CN113993900B - 特异性识别神经生长因子的抗体及其用途 - Google Patents

特异性识别神经生长因子的抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本申请涉及特异性地识别神经生长因子(NGF)的抗体或抗原结合片段，及其制备方法和用途。

Description

特异性识别神经生长因子的抗体及其用途
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以下提交的ASCII TEXT文本文件的内容通过整体引用并入本文中：计算机可读形式(CRF)的序列表(文本名称：抗NGF抗体_序列_表.txt，记录日期：2020.04.22，大小：33KB)
技术领域
本申请提供特异性识别神经生长因子(NGF)的抗体，及其制备方法和用途，包括用其治疗神经生长因子相关疾病的方法。
背景技术
神经生长因子(NGF)最初被认为是一种促进发育中的鸡胚神经元生长的蛋白质(Bueker 1948)。现已经知道NGF属于神经营养蛋白家族(neurotrophin，NT)，这是一组结构上相关的蛋白质，包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)。它们都是分泌型蛋白质，对周围神经系统的正常发育、模式化和维护是至关重要的。所有的神经营养蛋白都有一个共同的受体，即p75，而每一种神经营养蛋白特异性地结合不同的Trk受体亚型(A、B和C)(Huang and Reichardt,2003；Kalb,2005)。NGF结合受体p75和TrkA。
在健康人中，皮下注射NGF可在几分钟内引起局部的疼痛和痛觉过敏(Petty等人，1994)。即使是低剂量系统性给予NGF也会导致肌痛。这表明NGF对伤害性感受器具有激活或敏化作用。在转基因小鼠中，慢性收缩性损伤后，由神经胶质蛋白启动子驱动的NGF体内过表达可导致神经病理性疼痛行为的增强和神经元的萌发，这证明了NGF与神经病理性疼痛和背根神经节(DRG)中交感神经萌发之间的联系。NGF促进交感神经元的萌发和伤害性感受神经元异常神经支配的形成，这被认为有助于慢性伤害性感受/疼痛状态的诱导和维持(Ramer等人，1998，1999)。在临床前研究发现，注射CFA和角叉菜聚糖的动物中，NGF水平局部升高(Ma等人，2000)。组织受损释放的NGF及其随后在外周的作用被认为在诱导热痛觉过敏方面起主要作用。这一过程被称为"外周敏化"(Mendell等人，2002)。NGF与其高亲和力受体TrkA结合，内化和反向输送到DRG的伤害性感受细胞体后，启动伤害性感受神经肽(如P物质、CGRP)的分泌，在脊髓的背角中激活PKC(Sah等人，2003)。这是一个与"中枢敏化"相关的过程。因此，中和NGF与其受体的结合是一种治疗NGF介导的疾病和病患的方法。因此，抗NGF抗体是一种治疗由NGF表达增加或对NGF敏感性增加引起的疾病的方法。针对NGF的抗体，Tanezumab(辉瑞，Pfizer)在美国专利U.S.Pat.No.7,449,616中描述以及Fulranumab(安进，Amgen)在PCT公开号WO 2005/019266中描述。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开的专利申请中披露的内容，以引用方式全部并入本文中。
申请概述
本申请提供一种分离的能够特异性地与NGF结合的抗NGF抗体，及其用于治疗NGF相关疾病的方法。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗NGF抗体，所述分离的抗NGF抗体包括重链可变域(VH)，所述VH包含：一个包含序列TYWIS(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(HC-CDR)1；一个包含序列AIDPSDSDARYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的HC-CDR2；和一个包含序列SDPGYSGYSLLYGFDS(SEQ ID NO:3)的HC-CDR3，或者在HC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及轻链可变域(VL)，所述VL包含：一个包含序列RSSQSLVQRNX1NTYLS(SEQ ID NO:30)的轻链互补决定区(LC-CDR)1，其中X1为任何氨基酸；一个包含序列QVSNRYS(SEQ IDNO:5)的LC-CDR2；和一个包含序列GQGAHLPLT(SEQ ID NO:6)的LC-CDR3，或者在LC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VL变体。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗NGF抗体，所述分离的抗NGF抗体包括重链可变域(VH)，所述VH包含：一个包含序列TYWIS(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(HC-CDR)1；一个包含序列AIDPSDSDARYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的HC-CDR2；和一个包含序列SDPGYSGYSLLYGFDS(SEQ ID NO:3)的HC-CDR3，或者在HC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及轻链可变域(VL)，所述VL包含：一个包含序列RSSQSLVQRNX1NTYLS(SEQ ID NO:39)的轻链互补决定区(LC-CDR)1，其中X1为G、A、S或T；一个包含序列QVSNRYS(SEQ ID NO:5)的LC-CDR2；和一个包含序列GQGAHLPLT(SEQ ID NO:6)的LC-CDR3，或者在LC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VL变体。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗NGF抗体，所述分离的抗NGF抗体包括重链可变域(VH)，所述VH包含：一个包含序列TYWIS(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(HC-CDR)1；一个包含序列AIDPSDSDARYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的HC-CDR2；和一个包含序列SDPGYSGYSLLYGFDS(SEQ ID NO:3)的HC-CDR3，或者在HC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及轻链可变域(VL)，所述VL包含：一个包含序列RSSQSLVQRNGNTYLS(SEQ ID NO:4)或RSSQSLVQRNANTYLS(SEQ ID NO:7)的轻链互补决定区(LC-CDR)1；一个包含序列QVSNRYS(SEQ ID NO:5)的LC-CDR2；和一个包含序列GQGAHLPLT(SEQ ID NO:6)的LC-CDR3，或者在LC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VL变体。
在一些实施例中，提供一种分离的抗NGF抗体，包括VH，其包含具有SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ IDNOs:14-24中任一氨基酸序列的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，分离的抗NGF抗体与人NGF的结合的Kd值为0.1pM至1nM。
在一些实施例中，提供一种分离的抗NGF抗体，包括：VH，其包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列或包含与SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列具有至少90％序列同源性的变体序列；以及VL，其包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列或包含与SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列具有至少90％序列同源性的变体序列。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗NGF抗体，所述分离的抗NGF抗体包括：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的VL；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL；(iii)包含氨基酸序列SEQID NO:8的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的VL；(iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL；(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL；(vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的VH和包含氨基酸序列SEQ IDNO:20的VL；(vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的VL；(viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL；(ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VH和包含氨基酸序列SEQ IDNO:20的VL；(x)包含氨基酸序列SEQID NO:13的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的VL；或(xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的VL。
在一些实施例中，提供一种分离的抗NGF抗体，其与上述任一种分离的抗NGF抗体竞争性地结合NGF。在一些实施例中，提供一种分离的抗NGF抗体，其与上述任一种分离的抗NGF抗体特异性地结合相同的表位。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗NGF抗体，所述分离的抗NGF抗体包含Fc片段。在一些实施例中，所述分离的抗NGF抗体是全长的IgG抗体。在一些实施例中，所述分离的抗NGF抗体是全长的IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，所述分离的抗NGF抗体是嵌合的、全人的或人源化的。在一些实施例中，所述分离的抗NGF抗体是抗原结合片段，其选自由Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、单链抗体(scFv)、Fv片段、dAb、Fd、纳米抗体、双链抗体和线性抗体组成的组中。
在一些实施例中，提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码如上所述任一种抗NGF抗体。在一些实施例中，提供一种载体，所述载体包含如上所述任一种核酸分子。在一些实施例中，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述任一种抗NGF抗体、如上所述任一种核酸分子或如上所述任一种载体。在一些实施例中，提供一种制备抗NGF抗体的方法，包括：a)在有效表达抗NGF抗体的条件下培养上述任一种宿主细胞；并且b)从所述宿主细胞中获得所表达的抗NGF抗体。
在一些实施例中，提供一种治疗所需个体疾病或病症的方法，包括向所述个体施用有效量的如上所述的任一种抗NGF抗体。在一些实施例中，提供如上所述的任一种抗NGF抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。在一些实施例中，所述疾病或病症是由NGF表达增加或对NGF敏感性增加引起。在一些实施例中，所述疾病或病症选自由炎症性疼痛、手术后切口疼痛、神经性疼痛、骨折疼痛、痛风关节疼痛、带状疱疹后神经痛、烧伤引起的疼痛、癌症疼痛、骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛、坐骨神经痛和与镰状细胞危象相关的疼痛组成的组中。
同时还提供包含如上所述的任一种抗NGF抗体或其片段的药物组合物、试剂盒以及生产制品。
附图说明
图1A-1C所示结果为与对照抗体Tanezumab相比，优化的抗NGF抗体对NGF与受体TrkA结合的抑制作用。图1A所示结果为Ab4、Ab6、Ab10、Ab16或Ab36对NGF与受体TrkA结合的抑制作用。图1B所示结果为Ab37、Ab44、Ab46、Ab47或Ab54对NGF与受体TrkA结合的抑制作用。图1C所示结果为Ab4或Ab61对NGF与受体TrkA结合的抑制作用。
图2所示结果为与对照抗体Tanezumab相比，优化的抗NGF抗体Ab4或Ab61对NGF与受体p75结合的抑制作用。
图3A-3C所示结果为与对照抗体Tanezumab或Fulranumab相比，优化的抗NGF抗体与神经营养蛋白的交叉反应性。图3A所示结果为优化的抗NGF抗体Ab4、Ab6、Ab36、Ab44或Ab54与BDNF的交叉反应性。图3B所示结果为优化的抗NGF抗体Ab4、Ab6、Ab36、Ab44或Ab54与NT-3的交叉反应性。图3C所示结果为优化的抗NGF抗体Ab4、Ab6、Ab36、Ab44或Ab54与NT-4的交叉反应性。
图4A-4C所示结果为与对照抗体Tanezumab或Fulranumab相比，优化的抗NGF抗体的多特异性。图4A所示结果为优化的抗NGF抗体Ab4、Ab6、Ab36、Ab44或Ab54对dsDNA的多特异性。图4B所示结果为优化的抗NGF抗体Ab4、Ab6、Ab36、Ab44或Ab54对胰岛素的多特异性。图4C所示结果为优化的抗NGF抗体Ab4、Ab6、Ab36、Ab44或Ab54对杆状病毒颗粒的多特异性。
图5A-5B所示结果为优化的抗NGF抗体对NGF诱导的TF-1细胞增殖实验的抑制作用。图5A所示结果为优化的抗NGF抗体Ab6、Ab10或Ab16抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖。图5B所示结果为优化的抗NGF抗体Ab6、Ab36、Ab37或Ab54抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖。
图6所示结果为优化的抗NGF抗体Ab4或Ab61在PC12细胞中抑制NGF依赖的ERK1/2磷酸化。
图7所示结果为与对照抗体Tanezumab相比，优化的抗NGF抗体Ab4或Ab61对NGF诱导的鸡DRG神经突起生长的抑制作用。
图8A-8B所示结果为与对照抗体Tanezumab相比，优化的抗NGF抗体Ab4或Ab61在足底切口预防实验中的PWT。
图9A-9B所示结果为与对照抗体Tanezumab相比，优化的抗NGF抗体Ab4或Ab61在完全弗罗伊德佐剂(CFA)诱导的炎症性疼痛实验中的PWT。
本申请的详细描述
本申请一方面提供抗NGF抗体分子。通过scFv酵母展示库筛选以及适当设计的生物化学及生物学实验的组合，我们已经鉴定出能够结合人NGF并抑制人NGF与其受体作用的高效抗体分子。本文给出的结果表明，我们的抗体对人NGF表现出高度的特异性，例如，与已知的抗NGF抗体如Tanezumab和Fulranumab相比，不会与密切相关的神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)和脑源性神经营养因子(BDNF)发生交叉反应，并且令人惊讶地是，在各种生物学实验中证明了我们的抗体甚至比已知的抗体更有效(Tanezumab和Fulranumab作为实验对照，根据已发表的序列进行表达和纯化)。
本申请所提供的抗NGF抗体包括，例如，全长抗NGF抗体、抗NGF单链抗体(scFvs)、抗NGF Fc融合蛋白、多特异性(如双特异性)抗NGF抗体、抗NGF免疫偶联物以及诸如此类的。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗NGF抗体，所述分离的抗NGF抗体包括重链可变域(VH)，所述VH包含：一个包含序列TYWIS(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(HC-CDR)1；一个包含序列AIDPSDSDARYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的HC-CDR2；和一个包含序列SDPGYSGYSLLYGFDS(SEQ ID NO:3)的HC-CDR3，或者在HC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及轻链可变域(VL)，所述VL包含：一个包含序列RSSQSLVQRNX1NTYLS(SEQ ID NO:30)的轻链互补决定区(LC-CDR)1，其中X1为任意氨基酸；一个包含序列QVSNRYS(SEQ IDNO:5)的LC-CDR2；和一个包含序列GQGAHLPLT(SEQ ID NO:6)的LC-CDR3，或者在LC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VL变体。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗NGF抗体，所述分离的抗NGF抗体包括重链可变域(VH)，所述VH包含：一个包含序列TYWIS(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(HC-CDR)1；一个包含序列AIDPSDSDARYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的HC-CDR2；和一个包含序列SDPGYSGYSLLYGFDS(SEQ ID NO:3)的HC-CDR3，或者在HC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及轻链可变域(VL)，所述VL包含：一个包含序列RSSQSLVQRNX1NTYLS(SEQ ID NO:39)的轻链互补决定区(LC-CDR)1，其中X1为G、A、S或T；一个包含序列QVSNRYS(SEQ ID NO:5)的LC-CDR2；和一个包含序列GQGAHLPLT(SEQ ID NO:6)的LC-CDR3，或者在LC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VL变体。
在一些实施例中，提供一种抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包括重链可变域(VH)，所述VH包含：一个包含序列TYWIS(SEQ ID NO:1)的HC-CDR1；一个包含序列AIDPSDSDARYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的HC-CDR2；和一个包含序列SDPGYSGYSLLYGFDS(SEQ ID NO:3)的HC-CDR3；以及轻链可变域(VL)，所述VL包含：一个包含序列RSSQSLVQRNGNTYLS(SEQ ID NO:4)或RSSQSLVQRNANTYLS(SEQ ID NO:7)的LC-CDR1；一个包含序列QVSNRYS(SEQ ID NO:5)的LC-CDR2；和一个包含序列GQGAHLPLT(SEQ ID NO:6)的LC-CDR3。
同时还提供编码抗NGF抗体的核酸，包含抗NGF抗体的组合物，以及制备和使用抗NGF抗体的方法。
定义
如本文所述，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是一种获得有益的或期望的结果的方法，包括临床结果。鉴于本申请的目的，所述有益的或期望的临床结果，包括但不限于以下一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状，减轻疾病程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)，预防或延迟疾病复发，延迟或减缓疾病进展，改善疾病状态，缓解疾病(部分或全部)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病进展，改善或提高生活质量，增加体重，和/或延长生存期。同时，“治疗”还包括疾病病理结果的减少(例如，对癌症而言，肿瘤体积)。本申请的方法考虑了这些治疗的任何一个或多个方面。
术语“抗体”包括全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包括两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原的结合。两条链中的可变区通常包括3个高变的环，被称为互补决定区(CDRs)(轻链(LC)CDRs包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDRs包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文所披露的抗体或抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat,Chothia或Al-Lazikani惯例来定义或识别(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)。重链或轻链的3个CDR区插入到被称为框架区(FRs)的侧翼区段之间，所述框架区比CDR区具有更高的保守性，并形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区并不参与抗原结合，但展示出多种效应功能。抗体是基于它们重链恒定区的氨基酸序列进行分类的。抗体的五种主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别具有α、δ、ε、γ和μ型重链。几种主要的抗体类别被分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链n)或IgA2(α2重链)。
如本文所述，术语“抗原结合片段”是指一种抗体片段，包括，例如，双链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双链抗体(ds双链抗体)、单链抗体(scFv)、scFv二聚体(二价双链抗体)，由包含一个或多个CDRs的抗体片段组成的多特异性抗体、单域抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体或者能够与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(如亲本scFv)结合相同的抗原。在一些实施例中，抗原结合片段可能包括来自特定人抗体的一个或多个CDRs，该CDRs被移植到来自一个或多个不同人抗体的框架区。
如本文所述，术语“表位”是指抗体或抗体部分结合的抗原上特定的原子或氨基酸组。如果两种抗体或抗体部分表现出与某抗原竞争性结合，则它们可能结合抗原上相同表位。
如本文所述，当第一抗体在等摩尔浓度下抑制第二抗体与NGF靶标结合至少50％(例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)时，第一抗体与第二抗体“竞争”结合NGF靶标，反之亦然。PCT出版物WO 03/48731描述了基于交叉竞争的高通量抗体“表位归类”方法。
如本文所述，术语“特异性地结合”、“特异性地识别”或“对..来说是特异性的”是指可测量的和可再现的相互作用，例如抗体与靶标的结合可以确定在异质分子群，包括生物分子中存在该靶标。例如，抗体能够特异性地识别某靶标(可以是表位)是指，与其它靶标结合相比，该抗体与该靶标的结合具有更高的亲和力，亲合力，更容易和/或更持久。在一些实施例中，特异性地识别抗原的抗体与抗原的一个或多个抗原决定簇反应，其结合亲和力是其与其它靶标结合亲和力的至少10倍。
如本文所述，一种“分离的”抗NGF抗体是指一种抗NGF抗体，其(1)与天然存在的蛋白无关，(2)不含相同来源的其他蛋白，(3)由不同种属的细胞所表达，或(4)自然界中不存在。
如本文所述，术语“分离的核酸”，是指基因组、cDNA或合成来源的核酸或其组合。根据其来源，所述“分离的核酸”(1)与自然界中发现的“分离的核酸”中的全部或部分多核苷酸无关，(2)可与自然状态下不与之相连的多核苷酸可操作性地连接，或(3)在自然界中不作为较长序列的一部分而存在。
如本文所述，术语“CDR”或“互补决定区”是指重链和轻链多肽的可变域内发现的非连续抗原结合位点。在文献Kabat et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabatet al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteins ofimmunological interest”(1991)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.et al.,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.et al.,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；和Honegger and Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)中已经描述这些特殊的区域，其中当彼此之间互相比较时，这些定义包括氨基酸残基的重合或子集。然而，采用任何一种定义方式来指示抗体或移植抗体或其变体的CDR，均包括在本文所定义和使用的术语范围之内。表1中列了由上述引用的各篇参考文献所定义的CDR所包括的氨基酸残基的位置，以示比较。CDR预测的算法和结合界面在本领域是已知的，包括，例如Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.et al.,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.et al.,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)中均有描述。本段中所引用的参考文献的内容以其整体引用并入本文中，以用于本申请和可能包含在本文中的一个或多个权利要求中。
表1:CDR定义
1氨基酸残基编号参照上述Kabat et al.中的命名方法
2氨基酸残基编号参照上述Chothia et al.中的命名方法
3氨基酸残基编号参照上述MacCallum et al.中的命名方法
4氨基酸残基编号参照上述Lefranc et al.中的命名方法
5氨基酸残基编号参照上述Honegger and Plückthun中的命名方法
术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分与来自特定种属或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列一致或具有同源性，而这个(些)链的剩余部分与来自另一种属或属于其它抗体种类或亚类的抗体中的相应序列一致或具有同源性的抗体，以及此类抗体的片段，只要其具有本申请中的生物学活性(见U.S.Patent No.4,816,567；andMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
“Fv”是包含完整抗原识别及结合位点的最小抗体片段。该片段是由一个重链可变域和一个轻链可变域紧密非共价连接形成的二聚体。通过这两个域的折叠衍生出6个高变环(轻链和重链中各3个环)，所述高变环为抗体提供了用于结合抗原的氨基酸残基，并且赋予抗体与抗原结合的特异性。然而，即使单个可变域(或Fv片段的一半，其仅包含对抗原具有特异性的3个CDRs，)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整的结合位点。
“单链Fv”，也可简写成“sFv”或“scFv”，是包含被连接成单一多肽链的VH和VL抗体域的抗体片段。在一些实施例中，scFv多肽进一步包括VH和VL域之间的连接多肽，该连接多肽使得scFv形成抗原结合的理想结构。关于scFv的概述，见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双链抗体(diabodies)”是指，在VH和VL域之间采用短接头(例如5～10个残基)构建scFv片段(见上段内容)制备而成的一种小抗体片段，这样就使得可变域在链间而不是链内进行配对，产生一个双价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性的双链抗体是两个“交叉”scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL域位于不同的多肽链上。在EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中全面描述了双链抗体。
非人源(如啮齿类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包括最少的来自非人源抗体的序列。大多数情况下，人源化抗体是人源免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的高变区(HVR)残基被来自非人源种属例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的且具有理想的抗体特异性，亲和力和性能的高变区残基所取代(供体抗体)。在某些情况下，人源免疫球蛋白框架区(FR)中的残基被相应的非人源残基所取代。另外，人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中均不存在的残基。这些修饰能够进一步改善抗体的性能。通常，人源化抗体会包含基本上所有，至少一个，通常两个可变域，其中所有或基本上所有的高变环均与非人免疫球蛋白的高变环相对应，以及所有或基本上所有的框架区均是人免疫球蛋白序列。人源抗体任选地也还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。具体细节可以参考Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992).。
本文所鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为：在认为保守性取代属于序列同一性的一部分的情况下进行序列对比，候选序列与待比较多肽序列中相同氨基酸残基所占的百分比。可以通过本领域技术范围内的多种比对方式来确定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE软件等可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适的参数，包括在所比较序列的全长上实现最大化比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，氨基酸序列同一性百分比数值是使用序列比对电脑程序MUSCLE(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMCBioinformatics 5(1):113,2004)生成的。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一些实施例中，本申请所述的FcR是结合IgG抗体(一种γ受体)的FcR，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要在细胞质结构域有所不同。激活受体FcγRIIA的胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(见M.inAnnu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。所述术语还包括同种异型，例如FcγRIIIA同种异型:FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131和/或FcγRIIA-H131。在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)和Capel et al.,Immunomethods4:25-34(1994)；and de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中对FcRs进行了描述。本申请中术语FcR涵盖其他类型的FcRs，包括将来鉴定的FcRs。术语FcR同时还包括新生儿受体FcRn，其负责向新生儿转移母体IgGs(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)and Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。
术语“FcRn”指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn与主要组织相容性复合体(MHC)在结构上相似，由α链非共价结合到β2微球蛋白上组成。新生儿Fc受体FcRn的多种功能在Ghetieand Ward(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766.中进行了描述。FcRn在免疫球蛋白IgGs从母体向新生儿的被动转运和调控血清IgG水平中起到重要作用。FcRn作为一种救助受体，可以在细胞内和细胞间以完整的形式结合和运输胞吞化的IgG，并使它们免于经受默认的降解途径。
人IgG Fc区的“CH1结构域”通常从118位氨基酸延伸到215位氨基酸(EU编号系统)。
“铰链区”通常被定义为从人IgG1的216位Glu延伸到230位Pro(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过将形成重链间二硫键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于与IgG1相同位置后，可以使得其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从231位氨基酸延伸到340位氨基酸。CH2结构域的独特之处在于，它不会与另一个区域紧密配对，而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入了两条N端连接的支链糖链。据推测，糖类可能作为域与域间配对的替代，有助于保持CH2结构域稳定。Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3”结构域包括在Fc区内从C末端残基延伸到CH2结构域(从341位氨基酸到抗体序列的C末端，通常为IgG的第446或447位氨基酸残基)。
“功能性Fc片段”具有天然Fc区序列所具有的“效应功能”。示例性的“效应功能”包括C1q结合；补体依赖的细胞毒作用(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(如B细胞受体；BCR)等。这类效应功能通常需要Fc区与结合结构域(如抗体可变区)结合，并且可以使用本领域公知的多种实验方法进行评估。
具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的IgG Fc变体的抗体，与亲本多肽或包含天然Fc序列的多肽相比，其FcR结合活性和/或ADCC活性增强或减弱。表现出与FcR“结合增强”的Fc变体与亲本多肽或包含天然IgG Fc序列的多肽相比，其与至少一种FcR具有更高的结合亲和力(例如更低的表观Kd或IC50值)。在一些实施例中，与亲本多肽相比，结合能力增强3倍，例如5、10、25、50、60、100、150、200，甚至高达500倍或结合力提高25％到1000％。表现出与FcR“结合降低”的Fc变体，与亲本多肽相比，其与至少一种FcR具有更低的亲和力(例如更高的表观Kd或IC50值)。与亲本多肽相比，其结合能力下降40％或更多。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用”或“ADCC”是一种细胞毒性形式，指分泌型的Ig与存在于某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤细胞(NK)、中性粒细胞、和巨噬细胞)上的Fc受体(FcRs)结合，使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后使用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且是这种杀伤所必需的。介导ADCC的主要细胞类型中，NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的Table 3中总结了在造血细胞上FcR的表达。评估目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC实验，在美国专利No.5,500,362或5,821,337中进行了描述。适用于此类实验的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤性细胞(NK)。可选地，或者此外，目标分子的ADCC活性也可以在体内进行评估，例如在如Clynes et al.PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的动物模型中进行了描述。
包含Fc区变体的多肽与包含野生型IgG Fc多肽或亲本多肽相比，在人体效应细胞存在下表现出“增强的ADCC活性”或能够更有效的介导ADCC效应，所述包含Fc区变体的多肽在实验时与包含野生型IgG Fc多肽(或亲本多肽)数量上基本相同时，无论在体外或体内均能更有效的介导ADCC。通常采用本领域已知的任何体外ADCC实验方法来鉴定此类变体，例如用于鉴定ADCC活性的实验或方法，例如在动物模型中等。在一些实施例中，此类变体与野生型Fc(或亲代多肽)相比，介导ADCC的效率提高5到100倍，例如25到50倍。
“补体依赖的细胞毒作用”或“CDC”是指在补体存在的情况下裂解靶细胞。经典的补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)与结合同源抗原的抗体(具有适宜结构的亚类)相结合而启动的。为了评估补体激活，可以进行CDC实验，如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所描述的。在美国专利No.6,194,551B1和WO99/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列并增加或降低的C1q结合能力的多肽变体。这些专利出版物的内容通过引用明确地并入本文中。另见Idusogie et al.J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
除非另有说明，一种“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括相互之间互为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，例如编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中包含内含子。
术语“可操作性地连接”是指调控序列与异源核苷酸序列之间的功能性连接，从而使后者表达。例如，当第一个核苷酸序列与第二个核苷酸序列处于功能性关系时，第一个核苷酸序列与第二个核苷酸序列为可操作性地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，该启动子与编码序列为可操作性地连接。通常，可操作性连接的DNA序列是连续的，并且在必要时，可以在同一个阅读框中连接两个蛋白质编码区。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。如果两个比较序列的同一位置为相同的碱基或氨基酸单体亚基时，例如两个DNA分子的同一位置均为腺嘌呤，则这两个DNA分子在该位置是同源的。两个序列间的同源百分比是指两个序列中共有的匹配或同源位置的数量与位置总数之比再乘以100所得函数。例如，两个序列中如果10个位置中有6个位置是相匹配或同源的，则这两个序列的同源性为60％。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常来说，在比对两个序列时，以得到最大同源性为目的来进行对比。
本文所公开的抗NGF抗体或组合物的“有效量”是指足以实现特定目的的量。“有效量”可以凭经验和通过已知的与所述目的相关的方法确定。
药物、化合物或药物组合物的“有效量”是指足以产生有益或预期结果的量，包括临床结果，如疼痛感觉的缓解或减少。有效量可以通过一次或多次给药来实现。就本申请而言，药物、化合物或药物组合物的有效量是指足以治疗、改善、减轻和/或预防疼痛的强度的量，包括手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛，和/或骨关节炎疼痛。在一些实施方案中，“有效量”可以减少静止时的疼痛(静止疼痛)或机械引起的疼痛(包括运动后的疼痛)，或两者兼而有之，它可以在切口、切割、撕裂或损伤之前、期间或之后施用，和/或在疼痛刺激之前、期间或之后施用。正如在临床上所理解的那样，一种药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物一起实现。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下来考虑"有效量"，如果与一种或多种其他药剂一起使用，可能或已经达到了理想的结果，则可以认为单一药剂是以有效量给予的。
如本文所用的，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”是指无生物学活性或者其它不期望性质的材料，例如该材料能够加入到给予患者的药物组合物中，而不会引起显著的不良生物反应，或者，不与组合物中包含的任何其它组分以有害的方式相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学或制造检测的所需标准和/或包含在美国食品和药品管理局编制的非活性成分指南中。
本文中描述的本申请的实施例应理解为包含“由……组成”和/或“基本上由……组成”的实施例。
本文中提及“约”为一个数值或参数，包含(和描述)针对该值或参数本身的变体。例如，涉及“约X”的描述，包括“X”的描述。
如本文所用的，提及“不是(not)”一个数值或参数，通常表示并描述“除了(otherthan)”某一数值或参数之外。例如，该方法不能用于治疗X型癌症，意味着该方法通常用于治疗除X型癌症之外的其他类型。
除非上下文另有明确说明，本文和所述权利要求中所采用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数对象。
抗NGF抗体
一方面，本申请提供特异性结合NGF的抗NGF抗体。所述抗NGF抗体包括，但不限于，人源化抗体，嵌合抗体，小鼠抗体，人抗体，以及本文所述的包含重链和/或轻链CDRs的抗体分子。一方面，本申请提供与NGF结合的分离的抗体。预期的抗NGF抗体包括，例如，全长抗NGF抗体(如全长IgG1或IgG4)，抗NGF单链抗体，抗NGF Fc融合蛋白，多特异性(如双特异性)抗NGF抗体，抗NGF免疫偶联物，以及诸如此类的。在一些实施例中，抗NGF抗体是全长抗体(如全长IgG1或IgG4)或其抗原结合片段，其特异性结合NGF。在一些实施例中，抗NGF抗体是Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、单链抗体(scFv)、Fv片段、dAb、Fd、纳米抗体、双链抗体或线性抗体。在一些实施例中，特异性结合NGF的抗体是指抗体与NGF结合的亲和力至少是与非靶标结合亲和力的10倍以上(包括例如10、102、103、104、105、106、或107倍)。在一些实施例中，非靶标是指不是NGF的抗原。结合亲和力可通过本领域已知的方法来测定，如ELISA，荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀分析(RIA)。Kd值可以通过本领域已知的方法来测定，如表面等离子共振(SPR)技术或生物层干涉技术(BLI)。
尽管本文广泛地讨论了包含人序列的抗NGF抗体(例如，包含人CDR序列的人重链和轻链可变域)，但同时也考虑了非人抗NGF抗体。在一些实施例中，非人抗NGF抗体包括本文所述的抗NGF抗体的人CDR序列和非人框架区序列，在一些实施例中，非人框架区序列包括任何的用于使用如本文所述的一种或多种人CDR序列产生重链和/或轻链可变域的序列，包括例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔子、猪、牛(例如，牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类(例如，小猿，猕猴)等。在一些实施例中，非人抗NGF抗体包括将一种或多种本文所述的人CDR序列移植到非人框架区中(例如，鼠或鸡的框架区序列)所产生的抗NGF抗体。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体特异性识别人NGF中的表位。在一些实施例中，所述抗NGF抗体与除人之外其它物种的NGF发生交叉反应。在一些实施例中，所述抗NGF抗体对人NGF是完全特异性的，并且不与其它非人物种发生交叉反应。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体特异性结合人NGF中的线性表位。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体特异性结合人NGF中的非线性表位。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体与NGF蛋白(或其片段)的至少一种等位基因变体交叉反应。在一些实施例中，等位基因变体与天然存在的NGF蛋白(或其片段)相比，具有至多30个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个)的氨基酸取代(例如保守取代)。在一些实施例中，所述抗NGF抗体不与NGF蛋白(或其片段)的任何等位基因变体发生交叉反应。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体与NGF蛋白的至少一种种间变体发生交叉反应。在一些实施例中，例如，NGF蛋白(或其片段)是人NGF，并且NGF蛋白(或其片段)的种间变体是食蟹猴中的变体、小鼠中的变体或大鼠中的变体。在一些实施例中，所述抗NGF抗体不与NGF蛋白的任何种间变体发生交叉反应。
在一些实施例中，如本文所述的任一抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包括抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括IgG1型重链恒定区。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括IgG2型重链恒定区。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括IgG3型重链恒定区。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括IgG4型重链恒定区。在一些实施例中，所述重链恒定区包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:25。在一些实施例中，所述重链恒定区包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQID NO:26。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包含λ轻链恒定区。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包含κ轻链恒定区。在一些实施例中，所述轻链恒定区包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:27。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括抗体重链可变域和抗体轻链可变域。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH：包含一个HC-CDR1，其包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；一个HC-CDR2，其包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQID NO:2或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；和一个HC-CDR3，其包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:3或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含：一个包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1，一个包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2，一个包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VL，所述VL包含：一个LC-CDR1，其包含(包括由…组成或基本上由…组成)SEQ ID NOs:4或SEQ ID NO:7任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；一个LC-CDR2，其包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:5或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；和一个LC-CDR3，其包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:6或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VL，所述VL包含：一个包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NOs:4或者SEQ ID NO:7的LC-CDR1，一个包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2，一个包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗NGF抗体，所述分离的抗NGF抗体包括重链可变域(VH)，所述VH包含：一个包含序列TYWIS(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区(HC-CDR)1；一个包含序列AIDPSDSDARYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的HC-CDR2；和一个包含序列SDPGYSGYSLLYGFDS(SEQ ID NO:3)的HC-CDR3，或者在HC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及轻链可变域(VL)，所述VL包含：一个包含序列RSSQSLVQRNX1NTYLS(SEQ ID NO:30)的轻链互补决定区(LC-CDR)1，其中X1为任意氨基酸；一个包含序列QVSNRYS(SEQ IDNO:5)的LC-CDR2；和一个包含序列GQGAHLPLT(SEQ ID NO:6)的LC-CDR3，或者在LC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VL变体。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含：一个HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；一个HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；一个HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及VL，所述VL包含：一个LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；一个LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:5或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；一个LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2，一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:3的HC-CDR3，或者在HC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含：一个包含SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:7中任一氨基酸序列的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3，或者在LC-CDRs中包含至多5个氨基酸取代的VL变体。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQID NO:3的HC-CDR3；以及VL，所述VL包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQID NO:3的HC-CDR3；以及VL，所述VL包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列；以及VL，所述VL包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:1、2和3，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:4、5和6，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:1、2和3；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:4、5和6。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:1、2和3，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:7、5和6，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:1、2和3；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:7、5和6。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体重链可变区包括：一个包含序列EVQLVQSGAEVKKPGX1X2X3KISCKX4SGYX5FI(SEQ ID NO:31)的框架区FR1，其中X1为A或E，X2为T或S，X3为V或L，X4为V、G或I，X5为T或S，或者包含至多5个氨基酸取代的变体；一个包含序列WVX1QX2PGKGLEWMG(SEQ ID NO:32)的框架区FR2，其中X1为Q或R，X2为A或M，或者包含至多5个氨基酸取代的变体；一个包含序列X1VTIX2ADX3SX4X5TAYX6X7X8SSLX9X10X11DTAX12YYCAK(SEQID NO:33)的框架区FR3，其中X1为R或Q，X2为T或S，X3为T或K，X4为T或I，X5为D或S，X6为M或L，X7为E或Q，X8为L或W，X9为R或K，X10为S或A，X11为E或S，X12为V或M，或者包含至多5个氨基酸取代的变体；一个包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:34)的框架区FR4，或者包含至多5个氨基酸取代的变体。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体轻链可变区包括：一个包含序列DX1VMTQX2PLSX3PVTLGQPASISC(SEQ ID NO:35)的框架区FR1，其中X1为I或V，X2为T或S，X3为S或L，或者包含至多5个氨基酸取代的变体；一个包含序列WX1QQRPGQX2PRLLIY(SEQ ID NO:36)的框架区FR2，其中X1为L、Y或F，X2为P或S，或者包含至多5个氨基酸取代的变体；一个包含序列GVPDRFSGSGX1GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:37)的框架区FR3，其中X1为A或S，或者包含至多5个氨基酸取代的变体；一个包含序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:38)的框架区FR4，或者包含至多5个氨基酸取代的变体。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括重链可变区VH，所述VH包括：一个包含序列EVQLVQSGAEVKKPGX1X2X3KISCKX4SGYX5FI(SEQ ID NO:31)的框架区FR1，其中X1为A或E，X2为T或S，X3为V或L，X4为V、G或I，X5为T或S；一个包含序列WVX1QX2PGKGLEWMG(SEQ ID NO:32)的框架区FR2，其中X1为Q或R，X2为A或M；一个包含序列X1VTIX2ADX3SX4X5TAYX6X7X8SSLX9X10X11DTAX12YYCAK(SEQ ID NO:33)的框架区FR3，其中X1为R或Q，X2为T或S，X3为T或K，X4为T或I，X5为D或S，X6为M或L，X7为E或Q，X8为L或W，X9为R或K，X10为S或A，X11为E或S，X12为V或M；一个包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:34)的框架区FR4；以及轻链可变区VL，所述VL包括：一个包含序列DX1VMTQX2PLSX3PVTLGQPASISC(SEQ ID NO:35)的框架区FR1，其中X1为I或V，X2为T或S，X3为S或L；一个包含序列WX1QQRPGQX2PRLLIY(SEQ ID NO:36)的框架区FR2，其中X1为L、Y或F，X2为P或S；一个包含序列GVPDRFSGSGX1GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:37)的框架区FR3，其中X1为A或S；一个包含序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:38)的框架区FR4。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:8中的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQID NO:9中的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:11中的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:12中的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:13中的1个、2个或3个HC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括述VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:17中的1个、2个或3个LC-CDRs。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:19中的1个、2个或3个LC-CDRs。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括述VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:20中的1个、2个或3个LC-CDRs。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括述VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:23中的1个、2个或3个LC-CDRs。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括述VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:24中的1个、2个或3个LC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:8的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:17的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:8的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:19的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:8的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:23的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:9的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:19的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:11的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:19的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:11的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:20的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:12的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:17的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:12的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:19的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:12的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:20的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:13的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:17的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，其包含具有SEQ ID NO:8的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含具有SEQ ID NO:24的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列或包含与SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含SEQID NOs:14-24中任一氨基酸序列或包含与SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列的VH，以及包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:8或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:17或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:8或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:19或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:23或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:19或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:11或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:19或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:11或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:20或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:17或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:19或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:20或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:13或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:17或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的VL。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:8或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:24或包含与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述抗NGF抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的VL。
在一些实施例中，功能性表位可通过组合丙氨酸扫描法来解析。在此过程中，组合丙氨酸扫描技术可用于鉴定NGF蛋白中与抗NGF抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施例中，该表位是构象的，同时可以采用与NGF蛋白结合的抗NGF抗体的晶体结构来鉴定表位。
在一些实施例中，本申请提供与本文所述的任一种抗NGF抗体竞争性地结合NGF的抗体。在一些实施例中，提供能够与本文所述的任一种抗NGF抗体竞争性结合NGF上的表位的抗体。在一些实施例中，提供抗NGF抗体，其与包含VH和VL的抗NGF抗体分子结合相同的表位，其中所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列，以及所述VL包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列。在一些实施例中，提供抗NGF抗体，其与包含VH和VL的抗NGF抗体竞争性地结合NGF，其中所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列，以及所述VL包含SEQ IDNOs:14-24中任一氨基酸序列。
在一些实施例中，可以利用竞争实验来鉴定与本文所述的抗NGF抗体竞争性结合NGF的单克隆抗体。竞争实验可以通过识别相同的或空间上重叠的表位或者通过一个抗体竞争性抑制另一抗体与抗原结合来确定两个抗体是否结合相同的表位。在某些实施例中，这种竞争性抗体与本文所述的抗体结合相同的表位。一些示例性的竞争实验包括，但不限于如Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor,N.Y.)中所提到的常规实验。用于解析抗体结合的表位的详细示例性方法如Morris(1996)"Epitope Mapping Protocols，"in Methods inMolecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,N.J.)中所述。在一些实施例中，如果每种抗体阻断另一种抗体结合的50％或更多，则称其结合相同的表位。在一些实施例中，与本文所述的抗NGF抗体竞争的抗体是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
示例性抗NGF抗体序列如表2和表3所示，其中根据Kabat定义方式进行CDR编号。本领域技术人员将认识到有多种已知算法(Kabat定义方式)来预测CDR的位置以及界定抗体轻、重链可变区。包含如本文所述抗NGF抗体的CDRs、VH和/或VL序列，但基于预测算法而非下表中所示例的抗体也在本申请的范围内。
表2示例性抗NGF抗体CDR序列
表3.示例性序列
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NGF：神经生长因子
神经生长因子是由Rita Levi-Montalcini首次描述的，显示了其在交感和感觉神经元的发育、分化、成熟和保持完整性方面的重要性(Levi-Montalcini R,et al.TrendsNeurosci(1996)19:514-20)。在生理和病理事件，如遗传、代谢(糖尿病)和感染性神经疾病中，NGF参与调节周围神经纤维对热和疼痛的敏感性(Lewin GR,et al.Annu Rev Neurosci(1996)19:289-317)。Scully和Otten等人通过以前的研究报道了NGF参与交感神经元和感觉神经元的凋亡(Anand P,et al.Lancet(1994)344:129-30；Scully JL,et al.Cell BiolInt(1995)19:459-69；Ioannou MS,et al.Int J Mol Sci(2017)18:599)，进一步验证NGF与麻风病之间的关系。NGF也被确定为背根神经节(DRG)交感神经元和感觉神经元的营养剂(Levi-Montalcini R,et al.Proc Natl Acad Sci USA 1956；42:695-9)。进一步的研究发现了一系列相关的生长因子或神经营养蛋白，包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NTF3，也被称为NT-3)和NTF4(也被称为NT-4)(Barde YA，et al.EMBO J 1982；1:549-53；Ernfors P,et al.Proc Natl Acad Sci USA 1990；87:5454-8；Berkemeier LR,etal.Neuron 1991；7:857-66)。随后确定这些蛋白对哺乳动物神经系统的发育和维持至关重要。
神经生长因子在发育期和成熟期由免疫细胞和神经细胞以及外周效应细胞，如角质细胞、黑色素细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和施旺细胞，以preproNGF的形式内源性产生(Sofroniew MV,et al.Annu Rev Neurosci(2001)24:1217-81；Levi-Montalcini R,etal.Trends Neurosci(1996)19:514-20；Lewin GR,et al.Annu Rev Neurosci(1996)19:289-317)。NGF也在其他器官中合成，如性腺、甲状腺、甲状旁腺和外分泌腺(如唾液腺)(Ioannou MS，et al.Int J Mol Sci(2017)18：599；Vega JA，等，J Anat(2003)203：1-19)。NGF的表达和受体结合亲和力，以及由proNGF激活引发的细胞事件的持续时间和强度，决定了它在效应细胞或神经元中的特定活性(Ioannou MS,et al.Int J Mol Sci(2017)18:599；Patapoutian A,et al.Curr Opin Neurobiol(2001)11:272-80；Aloe L,et al.CurrNeuropharmacol(2015)13:294-303)。
如本文所述，术语“神经生长因子”和“NGF”是指神经生长因子及其至少保留了NGF部分生物活性的变体。如本文所述，NGF包括所有哺乳动物物种的天然或修饰序列的NGF，包括但不限于人、犬、猫、马或牛。
一个示例性人NGF的氨基酸序列包括或由SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29组成。
神经生长因子受体
神经营养蛋白通过两种类型的细胞表面受体发挥作用：共同的75kDa神经营养素受体(NGFR；也称为p75NTR和TNFRSF16)和特异的酪氨酸激酶受体(Trks或NTRKs)(Rodriguez-Tebar A,et al.Neuron 1990；4:487-92；Martin-Zanca D,et al.Mol CellBiol 1989；9:24-33；Klein R,et al.EMBO J1989；8:3701-9；Lamballe F,et al.Cell1991；66:967-79)。NGFR与所有神经营养素以相似的亲和力结合。该受体是TNF受体家族的成员，是一种含有一个单跨膜区的I型膜蛋白。胞外部分包括四个富含半胱氨酸的结构域，含有潜在的N-和O-连接的糖基化位点；胞内部分含有一个细胞质死亡结构域，与诱导细胞凋亡有关。第二类神经营养素受体，即Trk受体，包括一个具有配体结合特异性的同源蛋白家族。NGF优先与TrkA(NTRK1)结合，BDNF和NT-4与TrkB(NTRK2)结合，而NT-3与TrkC(NTRK3)结合。Trk受体的分子量约为140kDa，其中受体的每个单体包含约800个氨基酸。一半的总氨基酸组成受体的胞外部分；另外一半为一个单跨膜区和一个具有酪氨酸激酶活性的胞质结构域。这些受体的激酶结构域在氨基酸水平上存在约87％的同源性。配体与Trk受体的结合启动受体的二聚化，紧接着每个受体的激酶结构域中的酪氨酸残基发生转磷酸化。这些磷酸化事件与一系列细胞内信号级联的下游效应物相互作用，包括Ras有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)途径和磷脂酶Cγ(PLCγ)的招募，所有这些相互作用导致基因表达的激活，从而促进神经元的生存和/或分化(Kaplan DR,et al.CurrOpin Neurobiol 2000；10:381-91；Huang EJ,et al.Annu Rev Biochem 2003；72:609-42)。
全长抗NGF抗体
在一些实施例中，所述抗NGF抗体是全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述全长抗NGF抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施例中，所述全长抗NGF抗体包含IgG恒定区域，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的恒定区域。在一些实施例中，所述全长抗NGF抗体包含λ轻链恒定区。在一些实施例中，所述全长抗NGF抗体包含κ轻链恒定区。在一些实施例中，所述全长抗NGF抗体是全长的人抗NGF抗体。在一些实施例中，所述全长抗NGF抗体包含小鼠免疫球蛋白Fc序列。在一些实施例中，所述全长抗NGF抗体包含已经改变的或以其他方式改变的Fc序列，使得其具有增强的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)的效应功能。
因此，例如，在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，所述抗NGF抗体与NGF特异性结合。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG2恒定区的全长抗NGF抗体，所述抗NGF抗体与NGF特异性结合。在一些实施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG3恒定区的全长抗NGF抗体，所述抗NGF抗体与NGF特异性结合。在一些实施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，所述抗NGF抗体与NGF特异性结合。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，一个HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，和一个HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个LC-CDR1，其包含SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:7任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，和一个LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG2恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，一个HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQID NO:2或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，和一个HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQID NO:5或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG3恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，一个HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQID NO:2或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，和一个HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQID NO:5或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，和一个LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，一个HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，和一个HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体，和一个LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NOs:6或者包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，或者在HC-CDR序列中包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的重链可变域变体；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的LC-CDR3，或者在LC-CDR序列中包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的轻链可变域变体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述抗NGF抗体重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，所述抗NGF抗体轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，或者在HC-CDR序列中包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的重链可变域变体；以及b)轻链可变域，其所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQID NO:7的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3，或者在LC-CDR序列中包含至多3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的轻链可变域变体。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含重链可变域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列或包含与SEQ IDNOs:8-13中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及轻链可变域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列或包含与SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG2恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含重链可变域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列或包含与SEQ IDNOs:8-13中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及轻链可变域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列或包含与SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG3恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含重链可变域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列或包含与SEQ IDNOs:8-13中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及轻链可变域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列或包含与SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含重链可变域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列或包含与SEQ IDNOs:8-13中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列，以及轻链可变域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列或包含与SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同源性的变体序列。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含重链可变域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列，以及轻链可变域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含重链可变域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列，以及轻链可变域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:17的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:19的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:23的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:19的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:19的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:20的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:20的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:19的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:20的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:17的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:24的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:17的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:19的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:23的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:19的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:19的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:20的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:17的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:19的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:20的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQID NO:17的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链可变域，以及一个包含氨基酸序列SEQ IDNO:24的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
结合亲和力
结合亲和力可以采用Kd、Koff、Kon或Ka来表示。如本文所用，术语“Koff”是指抗体从抗原/抗体复合物中解离的速率常数，通过动力学选择装置测定。术语“Kon”是指抗体与抗原结合形成抗原/抗体复合物的结合速率常数。本文所用的解离常数“Kd”是指特定抗体抗原相互作用时的解离常数，是指在抗体分子溶液中，抗原占据所有抗体结合位点的一半并且达到平衡时所需的抗原浓度，等于Koff/Kon。Kd的测定假设所有的结合分子均在溶液中。抗体与细胞壁连接的情况，例如在酵母表达系统中，相应的解离速率常数采用EC50来表示，其是Kd的一个良好的近似值。亲和结合常数Ka是解离常数Kd的倒数。
平衡解离常数(Kd)可以作为反应抗体部分与抗原亲和力的指标。例如，可以通过Scatchard方法使用标记有各种标记物的抗体，和Biacore仪器(由Amersham Biosciences制造)进行简单分析，根据用户手册或附带试剂盒，通过表面等离子体共振来分析生物分子间的相互作用。使用这些方法得到的Kd值，用单位M来表示。与靶标特异性结合的抗体可能具有，例如≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M、≤10-12M或≤10-13M的Kd值。
抗体的结合特异性可以通过本领域已知的方法进行实验测定。这些方法包括，但不限于Western blots、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore测试和肽扫描等。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体特异性结合NGF靶标，其Kd值为10-7M至10-13M(例如10-7M至10-13M、10-8M至10-13M、10-9M至10-13M或10-10M至10-12M)。因此，在一些实施例中，抗NGF抗体与NGF之间结合的Kd值为10-7M至10-13M、1×10-7M至5×10-13M、10-7M至10-12M、10-7M至10-11M、10-7M至10-10M、10-7M至10-9M、10-8M至10-13M、1×10-8M至5×10-13M、10-8M至10-12M、10-8M至10-11M、10-8M至10-10M、10-8M至10-9M、5×10-9M至1×10-13M、5×10-9M至1×10-12M、5×10-9M至1×10-11M、5×10-9M-1×10-10M、10-9M至10-13M、10-9M至10-12M、10-9M至10-11M、10-9M至10- 10M、5×10-10M至1×10-13M、5×10-10M至1×10-12M、5×10-10M至1×10-11M、10-10M至10-13M、1×10-10M至5×10-13M、1×10-10M至1×10-12M、1×10-10M至5×10-12M、1×10-10M至1×10-11M、10- 11M至10-13M、1×10-11M至5×10-13M、10-11M至10-12M、10-12M至10-13M。在一些实施例中，抗NGF抗体与NGF之间结合的Kd值为10-7M至10-13M。
在一些实施例中，抗NGF抗体与非靶标之间结合的Kd值高于抗NGF抗体与靶标的Kd值，并且本文中引用的一些实施例中，抗NGF抗体与靶标(例如，NGF)的结合亲和力高于NGF抗体与非靶标的结合亲和力。一些实施例中，非靶标是指非NGF抗原。在一些实施例中，抗NGF抗体(针对NGF)与非NGF靶标结合的Kd值是抗NGF抗体和靶标NGF之间结合的Kd的至少10倍，例如10-100倍、100-1000倍、103-104倍、104-105倍、105-106倍、106-107倍、107-108倍、108-109倍、109-1010倍、1010-1011倍、1011-1012倍。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体与非靶标结合的Kd值为10-1M至10-6M(例如10-1M至10-6M，10-1M至10-5M，10-2M至10-4M)。在一些实施例中，所述非靶标是指非NGF抗原。因此，在一些实施例中，抗NGF抗体与非NGF靶标之间结合的Kd值为10-1M至10-6M、1×10-1M至5×10-6M、10-1M至10-5M、1×10-1M至5×10-5M、10-1M至10-4M、1×10-1M至5×10-4M、10-1M至10-3M、1×10-1M至5×10-3M、10-1M至10-2M、10-2M至10-6M、1×10-2M至5×10-6M、10-2M至10-5M、1×10-2M至5×10-5M、10-2M至10-4M、1×10-2M至5×10-4M、10-2M至10-3M、10-3M至10-6M、1×10-3M至5×10-6M、10-3M至10-5M、1×10-3M至5×10-5M、10-3M至10-4M、10-4M至10-6M、1×10-4M至5×10-6M、10-4M至10-5M、10-5M至10-6M。
在一些实施例中，当提及抗NGF抗体以高结合亲和力特异性地识别NGF靶标，并以低结合亲和力结合非靶标时，所述抗NGF抗体与NGF靶标结合的Kd值为10-7M至10-13M(例如10-7M至10-13M、10-8M至10-13M、10-9M至10-13M、10-10M至10-12M)，并且与非靶标结合的Kd值为10-1M至10-6M(例如10-1M至10-6M、10-1M至10-5M、10-2M至10-4M)。
在一些实施例中，当提及抗NGF抗体特异性地识别NGF时，将所述抗NGF抗体的结合亲和力与对照抗NGF抗体(例如Tanezumab)的结合亲和力进行比较。在一些实施例中，对照抗NGF抗体与NGF之间结合的Kd值是本申请所述的抗NGF抗体与NGF之间结合的Kd值的至少2倍，例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、10-100倍、100-1000倍、103-104倍。
核酸
编码抗NGF抗体的核酸分子也被考虑在内。在一些实施例中，提供一种(或一组)编码全长抗NGF抗体的核酸，包括本文所述的任一种全长抗NGF抗体。在一些实施例中，本文所述的抗NGF抗体的核酸(或一组核酸)还可以包括编码多肽标签的核酸序列(例如蛋白纯化标签，His-标签、HA标签)。
同时本文还考虑了包含抗NGF抗体的分离的宿主细胞，编码抗NGF抗体多肽组分的分离的核酸，或者包含编码本文所述的抗NGF抗体多肽组分的核酸的载体。
本申请还包括这些核酸序列的变体。例如，变体包括至少在中等严格杂交条件下与编码本申请的抗NGF抗体的核酸序列杂交的核苷酸序列。
本申请同时还提供可将本申请中核酸序列插入到其中的载体。
简言之，将编码抗NGF抗体的天然或合成的核酸插入到合适的表达载体中，使得核酸可操作性的连接到5’和3’端调控元件，例如包括启动子(例如淋巴细胞特异性启动子)和3’非翻译区(UTR)，可表达抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)。所述载体可适用于在真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆与表达载体包含调控目标核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
本申请所述的核酸也可以通过使用标准的基因递送方案，用于核酸免疫和基因治疗。核酸递送方法是本领域已知的。例如参见U.S.Pat.Nos.5,399,346、5,580,859、5,589,466，通过引用其全部内容并入本文。在一些实施例中，本申请还提供基因治疗载体。
可以将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包括，但不限于，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和柯斯质粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Green and Sambrook(2013,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)，以及其它病毒学或分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括，但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包括一个在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点以及一个或多个选择标记物(参见例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和U.S.Pat.No.6,326,193)
已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以应用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后分离重组病毒，在体内或体外递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。衍生自逆转录病毒的载体，例如慢病毒，是实现长期基因转移的合适工具，因为它们使得转基因长期稳定的整合以及在子代细胞中繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤的逆转录病毒例如小鼠白血病病毒具有额外的优势，因为它们可以转导非分裂细胞，例如肝细胞。同时，其还具有低免疫原性的额外优势。
其它的启动子元件，例如，增强子，调控转录起始频率。通常它们位于起始位点上游30-110bp处，虽然最近发现很多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，所以当元件彼此之间位置互换或移动时仍保持启动子的功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔增加到50bp，活性才会开始下降。
合适启动子的一个示例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是一个很强的组成型启动子序列，可以驱动任何与其可操作性连接的多核苷酸序列高水平表达。合适启动子的另一个示例是延伸因子1α(EF-1α)启动子。然而，也可以使用其它组成型启动子，包括但不限于，猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免病缺陷病毒长末端重复序列(HIV-LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，例如包括但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，不应将本申请局限在仅使用组成型启动子。诱导型启动子也是本申请考虑的部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要这种表达时，能启动其与之可操作性连接的多核苷酸序列表达，当不需要时，则关闭表达。诱导型启动子，包含但不局限于，金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施例中，抗NGF抗体的表达是可诱导的。在一些实施例中，编码抗NGF抗体的核酸序列可操作的连接到诱导型启动子上，包括本文所述的任一诱导型启动子。
诱导型启动子
诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要表达时，可启动与之可操作性连接的多核苷酸序列表达，而在不需要表达时，则关闭表达。真核细胞中适用的示例性诱导型启动子，包括但不限于，激素调节元件(例如，参见Mader,S.and White,J.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603-5607)、合成配体调节元件(参见Spencer,D.M.et al(1993)Science 262:1019-1024)以及电离辐射调控元件(参见Manome,Y.et al.(1993)Biochemistry 32:10607-10613；Datta,R.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1014-10153)。其它适用于体内或体外哺乳动物系统的示例性诱导型启动子参见Gingrichet al.(1998)Annual Rev.Neurosci 21:377-405。在一些实施例中，用于表达抗NGF抗体的诱导型启动子系统为Tet系统。在一些实施例中，表达抗NGF抗体的诱导型启动子系统为大肠杆菌lac抑制系统。
本申请所采用的一个示例性诱导型启动子系统为Tet系统。该系统是基于Gossen等(1993)描述的Tet系统。在一个示例性实施例中，目标多核苷酸由包含一个或多个Tet操纵子(TetO)位点的启动子控制。在非激活状态，Tet阻遏物(TetR)与TetO位点结合并抑制启动子的转录。在激活状态，例如，在存在诱导剂如四环素(Tc)、无水四环素、多西环素(Dox)或其活性类似物的情况下，诱导剂会使TetR从TetO上释放，从而导致转录发生。多西环素是四环素抗生素家族中的一员，其化学名为1-二甲氨基-2,4a,5,7-五羟基-11-甲基-4,6-二氧基-1,4a,11,11a,12,12a-六氢四烯-3-甲酰胺。
在一个实施例中，TetR经密码子优化适用于在哺乳动物细胞中表达，例如小鼠或人类细胞。由于遗传密码的简并性，大多数氨基酸由不止一个密码子编码，从而使得给定核酸的序列具有大量的变体，而其编码的氨基酸序列没有任何改变。然而，许多生物体在密码子使用方面存在差异，也称为“密码子偏好”(即，给定氨基酸使用特定密码子的偏好)。密码子偏好通常与特定密码子的优势tRNA种类的存在有关，反过来又提高了mRNA翻译的效率。因此可以通过密码子优化来定制源自特定物种的编码序列(例如，原核生物)，以提高其在不同物种(例如，真核生物)中的表达。
Tet系统的其它具体变体，包括以下的“Tet-Off”和“Tet-On”系统。在Tet-off系统中，转录在Tc或Dox存在下是失活的。在该系统中，由TetR与单纯疱疹病毒VP16强转录激活结构域融合组成的四环素调控的转录激活蛋白(tTA)，在四环素反应启动子元件(TRE)转录控制下调控靶核酸的表达。TRE元件由TetO序列串联与启动子(通常是来源于人巨细胞病毒即刻早期启动子的最小启动子序列)融合组成。在不存在Tc或Dox的情况下，tTA结合TRE并激活靶基因的转录。在存在Tc或Dox的情况下，tTA不能结合TRE，靶基因不能表达。
相反，在Tet-On系统中，转录在Tc或Dox存在下是激活的。Tet-On系统是基于反向四环素调控的转录激活因子rtTA。与tTA一样，rtTA是由TetR阻遏物与VP16反式激活域组成的融合蛋白。然而，TetR的DNA结合区中4个氨基酸的变化改变了rtTA的结合特性，使其在存在Dox的情况下只能识别靶转基因TRE上的tetO序列。所以在Tet-On系统中，只有在存在Dox的情况下，rtTA才能激活TRE调控的靶基因的转录。
另一种诱导型启动子系统是大肠杆菌的lac阻遏物系统(参见Brown et al.,Cell49:603-612(1987))。Lac阻遏物系统通过调控与包含lac操纵子(lacO)的启动子可操作性连接的目标多核苷酸的转录发挥功能。Lac阻遏物(lacR)与LacO结合，进而阻止目标多核苷酸的转录。通过合适的诱导剂来诱导目标多核苷酸的表达，例如，异丙基-β-D硫代半乳糖吡喃苷(IPTG)。
为了评估多肽或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可包含选择标记基因或报告基因或二者都有，以便于从病毒载体转染或感染的细胞群体中识别和选择表达细胞。在其他方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并在共转染实验中使用。选择标记基因或报告基因都可侧接于合适的调控序列，使其在宿主细胞中能够表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素耐药基因，如neo以及类似基因。
报告基因可用于鉴定潜在的转染细胞和评价调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，其编码一种多肽，其表达表现为一些易于检测的特性，例如酶活性。当DNA导入受体细胞后，在合适的时间检测报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因(e.g.,Ui-Tel et al.,2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的，可以通过已知的技术制备或通过商业途径获得。通常，把具有能够显示报告基因最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体认定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评估某些物质在调节启动子驱动的转录中能力。
在一些实施例中，提供编码本文所述的任一种全长抗NGF抗体的核酸。在一些实施例中，所述核酸包括编码全长抗NGF抗体重链和轻链的一个或多个核酸序列。在一些实施例中，所述一个或多个核酸序列中的每一个包含在单独的载体中。在一些实施例中，至少有一些核酸序列包含在同一载体中。在一些实施例中，所有核酸序列包含在同一载体中。载体可以选自，例如，哺乳动物表达载体和病毒载体(如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的载体)。
将基因导入细胞并表达的方法在本领域是已知的。在表达载体的上下文中，通过本领域的任何方法载体可以很容易地导入宿主细胞中，如哺乳动物细胞、细菌、酵母或昆虫细胞。例如表达载体可以通过物理、化学或生物方法导入宿主细胞。
将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、基因枪法、显微注射、电穿孔法以及诸如此类。制备包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是熟知的。参见例如Green and Sambrook(2013,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。在一些实施例中，通过磷酸钙转染法将多核苷酸导入宿主细胞。
将目标多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物细胞，例如人类细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1型、腺病毒和腺相关病毒等。参见如U.S.Pat.Nos.5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如高分子复合物、纳米胶囊、微球、磁珠和以脂质为基础的系统，其包括水包油乳剂、胶团、混合胶团和脂质体。一种在体内和体外被用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸导入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，所述核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可被包裹进脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸结合的连接分子连接在脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体形成复合物，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质结合，悬浮在脂质中，包含在胶束中或与胶束混合，或以其它方式与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物在溶液中不限于任何特定结构。例如，它们可能以双分子层结构、以胶束或以“塌陷”结构存在。它们也可以简单的分散在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或是合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
无论采用何种方法将外源核酸导入宿主细胞中或以其他方式将细胞暴露于本申请的抑制剂中，为了确认重组DNA序列存在于宿主细胞中，可以进行多种实验。这类实验包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”实验。例如Southern和Northern blotting，RT-PCR和PCR；“生物化学”实验，例如检测某一特定多肽是否存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISAs和Western blots)或者通过本文所述的实验来进行鉴定均落入本申请范围内。
抗NGF抗体的制备
在一些实施例中，所述抗-NGF抗体是单克隆抗体或源于单克隆抗体。在一些实施例中，所述抗-NGF抗体包括来自单克隆抗体的VH和VL，或者其变体。在一些实施例中，所述抗-NGF抗体进一步包括来自单克隆抗体的CH1和CL区域，或者其变体。单克隆抗体可以应用例如本领域已知的方法制备，包括杂交瘤细胞法、噬菌体展示方法或应用重组DNA法。此外，示例性的噬菌体展示法在本文及以下的实施例中进行了描述。
在杂交瘤细胞法中，通常用免疫剂免疫仓鼠、小鼠或其他适合的宿主动物，以引发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫剂可包括目标蛋白的多肽或融合蛋白。通常，如果需要人源细胞，采用外周血淋巴细胞(PBLs)，而如果需要非人哺乳动物来源细胞，则会使用脾细胞或淋巴结细胞。使用适当的融合剂将淋巴细胞与永生细胞系进行融合，例如聚乙二醇，以形成杂交瘤细胞。永生细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿类、牛科和人源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中进行培养，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合永生细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT or HPRT)，则杂交瘤细胞培养基通常包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，该培养基能阻止HGPRT缺陷细胞生长。
在一些实施例中，永生化细胞系有效融合，通过所选择的抗体生产细胞保证抗体高水平稳定表达，并且对某些培养基敏感，例如HAT培养基。在一些实施例中，永生细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，可以从例如，加利福尼亚圣地亚哥的索尔克细胞保藏中心和弗吉尼亚马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心获得。同时还描述了人骨髓瘤和鼠-人杂交骨髓瘤细胞系用于制备人源单克隆抗体。
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对多肽的单克隆抗体。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀法或体外结合实验确定，如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。此类技术或分析方法在本领域是已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以通过例如Munson and Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)中所述的斯卡查德(Scatchard)分析确定。
在鉴定出所需的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释法对目标克隆进行亚克隆，并通过标准方法进行培养。基于此目的适合的培养基包括，例如改良Eagle培养基(DMEM)和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内以腹水的形式生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基或腹水中分离或纯化，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
在一些实施例中，根据本文所述的任一抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包含选自抗体文库(例如展示scFv或Fab片段的噬菌体文库或酵母文库)的克隆的序列。以下的一般方法可以用来生成抗体展示文库。文库是使用变性的寡核苷酸通过PCR盒式突变产生的，如Kayet al.(1996),Phage display of peptides and proteins:a laboratory manual,SanDiego,Academic Press(see,pages pg 277-291)中所述。掺杂密码子NNK被用来随机化一个氨基酸位置，以包括20个可能的氨基酸。为了随机化一个氨基酸位置，只包括具有特定性质的氨基酸子集，使用Balint et al,(1993)Gene 137(1):109-18)中描述的掺杂密码子。使用重组PCR进行位点定向诱变，如Innis et al,(1990)PCR protocols:A guide tomethods and applications(see,pp.177-183)中所述。所述克隆可以通过筛选具有所需活性的抗体片段组合文库的方法进行鉴定。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库以及筛选这些文库来获得所需结合特性的抗体。这些方法在例如Hoogenboom et al.,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2001)中进行了综述，并且在例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks and Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；and Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中进行了进一步描述。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的所有组成成分，并在噬菌体文库中随机重组，然后筛选能够结合抗原的噬菌体，如Winter etal.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常以scFv片段或以Fab片段形式展示抗体片段。免疫来源的文库噬菌体提供针对免疫原的高亲和力抗体而不需要构建杂交瘤细胞。或者，可以克隆天然库(例如来自人)，来提供针对多种非自身抗原和自身抗原的单一抗体来源，而不需任何免疫，如Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)中所述。最后，天然文库也可以通过克隆来自干细胞的非重排V-gene片段，并使用包含随机序列的PCR引物编码CDR3高变区并且在体外完成重排的方法进行制备，如Hoogenboom andWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如U.S.Pat.No.5,750,373、和US Patent Publication Nos.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764,、2007/0292936和2009/0002360。
通过噬菌体展示筛选文库中能够特异性结合靶标NGF的抗NGF抗体部分的方法来制备所述的抗NGF抗体。该文库可以是人scFv噬菌体展示文库，具有至少1×109(例如至少1×109、2.5×109、5×109、7.5×109、1×1010、2.5×1010、5×1010、7.5×1010或1×1011)种多样性的独特的人抗体片段。在一些实施例中，所述文库是人天然文库，通过从健康受试者的PMBCs和脾脏中提取的DNA构建，包含所有人重链和轻链亚家族。在一些实施例中，所述文库是人天然文库，通过从各种疾病患者体内分离的PMBCs中提取的DNA构建，例如自身免疫病的患者、癌症患者和感染性疾病的患者。在一些实施例中，所述文库是半合成的人文库，其中重链CDR3完全是随机的，所有氨基酸(除了半胱氨酸)以相同的概率存在于任何给定的位置。(参见,例如,Hoet,R.M.et al.,Nat.Biotechnol.23(3):344-348,2005)。在一些实施例中，半合成的人文库的重链CDR3长度在5到24个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个)氨基酸之间。在一些实施例中，所述文库是全合成的噬菌体展示文库。在一些实施例中，所述文库是非人噬菌体展示文库。
对靶标NGF具有高亲和力的噬菌体克隆可以通过噬菌体与靶标NGF的迭代结合进行筛选，所述靶标NGF与固相支持物结合(例如用于溶液淘选的珠子或用于细胞淘选的哺乳动物细胞)，接下来去除未结合的噬菌体，并洗脱特异性结合噬菌体。随后，洗脱结合的噬菌体克隆并用于感染合适的宿主细胞，例如E.coli XL1-Blue，进行表达和纯化。可以通过多轮淘选(例如，2、3、4、5、6或更多轮)，例如溶液淘选、细胞淘选或两者结合以富集特异性结合NGF的噬菌体克隆。富集的噬菌体克隆与靶标NGF的特异性结合可以通过本领域已知的任何方法进行检测，包括例如ELISA和FACS。
筛选抗体库的另一种方法是在酵母细胞表面展示蛋白质。Wittrup等人(USPatent Nos.6,699,658和6,696,251)开发了一种酵母细胞展示文库的方法。在这种酵母展示系统中，一个组成部分包括酵母凝集素蛋白(Aga1)，它被固定在酵母细胞壁上。另一个组成部分包括凝集素蛋白Aga2的第二个亚单位，它可以通过与Aga1蛋白的二硫键显示在酵母细胞表面。在Aga1基因整合后，蛋白质Aga1从酵母染色体上表达。一个单链可变片段(scFv)库与酵母显示质粒中的Aga2序列进行基因融合，转化后，该质粒在酵母中用营养标记外显维持。Aga1和Aga2蛋白都在半乳糖诱导的启动子控制下表达。
人类抗体V基因谱系(VH和VK片段)是使用一组简并引物通过PCR方法获得，(Sblattero,D.&Bradbury,A.Immunotechnology 3,271-278 1998)。PCR模板来自市面上的RNAs或cDNAs，包括PBMC、脾脏、淋巴结、骨髓和扁桃体。将独立的VH和VK PCR文库合并在一起，然后通过重叠延伸PCR将其组装在一起，形成scFv格式(Sheets,M.D.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,6157-61621998)。为了构建酵母scFv展示文库，通过同源重组将产生的scFv PCR产物克隆到酵母展示质粒中。(Chao,G,et al,Nat Protoc.2006；1(2):755-68.Miller KD,et al.Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30,2008)。
抗NGF抗体可以用哺乳动物细胞展示系统来发现，其中抗体部分展示在细胞表面，针对靶标NGF的特异性抗体通过抗原导向的筛选方法分离，如U.S.patent No.7,732,195B2中所述。可以建立一个代表大量人类IgG抗体基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞库，并用于发现表达高亲和力抗体基因的克隆。另一个展示系统已被开发出来，该系统通过可变剪接使同一蛋白同时在细胞表面展示和分泌，其中展示的蛋白表型保持与基因型相关，从而允许在生物物理和基于细胞的功能试验中同时对可溶性分泌抗体进行表征。这种方法克服了以前哺乳动物细胞展示的许多局限性，能够直接筛选和成熟化全长的、糖基化的IgG形式的抗体(Peter M.Bowers,et al,Methods 2014,65:44-56)。瞬时表达系统适合在恢复抗体基因之前进行单轮抗原选择，因此对从较小的库中选择抗体最有用。稳定的外显体载体提供了一个有吸引力的选择。外显体载体可以高效转染并稳定地保持低拷贝数，允许多轮淘洗和解决更复杂的抗体库。
IgG文库是基于从一组人类供体中分离出来的种系序列的V基因片段与重排(D)J区域连接。从2000个人类血液样本中收集的RNA被逆转录为cDNA，使用VH和VK特异性引物扩增VH和VK片段，并通过凝胶提取纯化。通过将VH和VK片段分别亚克隆到含有IgG1或K恒定区的展示载体中，然后电穿孔或转导到293T细胞中，从而制备IgG文库。为了制备scFv抗体展示库，通过连接VH和VK产生scFvs，然后亚克隆到展示载体中，随后该载体电穿孔或转导到293T细胞中。如我们所知，IgG库是基于种系序列的V基因片段与重排(D)J区域连接，这些基因是从一组供体中分离出来的，供体可以是小鼠、大鼠、兔子或猴子。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法进行制备，例如U.S.Patent No.4，816,567中所述。编码本申请中所述单克隆抗体的DNA可以通过常规方法(例如通过能特异性结合编码鼠源抗体轻链和重链基因的寡聚核苷酸探针)轻易的分离和测序。如上所述的杂交瘤细胞或本申请的NGF特异性噬菌体克隆或其他来源的NGF特异性克隆可以作为这种DNA的来源。分离后，可将DNA置于表达载体中，然后该载体转染入宿主细胞，例如猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢癌(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，获得在重组宿主细胞中合成的单克隆抗体。所述DNA也可以被修饰，例如用人类重链和轻链恒定结构和/或框架区域的编码序列代替同源的非人类序列(美国专利号4,816,567；Morrison et al.，同上)，或者将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列上。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本申请中抗体的恒定区，或可以取代本申请中抗体可变域中的一个抗原结合位点，形成嵌合的二价抗体。
所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，一种涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达方法。通常在Fc区的任意位置截短重链，以阻止重链相互交联。或者，相关的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基取代或被缺失以防止交联。
体外方法也适用于制备单价抗体。消化抗体产生抗体片段，特别是Fab片段，可以使用任何本领域已知的方法完成。
具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域可以与免疫球蛋白恒定区融合。优选与免疫球蛋白重链恒定区进行融合，其包括至少部分铰链，CH2和CH3区。在一些实施例中，包含轻链结合必要位点的第一重链恒定区(CH1)至少出现在一种融合体中。编码免疫球蛋白重链融合体的DNA，如果需要，还可以包括编码免疫球蛋白轻链的DNA，被插入进独立的表达载体中，并共转染至合适的宿主生物中。
全人和人源化抗体
所述抗NGF抗体(如全长的抗NGF抗体)可以是人源化抗体或全人抗体。非人(如小鼠)抗体部分的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv或抗体的其他抗原结合子序列)，其通常包括最少的源于非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(受体抗体)，其中受体CDR的残基被具有所需特异性、亲和力和性能的非人源(供体抗体)CDR残基取代，例如小鼠、大鼠或兔子的CDR。在一些实施例中，人免疫球蛋白Fv框架区残基被相应的非人源残基取代。人源化抗体还可以包含既不属于受体抗体也不在引入的CDR或框架区序列中的氨基酸残基。通常，人源化抗体包含至少一个，通常两个可变域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列。
通常，人源化抗体含有一个或多个从非人源引入的氨基酸残基。那些非人源氨基酸残基通常被称为“移入”残基，通常来自“移入”可变域。根据一些实施例，人源化基本上可以按照Winter和其同事的如下方法进行(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDRs或CDR序列取代人源抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体部分(U.S.Patent No.4,816,567)，其基本上少于完整的人源抗体，其可变域已被来自非人源的相应序列所取代。在实际中，人源化抗体部分是典型的人源抗体部分，其中一些CDR残基和可能的一些框架区残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基所取代。
全人抗体是人源化的一种替代方式。例如，目前可以制备在免疫后能够产生完整的全人抗体文库而不产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已有报道，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合子缺失，完全抑制了内源性抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变小鼠体内，可在抗原刺激下产生全人抗体，参见，例如akobovits et al.,PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immunol.,7:33(1993)；U.S.Patent Nos.5,545,806,5,569,825,5,591,669；5,545,807；和WO 97/17852。或者，可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物中(例如内源性免疫球蛋白基因已经被部分或全部沉默的小鼠)来制备全人抗体。抗原刺激后，可以发现全人抗体的产生在各个方面都与其在人类中的产生非常相似，包括基因重排、组装和抗体文库。这种方法在例如U.S.Patent Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；and 5,661,016,and Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild et al.,NatureBiotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)中进行了描述。
全人抗体也以通过体外活化B细胞(见U.S.Patents 5,567,610和5,229,275)或通过使用本领域已知的各种技术来产生，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991).Cole et al.和Boerner et al.等人的技术也可以用于制备全人单克隆抗体。见Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)and Boerner etal.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991).
抗NGF抗体变体
在一些实施例中，本文提供的抗NGF抗体变体(例如，全长的抗NGF抗体)的氨基酸序列也在考虑中。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。抗体变体的氨基酸序列可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如，抗体氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或取代。可以通过氨基酸残基缺失、插入和取代的任一组合来完成最终的构建，使其具有所需的特征。例如，抗原结合性。
在一些实施例中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗NGF抗体变体。取代突变的目标位点包括高变区(HVRs)和框架区(FRs)。可以在目标抗体中引入氨基酸取代，筛选所需活性的产物，例如，改善的生物活性，保持/改善抗原结合能力，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
保守取代如下表4所示
表4保守取代
根据侧链性质将氨基酸分为不同类别：
a、疏水氨基酸：去甲亮氨酸Norleucine、蛋氨酸Met、丙氨酸Ala、缬氨酸Val、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile；
b、中性亲水性氨基酸：半胱氨酸Cys、丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、谷氨酰胺Gln；
c、酸性氨基酸：天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu；
d、碱性氨基酸：组氨酸His、赖氨酸Lys、精氨酸Arg；
e、影响链方向的氨基酸：甘氨酸Gly、脯氨酸Pro；
f、芳香族氨基酸：色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe。
非保守氨基酸的取代包含将以上一种类别取代为另一种类别。
一种示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，可采用例如以噬菌体展示为基础的亲和力成熟技术而方便地产生。简言之，将一个或多个CDR残基进行突变，变体抗体部分展示在噬菌体或酵母上，并筛选具有特定生物活性(例如，基于TF-1细胞增殖实验的生物学活性或结合亲和力)的变体。可以在HVRs区进行改变(例如，取代)来获得改善的基于TF-1细胞增殖实验的生物学活性或抗体亲和力。可以在HVR的“热点区”产生改变，即在体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见，例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或在特异的决定性残基(SDRs)，检测所得变体VH和VL的结合亲和力。从二级文库中构建和重新选择亲和力成熟的方法已经在一些文献中进行描述，例如，Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。
在一些亲和力成熟的实施例中，通过多种方法中的任一种(例如易错PCR，链改组或寡核苷酸定向突变)，将多样性引入选择的用于亲和力成熟的可变基因中。然后创建二级文库。对该文库进行筛选，鉴定出具有所需亲和力的抗体变体。另一种引入多样性的方法包括HVR介导的方式，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。涉及抗原结合的HVR残基被特异性地识别，例如，采用丙氨酸扫描诱变或建模。通常CDR-H3和CDR-L3区域尤其是重点靶标。
在一些实施例中，取代、插入或缺失可能发生在一个或多个HVRs内，只要这种改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVRs中产生基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，本文中提供的保守性取代)。这些改变可能发生在HVR“热点区”或SDRs区域之外。在一些实施例中上文提供的变体VH和VL序列，每一个HVR或者是未发生改变，或者包含不超过1个、2个或3个氨基酸取代。
一种有用的可以鉴定出抗体中能被靶向性突变的氨基酸残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085中所述。在该方法中，一个或一组目标残基(例如，带电残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)被中性或带负电荷氨基酸(例如，丙氨酸或谷氨酸)取代，以此来确定抗体与抗原相互作用是否受到影响。可以在氨基酸的位置进一步引入取代，来证明该位置对初始取代具有功能敏感性。或者/另外，通过抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触位点。这些接触位点残基和邻近残基可作为取代候选物而被靶向或消除。筛选变体，确定它们是否具有所需要的性质。
氨基酸序列的插入，包括在氨基端和/或羧基末端的融合，长度范围从1个残基到包含100个或更多个残基的多肽，还包括在序列内插入1个或多个氨基酸残基。末端插入的例子包括N末端具有甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体，包括在抗体分子N-末端或C-末端融合一个酶(例如，ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽。
Fc区变体
在一些实施例中，将一个或多个氨基酸修饰引入本文所述的抗体(例如，全长抗NGF抗体或抗NGF抗体融合蛋白)的Fc区，从而产生Fc区变体。在一些实施例中，Fc区变体具有增强的ADCC效能，通常与结合Fc的受体(FcRs)有关。在一些实施例中，Fc区变体具有降低的ADCC效能。有很多关于Fc序列的改变或突变影响其效能的例子，例如，WO 00/42072和Shields et al.J Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)描述了与FcRs的结合增强或减弱的抗体变体。这些出版物的内容通过引用并入本文。
抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)是治疗性抗体针对肿瘤细胞的作用机制。ADCC是细胞介导的免疫防御，当靶细胞膜表面的抗原被特异性抗体(例如，抗NGF抗体)结合，免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞(例如，癌细胞)。通常ADCC效应涉及由抗体激活的NK细胞。NK细胞表达Fc受体CD16。该受体识别并结合与靶细胞表面相结合的抗体分子的Fc部分。NK细胞表面最常见的Fc受体为CD16或FcγRIII。Fc受体与抗体Fc区的结合导致NK细胞的活化，释放细胞裂解颗粒，随后靶细胞凋亡。ADCC对肿瘤细胞的杀伤作用可以通过转染高亲和力FcR的NK-92细胞的特异性实验来测定。其结果与不表达FcR的野生型NK-92进行比较。
在一些实施例中，本申请还提供抗NGF抗体变体(例如全长抗NGF抗体变体)，其包含具有部分但不是全部的效应功能Fc区，使得其在体内具有延长的半衰期，然而特定的效应功能(例如CDC或ADCC)是非必需的或有害的，这种抗NGF抗体成为本申请理想的候选。通过在体外和/或体内进行细胞毒性检测来确认CDC和/或ADCC活性的减少/消除。例如，通过Fc受体(FcR)结合试验来确认抗体缺乏FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性)但依然保留FcRn的结合能力。介导ADCC的主要细胞中，NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页的表3中总结了FcR在造血细胞上的表达。在体外评估目标分子的ADCC活性的非限制性实例在U.S.Pat.No.5,500,362中进行了描述(参见例如Hellstrom,I.et al.Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))and Hellstrom,I et al.,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；U.S.Pat.No.5,821,337(see Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性检测方法(参见，例如ACTITM流式细胞术非放射性细胞毒性检测(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.)和CYTOTOX 96TM非放射性细胞毒性检测(Promega,Madison,Wis.))。此类检测实验采用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤细胞(NK)。或者，另外地，目标分子的ADCC活性在体内进行检测，例如，在动物模型中，如Clynes et al.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所述。同时还可以进行C1q结合试验来确认抗体不能与C1q结合，从而缺乏CDC活性。参见，例如WO2006/029879和WO 2005/100402中C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活情况，可进行CDC检测(参见，例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.andM.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。使用本领域已知的方法来测定FcRn结合和体内清除/半衰期(参见，例如，Petkova,S.B.et al.,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应功能的抗体，包括在Fc区残基238、265、269、270、297、327和329位进行一个或多个残基的取代(U.S.Pat.No.6,737,056)。这些Fc变体包括在265、269、270、297和327位进行两个或多个残基的取代的Fc变体，包括被称为“DANA”的Fc变体，其在265和297位残基取代为丙氨酸(U.S.Pat.No.7,332,581)。
这类与FcRs结合能力提高或降低的抗体变体已有描述(参见例如U.S.Pat.No.6,737,056；WO 2004/056312,和Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施例中，提供一种抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)变体，其包含具有一个或多个能够增强ADCC效应的氨基酸取代的Fc区变体。在一些实施例中，Fc区变体包含一个或多个能够增强ADCC效应的氨基取代，这些取代的位置在Fc区的298、333和/或334位(EU残基编号)。在一些实施例中，所述抗NGF抗体(例如，全长的抗NGF抗体)变体包括在Fc区的S298A，E333A和K334A位氨基酸取代。
在一些实施例中，Fc区的改变导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)的改变(即增强或减弱)，参见U.S.Pat.No.6,194,551,WO 99/51642,和Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在一些实施例中，提供一种抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)变体，其包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区变体，能够延长半衰期和/或增强与Fc受体(FcRn)的结合。具有延长半衰期和改善FcRn结合的抗体在US2005/0014934A1(Hinton等)中有所描述。这些抗体Fc区包含一个或多个氨基酸取代，增强了Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体在Fc区包含238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434位的残基中的一个或多个取代，例如Fc区434位残基的取代(U.S.Pat.No.7,371,826)。
同时参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；U.S.Pat.No.5,648,260；U.S.Pat.No.5,624,821和WO 94/29351中提供其它Fc区变体的例子。
本申请考虑了包括本文所述的任一种Fc变体或其组合的抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)。
糖基化变体
在一些实施例中，对本文所提供的抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)进行改变，以增加或降低抗NGF抗体糖基化的程度。通过改变抗NGF抗体或其多肽部分的氨基酸序列以此来增加或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现添加或删除抗NGF抗体上的糖基化位点。
其中抗NGF抗体包含Fc区，可以改变与其连接的糖。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，该寡糖通常通过N-连接与Fc区CH2结构域Asn297连接，参见例如Wright et al.，TIBTECH 15:26-32(1997)。所述寡糖可包含多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖苷(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双触角寡糖结构“茎”部的GlcNAc相连接的海藻糖。在一些实施例中，可对本申请的抗NGF抗体进行寡糖修饰，从而产生具有某些改进特性的抗NGF抗体变体。
与Fc区的CH2结构域连接的N-聚糖是异质的。CHO细胞中产生的抗体或Fc融合蛋白通过岩藻糖基转移酶活性被岩藻糖基化，参见Shoji-Hosaka et al.,J.Biochem.2006,140:777-83。通常，可以在人血清中检测出一小部分天然存在的非岩藻糖基化IgGs。Fc区的N-糖基化对于其与FcγR结合很重要；而非岩藻糖基化的N-聚糖增强了Fc与FcγRIIIa的结合能力。与FcγRIIIa结合能力增强使得ADCC效应增强，这在需要细胞毒性的某些抗体治疗应用中是有利的。
在一些实施例中，当不需要Fc介导的细胞毒作用时，增强的效应功能可能是有害的。在一些实施例中，Fc片段或CH2结构域是非糖基化的。在一些实施例中，通过对CH2结构域中的N-糖基化位点进行突变以阻止其糖基化。
在一些实施例中，提供抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)变体，其包含Fc区，其中连接于Fc区的糖类结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可能会增强ADCC功能。具体地，本文提供抗NGF抗体，其相对于野生型CHO细胞产生的相同抗NGF抗体具有减少的岩藻糖。也就是说，它们的特征在于，与天然CHO细胞(例如，产生天然糖基化形式的CHO细胞，含有天然FUT8基因的CHO细胞)产生的抗体相比，具有更少量的岩藻糖。在一些实施例中，所述抗NGF抗体的N-连接聚糖具有少于50％、40％、30％、20％、10％或5％的岩藻糖。例如，该抗NGF抗体的岩藻糖含量可能是1％-80％、1％-65％、5％-65％或20％-40％。在一些实施例中，所述抗NGF抗体的N-连接聚糖不包含岩藻糖，即，其中抗NGF抗体完全不含岩藻糖，或没有岩藻糖或是去岩藻糖基化。岩藻糖的含量是通过计算连接到Asn297上的糖链内岩藻糖平均含量相对于通过MALDI-TOF质谱测量的所有连接在Asn297上的糖结构(如复合、杂交或甘露糖结构)的总量来确定的，如WO 2008/077546所述。Asn297是指位于Fc区297位的天冬酰胺残基(EU Fc区残基编号体系)。然而，由于抗体的微小序列变化，Asn297也可位于297位的上游或下游±3个氨基酸，即在294和300位之间。这些岩藻糖基化变体可能具有增强的ADCC功能。参见例如US Patent Publication Nos.US 2003/0157108(Presta,L.)，US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体相关的出版物的实例，包括US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系包括缺乏蛋白岩藻糖基化功能的Lec13 CHO细胞(Ripka etal.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US Pat Appl No US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1,Adams et al.,尤其是实施例11)，和基因敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8基因敲除的CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki etal.Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)变体进一步提供二等分寡糖，例如，其中连接于抗NGF抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。这种抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)变体可能具有减少的岩藻糖基化和/或增强的ADCC功能。这类抗体变体的实例在WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；U.S.Pat.No.6,602,684(Umana et al.)；US 2005/0123546(Umana et al.),和Ferrara et al.,Biotechnology and Bioengineering,93(5):851-861(2006)中有所描述。还提供抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)变体，其在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基。这类抗NGF抗体变体可能具有增强的CDC功能。这类变体在例如WO 1997/30087(Patel et al.)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中有所描述。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)变体能包含能与FcγRIII相结合的Fc区。在一些实施例中，包含Fc区的所述抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)变体在人效应细胞(例如T细胞)存在下具有ADCC活性，或者与具有人野生型IgG1 Fc区的其他相同抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)相比，在人效应细胞存在下，具有增强的ADCC活性。
半胱氨酸工程变体
在一些实施例中，需要制备半胱氨酸工程化的抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)，在该抗体中一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代。在一些实施例中，取代残基出现在抗NGF抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，具有活性的巯基基团位于抗NGF抗体的可及位点，可以用于将该抗NGF抗体与其它部分偶联，例如药物部分或接头-药物部分，来制备如本文中进一步描述的抗NGF免疫偶联物。半胱氨酸工程化的抗NGF抗体(例如，全长抗NGF抗体)可以按照例如U.S.Pat.No.7,521,541所述进行制备。
衍生物
在一些实施例中，本文所提供的抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)可进一步修饰以包含本领域已知并且容易获得的其它非蛋白部分。适用于衍生化抗NGF抗体的部分，包括但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例，包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环已烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性，在制造中具有优势。聚合物可以具有任意分子量，可以是支链或非支链的。连接在抗NGF抗体上的聚合物数量可以变化，并且如果连接多于一个多聚物，它们可以是相同的或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑因素来确定，包括但不限于，需要改进抗NGF抗体的特性或功能，抗NGF抗体衍生物是否用于特定条件下的治疗等。
药物组合物
本文还提供包含任一种抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)、编码抗体的核酸、包含编码抗体的核酸的载体或者包含本文所述的核酸或载体的宿主细胞的组合物(例如药物组合物，在这里也称为制剂)。在一些实施例中，提供一种药物组合物，包含本文所述的任一种抗NGF抗体和药学上可接受的载体。
可通过混合具有所需纯度的抗NGF抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))获得合适的抗NGF抗体制剂，制备成冻干制剂或液体制剂形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲剂如：磷酸盐、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属复合物(如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)；示例性制剂如WO98/56418中所述，并通过引用明确并入本文。适合皮下给药的冻干制剂在WO97/04801中有所描述。这类冻干制剂可通过合适的稀释剂重构成高蛋白浓度的制剂，并且重构的制剂可以通过皮下给药的方式给予本文中待治疗个体。阳离子脂质体或脂质体可以用于将本申请中的抗NGF抗体递送至细胞。
本文所述的制剂除包含抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)之外，还可以包含一种或多种治疗特定病症所必要的其它活性物质，优选具有活性互补且彼此无不良反应的物质。例如，除了抗NGF抗体之外，可能需要进一步包含抗炎症药物、阿片类镇痛剂或NSAIDs。这些分子以对预期目的有效的量组合存在。其它这些物质的有效量取决于制剂中的抗NGF抗体的含量，疾病或病症或治疗的类型，以及如上所述的其它因素。这些药物通常以与本文描述的相同剂量和给药途径使用，或者以目前应用剂量的1％至99％使用。
所述抗NGF抗体(例如，全长抗NGF抗体)也可以包埋在例如通过凝聚技术和界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。可以制备缓释制剂。
可以制备抗NGF抗体(例如，全长抗NGF抗体)的缓释制剂。缓释制剂的适合的实例包括含有抗体(或其片段)的固体疏水聚合物半透性基质，这些基质是成型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(U.S.Pat.No.3,773,919)，L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)以及聚-D(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类的聚合物可以使分子的释放超过100天，某些水凝胶可以在更短的时间内释放蛋白质。当包封的抗体在体内长时间停留时，它们会因暴露于37℃的潮湿环境中发生变性或聚集，可能导致生物活性的丧失或免疫原性的改变。可以根据相应的机制，设计合理的策略来稳定抗NGF抗体。例如，如果发现聚集机制是通过硫代二硫化物交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基残基、在酸性溶液中冻干、控制含水量、使用适当的添加剂、以及开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
在一些实施例中，所述抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)配制在含有柠檬酸盐、氯化钠、乙酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨酯80(吐温80)或上述任何组合的缓冲液中。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过例如应用无菌过滤膜过滤而容易地实现。
使用抗NGF抗体的治疗方法
抗NGF抗体(例如，全长的抗NGF抗体)和/或本申请所述的组合物可以施用于个体(例如，哺乳动物，如人类)来治疗与NGF高表达相关的疾病和/或病症，以及对NGF的敏感性增加的疾病和/或病症，和/或与内源性NGF有关的病理状况，包括但并不限于急性疼痛、牙齿疼痛、外伤疼痛、手术疼痛、截肢或脓肿引起的疼痛、灼痛、脱髓鞘疾病、三叉神经痛、癌症、慢性酒精中毒、中风、丘脑疼痛综合症、糖尿病、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、毒素和化疗、一般头痛、偏头痛、丛集性头痛、混合血管和非血管综合征、紧张性头痛、一般炎症、关节炎、风湿病、红斑狼疮、骨关节炎、炎症性肠病、肠易激综合征、炎症性眼病、炎症性或不稳定的膀胱病、银屑病、有炎症成分的皮肤不适、晒伤、心肌炎、皮炎、肌炎、神经炎、胶原血管疾病、慢性炎症疾病、炎症性疼痛及相关的痛觉过敏和痛觉超敏、神经性疼痛及相关的痛觉过敏和痛觉超敏、糖尿病神经病变疼痛、灼痛、交感神经维持性疼痛、传入神经阻滞综合征、哮喘、上皮组织损伤或功能障碍、单纯性疱疹，呼吸系统、泌尿生殖系统、胃肠道或血管区域的内脏运动紊乱，伤口、烧伤、过敏性皮肤反应、瘙痒症、白癜风、一般胃肠道疾病、结肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、血管舒缩性或过敏性鼻炎、或支气管疾病、痛经、消化不良、胃食管反流、胰腺炎和内脏痛。在一些实施例中，所述个体是人类。因此，本申请在一些实施方案中提供了一种治疗个体中以NGF高表达和/或NGF功能异常(如疼痛)为特征的疾病和/或病症的方法，包括向个体施用有效量的组合物(如药物组合物)，该组合物包括抗NGF抗体(如全长抗NGF抗体)，如本文所述的任意一种抗NGF抗体(如全长抗NGF抗体)。
在一些实施例中，提供一种治疗患有以NGF高表达和/或NGF功能异常(如疼痛)为特征的疾病和/或病症的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗NGF抗体的药物组合物，其中所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含：一个包含SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:7中任一氨基酸序列的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。
在一些实施例中，提供一种治疗患有以NGF高表达和/或NGF功能异常(如疼痛)为特征的疾病和/或病症的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗NGF抗体(例如，全长抗NGF抗体)的药物组合物，其中所述抗NGF抗体包括VH，所述VH包含：一个包含氨基酸序列TYWIS(SEQ ID NO:1)的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列AIDPSDSDARYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SDPGYSGYSLLYGFDS(SEQ ID NO:3)的HC-CDR3；以及VL，所述VL包含：一个包含RSSQSLVQRNGNTYLS(SEQ ID NO:4)或者RSSQSLVQRNANTYLS(SEQ IDNO:7)中任一氨基酸序列的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列QVSNRYS(SEQ ID NO:5)的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列GQGAHLPLT(SEQ ID NO:6)的LC-CDR3。
在一些实施例中，提供一种治疗患有以NGF高表达和/或NGF功能异常(如疼痛)为特征的疾病和/或病症的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗NGF抗体的组合物，其中所述抗体包括：VH，其包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列或包含与SEQ IDNOs:8-13中任一氨基酸序列具有至少90％序列同源性的变体序列；以及VL，其包含SEQ IDNOs:14-24中任一氨基酸序列或包含与SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列具有至少90％序列同源性的变体序列。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，提供一种治疗患有以NGF高表达和/或NGF功能异常(如疼痛)为特征的疾病和/或病症的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗NGF抗体的组合物，其中所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH，以及包含氨基酸序列SEQID NO:17的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的VH，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的VL。在一些实施例中，本文所述抗NGF抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗NGF抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成。
在一些实施例中，所述个体是哺乳动物(例如人、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在一些实施例中，所述个体是人类。在一些实施例中，所述个体是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施例中，所述个体年龄小于60岁(包括例如小于50、40、30、25、20、15或10岁)。在一些实施例中，所述个体年龄大于60岁(包括例如大于70、80、90或100岁)。在一些实施例中，所述个体是被诊断为或在遗传角度上易患本文所描述的一种或多种疾病或病症(例如炎症、类风湿性关节炎、手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)。在一些实施例中，所述个体具有一种或多种与本文所述的一种或多种疾病或病症相关的风险因子。
在一些实施例中，本申请提供一种向个体中对表面表达NGF的细胞递送抗NGF抗体(例如本文所述的任一种抗NGF抗体，例如分离的抗NGF抗体)的方法，所述方法包括向该个体施用包含抗NGF抗体的组合物。
本申请的抗体和多肽可用于检测、诊断和监测与NGF表达改变或异常有关的疾病、病患或病症(在一些实施例中，NGF表达增加或减少(相对于正常样品)，和/或不正常的表达，如在通常缺乏NGF表达的组织和/或细胞中存在表达，或在通常拥有NGF表达的组织或细胞中没有NGF表达)。本申请的抗体和多肽可进一步用于检测，例如在与对NGF的敏感性或反应性改变或异常有关的疾病中NGF的表达。在一些实施例中，NGF的表达在个体样本中检测出，所述个体疑似患有一种以对NGF表达的敏感性或反应性改变或异常为特征或与之相关的疾病或病症(例如，NGF促进生长和/或转移的癌症)。
任何表现出NGF异常表达的疾病的许多诊断方法和这些疾病的临床描述在本领域是已知的。这类方法包括，但不限于，例如免疫组化、PCR以及荧光原位杂交(FISH)。
在一些实施例中，本申请所述抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)和/或组合物与第二、第三或第四药剂(包括例如抗炎药物、阿片类镇痛药或非甾体抗炎药NSAIDs)联合使用来治疗与NGF异常表达的疾病或病症(例如，类风湿性关节炎疼痛，以及骨关节炎疼痛)。
在一些实施例中，对类风湿性关节炎疼痛的诊断或评估是本领域公知的。评估可根据本领域已知的方法进行，如使用各种疼痛量表来表征病人的疼痛。参见例如Katz etal.，Surg Clin North Am.(1999)79(2):231-52；Caraceni et al.，JPain SymptomManage(2002)23(3):239-55。还有一些常用的量表来测量疾病状态，如美国风湿病学院(ACR)(Felson et al.，Arthritis and Rheumatism(1993)36(6)：729-740)，健康评估问卷(HAQ)(Fries et al.，(1982)J.Rheumatol.9:789-793)，Paulus量表(Paulus,et al.,Arthritis and Rheumatism(1990)33:477-484)，和关节炎影响测量表(AIMS)(Meenam,etal.,Arthritis and Rheumatology(1982)25:1048-1053)。抗NGF拮抗剂抗体可以通过任何合适的途径给予个体。不同给药途径的例子在此描述。
在一些实施例中，对骨关节炎疼痛的诊断或评估在本领域中是公知的。评估可根据本领域已知的方法进行，如使用各种疼痛量表表征病人的疼痛。参见例如Katz et al.，Surg Clin North Am.(1999)79(2):231-52；Caraceni et al，J Pain Symptom Manage(2002)23(3):239-55。例如，可采用WOMAC行走疼痛量表(包括疼痛、僵硬和身体功能)和100mm视觉模拟量表(VAS)来评估疼痛和评价对治疗的反应。
抗NGF抗体的给药剂量和方法。
施用于个体(例如人)的抗NGF抗体(例如分离的抗NGF抗体)组合物的剂量可能因特定组合物、给药方式和治疗疾病类型的不同而不同。在一些实施例中，组合物(例如，包含分离的抗NGF抗体的组合物)的量可在疼痛治疗中有效产生客观响应(例如，部分响应或完全响应)。在一些实施例中，抗NGF抗体组合物的量足以在个体中产生完全响应。在一些实施例中，抗NGF抗体组合物的量足以在个体中产生部分响应。在一些实施例中，抗NGF抗体组合物的给药剂量(例如当单独施用时)足以在使用抗NGF抗体组合物治疗的个体群体中产生高于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的总响应率。个体对本文所述治疗方法的响应可通过，例如，疼痛分数降低来确定。
在一些实施例中，组合物(例如包含分离的抗NGF抗体的组合物)的量足以减轻疼痛的强度。在一些实施例中，组合物的量足以延长个体的总体生存期。在一些实施例中，在使用抗NGF抗体组合物治疗的个体群体中，组合物的量(例如当单独施用时)足以产生高于50％、60％、70％或77％的临床益处。
在一些实施例中，组合物(例如包含分离的抗NGF抗体的组合物)的量，单独使用或与第二，第三、和/或第四药剂联合使用时，与同一受试者治疗前相比或与未接受治疗的其它受试者的相应活性相比，其足以减轻疼痛的强度至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。可以采用标准方法来测量该疗效的大小，例如纯化酶的体外检测、基于细胞的检测、动物模型或人体试验。
在一些实施例中，当将组合物施用于个体时，组合物中抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)的量低于引起毒性效应(即，一种高于临床可接受毒性水平的效应)的水平，或者处于潜在副作用可以控制或耐受的水平。
在一些实施例中，遵循相同的给药方案，组合物的量接近的组合物的最大耐受剂量(MTD)。在一些实施例中，组合物的量高于MTD的80％、90％、95％或98％。
在一些实施例中，组合物中抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)的含量在0.001μg到1000μg的范围之内。
在如上所述任一个实施例中，组合物中的NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)的有效量，按照体重计算，为0.1μg/kg到100mg/kg的范围之内。
抗NGF抗体组合物可通过多种途径施用于个体(如人类)，包括，例如静脉注射、动脉内给药、腹腔注射、肺内给药，口服给药、吸入给药、血管内给药、肌肉注射，气管内给药，皮下注射，眼内给药，鞘内给药，粘膜给药或经皮给药。在一些实施例中，使用组合物的缓释制剂。在一些实施例中，组合物通过静脉给药。在一些实施例中，组合物通过口内给药。在一些实施例中，组合物通过动脉给药。在一些实施例中，组合物通过腹膜内给药。在一些实施例中，组合物通过肝内给药。在一些实施例中，组合物通过肝动脉输注给药。在一些实施例中，组合物施用于远离第一病灶的部位。
制品及试剂盒
在本申请的一些实施例中，提供一种制品，所述制品包含一种物质，所述物质能够用于治疗以NGF高表达和/或NGF功能异常为特征的疼痛或炎症疾病(例如，类风湿性关节炎、手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)，或者用于递送抗NGF抗体(例如一种全长抗NGF抗体)到表面表达NGF的细胞。所述制品可以包括一种容器以及在容器上或随该容器附带的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。通常，该容器内装有能够有效治疗本文所述疾病或病症的组合物，并且具有一个无菌端口(例如该容器可以是一个静脉输液袋或是一个具有皮下注射针头可刺穿盖子的小瓶)。组合物中的至少一种活性物质即为本申请所述的抗NGF抗体。标签或包装说明书标示了该组合物可以用于治疗的特定病症。标签或包装说明书进一步包含给患者施用抗NGF抗体组合物的说明书。包括联合治疗的制品和试剂盒均在本文的考虑范围之内。
包装说明书是指通常包含在治疗产品的商业包装内的说明书，其包含关于与这些治疗产品使用有关的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告信息。在一些实施例中，包装说明书标明该组合物可以用于治疗疼痛或炎症性病症(例如类风湿性关节炎、手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)。在一些实施例中，包装说明书标明该组合物可用于治疗癌症(例如类风湿性关节炎疼痛)。
此外，所述制品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲液、格林氏溶液或葡萄糖溶液。还可以包括从商业和用户角度而言所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针头和注射器。
同时还提供可用于各种目的的试剂盒，例如用于治疗以NGF高表达和/或NGF功能异常为特征的炎症性病症或疾病(例如类风湿性关节炎、手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)，或者用于递送抗NGF抗体(例如全长抗NGF抗体)到表面表达NGF的细胞中，任选与制品组合。本申请的试剂盒包括一个或多个容器，其包含抗NGF抗体组合物(或单剂量形式和/或制品)，并且在一些实施例中，进一步包含另一种药剂(例如本文所述的药剂)和/或与本文所述任一方法相一致的使用说明书。该试剂盒可进一步包括选择适合治疗个体的描述。本申请中试剂盒中所附带的使用说明书通常是标签或包装说明书上的书面说明(例如包含在试剂盒内的纸页)，机器可读的说明(例如，磁性或光学储存光盘上的说明)也是可以接受的。
例如，在一些实施例中，试剂盒包括一种包含抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)的组合物。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包含本文所述的任一种抗NGF抗体的组合物，和b)至少一种有效量的其它药剂，其能够增强抗NGF抗体的效果(如治疗效果、检测效果)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包含本文所述的任一种抗NGF抗体的组合物，和b)向个体施用抗NGF抗体组合物用于治疗以NGF高表达和/或NGF功能异常为特征的疼痛或炎症疾病(例如类风湿性关节炎、手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)的使用说明书。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包含本文所述的任一种抗NGF抗体的组合物，和b)至少一种有效量的其它药剂，其能够增强抗NGF抗体的效果(如治疗效果、检测效果)和c)向个体施用抗NGF抗体组合物和其它物质用于治疗以NGF高表达和/或NGF功能异常为特征的疼痛或炎症疾病(例如类风湿性关节炎、手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)的使用说明书。所述抗NGF抗体和其他物质可以存在于独立的容器或同一个容器中。例如，该试剂盒可以包括一种特定组合物或两种或更多种组合物，其中一种组合物包括抗NGF抗体，另一种组合物包括另一种药剂。
在一些实施例中，试剂盒包含一种(或一组)编码抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)的核酸。在一些实施例中，试剂盒包含：a)一种(或一组)编码抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)的核酸，和b)一种表达核酸(或一组核酸)的宿主细胞。在一些实施例中，试剂盒包含：a)一种(或一组)编码抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)的核酸，和b)使用说明书，适用于：i)在宿主细胞中表达抗NGF抗体，ii)制备包含抗NGF抗体的组合物，和iii)向个体施用包含抗NGF抗体的组合物来治疗以NGF高表达和/或NGF功能异常为特征的疼痛或炎症疾病(例如类风湿性关节炎、手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)一种(或一组)编码抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)的核酸，b)一种表达核酸(或一组核酸)的宿主细胞，和c)使用说明书，适用于：i)在宿主细胞中表达抗NGF抗体，ii)制备包含抗NGF抗体的组合物，和iii)向个体施用包含抗NGF抗体的组合物来治疗以NGF高表达和/或NGF功能异常为特征的疼痛或炎症疾病(例如类风湿性关节炎、手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)。
本申请所述的试剂盒以合适的形式进行包装。合适的包装包括，但不限于，小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供其它的组分，例如缓冲液和说明信息。因此，本申请还提供制品，其包括小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等等。
关于抗NGF抗体组合物的使用说明书，通常包括一些信息，诸如，剂量，给药周期和给药途径的。容器可以是单位剂量的，大包装的(如，多剂量包装)或亚单位剂量的。例如，提供一种包含足够剂量的如本文所述的抗NGF抗体(例如全长的抗NGF抗体)的试剂盒以对个体进行长期有效的治疗，例如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周，8周，3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。试剂盒还可包含多单位剂量的抗NGF抗体、药物组合物和使用说明书，并且以足够在药房中储存和使用的量进行包装，例如，医院药房和复方药房。
本领域的技术人员将认识到在本申请的范围和宗旨内可能的若干实施例。现在将通过参考以下非限制性实施例来更详细地描述本申请。以下实施例进一步阐明本申请，但不应解释为以任何方式进行限制其范围。
具体实施方式
在下述公开的实施例中，适用如下缩写：NGF(Nerve growth factor，神经生长因子)。
实施例1：制备重组人NGF和小鼠NGF并且筛选抗NGF的单链抗体(scFv)
制备重组NGF-Fc融合蛋白
合成人NGF基因或小鼠NGF基因的全长序列(上海捷瑞)，并利用适当的限制酶识别位点将其亚克隆到含有人IgG1 Fc或IgG4 Fc基因的表达载体pTT5中。按照制造商的操作说明书对这2种NGF-Fc融合蛋白进行表达和纯化。简而言之，用表达载体转染293F细胞，并将上述细胞在37℃、8％CO2，120rpm条件下培养5天。收集细胞培养液，根据制造商的操作说明书，采用蛋白A柱纯化NGF-Fc蛋白。简而言之，首先用含有50mM PBS和0.15M NaCl(pH7.2)的PBS缓冲液平衡蛋白A柱，流速150cm/h，体积为6倍柱体积。培养基的上清液(调整pH值为7.2)以150cm/h的速度流穿柱子。充分平衡后，向柱子中加入50mM柠檬酸钠(pH 3.5)，收集含有NGF-Fc的洗脱液。
制备生物素化标记的NGF抗原
按照操作说明书，采用EZ-LinkTM NHS-PEG4-Biotin(ThermoFisher)对NGF-Fc融合蛋白进行生物素化标记。简而言之，NHS-PEG4-生物素与NGF-Fc蛋白按10:1的比例混合，在25℃孵育1小时，然后在PBS中透析以去除游离的NHS-PEG4-生物素。生物素化的NGF-Fc蛋白被命名为NGF-PEG4-生物素。通过ELISA法检测生物素化效率。简言之，将NGF-PEG4-生物素起始浓度设置为500ng/mL，按照1:2的比例进行倍比稀释，稀释之后包被ELISA板。采用SA-HRP来检测信号，用生物素化标准品做对照。生物素化标记效率估计在70％以上。
筛选抗NGF单链抗体(scFv)
经过几轮淘选后，从本公司的酵母展示文库中富集并筛选NGF特异性的scFvs。构建的酵母表面展示文库的多样性大于1010。首先采用MACS磁珠分选，通过NGF对该文库进行富集。简而言之，在SGCAA培养基中，将扩增后的scFv酵母文库在20℃下诱导40-48小时。在第一轮淘选中使用1μM的PEG4-生物素化的NGF-Fc蛋白。在4℃孵育1小时后，酵母在2500g下离心5分钟，以去除未结合的抗原，并以10ml PBSM/109个酵母的浓度重悬。加入链霉亲和素磁珠，充分混合。在冰上孵育30分钟后，用5-10倍体积的PBSM稀释酵母，并流穿MACS LS柱(Miltenyi Biotec)。洗脱和收集结合的细胞，用于培养和随后的FACS分选。
采用流式细胞分选筛选抗NGF单链抗体(scFv)：对之前MACS磁珠分选中富集的酵母进行流式细胞分选。简而言之，沉淀在SGCAA培养基中诱导的酵母细胞，并在1mL PBSM缓冲液中以14,000g洗涤30s。然后将酵母细胞重悬于100μL含有NGF-Fc的PBSM缓冲液中，并在室温孵化1小时。洗涤后，对细胞进行染色：用抗人IgG-Fc(1:100稀释)和FITC-抗V5(1:100稀释)在100μL PBSM缓冲液中冰上孵育20分钟。筛选出前1％的双阳性染色细胞，并将其分选到培养基中进行细胞扩增。抗原指导的筛选重复2-3个循环，抗原浓度从500nM逐步降低到100nM。通过进一步的FACS分析对单个克隆进行检测。对NGF具有高结合力的克隆，通过PCR从酵母中获得scFv基因，并在哺乳动物表达载体中重构形成全长的IgG1构建体。在筛选过程结束时获得一组阳性抗体，并进行NGF结合ELISA试验以及抑制人类NGF与TrkA受体和p75受体结合能力的功能测试。
NGF结合ELISA实验：在人NGF结合ELISA实验中，用1μg/mL，50μL/孔，l x PBS中的重组产生的人NGF包被康宁(Corning)3366高结合力96孔板，并在4℃孵育过夜。洗净板子，用250μL的1x PBS(含有1％BSA)在室温下封闭至少30分钟。每孔加入50μL经PBS/BSA稀释液1:1稀释后的培养液上清，或用稀释液从一定浓度开始连续稀释的纯化抗体，并在37℃孵育2小时。洗涤后，在PBS/BSA中以1:3000的稀释比例加入二抗，即山羊抗人IgG Fc AP(南方生物技术公司)。室温RT孵育1小时，洗净，加入PNPP底物后，在405nm处读取OD值。
TrkA抑制ELISA实验：TrkA抑制ELISA实验是为了确定抗NGF抗体具有阻断NGF与其受体TrkA结合的能力。在该实验中，1μg/mL人TrkA-Fc(IgG1-Fc，Sinobiological)包被96孔板，4℃孵育过夜。将来自细胞培养液上清的抗体或纯化后不同稀释度的抗体与人NGF-Fc4(IgG4-Fc)以70ng/mL的终浓度在37℃预孵育2小时。然后将总计50μL的反应混合物转移到TrkA-Fc包被的96孔板中，室温孵育2小时。清洗后，以1:1000的比例加入小鼠抗人IgG4-AP二抗(Southern biotech)。室温下1小时后，洗板，加入PNPP底物后，在405nm处读取ODs。
p75抑制ELISA实验：p75抑制实验是用来识别能够抑制NGF与p75结合的抗NGF抗体。在该实验中，1μg/mL的人p75-Fc(IgG1-Fc，Sinobiological)包被96孔板，4℃孵育过夜。将直接来自上清液或纯化后的不同稀释度的抗NGF抗体与人NGF-Fc4(IgG4-Fc)以350ng/mL的终浓度在37℃预孵育2小时。然后将共50μL的反应混合物转移到p75-Fc包被的96孔板中，在室温孵育2小时。洗涤后，以1:1000的比例加入小鼠抗人IgG4-AP二抗(Southernbiotech)。室温1小时后，洗板，加入PNPP底物后，在405nm处读取ODs。
实施例2：制备和表征全长的人源NGF抗体
制备全长的抗NGF抗体
将最有潜力的scFv抗体重构成具有人IgG1的重链恒定区和人kappa轻链恒定区的人IgG1抗体分子。从酵母真核表达载体中扩增VL和VH，分别构建入真核表达载体pTT5-L(包含kappa恒定区)和pTT5-H1(包含IgG1重链恒定区)中。提取表达轻链或重链的质粒，共转染293F细胞，37℃，8％CO2，120rpm培养5天，用Protein A亲和层析柱纯化培养液。简而言之，首先采用6倍柱体积的包含0.15M NaCl的50mM PBS缓冲液(pH7.2)以150cm/h的流速平衡Protein A柱。培养液上清(调节pH至7.2)以150cm/h流速流穿柱子。在进行进一步平衡之后，采用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.5)洗脱，收集包含抗NGF抗体的洗脱液。在已构建的全长抗体中，基于其在NGF结合、TrkA和p75抑制活性方面的功能(方法如实施例1中所述)，选取Ab1为先导抗体。
抗NGF先导抗体的优化
按照说明书在Expi293TM表达系统(Thermo Fisher)中进行小规模的抗体表达。Ab1的产量是55.4mg/L，正如文献中所报道的，低表达产量被认为是与其不良的生物物理特性有关，因为SEC分析显示出现了该蛋白质的聚集物(数据未显示)。为了提高抗体的可开发性，采用了框架再造的方法，其中，在抗体框架区域中基于抗体结构分析可能负责蛋白质溶解或稳定的位点上引入几个突变。此外，出于相同的目的，选择与亲本框架具有高同源性的来自于不同VH或VK家族的抗体框架。下述抗体的每个VH或VK中的两个框架用于该抗体中：对于VH基因，采用人类VH1-69*01和VH5-51*01，以及对于VK基因，采用VK2-24*01和VK2-30*01(www.IMGT.org)。测量抗体框架和突变之间进行不同组合后所产生的抗体的表达水平和与NGF结合的EC50，结果示于表5中。编号方式是EU Kabat编号体系。
表5
NGF结合ELISA实验：NGF结合ELISA实验如实施例1所述。如表5所示，所有的抗NGF抗体和对照抗体Tanezumab(Pfizer)都以高亲和力结合NGF。
TrkA抑制ELISA实验：采用优化的抗NGF抗体Ab4、Ab6、Ab10、Ab16、Ab36、Ab37、Ab44、Ab45、Ab46、Ab47、Ab48、Ab49、Ab52、Ab54、Ab55、Ab56、Ab57、Ab58、Ab59、Ab60、Ab61和对照抗体Tanezumab(Pfizer)，一种来自小鼠杂交瘤的人源化抗体，来进一步分析这些抗体阻断NGF与其受体TrkA结合的能力。TrkA的抑制实验如实施例1所述方法进行。
如图1A-1C和表6所示，所有优化的抗NGF抗体在阻断NGF与其受体TrkA的结合方面表现出比对照抗体Tanezumab更好或与之相当的功效。
表6 TrkA抑制实验
抗体 IC50(ng/mL) 抗体 IC50(ng/mL)
Ab4 74.6 Ab49 87.8
Ab6 76.9 Ab52 70.2
Ab10 80.4 Ab54 70.2
Ab16 73.5 Ab55 75.7
Ab36 89.9 Ab56 66.5
Ab37 132.3 Ab57 73.2
Ab42 77.3 Ab58 80.0
Ab44 130.0 Ab59 74.7
Ab45 89.8 Ab60 43.4
Ab46 53.3 Ab61 70.0
Ab47 66.2 Tanezumab 60.2
Ab48 93.5
p75抑制ELISA实验：采用优化的抗NGF抗体Ab4、Ab61和对照抗体Tanezumab，一种来自小鼠杂交瘤的人源化抗体，来进一步分析这些抗体阻断NGF与其受体p75结合的能力。P75抑制试验如实施例1中所述方法进行。
如图2和表7所示，优化的抗NGF抗体Ab4和Ab61在阻断NGF与其受体p75的结合方面表现出比对照抗体Tanezumab更好或与之相当的功效。
表7 p75抑制实验
抗体 IC50(ng/mL)
Ab4 481
Ab61 577
Tanezumab 525
实施例3：表征优化的抗NGF抗体的特异性和亲和力
抗NGF先导抗体的特异性
通过测量与神经营养蛋白的交叉反应性和多特异性实验，对优化的抗NGF抗体的特异性进行表征。
神经营养蛋白的交叉反应性：众所周知，神经营养蛋白之间有较高的序列同源性，包括NGF、BDNF、NT3和NT4。事实上，它们有共同的受体p75。采用ELISA方法分别检测抗NGF抗体与BDNF、NT3或NT4之间的交叉反应。选择两种对照抗体，Tanezumab(Pfizer)，一种来自小鼠杂交瘤的人源化抗体，和Fulranumab(Amgen)，一种来自转基因小鼠的全人类抗体作为对照，进行相同的平行测试。如图3A-3C所示，与两个对照抗体Tanezumab和Fulranumab相比，优化的抗体Ab4、Ab6、Ab36、Ab44或Ab54与BDNF、NT3或NT4之间均没有产生任何明显的交叉反应，即使在100μg/mL的高浓度下也是如此。
多特异性实验：抗体的多特异性被认为与药代动力学和药效学特性有关。
在dsDNA或胰岛素实验中，使用1x PBS溶液，将5μg/mL的dsDNA(Sigma)或胰岛素(Sigma)包被于康宁3366高结合力96孔板上，每孔50μL，4℃孵育过夜。第二天，用1x PBS清洗ELISA板三次，以去除未结合的dsDNA或胰岛素。
在杆状病毒颗粒(BVP)实验中，用50mM碳酸钠(pH 9.6)以1:100比例稀释BVP原液(BlueSky Biotech)。每孔50μL，在ELISA板(3369；Corning)上4℃孵育过夜。第二天，用1xPBS手动清洗ELISA板三次，以去除未结合的BVPs。
剩下的所有步骤都在室温下进行。向每孔中加入200μL封闭缓冲液(含有1％BSA的PBS，不含吐温)并孵育1小时，然后用200μL 1x PBS清洗三次。接着，将50μL含有100μg/ml并以2倍连续稀释的测试抗体的封闭缓冲液加入到孔中。一抗孵育1小时，然后用200μL的1xPBS清洗三次。将50μL 1:2000稀释的抗人IgG Fc抗体AP共轭物(Southern Biotech)加入每个孔中并孵育1小时，然后如前所述清洗三次。最后，在每个孔中加入50μL PNPP底物并孵育20-30分钟。在405nm处读取吸光度，用没有测试抗体的空白孔的吸光度进行归一化，确定dsDNA和胰岛素的分数。
选择两种对照抗体Tanezumab和Fulranumab进行同样的平行测试。如图4A-4C所示，与两个对照抗体相比，优化的抗体Ab4、Ab6、Ab36、Ab44或Ab54对dsDNA、胰岛素或BVP均没有产生任何明显的多特异性反应，即使在100μg/mL的高浓度下也是如此。
表征抗NGF抗体结合亲和力以及解离常数(Kd)
选择FortéBio生物层干涉仪(BLI)技术，通过使用Octet Red系统，进行亲和力测定。NGF在天然形态下是一种同源二聚体蛋白。当它与全长的抗体结合时，结合模型并未表现出1:1的双分子相互作用，导致动力学表现为亲合力而不是亲和力。为了测定亲和力，使用Fab制备试剂盒(Pierce)制备了IgG的单价Fab片段。
纯化后，根据基于序列计算的消光系数，采用OD280确定Fab浓度。在亲和力测定中，在动力学缓冲液中用抗人Fc传感器(AHC，Pall)捕获人NGF-Fc融合蛋白，其中人NGF-Fc蛋白上样浓度为2μg/mL，捕获时间为300秒。采用一系列Fab浓度，从50nM到小于1nM，在动力学缓冲液中用上述的NGF-Fc融合蛋白传感器(PALL)进行了相应的检测，其中Fab结合时间为300秒，解离时间为1200秒。根据手册，使用数据分析程序HT 10.0对动力学数据进行分析。所有的检测都在至少两次独立的实验中进行重复。表8显示了优化的抗NGF抗体和对照抗体Tanezumab的Kd,Ka,和Kdis。
表8结合亲和力和解离常数(Kd)
实施例4：NGF诱导的TF1细胞增殖的抑制实验
TF-1细胞增殖实验
TF1细胞是人类红白血病细胞系，具有因子依赖性，在细胞因子例如GM-CSF、IL-4和NGF等的存在下可以增殖。TF1细胞表达TrkA受体，但不表达p75。按照下述方案来确定优化的抗NGF抗体Ab4、Ab6、Ab10、Ab16、Ab36、Ab37、Ab44、Ab46、Ab47或Ab54抑制NGF诱导的TF1细胞系增殖的能力。
在含有RPMI 1640+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+0.1％Pen/Strep的且另外加入2ng/mL GM-CSF的生长培养基中培养TF1细胞系(ATCC)(R&D系统)。在实验前，以转速300x g，离心5分钟，3个循环，去除GM-CSF，并将细胞重悬于实验培养基(如上所述的相同生长培养基，但缺少GM-CSF)。这个过程之后，TF1细胞以4x105/mL的终浓度重悬于生长培养基中，在37℃，5％CO2中培养1小时，即NGF饥饿。将抗NGF抗体在实验培养基中以不同浓度连续稀释，并与20ng/mL的人NGF(R&D系统)在室温下预孵化1小时，每个浓度的抗体有3个重复。将50μL的TF1细胞与50μL的抗体/NGF反应液混合，将总共100μL的混合物转移到白色96孔培养板(PerkinElmer)的每个孔中，细胞终密度为1x104/孔，人NGF终浓度10ng/mL。实验板在37℃，5％CO2条件下，培养48小时。使用ATPlite 1step Luminescence Assay kit(PerkinElmer)测定TF1细胞在抗NGF抗体作用下的增殖结果。根据其手册，在96孔板的每个孔中加入100μL的底物溶液。700rpm摇晃混匀2分钟后，在Biotek Synergy Neo2读数器中读取板子的发光情况。
如图5A-5B和表9所示，优化的抗NGF抗体Ab4、Ab6、Ab10、Ab16、Ab36、Ab37、Ab54、Ab55、Ab61和对照抗体Tanezumab在抑制NGF诱导的TF1细胞增殖方面都表现出良好的功效。
表9 TF1细胞增殖抑制实验
抗体 IC50(pM) 抗体 IC50(pM)
Ab4 173.9 Ab37 256.8
Ab6 169.9 Ab54 183.5
Ab10 254.2 Ab55 184.5
Ab16 300.2 Ab61 346
Ab36 234.4 Tanezumab 170.3
实施例5：NGF依赖的ERK1/2磷酸化抑制实验
PC12细胞ERK1/2信号通路
PC12细胞是大鼠嗜铬细胞瘤衍生的细胞系，在细胞表面同时表达TrkA和p75受体。PC12细胞可以在NGF的作用下生长和分化，其中NGF涉及多种信号通路，包括ERK1/2的磷酸化。按照下述方案确定优化的抗NGF抗体Ab4、Ab61和对照抗体Tanezumab抑制NGF依赖的ERK1/2磷酸化的能力。
在该实验中，PC12细胞购自Sigma公司(ECACC)，并在RPMI 1640+2mM谷氨酰胺、10％马血清、5％胎牛血清(FBS)中悬浮培养。在信号检测之前，通过300g，离心5分钟沉淀细胞，在培养液中重悬，将PC12细胞置换到含有0.1％BSA的Opti-MEM实验培养液中。然后将细胞制成单细胞悬液，以1.0x105个细胞/孔接种在包被有IV型胶原蛋白的96孔板(BioCoatTM；BD Biosciences)中，并在37℃、5％CO2条件下孵育过夜，即血清饥饿。将抗NGF抗体连续稀释成不同浓度，并与人NGF(R&D系统公司，终浓度为10ng/ml)在含有0.1％BSA的Opti-MEM的实验培养液中，37℃预孵化1小时，然后将其加入到96孔板的每个孔中，每个样品3个重复。在37℃下用人NGF刺激PC12细胞15分钟，然后按照操作说明书，采用试剂盒(PerkinElmer)中新鲜制备的1x裂解缓冲液裂解贴壁细胞。按照操作说明书，使用p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)检测试剂盒(PerkinElmer)检测在白色1/2面积96板(PerkinElmer)中不同浓度的抗NGF抗体存在的情况下，ERK1/2蛋白磷酸化水平。在Biotek Synergy Neo2读数器中读取板子的发光情况。
如图6和表10所示，优化的抗NGF抗体Ab4或Ab61在抑制NGF依赖的ERK1/2磷酸化方面表现出良好的效果。
表10 ERK1/2信号通路抑制实验
抗体 Ab4 Ab61
IC50(pM) 130.9 174.5
实施例6：NGF诱导的鸡DRG神经突起生长抑制实验
在NGF存在下，鸡背根神经节(DRG)的神经元细胞可以在体外存活并分化出生长的神经突起。按照以下方案，确定优化的抗NGF抗体Ab4、Ab61和对照抗体Tanezumab诱导鸡DRG神经突起生长的能力。
在实验中，在解剖显微镜下机械分离并收集第8天胚胎(E8)腰部区域的DRG。将分离的DRG平铺于包被有小鼠尾巴胶原蛋白的培养瓶中。每个培养瓶含有4个收集的DRGs。对于实验中测试的每种抗NGF抗体，设置为6个浓度滴度，其中两个对照瓶中没有NGF或没有抗体。向每个DRG培养瓶中加入2mL无血清的Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM)(Gibco-BRL)，其中含有人NGF(终浓度为4ng/mL)和不同浓度的测试抗体。DRG在37℃，5％CO2以及水饱和的空气中孵育24小时。在倒置显微镜下拍摄DRG的数字图像，以量化DRG的神经突起的生长情况。从每个培养瓶中选择三个DRG进行分析。根据DRG周围的神经突起的长度和密度，将结果分为(-)和(+到++++)。
如图7和表11所示，优化的抗NGF抗体Ab4、Ab61在诱导鸡DRG神经突起生长方面表现出比对照抗体Tanezumab更好或与之相当的效果。
表11鸡DRG神经突起生长抑制实验
抗体 Ab4 Ab61 Tanezumab
IC50(pM) 66.3 78.6 72.7
实施例7：足底切口预防实验
动物饲养：在该研究中使用CD-1小鼠(7-8周龄)。将小鼠安置在温度(19.5-24.5℃)和相对湿度(45-65％)控制的房间，12小时的光照/黑暗周期，在整个研究过程中可以自由获取过滤的自来水和鼠粮。在动物设施处收到小鼠后，安置小鼠，在进行任何测试前给予3天的适应期并观察。
合格小鼠筛选：用机械钝针刺激小鼠的爪子(脚垫内)后，利用动态足底触觉仪测量机械痛疼痛阈值(PWT)。测量4次PWT，然后分别计算小鼠左右足的平均阈值。阈值在7.0-10.0之间的小鼠可进行下一步研究。同时采用T检验统计分析同一只小鼠的左右爪阈值的P值，P值>0.05的小鼠为合格。
抗体给药：在足底切口手术前24h，皮下施用抗体。小鼠被随机分为四组(每组6只)，具体如下：i)空白对照组，皮下注射PBS，10μl/g(n＝6)，不进行足底切口手术；ii)阴性对照组，皮下注射无关抗体25mg/kg(非抗NGF抗体)(n＝6)；iii)3个低剂量实验组，分别皮下注射抗NGF抗体(Tanezumab、Ab4、Ab61)10mg/kg(n＝6)；iv)3个高剂量实验组，分别皮下注射抗NGF抗体(Tanezumab、Ab4、Ab61)25mg/kg(n＝6)。
足底切口：足底手术按以前的描述进行(Brennan TJ,Vandermeulen EP,GebhartG.Characterization of a rat model of incisional pain.Pain 1996；64:493-502)。简而言之，在无菌准备和铺巾后，在左后爪的足底表面划一条1cm长的纵向皮肤切口，自距后跟0.5cm处起，向趾端延伸。用镊子夹起足底肌肉，纵向切开，保持肌肉的完整。轻轻按压止血后，用两根5-0尼龙间断水平褥式缝合切口。每天检查切口，表现出伤口感染或开裂迹象的动物从研究中排除。空白对照组小鼠不进行足底切口手术。
机械痛疼痛阈值(PWT)测试：在足底切口手术前24h(基线)和手术后6h、24h、48h、72h和96h，用动态足底触觉仪测量小鼠的机械痛疼痛阈值(PWT)。采用GraphPad Prism软件和ANOVA来分析各实验组与阴性对照组之间的差异。P<0.05表示有统计学显著性差异，P<0.01表示有高度的统计学显著性差异。
在整个实验过程中，足底切口手术前阴性对照组的PWT与空白对照组有高度的统计学显著性差异(P<0.01)，表明此次实验造模成功，模型是可行和可操作的。
如图8A所示，在低剂量抗体组(10mg/kg)：手术后6小时，所有实验组的PWTs都有所增加。Ab4或Tanezumab组小鼠的PWT与阴性对照组之间有统计学显著性差异(P<0.05)。在手术后24小时，Ab4或Ab61组小鼠的PWT与阴性对照组之间有高度的统计学显著性差异(P<0.01)。术后48小时，Ab4组与阴性对照组之间有高度的统计学显著性差异(P<0.01)，Ab61和Tanezumab组与阴性对照组相比均显示出统计学显著性差异(P<0.05)。术后72小时，Ab61组与阴性对照组之间有高度的统计学显著性差异(P<0.01)，Ab4组和Tanezumab组与阴性对照组相比均显示出统计学显著性差异(P<0.05)，以及术后96小时，所有实验组与阴性对照组之间均有高度的统计学显著性差异(P<0.01)。
如图8B所示，在高剂量抗体组(25mg/kg)：在术后6小时，所有实验组中的PWTs都有增加。Ab4组中的PWT与阴性对照组之间有高度的统计学显著性差异(P<0.01)，Ab61或Tanezumab组中则有统计学显著性差异(P<0.05)。术后24小时，Ab4组的PWT与阴性对照组之间仍有高度的统计学显著性差异(P<0.01)，Tanezumab组中仍有统计学显著性差异(P<0.05)。然而，在Ab61组，与阴性对照组相比，没有显著的统计学差异。在术后48小时和72小时，所有Ab4、Ab61和Tanezumab组与阴性对照组相比都有高度的统计学显著性差异(P<0.01)。而在术后96h，Ab4和Tanezumab组与阴性对照组相比均显示出高度的统计学显著性差异(P<0.01)，Ab61组与阴性对照组相比显示出统计学显著差异(P<0.05)。
总之，上述PTW试验结果表明，与不相关的抗体相比，抗NGF抗体Ab4、Ab61和Tanezumab在足底切口预防试验中都表现出显著的减痛效果，而且这种效果在抗NGF抗体给药后至少持续96h。
实施例8：完全弗罗伊德佐剂(CFA)诱导的炎症性疼痛实验
动物饲养和筛选合格小鼠：实验过程与之前在足底切口预防试验中描述的相同。
CFA诱导的炎症性疼痛模型：在实验前24小时，实验组的小鼠于足底注射20μl CFA(100％)，空白对照组的小鼠皮下注射PBS。
抗体给药：CFA注射24h后进行皮下施用抗体。小鼠被随机分为四组(每组6只)，具体如下：i)空白对照组，皮下注射PBS，10μl/g(n＝6)；ii)阴性对照组，皮下注射无关抗体25mg/kg(非抗NGF抗体)(n＝6)；iii)3个低剂量实验组，分别皮下注射抗NGF抗体，10mg/kg(Ab4、Ab61、Tanezumab)(n＝6)；iv)3个高剂量实验组，分别皮下注射抗NGF抗体(Ab4、Ab61、Tanezumab)，25mg/kg(n＝6)。
机械痛疼痛阈值(PWT)测试：在注射CFA后3小时、6小时、24小时、48小时和72小时，用动态足底触觉仪测量小鼠的机械痛疼痛阈值(PWT)。使用GraphPad Prism软件和方差分析来分析各实验组与阴性对照组之间的差异。P<0.05表示有统计学显著性差异，P<0.01表示有高度的统计学显著性差异。
在实验的整个过程中，CFA注射组的PWT与空白对照组之间有高度的统计学显著性差异(P<0.01)，说明CFA诱导的炎症性疼痛模型是成功的，模型是可行的、可操作的。
如图9A所示，在低剂量抗体组(10mg/kg)：在抗体注射后3小时，所有实验组的PWTs都有所增加。在抗体注射后6小时，Ab4或Ab61组小鼠的PWT与阴性对照组之间有统计学显著性差异(P<0.05)。抗体注射后24小时，Ab4、Ab61或Tanezumab组小鼠的PWTs与阴性对照组相比均显示出统计学显著性差异(P<0.05)。抗体注射后48小时，Tanezumab组的PWT与阴性对照组相比显示出高度的统计学显著性差异(P<0.01)。抗体注射后72小时和96小时，Ab4、Ab61或Tanezumab的PWTs与阴性对照组相比均显示出统计学显著性差异(P<0.05)。
如图9B所示，在高剂量抗体组(25mg/kg)：在抗体注射后的所有检测时间点，Ab4、Ab61或Tanezumab组中小鼠的PWTs与阴性对照组相比均显示出统计学显著性差异(P<0.05)。
总之，上述PWT试验结果表明，与不相关的抗体相比，抗NGF抗体Ab4、Ab61和Tanezumab在减少CFA诱发的炎症性疼痛方面都表现出很大的效果，而且这种效果是剂量依赖性的。
序列表
<110> 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司
<120> 特异性识别神经生长因子的抗体及其用途
<160> 39
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Thr Tyr Trp Ile Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
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Gly
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
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1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
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<210> 8
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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20 25 30
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Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Asp Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Gly Phe
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
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Trp Ile Ser Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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100 105 110
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<220>
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<400> 10
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<400> 11
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Thr Tyr
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Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Asp Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Gly Phe
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Asp Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Gly Phe
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Ala His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
115 120
<210> 29
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg
115
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa can be any amino acid
<400> 30
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> Xaa = Glu or Ala
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = Ser or Thr
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> Xaa = Val or Leu
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> Xaa = Val, Gly, or Ile
<220>
<221> 变体
<222> 28
<223> Xaa = Ser or Thr
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Lys Ile Ser Cys Lys Xaa Ser Gly Tyr Xaa Phe Ile
20 25 30
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = Arg or Gln
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = Met or Ala
<400> 32
Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 33
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = Arg or Gln
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = Thr or Ser
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> Xaa = Lys or Thr
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Ile or Thr
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa = Asp or Ser
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> Xaa = Leu or Met
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> Xaa = Gln or Glu
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = Leu or Trp
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> Xaa = Arg or Lys
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> Xaa = Ala or Ser
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> Xaa = Ser or Glu
<220>
<221> 变体
<222> 27
<223> Xaa = Val or Met
<400> 33
Xaa Val Thr Ile Xaa Ala Asp Xaa Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Ser Ser Leu Xaa Xaa Xaa Asp Thr Ala Xaa Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = Val or Ile
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = Thr or Ser
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa = Ser or Leu
<400> 35
Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Xaa Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = Leu, Tyr, or Phe
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> Xaa = Pro or Ser
<400> 36
Trp Xaa Gln Gln Arg Pro Gly Gln Xaa Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 37
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa = Ala or Ser
<400> 37
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Xaa Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa = Gly, Ala, Ser, or Thr
<400> 39
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Gln Arg Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15

Claims (16)

1.一种分离的抗NGF抗体，其中抗NGF抗体包括：
重链可变域VH，所述重链可变域VH包含：序列为TYWIS(SEQ ID NO:1)的重链互补决定区HC-CDR1，序列为AIDPSDSDARYSPSFQG(SEQ ID NO:2)的HC-CDR2，和序列为SDPGYSGYSLLYGFDS(SEQ ID NO:3)的HC-CDR3；
以及轻链可变域VL，所述轻链可变域VL包含：序列为RSSQSLVQRNGNTYLS(SEQ ID NO:4)或RSSQSLVQRNANTYLS(SEQ ID NO:7)的轻链互补决定区LC-CDR1，序列为QVSNRYS(SEQ IDNO:5)的LC-CDR2，和序列为GQGAHLPLT(SEQ ID NO:6)的LC-CDR3。
2.一种分离的抗NGF抗体，包括VH，其包含SEQ ID NOs:8-13中任一氨基酸序列的VH中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含SEQ ID NOs:14-24中任一氨基酸序列的VL中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
3.根据权利要求2中所述的分离的抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体与人神经生长因子结合的Kd值为0.1pM至1nM。
4.根据权利要求1中所述的分离的抗NGF抗体，包括：
(i)氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:17的VL；或，
(ii)氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:19的VL；或，
(iii)氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:23的VL；或，(iv)氨基酸序列为SEQ ID NO:9的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:19的VL；或，(v)氨基酸序列为SEQ IDNO:11的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:19的VL；
或，
(vi)氨基酸序列为SEQ ID NO:11的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:20的VL；
或，
(vii)氨基酸序列为SEQ ID NO:12的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:17的VL；
或，
(viii)氨基酸序列为SEQ ID NO:12的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:19的VL；
或，
(ix)氨基酸序列为SEQ ID NO:12的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:20的VL；或，(x)氨基酸序列为SEQ ID NO:13的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:17的VL；
或，
(xi)氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VH和氨基酸序列为SEQ ID NO:24的VL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体包含Fc片段。
6.根据权利要求5中所述的分离的抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体是全长的IgG抗体。
7.根据权利要求6中所述的分离的抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体是全长的IgG1或IgG4抗体。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体是嵌合的、全人的或人源化的。
9.根据权利要求1-4中任一项分离的抗NGF抗体，其中所述抗NGF抗体是一种抗原结合片段，选自由Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、单链抗体(scFv)或Fv片段组成的组中。
10.一种编码权利要求1-9中任一项所述的抗NGF抗体的核酸分子。
11.一种包含权利要求10中所述的核酸分子的载体。
12.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1-9中任一项所述的抗NGF抗体、权利要求10中所述的核酸分子或权利要求11中所述的载体。
13.一种制备抗NGF抗体的方法，包括：
a)在能有效表达抗NGF抗体的条件下培养权利要求12中所述的宿主细胞；并且
b)从宿主细胞中获得所表达的抗NGF抗体。
14.一种药物组合物，包含权利要求1-9中任一项所述的抗NGF抗体、权利要求10中所述的核酸分子、权利要求11中所述的载体或权利要求12中所述的分离的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
15.权利要求1-9中任一项所述的抗体、权利要求10中所述的核酸分子、权利要求11中所述的载体、权利要求12中所述的宿主细胞、由权利要求13中所述方法制备得到的抗体、或权利要求14中所述的药物组合物在制备治疗所需个体疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症由NGF表达增加或对NGF敏感性增加引起。
16.根据权利要求15中的用途，其中所述疾病或病症选自由炎症性疼痛、手术后切口疼痛、神经性疼痛、骨折疼痛、痛风关节疼痛、带状疱疹后神经痛、烧伤引起的疼痛、癌症疼痛、骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛、坐骨神经痛、与镰状细胞危象相关的疼痛和带状疱疹后神经痛组成的组中。
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