CN1665528B - 佐剂病毒颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有免疫增强或佐剂性能的免疫原载体。更具体地，免疫原载体是来自马铃薯X病毒组家族、最具体地番木瓜花叶病毒的病毒样颗粒(VLP)。重组技术生产的VLP与其自身蛋白质之一：蛋白质免疫原融合。上述VLP和来自病毒、细菌或寄生病原体的蛋白质或蛋白质提取物可以用作疫苗。

Description

佐剂病毒颗粒
技术领域
本发明涉及携带免疫原和具有免疫增强或佐剂活性的病毒颗粒。本发明具体涉及重组病毒颗粒和在人或动物中借助这些颗粒增强免疫应答的方法。 
背景技术
接种是最有效的抗击传染病的方法。新病毒病的出现(例如丙型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒)，和病原菌(伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhii))对抗生素的抗性是令人担忧的。接种因此成为帮助控制这些疾病的有效备选方案。 
在过去15年中，遗传工程允许精确鉴定负责保护性免疫应答的蛋白质片段。因此，出现新的接种策略。用适当免疫原性肽免疫动物允许生产可以控制疾病的中和抗体。那些免疫原性肽在异种系统中的表达提供亚单位疫苗的基础。 
尽管已经证实化学合成的寡肽能够刺激针对衍生它们的蛋白质的抗体生产，通常已发现肽本身免疫原性不足以用作疫苗。这是已经有相当大兴趣开发表位呈递系统的原因，在该系统中肽序列与能够组装成大分子结构的载体分子融合。 
当向宿主施用抗原时，通过使用免疫增强剂如佐剂，可以增强特异性免疫。免疫应答由免疫系统中的各种细胞介导。存在两种类型的免疫应答：由抗体介导的体液免疫，和主要由细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞免疫。抗原呈递细胞(“APC”)加工和呈递抗原至B和T细胞。作为激活结果B细胞分泌特异性抗体，T细胞变成体液应答的辅助细胞或细胞毒性细胞并直接攻击抗原。佐剂已经显示增加这些免疫应答。 
抗原的初始呈递诱导IgM和IgG抗体，形成初次应答。然而该抗体的生产可能随时间下降。再次应答主要涉及IgG抗体的生产，可以通过第二 次或时间较晚的抗原呈递引发。然而仅通过用抗原起动宿主不能保证再次应答乃至初次应答。 
抗原施用中经常遇到的一个困难是免疫系统响应的程度。某些抗原免疫原性不高，因为在施用后它们激发弱的初次应答或根本无应答。在这些情形中，免疫系统可能不对二次攻击响应，例如，宿主可能遭受计划防止抗原免疫的疾病或病症。 
在这些情形中，通常提供生理应答调节剂(“PRM”)。PRM通常定义为免疫增强化合物。它可以来源于细菌，如百日咳博德特氏菌(Bordellapertussis)或小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。PRM还可以包括化学物质，如多核苷酸，生理活性分子，如胸腺激素，和佐剂。 
佐剂是当与抗原施用时增强免疫系统应答的化合物，产生更高的抗体滴度和延长的宿主应答。通常使用的佐剂包括由油包水型乳状液组成的不完全弗氏佐剂，包含以上及加入的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的弗氏完全佐剂和明矾。然而在人中使用这些材料的困难例如在于它们有毒或者可导致宿主在注射位点发展损伤。 
Kawamura和Berzofsky在J.Immunol.，136：58(1986)中描述另一种方法。在该方法中，将与某些B细胞上存在的免疫球蛋白反应的抗-Ig抗体与铁蛋白和肌红蛋白偶联，并与不完全弗氏佐剂施用于小鼠。混合物的免疫原性改善了，但没有表明未加入佐剂的混合物的免疫原性。此外，尽管佐剂如弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂和Montanide可以极大地增强对抗原的免疫应答，它们具有一些缺点。当与注射形式的抗原使用时，在注射位点经常形成大的损伤，该情形使得它们不能令人满意地用于人，宠物或肉用家畜。此外，当口服或肠内施用时，这些佐剂不能用作免疫增强剂。 
本领域已知不同性质的免疫原或抗原载体可以相对容易地遗传改造。植物病毒是可以在植物中生产的那些系统和容易适合于本申请。豇豆花叶病毒(CPMV)，烟草花叶病毒X(TMVX)，和苜蓿花叶病毒(AIMV)已知已经被修饰来呈递目标表位。另一种植物病毒载体，马铃薯病毒X(PVX)，马铃薯X病毒组成员，已知容忍携带完整的蛋白质外壳。此外，美国专利6,232,099和6,042,832，国际专利申请公开号WO 97/39134，WO02/04007，WO 01/66778，WO 02/00169，和欧洲专利申请1167530， 全部描述携带与内源蛋白质融合的外源蛋白质的病毒样颗粒的不同变体。然而，在这些参考文献中没有任何地方提及该颗粒具有任何免疫增强或佐剂性能。 
鉴于本文所述现有技术，仍有对允许强烈免疫人和动物而同时避免实际实行的佐剂和二次免疫的使用的化合物和载体颗粒的巨大需要。 
发明内容
本发明的一个目的是提供具有免疫增强性能的免疫原-载体复合体，其由携带至少一种与所述VLP的蛋白质或其片段融合的免疫原的病毒样颗粒(VLP)组成，可以用于制备诱导针对蛋白质或其片段的免疫应答的组合物。 
本发明另一目的是提供包含病毒样颗粒(VLP)和来源于病毒、细菌或寄生虫的蛋白质或提取物的组合物，其可以用作疫苗。 
按照本发明还提供在人或动物中免疫增强免疫应答的方法，其包含向所述人或动物施用免疫原-载体，其由携带至少一种与所述VLP的蛋白质或其片段融合的免疫原的病毒样颗粒(VLP)组成，或者与不与所述VLP直接连接的抗原共同施用VLP或其片段。 
本发明还涉及编码由携带至少一种与蛋白质融合的免疫原的病毒样颗粒(VLP)组成的免疫原-载体复合体的多核苷酸，或编码由所述VLP其片段、或单独VLP组成的免疫原-载体复合体的多核苷酸，当在植物细胞、动物细胞或微生物中表达时，所述免疫原-载体复合体具有组装的能力。 
本发明还提供番木瓜花叶病毒(papaya mosaic virus)作为佐剂的应用。 
为了本发明的目的以下定义下列术语。 
当两个或多个通常编码两个单独蛋白质的基因天然或作为人工干预的结果重组而编码那两个蛋白质各自全部或部分的组合的蛋白质时，产生表述“嵌合蛋白质”。 
表述“融合衣壳蛋白”是指其中融合基因之一编码植物病毒的衣壳蛋白的融合蛋白。 
本文所用表述“保护性免疫”意欲是指动物如哺乳动物、鸟类、或鱼抵抗(延缓症状发作或减轻症状严重程度)作为其暴露于病原体抗原的结 果或在与病原体接触之后的疾病或死亡的能力。通过一种或多种下列机制实现保护性免疫：粘膜，体液或细胞免疫。粘膜免疫主要是呼吸道、肠胃道和泌尿生殖道的粘膜表面上分泌的IgA(sIGA)抗体的结果。在一系列由抗原加工细胞(B和T淋巴细胞)介导的导致B淋巴细胞在身体粘膜系组织上sIGA生产的事件之后产生sIGA抗体。通过口服疫苗可以刺激粘膜免疫。保护性免疫的主要结果是破坏病原体或抑制其复制自身的能力。 
本文所用表述“体液免疫”是指血清中IgG抗体和IgM抗体的结果。 
通过细胞毒性T淋巴细胞或通过涉及巨噬细胞和T淋巴细胞的迟发型超敏反应以及不需要抗体的涉及T细胞的其它机制可以实现本文所用表述“细胞免疫”。 
“重组病毒”是其中病毒的遗传物质已经与其它遗传材料组合的病毒。 
本文所用术语“多肽”或“肽”意欲是指其中存在至少四个肽键连接的氨基酸的分子。 
本文所用表述“病毒核酸”可以是病毒的基因组(或其大部分)，或与该基因组碱基序列互补的核酸分子。与病毒RNA互补的DNA分子也认为是病毒核酸。与病毒DNA碱基序列互补的RNA分子也被认为是病毒核酸。 
本文所用术语“病毒样颗粒”(VLP)是指与病毒颗粒具有类似物理外观的自组装颗粒并且包括假病毒。病毒样颗粒可以缺少或具有功能异常的某些野生型病毒基因的拷贝，这可导致病毒样颗粒不具有野生型病毒特征的一些功能，如复制和/或细胞-细胞移动。 
本文所用术语“疫苗”意欲是指融合蛋白，该蛋白作为一部分的任何颗粒，或该蛋白作为一部分的任何制剂如植物材料。 
本文所用术语“免疫增强剂”意欲是指当与抗原混合时增强免疫原性或抗原性和提供优异免疫应答的物质。应当认识到它可以增强巨噬细胞和其它抗原呈递细胞上共刺激因子的表达。 
附图简述 
图1举例说明纯化的PapMV的电子显微照片； 
图2举例说明PapMV CP的苜蓿素(tricine)的SDS-PAGE分析(A)和显示融合暴露在PapMV VLP表面上的免疫金标记(B)； 
图3A-3F举例说明体外组装的PapMV和PapMV VLP的电子显微照片； 
图4举例说明在气囊模型中PapMV诱导的白细胞累积； 
图5举例说明对PapMV的免疫应答。IP注射PapMV或ISS(等渗盐溶液)一次的小鼠(每个浓度6只)； 
图6举例说明对PapMV的免疫应答。IP注射PapMV或ISS(等渗盐溶液)一次的小鼠(每个浓度6只)； 
图7举例说明PapMV作为卵清蛋白佐剂的效力评估； 
图8A和8B举例说明对PapMV和来自HCV表面糖蛋白的E1和E2的HCV肽的免疫应答的特征；和 
图9举例说明显示在腹膜内注射后PapMV CP向淋巴结和脾特异性迁移的蛋白印迹。 
实施本发明的方法 
按照本发明，提供携带与内源性病毒蛋白融合的免疫原的病毒样颗粒，由此形成还能够免疫增强或具有佐剂作用的新型免疫原-载体。 
在本发明的一个实施方案中，提供一类载体，其当与免疫原或半抗原遗传连锁时可以增强宿主对免疫原或半抗原的免疫应答，无论复合体肠胃外、肠内或口服施用。另外它们的应用不导致注射位点的大损伤形成。 
辅佐细胞如巨噬细胞，B淋巴细胞，和树突细胞对于T细胞依赖性免疫应答的诱导是关键性的。辅佐细胞将抗原呈递给MHC-限制T细胞和生产膜相关的和分泌的共刺激因子，增强T淋巴细胞的增殖和分化。因此，感受态辅佐细胞的存在刺激T细胞依赖性免疫应答，它们的缺乏导致应答不足。该抗原呈递细胞(APC)运送的休眠的巨噬细胞和天然、未刺激的B淋巴细胞可能不能刺激天然CD4+T细胞，甚至可能诱导T细胞耐受。相反，树突细胞和激活的巨噬细胞和B细胞表达共刺激因子，以及高水平的APC。本发明免疫原-载体的作用机制是增强巨噬细胞和其它APC上共刺激因子的表达。为此，免疫原或蛋白质抗原与同时作为佐剂的本发明免疫原载体的施用，促进细胞介导免疫和T细胞依赖性抗体的生产。当与本发明免疫原-载体偶联在一起施用时，免疫原对于产生系统免疫最有效。 
在第一个实施方案中，本发明提供复合体，其包含与载体病毒样颗粒(VLP)偶联的免疫原，以使当将复合体施用于所述宿主时载体分子导致宿主对免疫原的免疫应答增强，其中免疫原可以包含抗原或半抗原和载体分子包含完整的病毒颗粒。更具体地，本发明的病毒是植物病毒。 
获得良好B细胞应答的一种方法是将抗原以有组织的形式提供。显示重复排列的表位与B细胞受体有效交联和迅速诱导不依赖T的IgM应答，稍后接着IgG应答。因此，增加表位免疫原性和对免疫系统的识别和呈递的一个好策略是如在植物病毒如PapMV的表面上以有组织的形式表达优势免疫表位。特别是，PapMV具备良好佐剂和载体的几个特征，因为它是系统发育距离远的抗原，它对于哺乳动物免疫系统是外源的，它的分子极其复杂并且是具有高分子量的有组织的结构。 
申请人已经意外地认识到晶体和重复结构不仅被先天免疫系统识别，而且另外对免疫宿主的免疫系统具有佐剂作用。 
在本发明的一个实施方案中，提供一种方法，其中良性高拷贝数杆状病毒、优选植物病毒如番木瓜花叶病毒(PapMV)的应用生产与病毒外壳蛋白亚基连接的免疫原。当组装时，病毒颗粒每个病毒粒包含多于1000个相同融合蛋白(其典型地为外壳蛋白-外源蛋白的融合分子)的长螺旋阵列。通常，免疫原部分将展示在病毒颗粒的外表面。 
按照本发明，植物和动物病毒的衣壳蛋白的结构满足这些要求并且可以设计呈递来源于病原体或其它来源的免疫原性肽，从而生产疫苗-佐剂。番木瓜花叶病毒(PapMV)的外壳蛋白例如，但不限于此，是开发该免疫原-载体-免疫增强剂的优异候选物。该病毒具有晶体杆状并且重复性极高(每个病毒粒1200个拷贝的相同亚基)。最近使用PapMV的免疫实验显示该病毒在小鼠中诱导极强的免疫应答和是开发疫苗的极好载体。可以用几种HCV表面包膜蛋白的免疫原性肽，如例如来源于膜孔蛋白的伤寒沙门氏杆菌肽，和用胰岛素的肽α9-23来设计该免疫原载体病毒。由病毒样颗粒(VLP)携带的融合外壳蛋白的组装定义为具有佐剂或免疫增强性能的免疫原-载体。 
按照本发明，可以免疫增强，或加强对给定抗原的免疫反应。特别是已知在它们在体内系统中激发抗体的能力方面小分子经常仅用作弱免疫 原。当连接到本发明的、自身是抗原性的免疫原-载体病毒上时，它将产生对小分子的提高的抗体应答。在该系统中与免疫原-载体连接的小分子可以成为半抗原或抗原，并且大小可以从小变到相当大。在该组合对卫生保健有意义的一个实施例中，乙型肝炎表面抗原的一小部分，包含其本身不是抗原性的测定的氨基酸序列，可以与VLP(匙孔免疫原载体)共价结合，获得的偶联物在体内系统中激发可以与VLP的天然表面抗原并且还强烈与整个肝炎病毒交叉反应的抗体。该免疫原-载体系统可以是针对半抗原或抗原编码的疾病的有效疫苗的基础。 
在本发明中，提供如下所述的某些新型免疫原-载体，其便利地通过重组DNA技术生产，用于提供单价以及多价免疫原性疫苗，和利用上述免疫原-载体概念。 
免疫原与载体VLP偶联形成免疫原-载体复合体并且然后可以用于宿主中以便激发免疫应答。免疫原对于T细胞，B细胞，NK细胞和巨噬细胞上的表面结构可以是特异性的或识别的，但对于I类或II类APC相关细胞表面结构则不然。 
载体VLP偶联的免疫原可以包含肽，半抗原，糖，蛋白质，核酸，和病毒一部分，细菌，寄生虫和其它完整的微生物。无论选择哪种免疫原，它必须以不干扰宿主免疫系统识别免疫原作为免疫原性实体的方式与载体VLP偶联。 
免疫原-载体复合体可以用作在宿主中产生免疫应答的疫苗。开始可以以适当剂量提供复合体以便引发免疫应答。这可以接着用复合体或单独免疫原加强。该方法的变化可包括形成一种或多种免疫原-载体复合体，其中一种或多种形式的免疫原与一种或多种载体VLP偶联并施用多种该复合体。 
施用免疫原-载体复合体的目的是以免疫的形式为宿主提供针对抗原的保护和避免使用具有不希望有的副作用的佐剂。 
在一个实施方案中，抗原可以小至诸如半抗原的免疫原或者可以相对大，如病毒的一部分。抗原的大小和类型对于本发明的实施不是关键性的。可以使用期望在宿主中针对其产生免疫应答的任何抗原。然而，本发明对于小的弱免疫原性半抗原特别有效。 
一旦一种或多种免疫原-载体复合体形成，可将该一种或多种复合体施用于宿主。给药方案无需不同于其它任何常规接受的接种程序。可以使用足以引发有效免疫应答的量的单一给药。备选地，可以使用开始给药复合体接着用单独抗原或一种或多种复合体加强的其它方案。类似地，如果抗体滴度下降低于可接受水平，用复合体或抗原加强可以在远晚于初始给药的时刻发生。 
本发明另一实施方案是因为VLP具有规则多价的和真正的螺旋结构，其比蛋白质或蛋白质游离亚基的聚集体更具免疫原性，可以容易地从编码的核酸组装。另外颗粒更大的稳定性可以提供免疫原部分对免疫系统长时间持续暴露。 
免疫原连接的病毒部分优选位于VLP的外表面。因此当颗粒来源于PaPMV时，载体部分可以位于氨基或羧基末端，或者插入位于CP外表面上的内环。这可导致与在CP另一位置上具有第二部分的颗粒的组装相比改善的组装，和可以增强颗粒表面上第二部分的免疫识别。 
在本发明的一个实施方案中，使用植物病毒载体的肽疫苗开发允许在安全条件下大量生产疫苗。使用重组PapMV期望每kg新鲜感染叶多达1g的重组病毒。 
在本发明的另一实施方案中，给药200μg重组病毒，或免疫原-载体复合体，其相当于14μg肽，可足以免疫。1公顷的感染番木瓜于是可能可以潜在地足以接种5百万患者。此外，培养植物是廉价的和有效的。农业是最廉价的生产生物量的方法，因为它不需要复杂的装备。 
病毒或假病毒可以在宿主细胞中组装以生产包含核酸和融合蛋白的感染性病毒颗粒。这可以使得用感染性病毒或假病毒颗粒感染相邻细胞并在其中表达融合蛋白。 
最初可以用颗粒形式(即组装的含有核酸和蛋白质的杆)或备选地核酸形式(即RNA如病毒RNA；cDNA或由cDNA制备的最终转录物)的病毒或假病毒感染宿主细胞，条件是用于初始感染的病毒核酸可以复制和导致具有嵌合蛋白质的整个病毒颗粒的生产。 
融合蛋白的第一(病毒)部分可以是来自包括其任何遗传修饰型式(如缺失，插入，氨基酸替代等)的病毒源的任何蛋白质、多肽或其部分。在 某些实施方案中，第一部分来源于病毒外壳蛋白(或其遗传修饰形式)。可以提及适于该目的的番木瓜花叶病毒的外壳蛋白。融合蛋白分子可以与其它融合蛋白分子或野生型外壳蛋白组装成免疫原-载体病毒粒。 
在本发明的一个优选实施方案中，颗粒来源于potyvirus或甚至更优选马铃薯X病毒组如PapMV，在该实施方案中，第二部分优选位于或邻近外壳蛋白的C-末端。在PapMV中，外壳蛋白的C-末端在病毒粒的外面形成一个区域。 
优选地，将编码免疫原部分的多核苷酸插入于或邻近编码病毒部分的多核苷酸的末端，以使在翻译后，融合蛋白在一末端具有病毒部分和在相反末端具有免疫原部分。病毒部分不必包含整个病毒外壳蛋白，但这仍然是个备选选择。 
遗传修饰以表达融合蛋白的病毒或假病毒形成本发明的另一实施方案，如任何宿主细胞感染该病毒或假病毒。 
优选地，用于复制病毒或假病毒的宿主细胞是细菌，其中病毒是植物病毒，尽管植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌可以与在这些细胞中复制的病毒一起使用。该细胞优选是细菌如大肠杆菌，尽管其它形式的细菌和其它细胞可能有用，如上述细胞。细胞可以是病毒的天然宿主细胞，从中衍生病毒样颗粒，但这不是必需。 
按照本发明的一个具体实施方案，将整个病毒样颗粒用于动物接种的肽表位的稳定和长时间持续展呈。 
按照本发明的另一实施方案，PapMV和PapMV病毒样颗粒似乎非常稳定和可以容易地在室温下保存。它们抵抗极高的温度和不利条件，因为植物病毒已经进化抵抗我们在环境中发现的非常困难的条件。当疫苗必须到达生活在贫穷国家、在难以接近的区域的人民时或对于诊断试验长时间贮存，这是非常重要的优势。 
备选地，此处所述的VLP可以单独用作免疫增强剂或佐剂来增强人或动物中针对靶抗原的免疫应答。优选佐剂或免疫增强VLP与针对其必须产生免疫应答的抗原共同施用。然而，佐剂VLP可以根据需要先于或接着向患者、人或动物给药抗原而施用。 
通过参考下列实施例将更容易理解本发明，提供这些实施例来举例说 明本发明而不是限制其范围。 
实施例I 
免疫原-载体VLP的制备 
通过将肽多聚化将提高选自本文所述淘选法的亲和肽的亲和力。多聚化将在番木瓜花叶病毒(PapMV)的表面上完成，该病毒是马铃薯X病毒组的成员。PapMV具有由CP亚基组装组成的杆状结构。一个病毒颗粒包含1200个亚基。我们将制备所选肽与PapMV CP的融合体。在体外组装从大肠杆菌表达系统中表达和纯化的PapMV CP后将制备融合体来将肽暴露在PapMV颗粒的表面。病毒CP的组装然后确保肽的多聚化并显著地提高亲和力。 
克隆外壳蛋白(CP)并使用番木瓜花叶病毒(PapMV)(图1)的外壳蛋白(CP)开发体外组装系统。在大肠杆菌中大量生产PapMV的CP(图2a)和在体外生产极类似于野生型病毒(wt virus)的PapMV病毒样颗粒(图2b)。首次显示重组PapMV CP可以在体外组装成病毒样颗粒。通过体外组装允许几种肽融合至CP的C-末端和因为融合产生比野生型病毒更宽的病毒样颗粒(图3)。 
实施例II 
免疫原-载体VLP的免疫增强作用 
经常使用佐剂以便增加候选疫苗的免疫应答。炎性应答的增强有利于更多吞噬细胞向注射位点的迁移，其又导致改善的抗原呈递细胞(APC)的抗原呈递。明矾，乳状液，微粒和细胞因子如GM-CSF已经全部用于增加候选疫苗的免疫应答。证实PapMV其自身诱导炎症事件，由此消除了对另外佐剂的需要。将气囊模型用于检验PapMV是否在体内诱导促炎事件。在该模型中，在第0天和第3天将无菌空气注射到小鼠的背部之下。在第7天，可以将促炎剂注射到气囊中并测量炎性应答。该模型紧密地表示皮下注射位点。 
将PapMV注射到鼠气囊中，与注射载体的小鼠(PBS)的0.8×106 个白细胞相比导致约8.5×106个白细胞的累积(图4)。在注射PapMV后 6小时在气囊中累积的嗜中性粒细胞(85％)和单核细胞(15％)。尽管低至1μg的PapMV的量足以诱导白细胞的累积，当注射100μgPapMV时出现最大累积。该累积类似于通过注射1μg强促炎因子LPS所诱导的累积。这些结果清楚地显示PapMV可以有效诱导炎症事件。该观察清楚地显示PapMV被免疫系统察觉，其诱导信号和涉及我们生物体防御的细胞的募集。可能PapMV通过自然免疫诱导信号。 
此外，在本发明实施方案中显示PapMV在小鼠中诱导强烈和长时间持续的体液应答(图5)。用三种浓度的PapMV：1，10和100αg注射10只小鼠。与免疫途径无关，在用PapMV免疫的BALB/c小鼠中有效诱导初次抗体应答(图5)。在免疫后第5天检测到高滴度。观察到初次IgM应答的典型曲线。第20天左右，即使用更多病毒加强免疫小鼠以后，缺乏IgM应答。免疫小鼠中的IgG应答遵循经典动力学。在免疫后第12天检测到高滴度的抗-PapMV，并且在用该病毒加强后按比例增加。IgG同种型分析显示在Ab应答的初次和二次阶段期间优选生产IgG2b和IgG1。在ab应答的记忆阶段期间IgG3增加滴度。这些数据显示PapMV能够在小鼠中诱导有效的Ab应答。有效诱导初次和再次应答以及持久的Ab记忆。优选生产IgG1提示优选释放IL-4。IL-4有利于向该类IgG的类别转换。因此在这些小鼠中可以设想对TH2应答的平衡。缺乏IgG2a显示缺乏IFN-α的释放，因为该细胞因子已经直接参与向该IgG同种型的类别转换。总之，这些数据显示PapMV诱导有效和持久抗体应答的能力。该结果提示PapMV颗粒是开发体液疫苗的优异载体。目的免疫原与VLP的融合体然后也将被免疫系统识别并引发对目的表位的强烈免疫应答。 
此外，发现在腹膜内或皮下注射到Balb/C小鼠以后PapMV VLP特异性地迁移至淋巴结和脾脏(图6)。该结果显示PapMV VLP是优异的载体，因为它们有效地迁移至免疫应答出现的位点。 
实验数据显示PapMV-抗原在小鼠中诱导有效抗体应答(图5)。实际上，有效诱导初次和再次应答以及持久的抗体记忆(图6)。几种免疫途径有效产生大量抗体。仅口服免疫不产生免疫应答。可能用于中和胃酸的NaHCO3损害病毒颗粒和影响颗粒的免疫原性。即使在一次注射100μgPapMV 350天以后也存在IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3(图6)。因为IgG2a 和IgG3存在和持久，我们可以推断PapMV诱导TH1应答。这提示PapMV颗粒是开发针对外源抗原的免疫体液应答的优异载体。目标表位与PapMV-颗粒的融合应当帮助引发针对目标表位的体液免疫应答。 
使用小鼠背部气囊模型的实验数据显示PapMV增强炎性应答和有利于吞噬细胞向接种位点的迁移(图6)。该结果证实PapMV其本身诱导炎症事件，因此消除了对另外的旨在改善抗原呈递细胞抗原呈递的佐剂策略的需要。用含有由重组蛋白质体外产生的特定肽融合体的病毒样颗粒(VLP)获得类似结果(图6)。募集非常快，因为我们观察到在处理后6-9小时之间细胞最多(数据未显示)。此外，PapMV-颗粒有效诱导对卵清蛋白的免疫应答，该蛋白质已知是非免疫原性(图7)。这通过腹膜内途径用2mg卵清蛋白，一种已知极弱的免疫原，或与50或100αg PapMV联合注射小鼠(Balb/C)证实。我们每次处理注射6只小鼠并在注射后0，4，8，12和20天收集样品。对每次治疗仅进行一次注射。即使卵清蛋白是弱免疫原，在PapMV的存在下，我们检测到强2倍的免疫应答。 
这些观察显示PapMV-颗粒迅速地被哺乳动物的免疫系统察觉为外源，其又诱导信号和参与生物体防御的细胞的募集。 
实施例III 
作为接种目标的丙型肝炎病毒 
丙型肝炎病毒(HCV)是导致急性和慢性肝病的正链RNA病毒。感染急性阶段通常与温和症状相关，但它可以导致肝硬化和肝细胞癌。全世界多于170百万的人受感染，是HIV的4倍。在接下来数年中，由HCV相关疾病导致死亡的数量可能甚至超过由AIDS导致的死亡率。目前，当前对HCV的治疗是不能令人满意的。仅可提供的治疗是干扰素(IFN)，但大多数HCV有抗性，因为干扰素诱导的蛋白激酶(PKR)被HCV E2蛋白抑制。 
已知20％的HCV感染患者自然清除病毒。该发现提示如果它有效反应，免疫系统可以消除病毒。还提示如果我们用针对HCV的治疗性疫苗加强它们的免疫系统，我们可以帮助慢性感染的患者，该疫苗可以通过产生针对病毒的中和抗体帮助清除病毒感染。 
发现所选2个表位在HCV病毒粒的表面上。E1表位(氨基酸285-303)和E2表位(氨基酸512-536)，在已经清除病毒感染的患者中显示强免疫原性(David等，2001)。设计PapMV以在其C-末端包含HCV的E1和E2肽的融合，所述E1和E2可以在体外组装成PapMV病毒样颗粒(图3)。 
选择3个表位，发现其位于病毒包膜糖蛋白保守区域中HVR-1外部E1和E2的HCV病毒粒表面上。E1表位(氨基酸285-303)和2个E2表位(氨基酸512-536和528-546)显示在已经清除病毒感染的患者中是强免疫原性的。此外，一个E2表位(512-536)显示引发中和抗体的生产，该中和抗体发现在清除感染的患者的血清中。这三个区域是开发HCV疫苗的良好候选物，因为它们在HCV亚型和毒株中是保守的和位于包膜糖蛋白高变区之外。PapMV-E1和PapMV-E2的构建体在大肠杆菌中表达。纯化重组蛋白质和体外组装。重组CP与HCV E2融合体的组装产生类似于重组wt CP对照的rVLP，除了它们因为融合似乎稍微较大以外。 
用体外生产的重组VLP免疫小鼠。使用多粘菌素柱去除LPS并且腹膜内和皮下注射到小鼠中。我们使用1，10和100αg VLP，每次治疗注射三只小鼠。通过ELISA分析对肽和对PapMV的免疫应答。观察到IgG针对肽以及VLP的表面(图8)。该结果显示重组PapMV可以用于在表位表面引发优异的免疫应答并且用作疫苗而无需佐剂帮助。 
实施例IV 
针对伤寒的免疫 
伤寒是网状内皮系统、肠淋巴组织和胆囊的急性感染，其是由细菌伤寒沙门氏杆菌导致。它仍然是全世界的重大疾病，影响多于1600万人，其中600,000感染死亡。感染大多数影响儿童和年轻人，并且可以通过接种预防。当前可获得不同类型的疫苗：1)热失活的、酚保存的全细胞亲代疫苗(Wyet-Ayers)，肌内或皮下施用。2)丙酮失活的和干燥的全细胞亲代疫苗。3)纯化的(非变性的)Vi多糖亲代疫苗(Aventis)，其通过注射到三角肌中施用。4)减毒gal E，Vi-阴性毒株Ty21a，用作活口服疫苗。 
失活的亲代疫苗(1-3类)可导致不希望有的免疫应答，因为脂多糖(LPS)的复杂性和存在抗原的数量，其引发不希望有的副作用。此外， Vi多糖是不依赖胸腺的抗原(Robins和Robins，1984)，其显示在田间试验(field trial)中具有良好功效，但也已知不足以诱导免疫记忆。需要对抗原的几个暴露来保持保护，使得该方法仅适合于旅行者访问的流行地。当前可提供的疫苗不适合于永久生活在污染区域的人们。基于减毒细菌的疫苗(类型4)可以导致恶心，呕吐和腹痛。还不推荐将该疫苗施用于患有免疫抑制、肠疾病、疟疾、服用抗生素的患者和孕妇和小于6岁的儿童。该疫苗必须保存在4℃，因为它对热敏感并且不能冷冻。当你想到达生活在热带气候最受伤寒影响区域的穷国家的人群时，ty21A对不利条件的敏感性是有问题的。 
伤寒沙门氏杆菌称为膜孔蛋白的膜蛋白显示是良好的免疫原，因为它在小鼠和人中引发抗体和细胞免疫应答并且能够保护小鼠抗伤寒沙门氏杆菌。膜孔蛋白是革兰氏阴性菌的膜上最丰富的蛋白质，其用作低分子量分子的被动扩散通道。这些蛋白质显示高程度的结构和功能同源性，因此推测具有共同祖先。对应于伤寒沙门氏杆菌膜孔蛋白的环6和7的两个小表位暴露于细菌表面，显示涉及通过用膜孔蛋白免疫引发的保护性机制。那些区域对于伤寒沙门氏杆菌是特异性的和是开发重组亚单位疫苗的极好表位。我们已经在PapMV CP的C-末端克隆了伤寒沙门氏杆菌膜孔蛋白的环6。纯化重组蛋白质并且如上所述用RNA体外生产PapMV病毒样颗粒(图3F)。 
应当理解本发明不限于上述优选实施方案，并且可能有修改，条件是它们在后附权利要求的范围内。 

Claims (31)

1.一种诱导免疫应答的组合物，其包含
(a)来源于番木瓜花叶病毒衣壳蛋白的组装的番木瓜花叶病毒病毒样颗粒和来源于病毒、细菌或寄生虫的蛋白质或提取物；或
(b)至少一种免疫原-载体复合体，其由来源于番木瓜花叶病毒衣壳蛋白组装的番木瓜花叶病毒病毒样颗粒和至少一种在羧基末端与所述衣壳蛋白融合或偶联的免疫原组成，从而使所述至少一种免疫原位于所述病毒样颗粒的外表面，其中将所述病毒样颗粒定义为自组装的颗粒，其具有与病毒颗粒相似的物理表观，并包括假病毒。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含番木瓜花叶病毒病毒样颗粒，所述免疫原在所述衣壳蛋白的羧基末端融合或偶联。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述免疫应答是全身性的免疫应答。
4.权利要求1或2的组合物，其中所述免疫应答是体液或细胞免疫应答。
5.权利要求1或2的组合物，其中所述动物是哺乳动物，鸟或鱼。
6.权利要求1或2的组合物，其中所述动物是人。
7.权利要求1或2的组合物，其中所述动物是非人动物。
8.权利要求1或2的组合物，其中所述免疫原由一种或多种抗原性结构域组成，每个抗原性结构域能引发特异性的免疫应答。
9.权利要求1或2的组合物，其中所述至少一种免疫原具有多于一种特异性。
10.权利要求1或2的组合物，其中所述免疫原是肽、半抗原、碳水化合物、核酸或过敏原。
11.权利要求1或2的组合物，其中所述组合物是疫苗。
12.一种多核苷酸，其编码融合蛋白，所述融合蛋白由融合了至少一种免疫原的番木瓜花叶病毒衣壳蛋白组成，所述免疫原融合在所述衣壳蛋白的羧基末端，所述融合蛋白能自组装以形成病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒定义为自组装颗粒，其具有类似于病毒颗粒的物理表观，并包括假病毒。
13.番木瓜花叶病毒或来源于番木瓜花叶病毒衣壳蛋白的组装的番木瓜花叶病毒病毒样颗粒在制备佐剂中的应用，其中所述病毒样颗粒定义为自组装颗粒，其具有类似于病毒颗粒的物理表观，并包括假病毒。
14.权利要求13的应用，其中所述佐剂用于在需要其的动物中加强免疫应答。
15.来源于番木瓜花叶病毒衣壳蛋白的组装的番木瓜花叶病毒病毒样颗粒和至少一种免疫原在制备疫苗中的应用，其中所述至少一种免疫原不与所述番木瓜花叶病毒病毒样颗粒连接，或其在羧基末端与所述衣壳蛋白融合或偶联，从而使所述至少一种免疫原位于所述病毒样颗粒的外表面，其中将所述病毒样颗粒定义为自组装的颗粒，其具有与病毒颗粒相似的物理表观，并包括假病毒
16.权利要求15的应用，其中所述疫苗用于在需要其的动物中诱导免疫应答。
17.权利要求15或16的应用，其中所述至少一种免疫原在所述衣壳蛋白的羧基末端融合或偶联。
18.权利要求15或16的应用，其中所述免疫原由一种或多种抗原性结构域组成，每个抗原性结构域能引发特异的免疫应答。
19.权利要求15或16的应用，其中所述至少一种免疫原具有多于一种特异性。
20.权利要求15或16的应用，其中所述免疫原是肽、半抗原、碳水化合物、蛋白质、核酸、过敏原、或病毒的一部分、细菌、寄生虫或其它完整的微生物。
21.权利要求15或16的应用，其中所述疫苗用于通过胃肠外、肠或口服给予动物。
22.权利要求15或16的应用，其中所述免疫原和所述番木瓜花叶病毒或番木瓜花叶病毒病毒样颗粒被共同给予动物。
23.权利要求15或16的应用，其中所述番木瓜花叶病毒病毒样颗粒是在给药所述免疫原之前或之后而被给予动物。
24.权利要求14或16的应用，其中所述免疫应答是全身性的免疫应答。
25.权利要求14或16的应用，其中所述免疫应答是体液或细胞免疫应答。
26.权利要求14或16的应用，其中所述动物是哺乳动物，鸟或鱼。
27.权利要求14或16的应用，其中所述动物是人。
28.权利要求14或16的应用，其中所述动物是非人动物。
29.一种重组融合蛋白，其由权利要求12的多核苷酸编码。
30.权利要求29的重组融合蛋白，其中所述融合蛋白是在大肠杆菌(E.coli)中产生的重组蛋白。
31.权利要求29或30的重组融合蛋白，其中所述至少一种免疫原包含丙型肝炎病毒表面包膜蛋白E1或E2的免疫原性肽或来源于膜孔蛋白的伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhi)肽。
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马光恕等.瓜类作物病毒病的研究进展.黑龙江农业科学 1.2001,1第45页左栏.
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