CN101633694B

CN101633694B - 抗鼠神经生长因子(ngf)的多克隆抗体的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN101633694B
Application number: CN200810071473A
Authority: CN
Inventors: 任宏伟; 邹宇飞; 熊玲媛; 马彬云; 孙朗; 杨幼瑶; 马凌燕; 付永超; 吴敏华
Original assignee: Xiamen Bioway Biotech Co Ltd
Current assignee: SINOBIOWAY BIOMEDICINE CO., LTD.
Priority date: 2008-07-24
Filing date: 2008-07-24
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2028-07-24
Also published as: CN101633694A

Abstract

本发明公开了抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体的制备方法及其在酶联免疫测定方法中的应用。用于鼠颌下腺NGF为免疫原制备的多克隆抗体可以用来定量检测小鼠生长因子。由此组装的试剂盒可以测定不同组织细胞神经生长因子的定位、表达以及检测血液、细胞、组织、培养基上清等不同样品中NGF含量。

Description

抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体的制备方法，和检测神经生长因子(NGF)的ELISA试剂盒。

背景技术

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是意大利科学家Levi-Montalcini 1953年发现的神经营养因子，是目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突触生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。1960年，美国科学家Cohen提取纯化NGF，并证明其生物活性。1986年，Montalcini和Cohen因对NGF的杰出研究而荣获诺贝尔生理医学奖。90年代至今，国内外多家制药公司和药物研究机构相继开始进行NGF开发研究。目前已开发出多种NGF试剂。

NGF包括α、β、γ三个亚单位，其中α亚单位功能尚不清楚，γ亚单位具有蛋白酶活性，β亚单位是NGF的活性亚单位。活性区β亚单位由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。NGF在人体内主要分布于脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织及成纤维细胞、平滑肌、骨骼肌、胶质细胞、雪旺氏细胞等。

目前NGF主要来源于雄性小鼠颌下腺(与人类NGF有90％同源性)、牛精浆、蛇毒、和豚鼠前列腺。分子量为140kD(7s NGF，由α、β、γ三个亚单位和锌离子构成)和13kD～14kD(2.5s NGF，结构与β亚基基本相同。故又称为β-NGF)。

NGF与受体结合，通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经酪氨酸蛋白激酶、酯酰肌醇钙、内源性环腺苷酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应，对靶细胞的某些结构或功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生物效应。

定性和定量地测定神经生长因子(NGF)的活性，对医药领域具有重大的作用。现有的NGF质量控制标准是采用鸡胚背根神经节法，测定NGF的生物学活性，由于该法实验误差大，结果判定易受主观因素影响。所以建立快速、准确、客观的NGF含量的测定方法，不仅有利于NGF质量控制，也可用于NGF的药代动力学研究，但这都需要NGF抗体的制备的获得和检测方法的建立。由于NGF的免疫原性较弱，很难获得抗体，在国内NGF高效价抗体获得还是一个空白。本发明通过特殊处理的NGF免疫兔子获得了高效价的NGF抗体，并将其制成检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体的方法；

本发明的另一目的在于利用上述方法制备的多克隆抗体，制备一种可以定量检测神经生长因子(NGF)的ELISA试剂盒，来检测不同细胞、组织中神经生长因子(NGF)的定位及表达；该试剂盒可检测血、培养上清、细胞、组织等不同样品中神经生长因子(NGF)。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：

一种抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体的制备方法：

采用纯化的鼠颌下腺神经生长因子(NGF)作免疫原，采用戊二醛聚合NGF后，免疫正常家兔，收集血清，从中分离纯化出抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体。

前述的一种抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

a、纯化的NGF经0.1％-0.5％戊二醛聚合后按照10μg～500μg/只，与等体积完全弗氏佐剂充分混合、乳化，皮下多点注射正常家兔；

b、2周～4周后，纯化的并经0.1％-0.5％戊二醛聚合的NGF与等体积不完全弗氏佐剂充分混合、乳化，再次皮下多点注射；

c、2周～4周后，重复步骤b；

d、末次免疫一周后采耳血，间接ELISA方法测效价，大于1∶1000即可；

e、耳缘静脉采血，收集血清，-20℃保存。

前述的制备的抗鼠神经生长因子(NGF)多克隆抗体的制备，还包括以下纯化步骤：

(1)、制备抗原亲合柱：

(2)、结合缓冲液(PBS)充分平衡抗原偶联的亲和层析柱；

(3)、兔多克隆免疫血清与PBS混合后，反复上样3次；

(4)、PBS充分洗涤，去除未结合蛋白；

(5)、洗脱缓冲液洗涤特异结合的抗免疫抗原的多克隆抗体，收集至加有适量10×PBSpH7.6的烧杯中；

(6)、透析至1×PBS中，蛋白定量，分装，-20℃保存。

上述纯化步骤中，抗原亲合柱的制备，包括：纯化的抗原(小鼠颌下腺神经生长因子NGF)透析于偶联缓冲液中，预冷的0.5mM～50mM HCl洗涤CNBr-活化的sepharose 4fastflow胶数次，负压超滤，并置换于偶联缓冲液中；将抗原与活化的胶粒混合，4℃搅拌过夜；用偶联缓冲液洗涤未完全结合的抗原；封闭缓冲液室温作用0.5小时以上，封闭未被抗原饱和的活化位点；洗涤缓冲液交替洗涤2次以上，偶联抗原的胶粒保存于20％的酒精中。

上述纯化步骤中，兔多克隆免疫血清与PBS的混合比为1∶2～1∶5；

上述纯化步骤中，上样的流速为0.1ml/min～1ml/min；

上述纯化步骤中，洗脱缓冲液为0.1M盐酸-甘氨酸缓冲液，pH 2.8；

上述纯化步骤中，偶联缓冲液为0.1mol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH8.3；

上述纯化步骤中，封闭缓冲液为封闭缓冲液为0.2mol/L甘氨酸；

上述纯化步骤中，洗涤缓冲液为醋酸盐缓冲液0.1mol/L CH₃COO·Na和0.5mol/LNaCl，pH4.0)。

上述方法制备的抗鼠神经生长因子(NGF)多克隆抗体，可以用来中和NGF的生物学活性。可以作各种标记，用以组建检测血液、尿样、培养上清和各种细胞、组织中鼠神经生长因子(NGF)含量的试剂盒。

纯化也可采用硫酸氨-正辛酸法：取一定体积的血清，用0.06mol/LpH4.8的HAc-NaAc缓冲液稀释2倍或4倍；逐滴加入正辛酸，使终浓度为75μl/ml(正辛酸/兔血清)，并搅拌30min，室温下12000r/min离心20min后取上清液；加入体积为上清1/10的0.1mol/L pH7.4的PBS溶液，静置2小时或4℃过夜；4℃12000r/min离心30min，弃上清；将沉淀溶于一定体积的0.01mol/L pH7.4的PBS中，用50～100倍体积的0.01 mol/LpH7.4的PBS于4℃透析过夜。

本发明的另一技术方案是：

一种检测NGF的ELISA试剂盒，采用抗鼠神经生长因子(NGF)多克隆抗体为捕获抗体，识别并结合待测标本中的NGF，采用

a、以生物素标记的抗鼠颌下腺神经生长因子(NGF)多克隆抗体为检测抗体，通过亲和素/链霉亲和素——辣根过氧化物或亲和素/链霉亲和素——碱性磷酸酶催化底物显色；或

b、以酶标记的抗鼠颌下腺神经生长因子(NGF)多克隆抗体为检测抗体，直接加底物显色；或

c、以抗鼠颌下腺神经生长因子(NGF)多克隆抗体为二级抗体，以酶标记的山羊的抗兔抗体为三级抗体，催化底物显色。

然后根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待测标本中神经生长因子(NGF)的含量，试剂盒包括包被抗体1支、检测抗体1支、神经生长因子(NGF)标准品1支、底物液1支、96孔ELISA板1块。

所述的检测神经生长因子(NGF)的ELISA试剂盒，包被抗体浓度为范围为0.2μg/ml-20μg/ml，检测抗体浓度范围为0.2μg/ml-20μg/ml；NGF标准品浓度范围为5pg/ml-5μg/ml。

一种检测神经生长因子(NGF)的方法，包括以下步骤：

(1)、将稀释好的包被抗体加入ELISA板，50～200μl/孔，4℃放置18h以上；

(2)、封闭：倒掉包被液，洗板3次，200～400μl/孔，30s/次；加入封闭液50～200μl/孔；

(3)、倒掉封闭液，不洗，加待检标本、阴性对照及倍比稀释的标准品，50～200μl/孔，室温于摇床上孵育1～3h。

(4)、倒掉待检标本，洗3次。加生物素标记多克隆抗体50～200μl/孔，于室温摇床上作用1～3h。

(5)、倒掉一抗，洗3次，加入1∶200～1∶1000稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物，50～200μl/孔，于室温摇床上作用10min～1h。

(6)、洗5次，加入底物Turbo-TMB 50～200μl/孔，避光作用15min～30min，至标准曲线出现明显梯度。

(7)、加入2M H₂SO₄10～100μl/孔，终止反应。

(8)、ELISA读数仪测450nm处OD值，绘制标准曲线。

本发明的有益效果是：本发明克服了由于NGF的免疫原性较弱，很难获得抗体的缺陷，通过特殊处理的NGF免疫家兔获得了高效价的NGF抗体，并将其制成检测试剂盒。本发明使神经生长因子(NGF)的有无及含量改变的检测成为可能；使体外实验中不同培养体系、不同纯化阶段中神经生长因子(NGF)的有无及含量改变的检测成为可能；使神经生长因子(NGF)在不同细胞、组织的表达、定位等检测成为可能；为神经生长因子(NGF)的受体研究等提供帮助。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明并不受限于下述实施例。

实施例1多克隆抗体的制备

制备

1、纯化的NGF经戊二醛聚合后按照150μg/只，与等体积完全弗氏佐剂充分混合、乳化，皮下多点注射正常家兔；

2、一个月后，相同量抗原与不完全弗氏佐剂充分混合、乳化，再次皮下多点注射；

3、一个月后，重复步骤2；

4、末次免疫一周后采耳血，间接ELISA方法测效价，大于1∶1000即可；

5、耳缘静脉采血，50ml/次，采2次，收集血清，-20℃保存。

实施例2多克隆抗体的纯化

1、抗原亲合柱的制备：纯化的抗原(小鼠颌下腺神经生长因子NGF)透析于偶联缓冲液(0.1mol/LNaHCO₃，0.5mol/LNaCl，pH8.3)中，预冷的0.5mM～50mM HCl洗涤CNBr-活化的sepharose 4fast flow胶数次，负压超滤，并置换于偶联缓冲液中；将抗原与活化的胶粒混合，4℃搅拌过夜；用偶联缓冲液洗涤未完全结合的抗原；封闭缓冲液(0.2mol/L甘氨酸)室温作用0.5小时以上，封闭未被抗原饱和的活化位点；偶联缓冲液和醋酸盐缓冲液0.1mol/LCH₃COO·Na和0.5mol/LNaCl，pH4.0)交替洗涤2次以上，偶联抗原的胶粒保存于20％的酒精中。

2、结合缓冲液(PBS)充分平衡抗原偶联的亲和层析柱；

3、兔多克隆免疫血清1ml与3ml PBS混合后，反复上样3次，流速0.5ml/min；

4、PBS充分洗涤，去除未结合蛋白；

5、洗脱缓冲液(0.1M盐酸-甘氨酸缓冲液，pH 2.8)洗涤特异结合的抗免疫抗原的多克隆抗体，收集至加有适量10×PBS pH7.6的烧杯中；

6、透析至1×PBS中，蛋白定量，分装，-20℃保存。

实施例3硫酸氨-正辛酸法纯化法：

取一定体积的血清，用0.06mol/L pH4.8的HAc-NaAc缓冲液稀释2倍或4倍；逐滴加入正辛酸，使终浓度为75μl/ml(正辛酸/兔血清)，并搅拌30min，室温下12000r/min离心20min后取上清液；加入体积为上清1/10的0.1mol/LpH7.4的PBS溶液，静置2小时或4℃过夜；4℃12000r/min离心30min，弃上清；将沉淀溶于一定体积的0.01mol/LpH7.4的PBS中，用50～100倍体积的0.01mol/LpH7.4的PBS于4℃透析过夜。

实施例4ELISA试剂盒

采用兔抗神经生长因子(NGF)多克隆抗体为捕获抗体，识别并结合待测标本中的神经生长因子(NGF)，以生物素标记的高亲和力抗神经生长因子(NGF)单克隆抗体为检测抗体，通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶催化底物显色。根据标准品OD值在双对数坐标纸上绘制标准曲线，在标准曲线上查出待测标本中NGF的含量。

试剂盒提供：

(1)、包被抗体1支(120μl)：使用时用包被缓冲液作100倍稀释；

(2)、检测抗体1支(120μl)：使用时用稀释缓冲液作100倍稀释；

(3)神经生长因子(NGF)标准品1支(20μl)：0.5mg/ml，使用时用稀释液稀释。

(4)Turbo-TMB底物1支；

(5)96孔ELISA板1块。

自备试剂和材料：

(1)0.1M phosphate buffer，0.15M NaCl，pH7.4(PBS)；

(2)包被缓冲液：0.05M Na₂CO₃-NaHCO₃，pH9.6；

(3)封闭液：1％BSA/PBS，0.02％硫柳汞；

(4)洗涤液：0.1M PBS，pH7.4，0.05％TWeen20；

(5)稀释液：PBS，0.5％BSA，0.02％硫柳汞。

(6)酶标仪等。

操作步骤：

(1)、包被：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，4℃放置18h以上；

(2)、封闭：倒掉包被液，洗板3次，300μl/孔，30s、次；加入封闭液100μl/孔；

(3)、倒掉封闭液，不洗，加待检标本、阴性对照及倍比稀释的标准品，100μl/孔，室温于摇床上孵育2小时。标准品稀释方法：取标准品1μl，加入1ml稀释缓冲液中，充分混匀，作1∶10，1∶10²，(1∶10²)/3，1∶10³，1∶10⁴，1∶10⁵，1∶10⁶系列稀释，成为500ng/ml，50ng/ml.16.67ng/ml，5ng/ml，500pg/ml，50pg/ml，5pg/ml。

(4)、倒掉待检标本，洗3次。加生物素标记多克隆抗体100μl/孔，于室温摇床上作用2小时。

(5)、倒掉一抗，洗3次，加入1∶500稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物，100μl/孔，于室温摇床上作用30分钟。

(6)、洗5次，加入底物Turbo-TMB 100μl/孔，避光作用15min～30min，至标准曲线出现明显梯度。

(7)、加入2M H₂SO₄50μl/孔，终止反应。

(8)、ELISA读数仪测450nm处OD值，绘制标准曲线。

质量控制

(1)、灵敏度：本测定盒灵敏度＜10pg/ml。

(2)平行测定三份不同浓度的样品，计算测定结果的平均值与标准差，并计算其变异系数。结果见表1。

表1批内变异系数测定结果

通过对三份不同浓度样品的测定，计算出本试剂盒批内变异系数最大为5.5％，而一般规定试剂盒的批内精密度(CV％)不超过10％，结果表明试剂盒的精密度良好。

Claims

1.一种抗鼠神经生长因子的多克隆抗体的制备方法，采用纯化的鼠颌下腺神经生长因子作免疫原，采用戊二醛聚合NGF后，分批次免疫正常家兔，加强免疫后一周收集血清，从中分离纯化出抗鼠颌下腺神经生长因子的多克隆抗体，其具体步骤是：

a、纯化的NGF经0.1％-0.5％戊二醛聚合后与等体积完全弗氏佐剂充分混合、乳化，皮下多点注射正常家兔，注射剂量为10μg～500μg/只；

b、2周～4周后，纯化的并经0.1％-0.5％戊二醛聚合的NGF与等体积不完全弗氏佐剂充分混合、乳化，再次皮下多点注射，注射剂量为10μg～500μg/只；

c、2周～4周后，重复步骤b；

d、末次免疫一周后采血，收集血清，-20℃保存；

还包括以下的抗体纯化步骤：

(1)、制备抗原亲合柱：纯化的小鼠颌下腺神经生长因子透析于偶联缓冲液中，预冷的0.5mM～50mM HCl洗涤CNBr活化的sepharose 4 fast flow胶数次，负压超滤，并置换于偶联缓冲液中；将抗原与活化的胶粒混合，4℃搅拌过夜；用偶联缓冲液洗涤未完全结合的抗原；封闭缓冲液室温作用0.5小时以上，封闭未被抗原饱和的活化位点；洗涤缓冲液交替洗涤2次以上，偶联抗原的胶粒保存于20％的酒精中：其中，偶联缓冲液为0.1mol/LNaHCO₃，0.5mol/L NaCl，pH8.3；封闭缓冲液为0.2mol/L甘氨酸；洗涤缓冲液为：0.1mol/LCH₃COO·Na和0.5mol/L NaCl，pH4.0；

(2)、PBS充分平衡抗原偶联的亲和层析柱；

(3)、兔多克隆免疫血清与PBS混合后，反复上样2-4次；

(4)、PBS充分洗涤，去除未结合蛋白；

(5)、洗脱缓冲液洗涤特异结合的抗免疫抗原的多克隆抗体，收集至加有适量10×PBSpH7.6的烧杯中；透析至1×PBS中，蛋白定量，分装，-20℃保存，其中，洗脱缓冲液为0.1M盐酸-甘氨酸缓冲液，pH 2.8。

2.一种检测神经生长因子的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述方法制备的多克隆抗体。

3.如权利要求2所述的一种检测神经生长因子的试剂盒，其中所述的试剂盒还包括检测抗体、神经生长因子标准品、Turbo-TMB底物、ELISA板。