CN102988971A

CN102988971A - 一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN102988971A
Application number: CN2012105093200A
Authority: CN
Inventors: 李朝阳; 李明义; 石乔
Original assignee: SHANDONG SINDER TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Xinde Weite Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2032-12-04
Also published as: CN102988971B

Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)合成M基因；2)表达载体的构建；3)蛋白的诱导表达；4)重组菌保存实验；5)疫苗的制备。口服免疫的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题，作为安全无毒，能在肠道粘膜定居的活载体系统，乳酸乳球菌是最合适的载体系统。口服疫苗通过胃肠黏膜进行抗原递呈，经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应。

Description

一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)同属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，两种病毒感染后所引起的临床症状极其相似，给养猪业带来严重危害。

PEDV经口鼻感染后直接进入小肠，在小肠上皮细胞增殖，引起小肠绒毛吸收上皮细胞变性、损伤、脱落和小肠绒毛萎缩，导致肠内酶活性降低，吸收功能障碍，肠道内渗透压增高，引起渗透性腹泻。造成掉膘、降低饲料利用率，浪费药物和人力等所造成的经济损失是非常严重的。该病是世界性的疾病之一，亚洲、欧洲以及美洲等国家的许多猪阳性率都有很高。

M蛋白是由226个氨基酸组成、分子质量为27KD～32KD的膜糖蛋白，在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用。M蛋白在感染细胞中位于高尔基体内，不能被转运到细胞膜，由3个结构域组成，即暴露于病毒囊膜外短的糖基化N末端区、病毒囊膜中大的C末端区和中间为α螺旋区。在补体存在的条件下，抗M蛋白囊膜外抗原表位的单克隆抗体能中和病毒的感染性。另外，M蛋白能介导机体产生α干扰素，所以M蛋白可以作为PEDV基因工程疫苗的候选抗原。

乳酸乳球菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，因其在食品工业各个领域中的长期应用已证明不具有致病性，被公认为安全级微生物。利用一些乳酸乳球菌在胃肠道、泌尿、生殖系统中或黏膜部位粘附存活且无病原性等特点，广泛开展了活菌口服后在体内定植及疫苗的研究。

然而，现有的疫苗一般需要注射，常规注射疫苗会产生应激及疫苗吸收的问题，而通过口服免疫时，免疫原在到达小肠粘膜之前会存在被降解或灭活的可能，虽然以细菌病毒为活载体可达到这一目的，但细菌病毒对人体会有一定的伤害性，且不能在肠道粘膜定居。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种安全无毒，能在肠道粘膜定居的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法。

本发明采用如下技术方案：包括以下步骤：

1).合成M基因

将合成M基因连接到PES载体上，按照合成序列说明书进行酶切，分别克隆至pMD18-T质粒载体上，转化感受态JM109细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定的阳性质粒；

2).表达载体的构建

将含有正确方向和序列的M基因片段用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ切下，经胶回收纯化与载体质粒pMG36e回收纯化后进行16℃过夜连接；将连接产物与感受态细胞MG1363轻柔混匀后，冰上放置5min，将其转入2mm的预冷电转化杯中，迅速电击，电击参数为电压2.5kV，电击时间为5ms，电击后加入900μl冰预冷的SGM17恢复培养基，混匀，将菌液转移至1.5ml离心管中，冰上放置10min，28℃厌氧培养2h，取适量菌液涂布于含有5μg/ml红霉素的GM17琼脂培养基上，28℃厌氧培养2-3d；于平板上挑取单个菌落，分别接种于含有5μg/ml红霉素的GM17液体培养基中，28℃厌氧培养过夜后，从MG1363中提取质粒；对重组质粒进行酶切鉴定及序列测定分析；

3).蛋白的诱导表达

从表达重组蛋白菌株的琼脂板上挑取单个菌落接入含红霉素的GM17培养基中，同时以携带空质粒菌株作为阴性对照，28℃非震荡培养至达OD600=1.0，加入nisin至终浓度为10ng/ml，继续培养10h后离心收集菌体，用灭菌PBS洗涤细胞1次，离心收集菌体，最后用灭菌的PBS悬浮细胞，进行SDS-PAGE蛋白检测实验；结果表明所表达的重组蛋白大小约为26KDa；SDS-PAGE电泳结束后，将未染色的聚丙酰胺凝胶上的蛋白转移到醋酸纤维素膜上，用1%的BSA封闭，以兔抗PEDV血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG的二抗与之反应，最后用DAB显色；Western鉴定重组蛋白具有与PED全病毒制备的抗血清发生反应的能力，证明重组蛋白具有了良好的反应原性；

4).重组菌保存实验

从表达重组蛋白菌株的培养液中取200μl，接种于含红霉素的100ml GM17培养基中；28℃非震荡培养至OD600=1.0，与100ml含3%蔗糖和10%脱脂牛奶混合液混合均匀，分装为2ml/管，冻干；冻干后分别经过7天、14天、21天、1个月，2个月及3个月进行菌体复苏并计数，结果显示活菌数均在10⁸CFU/ml；

5).疫苗的制备

取冻干好的菌粉，加入1ml的生理盐水，混合均匀，直接口服。

进一步地，在第1）步和第2）步之间还包括将编码PEDV膜糖蛋白的M基因连接到pMG36e质粒上构建成表达质粒pMG36e-M，转化MG1363，得到基因工程菌种MG1363/pMG36e-M。

本发明猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法的有益效果是：可以口服，口服免疫的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能，满足这一要求的必须是活的载体系统来传递完整无损的抗原成分。以细菌病毒为活载体均可达到这一目的，但作为安全无毒，能在肠道粘膜定居的活载体系统，乳酸乳球菌是最合适的载体系统。口服疫苗通过胃肠黏膜进行抗原递呈，可经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应。

附图说明

图1为酶切鉴定结果图；

图2为Western blot分析结果图；

图3为冻干曲线图。

具体实施方式

请参阅图1、图2和图3所示，本发明的一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1).合成M基因

将合成M基因连接到PES载体上，按照合成序列说明书进行酶切，分别克隆至pMD18-T质粒载体上，转化感受态JM109细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定的阳性质粒（见图1）；

2).表达载体的构建

将含有正确方向和序列的M基因片段用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ切下，经胶回收纯化与载体质粒pMG36e回收纯化后进行16℃过夜连接；将连接产物与感受态细胞MG1363（实验室保存）轻柔混匀后，冰上放置5min，将其转入2mm的预冷电转化杯中，迅速电击，电击参数为电压2.5kV，电击时间为5ms，电击后加入900μl冰预冷的SGM17恢复培养基，混匀，将菌液转移至1.5ml离心管中，冰上放置10min，28℃厌氧培养2h，取适量菌液涂布于含有5μg/ml红霉素的GM17（M17+0.5%葡萄糖）琼脂培养基上，28℃厌氧培养2-3d；于平板上挑取单个菌落，分别接种于含有5μg/ml红霉素的GM17液体培养基中，28℃厌氧培养过夜后，从MG1363中提取质粒；对重组质粒进行酶切鉴定及序列测定分析；

3).蛋白的诱导表达

从表达重组蛋白菌株的琼脂板上挑取单个菌落接入含红霉素的GM17培养基中，同时以携带空质粒菌株作为阴性对照，28℃非震荡培养至达OD600=1.0，加入nisin至终浓度为10ng/ml，继续培养10h后离心收集菌体，用灭菌PBS洗涤细胞1次，离心收集菌体，最后用灭菌的PBS悬浮细胞，进行SDS-PAGE蛋白检测实验；结果表明所表达的重组蛋白大小约为26KDa；SDS-PAGE电泳结束后，将未染色的聚丙酰胺凝胶上的蛋白转移到醋酸纤维素膜上，用1%的BSA封闭，以兔抗PEDV血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG的二抗与之反应，最后用DAB显色；Western鉴定（见图2）重组蛋白具有与PED全病毒制备的抗血清发生反应的能力，证明重组蛋白具有了良好的反应原性；

4).重组菌保存实验

从表达重组蛋白菌株的培养液中取200μl，接种于含红霉素的100ml GM17培养基中；28℃非震荡培养至OD600=1.0，与100ml含3%蔗糖和10%脱脂牛奶混合液混合均匀，分装为2ml/管，冻干；重组菌冻干曲线（见图3），冻干后分别经过7天、14天、21天、1个月，2个月及3个月进行菌体复苏并计数，结果显示活菌数均在10⁸CFU/ml（见表1）；

表1 重组菌保存实验

保存时间	溶剂	温度（℃）	菌数（CFU/ml）
				7天	生理盐水	-20	2.2×10⁸
14天	生理盐水	-20	2.2×10⁸
				21天	生理盐水	-20	2.0×10⁸
1月	生理盐水	-20	1.8×10⁸
				2月	生理盐水	-20	1.5×10⁸
3月	生理盐水	-20	1.1×10⁸

基因及氨基酸序列：

1 ATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTC

1 M S N G S I P V D E V I Q H L R N W N F

61 ACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTAC

20 T W N I I L T I L L V V L Q Y G H Y K Y

121 TCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGTTA

40 S A F L Y G V K M A I L W I L W P L V L

181 GCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTC

60 A L S L F D A W A S F Q V N W V F F A F

241 AGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATT

80 S I L M A C I T L M L W I M Y F V N S I

301 CGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTC

100 R L W R R T H S W W S F N P E T D A L L

361 ACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTA

120 T T S V M G R Q V C I P V L G A P T G V

421 ACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTA

140 T L T L L S G T L L V E G Y K V A T G V

481 CAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTAC

160 Q V S Q L P N F V T V A K A T T T I V Y

541 GGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGG

180 G R V G R S V N A S S G T G W A F Y V R

601 TCCAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTTCGGTTCTCACAGATAGTGAG

200 S K H G D Y S A V S N P S S V L T D S E

661 AAAGTGCTTCATTTAGTCTAA

220 K V L H L V

5).疫苗的制备

其中，在第1）步和第2）步之间还包括将编码PEDV膜糖蛋白的M基因连接到pMG36e质粒上构建成表达质粒pMG36e-M，转化MG1363，得到基因工程菌种MG1363/pMG36e-M。通过诱导表达及检测表明该重组蛋白具有良好的反应原性。

免疫试验

（1）试验猪：21日龄的商品用仔猪购自山东高密某猪场。

（2）接种方法：口服。

（3）分组及免疫接种：14头仔猪随即分为2组，每组7头，对每头猪进行采血，用ELISA检测母源抗体。每头仔猪接种量为1头份。分别于7d、14d、21d、28d测粪便中活菌数以及血液中抗体含量。粪便中活菌数含量均在1.0×10⁹以上以及临床症状观察。

猪免疫实验分组及免疫接种

疫苗的安全性试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物仔猪由山东某猪场提供。

1.1.2 试验药品

实验室制备的3批重组乳酸乳球菌疫苗产品，稀释后检测活菌数为1.0×10⁹/ml。

1.2 试验方法

本试验共采用了三批实验室制品，由于试验条件和场地限制，以下所有试验都是在不同时间分别独立进行。

1.2.1 单剂量安全性试验

7日龄仔猪80头，分为4组，每组20头。试验组3组(注射三批重组乳酸乳球菌疫苗制品)，生理盐水对照1组。试验组每头灌服稀释后的重组乳酸菌1ml，对照组灌服等剂量无菌生理盐水，灌服一次后，连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻、采食量下降等不良症状出现，并对成活率、增重、饲料利用率等生产性能进行统计。

1.2.2 单剂量重复安全性试验

7日龄仔猪80头，分为4组，每组20头。试验组3组(灌服三批重组乳酸乳球菌疫苗产品)，生理盐水对照1组。试验组每头灌服重组乳酸菌1ml，对照组灌服等剂量无菌生理盐水，每天1次，连用7天，用药后连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻、采食量下降等不良症状出现，并对成活率、增重、饲料利用率等生产性能进行统计。

1.2.3 超剂量安全性试验

7日龄仔猪80头，分为4组，每组20只。试验组3组(灌服三批重组乳酸乳球菌疫苗产品)，生理盐水对照1组。试验组每头灌服重组乳酸菌2ml，对照组灌服无菌生理盐水2ml，灌服1次后，连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻、采食量下降等不良症状出现，并对成活率、增重、饲料利用率等生产性能进行统计。

2 结果

2.1 仔猪单剂量试验，观察14天后结果见表1。

表1 重组猪乳酸乳球菌疫苗对7日龄仔猪单剂量使用的安全性试验结果

Figure 2012105093200100002DEST_PATH_IMAGE001

2.2 仔猪单剂量重复试验结果见表。

表2 重组猪乳酸乳球菌疫苗对7日龄仔猪单剂量重复使用的安全性试验结果

2.2

Figure 2012105093200100002DEST_PATH_IMAGE002

2.3 仔猪超剂量注射试验试验结果见表3。

表3 重组猪乳酸乳球菌疫苗对7日龄仔猪超剂量使用的安全性试验结果

Figure 2012105093200100002DEST_PATH_IMAGE003

3 结论

各试验组仔猪在灌服重组乳酸菌后，连续14天观察仔猪的反应，仔猪无腹泻、采食量下降等不良症状，所有试验仔猪均健康存活，体重增加。试验结束后随机挑选4头剖杀，观察剖检变化，各组仔猪剖检的组织和器官与生理盐水对照组基本无差别。

疫苗的效力试验

1.1试验药品

实验室制备的3批重组疫苗产品，稀释后检测活菌数为1.0×10⁹/ml。

1.2试验方法

1.2.1 免疫接种试验

7日龄仔猪40头，分为4组，每组10头。试验组3组(灌服三批重组乳酸乳球菌疫苗制品)，生理盐水对照1组。试验组每头灌服稀释后的重组乳酸菌1ml，对照组灌服等剂量无菌生理盐水，灌服一次后，连续14天观察仔猪精神状态，有无腹泻、采食量下降等不良症状出现，并对成活率、增重、饲料利用率等生产性能进行统计。

1.2.2 血清抗体检测以及粪便活菌检测

免疫后分别在7、14、22、28日采集猪血清，用ELISA试剂盒检测抗体含量。

免疫后分别在7、14、22、28日采集猪粪便，进行活菌分离鉴定。

1.2.3 攻毒试验

免疫后28天，用PEDV的传统毒株进行攻击。将病毒含量为10^5.9TCID₅₀/ml的病毒培养液按1ml每头的剂量进行喷鼻接种。继续饲养观察各组动物的反应，仔猪有无腹泻、采食量下降等不良症状。对病死猪和21天时扑杀的试验猪，进行活菌分离鉴定以及RT—PCR检测。

2 试验结果

2.1 血清抗体检测

猪免疫实验分组及免疫接种

2.2 活菌分离检测

分别于7d、14d、21d、28d进行粪便中活菌的分离鉴定，用红霉素LB板进行细菌增殖培养，革兰氏染色可以看到在粪便中有重组乳酸菌的存在。

2.3 攻毒实验结果

对照组猪攻毒后全部发病，死亡1头。病猪病变表现为：仔猪出现水样腹泻，粪便呈黄色，体重迅速下降，脱水严重；食欲不振，部分仔猪出现发烧症状。

2.4剖检及PCR检测

对照组猪剖检结果为：小肠充气扩张，肠壁呈透明状，肠内容物稀薄，呈黄色泡沫状，部分病例肠道充血，有粘液。胃有胀气并且内容为呈鲜黄色。脾脏以及淋巴结肿大，PCR检测结果显示呈阳性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1).合成M基因

2).表达载体的构建

3).蛋白的诱导表达

4).重组菌保存实验

5).疫苗的制备

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于：在第1）步和第2）步之间还包括将编码PEDV膜糖蛋白的M基因连接到pMG36e质粒上构建成表达质粒pMG36e-M，转化MG1363，得到基因工程菌种MG1363/pMG36e-M。