JP2010508369A - Fgfr4は化学療法薬剤に対する応答において癌細胞の抵抗性を促進する - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、過剰増殖疾病、例えば癌、例えば化学療法抵抗性の癌の予防、緩和又は/及び治療のための、治療的手段又は/及び剤との共投与のための繊維芽細胞増殖因子受容体4(FGRF4)阻害剤に関する。更に、本発明は、診断的手段に関し、その際、FGFR4遺伝子の発現状態又は/及び多形が、過剰増殖疾病、例えば癌に苦しむ患者において決定される。この決定の結果に基づいて、そして治療すべき疾病の状態に基づいて、治療的なプロトコルが開発されてよい。本発明のまた別の主題は、スクリーニング方法である。
第1表:
(a)上記したとおりのFGFR4阻害剤、及び
(b)過剰増殖疾病の予防、緩和又は/及び治療のための剤であって、(a)とは異なる剤、
を、場合により、医薬的に許容可能なキャリアー、希釈剤又は/及び助剤と一緒に含有する、医薬組成物又はキットである。
(a)FGFR4と少なくとも1つの化合物を接触させる工程、及び
(b)FGFR4活性をこの化合物の存在下で決定する工程
を含む。
図1:FGFR4は、ドキソルビシン(DXR)処理されたMDA−MB−453クローンにおいて上方制御される。
材料及び方法
試薬及び抗体
FGFリガンドを、TEBU (Offenbach, Germany)から購入した。この使用した抗体は、ポリクローナル抗FGFR4、抗Erk2及び抗Akt1/2(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、ウサギポリクローナル抗ホスホAkt(Ser473)(New England BioLabs, Beverly, MA)、マウスモノクローナル抗ホホスホチロシン抗体4G10(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)、マウスモノクローナル抗チューブリン(Sigma, St Louis, MO)、ウサギポリクローナル抗ホスホErk(Cell signalling, USA)及びマウスモノクローナル抗Bcl−xl(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)、マウスモノクローナル抗VSV抗体、マウスモノクローナル抗FGFR4抗体 10F10(U3pharma, Martinsried)であった。
細胞系列769−P、TE671、MDA−MB−453、BT474、MDA−MB361、MDA−MB231、ZR75−1及びMCF7を、ATCC(American type culture collection, Manassas, VA)から獲得し、そして、この供給者の指示に従って、MDA−MB−453細胞以外は培養させ、これは、10%のウシ胎児血清(FCS)及びグルタミン(Gibco/lnvitrogen, Karlsruhe, Germany)で補給されたRPMI培地中で維持した。
RNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて単離し、かつ、AMV逆転写酵素(Roche, Mannheim, Germany)及びOligodT-プライマー(Gibco, Germany)を用いてcDNA中に逆転写した。このRNA及びcDNA濃度を、NanoDrop ND1000(PeqLab, Erlangen, Germany)系を用いて測定した。半定量的PCR増幅のためには、以下のプライマー(MWG, Ebersberg, Germany)を使用した:
5′−ACCACAGTCCATGCCAT−CAC−3′ (GAPDH フォーワード)
及び5′−TCCACCACCCTG−TTGCTGTA−3′ (GAPDHリバース),
5′−AGAATTCTGCCACCATGTCTCAGAGCAACC−3′ (Bcl−xl フォーワード) 及び
5′−GGG−TGATGTGGAGCTGGGATGTC−3′ (Bcl−xl リバース)。PCR産物を、2%のアガロースゲルに対して電気泳動し、かつ、DNAをエチジウムブロミド染色を用いて視覚化した。
細胞培養体を、PBSで洗浄し、4℃で、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤(10mM ピロリン酸ナトリウム、1mM PMSF、2mM オルトバナジン酸ナトリウム、10μg/mlアプロチニン)で補給した、溶解緩衝液(50mM、HEPES/NaOH、pH7.5、150mM NaCl、1mMEDTA、10%グリセロール及び1%Triton X-100)を用いてインキュベーションした。細胞デブリを、遠心分離により除去した。タンパク質濃度測定を、Pierce (Bonn, Germany)からのMicro-BCA-タンパク質アッセイを用いて実施した。免疫沈降のために、全細胞溶解物を、抗体及び30μlのタンパク質A−又はG−セファローススラリー(GE Healthcare)と組み合わせた。この試料を、3時間回転輪上で4℃でインキュベーションした。この沈殿物を、3×SDS試料緩衝液中に懸濁した、HNTG緩衝液(20mM HEPES/NaOH、pH7.5、150mM NaCl、10%グリセロール、0.1% Triton X-100及び10mM ピロリン酸ナトリウム)で3回洗浄し、3分間沸騰させ、かつ、SDS−PAGEにかけた。ウェスタンブロット分析のために、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、かつ、適した抗体を用いてインキュベーションした。シグナルを、促進された化学発光検出系(ECL, Perkin Elmer, Wellesley, MA)を介して展開した。再度探査する前に、膜を、2%SDSを含有する65mM Tris/HCl pH6.8緩衝液を用いて、50℃で1時間にわたりストリップした。
内因性の遺伝子を標的化するために21ヌクレオチドsiRNAデュプレックス(Ambion, Huntington, Cambridge, UK)のトランスフェクションを、Elbashir et al. 2001により説明されたとおり、6ウェルプレートにつきLipofectamine 2000(Invitrogen)及びsiRNAデュプレックス0.84μgを使用して実施した。トランスフェクションした細胞を、示された時間点で評価した。使用したsiRNAの配列は次のとおりである:
FGFR4 5'−GGCUCUUCCGGCAAGUCAAtt−3' 及び GL2−ルシフェラーゼ 5'−CGUACGCGGAAUACUU−CGAtt−3'。FGFR4の特異的なサイレンシングを、イムノブロット分析により確認し、これは、以前説明されたとおりである。
細胞死を、以前に説明されたとおりにフローサイトメトリーを用いて低二媒体細胞のパーセンテージをカウントすることにより測定した(Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C1 Grignani, F., and Riccardi, C. (1991) J. Immunol. Methods 139, 271-279))。ヨウ化プロピジウム蛍光を、FACSCalibur (BD Biosciences)でFL2チャンネル中で測定した。細胞培養上清及びトリプシン化した細胞をプールした。
cDNAsの放射線ラベル化を、Megaprime-ラベル化キット(Amersham Biosciences)及び50μCiの[α−33P]ATPを反応につき使用して達成した。このラベル化したcDNAをQiagen からのNucleotide Removalキットを介して精製し、かつ、ハイブリダイゼーション緩衝液(5×SSC、0.1%SDS)中の0.5mg/mlのCOT−DNA(Invitrogen)を用いて、5分間95℃及び30分間68℃でインキュベーションして、cDNA中の繰り返し配列をブロックした。このcDNAを予備加熱(68℃)した、100μg/mlのtRNA(baker's yeast, Roche Applied Science)を含有するハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。cDNAアレイを、予備ハイブリダイゼーション緩衝液(5×デーンハルト(Denhardfs)、5×SSC、100mM NaPO4、2mM Na2P2O7、100μg/ml tRNA)中で4時間インキュベーションし、引き続きこのラベル化したcDNAをハイブリダイゼーション緩衝液中に16時間インキュベーションした。このcDNAを取り除き、かつこのcDNAアレイを、増加するストリンジェンシーで洗浄し、乾燥し、そしてリンイメージ化プレート(Fuji)上に曝した。このプレートをFujiBas2500リンイメージ化装置(phosphorimaging device)上で読み取り、かつ、この粗のスポット値(ボリューム)を、ArrayVision (RayTest, Canada)を用いて決定した。
DXR処理したMDA−MB453クローン中のFGFR4の増加した発現
乳癌細胞系列MDA−MB−453中での抗アポトーシス機構を同定するためのアッセイを実施した。従って、細胞をDXRで処理し、生存したクローンを単離した。平均してFGFR4mRNAの2倍の上方調節が、アレイ分析により産出された遺伝子発現プロファイルが比較された場合に、DXR処理を生存したクローン中で見出された(図1A)。このクローンの約半分がFGFR4mRNAレベルにおいて4倍までの増加を示し、その一方で、他のものは、弱い増加を示すか又は増加を示さなかった(図1B)。FGFR4発現レベルを、半定量的PCRにより評価し、かつ、定量化した。
更にFGFR4の抗アポトーシス機構における関連を分析するために、Fgfr4遺伝子を乳癌細胞系列MCF7において発現した(図2A)。これらの細胞の増殖は、通常の培養条件では影響を及ぼされなかった。しかしながら、DXR処理すると、MCF7−Fgfr4細胞は、MCF7に比較してより迅速な増殖を示した。異所的にFgfr4を発現する細胞中でのDXRに対するこの減少した感受性のために、我々は、フローサイトメトリーによりアポトーシス性細胞のパーセンテージを分析した。親のMCF7細胞に比較して、MCF7−Fgfr4発現細胞は、アポトーシスの減少した割合を示した(図2A)。
このFGFR4により支配されているシグナル経路を調べるために、我々は様々な乳癌細胞系列ZR75−1及びBT474を利用し、これはFGFR4の高い量を内因的に発現している。Fgfr4に対して指向した合成のsiRNA(siFGFR4)を用いた一過的なノックダウンは、96時間でのホスホErkレベルにおける減少を示した(図4)。このAktリン酸化は、ノックダウンにより影響を及ぼされず、かつ、全ての時間点で活性化されたままであった(データ示さず)。従って、FGFR4が、AktよりもむしろMAPK活性化を制御することを我々は結論付ける。アポトーシス割合もまた、様々な時間点でのFGFR4の一過的なノックダウンにより影響を及ぼされた(図4B)。
FGFR4過剰発現細胞系列の化学療法抵抗性を媒介する分子機構に関する更なる知見を得るために、FGFR4細胞を異所的に発現するMCF7細胞の遺伝子発現アレイ分析を実施した。ここで、我々は、Bcl−xl発現が未制御状態に比較して、FGFR4過剰発現のために2倍となることを検出できた(図5A)。我々は、半定量的PCRによりBcl−xlの発現レベルにおける相違を評価した。Bcl−xlタンパク質は、FGFR4を発現するMCF7細胞系列にのみ見出された(図5B)。Bcl−xl発現がFGFR4に依存していることを確認するために、我々は様々な細胞系列において一過的にFgfr4をノックダウンし、両者のタンパク質の発現の変化を分析した。ここで、我々はBcl−xl発現がFGFR4ノックダウンで抑制されていることを示すことができた。これらの結果は、Bcl−xl発現はFGFR4発現に依存性であり、かつ、FGFR4ノックダウンにより抑制されることができることを示した。MAPKはBcl−xl発現の極めて重要なレギュレーターであるので、MCF7−FGFR4細胞をU0126、特異的なMEK阻害剤で処理した。この半定量的なPCRは、U0126処理が、Bcl−xl発現を破壊することを示した(図5D)。従って、我々は、Bcl−xl発現が、FGFR4発現及びMAPK活性に依存することを結論付ける。
次に、我々は、この促進された化学療法抵抗性が、様々な癌細胞系列においてFgfr4活性と連結しているかどうかとの問いに言及したかった。この目的のために、Fgfr4ブロック化抗体(10F10)を使用した。我々は、様々な乳癌細胞系列を特異的なリガンドFGF19で刺激し、この系列は内因的にFgfr4を発現する。FGF19処理されると、p−Erk−レベルは、刺激されていない対照細胞に比較して増加した。Fgfr4ブロック化抗体でのこの細胞系列の予備インキュベーション及び引き続くFGF19刺激後に、単独でFGF19で処理された癌細胞系列に比較して減少したp−Erkレベルが検出されることができた(図6A)。この実験において、我々は、Fgfr4ブロック化抗体(10F10)が、Fgfr4媒介した下流のシグナリングを阻害することを明らかに示すことができた。
cDNAマイクロアレイ実験において、Fgfr4が、入手可能な乳癌細胞系列の約30%において高度に発現していることを観察できた(図7A)。このレセプターの高度の発現は、細胞系列BT−474、ZR75−1、MDA−MB−361及びMDA−MB−453において観察された。従って、これらの細胞系列を使用して、FGFR4シグナリングを阻害し、かつ、この癌細胞を化学療法のために敏感化した。FGF19/DXR処理した癌細胞系列のアポトーシス割合を、FGFR4ブロック化抗体で更に処理した細胞系列と比較した。様々な細胞系列のDXR/FGF19処理は、アポトーシスを低度から中間の低度において誘発し、その一方でFGFR4ブロック化抗体での更なる処理は、更にこのアポトーシス割合を顕著に増加させた(図7B):MDA−MB−361中約40%、ZR75−1中約29%、そして、BT−474中約10%。MDA−MB−453細胞中で、10F10−AB処理を用いて増加したアポトーシスを検出できなかった。これは、この細胞系列中でのFGFR4の構成的な活性化のためである可能性があり、これは、10F10抗体によりブロック化されることができなかった(データ示さず)。しかしながら、これらの実験において、FGFR4活性が、DXRに対する癌細胞の抵抗性を支持し、その一方でFGFR4活性化のFGFR4ブロック化抗体(10F10)による阻害は、癌細胞の増加した化学療法感受性を生じることが実証できた。
Claims (40)
- 過剰増殖疾病の予防、緩和又は/及び治療のための医薬品の製造のための、FGFR4阻害剤の、更なる治療的手段又は/及び更なる治療剤と組み合わせた使用。
- 更なる治療的手段又は/及び剤が、アポトーシス誘発性治療的手段又は/及び剤である、請求項1記載の使用。
- 過剰増殖疾病が、FGFR4過剰発現と関連している、請求項1又は2記載の使用。
- 過剰増殖疾病が、癌、例えば腎臓、膀胱、脳、食道、胃、膵臓、小腸、結腸、胸、肺、肝臓、脾臓、甲状腺、下垂体、副腎、卵巣、頸部、精巣の癌、前立腺癌、グリオーマ、メラノーマ、又は/及び白血病から選択される、請求項1から3までのいずれか1項記載の使用。
- 過剰増殖疾病が、少なくとも部分的に治療抵抗性である、請求項1から4までのいずれか1項記載の使用。
- 過剰増殖疾病が、少なくとも部分的に、アポトーシス誘発性治療的手段又は/及び剤に対して抵抗性である、請求項1から5までのいずれか1項記載の使用。
- 更なる治療的手段が、放射線療法である、請求項1から6までのいずれか1項記載の使用。
- 更なる治療剤が、細胞分裂抑制的、細胞毒性又は/及び化学療法的な剤から選択される、請求項1から7までのいずれか1項記載の使用。
- 細胞分裂抑制的、細胞毒性又は/及び化学療法的な剤がドキソルビシン、タキサン、白金化合物、ヌクレオシド類似体、マイトマイシンD、エトポシド、シクロホスファミド、トポイソメラーゼ阻害剤及びタンパク質、例えば抗腫瘍抗体、から選択される、請求項8記載の使用。
- 過剰増殖疾病が、BclXL又は/及びMAPキナーゼの過剰発現又は/及び過剰活動と関連している、請求項1から9までのいずれか1項記載の使用。
- 過剰増殖疾病に対する治療又は/及び剤の効力を増加させるための医薬品の製造のためのFGFR4阻害剤の使用。
- 過剰増殖疾病の放射線又は/及び医薬品治療に対する感受性を増加させるための医薬品の製造のためのFGFR4阻害剤の使用。
- 過剰増殖疾病が癌である、請求項11又は12記載の使用。
- FGFR4阻害剤が、直接的なFGFR4阻害剤である、請求項1から13までのいずれか1項記載の使用。
- FGFR4阻害剤が、非直接的なFGFR4阻害剤である、請求項1から13までのいずれか1項記載の使用。
- FGFR4阻害剤が、アンチセンス分子、リボザイム、siRNA分子、抗体及び抗体断片、溶解性FGFR4分子、アンタゴニスト性のFGFR4リガンドアナログ、ペプチド及び低分子量化合物から選択される、請求項1から15までのいずれか1項記載の使用。
- FGFR4阻害剤が、FGFR4抗体又はFGFR4mRNAに対して指向したsiRNA分子である、請求項1から16までのいずれか1項記載の使用。
- 活性成分として、
(a)FGFR4阻害剤、及び
(b)過剰増殖疾病の予防、緩和又は/及び治療のための剤であって、(a)とは異なる剤、
を、場合により、医薬的に許容可能なキャリアー、希釈剤又は/及び助剤と一緒に含有する、医薬組成物又はキット。 - 剤(b)が、アポトーシス誘発剤である、請求項18記載の医薬組成物又はキット。
- (a)の阻害剤及び(b)の剤を、単独の組成物の形態で又は少なくとも2つの別個の組成物の形態で提供する、請求項18又は19記載の組成物又はキット。
- FGFR4阻害剤の有効量を、更なる治療的手段又は/及び更なる治療的な剤との共投与においてこれらを必要とする被験体に投与することを含む過剰増殖疾病の予防、緩和又は/及び治療のための方法。
- 更なる治療的手段又は/及び剤が、アポトーシス誘発性治療的手段又は/及び剤である、請求項21記載の方法。
- 過剰増殖疾病が、少なくとも部分的に治療抵抗性である、請求項21又は22記載の方法。
- 過剰増殖疾病に罹患している可能性のある被験体からの試料を、FGFR4遺伝子の発現について分析する、過剰増殖疾病の診断方法。
- 過剰増殖疾病に罹患している可能性のある被験体からの試料を、FGFR4遺伝子中の多形の存在について分析する、過剰増殖疾病の診断方法。
- 過剰増殖疾病に罹患している可能性のある被験体からの試料を、FGFR4遺伝子の発現及びFGFR4遺伝子中の多形の存在について分析する、過剰増殖疾病の診断方法。
- 多形が、ヒトのFGFR4のアミノ酸388をコードする位置にある、請求項25又は26記載の方法。
- 過剰増殖疾病が、癌である、請求項24から27までのいずれか1項記載の方法。
- 癌が、非転移性癌である、請求項28記載の方法。
- 癌が、転移性癌である、請求項28記載の方法。
- 過剰増殖疾病のアポトーシス抵抗性状態を決定することを更に含む、請求項24から30までのいずれか1項記載の方法。
- 診断の結果に基づき過剰増殖疾病の治療のための治療方式を設定することを更に含む、請求項24から31までのいずれか1項に記載の方法。
- 過剰増殖疾病が、FGFR4過剰発現に関連した非転移性癌であり、その際、この治療方式は、更なる治療的手段又は/及び更なる治療剤と組み合わせた、FGFR4阻害剤の投与を含む、請求項32記載の方法。
- 非転移性癌は、FGFR4−388Gly又は/及びFGFR4−388Argアレルに関連している、請求項33記載の方法。
- 過剰増殖疾病が、FGFR4−388Argアレル及び場合によりFGFR4過剰発現に関連した転移性癌であり、その際、この治療方式は、更なる治療的手段又は/及び更なる治療剤と組み合わせた、FGFR4阻害剤の投与を含む、請求項32記載の方法。
- 過剰増殖疾病が、FGFR4−388Glyアレルに関連した転移性癌であり、その際、この治療方式は、更なる治療的手段又は/及び更なる治療剤と場合により組み合わせた、FGFR4アゴニストの投与を含む、請求項32記載の方法。
- 化合物がFGFR4阻害剤であるかどうかを決定することを含む、過剰増殖疾病のアポトーシス抵抗性を減少させるために適した化合物を同定又は/及びキャラクタリゼーションするためのスクリーニング方法。
- 過剰増殖疾病が、少なくとも部分的に療法に抵抗性のある過剰増殖疾病である、請求項37記載のスクリーニング方法。
- 分子的又は/及び細胞的アッセイを含む、請求項37又は38記載のスクリーニング方法。
- (a)少なくとも1の化合物をFGFR4と接触させる工程、及び
(b)この化合物の存在下でFGFR4活性を決定する工程
を含む、FGFR4阻害剤を同定する、請求項37から39までのいずれか1項記載のスクリーニング方法。
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