PT1523329E - Partícula viral adjuvante - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PARTÍCULA VIRAL ADJUVANTE"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção diz respeito a uma partícula virai contendo imunogénios e tendo atividade imunopotenciadora ou adjuvante. A invenção diz respeito em particular a partículas virais recombinantes, em particular para utilização na melhoria da resposta imunitária num humano ou num animal através destas partículas.

TÉCNICA ANTERIOR A vacinação é o método mais eficaz de combate a doenças infeciosas. 0 surgimento de novas doenças virais (por exemplo, vírus da hepatite C, vírus de imunodeficiência humana) e a resistência de bactérias patogénicas (Salmonella typhii) a antibióticos é alarmante. A vacinação torna-se assim uma alternativa eficiente para ajudar a controlar estas doenças.

Ao longo dos últimos 15 anos, a engenharia genética permitiu a identificação precisa de fragmentos de proteína que são responsáveis pela resposta de proteção imunitária. Como tal, surgiram novas estratégias de vacinação. A imunização de animais com péptidos imunogénicos apropriados permitiu a produção de anticorpos neutralizantes que conseguem controlar doenças. A expressão desses péptidos imunogénicos em sistemas heterólogos forneceu a base das vacinas de subunidades. 2

Apesar de ter sido demonstrado que os oligopéptidos sintetizados de forma quimica são capazes de estimular a produção de anticorpos contra a proteina de onde são provenientes, tem-se verificado geralmente que os próprios péptidos são insuficientemente imunogénicos para servir como vacinas. É por esta razão que tem havido um interesse considerável no desenvolvimento de sistemas de apresentação de epitopos, nos quais a sequência péptida é fundida numa molécula portadora capaz de ser montada numa estrutura macromolecular. A imunidade especifica pode ser melhorada pela utilização de imunopotenciadores, como adjuvantes, ao administrar um antigénio a um hospedeiro. A resposta imunitária é mediada por várias células no sistema imunitário. Há dois tipos de resposta imunitária: a imunidade humoral mediada por anticorpos e a imunidade celular mediada primariamente por linfócitos T citotóxicos. As células que apresentam antigénio ("CAA") processam e apresentam antigénio tanto a células B como T. As células B segregam anticorpos específicos em resultado da ativação e células T ou se tornam células helper para a resposta humoral ou células citotóxicas e atacam diretamente o antigénio. Tem-se provado que os adjuvantes aumentam estas respostas imunitárias. A apresentação inicial de um antigénio induz tantos anticorpos lgM como lgG, formando a resposta primária. Esta produção de anticorpos pode contudo diminuir ao longo do tempo. Uma resposta secundária, que envolve principalmente a produção de anticorpos lgG, pode ser despoletada pela apresentação de antigénio secundária ou posterior no tempo. Uma resposta secundária ou mesmo primária, contudo, não é garantida meramente pela imprimação do hospedeiro com um antigénio. 3

Uma dificuldade muitas vezes encontrada na administração de um antigénio é até que ponto o sistema imunitário responderá. Certos antigénios não são muito imunogénicos na medida em que mediante a administração provocam uma resposta primária fraca ou nenhuma resposta de todo. Em tais casos, o sistema imunitário poderá não responder a um segundo desafio, e, por exemplo, o hospedeiro pode sofrer da doença ou condição que a imunização com o antigénio foi concebida para evitar.

Em tais situações, é comum dar um modulador de resposta biológica ("MRB") . Um MRB é geralmente definido como um composto imunopotenciador. Pode ser derivado de bactérias como a Bordella pertussis ou Corynebacterium parvum. 0 MRB também pode incluir quimicos, como polinucleótidos, moléculas fisiologicamente ativas, tais como hormonas timicas e adjuvantes.

Os adjuvantes são compostos que melhoram a resposta dos sistemas imunitários quando administrados com antigénio produzindo maiores títulos de anticorpos e resposta de hospedeiro prolongada. Os adjuvantes comummente utilizados incluem Adjuvante Incompleto de Freund, que consiste de uma emulsão de água em óleo, Adjuvante Completo de Freund, que compreende o acima referido com a adição de Mycobacterium tuberculosis e alúmen. A dificuldade, contudo, da utilização destes materiais em humanos, por exemplo, é que são tóxicos ou podem fazer com que o hospedeiro desenvolva lesões no local da injeção.

Outra abordagem foi descrita por Kawamura e Berzofsky em J. Immunol., 136:58 (1986). Nesta abordagem, anticorpos anti-lg que são reativos com imunoglobinas presentes em certas células B, foram conjugados com ferritina e mioglobina, e 4 foram administrados a ratos com Adjuvante Incompleto de Freund. A imunogenicidade da mistura foi melhorada, mas não houve indicação da imunogenicidade da mistura sem a adição do adjuvante. Igualmente, apesar de adjuvantes como o Adjuvante Completo de Freund, Adjuvante Incompleto de Freund e Montanida podem melhorar grandemente a resposta imunitária a um antigénio, estes sofrem também de algumas desvantagens. Quando usados com um antigénio numa forma injetável, muitas vezes formam-se grandes lesões no local da injeção, uma situação que os torna insatisfatórios para tal utilização em humanos, animais de estimação ou animais para produção de carne. Além disso, estes adjuvantes não atuam como agentes imunopotenciadores quando administrados oralmente ou enteralmente.

Na técnica sabe-se que os portadores de imunogénios ou antigénios de natureza diferente podem ser produzidos geneticamente de forma relativamente simples. Virus de plantas são aqueles sistemas que podem ser produzidos em plantas e que são facilmente adaptados a esta aplicação. Virus de mosaico de feijão-frade (VMFV), virus de mosaico de tabaco (VMT) e virus de mosaico de luzerna (VML) são conhecidos por terem sido modificados para a apresentação de epitopos de interesse. Outro vetor virai de planta, o virus X da batata (VXB), um membro do grupo potexvirus, é conhecido por tolerar o transporte de um revestimento de proteina completo. Igualmente, as patentes americanas 6,232,099 e 6,042,832, pedidos de patente internacional publicados sob o número WO 97/39134, WO 02/04007, WO 01/66778, WO 02/00169, pedido EP 1167530 e Porta, C. et al. (Reviews in Medicai Virology, 1998, 8:25-41), todos descrevendo diferentes variações de particulas semelhantes a virus transportando proteínas estranhas em fusão com proteínas endógenas. Para além disso, a utilização do vírus do mosaico da papaia (PapMV) como um sistema de 5 apresentação de epitopo foi descrita (Ikegami, R., M. Sc. Thesis, National Library of Canada, Otava, Ontário).

Tendo em consideração o estado da técnica aqui descrito, continua a subsistir uma grande necessidade de compostos e partículas portadoras que permitam uma imunização forte de humanos e animais ao mesmo tempo que evitam a utilização de adjuvantes e vacinações secundárias como atualmente praticado.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações em anexo. Nas formas de realização aqui descritas, entende-se que a referência a um vírus ou partícula semelhante a um vírus (PSV) é uma referência a PapMV ou PapMV PSV.

Um objetivo da presente invenção é providenciar um complexo portador de imunogénio tendo uma propriedade imunopotenciadora, consistindo de uma partícula semelhante a vírus (PSV) contendo pelo menos um imunogénio em fusão com uma proteína ou seu fragmento do referido PSV, que possa ser usada na preparação de uma composição para induzir uma resposta imunitária contra a proteína ou seu fragmento.

Outro objetivo da presente invenção é providenciar uma composição compreendendo uma partícula semelhante a um vírus (PSV) e uma proteína ou um extrato derivado de um vírus, bactéria ou parasita, para utilização como vacina. É aqui revelado um método para imunopotenciar uma resposta imunitária num humano ou num animal que compreende a administração ao referido humano ou animal de um portador 6 de imunogénio consistindo de uma partícula semelhante a um vírus (PSV) transportando pelo menos um imunogénio em fusão com uma proteína ou seu fragmento do referido PSV, ou administrar um PSV ou um seu fragmento concomitantemente com um antigénio não diretamente ligado ao referido PSV. A presente invenção também se relaciona com a codificação polinucleótida de um complexo portador de imunogénio consistindo de uma partícula semelhante a um vírus (PSV) transportando pelo menos um imunogénio fundido no terminal C da proteína de revestimento da referida PSV, o referido complexo de portador de imunogénio tendo a capacidade de ser montado quando expresso numa célula de uma planta, numa célula animal ou num microrganismo.

Para além disso, é aqui revelada a utilização de um vírus de mosaico da papaia como um adjuvante.

Para o propósito da presente invenção, são definidos de seguida os seguintes termos. A expressão "proteína quimérica" é criada quando dois ou mais genes que normalmente codificam duas proteínas separadas recombinam quer naturalmente quer em resultado de intervenção humana, para codificar uma proteína que é uma combinação de toda ou parte de cada uma das duas proteínas. A expressão "proteína de cápside de fusão" significa uma proteína de fusão em que um dos genes na fusão codifica uma proteína de cápside de vírus de planta. A expressão "imunidade protetora" como aqui usada destina-se a significar a capacidade de um animal, como um mamífero, pássaro, ou peixe resistir (início retardado dos sintomas ou gravidade reduzida dos sintomas), em virtude da 7 sua exposição ao antigénio de um patogénio, doença ou morte que de outra forma advém do contacto com o patogénio. A imunidade protetora é alcançada por um ou mais dos seguintes mecanismos: imunidade mucosa, humoral ou celular. A imunidade mucosa é primariamente resultado de anticorpos IgA secretor (IGAs) em superficies mucosas dos tratos respiratórios, gastrointestinais e geniturinários. Os anticorpos IGAs são gerados após uma série de eventos mediados por células processadoras de antigénio, linfócitos B e T, que resultam em produção de IGAs por linfócitos B em tecidos do corpo forrados de mucosa. A imunidade mucosa pode ser estimulada por uma vacina oral. 0 resultado primário da imunidade protetora é a destruição do patogénio ou inibição da sua capacidade de se replicar. A expressão "imunidade protetora" como aqui usada significa o resultado de anticorpos lgG e anticorpos lgM em soro. A expressão "imunidade celular" como aqui usada pode ser alcançada através de linfócitos T citotóxicos ou através de hipersensibilidade de tipo retardado que envolve macrófagos e linfócitos T, bem como outros mecanismos envolvendo células T sem a necessidade de anticorpos.

Um "virus recombinante" é aquele em que o material genético de um virus é combinado com outro material genético.

Os termos "polipéptido" ou "péptido" como aqui usados referem-se a uma molécula em que há pelo menos quatro aminoácidos ligados por ligações péptidas. A expressão "ácido nucleico virai" como aqui usada pode ser o genoma (ou uma sua maioria) de um virus ou uma molécula de ácido nucleico complementar na sequência base a esse genoma. Uma molécula ADN que é complementar a ARN virai também é considerada ácido nucleico virai. Uma molécula ARN que é complementar na sequência base a ADN virai também é considerada ser ácido nucleico virai. 0 termo "particula semelhante a virus" (PSV) como aqui usado refere-se a partículas automontáveis que têm um aspeto físico semelhante a partículas de vírus e incluem pseudovírus. As partículas semelhantes a vírus podem ter ou não ter cópias disfuncionais de certos genes do vírus do tipo selvagem e isto pode resultar na partícula semelhante a vírus ser incapaz de alguma função que é característica do vírus de tipo selvagem, como a replicação e/ou movimento célula/célula. 0 termo "vacina" como aqui usado pretende significar a proteína de fusão, qualquer partícula da qual esta proteína seja parte, ou qualquer preparação como material de planta de que essa proteína seja parte. 0 termo "imunopotenciador" como aqui usado pretende significar uma substância que quando misturada com um antigénio aumenta a imunogenicidade ou antigenicidade e providencia uma maior resposta imunitária. Será reconhecido que melhora a expressão de co-estimuladores em macrófagos e outras células que apresentam antigénios.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra um micrófago eletrão de PapMV purificado; A Figura 2 ilustra a análise SDS-PAGE tricina de PapMV PR (A) e rotulagem immunogold mostrando que a fusão é exposta na superfície de PapMV PSV (B); 9

As Figuras 3A a 3F ilustram micrófagos eletrão de PapMV e PapMV PSV montados in vitro; A Figura 4 ilustra a acumulação de leucócitos induzida por PapMV no modelo de bolsa de ar; A Figura 5 ilustra a resposta imunitária a PapMV. Ratos (6 por cada concentração) que foram injetados IP uma vez com PapMV ou com ISS (solução salina isotónica); A Figura 6 ilustra uma resposta imunitária a PapMV. Ratos (6 por cada concentração) que foram injetados IP uma vez com PapMV ou com ISS (solução salina isotónica); A Figura 7 ilustra uma avaliação da potência PapMV como adjuvante à ovalbumina;

As Figuras 8A e 8B ilustram a caracterização da resposta imunitária a PapMV e a péptidos HCV derivados da superfície HCV de glicoproteínas EI e E2; e A Figura 9 ilustra western blotting mostrando a migração específica de PapMV PR para o nodo linfático e baço com uma injeção intraperitoneal.

MÉTODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO É aqui revelada uma partícula semelhante a um vírus transportando imunogénio em fusão com proteínas virais endógenas, formando assim um novo tipo de portador de imunogénio sendo também capaz de imunopotenciação ou tendo um efeito adjuvante. É aqui revelada uma classe de portadores que quando ligados geneticamente a um imunogénio ou hapteno podem melhorar a 10 resposta imunitária do hospedeiro a imunogénio ou hapteno independentemente de se o complexo é administrado parenteralmente, enteralmente ou oralmente. Além disso, a sua utilização não resulta na formação de grandes lesões nos locais de injeção. Células acessórias como macrófagos, linfócitos B e células dendriticas são essenciais para a indução de respostas imunitárias dependentes de célula T. As células acessórias apresentam antigénios a células T restringidas a MHC e produzem co-estimuladores segregados e associados a membrana que melhoram a proliferação e diferenciação de linfócitos T. Como tal, a presença de células acessórias competentes estimula respostas imunitárias dependentes de célula T e a sua ausência conduz a respostas deficientes. Macrógafos em repouso e linfócitos B sem tratamento prévio e não estimulados sentidos por tais células apresentando antigénio (CAA) podem não estimular células T CD4+ sem tratamento prévio e podem mesmo induzir a tolerância de célula T. Em contraste, as células dendriticas e macrófagos ativados e células B expressam co-estimuladores, bem como elevados niveis de CAA. Um mecanismo de ação do portador de imunogénio aqui revelado é o melhoramento da expressão de co-estimuladores em macrófagos e outros CAA. Por causa disto, a administração de imunogénios ou antigénios de proteina com os portadores de imunogénio aqui revelados, agindo simultaneamente como um adjuvante, promove a imunidade mediada por células e a produção de anticorpos dependente de célula T. Os imunogénios são mais eficazes a gerar imunidade sistémica quando administrados acoplados juntamente a um portador de imunogénio aqui revelado.

Em uma primeira forma de realização, a invenção providencia um complexo compreendendo um imunogénio acoplado a uma partícula portadora semelhante a um vírus (PSV) no terminal 11 C da proteína de revestimento, de forma a que a molécula portadora provoque a resposta imunitária de um hospedeiro para o imunogénio a ser melhorado quando o complexo é administrado ao referido hospedeiro, em que o imunogénio pode compreender quer um antigénio, quer um hapteno, e a molécula compreende uma partícula integral de PapMV.

Uma forma de obter uma boa resposta de células B é apresentar o antigénio de uma forma organizada. É mostrado que epitopos arranjados de forma repetitiva cruzam eficientemente com o recetor de célula B e induzem uma pronta resposta lgM independente de T, seguida depois de uma resposta lgG. Como tal, uma boa estratégia para aumentar os epitopos de imunogenicidade e o reconhecimento e apresentação ao sistema imunitário é a expressão de epitopos imunodominantes de uma forma organizada como na superfície de um vírus de planta como PapMV. Em particular, PapMV preenche várias características de um bom adjuvante e portador porque é um antigénio filogeneticamente distante, é exógeno ao sistema imunitário dos mamíferos, é molecularmente muito complexo e é uma estrutura organizada que tem um elevado peso molecular.

Tem sido surpreendentemente reconhecido pelo requerente que uma estrutura cristalina e repetitiva não só é reconhecida pelo sistema imunitário inato, como também tem um efeito adjuvante no sistema imunitário de um hospedeiro imunizado.

Em uma forma de realização da presente invenção, é providenciado um método no qual a utilização de um número de cópia elevado de vírus do mosaico da papaia (PapMV) benigno cilíndrico produz imunogénio associado a subunidades de proteína de revestimento virai. Quando montadas, as partículas de vírus compreendem longos conjuntos helicoidais de mais de 1000 proteínas de fusão 12 idênticas (que são normalmente moléculas de fusão de proteína de revestimento-proteína estranha) por virião. Geralmente, a porção imunogénica será exibida na superfície exterior das partículas de vírus no terminal C da proteína de revestimento. A estrutura das proteínas de cápside de vírus de plantas e animais preenchem estes requisitos e podem ser totalmente concebidas para apresentar péptidos imunogénicos derivados do patogénio ou outras fontes com as quais seja produzido um adjuvante de vacina. A proteína de revestimento do vírus do mosaico da papaia (PapMV), de acordo com a presente invenção, é um excelente candidato para o desenvolvimento de um tal imunopotenciador portador de imunogénio. Este vírus apresenta uma forma de vareta cristalina e é muito repetitivo (1200 cópias da mesma subunidade por virião). Experiências de imunização recentes com PapMV indicam que este vírus induz uma resposta imunitária muito forte em ratos e é um excelente vetor para o desenvolvimento da vacina. Este vírus portador de imunogénio pode ser concebido com vários péptidos imunogénicos, por exemplo, das proteínas de envelope de superfície HCV, péptidos Salmonella typhii derivadas da proteína porina, e o péptido 0(9-23 da insulina. A montagem de proteínas de revestimento de fusão transportadas por partículas semelhantes a vírus (PSV) é definida como um portador de imunogénio tendo propriedades adjuvantes ou imunopotenciadoras.

De acordo com a presente invenção, é possível providenciar uma composição para imunopotenciar ou reforçar uma reação imunitária contra um dado antigénio. Sabe-se, em particular, que pequenas moléculas funcionam muitas vezes bastante mal como imunogénios na sua capacidade de provocar anticorpos num sistema in vivo. Quando associadas a um vírus portador de imunogénio, que é ele próprio antigénico, 13 dará azo a uma melhor resposta de anticorpos à molécula mais pequena. A molécula pequena liqada ao portador de imunogénio neste sistema pode ser chamada hapteno ou antigénio, e pode variar em tamanho de pequena a bastante grande. Num exemplo desta combinação, de interesse para o campo dos cuidados de saúde, uma pequena porção do antigénio de superfície de hepatite B, compreendendo uma sequência de aminoácidos determinados, que não é ela própria antigénica, pode ser ligada de forma covalente ao PSV, e o conjugado resultante provoca anticorpos num sistema in vivo que pode reagir contra o antigénio de superfície nativo do PSV e também fortemente com todo o vírus da hepatite. Este sistema de portador de imunogénio pode ser a base para uma vacina eficaz contra uma doença para a qual o hapteno ou o antigénio codificam. São aqui revelados portadores de imunogénio, como abaixo descrito, que são convenientemente produzidos por técnicas recombinantes de ADN, que são úteis em providenciar vacinas imunogénicas univalentes e multivalentes, e que empregam o conceito de portador de imunogénio acima descrito. É acoplado um imunogénio a um portador PSV para formar um complexo portador de imunogénio que pode ser então usado num hospedeiro para provocar uma resposta imunitária. 0 imunogénio pode ser específico ou reconhecido para estruturas de superfície em células T, células B, células NK e macrófagos, mas não para estruturas de superfície celular associadas a APC da Classe I ou Classe II. 0 imunogénio ao qual o portador PSV está acoplado pode compreender péptidos, haptenos, hidratos de carbono, proteínas, ácidos nucleicos, e parte de vírus, bactérias, parasitas e outros microrganismos totais. Independentemente do imunogénio selecionado, este terá de ser acoplado ao 14 portador PSV de forma a não interferir com o reconhecimento do imunogénio pelo sistema imunitário do hospedeiro como uma entidade antigénica. 0 complexo portador de imunogénio pode ser usado como uma vacina para provocar uma resposta imunitária no hospedeiro. 0 complexo inicialmente pode ser dado numa dosagem apropriada por forma a obter uma resposta imunitária. A isto pode-se seguir um reforço com o complexo ou unicamente com o imunogénio. Uma variante desta abordagem pode incluir a formação de um ou mais complexos portadores de imunogénio em que uma ou mais formas de um imunogénio são acopladas a um ou mais PSV e são administrados vários destes complexos. 0 propósito de administrar o portador de imunogénio é providenciar proteção ao hospedeiro sob a forma de imunidade ao antigénio e evitar a utilização de adjuvantes que tenham efeitos colaterais indesejados.

Numa forma de realização da invenção, o antigénio pode ser um imunogénio tão pequeno como um hapteno ou pode ser relativamente grande, como parte de um vírus. 0 tamanho e tipo de antigénio não são críticos para a prática desta invenção. Pode ser usado qualquer antigénio para o qual seja desejada uma resposta num hospedeiro. A invenção é especialmente útil, contudo, para pequenos haptenos imunogénicos fracos.

Após o ou os complexos portadores de imunogénio estarem formados, o complexo ou complexos podem ser administrados ao hospedeiro. 0 regime de administração não tem de ser diferente de qualquer outro programa de vacinação geralmente aceite. Pode ser usada uma única administração numa quantidade suficiente para obter uma resposta imunitária eficaz. Em alternativa, podem ser usados outros 15 regimes de administração inicial do complexo, seguido de reforço apenas com antigénio ou com um ou mais complexos. Igualmente, pode ocorrer reforço quer com o complexo quer com o antigénio a alturas que ocorram bem depois da administração inicial, se os titulos de anticorpos descerem dos niveis aceitáveis.

Uma outra forma de realização da presente invenção é que uma vez que os PSV têm uma estrutura helicoidal multivalente regular e verdadeira que pode ser mais imunogénica do que a agregação de proteínas ou subunidades de proteínas livres, podem ser facilmente montados a partir de um ácido nucleico codificador. Igualmente, a maior estabilidade da partícula pode providenciar uma longa exposição da porção de imunogénio ao sistema imunitário. A porção de vírus na qual o imunogénio é ligado é disposta de preferência na superfície exterior do PapMV PSV para utilização como um adjuvante na vacinação para potenciar uma resposta imunitária. Assim, onde a partícula deriva de PapMV, a porção do portador é disposta no terminal carboxi. Isto pode resultar em montagem melhorada quando comparado com a montagem de partículas com uma segunda porção noutra localização do PR, e pode aumentar o reconhecimento imunitário da segunda porção na superfície da partícula. 0 desenvolvimento da vacina de péptidos usando um vetor virai de planta permite a produção em massa de vacinas em condições de segurança. Espera-se 1 grama de vírus recombinante por quilograma de folhas frescas infetadas com o PapMV recombinante. A administração de 200 pg de vírus recombinante, ou complexo portador de imunogénio, que corresponde a 14 pg de péptido pode ser suficiente para imunização. Um hectare de 16 papaia infetada pode então ser potencialmente suficiente para a vacinação de 5 milhões de pacientes. Para além disso, o cultivo de plantas é barato e eficaz. A agricultura é a forma mais barata de produzir uma biomassa, porque não exige equipamento sofisticado. 0 virus ou pseudovirus pode ser montado na célula hospedeira para produzir partículas de virus infecioso que compreendam ácido nucleico e proteina de fusão. Isto pode permitir a infeção de células adjacentes pelo virus ou pseudovirus infecioso e expressão da proteina de fusão ai. A célula hospedeira pode ser infetada inicialmente com virus ou pseudovirus em forma de partícula (isto é, em hastes montadas compreendendo ácido nucleico e uma proteina) ou em alternativa em forma de ácido nucleico (isto é, como ARN virai; ADNc ou transcriptos de escoamento preparados a partir de ADNc) desde que o virus ácido nucleico usado para infeção inicial possa replicar e provocar a produção de partículas de virus inteiras com a proteina quimérica. A primeira porção (virai) da proteina de fusão pode ser qualquer proteina, polipéptido ou suas partes, derivada do virus do mosaico da papaia incluindo quaisquer suas versões geneticamente modificadas (como eliminações, inserções, substituições de aminoácidos e semelhantes). De acordo com as reivindicações em anexo, a primeira porção será derivada de uma proteina de revestimento do virus do mosaico da papaia (ou uma sua versão geneticamente modificada). Uma molécula de proteina de fusão pode agrupar-se com outras moléculas de proteina de fusão ou com proteina de revestimento de tipo selvagem num virião portador de imunogénio. 17

De acordo com as composições e proteínas de fusão da invenção, a partícula é derivada do potexvírus PapMV, e a segunda porção está disposta no terminal C da proteína de revestimento. Em PapMV, o terminal C da proteína de revestimento forma um domínio do lado de fora do virião.

De acordo com os polinucleótidos da invenção, uma codificação de polinucleótido para a porção de imunogénio é inserida no terminal da codificação de polinucleótido para o terminal C da porção virai, de forma a que com a translação, a proteína de fusão fique com a porção virai numa extremidade e a porção de imunogénio na extremidade oposta. Não é necessário que a porção virai compreenda uma proteína de revestimento de vírus completa, mas esta é uma opção alternativa.

Um vírus ou pseudovírus geneticamente modificado para expressar a proteína de fusão forma uma outra forma de realização da presente invenção. Também é aqui revelada uma célula hospedeira infetada com um tal vírus ou pseudovírus.

De preferência, a célula hospedeira usada para replicar o vírus ou pseudovírus é uma bactéria, em que o vírus é um vírus de planta, apesar de células de plantas, células de insetos, células de mamíferos e bactérias poderem ser usadas com vírus que replicarão em tais células. A célula é de preferência uma bactéria como o E. coli, apesar de poderem ser úteis outras formas de bactérias e outras células, tais como as células acima referidas. A célula poderá ser uma célula hospedeira natural para o vírus a partir da qual a partícula semelhante a um vírus deriva, mas tal não é necessário. 18

Toda a partícula semelhante a um vírus é usada para apresentação estável e duradoura de epitopos péptidos na vacinação de animais.

PapMV e as partículas semelhantes a vírus PapMV parecem ser muito estáveis e podem ser armazenadas facilmente à temperatura ambiente. Resistem a temperaturas muito elevadas e a condições adversas, já que os vírus de plantas evoluíram para resistir a condições muito difíceis que se reqistam no meio ambiente. Esta é uma vantagem muito importante quando a vacina tem de atingir pessoas que vivem em países pobres, em regiões de acesso difícil, ou têm de ser armazenadas por longos períodos de tempo.

Em alternativa, a PSV aqui descrita pode ser usada sozinha como imunopotenciador ou adjuvante para melhorar a resposta imunitária em humanos ou animais contra antigénios alvo. É preferível que o adjuvante ou PSV imunopotenciador sejam administrados concomitantemente com o antigénio contra o qual deve ser suscitada uma resposta imunitária. Contudo, a PSV adjuvante pode ser administrada prévia ou subsequentemente, dependendo das necessidades, à administração do antigénio aos pacientes, humanos ou animais. A presente invenção será melhor compreendida com referência aos seguintes exemplos que são apresentados para ilustrar a invenção e não para limitar o seu âmbito.

EXEMPLO I

Preparação de PSV portadora de imunogénio 19 A avidez dos péptidos de afinidade selecionados aqui descritos será melhorada pela multimerização dos péptidos. A multimerização será feita na superfície do virus de mosaico da papaia (PapMV) que é um membro do grupo potexvirus. 0 PapMV tem uma estrutura tipo haste que é feita por montagem das subunidades PR. Uma partícula de virus contém 1200 subunidades. Faremos uma fusão do péptido selecionado com o PapMV PR. A fusão será feita para expor o péptido à superfície das partículas PapMV após reunião in vitro de um PapMV PR expresso e purificado a partir de um sistema de expressão E.coli. A reunião do PR virai garantiu depois a multimerização do péptido e tem uma avidez consideravelmente melhor. O gene da proteína de revestimento (PV) foi clonado e foi desenvolvido um sistema de reunião in vitro usando a proteína de revestimento (PR) do vírus de mosaico da papaia (PapMV) (Figura 1) . O PR de PapMV foi produzido em E.coli em grande quantidade (Figura 2a) e produziu in vitro partículas semelhantes a vírus PapMV que são muito semelhantes ao vírus wt (Figura 2b). É revelado pela primeira vez que um PapMV PR recombinante pode montar-se in vitro em partículas semelhantes a vírus. A fusão de vários péptidos no terminal C de PR é permitida por reunião in vitro e dá azo a partículas semelhantes a vírus que são mais extensas do que o vírus wt por causa da fusão (Figura 3) .

EXEMPLO II

Efeito de imunopotenciação de PSV portadora de imunogénio

Muitas vezes é usado um adjuvante para aumentar a resposta imunitária de uma vacina candidato. A melhoria da resposta 20 inflamatória favorece a migração de mais fagócitos para o local da injeção, que por sua vez resulta numa apresentação de imunogénio melhorada por células que apresentam antigénio (CAA). Alúmen, emulsões, microparticulas e citoquinas como GM-CSF foram todas usadas para aumentar a resposta imunitária da vacina candidato. Foi confirmado que o PapMV induz por si próprio um episódio inflamatório, eliminando assim a necessidade de adjuvantes adicionais. O modelo de bolsa de ar foi usado para examinar se o PapMV induziu um evento pró-inflamatório in vivo. Neste modelo, é injetado ar esterilizado no dorso dos ratos nos dias 0 e 3. No dia 7, podem ser injetados agentes pró-inflamatórios na bolsa de ar e ser medida a resposta inflamatória. Este modelo representa minuciosamente os locais de injeção subcutâneos. A injeção de PapMV na bolsa de ar dos murinos resultou na acumulação de aproximadamente 8,5 x 106 leucócitos, em comparação com 0,8 x 106 leucócitos em ratos injetados com veiculo (PBS) (Fig.4). Acumularam-se neucrófilos (85%) e monócitos (15%) na bolsa de ar 6 horas após a injeção de PapMV. Enquanto quantidades tão baixas como 1 yg de PapMV foram suficientes para induzir a acumulação de leucócitos, a acumulação máxima ocorreu quando foram injetados 100 yg de PapMV. Esta acumulação foi semelhante à induzida por injeção de 1 yg de LPS, um potente fator pró-inflamatório. Estes resultados demonstram claramente que PapMV pode induzir eficazmente um episódio inflamatório. Esta observação mostra claramente que o PapMV é percebido pelo sistema imunitário que induz a sinalização e recrutamento de células envolvidas na defesa do nosso organismo. É provável que o PapMV induza sinalização através de imunidade inata. 21

Para além disso, foi mostrado na presente experiência que o PapMV induz uma forte e duradoura resposta humoral nos ratos (Figura 5). 10 ratos foram injetados com três concentrações de PapMV; 1, 10 e 100 yg. Foi eficazmente induzida uma resposta de anticorpos primária em ratos BALB/c imunizados com PapMV, independentemente da via de administração (Figura 5) . Foram detetados titulos elevados no dia 5 após a imunização. Foi observada uma curva clássica de uma resposta lgM primária. Por volta do dia 20, a resposta lgM estava ausente, mesmo após reforçar os ratos com mais virus. A resposta lgG em ratos imunizados segue a cinética clássica. Foram detetados títulos elevados de anti-PapMV no dia 12 após a imunização e aumentaram proporcionalmente após reforço com este vírus. A análise de isótipos lgG mostrou uma preferência na produção de lgG2b e lgGl durante a fase primária e secundária da resposta Ab. O lgG3 aumentou os títulos durante a fase de memória da resposta Ab. Estes dados mostram que o PapMV pode induzir uma resposta Ab eficaz em ratos. Foram induzidas respostas primárias e secundárias, bem como uma memória Ab duradoura. A produção preferencial de lgGl sugere uma libertação preferencial de IL-4. IL-4 favorece a mudança de classe para este tipo de lgG. Como tal, podia ser visado um equilíbrio em relação à resposta TH2 nestes ratos. A falta de lgG2a indica a ausência de libertação de IFN-α, já que esta citoquina esteve diretamente envolvida na mudança de classe em relação a este isótipo lgG. Vistos em conjunto, estes dados mostraram a capacidade de PapMV induzir uma resposta de anticorpos eficaz e duradoura. Este resultado sugere que as partículas PapMV são um vetor excelente para o desenvolvimento de uma vacina humoral. A fusão de um imunogénio de interesse para PSV será então reconhecida, também pelo sistema imunitário e desencadear uma forte resposta imunitária do epitopo de interesse. 22

Igualmente, descobriu-se que PapMV PSV migram especif icamente para os nodos linfáticos e o baço após injeção intraperitoneal ou subcutânea em ratos Balb/C (Figura 6). Este resultado indica que PapMV PSV são excelentes portadores porque migram eficazmente para os locais de emergência de resposta imunitária.

Os dados experimentais demonstram que o antigénio PapMV induz uma resposta de anticorpos eficaz em ratos (Figura 5) . De facto, as respostas primária e secundária são eficazmente induzidas, bem como uma memória de anticorpos duradoura (Figura 6) . Várias vias de imunização produziram quantidades de anticorpos eficazmente grandes. Apenas a imunização oral não resultou numa resposta imunitária. É provável que o NaHC03 usado para neutralizar o ácido do estômago tenha danificado as partículas de vírus e afetado a imunogenicidade das partículas. Estavam presentes lgGl, lgG2 e lgG3 mesmo 350 dias após uma injeção de 100 yg de PapMV (Figura 6) . Porque lgG2 e lgG3 estão presentes e persistem, podemos deduzir que é induzida uma resposta TH1 com PapMV. Isto sugere que as partículas PapMV são excelentes vetores para o desenvolvimento de uma resposta humoral imunitária a um antigénio estranho. A fusão de um epitopo de interesse com a partícula PapMV devia ajudar a desencadear uma resposta imunitária humoral contra o epitopo de interesse.

Dados experimentais usando o modelo de bolsa de ar no dorso dos ratos demonstraram que PapMV melhora a resposta inflamatória e favorece a migração de fagócitos no local de inoculação (Figura 6). Este resultado confirma que o PapMV induz por si próprio um episódio inflamatório, eliminando assim a necessidade de estratégias adjuvantes adicionais com o objetivo de melhorar a apresentação de antigénio por células que apresentam antigénio. Foram obtidos resultados 23 semelhantes com partículas semelhantes a vírus (PSV) albergando a fusão de péptidos específicos gerados in vitro a partir de proteínas recombinantes (Figura 6) . 0 recrutamento foi muito rápido, uma vez que observámos o máximo de células entre 6 a 9 horas após o tratamento (dados não mostrados). Para além disso, as partículas PapMV são eficazes para induzir uma resposta imunitária na ovalbumina, uma proteína conhecida por ser um não-imunogénico (Figura 7). Isto foi estabelecido injetando ratos (Balb/C) por via intraperitoneal com 2 mg de ovalbumina, uma proteína conhecida por ser um imunogénio muito fraco, ou em combinação com 50 ou 100 yg de PapMV. Injetámos 6 ratos por tratamento e recolhemos amostras nos dias 0, 4, 8, 12 e 20 após a injeção. Só foi dada uma injeção por tratamento. Detetámos uma resposta imunitária duas vezes mais potente à ovalbumina na presença de PapMV, mesmo com a ovalbumina sendo um imunogénio fraco.

Estas observações demonstram que as partículas PapMV são rapidamente percebidas como estranhas pelo sistema imunitário dos mamíferos, o que por seu lado induz a sinalização e recrutamento de células envolvidas na defesa do organismo.

EXEMPLO III

Virus da hepatite C como alvo de vacinação 0 vírus da hepatite C (HCV) é uma cadeia positiva de vírus ARN que causa doenças de fígado crónicas e agudas. A fase aguda de infeção é geralmente associada a sintomas ligeiros, mas pode conduzir a cirrose e carcinoma hepatocelular. Mais de 170 milhões de pessoas em todo o mundo foram infetadas, o que representa 4 vezes mais do que 24 o HIV. Nos próximos anos, o número de mortes de doenças associadas com HCV pode mesmo superar a taxa de mortalidade causada pelo SIDA. No tempo presente, as terapias atuais contra HCV são insatisfatórias. A única terapia disponível é interferon (IFN), mas a maior parte dos HCV são resistentes por causa de uma inibição da quinase de proteina induzivel por interferon (PKR) pela proteina HCV E2 .

Sabe-se que 20% dos pacientes infetados com HCV eliminam naturalmente o virus. Esta observação sugere que o sistema imunitário pode eliminar os virus se reagir de forma eficaz. Também sugere que poderíamos ajudar os pacientes infetados cronicamente ao reforçar o seu sistema imunitário com uma vacina terapêutica contra HCV que poderia ajudar a eliminar a infeção virai criando anticorpos neutralizantes do virus.

Os 2 epitopos escolhidos encontram-se na superfície do virião HCV. O epitopo EI (aminoácido 285-303) e epitopo E2 (aminoácidos 512-536) têm-se revelado muito imunogénicos em pacientes que eliminaram a infeção virai (David et al., 2001). O PapMV foi concebido para albergar no seu terminal C a fusão do péptido EI e E2 de HCV que pode montar-se in vitro em partículas semelhantes a vírus (Figura 3).

Foram escolhidos três epitopos que se encontram na superfície do virião HCV de EI e E2 fora de HVR-1 em região conservada das glicoproteínas de envelope virais. Um epitopo EI (aminoácido 285-303) e 2 epitopos E2 (aminoácidos 512-536 e 528-546) revelaram ser muito imunogénicos em pacientes que eliminaram a infeção virai. Para além disso, um epitopo E2 (512-536) revelou despoletar a produção de anticorpos neutralizantes, que se encontram no soro do paciente, que eliminaram a infeção. Estas três 25 regiões são boas candidatas para o desenvolvimento de uma vacina HCV porque são conservadas através de subtipos e estirpes HCV e são localizadas fora da região hipervariável das glicoproteínas envelope. As conceções PapMV-El e PapMV-E2 foram expressas em E.coli. As proteínas recombinantes foram purificadas e reunidas in vitro. A reunião do PR recombinante com as fusões HCV E2 gera rPSV que são similares ao controlo wt PR recombinante com exceção que parecem ser ligeiramente maiores por causa da fusão.

Foram imunizados ratos com as PSV recombinantes que foram produzidos in vitro. Foram removidos os LP usando uma coluna de polimixina e injetados em ratos intraperitonealmente e subcutaneamente. Usámos 1, 10 e 100 pg de PSV e foram injetados 3 ratos por tratamento. A resposta imunitária ao péptido e a PapMV foi analisada por ELISA. Foi observado que lgG foram direcionados para o péptido, bem como para a superfície das PSV (Figura 8) . Este resultado mostra que o PapMV recombinante pode ser usado para desencadear uma excelente resposta imunitária na superfície dos epitopos e usado como vacina sem ajuda de um adjuvante.

EXEMPLO IV

Imunização contra a febre tifoide A febre tifoide é uma infeção aguda do sistema reticuloendotelial, do tecido linfóide intestinal e da vesícula biliar que é causada pela bactéria Salmonella typhii. Continua a ser uma doença significativa a nível mundial que afeta mais de 16 milhões de pessoas das quais 600 mil não sobrevivem à infeção. A maioria das infeções afeta crianças e jovens adultos e pode ser prevenida por 26 via de vacinação. Estão atualmente disponíveis vários tipos de vacinas: 1) vacina parental de célula inteira preservada em fenol e inativada por calor (Wyeth-Amherst), administrada intramuscularmente ou subcutaneamente. 2) vacina parental seca de célula inteira e desativada com acetona. 3) vacina parental de polissacarídeo Vi purificada (não desnaturado) (Aventis) que é administrada por injeção no deltoide. 4) Estirpe Ty21a Vi negativo, gal E atenuada, usada como vacina oral viva.

Bactérias parentais inativadas (tipo 1-3) podem conduzir a respostas imunitárias indesejadas por causa da complexidade do lipopolissacarídeo (LPS) e do número de antigénios apresentados que provocam efeitos colaterais indesejados. Para além disso, os polissacarídeos Vi são antigénios independentes do timo (Robins and Robins, 1984) que revelaram ter uma boa eficácia nos ensaios de campo, mas que são também conhecidos por serem ineficazes na indução de memória imunológica. São necessárias várias exposições ao antigénio para manter a proteção, tornando esta abordagem apropriada apenas para viajantes de visita a zonas endémicas. As vacinas presentemente disponíveis não estão adaptadas para pessoas que vivem permanentemente em zonas contaminadas. As vacinas baseadas em bactérias atenuadas (tipo 4) podem causar náusea, vómitos e dor abdominal. Também não é aconselhável administrar esta vacina a pacientes que sofram de imunossupressão, doenças intestinais, diarreia, que estejam a tomar antibióticos ou a mulheres grávidas e crianças com menos de 6 anos de idade. Esta vacina deve ser armazenada a 4°C porque é sensível ao calor e não deve ser congelada. A sensibilidade de ty21A a condições adversas é problemática quando se quer atingir populações que vivem em países pobres em climas tropicais, regiões que são as mais afetadas pela tifoide. 27

Uma proteína membrana da S. typhii chamada porina revelou ser um bom imunogénio, já que provoca resposta imunitária de anticorpos e celular em ratos e humanos e foi capaz de proteger ratos contra S. typhii. As porinas são a proteína mais abundante na membrana de bactérias gram-negativas e funcionam como canais de difusão passivos para moléculas com baixo peso molecular. Estas proteínas apresentam um elevado grau de homologia estrutural e funcional e assume-se como tal terem um ascendente comum. Dois pequenos epitopos correspondendo às ansas (loop) 6 e 7 da porina S. typhii que estão expostos à superfície das bactérias revelaram estar envolvidos nos mecanismos de proteção provocados pela imunização com porinas. Essas regiões são específicas para S. typhii e são excelentes epitopos para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade recombinante, Clonámos no terminal C do PapMV PR a ansa 6 da porina de S. typhii. A proteína recombinante foi purificada e as partículas semelhantes a vírus PapMV foram produzidas in vitro com ARN como anteriormente descrito (Figura 3F).

Pressupõe-se que a invenção não está restringida a nenhuma das formas de realização preferenciais acima, e que são possíveis modificações desde que dentro do âmbito das reivindicações em anexo.

Lisboa, 30 de Setembro de 2013

Claims (33)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição compreendendo um adjuvante capaz de potenciar uma resposta imunitária num animal e em um ou mais antigénios estranhos, o referido adjuvante compreendendo um Virus do Mosaico da Papaia (PapMV) ou uma particula semelhante a um virus PapMV compreendendo uma proteina de revestimento PapMV, a referida proteina de revestimento sendo capaz de reunir para formar a referida particula semelhante a um virus, em que um ou mais antigénios estranhos são fundidos ou ligados de forma covalente no terminal C da proteina de revestimento do referido PapMV ou particula semelhante a um virus PapMV de forma a que o ou os antigénios estranhos sejam dispostos na superfície exterior do referido vírus ou partícula semelhante a um vírus, e em que a referida composição é adequada para utilização como vacina.

2. A composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizada em que o referido adjuvante compreende uma partícula semelhante a um vírus PapMV e o ou os antigénios estranhos referidos são fundidos ou ligados de forma covalente no terminal C da proteína de revestimento da referida partícula semelhante a um vírus PapMV.

3. A composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizada em que um ou mais antigénios estranhos são fundidos no terminal C da proteína de revestimento.

4. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3 caracterizada em que o 2 referido adjuvante compreende uma partícula semelhante a um vírus PapMV compreendendo proteína de revestimento geneticamente modificada.

5. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4 caracterizada em que um ou mais dos referidos antigénios estranhos são imunogénios com mais de uma especificidade.

6. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5 caracterizada em que um ou mais dos antigénios estranhos referidos derivam de um ou mais vírus, bactérias ou parasitas.

7. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 caracterizada em que um ou mais dos antigénios estranhos referidos compreende um epitopo antigénico de hepatite C ou um epitopo antigénico de Salmonella typhii.

8. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 caracterizada em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária sistémica.

9. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 caracterizada em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária humoral, uma resposta imunitária celular ou uma sua combinação.

10. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 caracterizada em que a referida resposta imunitária é uma resposta de memória de anticorpo duradoura. 3

11. Um polinucleótido codificando uma proteína de fusão, a referida proteína de fusão compreendendo uma proteína de revestimento de Vírus do Mosaico da Papaia (PapMV) e um ou mais antigénios estranhos fundidos no terminal C da referida proteína de revestimento, a referida proteína de revestimento sendo capaz de montagem para formar uma partícula semelhante a um vírus.

12. Uma proteína de fusão recombinante compreendendo proteína de revestimento de Vírus do Mosaico da Papaia (PapMV) e um ou mais antigénios estranhos fundidos no terminal C da referida proteína de revestimento, a referida proteína de revestimento sendo capaz de reunir para formar uma partícula semelhante a um vírus.

13. A proteína de fusão recombinante de acordo com a reivindicação 12 caracterizada em que a referida proteína de fusão é uma proteína recombinante produzida em E. coli. 14. 0 polinucleótido da reivindicação 11 ou a proteína de fusão recombinante da reivindicação 12 ou 13 caracterizada em que a referida proteína de revestimento é uma proteína de revestimento geneticamente modificada. 15. 0 polinucleótido de acordo com a reivindicação 11 ou 14 ou a proteína de fusão recombinante de qualquer uma das reivindicações 12, 13 ou 14 caracterizado em que um ou mais dos antigénios estranhos referidos compreende um epitopo antigénico de vírus da hepatite C ou um epitopo antigénico de Salmonella typhii. 4

16. Uma partícula semelhante a um vírus do mosaico da papaia (PapMV) compreendendo várias proteínas de fusão recombinantes, cada uma das referidas proteínas de fusão recombinantes compreendendo proteína de revestimento PapMV e um ou mais antigénios estranhos fundidos no terminal C da referida proteína de revestimento, em que as referidas proteínas de fusão recombinantes são capazes de reunir para formar uma partícula semelhante a um vírus e em que a partícula semelhante a um vírus é capaz de agir como adjuvante.

17. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ,7, 8, 9 ou 10 ou com a partícula semelhante a um vírus PapMV da reivindicação 16, para utilização como vacina num animal em falta dela.

18. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9 ou 10 ou com a partícula semelhante a um vírus PapMV da reivindicação 16, para utilização na indução de uma resposta imunitária num animal em falta dela.

19. A composição ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com a reivindicação 18 para utilização de acordo com a reivindicação 18 para administração parenteral, enteral ou oral no referido animal.

20. Utilização da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou a PapMV PSV da reivindicação 16, na produção de um medicamento.

21. A utilização de acordo com a reivindicação 20 em que o referido medicamento é uma vacina. 5

22. A utilização de acordo com a reivindicação 20 ou 21 em que o referido medicamento serve para induzir uma resposta imunitária num animal em necessidade dela.

23. A composição ou partícula semelhante a um virus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18 ou 19 para utilização com qualquer uma das reivindicações 17, 18 ou 19 ou a utilização de acordo com a reivindicação 22, em que o animal é um humano.

24. Um virus do mosaico da papaia (PapMV) ou partícula semelhante a um vírus PapMV compreendendo proteína de revestimento PapMV, a referida proteína de revestimento sendo capaz de reunir para formar uma partícula semelhante a um vírus, para utilização como um adjuvante em vacinação para potenciar uma resposta imunitária em um ou mais antigénios estranhos que não estão ligados ao referido PapMV ou PapMV PSV ou estão fundidos ou ligados de forma covalente no terminal C da proteína de revestimento do referido PapMV ou PapMV PSV num animal em necessidade dela.

25. O PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com a reivindicação 24 para utilização conforme a reivindicação 24 em que a referida partícula semelhante a vírus PapMV compreende proteína de revestimento geneticamente modificada.

26. O PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com a reivindicação 24 ou 25 para utilização conforme a reivindicação 24 ou 25 em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária sistémica. 6 27. 0 PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com a reivindicação 24 ou 25 para utilização conforme a reivindicação 24 ou 25 em que a referida resposta imunitária humoral, uma resposta imunitária celular ou uma sua combinação. 28. 0 PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com a reivindicação 24 ou 25 para utilização conforme a reivindicação 24 ou 25 em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária de anticorpos duradoura. 29. 0 PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27 ou 28 para utilização conforme a reivindicação 24, 25, 26, 27 ou 28 em que o referido PapMV ou partícula semelhante a vírus PapMV se destina a administração parenteral, enteral ou oral num animal.

30. O PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 para utilização conforme a reivindicação 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 em que o ou os antigénios estranhos referidos são imunogénios com mais de uma especificidade.

31. O PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 para utilização conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 30 em que o ou os antigénios estranhos referidos derivam de um ou mais vírus, bactérias ou parasitas.

32. O PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 7 26, 27, 28, 29, 30 ou 31 para utilização conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 31 em que o ou os antigénios estranhos referidos compreendem um epitopo antigénico de hepatite C ou um epitopo antigénico de Salmonella typhi.

33. O PapMV ou particula semelhante a um virus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 para utilização conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 32 em que o ou os antigénios estranhos referidos e o referido PapMV ou partícula semelhante a vírus PapMV se destinam a co-administração ao referido animal.

34. O PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 para utilização conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 32 em que o referido PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV se destina a administração ao referido animal antes ou depois da administração do ou dos antigénios referidos.

35. O PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 para utilização conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 33 em que o ou os antigénios estranhos referidos são fundidos ou ligados de forma covalente ao terminal C da proteína de revestimento do referido PapMV ou partícula semelhante a vírus PapMV.

36. O PapMV ou partícula semelhante a vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 para utilização conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 33 em que o ou os antiqénios estranhos referidos são fundidos no terminal C da proteína de revestimento. 37. 0 PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 34 para utilização conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 32 ou 34 em que o ou os antiqénios estranhos referidos não estão ligados ao referido PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV.

38. O PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 para utilização conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 37 em que o referido animal é um humano. 39. 0 PapMV ou partícula semelhante a um vírus PapMV de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 para utilização conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 37 em que o referido animal é um animal não humano.

40. Um método para produzir in vitro uma partícula semelhante a um Vírus de Mosaico da Papaia (PapMV) caracterizado por o referido método compreender: (a) expressar numa célula hospedeira E.coli uma proteína de revestimento PapMV clonada fundida no seu terminal C a um ou mais antigénios e (b) permitir que a proteína de revestimento fundida expressa se monte para formar a referida partícula semelhante a um vírus em que a partícula semelhante a um vírus é um 9 adjuvante para potenciar num animal em falta de uma resposta imunitária no ou nos antigénios estranhos referidos e em que o ou os antigénios estranhos referidos são dispostos na superficie exterior da particula semelhante a um virus. 41. 0 método de acordo com a reivindicação 40 caracterizado por a referida proteina de revestimento ser uma proteina de revestimento geneticamente modificada. Lisboa, 30 de Setembro de 2013