JP2022541200A - Ｃｄ３８に特異性を有する抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明において、発明者らは、二重特異性抗体及びＣＡＲ－Ｔ細胞の作製に適し得るＣＤ３８に対する新しい抗体を作製した。特に、本発明者らは、ＭＭ細胞のＣＤ３８を標的とするとともにＣＤ３εを介して細胞傷害性Ｔ細胞を動員する新しい二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、Ｂｉ３８－３の開発を報告している。Ｂｉ３８－３は、抵抗プロセスに寄与する自然のｍＡｂのＦｃ領域を有しないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖し、サイトカインを放出し、ＣＤ３８陽性ＭＭ細胞を溶解するようにＴ細胞を誘発した。同様に、Ｂｉ３８－３は、診断時及び再発時の両方におけるＭＭ患者から単離した腫瘍形質細胞を排除するように自家Ｔ細胞を誘導した。Ｂｉ３８－３によって誘発された細胞傷害性は、高レベルのＣＤ３８を発現する細胞に限定され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴリンパ球、Ｂリンパ球、及びＮＫリンパ球の完全性を維持した。【選択図】図３

Description

本発明は、医学の分野のものであり、特に腫瘍学の分野のものである。

ＣＤ３８はタイプＩＩ膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ３８の機能は、接着及びシグナリング事象における受容体媒介と酵素活性との両方を含む。ＣＤ３８は通常、造血細胞、及び固形組織に見受けられる。造血細胞について、胸腺髄質細胞の大多数がＣＤ３８^＋であり、休止及び循環するＴ細胞及びＢ細胞がＣＤ３８^－であり、活性化細胞がＣＤ３８^＋である。また、ＣＤ３８は、休止ＮＫ細胞及び単球の約８０％、及びリンパ節の胚中心のリンパ芽球、プラズマＢ細胞、及び一部の濾胞内細胞において発現される。また、ＣＤ３８は、樹状細胞にも発現することができる。高い比率の正常な骨髄細胞、特に前駆細胞がＣＤ３８を発現する。さらに、５０～８０％の臍帯血細胞がＣＤ３８^＋であり、ヒト血液において、生涯における最初の２～３年間そのようになる。ＣＤ３８はまた、リンパ球系前駆細胞に加え、赤血球及び血小板において発現される。固形組織について、ＣＤ３８は、上皮内細胞及び粘膜固有層のリンパ球によって腸に、プルキンエ細胞及び神経原線維変化によって脳に、上皮細胞によって前立腺に、β細胞によって膵臓に、破骨細胞によって骨に、網膜細胞によって目に、平滑筋及び横紋筋の筋細胞膜に発現する。

また、ＣＤ３８は、多発性骨髄腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性／骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、ＮＫ細胞性白血病、及び形質細胞性白血病を含む多様な悪性の血液疾患にも発現する。例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）は、単クローン性免疫グロブリンを分泌する腫瘍形質細胞が患者の骨髄において蓄積することや溶骨性病変によって特徴づけられる、不均一性の血液悪性腫瘍である^１。現行の処置は、全生存期間中央値を約６年に引き上げており、近年におけるエロツズマブ（抗ＳＬＡＭＦ７）及びダラツムマブ（抗ＣＤ３８）などのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発により予後がさらに改善している^２－４。しかしながら、プロテアソーム阻害剤（ＰＩ）、免疫調節剤（ＩＭＩＤ）、及びｍＡｂ処置後に疾患が再発した患者の全生存期間は未だ極めて不良であり、ＭＭは不治の疾患となっている。このように、患者の治療を改善し、最終的に根治的処置を開発するため、新たな治療の方策が必要とされている。

いくつかの抗ＣＤ３８抗体が、文献、例えば非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３に記載されている。例えば、特許文献１は、いくつかのヒト抗ＣＤ３８抗体を記載している。

国際公開第２００６／０９９８７５号

Ｌａｎｄｅ Ｒ等、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２０（１）、３０－８（２００２） Ａｕｓｉｅｌｌｏ Ｃ Ｍ等、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．５６（６）、５３９－４７（２０００）、 Ｃｏｔｎｅｒ Ｔ等、Ｉｎｔ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３（３）、２５５－６８（１９８１）

特許請求の範囲によって規定されるように、本発明はＣＤ３８に特異性を有する抗体及びその使用に関する。

図１は、患者のＭＭ腫瘍細胞におけるＢｉ３８－３の用量依存性自家Ｔ細胞媒介の溶解を示す。ＣＤ１３８＋形質細胞を患者の骨髄から精製し、ＰＢＭＣから単離した自家ＣＤ３＋Ｔ細胞と、５：１のＥ：Ｔ細胞比で２４時間共培養した。培養物を、ＦＡＣＳによって分析して、生存ゲートに入るＣＤ１３８＋細胞の数をモニタリングした。診断時における４人の異なる患者及び再発時における３人の異なる患者において生存ＣＤ１３８＋細胞のパーセンテージ（未処置条件に対して）を示すトリプリケートの実験の平均を示す。ヒストグラムは、診断時における５人の同じ患者（上部）及び再発時における３人の同じ患者（下部）の腫瘍形質細胞におけるＢｉ３８－３単独、Ｔ細胞単独、及びＢｉ３８－３（１００ｎｇ／ｍＬ）とＴ細胞の平均作用を示す。標準偏差を示し、ｐ値をスチューデントのｔ検定により算出した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図２は、ＭＭ１．Ｓｌｕｃ異種移植マウスモデルにおけるＢｉ３８－３のｉｎ ｖｉｖｏの活性を示す。Ａ．処置スケジュール。ＮＳＧマウスに５．１０^６のＭＭ１．ＳＬｕｃ細胞を接種（静脈内）し、すべてのマウスに同様のレベルのルシフェラーゼ発現ＭＭ細胞が検出された１３日目に、処置を開始した。精製したＴ細胞（５．１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を、Ｂｉ３８－３又はＰＢＳと共に静脈内に注入した（青色矢印）。Ｂｉ３８－３の静脈内注射（０．１ｍｇ／Ｋｇ）を、９日間毎日繰り返した（黒色矢印）。ルシフェラーゼ活性を、腫瘍注射の７、１１、１３、１５、１８、及び２１（又は２２）日後にＩＶＩＳイメージングシステムで測定した（赤色矢印）。Ｂ．骨髄腫進行／退縮を評価するための連続生物発光イメージング。放射度をマウス全身において測定した。左側のイメージは、ＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞の接種の７日後かつ処置開始の前における発光を示す。右側のイメージは、ＭＭ．１Ｓ細胞の接種の１８日後かつＢｉ３８－３（上部パネル）又はビヒクル（下部パネル）での処置の４日後を示す。放射カラースケールは右側に示す。Ｃ．ビヒクル（青色線）及びＢｉ３８－３（赤色線）で処置したマウスの長手方向放射レベル。２人の別個のドナーのＴ細胞を接種した群につき９匹のマウスを示す。ｐ値をスチューデントのｔ検定により２２日目に算出した（＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図３は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す。Ａ．様々なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び共刺激受容体（ＣＣＲ）の構造の模式図。第１世代（１Ｇ）ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナリングドメインを含み、第３世代ＣＡＲ（３Ｇ）は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ｚシグナリングドメインを含む。ＣＣＲは、ＣＤ２８及び４－１ＢＢシグナリングドメインを含むが、ＣＤ３ζドメインを有しない。ＣＡＲ Ｍｏｃｋは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ領域を有しない。Ｂ．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ３８発現ＭＭ（ＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６）及びＣＤ３８陰性線維芽細胞（ＨＥＫ２９３）細胞株における様々なＣＡＲ－Ｔの細胞傷害活性。ルシフェラーゼを発現する細胞を、上述のＣＡＲ－Ｔ細胞と、種々のエフェクター／標的比（Ｅ：Ｔ）において２０時間培養した。細胞傷害活性を、培養物におけるルシフェラーゼレベルを測定することによって判定した。４つの独立実験を示す。 図４は、Ｂｉ３８－３に対する血液細胞及び骨髄造血前駆細胞の感受性を示す。Ａ．Ｔｒｅｇ対ＭＭ１．Ｓ細胞における相対的なＢｉ３８－３媒介のＴ細胞溶解。健康なドナーからの精製したＴ細胞（ｎ＝３）を、ＭＭ１．Ｓ細胞の存在下で、Ｂｉ３８－３の濃度を増加させて、２４時間共培養した。Ｂ．ＣＤ３４＋骨髄造血前駆細胞対ＭＭ１．Ｓ細胞における相対的なＢｉ３８－３媒介のＴ細胞溶解。健康なドナー（股関節手術）の骨髄から精製した、対にしたＣＤ３４＋造血前駆細胞及びＴ細胞（ｎ＝４）を、ＭＭ１．Ｓ細胞の存在下で、Ｂｉ３８－３の濃度を増加させて、２４時間共培養した。生存ＣＤ２０＋（Ｂ細胞）、ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ細胞）、ＣＤ３４＋（造血前駆細胞）、及びＣＤ１３８＋（ＭＭ１．Ｓ細胞）の数を、カウントビーズを使用してＦＡＣＳによって算出し、それぞれ未処理のコントロールに対する比として表した。ヒストグラムは、各Ｂｉ３８－３濃度におけるＢ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ３４＋造血前駆細胞、及びＭＭ．１Ｓ細胞の比を示し、エラーバーはＳＤを示す。ＣＤ３４＋個体群の正規性を、シャピロ－ウィルクの正規化検定で定め、ｐ値を対応のないスチューデントのｔ検定により判定した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。

本発明者等は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＤ３８陽性ＭＭ細胞の特異的なＴ細胞媒介の溶解を誘発する、新しい抗ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体を開発した。この新しい抗ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体であるＢｉ３８－３により媒介される、ＭＭ細胞のＴ細胞による殺傷は、治療用抗体のＦｃγＲへの結合に関連する抗ＣＤ３８ｍＡｂ（ＭＭの処置に承認された抗ＣＤ３８ｍａｂのダラツムマブなど）に対する抵抗の機序に影響されないと考えられる。本発明者等は、Ｂｉ３８－３が、同様の効果で診断時及び再発時における患者の腫瘍形質細胞の自家Ｔ細胞媒介の殺傷を媒介することを示した。さらに、発明者等は、Ｂｉ３８－３が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞に有意な作用を有さず、Ｂ細胞をＴ細胞の細胞傷害活性から保護しながら、ＭＭ細胞のＴ細胞媒介の殺傷を即座に誘発するということを示した。発明者等は、Ｂｉ３８－３が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてわずか３日で腫瘍負荷の６倍低下を誘発できることを示した。このように、本発明者等は、Ｂｉ３８－３がＭＭの処置において選択的且つ効果的な化合物であり、現場の最前線と再発との両方に使用でき得、ＭＭ患者におけるさらなる評価を支援し得ることを示した。

（主な定義）
本明細書において使用するとき、「ＣＤ３８」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ／サイクリックＡＤＰ－リボースヒドロラーゼ１を指す。ＣＤ３８の例のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＣＤ３８の細胞外ドメインは、配列番号１における４３番目のアミノ酸残基から３００番目のアミノ酸残基の範囲である。
配列番号１ ＞ｓｐ｜Ｐ２８９０７｜ＣＤ３８＿ＨＵＭＡＮ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ／ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ １ ＯＳ＝Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＣＤ３８ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２
ＭＡＮＣＥＦＳＰＶＳＧＤＫＰＣＣＲＬＳＲＲＡＱＬＣＬＧＶＳＩＬＶＬＩＬＶＶＶＬＡＶＶＶＰＲＷＲＱＱＷＳＧＰＧＴＴＫＲＦＰＥＴＶＬＡＲＣＶＫＹＴＥＩＨＰＥＭＲＨＶＤＣＱＳＶＷＤＡＦＫＧＡＦＩＳＫＨＰＣＮＩＴＥＥＤＹＱＰＬＭＫＬＧＴＱＴＶＰＣＮＫＩＬＬＷＳＲＩＫＤＬＡＨＱＦＴＱＶＱＲＤＭＦＴＬＥＤＴＬＬＧＹＬＡＤＤＬＴＷＣＧＥＦＮＴＳＫＩＮＹＱＳＣＰＤＷＲＫＤＣＳＮＮＰＶＳＶＦＷＫＴＶＳＲＲＦＡＥＡＡＣＤＶＶＨＶＭＬＮＧＳＲＳＫＩＦＤＫＮＳＴＦＧＳＶＥＶＨＮＬＱＰＥＫＶＱＴＬＥＡＷＶＩＨＧＧＲＥＤＳＲＤＬＣＱＤＰＴＩＫＥＬＥＳＩＩＳＫＲＮＩＱＦＳＣＫＮＩＹＲＰＤＫＦＬＱＣＶＫＮＰＥＤＳＳＣＴＳＥＩ

本明細書において使用するとき、「ＣＤ３」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）及びまたヘルパーＴ細胞の両方の活性化を促す、ＣＤ３（表面抗原分類３）Ｔ細胞共受容体を指す。これはタンパク質複合体からなり、４つの特定の鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖（ゼータ鎖）に会合して、Ｔリンパ球の活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子は共にＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３εの例のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号２における２３番目のアミノ酸残基から２０７番目のアミノ酸残基の範囲である。
配列番号２ ＞ｓｐ｜Ｐ０７７６６｜ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ ｃｈａｉｎ ＯＳ＝Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＣＤ３Ｅ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ

本明細書において使用するとき、「抗体」という用語は、このように、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すように使用し、この用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗原結合ドメインを含む抗体フラグメント、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント、バイボディ、トリボディ（それぞれ二重特異性又は三重特異性のｓｃＦｖ－Ｆａｂフュージョン）、ｓｃ－ダイアボディ、κ（λ）ボディ（ｓｃＦｖ－ＣＬフュージョン）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞を誘引するｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ直列型）、ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）、ＳＩＰ（小分子免疫タンパク質、ミニボディの一種）、ＳＭＩＰ（「小分子モジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ－Ｆｃ二量体）、ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性再標的化」）、１つ以上のＣＤＲを含む小分子抗体擬態分子などを含む。種々の抗体に基づくコンストラクト及びフラグメントを調製及び使用する技術は当該技術分野で既知である（Ｋａｂａｔ等、１９９１を参照。特に言及することによって本明細書に援用する）。ダイアボディは特に、欧州特許第４０４，０９７号及び国際公開第９３／１１１６１号にさらに記載されており、直鎖状抗体はＺａｐａｔａ等によってさらに記載されている（１９９５）。抗体は、従来技術を使用して断片化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは抗体をペプシンで処理することによって作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントはジスルフィド架橋を還元するように処理して、Ｆａｂ’フラグメントを作製することができる。パパイン消化により、Ｆａｂフラグメントを形成することができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性の抗体フラグメント、並びに他のフラグメントも、組換え技術によって合成可能である、又は化学的に合成可能である。抗体フラグメントを作製する技術は当該技術分野において既知であり、記載されている。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ等、２００６；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５；Ｌｅ Ｇａｌｌ等、２００４；Ｒｅｆｆ及びＨｅａｒｄ、２００１；Ｒｅｉｔｅｒ等、１９９６；並びにＹｏｕｎｇ等、１９９５のそれぞれが有効な抗体フラグメントの作製をさらに記載して可能にしている。

自然抗体において、２つの重鎖はジスルフィド結合により互いに結合し、それぞれの重鎖はジスルフィド結合により１つの軽鎖と結合している。ラムダ（１）とカッパ（ｋ）との２つの軽鎖の種類がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主な重鎖のクラス（又はアイソタイプ）ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥがある。それぞれの鎖は、特定の配列ドメインを含む。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）との２つのドメインを含む。重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つから４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４、これらをまとめてＣＨという）の４つ（α、δ、γ）から５つ（μ、ε）のドメインを含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）との結合などの重要な生物学的特性を与える。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に高頻度可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基で構成されている。ときとして、非高頻度可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、抗体結合部位に関与し得る、又は全ドメイン構造、つまり結合部位に影響し得る。ＣＤＲは、共にネイティブ免疫グロブリン結合部位の自然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、及びＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲを有する。ゆえに、抗原結合部位は、典型的に、重鎖及び軽鎖のＶ領域のそれぞれのＣＤＲのセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に配置されたアミノ酸配列を指す。抗体可変ドメインの残基は、従来より、Ｋａｂａｔ等によって考案されたシステムに従って番号付けされている。このシステムは、Ｋａｂａｔ等、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健福祉省、ＮＩＨ、米国（以下「Ｋａｂａｔ等」）に示されている。この番号付けシステムを本明細書に使用している。Ｋａｂａｔの残基名称は、配列番号の配列におけるアミノ酸残基の線形の番号付けに常に直接対応しているわけではない。実際の線形のアミノ酸配列は、基本の可変ドメイン構造のフレームワーク領域であっても相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても、構造成分の短縮、又は構造成分への挿入に対応して、厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも少ない又は多いアミノ酸を含み得る。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、所定の抗体おいて、抗体の配列における相同性の残基を「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けした配列とアライメントすることによって定めることができる。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うと、残基３１～３５Ｂ（ＶＨ－ＣＤＲ１）、残基５０～６５（ＶＨ－ＣＤＲ２）、及び残基９５～１０２（ＶＨ－ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うと、残基２４～３４（ＶＬ－ＣＤＲ１）、残基５０～５６（ＶＬ－ＣＤＲ２）、及び残基８９～９７（ＶＬ－ＣＤＲ３）に位置する。

本明細書において使用するとき、「ＢＢ５１抗体」という用語は、配列番号３に示すような重鎖の可変ドメイン及び配列番号４に示すような軽鎖の可変ドメインによって特徴づけられるマウス抗体を指す。
配列番号３ ＞ ＩｇＨ ＶＨ１．８７－Ｄ１．１－Ｊ１：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＱＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＤＧＤＴＲＹＴＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＮＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＲＴＴＧＡＰＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４ ＞Ｉｇｋ Ｖｋ１２．４４－Ｊｋ５：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＦＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＴＫＴＬＴＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＮＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＧＩＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ

本明細書において使用するとき、「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメント及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントを含む融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖の可変領域は、例えば合成リンカー、例えば小分子可動性ポリペプチドリンカーによって近接して結合し、一本鎖ポリペプチドとして発現することが可能であり、ｓｃＦｖは、それが由来する完全な状態の抗体の特異性を保持する。特定しない限り、本明細書において使用するとき、ｓｃＦｖは、例えばポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に対していずれの順番でもＶＬ及びＶＨの可変領域を有することができ、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含むことができる、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含むことができる。本明細書において使用するとき、「モノクローナル抗体」、「モノクローナルＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」、「ｍＡｂ」などという用語は、本明細書において使用するとき、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。

本明細書において使用するとき、「キメラ抗体」という用語は、非ヒト抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、並びにヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインを含む抗体を指す。一部の実施形態において、「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域（すなわち重鎖及び／若しくは軽鎖）若しくはそれらの一部を変化、置換、又は交換して、抗原結合部位（可変領域）が異なる若しくは変化させたクラス、エフェクター機能、及び／若しくは種の定常領域に結合する抗体分子、若しくは、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤などキメラ抗体に新たな特性を与える全面的に異なる分子、又は（ｂ）可変領域、若しくはその一部を、異なる又は変化させた抗原特異性を有する可変領域に変化、置換、又は交換した抗体分子である。また、キメラ抗体は、霊長類化抗体及び特にヒト化抗体を含む。さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見受けられない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体機能をさらに改良するためになされる。さらなる詳細について、Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）が参照される（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１－６８５５（１９８４）参照）。

本明細書において使用するとき、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体からの可変領域フレームワーク領域及び定常領域を有するが、それまでの非ヒト抗体のＣＤＲを保持する抗体を指す。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、最小の非ヒト免疫グロブリン由来の配列を含む。多くの場合、ヒト化抗体及びその抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体又は抗体フラグメント）であり得る。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入したＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見受けられない残基を含むことができる。そうした抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を保持するように、しかしながら非ヒト抗体に対する免疫反応を防ぐように設計されている。これらの改変は、抗体又は抗体フラグメントの機能をさらに改良し最適化することができる。一般に、ヒト化抗体又はその抗体フラグメントは、すべて又は実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべて又は大部分のＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ及び典型的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み得る。また、ヒト化抗体又は抗体フラグメントは、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むことができる。さらなる詳細について、Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ、３２１： ５２２－５２５、１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３－３２９、１９８８；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３－５９６、１９９２が参照される。

本明細書において使用するとき、抗体が所定の抗原又はエピトープに結合するという文脈における「結合」という用語は、典型的に、例えば表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）技術によりＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器においてリガンドとして抗原及びアナライトとして抗体の可溶形態を使用して測定するとき、約１０^－６ＭのＫ_Ｄに対応する低親和性での結合である。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａａｔａｗａｙ、ＮＪ）は、モノクローナル抗体のエピトープビン群に慣例的に使用されている多様な表面プラズモン共鳴法アッセイフォーマットの１つである。典型的に、抗体は、所定の抗原と同一でない又は密接に関連しない非特異性抗体（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合におけるＫ_Ｄよりも、少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫ_Ｄに対応する親和性で、所定の抗原に結合する。抗体のＫ_Ｄが極めて低い（すなわち、抗体が高親和性を有する）と、抗体が抗原を結合するＫ_Ｄが、典型的に非特異性抗原に対するＫ_Ｄよりも少なくとも１０，０００倍低い。抗体は、そうした結合が検出できない（例えばプラズモン共鳴法（ＳＰＲ）技術を使用してＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器においてリガンドとして抗原及びアナライトとして抗体の可溶形態を使用して）、又は、その抗体及び異なる化学構造若しくはアミノ酸配列を有する抗原若しくはエピトープによって検出される結合よりも１００倍、５００倍、１０００倍、又は１０００倍を超えて少ない場合、実質的に抗原又はエピトープを結合しないといえる。

本明細書において使用するとき、「二重特異性抗体」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、２つの異なるペアの重鎖及び軽鎖、並びにまた２つの異なる抗原結合部位を有する人工のハイブリッド抗体を指す。

本明細書において使用するとき、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」又は「ＢｉＴＥ」という用語は、２つの可動的に接続した一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）から構成される組換えタンパク質コンストラクトである二重特異性抗体を指す。該ｓｃＦｖ抗体の１つは、選択した標的細胞発現腫瘍抗原に特異的に結合し、第２のものは、Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体複合体のサブユニットであるＣＤ３などの他の分子に特異的に結合する。一部の実施形態において、ＢｉＴＥ抗体は、Ｔ細胞を標的細胞に一時的に結合し、同時にＴ細胞の細胞溶解活性を活性化することができる。Ｔ細胞のＢｉＴＥ媒介活性化は、Ｔ細胞における特定のＴ細胞受容体も、標的細胞におけるＭＨＣ Ｉ分子、ペプチド抗原又は共刺激分子も必要としない。

本明細書において使用するとき、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は、ＣＡＲを発現するように遺伝子学的に操作されたＴリンパ球を指す。ＣＡＲ－Ｔ細胞の定義には、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、及びエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞などを含むＴリンパ球のすべてのクラス及びサブクラスを包含する。遺伝子学的に改変されたＴリンパ球は、遺伝子学的に改変されたＴ細胞を使用して処置を受ける対象から「由来する」又は「取得する」ことができる、又は異なる対象から「由来する」又は「取得する」ことができる。

本明細書において使用するとき、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞において、標的細胞、典型的にがん細胞に対する特異性、及び細胞内シグナル生成を細胞に与える、セットのポリペプチド、典型的に最も単純な実施形態において２つのポリペプチドを指す。一部の実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに以下に規定するような刺激分子及び／又は共刺激分子由来の機能的シグナリングドメインを含む細胞質シグナリングドメイン（本明細書において「細胞内シグナリングドメイン」とも呼ぶ）を含む。一部の態様において、セットのポリペプチドは互いに近接している。一部の実施形態において、セットのポリペプチドは、二量体化分子の存在下で、ポリペプチドを互いに結合することができる、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナリングドメインに結合することができる、二量体化スイッチを含む。一部の実施形態において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に会合したζ鎖である。一部の実施形態において、細胞質シグナリングドメインは、以下に規定するような少なくとも１つの共刺激分子由来の１つ以上の機能的シグナリングドメインをさらに含む。一部の実施形態において、共刺激分子は、本明細書に記載する共刺激分子、例えば４－１ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／又はＣＤ２８から選ばれる。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激分子由来の機能的シグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び共刺激分子由来の機能的シグナリングドメインと刺激分子由来の機能的シグナリングドメインとを含む細胞内シグナリングドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の共刺激分子由来の２つの機能的シグナリングドメインと刺激分子由来の機能的シグナリングドメインとを含む細胞内シグナリングドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の共刺激分子由来の少なくとも２つの機能的シグナリングドメインと刺激分子由来の機能的シグナリングドメインとを含む細胞内シグナリングドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）において任意のリーダー配列を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端においてリーダー配列をさらに含み、該リーダー配列は、任意で、細胞プロセス及びＣＡＲの細胞膜への局在化時に抗原結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）から切断される。特定の態様において、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン及び内部ドメインのＣＤ３－ζと融合させた、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合物を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３－ζ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／又はＯＸ４０などのさらなる共刺激シグナリングのドメインを含む。一部の実施形態において、共刺激分子、イメージングのためのレポーター遺伝子（例えば、陽電子放射断層撮影用）、プロドラッグの添加の際Ｔ細胞を条件的に除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体を含む分子を、ＣＡＲと共発現することができる。

本明細書において使用するとき、「Ｔ細胞」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、細胞媒介免疫における中心的役割を担う免疫系の重要な構成要素を表す。Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体の分子による提示又は制限により、そのＴＣＲ（抗原のＴ細胞受容体）で抗原を認識するので、一般のリンパ球として知られている。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びγδＴ細胞など、それぞれ特定の機能を有するいくつかのＴ細胞のサブセットがある。

本明細書において使用するとき、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、表面にＣＤ８を発現するＴ細胞のサブセットを指す。これらは、ＭＨＣクラスＩ限定的であり、細胞傷害性Ｔ細胞として機能する。また、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔキラー細胞、細胞溶解Ｔ細胞、又はキラーＴ細胞とも呼ばれる。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーの一員であり、主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩ限定相互作用における関連認識要素である。本明細書において使用するとき、「腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は、血流から出て腫瘍に移動した患者のＣＤ８＋Ｔ細胞のプールを指す。

本明細書において使用するとき、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」（Ｔヘルパー細胞又はＴＨ細胞とも呼ばれる）という用語は、表面にＣＤ４糖タンパク質を発現し、Ｂ細胞の形質細胞及びメモリーＢ細胞への成熟並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む免疫プロセスにおける他の白血球を支援する、Ｔ細胞を指す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示すると、活性化される。これは、活性化されると急速に分裂して、能動免疫応答を調節又は支援するサイトカインを分泌する。これらの細胞は、様々な種類の免疫応答を促進するように様々なサイトカインを分泌するＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、ＴＦＨ、又はＴｒｅｇを含むいくつかのサブタイプの１つに分化することができる。ＡＰＣからのシグナリングにより、Ｔ細胞を特定のサブタイプに誘導する。ＣＤ４に加えて、当該技術分野で既知のＴＨ細胞表面バイオマーカーは、ＣＸＣＲ３（Ｔｈ１）、ＣＣＲ４、Ｃｒｔｈ２（Ｔｈ２）、ＣＣＲ６（Ｔｈ１７）、ＣＸＣＲ５（Ｔｆｈ）、並びにサイトカイン及びＴ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＥＯＭＥＳ、ＲＯＲγＴ、ＢＣＬ６、及びＦｏｘＰ３を含む転写因子のサブタイプ特異的発現を含む。

本明細書において使用するとき、「γδＴ細胞」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有する。γδＴ細胞は通常、健康な個体（ヒト、サル）において末梢血リンパ球１～５％を占める。これは防御免疫応答の開始に関与し、抗原提示細胞のＭＨＣ分子によって提示することなく、抗原と直接相互作用することで抗原リガンドを認識するということが示されている。γ９δ２Ｔ細胞（γ２δ２Ｔ細胞と呼ばれることもある）は、可変ドメインＶγ９及びＶδ２でＴＣＲ受容体を保持するγδＴ細胞である。これは、ヒト血液におけるγδＴ細胞の大部分を構成する。γδＴ細胞は、活性化されると、種々の種類の細胞、特に病原体細胞の殺傷に効果的な、強力な非ＭＨＣ制限細胞傷害活性を示す。それは、ウイルス（Ｐｏｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，６２：１－５）又はマイコバクテリアなどの他の細胞内寄生虫（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９５，ｖｏｌ．６３，ｎｏ．１２：４６２８－４６３３）又は原虫（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９６，ｖｏｌ．６４，ｎｏ．８：２８９２－２８９６）に感染した細胞であり得る。また、それは、がん細胞であり得る（Ｐｏｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：６００９－６０１５； Ｆｏｕｒｎｉｅ ａｎｄ Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ，Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６６ｔｈ Ｆｏｒｕｍ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４７：３３８－３４７）。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて該細胞の活性を調節するという可能性により、感染疾患（特にウイルス又は寄生虫）、がん、アレルギー、及びさらに自己免疫性及び／又は炎症性障害などの種々の病態の処置における新しく効果的な治療アプローチが得られ得る。

本明細書において使用するとき、「処置」又は「処置する」という用語は、疾患にかかるリスクを有する又は疾患にかかったと疑われる患者、及び病気である又は疾患若しくは医学的状態に罹患していると診断された患者の処置を含む、予防又は抑止処置、及び根治又は疾患修飾処置の両方を指し、臨床における再発の抑制を含む。処置は、障害若しくは再発の障害の発症を抑止、治癒、遅延する、障害若しくは再発の障害の重篤度を軽くする、若しくは障害若しくは再発の障害の１つ以上の症状を改善するため、又はそうした処置が存在しない場合に予想されるものを超えて患者の生存を延長させるため、医学的障害を有する又は最終的にそうした障害に罹患し得る患者に行うことができる。「治療レジメン」は、病気の処置のパターン、例えば治療時に使用する投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、誘導レジメン及び維持レジメンを含むことができる。「誘導レジメン」又は「誘導期間」という表現は、疾患の初期の処置に使用する治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。誘導レジメンの全体的な目的は、処置レジメンの初期期間に高レベルの薬剤を患者に提供することである。誘導レジメンは、「負荷レジメン」を（部分的又は全体的に）使用することができ、これは、医師が維持レジメン時に使用し得るものより多い用量の薬剤を投与すること、医師が維持レジメン時に薬剤を投与し得るより頻回で薬剤を投与すること、又はその両方を含むことができる。「維持レジメン」又は「維持期間」という表現は、例えば患者を長期間（数か月又は数年）寛解の状態に維持するため、病気の処置時に患者のメンテナンスに使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、持続的治療（例えば、薬剤を規則的な間隔で、例えば毎週、毎月、毎年など投与すること）、又は断続的治療（例えば、中断を含む処置、断続的処置、再発における処置、若しくは所定の特定の条件［例えば疼痛、疾患の徴候など］を満たした上での処置）を使用することができる。

本明細書において使用するとき、「がん」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、自律性増殖の能力を有する、すなわち、身体の他の部分に浸潤する又は広がる可能性を有する、急速に増殖する細胞増殖によって特徴づけられる異常な状態又は病態を有する、異常な細胞を指す。この用語は、病理組織学的な侵襲度の種類又は段階とは関係なく、すべての種類のがん増殖又は発癌プロセス、転移組織又は悪性がん化細胞、組織、若しくは器官を含むことを意味する。「がん」という用語は、罹患した肺、乳房、甲状腺、リンパ球、胃腸、及び、泌尿生殖器などの種々の器官系の悪性病変、並びに、大部分の結腸がん、腎臓細胞癌、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、膠芽腫、非小細胞肺癌、小腸がん、及び食道がんなどの悪性病変を含む腺癌を、限定することなく含む。また、「がん」という用語は、固形腫瘍及び血液媒介腫瘍を、限定することなく含む。

「固形腫瘍」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、副腎皮質がん、肛門がん、胆管がん（例えば、肝門部領域がん、遠位胆管がん、肝内胆管がん）、膀胱がん、骨がん（例えば、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫、多発性骨髄腫）、脳及び中枢神経系がん（例えば、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン細胞腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳がん（例えば、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房症）、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん（例えば、子宮内膜腺癌、腺棘細胞癌、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）、食道がん、胆のうがん（粘液性腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛癌、破壊性絨毛腺癌）、カポジ肉腫、腎臓がん（例えば腎細胞がん）、咽頭及び下咽頭がん、肝臓がん（例えば血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺がん（例えば小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔がん（例えば感覚神経芽腫、正中肉芽腫）、上咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔及び中咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺がん、皮膚がん（例えば黒色腫、非黒色腫皮膚がん）、胃がん、精巣がん（例えばセミノーマ、非セミノーマ胚細胞がん）、胸腺がん、甲状腺がん（例えば濾胞性がん、未分化癌、低分化癌、甲状腺髄様癌）、膣がん、外陰がん、並びに子宮がん（例えば子宮平滑筋肉腫）からなるが、これらに限定されない群より選択される固形腫瘍を指す。

「血液媒介がん」又は「白血病」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、血液細胞のがんを指す。これは、血液細胞がつくられる骨の中心の軟部組織である骨髄で始まる。白血病では、骨髄は、正常な血液細胞を押し出す異常な細胞をつくり始める。

一部の実施形態において、がんはＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍である。

本明細書において使用するとき、「ＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍」という用語は、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫を含むＣＤ３８を発現する腫瘍細胞の存在によって特徴づけられる血液悪性腫瘍を指す。そうしたＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍の例は、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫；急性前骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病及び成熟Ｂ細胞腫瘍、例えばＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）（低悪性度、中悪性度、及び高悪性度ＦＬを含む）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴ型、節型及び脾型）、有毛細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、形質細胞腫、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、形質細胞性白血病、並びに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を含む。

一部の実施形態において、ＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である。

本明細書において使用するとき、「治療有効量」という用語は、所望の治療結果を得るため、必要な投与量及び期間において有効な量を指す。活性剤の治療有効量は、個人の病状、年齢、性別、及び体重、活性剤が個人において所望の応答を誘発できることのなどの要因に応じて変わり得る。また、治療有効量は、抗体又は抗体部分の任意の毒性又は有害な作用を治療的に有益な作用が上回るものである。活性剤の効果的な投与量及び投与レジメンは、処置する疾患又は状態によって決まり、当業者が決定することができる。当業者である医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるものよりも低いレベルで、医薬組成物中に使用する活性剤の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることができる。一般に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の投与レジメンにより治療効果を生じるのに有効な最も低い用量である化合物の量であり得る。そうした有効用量は一般に、上述の要因によって決まり得る。例えば、治療用途のための治療有効量は、疾患の進行を安定化できるというによって判定することができる。典型的に、化合物のがん抑制能は、例えば、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系で評価することができる。治療有効量の治療用化合物は、患者における腫瘍サイズを小さくする又はさもなくば症状を改善することができる。当業者は、そうした量を、患者のサイズ、患者の症状の重篤度、及び選択した特定の組成物又は投与経路などの要因に基づいて決定することができ得る。本発明の阻害剤の治療有効量の例示的で非限定的な範囲は、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５、例えば約０．３、約１、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、又は約８ｍｇ／ｋｇである。本発明の阻害剤の治療有効量の例示的で非限定的な範囲は、０．０２～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０２～３０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０５～１０ｍｇ／ｋｇ、又は０．１～３ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５～２ｍｇ／ｋｇである。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下でとすることができ、例えば標的部位の近位に投与することができる。上述の処置方法及び用途における投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単回のボーラスを投与しても、数回の分割用量を経時で投与しても、又は用量を、治療状況の緊急事態が示されれば比例的に低減若しくは増加させてもよい。一部の実施形態において、処置効力は、治療時に、例えば所定の時点でモニタリングされる。一部の実施形態において、効力は、疾患領域の可視化によって、又は本明細書にさらに記載されている他の診断方法によって、例えば、本発明の標識した阻害剤、本発明の阻害剤由来のフラグメント若しくはミニ抗体を使用して、例えば１回以上のＰＥＴ－ＣＴスキャンを行うことによってモニタリングすることができる。必要に応じて、医薬組成物の有効な１日用量は、任意で単一投与剤形で、１日を通して適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６、又はそれ以上の分割用量として投与することができる。一部の実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、任意の望ましくない副作用を最小限にするため、長時間かけて、例えば２４時間を超えて緩徐な持続注入によって投与される。本発明の阻害剤の有効用量はまた、毎週、隔週、又は３週間ごとの投薬期間を使用して投与することができる。投与期間は、例えば８週間、１２週間に、又は臨床的進行が認められるまでに限定することができる。非限定的な例として、本発明における処置は、処置開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０日目の少なくとも１日に、又はあるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週目の少なくとも１週に、又はそれを任意に組み合わせて、１日あたり約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇの量の、本発明の阻害剤の１日用量として、単回用量又は２４、１２、８、６、４、若しくは２時間毎に分割用量を使用して、又はそれを任意に組み合わせて使用して提供することができる。

（本発明の抗体）
本発明の第１の目的は、
－ （ｉ）配列番号５に示すＨ－ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号６に示すＨ－ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７に示すＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖、並びに
－ （ｉ）配列番号８に示すＬ－ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号９に示すＬ－ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０に示すＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖、を含むＣＤ３８の細胞外ドメインに結合特異性を有するモノクローナル抗体に関する。
配列番号５（Ｈ－ＣＤＲ１）：ＧＹＴＦＴＳＹＷ
配列番号６（Ｈ－ＣＤＲ２）：ＩＹＰＧＤＧＤＴ
配列番号７（Ｈ－ＣＤＲ３）：ＡＲＥＲＴＴＧＡＰＲＹＦＤＶ
配列番号８（Ｌ－ＣＤＲ１）：ＥＮＩＹＳＦ
配列番号９（Ｌ－ＣＤＲ２）：ＮＴＫ
配列番号１０（Ｌ－ＣＤＲ３）：ＱＨＨＹＧＩＰＬＴ

一部の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するＶＨドメインを含む。

一部の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するＶＬドメインを含む。

本発明において、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有するということを意味する。本発明において、第２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有するということを意味する。配列同一性は多くの場合、同一性（又は類似性若しくは相同性）の比率として判定され、その比率が高いほど２つの配列の類似性が高い。比較のための配列アライメントの方法は当該技術分野において周知である種々のプログラム及びアライメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２、１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３、１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：２４４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３：２３７－２４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１－１５３、１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ等、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：１０８８１－１０８９０、１９８８；Ｈｕａｎｇ等、Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌｓ Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１５５－１６５、１９９２；並びにＰｅａｒｓｏｎ等、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４：３０７－３１、１９９４）に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、６：１１９－１２９、１９９４には、配列アライメント法及び相同性の算出に関する詳細な考察が記載されている。一例として、アライメントツールであるＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７，１９８９）又はＬＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）を用いて配列比較を行うことができる（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，１９９６，Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ｆａｓｔａ２０ｕ６３ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ｕ６３，１９９６年１２月に公開）。ＡＬＩＧＮでは配列全体を互いに比較し、ＬＦＡＳＴＡでは局所類似性の領域を比較する。これらのアライメントツール及びそれぞれのチュートリアルは、例えばインターネット上のＮＣＳＡウェブサイトで入手可能である。あるいは、約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較には、デフォルトのパラメータ（ギャップ存在コスト１１、残基あたりのギャップコスト１）に設定したデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて、Ｂｌａｓｔ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ機能を使用することができる。短いペプチド（約３０アミノ酸より少ないもの）のアライメントを行う際には、デフォルトのパラメータ（開始ギャップペナルティ９、伸長ギャップペナルティ１）に設定したＰＡＭ３０マトリックスを用いて、Ｂｌａｓｔ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ機能を使用してアライメントを行う必要がある。ＢＬＡＳＴ配列比較システムは、例えばＮＣＢＩウェブサイトから利用可能であり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３－４１０、１９９０；Ｇｉｓｈ及びＳｔａｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、３：２６６－２７２、１９９３；Ｍａｄｄｅｎ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：１３１－１４１，１９９６；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９－３４０２、１９９７；並びにＺｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、７：６４９－６５６，１９９７も参照される。

このように、本発明は、ＢＢ５１抗体のＶＬ領域、ＶＨ領域の機能性変異体、又はＣＤＲの１つ以上の機能性変異体を含む抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体の文脈において使用されるＶＬ、ＶＨ又はＣＤＲの機能性変異体は、親抗体（すなわちＢＢ５１抗体）の親和性／結合力及び／又は特異性／選択性の少なくともかなりの比率（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上）を、抗体が依然として保持することを可能とし、場合によってはこうした本発明のモノクローナル抗体は、親Ａｂよりも高い親和性、選択性及び／又は特異性を伴い得る。そうした機能性変異体は、典型的には、親Ａｂに対する高い配列同一性を保持する。ＣＤＲ変異体の配列は、大部分の保存置換によって親抗体配列のＣＤＲの配列とは異なり得、例えば、変異体における置換の少なくとも約３５％、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上（例えば約６５～９５％、例えば約９２％、９３％、又は９４％）がアミノ酸残基の保存置換である。ＣＤＲ変異体の配列は、大部分の保存置換によって親抗体配列のＣＤＲの配列とは異なり得、例えば、変異体における置換の少なくとも１０個、例えば少なくとも９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つがアミノ酸残基の保存置換である。本発明の文脈において、保存置換は、以下のように表されるアミノ酸クラス内における置換によって定義することができる。
脂肪族残基Ｉ、Ｌ、Ｖ、及びＭ
シクロアルケニルに会合した残基Ｆ、Ｈ、Ｗ、及びＹ
疎水性残基Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹ
負荷電残基Ｄ及びＥ
極性残基Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴ
正荷電残基Ｈ、Ｋ、及びＲ
小さい残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、及びＶ
極めて小さい残基Ａ、Ｇ、及びＳ
ターンに関与する残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、及び形成に関与する残基Ｔ
可動性残基Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、及びＲ

さらなる保存置換分類は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンを含む。変異体ＣＤＲにおける疎水親水性／親水性特性及び残基の重量／サイズに関する保存も、ＢＢ５１抗体のＣＤＲと比較して実質的に保持される。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与することにおける疎水親水度アミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般に理解されている。アミノ酸の相対的な疎水親水度の特徴は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次いでタンパク質と、他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定めるということが認められている。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷の特徴に基づいて疎水親水度の指標が割り当てられている。これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタメート（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパルテート（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）である。類似の残基の保持もまた又はあるいは、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、標準的な設定のＢＬＯＳＵＭ６２、開始ギャップ＝１１及び伸長ギャップ＝１を使用してＮＣＢＩにおいて利用可能なＢＬＡＳＴ２．２．８）の使用によって決定されるような、類似性スコアによって判定することができる。適切な変異体は、典型的には、親ペプチドと少なくとも約７０％の同一性を示す。

一部の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体はキメラ抗体である。一部の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号３に示す重鎖を有するキメラ抗体である。一部の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号４に示す軽鎖を有するキメラ抗体である。一部の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号３に示す重鎖及び配列番号４に示す軽鎖を有するキメラ抗体である。

一部の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体はヒト化抗体である。

本発明のモノクローナル抗体は、上述の態様における１つ以上の機能的又は構造的な特徴により、又は、選択した機能的及び構造的な特徴の任意の組み合わせにより特徴付けることができる。

本発明の抗体は、任意のアイソタイプのものとすることができる。アイソタイプの選択は、典型的には、ＡＤＣＣ誘発などの所望のエフェクター機能によって導かれ得る。例のアイソタイプは、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域κ又はλのいずれかを使用することができる。必要に応じて、本発明のモノクローナル抗体のクラスを、既知の方法によりスイッチすることができる。典型的なクラススイッチング技術は、あるＩｇＧサブクラスを別のものに、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換するために使用することができる。このように、本発明のヒトモノクローナル抗体のエフェクター機能は、アイソタイプスイッチングにより、種々の治療的使用のために、例えばＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体に変化させることができる。一部の実施形態において、本発明の抗体は全長抗体である。一部の実施形態において、全長抗体はＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態において、全長抗体はＩｇＧ４抗体である。一部の実施形態において、ＩｇＧ４抗体は安定化したＩｇＧ４抗体である。適切な安定化したＩｇＧ４抗体の例は、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域における４０９番目のアルギニン（前述のＫａｂａｔ等のようにＥＵインデックスで示されている）がリジン、スレオニン、メチオニン、又はロイシン、好ましく、リジンで置換されている（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）抗体、及び／又は、ヒンジ領域がＣｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ配列を含む抗体である。他の適切な安定化したＩｇＧ４抗体は、国際公開第２００８／１４５１４２号に開示されており、これは言及することによってその全体が本明細書に援用される。一部の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、ＡＤＣＣなどのエフェクター機能を媒介する能力が低減され、又は更に除去されるように変異されている、非ＩｇＧ４型、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３の抗体である。こうした変異は、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦ等、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７（２）：１１２９－１１３８（２００６）、及びＨｅｚａｒｅｈ Ｍ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７５（２４）：１２１６１－１２１６８（２００１）に記載されている。

フレームワーク又はＣＤＲ領域内になされる修飾に加えて、又は、それに代えて、本発明の抗体は、典型的には、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合性、及び／又は抗原依存性細胞傷害性などの抗体の１つ以上の機能特性を改変するため、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作することができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ここでも抗体の１つ以上の機能特性を改変するため、化学的に修飾することができる（例えば、１つ以上の化学的部分を抗体に付着させることができる）、又は、そのグリコシル化を改変するように修飾することができる。例えば、本発明により提供される抗体の親和性は、当技術分野において既知の任意の適切な方法を使用して改変することができるということが理解され得る。したがって、本発明はまた、ＣＤ３８に対する親和性を向上させた本発明の抗体分子の変異体にも関する。こうした変異体は、ＣＤＲを変異させること（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２－４０３，１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９－７８３，１９９２）、Ｅ．ｃｏｌｉの変異誘発株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９－３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４－７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７－８８，１９９６）、及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８－２９１，１９９８）を含む、数多くの親和性成熟プロトコールにより得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎ等（上述参照）では、これらの親和性成熟方法を検討している。

一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するように、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより改変される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。親和性を改変したエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１コンポーネントとすることができる。このアプローチは、共にＷｉｎｔｅｒ等による米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び第５，６４８，２６０号明細書にさらに詳細に記載されている。

一部の実施形態において、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸を、抗体が改変されたＣ１ｑ結合性及び／又は低下した若しくは消失した補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、ｌｄｕｓｏｇｉｅ等による米国特許第６，１９４，５５１号明細書にさらに詳細に記載されている。

一部の実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、補体を固定する抗体の能力が改変される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ等による国際公開第９４／２９３５１号にさらに記載されている。一部の実施形態において、Ｆｃ領域が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を向上させ、及び／又は、１つ以上のアミノ酸を修飾することによりＦｃ受容体に対する抗体の親和性を向上させるように修飾される。このアプローチは、Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第００／４２０７２号にさらに記載されている。さらに、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、ＦｃｙＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１における結合部位がマッピングされており、結合性が向上した変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．等、２００１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．２７６：６５９１－６６０４、国際公開第２０１０／１０６１８０号を参照）。

一部の実施形態において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化した抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を有しない）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を向上させるように改変することができる。こうした炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することにより得ることができる例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の除去することにより、その部位におけるグリコシル化を除去する、１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。そうしたグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を向上させることができる。こうしたアプローチは、Ｃｏ等による米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳細に記載されている。さらに又はあるいは、グリコシル化の種類を改変した抗体、例えば、フコシル残基の量を少なくした低フコシル化抗体若しくはフコシル残基を有しない非フコシル化抗体、又は、二分岐ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体を作製することができる。こうした改変したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を向上させることが示されている。こうした炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を改変した宿主細胞中で抗体を発現させることにより得ることができる。グリコシル化機構を改変した細胞は、当該技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現させることにより、グリコシル化を改変した抗体を作製する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇ等による欧州特許第１，１７６，１９５号は、機能上破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を記載しており、この遺伝子は、こうした細胞株中で発現された抗体が低フコシル化を示すか又はフコシル残基を有しないように、フコシルトランスフェラーゼをコードする。したがって、一部の実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、低フコシル化又は非フコシル化パターンを示す細胞株、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の発現を欠損させた哺乳動物細胞株中での組換え発現により作製することができる。Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に付着させる能力が低下しており、その宿主細胞中で発現させた抗体の低フコシル化をももたらす変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞を記載している（Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．等、２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照）。Ｕｍａｎａ等による国際公開第９９／５４３４２号は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株を記載しており、操作された細胞株中で発現させた抗体は、抗体のＡＤＣＣ活性向上をもたらす、二分岐ＧｌｃＮａｃ構造の増大を示すようになる（Ｕｍａｎａ等、１９９９ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照）。Ｅｕｒｅｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、フコシル残基を有しない、改変した哺乳動物グリコシル化パターンを有する抗体を作製可能な、遺伝子学的に操作されたＣＨＯ哺乳動物細胞をさらに記載している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｅｋａｉｎｃ．ｃｏｍ／ａ＆ｂｏｕｔｕｓ／ｃｏｍｐａｎｙｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンに操作され、グリコシル化パターンとしてフコースを有しない抗体を作製可能な、酵母又は糸状菌中において作製することができる（例えば、欧州特許第１２９７１７２号を参照）。

一部の実施形態において、抗体は抗原結合フラグメントである。抗体フラグメントは、従来技術により、例えば、全長抗体のフラグメント化により、又は、組換え細胞中で抗体フラグメントをコードする核酸を発現することにより得ることができる（例えば、Ｅｖａｎｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８４、１２３－３８（１９９５））参照）。そして、フラグメントを、全長抗体について本明細書で記載するのと同じ方法において、その特性について試験又はスクリーニングすることができる。

一部の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、本発明の抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むｓｃＦｖフラグメントである。一部の実施形態において、本発明のｓｃＦｖフラグメントは、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる。
配列番号１１； ＞ ｓｃＦｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＦＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＴＫＴＬＴＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＮＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＧＩＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＱＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＤＧＤＴＲＹＴＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＮＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＲＴＴＧＡＰＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ

（本発明の抗体を作製するための核酸分子及びその使用）
本発明のモノクローナル抗体は、以下のものに限られないが、単独又は組み合わせの、任意の化学的、生物学的、遺伝学的、又は酵素学的技術など、当該技術分野において既知の任意の技術により作製することができる。例えば、所望の配列のアミノ酸配列を知ることで、当業者は、ポリペプチドの作製のための標準的方法により該抗体を容易に作製できる。例えば、これは、既知の固相法を使用して、好ましくは市販のペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより製造されているものなど）を使用して、製造者の説明書に従って合成することができる。あるいは、本発明の抗体は、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。例えば、抗体は、発現ベクターに抗体をコードするＤＮＡ配列を組み込み、及び所望の抗体を発現し得、後に既知の方法を使用して抗体を単離することができる適切な真核又は原核の宿主にそうしたベクターを導入した後に、ＤＮＡ発現生成物として得ることができる。

したがって、本発明のさらなる目的は、本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸配列に関する。一部の実施形態において、核酸配列は、本発明のモノクローナル抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする。

典型的に、該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、これは任意の適切なベクターに含むことができる。「ベクター」という用語は、本明細書において使用するとき、連結した他の核酸を輸送可能な核酸分子を指すように用いられる。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションし得る、円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。他の種類のベクターはウイルスベクターであり、該ベクターでは、更なるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。特定のベクターは、導入された宿主細胞において自律複製可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（非エピソーム哺乳動物ベクターなど）を、宿主細胞に導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込むことにより、宿主ゲノムと共に複製することができる。さらに、特定のベクターは、操作可能に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。そうしたベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（又は、単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術での使用における発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、互換的に使用することができる。ただし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなど）などのそうした他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。

したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。

このようなベクターは、対象への投与の際、該抗体を発現させる又は発現を誘導するため、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の調節因子を含むことができる。動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例は、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ ｅｔ ａｌ．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ ＪＯ ｅｔ ａｌ．１９８５）及びエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ｅｔ ａｌ．１９８３））等を含む。動物細胞用の任意の発現ベクターは、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入して発現させることができる限り、使用することができる。適切なベクターの例は、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．１９８１）、ｐＳＧｌβｄ２－４－（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）等を含む。プラスミドの他の例は、複製起点を含む複製プラスミド、又は例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込みプラスミド等を含む。ウイルスベクターの他の例は、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、及びＡＡＶベクターを含む。そうした組換えウイルスは、当該技術分野において既知の方法により、例えば、パッケージ細胞に遺伝子導入することにより、又は、ヘルパープラスミド若しくはウイルスを一過性遺伝子導入することにより作製することができる。ウイルスパッケージ細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等を含む。そうした複製欠損組換えウイルスを作製するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開第９５／１４７８５号、国際公開第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号明細書、米国特許第６，０１３，５１６号明細書、米国特許第４，８６１，７１９号明細書、米国特許第５，２７８，０５６号明細書、及び国際公開第９４／１９４７８号に見出すことができる。

本発明のさらなる目的は、本発明における核酸及び／又はベクターによって遺伝子導入した、感染させた、又は形質転換した宿主細胞に関する。

「形質転換」という用語は、「外来性」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ、又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することにより、宿主細胞が、導入した遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入した遺伝子又は配列によりコードされるタンパク質又は酵素を生成することを意味する。導入したＤＮＡ又はＲＮＡを受容して発現する宿主細胞は「形質転換」されている。

本発明の核酸は、適切な発現系において本発明のモノクローナル抗体を作製するために使用することができる。「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入された外来性ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための、適切な条件下における宿主細胞及び対応するベクターを意味する。一般的な発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、及び哺乳動物宿主細胞とベクターを含む。宿主細胞の他の例は、原核生物細胞（細菌など）及び真核生物細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）を限定することなく含む。具体的な例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの酵母、哺乳動物細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等)、及び、初代又は株化された哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球細胞、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から作製される）を含む。また、例としては、マウスＳＰ２／０－Ａｇｌ４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と呼ばれる）を欠損しているＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇ ｅｔ ａｌ；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１ １．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」と呼ばれる）等も含む。

また、本発明は、本発明における抗体を発現する組換え宿主細胞を作製する方法に関し、該方法は、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて、上述のような組換え核酸又はベクターをコンピテント宿主細胞に導入するステップ、（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて、得られた組換え宿主細胞を培養するステップ、及び、（ｉｉｉ）任意で、該抗体を発現し、及び／又は、分泌する細胞を選択するステップを含む。そうした組換え宿主細胞は、本発明の抗体を作製するために使用することができる。

（本発明の多特異性抗体）
本発明のさらなる目的は、本発明のモノクローナル抗体からの第１抗原結合部位と、少なくとも１つの第２抗原結合部位とを含む多特異性抗体に関する。

本発明において、本発明の多特異性抗体は、ＣＤ３８の細胞外ドメインと、目的のものの他の抗原の細胞外ドメインとに結合する。

一部の実施形態において、第２抗原結合部位は、例えば、ヒトエフェクター上の抗原を結合することによって、又は細胞傷害剤若しくは第２治療剤を結合することによって、殺傷機序を動員するために使用される。

本明細書において使用するとき、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識期及び活性化期とは対照的に、免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を指す。例の免疫細胞は、骨髄又はリンパ起源の細胞、例えば、リンパ球（Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞、及び顆粒球、例えば、好中球、好酸球、及び好塩基球を含む。一部のエフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現し、特定の免疫機能を遂行する。一部の実施形態において、エフェクター細胞は、ナチュラルキラー細胞などのＡＤＣＣを誘発可能である。例えば、単球、マクロファージは、ＦｃＲを発現し、標的細胞の特異的な殺傷、及び抗原を免疫系の他のコンポーネントに提示することに関与する。一部の実施形態において、エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食することができる。エフェクター細胞上での特定のＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子によって調節することができる。エフェクター細胞は、標的抗原を貪食することができる、又は、標的細胞を貪食若しくは溶解することができる。適切な細胞傷害剤及び第２治療剤は、以下に例示され、毒素（放射能標識ペプチドなど）、化学療法剤、及びプロドラッグを含む。

一部の実施形態において、第２抗原結合部位をＴ細胞の動員に使用する。一部の実施形態において、第２抗原結合部位は、ＣＤ３εの細胞外ドメインに対する特異性を有する。

一部の実施形態において、本発明の多特異性抗体は、本発明の抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、それからなる、又は実質的にそれからなる抗原結合ドメインを含む。

一部の実施形態において、抗原結合ドメインはリンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に配置することができる。

本発明の多特異性抗体分子についての例のフォーマットは、（ｉ）一方がＣＤ３８に対する特異性を有し、他方はＣＤ３εなどの他の抗原に対する特異性を有する、化学的なヘテロコンジュゲーションにより架橋した２つの抗体；（ｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む単一の抗体；（ｉｉｉ）２つの異なる抗原結合領域、例えば、さらなるペプチドリンカーにより直列に連結された２つのｓｃＦｖを含む一本鎖抗体；（ｉｖ）各軽鎖及び重鎖が、短いペプチド結合を介して直列の２つの可変ドメインを含有する、デュアル可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ （ＤＶＤ－Ｉｇ） Ｍｏｌｅｃｕｌｅ， Ｉｎ ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））；（ｖ）化学的に連結した二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメント；（ｖｉ）標的抗原のそれぞれに対する２つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合物である、Ｔａｎｄａｂ；（ｖｉｉ）多価分子をもたらすｓｃＦｖとダイアボディとの組み合わせであるフレキシボディ；（ｖｉｉｉ）Ｆａｂに適用すると、異なるＦａｂフラグメントに連結した２つの同一のＦａｂフラグメントからなる三価の二重特異性結合タンパク質を生成することができる、プロテインキナーゼＡにおける「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドック・アンド・ロック」分子；（ｉｘ）例えば、ヒトＦａｂ－アームの両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるＳｃｏｒｐｉｏｎ分子、及び（ｘ）ダイアボディを含むが、これらに限定されない。

二重特異性抗体についての他の例のフォーマットは、ヘテロ二量体化させるための、相補的なＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子である。そうした分子は、既知の技術、例えば、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、及び静電マッチ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ－ｍａｔｃｈｅｄ）（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、鎖交換操作ドメインボディ（Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ）（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、及びＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）技術として知られるものなどを使用して調製することができる。

一部の実施形態において、二重特異性抗体は、典型的にはＤｕｏＢｏｄｙ技術を使用する、制御されたＦａｂ－アーム交換により得られる又は得ることができる。制御されたＦａｂ－アーム交換により二重特異性抗体を作製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、国際公開第２００８／１１９３５３号及び第２０１１／１３１７４６号（両方ともＧｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）に記載されている。国際公開第２００８１１９３５３号に記載された１つの例の方法において、二重特異性抗体は、還元条件下でのインキュベーションの際、両方ともＩｇＧ４様ＣＨ３領域を含む２つの単特異性抗体間の「Ｆａｂ－アーム」又は「半分子」交換（重鎖と付着した軽鎖とのスワッピング）により形成される。得られた生成物は、異なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異性抗体である。国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載された別の例の方法において、本発明の二重特異性抗体は、第１及び第２の抗体の少なくとも１つが本発明の抗体である、以下のステップを含む方法によって調製され、該ステップは、（ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第１の抗体を提供し、該Ｆｃ領域が第１のＣＨ３領域を含む、ステップ、（ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第２の抗体を提供し、該Ｆｃ領域が第２のＣＨ３領域を含み、該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が異なり、該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用のそれぞれより強くなっている、ステップ、（ｃ）還元条件下において、該第１の抗体を該第２の抗体と共にインキュベーションするステップ、並びに、（ｄ）第１の抗体が本発明の抗体であり、第２の抗体が異なる結合特異性を有する、又はその逆である、該二重特異性抗体を得るステップである。還元条件は、例えば、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンから選択されるものなど、還元剤を添加することにより提供することができる。ステップ（ｄ）は、例えば、還元剤の除去により、例えば脱塩により、非還元性又はほとんど還元性でなくなる条件に回復させることをさらに含むことができる。好ましくは、第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用のそれぞれより強くなるように、少数の、ある程度保存的な、非対称の変異のみを含む。この相互作用及びそれがどのようにして得られるかについてのさらなる詳細は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載されており、これは言及することによってその全体が本明細書に援用される。他の一部の実施形態において、本発明の二重特異性抗体は対称のクラスＩｇＧ４の二重特異性抗体であり、これは、それぞれ可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びヒンジ領域を含む２つの重鎖を含み、各重鎖において、軽鎖のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメインにおけるシステインが他のアミノ酸で置換され、任意で上部ヒンジ領域に位置するアミノ酸の１つ以上がシステインで置換され、各重鎖の定常領域配列が類似する又は同一であり、各重鎖の可変領域が異なる。該二重特異性フォーマットの抗体は、国際公開第ＷＯ２０１３／１２４４５０号に記載されている。一部の実施形態において、本発明の二重特異性抗体は非対称の抗体であり、これは、それぞれが少なくとも可変領域、ヒンジ領域、及びＣＨ１ドメインを含む２つの重鎖又は重鎖フラグメントを含み、第１の重鎖又はそのフラグメントはクラスＩｇＧ４であり、（ａ）ＣＨ１ドメインにおいて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けした、１２７番目における鎖間システインが、他のアミノ酸で置換され、及び（ｂ）任意で上部ヒンジ領域に位置するアミノ酸の１つ以上がシステインで置換され、第２の重鎖又はそのフラグメントは、鎖の一部又はすべてが可変領域外の少なくとも領域（例えば定常領域）において該第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有することにより特徴づけられる。該二重特異性フォーマットの抗体は、国際公開第ＷＯ２０１３／１２４４５１号に記載されている。

一部の実施形態において、本発明の多特異性抗体は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）抗体である。

一部の実施形態において、本発明の多特異性抗体はＢｉＴＥ（登録商標）抗体である。

一部の実施形態において、本発明の多特異性抗体は配列番号１２に示す配列を含む。
配列番号１２ ＞ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｉ３８－３
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＦＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＴＫＴＬＴＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＮＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＧＩＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＱＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＤＧＤＴＲＹＴＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＮＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＲＴＴＧＡＰＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＡＡＡ

また、本発明は、本発明の多特異性抗体をコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、核酸は上述のようにベクターに組み込まれる。

（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する宿主細胞を作製するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びその使用）
また、本発明は、本発明の抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

本明細書において使用するとき、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞シグナリングドメインに連結された抗体（例えば、ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含む人工的に構築したハイブリッドタンパク質又はポリペプチドを指す。ＣＡＲの特徴は、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、Ｔ細胞の特異性及び反応性を選択した標的に非ＭＨＣ制限の様式において再誘導できることを含む。さらに、Ｔ細胞に発現されるとき、ＣＡＲは、有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α及びβ鎖と二量体化しない。典型的に、該キメラ抗原受容体は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む。また、本発明のキメラ抗原受容体は、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを含む。

一部の実施形態において、抗原結合ドメインはリンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に配置することができる。

一部の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、それからなる、又は実質的にそれからなる抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。

一部の実施形態において、本発明のＣＡＲは、配列番号１３又は配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる。
配列番号１３ ＞ ＣＡＲ ＣＤ３８ １Ｇ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＦＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＴＫＴＬＴＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＮＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＧＩＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＱＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＤＧＤＴＲＹＴＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＮＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＲＴＴＧＡＰＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＬＥＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号１４ ＞ ＣＡＲ ＣＤ３８ ３Ｇ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＦＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＴＫＴＬＴＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＮＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＧＩＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＱＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＤＧＤＴＲＹＴＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＮＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＲＴＴＧＡＰＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＬＥＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＧＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、並びにＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ζ細胞内ドメインからなる群より選択される細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを含む。ＣＤ２８は、Ｔ細胞共刺激に重要であるＴ細胞マーカーである。４－１ＢＢは、強力な共刺激シグナルをＴ細胞に伝達して、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存性を高める。ＣＤ３ζはＴＣＲに会合してシグナルを生成し、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。

一部の実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えばジスルフィド架橋を介して環化、又は酸付加塩に変換、及び／又は任意で二量体化若しくは重合することができる。

また、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体抗体をコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、核酸は上述のようにベクターに組み込まれる。

したがって、本発明のさらなる目的は、上述のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作した宿主細胞に関する。

一部の実施形態において、宿主細胞は細胞傷害性リンパ球である。

本明細書において使用するとき、「細胞傷害性リンパ球」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、感染した標的細胞になされる致死性の攻撃が感染の広がりを限定的にするために要求される、ウイルス病原体などの細胞内病原体の破壊を標的とするリンパ球を指す。本発明において、「細胞傷害性リンパ球」は、細胞傷害性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を含む。

一部の実施形態において、宿主細胞はナチュラルキラー細胞である。

本明細書において使用するように、「ナチュラルキラー細胞」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、自然免疫系に重要である細胞傷害性リンパ球の種類を指す。ＮＫ細胞の役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性Ｔ細胞のものと類似する。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞に迅速な応答を行って、腫瘍形成に応答する。

一部の実施形態において、宿主細胞は、例えば末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したＴ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、培養したＴ細胞、例えば初代Ｔ細胞、又は培養したＴ細胞株からのＴ細胞、例えばジャーカット、ＳｕｐＴ１など、又は哺乳動物から得たＴ細胞など、任意のＴ細胞とすることができる。Ｔ細胞は、哺乳動物から得る場合、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得ることができる。また、Ｔ細胞は濃縮又は精製することもできる。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞とすることができ、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えばＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などを含むが、これらに限定しない任意の発生段階のものとすることができる。Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。

したがって、本発明のさらなる目的は、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＣＡＲ－Ｔ細胞である。

一部の実施形態において、宿主細胞は多能性幹細胞（ＰＳＣ）である。ＰＳＣは、実際にＣＡＲによって修飾してから、Ｔ細胞の誘導に使用することができる（例えば国際出願第２０１７１００４０３号）。ＰＳＣは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。ｉＰＳＣは、成体細胞（例えば体細胞）から直接作製することができる。ｉＰＳＣは、典型的に、所定の細胞型に特定の多能性関連遺伝子のセット又は「リプログラミング因子」を導入することによって誘導又は作製することができる。リプログラミング因子は、Ｙａｍａｎａｋａ因子としても知られるＯＣＴ４（「ＰＯＵ５ＦＬ」としても知られる）、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣ、及びＫＬＦ４を含むがこれらに限定されない。Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ；Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ（２００６）「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ」Ｃｅｌｌ １２６（４）：６６３－７６が参照される。

一部の実施形態において、宿主細胞は造血幹細胞である。本明細書で使用するとき、「造血幹細胞」又は「ＨＳＣ」という用語は、自己複製し、血液細胞の前駆体に分化することができる血液細胞を指す。この前駆細胞は、自己複製できず、成熟血液細胞に分化する必要がある未成熟血液細胞である。造血幹細胞・前駆細胞は、Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－、Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０－ＣＤ４５ＲＡ－、Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＩＬ－３ａｌｏＣＤ４５ＲＡ－、及びＬｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０＋などの数多くの表現型を示す（Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃｕｓ １８：６２－６７，１９９６；Ｐｉｍｅｎｔｅｌ，Ｅ．，Ｅｄ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｖｏｌ．ＩＩＩ：Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｐｐ．１－２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９４）。骨髄微小環境内において、幹細胞は自己複製し、生存期間にわたってあらゆる成熟血液細胞を生じさせる造血幹細胞の継続的作製を維持する。一部の実施形態において、造血前駆細胞又は造血幹細胞は末梢血液細胞から単離される。

一部の実施形態において、ＣＡＲ活性は、ＣＡＲ治療の安全性及び効力を最適化することが必要とされる場合、制御することができる。ＣＡＲ活性を調節可能な多くの方法が存在する。例として、例えば二量体化ドメインと融合させたカスパーゼを使用する誘導性アポトーシス（例えばＤｉ等、Ｎ Ｅｇｎｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１１ Ｎｏｖ．３；３６５（１８）：１６７３－１６８３参照）を、本発明のＣＡＲ治療における安全スイッチとして使用することができる。

（処置方法及び医薬組成物）
本発明の抗体、多特異性抗体、及びＣＡＲ－Ｔ細胞は、特に治療における使用に適する。

したがって、本発明のさらなる目的は、治療を必要とする対象における治療の方法に関し、該方法は、治療有効量の本発明の抗体及び／又は本発明の多特異性抗体及び／又は本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群を対象に投与することを含む。

特に、本発明の多特異性抗体及びＣＡＲ－Ｔ細胞は、特にがんの処置に、より具体的にはＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍の処置に適する。

したがって、本発明は、処置を必要とする対象におけるがんの処置に使用するための、本発明の抗体及び／又は本発明の多特異性抗体及び／又は本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群に関する。

一部の実施形態において、がんはＣＤ３８陽性のがんである。

一部の実施形態において、ＣＤ３８陽性のがんはＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍である。

一部の実施形態において、ＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である。

一部の実施形態において、がんは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）レベルを示さない又はＢ細胞成熟抗原レベルが極めて低いがんである。

一部の実施形態において、がんは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）レベルを示さない又はＢ細胞成熟抗原レベルが極めて低いＣＤ３８陽性のがんである。

一部の実施形態において、がんは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）レベルを示さない又はＢ細胞成熟抗原レベルが極めて低いＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍である。

一部の実施形態において、本発明の多特異性抗体及び／又は本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群は、ＣＤ３８陽性のがんの特異的なＴ細胞媒介溶解を誘発する。

一部の実施形態において、本発明の多特異性抗体及び／又は本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群は、Ｂ細胞及びＮＫ細胞をＴ細胞の細胞傷害活性から保護しながら、ＣＤ３８陽性のがんの特異的なＴ細胞媒介溶解を誘発する。

本明細書において使用するとき、「対象」という用語は、任意の哺乳動物、例えばげっ歯動物、ネコ、イヌ、及び霊長動物を指す。特に、本発明において、対象は、がん、好ましくはＣＤ３８陽性のがん、より好ましくはＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍に罹患している、又はそれらの罹患に感受性があるヒトである。

一部の実施形態において、対象はがんを再発している。一部の実施形態において、対象はＣＤ３８陽性のがんを再発している。一部の実施形態において、対象はＣＤ３８陽性の血液悪性腫瘍を再発している。

一部の実施形態において、対象は、ＣＤ３８を標的とするモノクローナル抗体（ダラツムマブなど）に対する抵抗性を有する。

一部の実施形態において、対象は、ＣＤ３８を標的とするモノクローナル抗体による治療を受けており、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体に対する抵抗性を得ている。

特定の実施形態において、本発明の抗体及び／又は本発明の多特異性抗体及び／又は本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群は、抗がん治療と組み合わせて使用することができる。

したがって、本発明は、治療を必要とする対象における治療の方法に関し、該方法は、がんを処置するための組み合わせの製剤として、治療有効量の本発明の抗体及び／又は本発明の多特異性抗体及び／又は本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群、並びに（ｉｉ）従来の処置を対象に投与すること含む。

本明細書において使用するとき、「抗がん治療」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、がんの処置に使用される、自然又は合成の任意の化合物を指す。

特定の実施形態において、抗がん治療は、放射線療法、抗体療法、又は化学療法を指す。

本明細書において使用するとき、「化学療法剤」という用語は、腫瘍増殖の阻害に有効な化学物質を指す。化学療法剤の例は、多種キナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ及びスニチニブ、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ、及びウレドパ；エチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチロールオメラミンを含む）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（ｃａｒｎｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；クリスタチン；ＣＣ－１０６５（その合成類似体アドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシンを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ－２１８９及びＣＢＩ－ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラヌスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリチアマイシン、特にカリチアマイシン１１及びカリチアマイシン２１１、例えば、Ａｇｎｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３－１８６（１９９４）を参照）；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡを含む）；エスペラマイシン；及びネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カニノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン（ｉｄａｎｒｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、キラマイシン、ロドルビシン、ストレプトムグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎物質、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｒｎｉｄｅ）グリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲナニウム；テヌアゾン酸、トリアジクオン、２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン（２，２’，２’’－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｅ）；トリコテセン（特にＴ－２トキシン、ベルカリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロジリンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｍｔｏｌ）；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ， Ａｎｔｏｎｙ， Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；並びに、上記いずれかの薬学的に許容し得る塩、酸、又は誘導体を含む。また、この定義には、腫瘍におけるホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）、並びに、抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン、並びに、上記いずれかの薬学的に許容し得る塩、酸、又は誘導体も含まれる。

本明細書において使用するとき、「放射線療法」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、電離放射線によるがんの処置を指す。電離放射線は、遺伝物質を傷害することで、処置される領域（「標的組織」）における細胞を損傷又は破壊するエネルギーを与え、これらの細胞が成長し続けられないようにする。一般に使用される放射線療法の一種は、光子、例えばＸ線に関与する。これが有するエネルギー量に応じて、身体の表面又はより深部にあるがん細胞を破壊するように、光線を使用することができる。Ｘ線ビームのエネルギーが大きくなると、Ｘ線がより深く標的組織に入ることができる。線形加速器及びベータトロンは、次第にエネルギーが大きくなるｘ線を生成する。がん部位に放射線（ｘ線など）を集束させるための機械の使用は、外部ビーム放射線療法と呼ばれている。ガンマ線は、放射線療法で使用されている別の形態の光子である。ガンマ線は、特定の元素（ラジウム、ウラニウム、及びコバルト６０など）が分解又は崩壊する際に放射線を放出すると自然に生成される。一部の実施形態において、放射線療法は外部放射線療法である。外部放射線治療の例は、従来の外部ビーム放射線療法；異なる方向から腫瘍の形状に厳密に合うように成形したビームを送達する三次元原体放射線療法（３Ｄ－ＣＲＴ）；放射線ビームを腫瘍の形状に厳密に合うように成形して、また腫瘍の形状に従って放射線の線量を変化させる、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、例えばヘリカルトモセラピー；原体陽子線放射線療法；放射線処置を誘導するため腫瘍のリアルタイムの画像を提供するように走査及び放射線技術を組み合わせた、画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）；外科手術時に腫瘍に直接放射線を送達する、術中放射線療法（ＩＯＲＴ）；単回で小さな腫瘍領域に正確な多くの放射線線量を送達する定位放射線手術；１日あたり１を超える放射線療法の処置（分割）を対象に行う、多分割放射線療法、例えば連続多分割加速放射線治療（ＣＨＡＲＴ）；並びに分割あたり多くの線量ではあるが、分割回数は少ない放射線療法を行う、少分割放射線療法を含むが、これらに限定されない。

本明細書において使用するとき、「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質を完全に又は部分的に低下、阻害、干渉、又は調節する分子を指す。

本明細書において使用するとき、「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、シグナルを上げる（刺激性チェックポイント分子）又はシグナルを下げる（抑制性チェックポイント分子）ようにＴ細胞によって発現される分子を指す。

刺激性チェックポイントの例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＩＣＯＳを含む。抑制性チェックポイント分子の例は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７７、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、及びＶＩＳＴＡを含む。

本明細書において使用するとき、「組み合せの処置」、「組み合せの治療」、又は「治療の組合せ」という用語は、１つを超える薬剤を使用する処置を指す。組み合わせの治療は二剤併用療法（ｄｕａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）又は二重療法（ｂｉ－ｔｈｅｒａｐｙ）とすることができる。

本発明における組み合わせの処置に使用する薬剤は、共に、個別に、又は順次、対象に投与される。

本明細書において使用するとき、「共に投与」という用語は、同じ経路で、かつ同時に又は実質的に同時に２つの活性成分を投与することを指す。「個別に投与」という用語は、異なる経路で、同時に又は実質的に同時に２つの活性成分を投与することを指す。「順次投与」という用語は、同一又は異なる投与経路で、別の時点において２つの活性成分を投与することを指す。

特に、上述のように調製したＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群は、本開示に基づいて当業者には明らかである既知の技術又はその変形に従って養子免疫療法のための方法及び組成物に使用することができる。例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ等の米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号明細書が参照され、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号明細書も参照される。現在のところ、大部分の養子免疫療法は、患者自身の免疫細胞を使用する処置を対象とする自己リンパ球療法（ＡＬＴ）である。この治療は、患者自身のリンパ球を処理することに関与する。典型的に、処置は、患者のリンパ球を除去し、上述のようにＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群において該細胞を変換することによってなされる。ＣＡＲ－Ｔ細胞を本発明のＣＡＲで調製すると、免疫系を増強して腫瘍細胞を殺傷するため、このエクスビボの細胞を患者に再注入する。一部の実施形態において、細胞は、最初にその培地から採取し、次に処置有効量での投与のために適切な培地及び容器システム（「薬学的に許容される」担体）中で細胞を洗浄及び濃縮することにより製剤化する。適切な注入培地は任意の等張性培地製剤、典型的には通常の生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）又はＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）とすることができるが、また、水又は乳酸リンゲル液中の５％デキストロースも利用することができる。注入培地には、ヒト血清アルブミンを補充することができる。組成物における細胞の処置有効量は、所望の特異性を有するＴ細胞の相対的な量、レシピエントの年齢及び体重、標的となる状態の重篤度、及び標的Ａｇの免疫原性によって決まる。この細胞の量は、約１０^３／ｋｇ、好ましくは５×１０^３／ｋｇほども低くなり得、及び１０^７／ｋｇ、好ましくは１０^８／ｋｇほども高くなり得る。細胞の数は、それに含まれる細胞の種類と同様に、組成物に意図する最終的な使用によって決まる。例えば、特定のＡｇに特異的である細胞が求められる場合、その個体群は、７０％を超える、一般に８０％、８５％及び９０～９５％を超えるそうした細胞を含み得る。本明細書で提供する使用のため、細胞は一般に１リットル以下の容積であり、５００ｍｌ以下、さらに２５０ｍｌ又は１００ｍｌ以下とすることができる。臨床的に適切な数の免疫細胞を、所望の総細胞量に累積的に等しい又はそれを超える複数の注入に配分することができる。

投与のため、本発明の抗体は医薬組成物として製剤化される。本発明の抗体を含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製し、それによって治療分子を薬学的に許容される担体との混合物に組み合わせるように、既知の方法に従って製剤化することができる。組成物は、その投与をレシピエントの患者が許容可能である場合、「薬学的に許容される担体」といえる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当業者に周知である。（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）を参照）製剤は、１つ又はそれ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面におけるタンパク質の損失を防止するためのアルブミン等をさらに含むことができる。医薬組成物の剤形、投与経路、投与量及びレジメンは、必然的に、処置する状態、病気の重篤度、患者の年齢、体重、及び性別等によって決まる。本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、又は眼内投与等のために製剤化することができる。

典型的に、医薬組成物は、注射可能な製剤に薬学的に許容されるビヒクルを含む。これは、特に、等張液、滅菌液、生理食塩液（一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、若しくはマグネシウム塩化物等、若しくはそうした塩の混合物）、又は、場合に応じて、滅菌水又は生理食塩水を添加すると、注射可能な溶液を構成可能とする乾燥、特に凍結乾燥組成物とすることができる。

投与に使用する用量は、種々のパラメータに応じて、特に使用する投与モード、関連する病態、あるいは求められる処置期間に応じて、適応させることができる。

医薬組成物の調製のため、有効量の抗体を、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散させることができる。

注射における使用に適切な医薬剤形は、滅菌水溶液又は分散液、ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤、及び注射可能な滅菌溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。すべての場合において、剤形は滅菌である必要があり、容易に注射可能な程度に流動性である必要がある。これは、製造及び保管の条件下で安定である必要があり、細菌及び真菌などの微生物のコンタミネーションに対して保護する必要がある。

遊離塩基又は薬理的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製することができる。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合液中、並びに油中で調製することができる。保管及び使用の通常の条件下において、それらの製剤は、微生物の増殖を防ぐため保存剤を含む。

本発明の抗体は、中性又は塩形態で、組成物に配合することができる。薬学的に許容される塩は、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマンデル酸等の有機酸とともに形成された、（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成された）酸付加塩を含む。また、遊離カルボキシル基と形成された塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、及びプロカイン等の有機塩基由来であってもよい。

また、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体とすることもできる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持により、及び、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物活動は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により防ぐことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注入可能な組成物の持続性吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンを組成物に使用することにより行うことができる。

滅菌注射溶液は、必要とされる量の活性化合物を、上述で列挙した種々の他の成分を含む適切な溶媒に含ませ、必要に応じて、続いて、ろ過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌した活性成分を、基本分散媒体と上述で列挙したものからの必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクルに含ませることにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から、活性成分と任意のさらなる所望の成分との粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥技術である。

直接注射するためのより濃度の高い又は高濃度の溶液の調製も考慮され、この場合、溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、極めて急速な浸透をもたらし、高濃度の活性剤を小さな腫瘍領域に送達すると想定される。

溶液は、製剤化すると、投与剤形に適合する方法において、治療的に有効な量で投与され得る。製剤は、上述の種類の注射溶液などの各種の投与剤形で容易に投与されるが、薬剤放出カプセル剤等も利用することができる。

水溶液での非経口投与のため、例えば、溶液を、必要に応じて適切に緩衝する必要があり、液体希釈剤をまず、十分な生理食塩水又はグルコースにより等張性にする必要がある。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。これに関して、利用可能な滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者が知ることになる。例えば、１回の投与量を、１ｍＬの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解して、１０００ｍｌの皮下点滴液に加える、又は、注入の目的部位に注射するかのいずれかとすることができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１０３５－１０３８及び１５７０－１５８０ページを参照）。いくつかの用量の変形例は、処置する対象の状態に応じて必然的に生じ得る。投与を担う人は、任意の事象において、個々の対象に適切な用量を決定し得る。

本発明の抗体は、用量あたり、約０．０００１～１．０ミリグラム、又は約０．００１～０．１ミリグラム、又は約０．１～１．０、又はさらに約１０ミリグラムほどを含むように、治療混合物中に配合することができる。また、複数回の用量を投与することもできる。

静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤形は、例えば、錠剤又は経口投与用の他の固体、長期放出カプセル剤、及び現在使用されている任意の他の剤形を含む。

一部の実施形態において、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が、宿主細胞への抗体の導入に考慮される。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者に既知である。

ナノカプセルは、一般に、安定し、再現性のある方法で、化合物を封入することができる。細胞内でのポリマー過負荷による副作用を避けるため、こうした超微細粒子（約０．１μｍサイズ）は、一般に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて分解することができるポリマーを使用して設計される。これらの要求に合致する生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が本発明の使用に考慮され、こうした粒子は容易に作製することができる。

リポソームは、水性媒体中に分散するとともに、多重膜同中心二重層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する、リン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、コアに水溶液を含み、２００～５００Åの範囲の直径を有する、小型の単膜小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在により決まる。

本発明を以下の図面及び実施例によってさらに記載する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するとしていかようにも解釈されるべきでない。

（実施例１：多発性骨髄腫の処置のための新しいＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）
方法
Ｂｉ３８－３の構築及び精製
Ｂｉ３８－３を、抗ヒトＣＤ３８及びＣＤ３ε（それぞれＢ５１及びＯＫＴ３）を作製するマウスハイブリドーマ由来であり、１５アミノ酸グリシン－セリン（Ｇ４Ｓ１ｘ３）スペーサーによって連結した、２つのｓｃＦｖの融合によって作製した。ヒトＣＤ８のリーダーペプチドを、融合フラグメントのＮ末端に遺伝子的に連結し、Ｍｙｃタグ及びＨｉｓタグ配列をＣ末端に導入した。Ｂｉ３８－３をコードする配列を、ｐＣＤＮＡ３発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にクローニングし、シーケンシングによって確認した。このベクターを、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に一時的に遺伝子導入し、Ｂｉ３８－３に対応する５５．６Ｋｄのタンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ）を用いて上清から精製した。Ｂｉ３８－３の完全性をクーマシーブルー染色及び抗Ｍｙｃタグ抗体でウエスタンブロットによって分析した。

細胞株
ＭＭ１．Ｓ、ＮＣＩ－Ｈ９２９、及びＫＭＳ－１１のＭＭ細胞株を、１０％の熱失活ウシ胎仔血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ－グルタミンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地において維持した。すべての細胞株を、マイコプラズマコンタミネーションに対してモニタリングした。ルシフェラーゼ発現ＭＭ１．Ｓ及びＫＭＳ－１１細胞（ＫＭＳ１１ｌｕｃ及びＭＭ１．Ｓｌｕｃ）を、ルシフェラーゼ発現ベクターによるレンチウイルスの形質導入によって作製した（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｐｕｒｏ ＬＵＣ （ｗ１６８－１）、Ｅｒｉｃ Ｃａｍｐｅａｕ及びＰａｕｌ Ｋａｕｆｍａｎより贈呈）。ＣＤ３８欠損ＭＭ１．Ｓ細胞を作製するため、２つのペアのＲＮＡガイドが、ＣＤ３８遺伝子のエクソン２及び３を欠失させるように設計された。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、ｐＸ４５８ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミドＩＤ ４８１３８、Ｄｒ Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇより贈呈）にクローニングして、シーケンシングにより検証した。Ｃａｓ９欠失のため、２×１０^６のＭＭ１．Ｓｌｕｃ細胞は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）を用いて２μｇの各Ｃａｓ９ベクターをヌクレオフェクションし、培地で２４時間インキュベートし、ＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳによって選別し、９６ウェルプレートにおいてクローニングした。サブクローンを、ＣＤ３８発現についてフローサイトメトリーによって分析し、ＣＤ３８陰性クローンをさらなる分析のため選別した。

血液及び骨髄試料
健康なドナーの末梢血試料を、フランス血液機構（ＥＦＳ）から取得した。新しい腫瘍形質細胞を、骨髄腫患者の骨髄吸引物のバフィーコートから採取し、さらに、抗ＣＤ１３８コーティングビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて精製した。すべての場合において、ヘルシンキ宣言及びサンルイ病院内部調査委員会の承認に従って、患者及びボランティアの告知に基づく同意を得ている。

フローサイトメトリー及び細胞傷害性
ＫＭＳ－１１ｌｕｃ又はＭＭ１ＳｌｕｃのＭＭ細胞株の溶解を判定するため、精製した末梢Ｔ細胞（エフェクター）を、平底の９６ウェルにおいて、培地（ＲＰＭＩ、１０％の熱失活ウシ胎仔血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ－グルタミン）中で、種々の濃度のＢｉ３８－３と、ルシフェーゼ発現ＭＭ１．Ｓ又はＫＭＳ－１１細胞（標的）と共に、１：５のエフェクター対標的比で、インキュベートした。生存ＭＭ細胞によって生成されるルシフェラーゼシグナルを、製造者の指示に従ってホタルルシフェラーゼ基質の添加後２０分以内に（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ ルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ Ｐｌｕｓルミノメータープレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ ＧｍｂＨ，Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、２４時間後に判定した。初代細胞におけるＴ細胞の細胞傷害性を、同様の共培養条件を用いてフローサイトメトリーによってアッセイした。エフェクターＴ細胞を、精製した標的ＭＭ細胞及びＢｉ３８－３の段階希釈物と共にインキュベートした。インキュベート後、抗ヒトＣＤ１３８－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（ｃｌｏｎｅ ４４Ｆ９－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、抗ＣＤ２０－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ（ＢＶ）６０５（Ｃｌｏｎｅ ２Ｈ７－ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４－ＡＰＣ／シアニン７（Ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ４－ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及び抗ＣＤ８－ＢＶ４２１（Ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ８－ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体を細胞に添加して、標的細胞をエフェクター細胞から識別し、生細胞の数をＢｒｉｇｈｔｃｏｕｎｔビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてフローサイトメトリーによって判定した。すべてのＦＡＣＳを、Ｃａｎｔｏ ＩＩ（Ｂｅｃｋｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において得た。増殖指標の分析と算出をＦｌｏｗｊｏで行った。

Ｔ細胞活性及び増殖アッセイ
活性検出のため、エフェクター細胞（Ｔ細胞）及び標的細胞（ＭＭ１．Ｓ）を、５：１の比で２４時間共培養し、抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ－シアニン７（Ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ４）、抗ＣＤ８－ＢＶ４２１（Ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ８）、抗ＣＤ２５－フィコエリスリン（Ｐｅ）／シアニン５（ｃｌｏｎｅ ＢＣ９６）、及び抗ＣＤ６９－ＢＶ７１１（ｃｌｏｎｅ ＦＮ ５０）抗体（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。増殖分析のため、Ｔ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識して、Ｂｉ３８－３（１０ｎｇ／ｍＬ）あり（又はなし）で、ＭＭ１．Ｓ細胞又はＭＭ１．Ｓ－ＣＤ３８ＫＯによって、９６時間刺激した。細胞を、抗ＣＤ４－ＡＰＣ／Ｃｙ７（ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ４）及び抗ＣＤ８－ＢＶ４２１（ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ８）抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。

細胞培養上清におけるサイトカインの定量化
細胞傷害アッセイの上清におけるサイトカインの濃度を、ＢＤ ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ（Ｂｅｃｋｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。データを、Ｃａｎｔｏ ＩＩにおいて取得し、ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙソフトウェア（Ｂｅｃｋｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。

全身性腫瘍マウスモデル
動物実験委員会（Ｃｏｍｉｔｅ ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ Ｐａｒｉｓ－Ｎｏｒｄ）によって承認されたプロトコールのもと、６～１２週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγヌルマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いた。マウスに、尾静脈注射によって５×１０^６のＭＭ１．Ｓｌｕｃ細胞を接種し、続いて、１４日後、０．０８ｍｇ／ＫｇのＢｉ３８－３を含む（又は含まない）、５×１０^６の精製ヒトＴ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃの汎Ｔ細胞単離キットを用いて精製）を注入した。Ｂｉ３８－３（又はコントロールのＰＢＳ）の尾静脈注射を、９日間毎日繰り返した。ランダム化も盲検法も用いらなかった。生物発光イメージングを、３又は４日毎に行った。マウスに、２４０μＬのＤ－ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ）（ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリンカリウム塩、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を腹腔内に注射し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と共にＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、中ビニングレベル及び種々の露光時間で、２５ｃｍの視野において、１５分後に、イメージ取得を行った。ＭＭ細胞の接種の２２日後、すべてのマウスを絶命させた。

結果
Ｂｉ３８－３の構築、作製、及び結合特性
Ｂｉ３８－３は、抗ヒトＣＤ３８及びＣＤ３ε（それぞれＢ５１及びＯＫＴ３）を作製するマウスハイブリドーマ由来であり、１５アミノ酸グリシン－セリン（Ｇ４Ｓ１ｘ３）スペーサーによって連結した、２つのｓｃＦｖからなる（図示せず）。抗ＣＤ３８重鎖及び軽鎖の可変ドメインに対応するアミノ酸配列、並びに抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ及びＢｉ３８－３のアミノ酸配列を表１に示す。
表１は、ＢＢ５１５ハイブリドーマ（抗ＣＤ３８）の免疫グロブリン（ＩｇＨ及びＩｇＫ）のアミノ酸配列、対応するｓｃＦｖ及びＢｉ３８－３のアミノ酸配列を示す。

抗ＣＤ３８ｓｃＦｖはＮ末端に位置し、抗ＣＤ３８εｓｃＦｖはＣ末端に位置し、Ｍｙｃタグ及びＨｉｓｘ６タグ配列が続く（図示せず）。Ｂｉ３８－３発現ベクターを一時的に遺伝子導入したＨＥＫ－２９３細胞のウエスタンブロット分析により、５５．６Ｋｄの予想サイズを有し、抗Ｍｙｃタグ抗体によって認識される特有のタンパク質を明らかにした（データを示さず）。Ｂｉ３８－３を、一時的に遺伝子導入したＨＥＫ－２９３細胞の培地上清から、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ）で精製した。単量体Ｂｉ３８－３タンパク質の純度を、ゲル電気泳動法、続いてクーマシーブルー染色によって示した（データを示さず）。ＣＤ３８発現ＭＭ１．Ｓ、ＫＭＳ１１、及びＮＣＩ－Ｈ９３９のＭＭ細胞に対するＢｉ３８－３の結合を、ｓｃＦｖドメインを認識する抗Ｆａｂ抗体で、フローサイトメトリーによって分析した。Ｂｉ３８－３がＭＭ細胞株表面において検出されることを観察し、より低いレベルのＣＤ３８を発現するＫＭＳ１１細胞ではあまり濃くない染色、より高いレベルのＣＤ３８を示すＭＭ１．Ｓ及びＮＣＩ－Ｈ９２９細胞ではより強い信号であった（データを示さず）。ＣＤ３８に対するＢｉ３８－３の特異性を検証するため、ＭＭ１．Ｓ細胞におけるＣＤ３８遺伝子を不活性化するように（ＭＭ１．Ｓ－ＫＯ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９方法を用いた（データを示さず）。ＦＡＣＳ分析により、Ｂｉ３８－３がＣＤ３８陰性ＭＭ１．Ｓ－ＫＯ細胞の表面において検出できないことを明らかにした（データを示さず）。したがって、精製したＢｉ３８－３は、ＭＭ細胞のＣＤ３８を効果的かつ特異的に認識する。

Ｂｉ３８－３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＭ細胞に対応してＴ細胞活性化及び増殖を誘導する
次に、Ｂｉ３８－３によって誘発されるＭＭ細胞に対するＴ細胞の応答を検討した。まず、バイオレット蛍光染色Ｔ細胞の増殖指標を測定するため、ＦＡＣＳ分析を行った。ＭＭ１．Ｓ標的細胞（Ｔ）の存在下におけるＢｉ３８－３によるドナーのエフェクターＴ細胞（Ｅ）の刺激により、着実な増殖がもたらされ、４日後で平均５細胞分裂（増殖指標）となり、これは抗ＣＤ３８／ＣＤ２８ビーズでの処置により誘導されるものよりわずかに高いレベルであった（データを示さず）。ＣＤ３８欠損ＭＭ１．Ｓ細胞及びＢｉ３８－３と培養したＴリンパ球は増殖しなかったので、増殖は標的細胞におけるＣＤ３８発現を要求するものであった。さらに、Ｂｉ３８－３単独又はＭＭ１．Ｓ細胞単独での培養も、有意なＴ細胞増殖を誘導しなかった。

次に、ドナーのＴ細胞におけるＣＤ６９及びＣＤ２５早期活性化マーカーの発現を分析した。ＭＭ１．Ｓ細胞との一晩の共培養後、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞は、即座に両方のマーカーをＢｉ３８－３の用量依存的にアップレギュレートし、最大８０％のＣＤ６９陽性Ｔ細胞を最も高い濃度で検出した（データを示さず）。一方で、１００ｎｇ／ｍＬのＢｉ３８－３単独で刺激した際、より低いパーセンテージのＣＤ２５及びＣＤ６９発現Ｔ細胞（それぞれ１５％及び３０％）を観察した。さらに、ＭＭ１．Ｓ標的細胞単独との共培養は、活性化マーカーの発現を誘導しなかった（データを示さず）。これに一致して、ＭＭ１．ＳＫＯ細胞及びＢｉ３８－３との共培養が、野生型ＭＭ１．Ｓ細胞との共培養と比較して、ＣＤ６９及びＣＤ２５をより少なく誘発し（データを示さず）、活性化マーカーのアップレギュレートが標的細胞におけるＣＤ３８発現によって高まったことを示す。

最後に、サイトカインの産生がＢｉ３８－３によって誘発されることをモニタリングした。ＭＭ１．ＳとドナーＴ細胞との共培養により、Ｂｉ３８－３の用量依存的に、インターフェロン－γ（ＩＦＮｇ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦａ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－４、及びＩＬ－１０の産生を誘発した（データを示さず）。一方で、Ｂｉ３８－３単独での刺激又はＭＭ１．Ｓ単独との共培養は、これらのサイトカインのいずれかのＴ細胞分泌を誘導できなかった（図示せず）。これらの結果は共に、Ｂｉ３８－３がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ３８発現ＭＭ細胞に対応してＴ細胞増殖、活性化、及びサイトカイン放出を誘導するということを示す。

Ｂｉ３８－３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＭ細胞のＣＤ３８依存性Ｔ細胞媒介の殺傷を誘導する
Ｂｉ３８－３の機能を評価するため、ホタルルシフェラーゼ発現標的ＫＭＳ１１及びＭＭ１．ＳのＭＭ細胞株において健康なドナーのＰＢＭＣから単離したエフェクターＴ細胞の細胞傷害活性を測定するように共培養アッセイを行った。種々の濃度のＢｉ３８－３の存在下における殺傷パーセンテージを測定するため、残っている生存ＭＭ標的細胞の数を示すルシフェラーゼのレベルを、未処理コントロールにおいて観察されるルシフェラーゼと比較した。Ｔ細胞は、Ｂｉ３８－３の用量依存的にＫＭＳ１１標的細胞を即座に殺傷し、５０％有効濃度（ＥＣ_５０）は約５ｎｇ／ｍＬであり、この５５．６Ｋｄタンパク質では０．０９ｎＭに相当する（データを示さず）。また、Ｂｉ３８－３媒介のＴ細胞の細胞傷害活性を、ＭＭ１．Ｓ細胞との共培養において観察した。しかしながら、より高いレベルのＣＤ３８を発現するこの細胞株において、ＥＣ_５０は１０倍低く（０．５ｎｇ／ｍＬ）、Ｂｉ３８－３の効果がより強いことを示す。一方で、ＭＭ１．Ｓ又はＫＭＳ１１のＭＭ細胞の生存度は、Ｔ細胞又はＢｉ３８－３単独との共培養によって影響を受けなかった（データを示さず）。さらに、Ｂｉ３８－３はＭＭ１．Ｓ－ＫＯ細胞におけるＴ細胞媒介の殺傷不良をもたらし、最も多い用量のＢｉ３８－３（１ｎｇ／ｍＬ）でもＣＤ３８欠損ＭＭ１．Ｓ細胞の約半数が共培養後も生存した（データを示さず）。したがって、Ｂｉ３８－３は、ＣＤ３８発現ＭＭ細胞における効果的なＴ細胞の細胞傷害活性を誘導した。

Ｂｉ３８－３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて腫瘍形質細胞の自家Ｔ細胞媒介の殺傷を誘導する
次に、自家Ｔ細胞によってＭＭ細胞の溶解を誘導するＢｉ３８－３の可能性について分析した。診断時の患者から単離した標的腫瘍形質細胞を、種々の濃度のＢｉ３８－３の存在下において、精製した自家エフェクターＴ細胞と共に、Ｅ：Ｔ比が１：５でインキュベートした。一晩の共培養物のＦＡＣＳ分析により、生存ＣＤ１３８陽性ＭＭ細胞の数がＢｉ３８－３の用量依存的に減少し、ＥＣ_５０が患者に応じて０．５～１ｎｇ／ｍＬの範囲であることを明らかにした（図１）。重要な点として、Ｔ細胞が存在しない場合、Ｂｉ３８－３は、新しい初代ＭＭ細胞に対して毒性を示さなかった。Ｂｉ３８－３誘導の自家Ｔ細胞の細胞傷害性を、再発時のＭＭ患者の腫瘍形質細胞においてさらに検討し、同様の効力を示し、ＥＣ_５０が０．２～１ｎｇ／ｍＬの範囲であった（図１）。したがって、このｉｎ ｖｉｔｒｏの実験において、Ｂｉ３８－３は、診断時及び再発時の両方における患者の腫瘍形質細胞の自家Ｔ細胞媒介の殺傷を誘発した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ３８高発現ＭＭ細胞に対するＢｉ３８－３の特異的活性
ＣＤ３８は形質細胞に高発現される一方、造血細胞のサブセットを含む種々の細胞型にも発現される。血液細胞におけるＢｉ３８－３の作用を検討するため、ドナーのＰＢＭＣを、種々の濃度のＢｉ３８－３で２４時間処理し、様々な細胞個体群をＦＡＣＳによって分析した（データを示さず）。生存ゲートに入るＣＤ１４発現単球のパーセンテージがＢｉ３８－３の用量依存的に著しく低下するということを観察した（データを示さず）。一方で、ＣＤ１４陽性細胞のパーセンテージが低下するとき、合わせてＰＢＭＣ個体群の約６０％に相当するＣＤ４及びＣＤ８Ｔリンパ球のパーセンテージは、Ｂｉ３８－３に対応してわずかに増加した。同様に、Ｂ（ＣＤ１９＋）細胞及びＮＫ（ＣＤ５６＋）細胞個体群は、高濃度のＢｉ３８－３でも（１００ｎｇ／ｍＬ）、わずかに上昇した、又は同様のレベルにとどまった（それぞれ約１０％及び５％）（データを示さず）。次に、血液細胞表面におけるＣＤ３８の発現がＢｉ３８－３によって損なわれるかどうかを検討した。ＦＡＣＳ分析は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞におけるＣＤ３８の平均蛍光強度（ＭＩＦ）が、増加させたＢｉ３８－３用量を含む培養物において、同様に保たれることを示した（データを示さず）。これに一致して、ＣＤ３８発現はＣＤ１４＋骨髄細胞において著しく低下しないが、細胞を検出できない、又は極少数の細胞しか検出できないということから、分析は、より多い用量のＢｉ３８－３では行えなかった（１及び１００ｎｇ／ｍＬ）。ＣＤ３８が多い（ＣＤ３８ｈｉ）ＭＭに対するＣＤ３８が中程度の（ＣＤ３８ｉｎｔ）細胞におけるＢｉ３８－３の活性を比較するため、高レベルのＣＤ３８を発現するＭＭ１．Ｓ（データを示さず）、中程度の量のＣＤ３８を発現する新しく単離したＢ細胞（データを示さず）、及び自家Ｔ細胞と共培養アッセイを行った。一晩の培養後、生存ＣＤ２０陽性Ｂ細胞及びＣＤ１３８陽性ＭＭ１．Ｓ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した。ＭＭ１．Ｓ細胞のパーセンテージが０．１ｎｇ／ｍＬのＢｉ３８－３濃度で低下し、より多い用量ではこの低下がさらに著しいということを観察した（データを示さず）。一方で、未処理の条件と比較すると、生存ＣＤ２０陽性Ｂ細胞のパーセンテージは高濃度のＢｉ３８－３でも変化しないままだった（データを示さず）。

共に低レベルのＣＤ３８を発現するＣＤ３４＋骨髄造血前駆細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるＢｉ３８－３の傷害性作用の可能性を検討するため、同様の３種の自家共培養アッセイを開発した。Ｂｉ３８－３が低濃度（１０～２ｎｇ／ｍＬ以上）でＭＭ細胞殺傷を即座に誘導する一方、これがＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇにおいて有意なＴ細胞媒介の細胞傷害性を誘発しないことを見出した（図２Ａ）。同様に、１０ｎｇ／ｍＬより低い濃度においてＣＤ３４＋造血前駆細胞における有意な傷害性はなく、最高濃度において中程度の傷害性（＞４０％生存度）があった（図２Ｂ）。この結果は共に、Ｂｉ３８－３がＣＤ３８の表面発現を損なわず、高レベルのＣＤ３８を発現する細胞のＴ細胞媒介の殺傷のみを誘発し、造血前駆細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞などの中程度のレベルのＣＤ３８発現する細胞に対して傷害性がない、又は限定的な傷害性を有する、ということを示す。

この結果は共に、Ｂｉ３８－３がＣＤ３８の表面発現を損なわず、ＣＤ３８ｉｎｔ細胞に対して有意な活性を有さずに、ＣＤ３８ｈｉ細胞のＴ細胞媒介の殺傷を誘発する、ということを示す。

Ｂｉ３８－３はｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＭ細胞増殖を制御する
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＢｉ３８－３の抗腫瘍活性はヒトＭＭ異種移植マウスモデルを用いて評価した。ＭＭ１．Ｓｌｕｃ細胞をＮＳＧマウスの尾静脈に注射し、ルシフェラーゼレベルをＩＶＩＳイメージングシステムによって４日毎に測定した。ＭＭ１．Ｓ注射の１４日後に、精製したヒトＴ細胞を、Ｂｉ３８－３あり又はなしで（０．０８ｍｇ／ｋｇ）静脈内に移植した。Ｂｉ３８－３又はビヒクルでの処置を７日間毎日繰り返した（図２Ａ）。腫瘍細胞注射の１１日後、すべてのマウスが、同様のレベルの放射（ルシフェラーゼ）を示し、ＭＭ細胞がＢｉ３８－３処置前に宿主動物において有効に生着したことを示した（図２Ｂ）。コントロールのマウスが急速な腫瘍進行を示す一方、Ｂｉ３８－３で処置したすべての動物は、Ｂｉ３８－３処置の最初の４日内に腫瘍増殖における５倍の低下を示した（図２Ｃ）。７日後、Ｂｉ３８－３で処置したマウスにおけるルシフェラーゼ発現ＭＭ細胞のレベルは、初期レベルのたった１０分の１であり、未処置のコントロールよりも５０倍低いものであった。これらの結果は、Ｂｉ３８－３がｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＭ腫瘍の進行を制御することに効果的であることを示す。

検討
本明細書において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＤ３８陽性ＭＭ細胞の特異的なＴ細胞媒介の溶解を誘発する、新しい抗ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体であるＢｉ３８－３の開発が報告される。

ＣＤ３８を標的とするモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、ＭＭの処置において治療効果を示している^１３。ＭＭに対して承認されている抗ＣＤ３８Ｍａｂであるダラツムマブは、単独^１４、又は通常の治療レジメン標準と組み合わせて^２、１５、良好な治療有効性を示している。これらの臨床データは、腫瘍形質細胞において多く発現されるＣＤ３８がＭＭの免疫治療における選択標的となることを示している。しかしながら、顕著な生存率の向上にもかかわらず、ダラツムマブで処置した多くの患者が、腫瘍細胞におけるＣＤ３８のＦｃγＲ依存性ダウンレギュレート、並びに補体依存性細胞傷害性、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性、及び抗体依存性細胞食作用の阻害を含む抵抗機序のため、最終的に再発する^１６。Ｂｉ３８－３は、自然の免疫グロブリンに見受けられるＦｃ領域を有さず、標的細胞におけるＣＤ３８発現をダウンレギュレートすることなく、その抗ＣＤ３ｓｃＦｖを介して細胞傷害性Ｔ細胞を動員する（データを示さず）。したがって、ＭＭ細胞のＢｉ３８－３媒介のＴ細胞による殺傷は、治療用抗体のＦｃγＲへの結合に関連するダラツムマブなどの抗ＣＤ３８ｍＡｂに対する抵抗の機序に影響されないと考えられる。同様に、再発時に観察されるとともに^１７、抵抗に寄与すると考えられる細胞傷害性細胞における補体阻害物質ＣＤ５５及びＣＤ５９のアップレギュレートは、Ｂｉ３８－３処置の際に起こらないと考えられる。さらに、ＭＭは免疫系異常によって特徴づけられ、ＩＭＩＤ及びデキサメタゾンを伴う治療レジメンの標準は、細胞傷害性細胞の有効性を限定的にする可能性がある。しかしながら、これらのデータは、Ｂｉ３８－３が同様の効果で診断時及び再発時における患者の腫瘍形質細胞の自家Ｔ細胞媒介の殺傷を媒介することを示す（図１）。これらのデータは共に、Ｂｉ３８－３が、ダラツムマブを含むものを包含する標準処置に対して抵抗性のある患者におけるＭＭ細胞を効果的に排除し得るということを示唆している。

ＣＤ３８がＴリンパ球、Ｂリンパ球、及びＮＫリンパ球を含む血液細胞表面に発現されることから^１８、抗ＣＤ３８ｍＡｂは、これらを標的にして、その機能を損なう可能性があり得る。実際に、ダラツムマブは、制御性Ｔ細胞を排除することが示されており^１９、これは処置の初期段階におけるＴ細胞の数及び活性の増加に関連し得るプロセスである^１６。さらに、ダラツムマブ処置は、ＮＫ細胞の枯渇をもたらし^２０、感染症に対する患者の感受性を高め得る^２１。これらのデータは、Ｂｉ３８－３がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞に有意な作用を有さないということを示す（データを示さず）。また、これが、高用量においても（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ細胞をＴ細胞の細胞傷害活性から保護しながら、ＭＭ細胞のＴ細胞媒介の殺傷を即座に誘発したということが報告される。興味深い点として、これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＢ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞におけるＴ細胞の細胞傷害性を誘発する、抗ＣＤ３８ＢｉＴＥとして近年記載されたＡＭＧ４２４の活性と対照的である^２２。特に骨髄細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＢｉ３８－３の傷害性評価のため、さらなる実験が必要であるものの、これらの結果は、Ｂｉ３８－３が低レベルのＣＤ３８を発現する細胞に影響することなくＭＭ細胞の排除を効果的に誘導し得ることを示唆する。

近年、Ｆｃ受容体様５（Ｆｃｒｌ５若しくはＦｃＨＲ５）又はＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を対象とする二重特異性抗体が報告されている^{１０、１２、２３}。ＢＣＭＡ及びＣＤ３εを標的とするＢｉＴＥであるＢＩ８３６９０９は、ＮＣＩ－Ｈ９２９マウス異種移植モデルにおいて０．５ｍｇ／Ｋｇの用量でＭＭ細胞を排除することが示された^２３。同様に、突然変異Ｆｃ領域を含む非対称二重特異性抗体であるＥＭ８０１は、同じ用量（０．５ｍｇ／Ｋｇ）で免疫低下マウスにおけるＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を効果的に排除した^１０。ＢＣＭＡの発現は、メモリーＢ細胞、並びに通常及び悪性の形質細胞の両方を含む胚中心後のＢ細胞に限定される^２４。しかしながら、ＭＭ患者の大多数がＢＣＭＡを発現するものの、症例の６～９％がこのマーカーに対して陰性であり、腫瘍形質細胞における発現レベルは患者の間でも不均一である^{２５、２６}。さらに、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞で処置したＭＭ患者において、ＢＣＭＡは腫瘍形質細胞においてダウンレギュレートされ^２７、これは腫瘍エスケープ及び再発に寄与し得るプロセスである。これらのデータは共に、ＭＭにおけるさらなる標的を同定して評価する必要性を強めるものである。実際に、効果的且つ安全な二重特異性抗体の開発は、ＭＭの処置向上に寄与し得る。

これらのデータは、Ｂｉ３８－３によるＣＤ３８の標的化が、同様のマウスモデルにおいてＢＣＭＡ二重特異性抗体について報告されたものより顕著に低い用量である０．１ｍｇ／Ｋｇ（図２）で、異種移植モデルにおいて効果的であることを示す^{１０、２３}。したがって、Ｂｉ３８－３は、ＢＣＭＡを発現しない又は極めて低いレベルのＢＣＭＡを発現するＭＭ症例において注目される治療オプションに相当し得る。

ＢｉＴＥは、いくつかの悪性病変においてその効力を証明しているものの、その臨床開発は、ポンプによる持続注入を必要とする患者における短い半減期によって妨げられている^９。ＣＤ１９／ＣＤ３ＢｉＴＥのブリナツモマブは、近年、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）の処置に承認された。興味深い点として、早期の第２相臨床試験によって、生存性の向上に関連するＭＲＤ陰性が処置の第１周期の最後に得られ得ることが示された^{２８、２９}。ＭＲＤの場合におけるブリナツモマブの最適な周期数は、ＡＬＬにおいてさらに研究すべきこととして残っているが、臨床データは、経時の限定的なＢｉＴＥ処置がなおＭＲＤ＋患者の予後を改善し得ることを示している。この研究において、Ｂｉ３８－３が、高増殖ＭＭ細胞株（ＭＭ１．Ｓ）を使用したにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてわずか３日で腫瘍負荷の６倍低下を誘発できたことを示す（図２Ｃ）。したがって、腫瘍形質細胞におけるこの急速かつ明らかな活性は、ＡＬＬにおけるブリナツモマブと同様に、Ｂｉ３８－３が、限定的な周期数の後、ＭＭ患者におけるＭＲＤを排除し、標準処置後の予後を改善し得るということを示唆する。

まとめると、本稿に提示したデータは、現場の最前線と再発との両方に使用でき得る、ＭＭの処置において選択的且つ効果的な化合物としてＢｉ３８－３を同定し、ＭＭ患者におけるさらなる評価を支援する。

（実施例２：ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製）
方法
形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
ＨＥＫ２９３細胞に、１０μｇのＣＡＲコンストラクト及びヘルパープラスミド（ｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．Ｇ）をリン酸カルシウムで遺伝子導入した。遺伝子導入の１２時間後、完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＶＳ）を新しくし、遺伝子導入の２日後、レトロウイルス粒子を含む無細胞上清を採取し、遠心分離によって濃縮して、形質導入に使用した。Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃの汎Ｔ細胞単離キットを用いて精製）を、培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ）においてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で刺激した。１６時間後、細胞を、ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎがコーティングされた（１５ｍｇ／ｍＬ）（Ｔａｋａｒａ）６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、上述のレンチウイルス粒子を一晩形質導入した。形質導入の７２時間後、ＧＦＰ及びＣＡＲの発現をフローサイトメトリーによって測定して、形質導入効率を判定した。形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞全体の８０％を超えるものに相当し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験に用いた。

結果
抗ＣＤ３８ＣＡＴ－Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＭ細胞溶解を誘発する
Ｂｉ３８－３がＭＭ細胞のＴ細胞媒介の溶解を誘導したので（実施例１参照）、その抗ＣＤ３８ｓｃＦｖがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の場合において遺伝子導入Ｔ細胞の直接の細胞傷害性を誘発できるかどうかを検証した。ＢＢ５１由来抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８のヒンジ及び膜貫通領域、及びＣＤ３ζシグナリングドメインを含む、第１世代の抗ＣＤ３８ＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲ ＣＤ３８ １Ｇ）を開発した（図３Ａ）。ＣＤ３ζ活性領域の共刺激シグナリングドメインとの会合がＣＡＲの活性を高めることが示されたので、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ、ＣＤ２８の膜貫通領域、並びにＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）及びＣＤ３ζのシグナリングドメインで、この順番において構成される、第３世代の抗ＣＤ３８ＣＡＲ（ＣＡＲ ＣＤ３８ ３Ｇ）も構築した（図３Ａ）。コントロールとして、ｓｃＦｖドメインのないＣＡＲ（ＣＡＲ Ｍｏｃｋ）、及びＣＤ３８ ３Ｇと類似するがＣＤ３ζシグナリングドメインを有しない共刺激のＣＡＲ（ＣＣＲ ＣＤ３８）を作製した。これらのコンストラクトに対応するタンパク質配列を表２に示す。各ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を、ＧＦＰ共発現可能なレンチウイルスベクターにクローニングして、ウイルス粒子を作製し、ドナーＴ細胞に形質導入した。すべてのＣＡＲコンストラクトは、ヒトＴリンパ球への形質導入において発現されたが（ＣＡＲ－Ｔ）、ＣＡＲ ＣＤ３８ ３Ｇは他のコンストラクトよりも低いレベルで発現された（データを示さず）。この違いにもかかわらず、形質導入したすべてのＴ細胞は、ＣＡＲを安定して発現しながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて２週にわたって増殖でき、ＣＤ３８発現Ｔ細胞における傷害作用の可能性があるがなおもＣＡＲ－Ｔ培養ができたことを示す（データを示さず）。エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｅ）の細胞傷害機能を検討するため、種々の比のルシフェラーゼ発現標的細胞（Ｔ）との共培養実験を行った。ＣＤ３８発現ＭＭ１．Ｓ及びＲＰＭＩ８２８８のＭＭ細胞は、Ｍｏｃｋ及びＣＣＲ ＣＤ３８のネガティブコントロールと比較して、ＣＡＲ ＣＤ３８ １Ｇ及び３Ｇの両方によって即座に溶解された（図３Ｂ）。低いＥ／Ｔ比においても（＜２．５）、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－ＴはＭＭ細胞を殺傷したが、ＣＣＲ ＣＤ３８及びＭｏｃｋ形質導入Ｔ細胞は細胞傷害不良を示した。一方で、ＣＡＲ ＣＤ３８ １Ｇ及び３Ｇは、ＣＤ３８陰性ＨＥＫ２９３細胞において溶解を誘導しない、又はほとんど溶解を誘導しなかった（図３Ｂ）。したがって、ＢＢ５１ハイブリドーマ由来の抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、様々なＣＡＲコンストラクトの場合にＭＭ細胞におけるＴ細胞の細胞傷害性を促進するのに効果的である。
表２は、第１世代及び第３世代の抗ＣＤ３８ ＣＡＲ（それぞれＣＡＲ ＣＤ３８ １Ｇ及び３Ｇ）並びに共刺激ＣＡＲ（ＣＣＲ ＣＤ３８）のアミノ酸配列を示す。

参考文献
本願において、種々の参考文献によって、本発明が属する技術の現状が記載されている。これらの参考文献の開示は、本明細書において言及によって本開示に援用される。

Claims (25)

1. ＣＤ３８の細胞外ドメインに結合特異性を有するモノクローナル抗体であって、
   － （ｉ）配列番号５に示すＨ－ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号６に示すＨ－ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７に示すＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖、並びに
   － （ｉ）配列番号８に示すＬ－ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号９に示すＬ－ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０に示すＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖を含む、モノクローナル抗体。
2. 配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するＶＨドメインを含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するＶＬドメインを含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
4. キメラ抗体、特に配列番号３に示す重鎖及び／又は配列番号４に示す軽鎖を有するキメラ抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
5. ヒト化抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
6. 請求項１に記載の抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むｓｃＦｖフラグメント。
7. 配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のｓｃＦｖフラグメント。
8. 請求項１に記載のモノクローナル抗体からの第１抗原結合部位と、少なくとも１つの第２抗原結合部位とを含む多特異性抗体。
9. 前記第２抗原結合部位をＴ細胞の動員に使用する、請求項８に記載の多特異性抗体。
10. 前記第２抗原結合部位は、ＣＤ３εの細胞外ドメインに対する特異性を有する、請求項９に記載の多特異性抗体。
11. 請求項６に記載の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、それからなる、又は実質的にそれからなる抗原結合ドメインを含む、請求項８に記載の多特異性抗体。
12. ＢｉＴＥ（登録商標）抗体である、請求項８に記載の多特異性抗体。
13. 配列番号１２に示す配列を含む、請求項１２に記載の多特異性抗体。
14. 請求項１に記載の抗体の抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
15. 請求項６に記載の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、それからなる、又は実質的にそれからなる抗原結合ドメインを含む、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
16. 細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、並びにＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ζ細胞内ドメインからなる群より選択される細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを含む、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
17. 配列番号１３又は１４に示すアミノ酸配列からなる、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
18. 請求項１に記載のモノクローナル抗体、請求項８に記載の多特異性抗体、又は請求項１４に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列。
19. 請求項１に記載のモノクローナル抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸配列。
20. 請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
21. 請求項１に記載のモノクローナル抗体、請求項８に記載の多特異性抗体、又は請求項１４に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作した宿主細胞。
22. ＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
23. 治療を必要とする対象における治療の方法であって、治療有効量の請求項１に記載の抗体及び／又は請求項８に記載の多特異性抗体及び／又は請求項２２に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群を前記対象に投与することを含む、方法。
24. 処置を必要とする対象におけるがん、さらに具体的にはＣＤ３８陽性血液悪性腫瘍を処置する方法であって、治療有効量の請求項１に記載の抗体及び／又は請求項８に記載の多特異性抗体及び／又は請求項２２に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群を前記対象に投与することを含む、方法。
25. 所定量の請求項１に記載の抗体及び／又は請求項８に記載の多特異性抗体及び／又は請求項２２に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の個体群を含む医薬組成物。
    

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