JP5788676B2 - デングウイルスの複数のサブタイプに対する新規ワクチン - Google Patents
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Description
本出願は、2008年1月11日出願の米国仮出願第61/020,490号の利益を請求し、その全文を参照することにより本明細書に組み込む。
本明細書で使用するとき、ヌクレオチド及びアミノ酸の配列相同性は、FASTA、BLAST、及びGapped BLAST(Altschul et al.,Nuc.Acids Res.,1997,25,3389、この全文は参照することにより本明細書に組み込まれる)、及びPAUP* 4.0b10ソフトウェア(D.L.Swofford,Sinauer Associates,Massachusetts)を用いて決定することができる。簡潔に述べると、BLASTアルゴリズム(Basic Local Alignment Search Toolの略語である)は、配列の類似性を決定するのに好適である(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403−410、この全文は参照することにより本明細書に組み込まれる)。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)を通して公的に入手可能である。BLASTアルゴリズムにより提供される1つの類似性の尺度は、最小合計確率(smallest sum probability)(P(N))であり、これは2つのヌクレオチド配列間の一致が偶発する可能性の指標を提供する。例えば、試験核酸と他の核酸との比較における最小合計確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は別の核酸に類似しているとみなされる。「類似性の百分率」は、PAUP* 4.0b10ソフトウェア(D.L.Swofford,Sinauer Associates,Massachusetts)を用いて計算することができる。共通配列の平均類似性は、系統樹中の全ての配列を比較して計算される。
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質、及びタンパク質をそれに対して免疫反応が誘発され得る免疫原として特に有効にするエピトープを有するタンパク質をコード化する遺伝子コンストラクトを提供することにより、改善されたワクチンを提供する。したがって、ワクチンは、治療的又は予防的免疫反応を誘導するために提供できる。
標本抽出バイアスを避けるために、GeneBankから、異なる地理的集団のおよそ15種のサブタイプ配列を収集した。用いた配列は全て非組み換えであった。デングエンベロープ(デングE)DIII配列の多重配列比較を、アプリケーションClustal X(バージョン1.81)を用いて実行し、ここでペアワイズ配列比較パラメータは、ギャップ開始ペナルティ(gap opening penalty)として10、ギャップ伸長ペナルティ(gap extension penalty)として0.1を用いて、動的な、時間はかかるが正確なプログラミング(dynamic slow-accurate programming)に設定した。多重配列比較パラメータは、0.2に等しいギャップ伸長ペナルティを含んでいた。多重配列比較を実施し、手動でいくつかの軽微な調整を行った後、デングE共通ヌクレオチド配列を得た。推定アミノ酸配列を用いて、コドン間に挿入されるように配列比較ギャップの導入を導いた。コドンの最適化及びRNAの最適化を、GeneOptimizer(GENEART,Germany)を用いて実施した。コドンを最適化した合成配列をさらに、pVAXの哺乳類発現プラスミドのKpnI/PstI部位にクローニングした。
ヒトスジシマカC6/36細胞、Vero、HEK293、HeLa、RD、及びBHK細胞を、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から入手した。C6/36細胞を、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリンG(100U/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)、L−グルタミン、及び非必須アミノ酸を添加したイーグル最小必須培地(EMEM;Gibco BRL)中にて、5%CO2、28℃で維持した。Vero細胞を、10%の熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリンG(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/mL)、L−グルタミン、及び非必須アミノ酸を添加した、115mMのHEPES緩衝液を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)−F12(Gibco BRL)中にて、5%CO2、37℃で維持した。HEK293、HeLa、及びRD細胞を、10%の熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリンG(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/mL)を添加した、DMEM培地中にて、5%CO2、37℃で維持した。
4種のデング血清型全てのDIIIドメインを表すエンベロープ領域(295〜415)は、コード化DIIIドメインを含むpQEベクターを用いて形質転換することにより大腸菌内で発現させた。デングE−DIIIの予測される大きさは約16kDaである。細菌溶菌液のSDS−PAGE(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)は、(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド)IPTG−誘導性大腸菌培養物内で、予想された大きさのタンパク質が過剰発現したことを示した。IPTGは、ベータ−ラクトシダーゼの活性を誘導するために、アロラクトースの分子擬態として一般的に用いられている。さらに、Ni−カラム(ポリヒスチジンでタグ付けされた組み換えタンパク質に結合する能力を有するNiでキレート化されたカラム)で溶出された画分に見られるタンパク質のバンドの出現は、IPTG処理された溶菌液を含むカラム中に見られる目立つバンドの移動度に一致する。未処理及びIPTG処理されたサンプルの両方の、pQE−ベクターを形質転換したサンプルの溶菌液(図8、最初の2つのレーン)は、DIIIドメインに一致するタンパク質バンドを示さなかった。この結果は、精製されたタンパク質が、IPTGにより誘導したとき、pQEベクター発現コンストラクトから発現したデングDIIIドメインであることを裏付ける。
図9に示したスケジュールにしたがって、マウスをプラスミドDNAコンストラクト(上記実施例1に記載)で免疫した。
DV−U−DIII血清を、デング−2に感染した細胞に対して、抗DIII血清がデング−2ウイルスに反応できるかどうかを見るために試験した。天然では、DIIIドメインは、該ウイルスの外表面上のデングEの三次元立体構造のピーク領域に位置すると考えられる。
DENV1、−2、−3、及び−4感染性の、pDV−U−DIII又は予め免疫した血清(対照)に対して産生された血清の中和能力を、プラーク中和アッセイを用いて決定した。プラーク還元中和試験を、Russel et al(A Plaque Reduction Test for Dengue Virus Neutralizing Antibodies. 1967. p.285−290)、Kochel,T.J.,et al.(Effect of dengue−1 antibodies on American dengue−2 viral infection and dengue haemorrhagic fever. The Lancet, 2002. 360(9329):p.310−312)、及びWu,S.−J.L.,et al.(Detection of Dengue Viral RNA Using a Nucleic Acid Sequence−Based Amplification Assay.2001.p.2794−2798)のプロトコルを修正したものを用いて実施した。
DIII−DNAを接種したマウスのマウス脾臓を調製して、DIIIタンパク質に対する抗体を産生することができるB細胞の頻度を測定した。
アカゲザルに、pDV−U−DIIIデング発現コンストラクトを接種することができる。3度の追加免疫後、抗体力価を評価し、サルを4種全てのデングウイルス血清型を用いて抗原曝露することができる。
Claims (26)
- デングDIIIドメインポリペプチドを発現するコード化ヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドが4種の異なるデングウイルスサブタイプに由来するDIIIドメインを含む配列と、
哺乳類内における前記ポリペプチドの発現を調節し、前記コード化ヌクレオチド配列に機能的に連結するプロモータと、
を含む、哺乳類内でデングウイルスの4種全てのサブタイプに対する免疫反応を誘発するポリペプチドを発現させることができ、ここで、前記コード化ヌクレオチド配列が配列番号5で表されるものである、核酸コンストラクト。 - 前記コード配列のN−末端に機能的に連結し、前記プロモータに機能的に連結するIgEリーダー配列をさらに含む、請求項1に記載の核酸コンストラクト。
- 前記コード配列のC−末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含む、請求項1又は2に記載の核酸コンストラクト。
- 前記核酸コンストラクトのコドンが最適化されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
- 哺乳類内で免疫反応を誘発するのに有効な量の共通デング抗原を哺乳類の細胞内で発現させることができるDNAプラスミドであって、前記共通デング抗原が、デングウイルス−サブタイプ1、デングウイルス−サブタイプ2、デングウイルス−サブタイプ3、若しくはデングウイルス−サブタイプ4の共通DIIIドメイン、又はこれらの組み合わせを含むDNAプラスミドと、
製薬上許容できる賦形剤と、
を含む、哺乳類内で複数のデングウイルスサブタイプに対する免疫反応を生じさせることができるDNAプラスミドワクチンであって、
前記DNAプラスミドが、前記共通デング抗原をコード化するコード配列に機能的に連結するプロモータを含み、前記共通DIIIドメインが配列番号10で表される配列から成る、DNAプラスミドワクチン。 - 前記DNAプラスミドが、前記コード配列のN−末端に結合し、前記プロモータに機能的に連結するIgEリーダー配列をさらに含む、請求項5に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記DNAプラスミドワクチンが、前記コード配列のC−末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含む、請求項5又は6に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記DNAプラスミドのコドンが最適化されている、請求項5〜7のいずれか一項に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記製薬上許容できる賦形剤がアジュバントである、請求項5〜8のいずれか一項に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記アジュバントが、IL−12及びIL−15から成る群から選択される、請求項9に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記製薬上許容できる賦形剤がトランスフェクション促進剤である、請求項5〜8のいずれか一項に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記トランスフェクション促進剤が、ポリアニオン、ポリカチオン、又は脂質である、請求項11に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記トランスフェクション促進剤が、6mg/mL未満の濃度のポリ−L−グルタミン酸である、請求項11に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記DNAプラスミドワクチンが、1mg/mL以上の全DNAプラスミド濃度を有する、請求項5〜13のいずれか一項に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記DNAプラスミドが複数の独特なDNAプラスミドを含み、前記複数の独特なDNAプラスミドのそれぞれが、デングウイルス−サブタイプ1、デングウイルス−サブタイプ2、デングウイルス−サブタイプ3、若しくはデングウイルス−サブタイプ4、又はこれらの組み合わせに由来するDIIIドメインを含むポリペプチドをコード化している、請求項5〜14のいずれか一項に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記コード化ヌクレオチド配列が配列番号5を含む、請求項15に記載のDNAプラスミドワクチン。
- デングウイルスDIIIドメインを発現する少なくとも2種の異なるDNAプラスミドを含む、請求項16に記載のDNAプラスミドワクチンであって、前記プラスミドが、
共通デングウイルス−サブタイプ1 DIIIドメインをコード化する配列を含むDNAプラスミド、
共通デングウイルス−サブタイプ2 DIIIドメインをコード化する配列を含むDNAプラスミド、
共通デングウイルス−サブタイプ3 DIIIドメインをコード化する配列を含むDNAプラスミド、及び
共通デングウイルス−サブタイプ4 DIIIドメインをコード化する配列を含むDNAプラスミド、
から成る群から選択される、DNAプラスミドワクチン。 - 共通デングウイルス−サブタイプ1 DIIIドメインをコード化する配列を含むDNAプラスミド、
共通デングウイルス−サブタイプ2 DIIIドメインをコード化する配列を含むDNAプラスミド、
共通デングウイルス−サブタイプ3 DIIIドメインをコード化する配列を含むDNAプラスミド、及び
共通デングウイルス−サブタイプ4 DIIIドメインをコード化する配列を含むDNAプラスミド、
を含む、請求項17に記載のDNAプラスミドワクチン。 - 前記共通デングウイルス−サブタイプ1 DIIIドメインが配列番号1である、請求項17に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記共通デングウイルス−サブタイプ2 DIIIドメインが配列番号2である、請求項17に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記共通デングウイルス−サブタイプ3 DIIIドメインが配列番号3である、請求項17に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記共通デングウイルス−サブタイプ4 DIIIドメインが配列番号4である、請求項17に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記哺乳類がヒト以外の霊長類である、請求項5〜22のいずれか一項に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記免疫反応が体液性反応である、請求項5〜23のいずれか一項に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記免疫反応が細胞性反応である、請求項5〜23のいずれか一項に記載のDNAプラスミドワクチン。
- 前記免疫反応が、体液性反応と細胞性反応との組み合わせである、請求項5〜23のいずれか一項に記載のDNAプラスミドワクチン。
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