KR20180057766A

KR20180057766A - 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스에 대한 동시 항원성 복합 항원 단백질의 제조 방법

Info

Publication number: KR20180057766A
Application number: KR1020160155196A
Authority: KR
Inventors: 우수동; 이승희; 배성민; 곽원석
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2018-05-31
Also published as: KR101886286B1

Abstract

본 발명은 다중 항원성을 가지는 바이러스 유사입자의 제조 방법에 관한 것으로서, 돼지파보바이러스의 중요 항원인 VP2 단백질 및 돼지열병바이러스의 중요 항원인 E2 단백질의 에피톱 부위를 융합시킨 바이러스 유사입자 및 이의 제조 방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명의 융합 단백질을 이용하면 두 가지 바이러스의 동시 항원성을 가지는 바이러스 입자를 제조할 수 있으므로 이를 효과적으로 복수의 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료에 이용할 수 있다.

Description

돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스에 대한 동시 항원성 복합 항원 단백질의 제조 방법{Method of manufacturing dual-antigenic combined antigen protein of Porcine Parvovirus and Classical Swine Fever Virus}

본 발명은 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스에 대한 동시 항원성 복합 항원 단백질의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돼지파보바이러스의 중요 항원인 VP2 단백질 및 돼지열병바이러스의 중요 항원인 E2 단백질의 에피톱 부위를 융합 발현시킴으로써 두 가지 바이러스의 동시 항원성을 가지는 바이러스 유사입자의 제조 방법에 관한 것이다.

돼지파보바이러스 감염증은 돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus; PPV)의 감염에 의하여 번식장애가 생기는 돼지의 전염성 질병으로써, 임신한 돼지에 감염되면 일반적인 모돈(성돈) 및 자돈에서는 특별한 임상증상이 나타나지 않지만, 초임돈에 한하여 유산을 하거나, 죽어서 나오는 사산, 검게 변색되어 배출되는 미이라변성 등의 번식장애 형태의 증상이 나타나는 질병이다.

돼지열병은 돼지열병바이러스(Classical Swine Fever Virus; CSFV)가 태반을 거쳐 태아를 공격하고 태아흡수, 기형, 유산 및 조산을 유발하며 태반을 통한 지속적인 감염으로 장기간 동안 문제를 일으키기 때문에 양돈업에 막대한 경제적 손실을 일으키는 전염병이다.

돼지파보바이러스 감염증의 예방을 위하여 현재까지 세계적으로 사용되고 있는 돼지파보바이러스 백신으로는 돼지파보바이러스를 조직배양한 후 포르말린을 이용하여 바이러스를 불활화한 사독 백신이 있으나, 이 방법을 이용하여 백신을 생산하기는 극히 어렵다. 이에 따라 백신 생산 단가가 1두당 1천원 정도로 돼지 질병 백신 중 가장 비싸게 판매되고 있는 실정이다. 또한 완벽한 바이러스 불활화가 어렵기 때문에, 사독 백신을 사용할 시 백신주에 의한 감염이 발생하여 예방을 위한 접종이 감염증을 유발하는 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 돼지열병바이러스 또한 효과적인 치료방법은 없는 실정이며, 예방법으로 현재 비활성 백신 또는 불활화 백신 등이 사용되고 있으나 국내 사용 백신주의 효능에 대한 문제점이 제기되고 있다.

돼지파보바이러스에 대한 주요 항원으로는 그 구조단백질들 중 VP2 단백질의 이용이 가장 효과적인 것으로 보고되고 있고, VP2 발현만으로도 바이러스 유사입자(virus like protein, VLP) 형성이 가능하여, VP2를 이용한 VLP 형태의 다양한 항원 생산 방법이 보고되고 있다.

선행기술로써 곤충세포주인 Sf 계열의 세포를 이용하여 VP2 단백질을 생산하는 방법이 발표된 바 있다(한국등록특허 제014220호). 그러나 세포주를 이용하여 단백질을 생산하는 방법은 세포의 대량 배양 조건이 요구되고 그에 따라 많은 양의 세포 배지가 필요하며, 배양 배지의 가격이 대부분 고가이기 때문에 경제적이지 못하다는 단점을 가지고 있다. 그에 따라 최근에는 누에 유충을 이용한 VLP의 효과적인 생산 방법이 보고된 바 있다.

한편, 누에 유충 1마리는 곤충세포 배양액 100 ~ 200 ㎖를 대신할 수 있기 때문에 단백질 대량 생산이 용이하며, 곤충세포주는 단일 세포이지만 다양한 세포가 존재하는 곤충생체반응기를 이용할 경우 생산된 단백질의 활성 또한 높아질 수 있다. 또한, 누에 1마리의 가격은 100원 정도로, 500 ㎖에 5만원 정도인 세포배지에 비하여 상당히 저렴하다는 이점이 있다.

한국공개특허 제10-2012-0125627호(2012.11.16) 한국등록특허 제10-0142210호(1998.03.27) 한국등록특허 제10-0320165호(2001.12.26) 한국등록특허 제10-1313906호(2013.09.23)

Je et al., Biotechnol. Lett., 23 : 1809-1817, 2001 Guo C. et al, Arch Virol. 2014 May;159(5):963-70

본 발명자들은 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스의 감염증의 예방, 진단 및 치료를 위하여 백신과 진단용 항원을 각각 생산해야 하는 불편함을 해소하기 위하여 돼지파보바이러스 중요 항원인 VP2 단백질을 기반으로 돼지열병바이러스 중요 항원인 E2 단백질의 중요 항원 에피톱 부위를 융합 발현시킴으로써 두 가지 바이러스에 대해 동시 항원성을 가지는 바이러스 유사입자를 제작하고자 예의 연구 노력하였다.

그 결과, 본 발명자들은 각 바이러스에 대한 단일 항원 단백질의 생산을 대체하여 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus)와 누에 유충을 이용하여 두 가지 항원성을 동시에 가지는 바이러스 유사입자 제작 방법을 고안함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은, 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스에 대해 동시 항원성을 가지는 바이러스 유사입자 및 그 제조 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus) VP2(viral protein 2) 단백질 및 (b) 돼지열병바이러스(classical swine fever virus) E2 단백질의 에피톱이 융합된 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스 동시 항원성 복합 항원 단백질을 제공한다.

상기 VP2는 돼지파보바이러스의 주요 구조단백질로서 이로 인해 면역이 유도된 숙주에서 중화항체(neutralizing antibodies)의 생성을 유도하는 것에 관여한다(Guo C. et al, Arch Virol. 2014 May;159(5):963-70). 상기 VP2의 아미노산 서열은 서열목록 제1서열로 표시되며, 이를 코딩하는 핵산 서열은 서열목록 제2서열로 표시된다.

상기 E2는 돼지열병바이러스의 4개의 구조단백질인 Capsid, E^rns, E1 및 E2 중 하나로서, 외피를 구성함으로써 바이러스를 중화하는 항체 생성에 관여하는 주요한 방어 항원으로 알려져 있다. E2의 에피톱에 해당하는 아미노산 서열은 서열목록 제3서열로 표시되는 CKEDYRY 부위이며, 이를 코딩하는 핵산 서열은 서열목록 제4서열로 표시된다.

본 발명의 명세서상의 용어 "융합"은 N 말단 또는 C 말단의 아미노산과 펩타이드 결합을 통해 결합되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서상의 용어 "동시 항원성 복합 항원 단백질"은 둘 이상의 바이러스 또는 세균으로부터의 항원이 융합되어 각 항원의 특징을 동시에 나타내는 복합 항원 단백질을 의미한다. 상기 복합 항원 단백질은 각 바이러스로부터의 항원 또는 그의 에피톱을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 E2 단백질의 에피톱은 상기 VP2 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합되어 있는 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 E2 단백질의 에피톱은 상기 VP2 단백질의 N 말단에 융합되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 복합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스 동시 항원성 백신용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 복합 항원 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 (b) 상기 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로모터는 곤충 세포에서 작동가능한 프로모터이고, 배큘로바이러스(Baculovirus)에서 유래한 폴리헤드린(Polyhedrin) 프로모터, IE-1 프로모터, IE-2 프로모터, p35 프로모터, p10 프로모터 및 gp64 프로모터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 프로모터는 폴리헤드린 프로모터일 수 있다.

본 발명의 명세서상의 용어 "폴리헤드린 프로모터"는, 외부 환경으로부터 바이러스 입자들을 보호하기 위한 큰 구조물인 다각체를 형성하는 기능을 한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 컨스트럭트는 전사 종결 서열을 추가적으로 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트로 형질 감염(co-transfection)된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 명세서상의 용어"형질 감염"은, 바이러스에서 핵산만을 화학적으로 분리하고 정제하여 바이러스의 숙주 세포에 넣어 두면 핵산이 세포 안에 들어가서 감염성을 가진 정상적인 바이러스 입자를 만드는 현상을 의미한다.

상기 형질 감염은 배큘로바이러스(Baculovirus)의 핵산을 이용하여 수행될 수 있다. 배큘로바이러스는 다각체를 형성하므로, 감염 여부는 숙주 내의 다각체 단백질의 존재여부를 통해 판단할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포일 수 있다.

상기 숙주 세포는 살아있는 곤충으로부터 분리된 상태의 세포주 또는 살아있는 곤충의 체내에 포함되는 세포일 수 있으므로, 본 발명인 복합 항원 단백질의 제조 방법의 구체적인 단계를 설명하기 위해 언급된 본 명세서 상의 용어 "배양"은 살아있는 곤충으로부터 분리된 상태의 세포주의 In vitro 배양 및 상기 숙주 세포를 갖는 살아있는 곤충의 사육을 포함하는 포괄적인 용어로 해석된다. 상기 곤충은 누에일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스 동시 항원성 복합 항원 단백질의 제조 방법을 제공한다: (a) 상기 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트로 형질 감염된 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 숙주세포로부터 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스 동시 항원성 복합 항원 단백질을 분리하여 수득하는 단계.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

본 발명은 돼지파보바이러스의 중요 항원인 VP2 단백질 및 돼지열병바이러스의 중요 항원인 E2 단백질의 에피톱 부위를 융합시킨 바이러스 유사입자 및 이의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 융합 단백질을 이용하면 두 가지 바이러스의 동시 항원성을 가지는 바이러스 입자를 제조할 수 있으므로 이를 효과적으로 복수의 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료에 이용할 수 있다.

도 1a는 돼지파보바이러스 VP2 유전자에 돼지열병바이러스 항원단백질 E2의 주요 에피톱을 융합한 유전자(VP2-E2)를 배큘로바이러스 전이벡터 pBmKSK3에 클로닝하는 과정 및 재조합 누에 핵다각체병 바이러스 제작과정을 나타내는 개요도이다.
도 1b는 돼지파보바이러스의 VP2 유전자의 N 말단에 돼지열병바이러스의 항원단백질 E2의 주요 에피톱을 융합한 유전자(VP2-E2)를 배큘로바이러스 전이벡터 pBmKSK3에 클로닝한 pBmKSK3-N-VP2를 나타내는 도면이다.
도 2a는 Bm5 세포주에서 발현된 VP2-E2 단백질을 단백질 전기영동 분석 방법으로 분석한 결과이다.
도 2b는 Bm5 세포주에서 발현된 VP2-E2 단백질에 대하여 돼지파보바이러스항체와 돼지열병바이러스 E2 에피톱 항체를 이용하여 웨스턴블랏 분석을 실시한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 누에 유충의 혈림프 및 지방체에서 발현된 VP2-E2 단백질을 단백질 전기영동 분석 방법과 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 세포주 및 누에 유충의 혈림프와 지방체에서 VLP를 분리한 다음 투과전자현미경을 통해 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 재조합 누에 핵다각체병 바이러스 제작

돼지파보바이러스의 게놈 DNA를 주형으로 서열목록 제5서열과 서열목록 제6서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하고, 돼지파보바이러스의 VP2 단백질 N 말단에 돼지열병바이러스 E2 항원의 중요 에피톱 부위인 CKEDYRY 아미노산을 함께 코딩하는 DNA 단편을 얻었다.

또한 동일한 주형으로 서열목록 제7서열과 서열목록 제8서열을 이용하여 VP2 단백질 C 말단에 E2의 CKEDYRY 에피톱 부위를 함께 코딩하는 DNA 단편을 얻었다.

각 DNA 단편을 T&A 클로닝 벡터(RBC Bioscience)에 클로닝하고 Sac II 및 Xba I으로 절단한 후, 이를 인서트로 하여 Sac II와 Xba I 절단하여 얻은 pBmKSK3(한국등록특허 제10-0320165호)에 삽입하여 전이벡터 pBmKSK3-N-VP2와 pBmKSK3-VP2-C를 각각 제작하였다(도 1a). 이 벡터에서 VP2 단백질 코딩 DNA 단편은 폴리헤드린 프로모터의 다운스트림에 위치한다.

상기 서열목록 제5서열 내지 제8서열의 정보는 표 1에 정리된 바와 같다.

서열목록	구분	서열
제5서열	CSFV E2-CKEDYRY-PPV VP2-F 프라이머	5'-CCGCGGCCACCATGTGCAAGGAAGATTACAGGTACAGTGAAAATG-3'
제6서열	PPV-VP2-R 프라이머	5'-TCTAGACTAGTATAATTTTCTTGGTATAAG-3
제7서열	PPV-VP2-F 프라이머	5'-CCGCGGCCACCATGAGTGAAAATGTGGAAC-3'
제8서열	PPV VP2-CSFV-E2-CKEDYRY-R	5'-TCTAGACTAGTACCTGTAATCTTCCTTGCA GTATAATTTTCTTGG-3'

제작한 전이벡터와 재조합 바이러스 bBpGOZA(Je et al., Biotechnol. Lett., 23 : 1809-1817, 2001)의 게놈 DNA를 100 ㎕의 TC-100 배지(WelGene)에 혼합하고, 셀펙틴 II(Cellfectin II, Invitrogen) 5 ㎕를 100 ㎕의 TC-100 배지에 혼합한 후 각각을 15 분 동안 27 ℃에서 방치하였다. 이후 두 혼합액을 섞어주고 다시 15 분 동안 27 ℃에서 방치하였다.

이 혼합액을 누에 세포주, Bm5(Bombyx mori 5)를 25 ㎟ 배양 플라스크당 2.0 x 10⁶ 개의 세포로 분주하여 배양액에 접종하고, 더 배양하여 재조합 누에 핵다각체병 바이러스 rBp-N-VP2와 rBp-VP2-C를 각각 제작하였다.

이와 같은 방법으로 제작된 재조합 바이러스들을 일반적인 바이러스 순수분리 방법인 용균반점법(Plaque assay)으로 순수하게 분리하였고, 바이러스를 대량으로 제조하기 위해 순수 분리된 바이러스들을 T-25 플라스크(SPL Inc.)에 재접종하여 증식시킴으로써 대량으로 바이러스를 수득할 수 있었다. 수득한 바이러스들은 희석종말법(King and Possee, 1992, The Baculovirus Expression System. A Laboratory Guide)에 의해 정량하여 사용하였다(도 1a 참조).

실시예 2. 누에 세포주에서 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스에 대한 VLP의 단백질 전기영동 분석

상기 실시예 1에서 제조된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스들을 곤충 세포주인 Bm5 세포에 세포당 1개의 바이러스 입자가 존재하도록 60 x 15 ㎜ 배양 플레이트당 1.0 x 10⁶ 개로 분주하여 1시간 동안 정치하여 Bm5 세포에 각각 감염시켰다. 접종 후 3일이 경과된 때에 세포를 도립현미경으로 관찰하여, 감염된 세포내에서 다각체 단백질이 나타나는 경우에 감염된 것으로 판단하였다. 이때 대조구로는 야생형 배큘로바이러스 BmNPV-K1(국내분리주, KCTC 0491BP)를 사용하였다.

이 재조합 바이러스들을 플레이트에서 수거하고 배양액을 1,000xg로 5분 동안 원심분리하였다. 침전물에 세포용해용액(20 mM Tris-Hcl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5% 글리세롤, 1% NP-40)을 가하고 얼음에서 30분 동안 방치하였다. 반응액에 5X 시료 완충액(0.6 ㎖ 1 M Tris-HCl(pH 6.8), 5 ㎖의 50％ 글리세롤, 2 ㎖의 10％ SDS, 0.5 ㎖의 2-머캅토에탄올, 1 ㎖ 1％ 브로모페놀블루, 0.9 ㎖ H₂O)을 가하고 혼합한 다음, 100℃에서 10분 동안 중탕가열하고 얼음에 잠시 놓아둔 다음 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다.

원심분리한 상등액으로 10% 단백질 전기영동 젤을 이용한 단백질 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 젤을 코마시 염색시약(coomasie brillant blue)으로 염색한 결과, 돼지파보바이러스 VP2와 돼지열병바이러스 에피톱 융합 단백질의 예상 크기인 약 64 kDa 위치에 단백질이 존재함을 확인하였다(도 2a).

목적 단백질의 정확한 확인을 위하여 돼지파보바이러스를 토끼의 복강 내에 접종하여 생산된 혈청 및 돼지열병바이러스 E2의 에피톱 CKEDYRY 아미노산으로 구성된 펩타이드를 합성하여 토끼의 복강내에 접종하여 생산된 혈청으로 각각 웨스턴블랏 분석을 실시하였다.

웨스턴블랏 분석을 위하여 상기와 같은 방법으로 제조된 단백질 시료들로 단백질 전기영동 후, 젤에 존재하는 단백질들을 나이트로섬유소막(Pall Corp.)으로 전기이동시켰다. 전기이동된 나이트로섬유소막은 탈지유(skim milk)를 5% 농도로 녹인 TBS-T 완충용액(20mM Trs, 150mM NaCl, 0.5% Tween 20, pH 7.4)에서 1시간 동안 처리하고, 웨스턴블랏 분석을 위하여 돼지파보바이러스에 대한 혈청과 돼지열병바이러스 중요 항원 에피톱 부위에 대한 혈청을 각각 1차 항체로 하여 4시간 동안 막에 처리한 후 TBS-T 완충용액으로 10분씩 3회 세척하였다. 그 후 TBS-T 완충용액에 희석한 토끼 혈청에 대한 2차 항체를 막에 처리한 다음, 10분씩 3회 세척하였다. 최종적으로 처리된 막에 Western HRP 기질(Millipore, USA)을 처리하고 X-ray film에 현상하여 특이 밴드를 관찰하였다.

그 결과, 단백질 전기영동 분석에서 관찰된 약 64 kDa 위치에서 돼지파보바이러스 혈청과 돼지열병바이러스 혈청에 대하여 각각 특이 밴드를 나타내어 64 kDa 크기의 단백질이 이들 두 가지 바이러스에 대해 각각 특이적인 단백질임을 확인하였다(도 2b). 돼지파보바이러스 VP2의 N-말단과 C-말단에 돼지열병바이러스 에피톱을 각각 융합하여 발현시킨 결과를 비교한 결과, N-말단에 융합발현 시킨 경우 더욱 높은 발현을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 누에 유충으로부터 VP2 단백질의 생산

상기 실시예 1에서 제조된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스 입자 1 x 10⁵ 개를 5령 1일째의 누에 유충에 1 ㎖ 주사기를 이용하여 접종하였다. 이때 대조구로 야생형 배큘로바이러스 BmNPV-K1를 사용하였다. 접종 후 5일 동안 사육하며 육안으로 관찰하면서 감염된 유충으로부터 혈림프와 지방체를 수집하였다. 혈림프는 누에 유충의 다리끝 부분을 잘라 얼음에 냉각된 튜브에 수거하였고, 지방체는 누에 유충을 해부가위로 절개한 후 하얀 지방체만을 얼음에 냉각된 튜브에 수거하였다.

상기 방법으로 수집한 혈림프 1 ㎕와 지방체 50 ㎎에 각각 세포용해용액(20 mM Tris-Hcl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5% 글리세롤, 1% NP-40)을 가하고 얼음에 30분 동안 방치하였다. 반응액에 5X 시료 완충액(0.6 ㎖ 1 M Tris-HCl(pH 6.8), 5 ㎖의 50％ 글리세롤, 2 ㎖의 10％ SDS, 0.5 ㎖의 2-머캅토에탄올, 1 ㎖ 1％ 브로모페놀블루, 0.9 ㎖ H₂O)을 가하고 혼합한 후, 100℃에서 10분 동안 중탕가열하고 얼음에서 잠시 놓아둔 다음, 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다.

이후 상등액을 10% 단백질 전기영동 젤을 이용하여 단백질 전기영동과 상기 실시예 2의 웨스턴블랏 분석을 각각 수행하였다. 전기영동 후, 젤을 코마시 염색시약(coomasie brillant blue)으로 염색한 결과 융합단백질의 예상 위치인 약 64 kDa에서 특이적인 단백질은 VP2의 N-말단에 E2 에피톱을 융합발현시킨 경우에만 확인이 가능하였다. 웨스턴블랏 분석에서도 동일한 결과를 보여주었다(도 3).

실시예 4. 황산암모니움(ammonium sulfate)을 이용한 VLP 정제

상기 실시예 2, 3에서 재조합 누에 핵다각체병 바이러스를 감염시킨 Bm5 세포주와 누에 유충에서부터 분리한 혈림프 및 지방체에서 수집한 시료를 이용하여, 각각의 시료에서 돼지파보바이러스 VP2 단백질과 돼지열병바이러스 E2 융합발현에 의하여 형성된 VLP를 정제하였다.

구체적으로 Bm5 세포주와 누에 유충의 혈림프 및 지방체에 따라 다음과 같은 정제방법을 사용하였다.

실시예 4-1. Bm5 세포주로부터의 VLP 정제방법

실시예 1에서 제조된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스를 곤충 세포주 Bm5 세포에 세포당 1개의 바이러스 입자가 되도록 T-25 플라스크에 2.0 x 10⁶ 개로 분주하여 세포에 감염시켰다. 접종 후 3일이 경과된 때에 세포를 도립현미경으로 관찰하여, 감염된 세포내에서 다각체 단백질의 존재여부를 통해 감염여부를 조사하였다. 이때 대조구로 야생형 배큘로바이러스 BmNPV-K1를 사용하였다.

이와 같이 제조된 재조합 바이러스들을 플라스크에서 수집하기 위하여 배양액을 1,000g로 5분 동안 원심분리하였다. PBS 세척버퍼 1 ㎖로 세척한 다음, 800 ㎕의 25 mM 탄산수소나트룸(sodium bicarbonate)를 처리하여 삼투압 충격(osmotic shock)을 주었다. 이후 얼음에서 10분 동안 놓아둔 다음 볼텍싱을 이용하여 1분 동안 혼합하는 과정을 3회 수행한 후, 10000 rpm, 4℃에서 7분 동안 원심분리하였다.

원심분리한 상등액을 새 튜브에 옮긴 다음, 100% 황산암모늄(ammonium sulfate) 200 ㎕를 넣어서 20%로 처리하였고, 4℃ 냉장고에 20분 동안 놓아두었다. 이후 10000 g, 4℃, 30분 동안 원심분리 하여 바이러스 입자 침전물을 획득하였다.

실시예 4-2. 누에 유충의 혈림프로부터의 VLP 정제방법

누에 유충 5령 1일째 1 x 10⁵ 개의 바이러스 입자를 1 ㎖ 주사기를 이용하여 누에 유충에 주사접종하였다. 이때 대조구로 실시예 3과 같이 야생형 배큘로바이러스 BmNPV-K1를 사용하였다. 접종 후 5일 동안 사육하며 육안으로 관찰하면서 감염된 유충으로부터 혈림프를 수집하였다. 상기 혈림프는 누에 유충의 다리끝 부분을 잘라 얼음에 냉각된 튜브에 수집하였다.

이와 같이 수집한 혈림프 100 ㎕를 PBS 세척용액 700 ㎕에 희석하였고, 10000 rpm, 4℃에서 7분 동안 원심분리를 수행하였다. 이후 원심분리한 상등액을 새 튜브에 옮긴 다음, 100% 황산암모늄(ammonium sulfate)을 20%로 처리하였고, 4℃ 냉장고에 20분 동안 놓아두었다. 이후 10000 g, 4℃, 30분 동안 원심분리 하여 바이러스 입자 침전물을 획득하였다.

실시예 4-3. 누에 유충의 지방체에서의 VLP 정제방법

누에 유충 5령 1일째 1 x 10⁵ 개의 바이러스 입자를 1 ㎖ 주사기를 이용하여 누에 유충에 주사접종하였다. 이때 대조구로 실시예 3과 같이 야생형 배큘로바이러스 BmNPV-K1를 사용하였다. 접종 후 5일 동안 사육을 하며 육안으로 관찰하면서 감염된 유충을 절개하여 하얀 지방체를 수집하였다. 이 지방체를 냉각된 새 튜브에 50 ㎍씩 담은 다음, 삼투압 충격(osmotic shock)을 위하여 720 ㎕의 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)을 처리하였다.

이후 얼음에서 10분 동안 놓아둔 다음 볼텍싱을 이용하여 1분 동안 섞어주는 과정을 3회 수행한 후, 10000 rpm, 4℃에서 7분 동안 원심분리를 하였다. 원심분리한 상등액을 새 튜브에 옮긴 다음, 100% 황산암모늄(ammonium sulfate) 200 ㎕를 넣어서 20%로 처리하였고, 4℃ 냉장고에 20분 동안 놓아두었다. 이후 10000 g, 4℃, 30분 동안 원심분리 하여 바이러스 입자 침전물을 획득하였다.

실시예 5. 에너지 투과전자현미경을 통한 VLP의 확인

상기 실시예 4에서 Bm5 세포주와 누에 유충에서 분리한 혈림프 및 지방체로부터 정제한 VLP의 시료를 카본-코팅된 그리드에 흡착시킨 후, 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid)을 이용하여 5분 동안 염색하고 실온에서 40분 동안 건조시킨 다음, 에너지 투과전자현미경(Libra 120, Carl Zeiss, 독일)을 사용하여 사진을 촬영하였다. 촬영한 사진을 분석한 결과, 돼지파보바이러스 유사입자의 크기는 20 nm인 것으로 확인되었으며, 이는 핵산을 포함하는 본래의 바이러스 입자 크기와 유사하였다(도 4).

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Method of manufacturing dual-antigenic combined antigen protein of Porcine Parvovirus and Classical Swine Fever Virus <130> PN160381 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 567 <212> PRT <213> Porcine Parvovirus <400> 1 Met Ser Glu Asn Val Glu Gln His Asn Pro Ile Asn Ala Gly Thr Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gly Gly Val Gly Val Ser Thr Gly 20 25 30 Ser Phe Asn Asn Gln Thr Glu Phe Gln Tyr Leu Gly Glu Gly Leu Val 35 40 45 Arg Ile Thr Ala His Ala Ser Arg Leu Ile His Leu Asn Met Pro Glu 50 55 60 His Glu Thr Tyr Lys Arg Ile His Val Leu Asn Ser Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Ala Gly Gln Met Val Gln Asp Asp Ala His Thr Gln Met Val Thr Pro 85 90 95 Trp Ser Leu Ile Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Ala 100 105 110 Asp Trp Gln Leu Ile Ser Asn Asn Met Thr Glu Ile Asn Leu Val Ser 115 120 125 Phe Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Ile Thr Glu Ser 130 135 140 Ala Thr Ser Pro Pro Thr Lys Ile Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser 145 150 155 160 Leu Met Val Ala Leu Asp Thr Asn Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Pro Ala 165 170 175 Ala Pro Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Thr Lys 180 185 190 Pro Thr Gln Tyr Arg Tyr Tyr Leu Ser Cys Thr Arg Asn Leu Asn Pro 195 200 205 Pro Thr Tyr Thr Gly Gln Ser Gln Gln Ile Thr Asp Thr Ile Gln Thr 210 215 220 Gly Leu His Ser Asp Ile Met Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ala Val Pro 225 230 235 240 Ile His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ser Thr Gly Ile Tyr His 245 250 255 Phe Asp Thr Lys Pro Leu Lys Leu Thr His Ser Trp Gln Thr Asn Arg 260 265 270 Ser Leu Gly Leu Pro Pro Lys Leu Leu Thr Glu Pro Thr Thr Glu Gly 275 280 285 Asp Gln His Pro Gly Thr Leu Pro Ala Ala Asn Thr Arg Lys Gly Tyr 290 295 300 His Gln Thr Met Asn Asn Ser Tyr Thr Glu Ala Thr Ala Ile Arg Pro 305 310 315 320 Ala Gln Val Gly Tyr Asn Thr Pro Tyr Met Asn Phe Glu Tyr Ser Asn 325 330 335 Gly Gly Pro Phe Leu Thr Pro Ile Val Pro Thr Ala Asp Thr Gln Tyr 340 345 350 Asn Asp Asp Glu Pro Asn Gly Ala Ile Arg Phe Thr Met Gly Tyr Gln 355 360 365 His Gly Gln Leu Thr Thr Ser Ser Gln Glu Leu Glu Arg Tyr Thr Phe 370 375 380 Asn Pro Gln Ser Lys Cys Gly Arg Ala Pro Lys Gln Gln Phe Asn Gln 385 390 395 400 Gln Ala Pro Leu Asn Leu Glu Asn Thr Asn Asn Gly Thr Leu Leu Pro 405 410 415 Ser Asp Pro Ile Gly Gly Lys Pro Asn Met His Phe Met Asn Thr Leu 420 425 430 Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Thr Ala Pro Val Phe 435 440 445 Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Leu Asp Thr Asp Leu Lys Pro 450 455 460 Arg Leu His Val Thr Ala Pro Phe Val Cys Lys Asn Asn Pro Pro Gly 465 470 475 480 Gln Leu Phe Val Lys Ile Ala Pro Asn Leu Thr Asp Asp Tyr Asn Ala 485 490 495 Asp Ser Pro Gln Gln Pro Arg Ile Ile Thr Tyr Ser Asn Phe Trp Trp 500 505 510 Lys Gly Thr Leu Thr Phe Thr Ala Lys Met Arg Ser Ser Asn Met Trp 515 520 525 Asn Pro Ile Gln Gln His Thr Thr Thr Ala Glu Asn Ile Gly Lys Tyr 530 535 540 Ile Pro Thr Asn Ile Gly Gly Met Lys Met Phe Pro Glu Tyr Ser Gln 545 550 555 560 Leu Ile Pro Arg Lys Leu Tyr 565 <210> 2 <211> 1704 <212> DNA <213> Porcine Parvovirus <400> 2 atgagtgaaa atgtggaaca acacaaccct attaatgcag gcactgaatt gtctgcaaca 60 ggaaatgaat ctgggggggt tggtgtgtct acaggtagtt tcaataatca aacagaattt 120 caatacttgg gggagggctt ggttagaatc actgcacacg catcaagact catacatcta 180 aatatgccag aacatgaaac atacaaaaga atacatgtac taaattcaga atcaggggtg 240 gcgggacaaa tggtacaaga cgatgcacac acacaaatgg taacaccttg gtcactaata 300 gatgctaacg catggggggt gtggttcaat ccagcagact ggcagttaat atccaacaac 360 atgacagaaa taaacttagt tagttttgaa caagaaatat tcaatgtagt acttaaaaca 420 attacagaat cagcaacctc accaccaacc aaaatatata ataatgatct aactgcaagc 480 ttaatggtag cactagacac caataacaca cttccataca caccagcagc acctagaagt 540 gaaacacttg gtttttatcc atggttacct acaaaaccaa ctcaatacag atattaccta 600 tcatgcacca gaaacctaaa tccaccaaca tacactggac aatcacaaca aataacagac 660 acaatacaaa caggactaca cagtgacatt atgttctaca caatagaaaa tgcagtacca 720 attcatcttc taagaacagg agatgaattc tccacaggaa tatatcactt tgacacaaaa 780 ccactaaaat taactcactc atggcaaaca aacagatctc taggactgcc tccaaaacta 840 ctaactgaac ctaccacaga aggagaccaa cacccaggaa cactaccagc agctaacaca 900 agaaaaggtt atcaccaaac aatgaataat agctacacag aagcaacagc aattaggcca 960 gctcaggtag gatataatac accatacatg aattttgaat actccaatgg tggaccattt 1020 ctaactccta tagtaccaac agcagacaca caatataatg atgatgaacc aaatggtgct 1080 ataagattta caatgggtta ccaacatgga caattaacca catcttcaca agagctagaa 1140 agatacacat tcaatccaca aagtaaatgt ggaagagctc caaagcaaca atttaatcaa 1200 caggcaccac taaacctaga aaatacaaat aatggaacac ttttaccttc agatccaata 1260 ggagggaaac ctaacatgca tttcatgaat acactcaata catatggacc attaacagca 1320 ctaaacaata ctgcacctgt atttccaaat ggtcaaatat gggataaaga acttgataca 1380 gatctaaaac ctagactaca tgttacagct ccatttgttt gtaaaaacaa tccaccagga 1440 caactatttg taaaaatagc accaaaccta acagatgatt acaatgctga ctctcctcaa 1500 caacctagaa taataactta ttcaaacttt tggtggaaag gaacactaac attcacagca 1560 aaaatgagat ccagtaatat gtggaaccct attcaacaac acacaacaac agcagaaaac 1620 attggtaaat atattcctac aaatattggt ggcatgaaaa tgtttccaga atattcacaa 1680 cttataccaa gaaaattata ctag 1704 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Classical Swine Fever Virus <400> 3 Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr 1 5 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Classical Swine Fever Virus <400> 4 tgcaaggaag attacaggta c 21 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequences <400> 5 ccgcggccac catgtgcaag gaagattaca ggtacagtga aaatg 45 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequences <400> 6 tctagactag tataattttc ttggtataag 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequences <400> 7 ccgcggccac catgagtgaa aatgtggaac 30 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequences <400> 8 tctagactag tacctgtaat cttccttgca gtataatttt cttgg 45

Claims

(a) 돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus) VP2(viral protein 2) 단백질 및 (b) 돼지열병바이러스(classical swine fever virus) E2 단백질의 에피톱이 융합된 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스 동시 항원성 복합 항원 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 E2 단백질의 에피톱은 상기 VP2 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 2 항에 있어서, 상기 E2 단백질의 에피톱은 상기 VP2 단백질의 N 말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 복합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스 동시 항원성 백신용 조성물.
(a) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 복합 항원 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 (b) 상기 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트.
제 5 항에 있어서, 상기 프로모터는 곤충 세포에서 작동가능한 프로모터인 것을 특징으로 하는 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트.
제 6 항에 있어서, 상기 프로모터는 폴리헤드린(Polyhedrin) 프로모터, IE-1 프로모터, IE-2 프로모터, p35 프로모터, p10 프로모터 및 gp64 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트.
제 5 항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 전사 종결 서열을 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트.
제 5 항에 따른 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트로 형질 감염(co-transfection)된 숙주세포.
제 9 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 10 항에 있어서, 상기 곤충은 누에인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
다음 단계를 포함하는 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스 동시 항원성 복합 항원 단백질의 제조 방법:
(a) 제 9 항에 따른 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 배양된 숙주세포로부터 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스 동시 항원성 복합 항원 단백질을 분리하여 수득하는 단계.