JP6622326B2 - インフルエンザa/上海/2/2013 h7配列の改変h7赤血球凝集素糖タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、米国立衛生研究所(National Institute of Health)によって与えられた認可番号AI082642による米国政府の経済的支援によってなされたものである。米国政府は、本発明に特定の権利を有し得る。
本出願は、米国を指定している、35U.S.C.§371の下で2016年5月2日に出願されたPCT国際特許出願番号PCT/US2016/030425号の国内段階出願であり、2015年5月4日に提出された米国仮特許出願第62/156,718号に対する優先権を主張する。上記出願の全体を本明細書において引用により援用する。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子提出された配列表を含んでおり、これによってその全体を引用により援用する。2017年12月11日に作成された前記ASCIIコピーは「SEQUENCE LISTING MODIFIED H7_ST25」という名称であり、20KBバイトのサイズである。
本明細書において用いられる「アジュバント」という用語は、ワクチンの効果を助けて増強する物質を示す。
APC 抗原提示細胞(antigen presenting cell)
CEFT サイトメガロウイルス(HCMV)、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、破傷風トキソイドウイルス(Cyto−megalovirus(HCMV)、Epstein−Barr virus、Flu viruses、Tetanus toxoid virus)
DMSO ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)
DPBS ダルベッコリン酸緩衝食塩水(Dulbecco’s Phosphate−Buffered Saline)
HBSS ハンクス平衡塩類溶液(Hank’s Balanced Salt Solution)
HLA ヒト白血球抗原(human leukocyte antigen)
HPLC 高速液体クロマトグラフィー(high performance liquid chromatography)
IAV インフルエンザAウイルス
ICS 免疫原性コンセンサス配列(immunogenic consensus sequences)
MHC 主要組織適合複合体(major histocompatibility complex)
PBMC 末梢血単核細胞
PHA フィトヘマグルチニン(phytohaemagglutinin)
TCR T細胞受容体
Treg 制御性T細胞
TRF 時間分解蛍光(time resolved fluorescence)
EpiMatrixシステム(エピバックス、プロヴィデンス、RI、USA)を用いて、全体的および局所的の両方の免疫原性の可能性に対して、H7N9インフルエンザのアミノ酸配列を分析した。識別された推定エピトープクラスタを、GenBank(登録商標)(米国立衛生研究所(National Institutes of Health)、ベセスダ(Bethesda)、MD、USA)より入手可能な非冗長タンパク質データベースと、ラホーヤアレルギー免疫研究所(La Jolla Institute for Allergy and Immunology)(ラホーヤ(La Jolla)、CA、USA)の免疫エピトープデータベースと、エピバックス社(エピバックス、プロヴィデンス、RI、USA)が維持する公知のMHCリガンドおよびT細胞エピトープのデータベースとに対してさらにスクリーニングした。
入力配列を重複する9量体のフレームにパーズし、多くの付加的な「ファミリーメンバー」対立因子と機能的に同等またはほぼ同等な8つの一般的クラスII対立因子、すなわち「スーパータイプ」のパネルに関して、各フレームを評価した。8つのスーパータイプ対立因子と、それぞれのファミリーメンバーとは、ヒト母集団の98%をはるかに超える部分を「包含」する(Southwood、Sら.、J.Immunol.、160(7):3363〜73、1998)。各々のフレームの対立因子による「評価」で、HLA結合親和性を予測した。EpiMatrixシステム評価スコアは約−3から+3の範囲にわたり、正規分布した。1.64より高いEpiMatrixシステム評価スコアを「ヒット」と分類し、これは中程度から高い親和性でHLA分子に結合する有意な確率を伴う、したがってそれらがたとえば樹状細胞またはマクロファージなどのAPCの表面に提示され、そこで通過するT細胞に調べられ得る有意な確率を有する、免疫原性の可能性を示す。
クラスIIに対して、潜在的T細胞エピトープはタンパク質配列全体にランダムに分布するのではなく、特定の領域に「クラスタ化」する傾向がある。T細胞エピトープ「クラスタ」の長さは9から約25アミノ酸の範囲であり、複数の対立因子および複数のフレームにまたがるそれらの親和性を考慮すると、4から40の結合モチーフを含み得る。最も反応性の高いT細胞エピトープクラスタの多くが単一の9量体フレームを含み、それは少なくとも4つの異なるHLA対立因子に対して反応性であることが予測されることが発見された(以後「EpiBar」と呼ぶ)。EpiBarを含有する配列は、インフルエンザ赤血球凝集素306−318(クラスタスコア22)、破傷風毒素825−850(クラスタスコア46)、およびGAD65 557−567(クラスタスコア23)を含む。EpiBarの視覚的表示を図17に示し、それは、乱交雑インフルエンザエピトープのEpiBarおよびEpiMatrix分析の例を示す。インフルエンザHAペプチドは乱交雑の免疫原性であることが公知のエピトープである。EpiMatrixにおいて、そのスコアは8つの対立因子すべてに対して極度に高い。上記で述べたように、そのクラスタスコアは22である。10より高いクラスタスコアは有意とみなされる。帯状のEpiBarパターンは、乱交雑エピトープの特徴である。結果を、PRYVKQNTL(配列番号21)、RYVKQNTLK(配列番号22)、YVKQNTLKL(配列番号23)、VKQNTLKLA(配列番号24)およびKQNTLKLAT(配列番号25)について図17に示す。Zスコアは9量体フレームが所与のHLA対立因子に結合する可能性を示す。上位5%のすべてのスコアを「ヒット」とみなし、簡略化のため、10%未満の非ヒット(*)は図17においてマスクされる。
行ったインシリコ分析は、インフルエンザAのA/上海/2/2013 H7株の324番目の位置に有意なT細胞エピトープの存在を識別した(「エピトープ321」)。その結果を図4に報告する。加えて、エピトープ321のTCRコンタクトとヒトゲノム内にあるT細胞エピトープとの対応を確立した。図5を参照。インフルエンザA/上海/2/2013 H7の改変エピトープクラスタ321のEpiMatrix分析を図7に示す。加えて、行ったインシリコ分析は、一般的変異体のTCRコンタクトと、ヒトゲノムに含まれるT細胞エピトープとの間に有意な対応がないことを発見した。図8を参照。インフルエンザのA/上海/2/2013 H7株の提案される改変を図6に示す。図2は、本出願において構想され、構築され、テストされて請求されるA/上海/2/2013 H7変異体の配列である。
GISAID(http://platform.gisaid.org/)からの4つのヒトH7N9インフルエンザ配列(A/杭州(Hangzhou)/1/2013、A/安徽/1/2013、A/上海/1/2013、およびA/上海/2/2013)のHLAクラスII制限エピトープについて分析し、広いHLAおよび株の適用範囲を可能にするように構築免疫原性コンセンサス配列(ICS)を構築した。それぞれ正の対照およびH7N9ペプチドのヒト「類似体」の働きをするための、A(H1N1)、A(H3N2)、およびA(H5N1)からの4つの公的に利用可能なインフルエンザAエピトープと、ヒトタンパク質からの5つのペプチドとに加えて、自身とのさまざまな程度の交差保存を有する15の代表的なICSを選択した。ヒト類似体ペプチドは、ヤヌスマトリクス(エピバックス、プロヴィデンス、RI、USA)によって、選択されたH7N9ペプチドによる模倣の標的であり得ると識別されたペプチドに含まれるものであった。
H7N9ペプチドと他のIAV株との類似性が報告されている(De Groot ASら、Hum.Vaccin.Immunother.、9:950−6、2013)。ヤヌスマトリクス(エピバックス、プロヴィデンス、ロードアイランド(Rhode Island)、USA)を用いて、ヒトゲノムとの交差保存を評価した。ユニプロット(UniProt)で概観されるヒトゲノムデータベースを、比較のためのヒト配列のソースとして翻訳した(The UniProt Consortium、Nucleic Acids Res.、40:D71〜5、2012)。
サイトスケープ(サイトスケープ・コンソーシアム、サンディエゴ(San Diego)、カリフォルニア、USA)を用いて、各ペプチドとヒトゲノムとの予測交差反応性の定性分析を提供した。図10A〜10Cは、各々のペプチドに対するサイトスケープネットワークを示す。
本発明のペプチドは、いずれも当業者に公知の標準的な合成法および手順を用いることによって、商業的に入手可能な出発材料、文献において公知の化合物を用いるか、または容易に調製される中間物質から、さまざまなやり方で調製された。有機分子の調製ならびに官能基の転換および操作のための標準的な合成法および手順は、当該技術分野の関連科学文献または標準的な教科書から得ることができる。任意の1つまたはいくつかの供給源に限定されないが、たとえば本明細書において引用により援用されるSmith、M.B.およびMarch、J.、March’s Advanced Organic Chemistry:Reactions、Mechanisms、and Structure、5th edition、John Wiley & Sons:New York、2001;Greene、T.W.、Wuts、P.G.M.、Protective Groups in Organic Synthesis、3rd edition、John Wiley & Sons:New York、1999;R.Larock、Comprehensive Organic Transformations、VCH Publishers(1989);L.FieserおよびM.Fieser、Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis、John Wiley and Sons(1994);ならびにL Paquette、ed.、Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis、John Wiley and Sons(1995)などの古典的テキストは、当業者に公知の有機合成の有用かつ認知された参照教科書である。
計算的予測を検証するために、HLAクラスII結合親和性アッセイを行った。5つの一般的HLA DRB1対立因子、すなわちHLA DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、およびDRB1*0801に対する競合アッセイにおける結合親和性について、24のペプチドすべてを評価した(図11)。3つの濃度(1、10、および100μΜ)の非ビオチン化テストペプチドを用いて、可溶性クラスII分子(ベナロヤ研究所(Benaroya Institute)、シアトル(Seattle)、WA、USA)へのビオチン化標準ペプチド(25nM)の結合に対して競合させた。反応を37℃にて24時間インキュベートして、平衡に到達させた。次いで、パン抗HLA−DR抗体、たとえばL243、抗HLA−DRA(BioXCell、ウエストレバノン(West Lebanon)、NH、USA)などでコートした96ウェルプレート上に、クラスII HLA−ペプチド複合体を捕捉した。次いでこのマイクロウェルプレートを洗浄して過剰なペプチドを除去し、ユーロピウム標識したストレプトアビジン(パーキンエルマー(Perkin−Elmer)、ホプキントン(Hopkinton)、MA、USA)とともに室温にて1時間インキュベートした。ユーロピウム活性化緩衝剤(パーキンエルマー、ホプキントン、MA、USA)を加えてプレートを室温にて15〜20分間現像してから、時間分解蛍光(TRF)プレートリーダー(BMGラボテック社(BMG Labtech GMBH)、オルテンベルク(Ortenberg)、DE)においてプレートを読取った。アッセイは3つ組で行った。24のペプチドすべてについて、クラスII HLA対立因子結合ポケットの広い表現を提供するHLAクラスII対立因子の選択である5つの対立因子、すなわちDRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、およびDRB1*0801に対して結合アッセイを行った。
非特定化した健康なドナーから白血球除去フィルターが得られ(ロードアイランド・ブラッドセンター(Rhode Island Blood Center)、プロヴィデンス、RI、USA)、年齢を特定した健康なドナーからバフィーコートが得られた(リサーチ・ブラッド・コンポーネンツ(Research Blood Components)、ブライトン(Brighton)、MA、USA)。ヒト血液を用いたすべての研究は、NIHの規定に従い、ロードアイランド大学(University of Rhode Island)機関審査委員会の承認を得て行った。
新しく単離したPBMCを個々のペプチド(10μg/ml)またはペプチドのプール(10μg/ml)とともに、5%CO2雰囲気下で37℃にて8日間培養して、抗原特異的T細胞を拡張させた。ペプチドを培養物に入れる前に、ペプチドをDMSOに溶解し、培地でさらに希釈した。ウェル当りのペプチド当りのDMSOの最大濃度は0.2%であった。48ウェル細胞培養プレートのウェルにおいて、150μlの培地中の2×106の細胞を、150μlの各個々のペプチドまたはプールで刺激した。正の対照ウェルは、1μg/mlのPHA(サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、MA、USA)、または10μg/mlのCEFTペプチドプール(CTL、シェーカーハイツ(Shaker Heights)、OH、USA)を受取った。負の対照ウェルは、培地および0.2%DMSOのみを受取った。3日目および6日目に、細胞に10ng/mlのIL−2(BDファーミンゲン(BD Pharmingen)、サンディエゴ(San Diego)、CA、USA)を半培地交換によって補充した。8日目に、PBMCを集めて洗浄し、ELISpotアッセイによってサイトカイン分泌を測定するための抗原再刺激の準備をした。HLA−DR遮断実験のために、同じドナーからのPBMCを5μg/mlの精製NA/LE(登録商標)マウス抗ヒトHLA−DR抗体(BDファーミンゲン、サンディエゴ、CA、USA)の存在下または不在下で培養した。
ペプチドがHLA−DRによって提示されたかどうかを識別するために、3人の健康なドナーにおけるIFNγ酵素結合免疫スポット(ELISpot)によるエピトープ特異的T細胞応答に対する抗HLA−DR抗体の影響を調べた。10のペプチド(IAV−1、H7N9−2、−4、−7、−9、−12、−13、−14A、5−HUMAN−A、および−B)に対して、HLA−DRを遮断することによってペプチド特異的スポット形成が100%阻害され、これらのペプチドはHLA−DRによって制限されることを示した(表2)。
18人の個別の健康なドナーからのPBMCを、培養物中で個々のペプチドによって8日間にわたって刺激した。ΙFΝγ ELISpotキットを用いた製造者のプロトコル(マブテック(Mabtech)AB、シンシナティ(Cincinnati)、OH、USA)に従うELISpotアッセイにおいて、個々のペプチドによる再刺激に応答したヒトΙFΝγ生成を測定した(図12A)。ペプチドに対するエクスビボ応答は24〜48時間ではバックグラウンドより有意に高く上昇せず、前駆体集団を拡張せずに検出するにはエピトープ特異的T細胞の頻度が低過ぎたことを示唆したため、ELISpotアッセイは8日間の拡張期間の後に行われた。抗ヒトΙFΝγ捕捉抗体を予めコートしたELISpotプレートに、細胞を1×105/ウェルまたは1.5×105/ウェルにて移し、対応するペプチド10μg/mlによって再刺激した。正の対照ウェルを、1μg/mlのPHAまたは10μg/mlのCEFTによって刺激した。負の対照は、ペプチド刺激培養物に存在するのと同じ濃度のDMSO(0.2%)を伴う培地のみを受取った。すべての刺激および対照を3つ組のウェルに投与した。ELISpotプレートを5%CO2雰囲気下で37℃にて24時間インキュベートし、洗浄し、二次HRP標識抗ΙFΝγ検出抗体とともにインキュベートし、TMB基質を加えることによって現像した。免疫スポットリーダー、すなわちCTL S5 UVアナライザー(セルラーテクノロジー・リミテッド(Cellular Technology Limited)、シェーカーハイツ、OH、USA)を用いて、生のスポットカウントを記録した。スポット数が百万PBMC当りバックグラウンドより50を超えて多く、かつバックグラウンドの少なくとも2倍であるとき、その応答を陽性とみなした。各ペプチドの3つ組の平均スポット数を負の対照ウェルの平均スポット数で割ることによって、ELISpot SIを定めた。
約3×106のPBMCを、0.5μg/mlの抗CD49dおよび抗CD28抗体(BDファーミンゲン)(BDバイオサイエンシズ(BD Biosciences)、サンホゼ(San Jose)、CA、USA)の存在下で8日間にわたり、10μg/mlの個々のペプチドもしくはプールされたペプチド、または負の対照としての0.2%DMSOを有する培地によって刺激した。3日目および6日目にIL−2(10ng/ml)を加えた。8日目に、PBMCを10μg/mlの対応ペプチドまたは負の対照によって24時間再刺激した。9日目に細胞を集めて洗浄し、フローサイトメトリ分析の準備をした。
上述の観察をH7N9感染および/またはワクチン接種とより特定的に関係付けるために、2つのペプチドプールによって同じ実験を行った(図13)。第1のプールは、10から20のヤヌスマトリクス・デルタ値を有するH7N9 ICSペプチドを含んだ(H7N9−4から−12)。第2のプールは、20より高いヤヌスマトリクス・デルタ値を有するペプチドを含んだ(H7N9−13から−14B)。第1のプールには第2のプールよりも多くのペプチドがあったため、体積単位当たりの合計が同じになるようにプール濃度を等しくした。最もヒトに近いH7N9ペプチドからなる第2のプールのSIは、第1のプールよりも有意に低かった(p<0.05)。これらの結果は5人のドナーの平均応答を反映する。ペプチドは、それらの循環するIAVとの類似性、ヒト配列との交差保存、または自己抗原としての状態に基づくそれらの予測される免疫学的特性に従うグループにプールされ、その結果はプール内の個々のペプチドに対して観察されたものと一致した。
加えて、ペプチドが健康なドナーのPBMCにおいてTregを拡張する能力について、ペプチドを個別にテストした。20より大きいヤヌスマトリクス・デルタ値を有する3つのペプチドはすべて、インビトロで培地よりも有意に高い割合のCD3+CD4+FoxP3+T細胞の拡張を誘導した(n=3)(図14B、p<0.05)。並行して行ったアッセイにおけるCD25+FoxP3+およびCD39+FoxP3+Tregの頻度にも同様の傾向が観察されたが、CD39+FoxP3+頻度の増加のみが統計学的に有意であった。プールされたインフルエンザAエピトープは、インビトロでCD25+FoxP3+およびCD39+FoxP3+T細胞の類似の拡張を誘導しなかった(n=9)。
公知のHLA乱交雑およびヒトTCRシグネチャを有するペプチドは、自然感染またはワクチン接種において起こり得る隣接炎症応答に対して制御効果を及ぼし得るかどうかを定めるために、バイスタンダー抑制実験を行った。ヤヌスマトリクス・デルタ値21.85を有する季節性インフルエンザHA免疫優性エピトープのH7相同体であるペプチドH7N9−13の存在下または不在下で、正常な対象のPBMCをH7N9 ICSペプチドのプール(H7N9−1、−2、−9、および−13を除くすべてを含む)によって刺激した。H7N9−13の添加によってプールが希釈されないことを確実にするために、両方の培養物が同じ絶対濃度のプールされたペプチドを有し、H7N9−13の添加が唯一の変数となるように、濃度を調整した。H7N9−13との共インキュベーションは、プールされたペプチドに対するT細胞応答を有意に抑制した(n=7)(図15A、p<0.01)。これに対し、H7N9−13ほどヒトゲノムとの交差保存がないペプチドH7N9−9との共インキュベーションは、H7N9エピトープのプールに対するT細胞応答を抑制せず(n=4)(図15B)、H7N9−13の免疫抑制活性はペプチド特異的であることを示唆した。
グラフパッドプリズム(Graphpad Prism)(グラフパッドソフトウェア社(GraphPad Software、Inc.)、ラホーヤ、CA、USA)またはマイクロソフトエクセル(Microsoft Excel)(マイクロソフト社(Microsoft Corporation)、レドモンド(Redmond)、WA、USA)を用いて、p値および統計的有意性を定めるためのテストを行った。ヤヌスマトリクス・デルタとSIとを相関させるときに、ピアソン関数を用いてRを定めた。スチューデントt検定を用いて、対応または独立のT細胞反応性値の統計的有意性を算出した。
6〜8週齢の6匹の雌HLA DR3トランスジェニックマウスのグループを筋肉内刺激し、その4週間後に、野生型赤血球凝集素(図3)と、ノイラミニダーゼと、マトリックスタンパク質とで構成されるA/上海/2/2013(H7N9)ウイルス様粒子か、またはクラスタ321を操作したA/上海/2/2013(H7N9)赤血球凝集素(図2)とともに調合された同じノイラミニダーゼと、マトリックスタンパク質とで構成されるウイルス様粒子のいずれかによって追加免疫した。インフルエンザマトリックスタンパク質(M1)、ノイラミニダーゼ、赤血球凝集素または操作された赤血球凝集素を発現するプラスミドで一過的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞培養物発現系(HEK 293T細胞)において、ウイルス様粒子を生成した。細胞培養上清を集め、超遠心分離によってVLPを精製した。HA含有量に従うワクチン用量は、タンパク質濃度に基づくものであった。用量当り0.12μg(低)、0.6μg(中)、または3μg(高)のいずれかのHAによってマウスを免疫化した。野生型および操作免疫原の両方をイムジェクトアラム(Imject Alum)アジュバントと共調合した。赤血球凝集阻害アッセイによる中和抗体活性の測定のために、各免疫化の前および追加免疫化の4週間後に血清を集めた。クラスタ321操作A/上海/2/2013ウイルス様粒子ワクチンによって免疫化したマウスは、防御レベルの赤血球凝集阻害抗体を発達させ、H7−HAの改変は中和エピトープを保存したことを示唆した。加えて、クラスタ321操作A/上海/2/2013ウイルス様粒子ワクチンは、野生型ウイルス様粒子ワクチンよりも早く、かつ低い用量で赤血球凝集阻害抗体を産生した(図16)。
ウマ赤血球の凝集を阻害できるHAに対する機能性抗体を評価するために、HAI(Hemagglutination Inhibition)アッセイを用いた。CDC研究室に基づくインフルエンザ調査マニュアルからプロトコルを適応させた。非特異的阻害剤を不活性化するために、テストの前に血清を受容体破壊酵素(RDE:receptor destroying enzyme)(デンカ生研株式会社(Denka Seiken、Co.)、東京(Tokyo)、JP)で処理した。1部の血清に3部のRDEを加え、37℃にて一晩インキュベートした。56℃にて約30分間インキュベートすることによって、RDEを不活性化した。RDE処理血清をv底マイクロタイタープレートにおいて2倍段階希釈した。約8HAU/50μLに調整した等体積のリアソータントウイルスを各ウェルに加えた。リアソータントウイルスは、マウス適応株A/プエルトリコ(Puerto Rico)/8/1934の内部遺伝子と、A/上海/2/2013の表面タンパク質HAおよびNAとを含んだ。プレートに蓋をして、室温にて20分間インキュベートした後、1%ウマ赤血球(HRBC)(ランパイアバイオロジカルス(Lampire Biologicals)、パイパーズビル(Pipersville)、PA、USA)のPBS溶液を加えた。赤血球を4℃にて保存し、調製から72時間以内に使用した。撹拌によってプレートを混合し、蓋をし、室温にて1時間RBCを沈降させた。非凝集RBCを含有する最終ウェルの相互希釈度によって、HAI力価を定めた。各プレートに対して、正および負の血清対照が含まれた。
Claims (14)
- 配列番号2の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドであって、前記フラグメントは配列番号3を含むことを条件とする、ポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項2に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項3に記載のベクターを含む細胞。
- 配列番号2の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含む1つまたはそれ以上のポリペプチドを含むワクチンであって、前記フラグメントは配列番号3を含むことを条件とする、ワクチン。
- アジュバントをさらに含む、請求項5に記載のワクチン。
- 配列番号2の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含む1つまたはそれ以上のポリペプチドを含む組成物であって、前記フラグメントは配列番号3を含むことを条件とする、組成物。
- 必要とする対象におけるインフルエンザに対するワクチンを接種するための組成物であって、配列番号2の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含む1つまたはそれ以上のポリペプチドを含み、前記フラグメントは配列番号3を含むことを条件とする、組成物。
- 前記組成物はアジュバントをさらに含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記インフルエンザはトリ起源H7N9インフルエンザである、請求項8に記載の組成物。
- 必要とする対象における抗H7抗体応答を増強するための組成物であって、配列番号2の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含む1つまたはそれ以上のポリペプチドを含み、前記フラグメントは配列番号3を含むことを条件とする、組成物。
- 前記組成物はアジュバントをさらに含む、請求項11に記載の組成物。
- 対象における抗H7抗体応答を増強するためのキットであって、配列番号2のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む1つまたはそれ以上のポリペプチドを含み、前記フラグメントは配列番号3を含むことを条件とする、キット。
- アジュバントをさらに含む、請求項13に記載のキット。
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