CN101319001A

CN101319001A - 一种n端特异的人dbf4b多肽及其抗体制备方法

Info

Publication number: CN101319001A
Application number: CNA2007101002057A
Authority: CN
Inventors: 杜宏武; 陈光宇; 王德仙; 陈吾奇
Original assignee: BEIJING IMMUNOHUNT Corp
Current assignee: BEIJING IMMUNOHUNT Corp
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2007-06-06
Publication date: 2008-12-10

Abstract

本发明公开了一种N端特异的人DBF4B多肽及其抗体的制备方法，属于以抗体为特征的体外试验用的生物制品。N端特异的人DBF4B多肽的氨基酸序列为：KNSPGAR KHPFSGKS。抗人DBF4B多肽抗体按以下方法制备：(1)人DBF4B抗原表位的分析；(2)人DBF4B N端多肽的合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔抗人DBF4B多肽抗体；(5)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人DBF4B多肽抗体。本发明制备的N端特异的抗人DBF4B合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人DBF4B发生特异性结合反应；制备成本低；纯化后的抗体可完全用于免疫印迹和酶联免疫吸附实验，以及建立体外免疫分析方法。该抗体为DBF4B在细胞周期和基因组复制中的生物学作用研究提供了有用的工具。

Description

一种N端特异的人DBF4B多肽及其抗体制备方法

技术领域

本发明涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种N端特异的人DBF4B多肽及其抗体制备方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

DBF4B(DBF4homolog B isoform 2)是CDC-7类似蛋白1的调控因子，它是一种参与细胞周期调控和基因组复制的丝氨酸-苏氨酸激酶。DBF4B定位于细胞核，其表达受到细胞周期的调控。

发明内容

本发明是为解决通过免疫实验特异性检测人DBF4B的表达与天然存在，并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，而提供的一种能特异性针对人DBF4B的N端的合成多肽、相应抗体及其制备方法。本发明还可同时解决目前使用的类似抗体价格高，亲和力低，抗体结合蛋白的位置不特异且抗原性较差等问题。本发明所述的抗人DBF4B合成多肽、相应抗体，按照以下步骤制备：

抗原表位分析与拮抗位置确定：利用多种表位预测软件，如DNAstar，OMIGA，UWGCG等进行综合分析，主要考量指标包括亲水性结构、抗原指数、表面可及性等，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终确定第38到第52位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为KNSPGARKHPFSGKS。

多肽的合成：靶标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化，然后通过HPLC，用每分钟1％的标准乙晴梯度来检测纯度。

多肽与载体蛋白交联：由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能诱导产生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选择钥孔嘁血蓝素进行交联，能显著增加抗原的大小和免疫原性，从而制备出人工免疫原。

免疫动物：所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原，免疫家兔制备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性饲养后进行多点注射免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。

抗体纯化：达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE和HPLC验证纯度，得到目标抗体。

本发明制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然人DBF4B分子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。该合成肽抗体的制备，为人DBF4B分子的研究及其相关疾病的研究(如诊断策略的制定，流行病学调查、预防和控制)提供了一个重要的工具，以及在生物医学研究中对相应靶蛋白的特性、含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具有重要作用。

附图说明

图1是液相色谱鉴定合成多肽纯度结果图。

图2是质谱鉴定合成多肽分子量结果图。

图3是通过ELISA方法鉴定纯化抗体相对亲和常数结果图。

图1表明经过HPLC对合成的多肽进行纯化后，液相色谱鉴定纯度为95.5％。

图2表明多肽分子量理论值为1700，质谱鉴定实测值【M+H⁺】为1701.4。

图3中间接ELISA检测制备的多抗和多肽抗原亲和常数为10⁹-10¹⁰L/mol。

具体实施方式

实施例1：人DBF4B抗原肽的合成。

用DNAstar，OMIGA，UWGCG等蛋白分析软件，对人DBF4B氨基酸序列进行亲水性结构(hydrophilicity)、抗原指数(antigenicity)、表面可及性(surface probability)以及同源性(homology)等分析，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终确定第38到第52位为靶标，其氨基酸序列为KNSPGARKHPFSGKS。在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减合成后获得粗品。经30％乙睛溶解后，进行高压液相色谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽，质谱鉴定。

实施例2：合成多肽与载体的偶联。

载体蛋白选择KLH(Keyhole limpet hemocyanin)，用双功能试剂顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽进行偶联：取KLH 5mg(0.11μmol，含赖氨酸2.2μmol)，溶于0.75mL偶联缓冲液1(50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5)；3mg MBS(11μmo)溶于75μL二甲酰胺(DMF)。将MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温作用30分钟。迅速离心后，将反应混合物(约0.8mL)加入预先用偶联缓冲液2(0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCL，0.01mol/LNa₂EDTA，pH7.0)平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56，室温下旋转混合，作用2小时后置4℃过夜，将反应混合物(约0.7mL)加入预先用磷酸缓冲液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将KLH、MBS-KLH和偶联物进行SDS-KLH和偶联物进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率。

实施例3：抗多肽抗体的制备。

取偶联的KLH-多肽500μg，溶于500μL磷酸缓冲液，加等体积完全福氏佐剂。免疫选取适龄免疫用新西兰兔(体重标准为2-2.5公斤)，经过适应性饲养后，背部皮内不少于15点注射。2周后抗原量减半(250μg)，加等体积的不完全福氏佐剂，第一次加强免疫。2周后进行第二次加强免疫，方法同前。再2周后耳缘静脉少量采血，用合成多肽(1μg/mL)包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到1∶16万时停止免疫，采用颈动脉放血收集抗体。

实施例4：亲和层析纯化抗多肽抗体。

①人DBF4B合成多肽亲和层析柱的制备：称取1.5g CNBr活化Sepharose 4B，用1mmol/L盐酸充分浸洗膨胀凝胶后，再用偶联缓冲液洗2次，迅速与溶于5mL偶联缓冲液的合成多肽500μg混合，室温下旋转混合2小时。加入0.2mol/L甘氨酸4mL终止反应，室温下旋转混合1小时。用偶联缓冲液和甘氨酸缓冲液交替洗凝胶各2次，再用50mL磷酸盐缓冲液洗凝胶，按终止浓度0.02％加叠氮钠(NaN₃)，置4℃保存。

②亲和层析纯化抗多肽抗体：将20mL兔抗多肽血清与1.6mL多肽偶联的Sepharose 4B共同加入50mL离心管，4℃旋转混合6小时。将凝胶加入层析柱，弃去流出液，用15mL磷酸盐缓冲液冲洗凝胶。每次加0.8mL pH2.9，0.1mol/L甘氨酸缓冲液洗脱，共8次，洗脱液分别加入8支预先加入80μL 2mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.5)，20mL磷酸盐缓冲液洗凝胶。上述全部操作过程在4℃下完成。每管取洗脱液2μL，稀释50倍后测280nm的OD值，计算蛋白质含量并绘制洗脱曲线。

实施例5：抗体的鉴定，使用间接ELISA方法检测抗体相对亲和常数。

用合成肽交联BSA，分别以5μg/mL和10μg/mL的浓度，在4度下包被ELISA检测板过夜，10％的山羊血清室温封闭2小时后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的抗体，再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗0.1mL，TMB显色测定A₄₅₀。以抗体浓度的对数为横坐标，以曲线达到水平时的A₄₅₀值为100％，以其他相对于该浓度的百分数为纵坐标作图，求出A₅₀即50％A值对应的抗体浓度。按照Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-2[Ab]t)算出抗体相对亲和常数，其中[Ab’]t、[Ab]t指的是A₅₀时即包被抗原分别为5μg/mL和10μg/mL时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度，[Ag]t、[Ag’]t指的是包被的抗原浓度本实验中即指10μg和5μg，n＝[Ag]t/[Ag’]t，本实验中n＝2。

试验效果

1.人DBF4B合成多肽：HPLC纯化后，使用液相色谱鉴定纯度为95.5％。多肽分子量理论值为1700，质谱鉴定实测值【M+H⁺】为1701.4。

2.多肽与载体的偶联效率：SDS-PAGE电泳鉴定偶联效率与样品回收率大致相符，大于80％。

3.抗体效价：多只家兔得到的抗血清效价均在1∶100万以上。

4.抗体亲和力：相对亲和常数为10⁹-10¹⁰L/mol。

5.抗体的应用：以上技术指标的实现保证该抗体完全可以应用于蛋白印迹和各种酶免实验，以及建立相应体外免疫分析试剂。

序列表

<110>北京意宏安生物科技有限公司

<120>一种N端特异的人DBF4B多肽及其抗体制备方法

<160>2

<210>1

<211>170

<212>PRT

<213>人

<400>1

MSEPGKGDDCLELESSMAESRLRAPDLGVSRCLGKCQKNSPGARKHPFSGKSFYLDLPAGKNLQFLTGAIQQLGGVIEGFLSKEVSYIVSSRREVKAESSGKSHRGCPSPSPSEVRVETSAMVDPKGSHPRPSRKPVDSVPLSRGKELLQKAIRNQVSWGKMGQSRWSPA

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>2

KNSPGARKHPFSGKS

Claims

1.一种N端特异的人DBF4B多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为：KNSPGARKHPFSGKS。

2.一种特异的抗人DBF4B N端合成多肽抗体，其特征在于该抗体效价在1∶1000000以上，特异性强，亲和力高达10⁹-10¹⁰L/mol。

3.一种特异的抗人DBF4B N端合成多肽抗体的制备方法，其特征在于以人DBF4B氨基酸序列中第38到第52位的KNSPGARKHPFSGKS肽段序列作为抗原肽合成人DBF4B抗原肽；纯化的抗原肽与蛋白载体偶联，经柱层析纯化后；制备出人工免疫原，免疫动物，制备多肽抗体，并经亲和层析纯化而成。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于载体蛋白为钥孔嘁血蓝素。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于偶联的KLH-多肽加福氏佐剂免疫后收集抗体。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于抗原肽与载体蛋白偶联作为免疫原，免疫家兔制备兔抗人DBF4B合成多肽抗体。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于合成多肽偶联Sepharose 4B，制备亲和层析柱，用于纯化抗多肽抗体。