ml de mezcla de células en tubos cónicos de 15 ml. Se añaden a cada tubo 0,1 ml de proteína obtenida mediante ingeniería genética a 0,1 mg/ml - 1 mg/ml en PBS/desoxicolato al 0,15%/bicarbonato de sodio al 0,1%/pH 7,8. Se colocan los tubos en ángulo en un soporte de styrofoam en un baño de hielo, que se agita durante 4 horas. Las células se separan por centrifugación, se lavan dos veces con PBS y se resuspenden para su utilización.

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Ejemplo 20

Se aíslan células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de sangre completa mediante centrifugación en gradiente, se resuspenden en RPMI 1640 con suero de ternero fetal al 10% y se colocan en una placa de plástico durante 2 h a 37ºC en CO_{2} al 5%. Se desechan las células no adherentes y se cultivan las células adherentes durante 7 días con GM-CSF humano 800 U/ml y IL-4 humana 500 U/ml. Entonces se recogen aproximadamente de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{8} de estas células, se siembran en placa y se mezclan con aproximadamente de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{8} células recubiertas con citocina que comprenden células recogidas de un sujeto con cáncer, por ejemplo células tumorales malignas recubiertas con citocina que comprenden un ligando para un receptor para TNF-\alpha y/o un ligando para un receptor para IL-12. Se incuba la mezcla a 37ºC durante aproximadamente de 5 min. a 6 h. Entonces se administran aproximadamente de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{8} de las APC al sujeto, por ejemplo, mediante inyección subcutánea.

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Ejemplo 21

Se recogen macrófagos de médula ósea murina. Entonces se recogen aproximadamente de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{8} de estas células, se siembran en placa y se mezclan con aproximadamente de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{8} células de melanoma B16 recubiertas con citocina, por ejemplo células B16 recubiertas con citocina que comprenden un ligando para un receptor para GM-CSF y/o un ligando para un receptor para IL-12. Se incuba esta mezcla a 37ºC durante aproximadamente de 5 min. a 6 h. Entonces se administran de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{8} de las APC a un ratón que porta tumor B16, por ejemplo mediante inyección subcutánea.

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Dosificación, modo de administración y formulación farmacéutica

La invención comprende procedimientos de modulación de una respuesta inmunitaria en un mamífero frente a un antígeno seleccionado, comprendiendo el procedimiento administrar a un mamífero una cantidad terapéutica de células recubiertas con citocina y/o mejoradas en opsonina, o administrar una cantidad terapéutica de APC que se han puesto en contacto con células recubiertas con citocina y/o células mejoradas en opsonina in vitro.

Las células descritas en la presente memoria pueden prepararse como inyectables, o bien como suspensiones o bien disoluciones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en o suspensión en, líquido antes de la infección. También puede emulsionarse la preparación o encapsularse las células en liposomas. Con frecuencia se mezclan los principios activos inmunogénicos con vehículos que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que no provoca una reacción alérgica u otro efecto indeseado en los sujetos a los que se administra. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento de pH y/o adyuvantes que mejoran la eficacia de la vacuna. Los ejemplos de adyuvantes que pueden ser eficaces incluyen pero no se limitan a: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, denominada nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (COP) 19835A, denominada MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween 80. Otros ejemplos de adyuvantes incluyen DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio), adyuvantes completo e incompleto de Freund y QuilA. Además, pueden utilizarse sustancias de inmunomodulación tales como linfocinas (por ejemplo, IFN-, IL-2 y IL-12) o inductores de IFN- sintéticos tales como poli I:C en combinación con los adyuvantes descritos en la presente memoria.

Las células de la invención pueden administrarse por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, o bien por vía subcutánea o bien por vía intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios, y en algunos casos, formulaciones orales o formulaciones adecuadas para su distribución como aerosoles. En el caso de las formulaciones orales, la manipulación de subgrupos de células T empleando adyuvantes, empaquetamiento de antígeno, o la adición de citocinas individuales a diversas formulaciones puede dar como resultado vacunas orales mejoradas con respuestas inmunitarias optimizadas. Para supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo del 0,5% al 10%, preferentemente del 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen tales excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, estearato magnésico de almidón, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos o formulaciones de liberación sostenida y contienen el 10%-95% de principio activo, preferentemente el 25-70%.

Las células de la invención pueden formularse en las composiciones de vacuna como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, maleico y similares. Las sales formadas con los tres grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.

Cualquier componente celular de tales composiciones de vacuna puede someterse, en la preparación para su inclusión en tales composiciones, a tratamientos que implican la atenuación o inactivación de las células de la vacuna, incluyendo, por ejemplo, la exposición a radiación ionizante, que puede inhibir la división celular, agentes antiproliferativos tales como ciclofosfamida, citocalasina D o colchicina, o eliminación con o sin fijación.

Las células se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que será profiláctica y/o terapéuticamente eficaz. La cantidad que ha de administrarse depende del sujeto que va a tratarse, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseado. Los intervalos de dosis adecuados están en el orden de varios cientos de microgramos de principio activo por vacunación con un intervalo preferido de desde aproximadamente 0,1 ug hasta 1000 ug, tal como en el intervalo de desde aproximadamente 1 ug hasta 300 ug, y preferentemente en el intervalo de desde aproximadamente 10 ug hasta 50 ug. Regímenes adecuados para la administración inicial y administraciones de refuerzo son también variables pero se tipifican por una administración inicial seguida de inoculaciones u otras administraciones posteriores. Las cantidades precisas de principio activo requeridas para administrarse dependen del juicio del médico y pueden ser características de cada sujeto. Será evidente para los expertos en la materia que la cantidad terapéuticamente eficaz de células de esta invención dependerá, entre otras cosas, del programa de administración, la dosis unitaria de antígeno administrada, si las células se administran en combinación con otros agentes terapéuticos, el estado inmunitario y la salud del receptor, y la actividad terapéutica de la composición particular.

Las células pueden administrarse en un programa de dosis unitaria, o preferentemente en un programa de dosis múltiples. Un programa de dosis múltiples es aquél en el que una serie primaria de vacunación puede incluir 1-10 dosis separadas, seguida de otras dosis administradas en intervalos de tiempo posteriores requeridos para mantener y/o reforzar la respuesta inmunitaria, por ejemplo, a los 1-4 meses para una segunda dosis y, si fuera necesario, una(s)
dosis posterior(es) tras varios meses. Son preferibles administraciones de refuerzo periódicas a intervalos de 1-5 años, habitualmente 3 años, para mantener los niveles deseados de inmunidad protectora. La serie de la inmunización puede ir seguida de ensayos de proliferación in vitro de linfocitos de sangre periférica (PBL) cultivados de manera conjunta con ESAT6 o ST- CF, y midiendo los niveles de IFN- liberado de los linfocitos cebados. Los ensayos pueden realizarse utilizando marcadores convencionales, tales como radionucleótidos, enzimas, marcadores fluorescentes y similares. Un experto en la materia conoce estas técnicas y pueden encontrarse en las patentes US números 3.791.932, 4.174.384 y 3.949.064.

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Otras formas de realización

Los ejemplos anteriores muestran experimentos realizados y contemplados por los presentes inventores para realizar y llevar a cabo la invención. Se cree que estos ejemplos incluyen una descripción de las técnicas que sirven tanto para informar de la materia de la práctica de la invención como para demostrar su utilidad. Los expertos en la materia apreciarán que las técnicas y formas de realización dadas a conocer en la presente memoria son solamente formas de realización preferidas y que en general pueden emplearse numerosos procedimientos y técnicas equivalentes para conseguir el mismo resultado.

Claims

1. Composición de vacuna que comprende una célula recubierta con citocina que puede obtenerse mezclando una citocina con una célula, en la que la citocina se introduce desde o se produce fuera de la célula y comprende un resto heterólogo de unión a la membrana celular que puede unirse a dicha célula cuando se mezcla con dicha célula.

2. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho resto heterólogo de unión a la membrana celular comprende un resto de GPI.

3. Composición de vacuna según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha citocina es un ligando para el receptor de GM-CSF.

4. Composición de vacuna según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha citocina es un ligando para uno de entre los receptores siguientes: el receptor de IL-2, el receptor de IL-4, el receptor de IL-6, el receptor de IL-10, el receptor de IL-12, el receptor de TNF-\alpha, el receptor de IFN-\gamma o un receptor de quimiocina.

5. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula es una célula patogénica.

6. Composición de vacuna según la reivindicación 5, en la que dicha célula recubierta con citocina es una célula tumoral maligna.

7. Composición de vacuna según la reivindicación 5, en la que dicha célula de dicha célula recubierta con citocina se selecciona de entre el grupo constituido por: una bacteria, un hongo o una célula de un parásito.

8. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende asimismo una célula mejorada en opsonina.

9. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula es incapaz de dividirse in vitro.

10. Procedimiento para preparar una célula recubierta con citocina para su utilización en una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la etapa de mezclar una citocina con una célula, en el que la citocina comprende un resto heterólogo de unión a la membrana celular.

11. Composición de vacuna que comprende una célula recubierta con citocina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para vacunar a un mamífero contra un antígeno seleccionado, en la que la célula recubierta con citocina comprende el antígeno seleccionado.