JP2002325579A - ポリぺプチドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】昆虫細胞中、組換えバキュロウイルスでポリぺ
プチドを発現させる場合の低い生産量を増加させる。 【解決手段】組換えバキュロウイルスで目的のポリぺプ
チドを発現させる場合に、そのコーディング配列の上流
側にロブスター由来の２１塩基対の非翻訳領域を連結す
ることにより、目的のポリぺプチドの発現量を顕著に増
加させることができる。この方法に使用する前記２１塩
基対のポリヌクレオチド配列及びこの配列を含むトラン
スファーベクター、この配列を含む組換えバキュロウイ
ルスゲノム並びにこの組換えバキュロウイルスゲノムを
含む組換えバキュロウイルスを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明はタンパク質の生産方
法に関する。さらに具体的には、本発明は組換え技術に
よりポリぺプチドを昆虫等で生産する場合におけるその
生産効率を向上させる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリペプチドを生産する方法としては、
今日多くの方法が開発されている。例えば、生体成分で
あるタンパク質を例にとると、生体から直接タンパク質
試料を調製することも可能であるが、大量に調製するこ
とは困難である場合が少なくなく、費用がかかる上にア
イソフォームの存在など、その品質が不均一であったり
するという問題がある。今日最も多用されているのは遺
伝子工学的手法である。その場合最も多いのが大腸菌を
用いる方法である。大腸菌はその取り扱いが最も容易
で、その系による発現は最も迅速であるが問題もある。
大腸菌は原核生物であるため、真核生物由来の外来タン
パク質を発現しようとすると、折畳みが上手くいかず水
に溶けないタンパク質ができてしまったり、機能に重要
な翻訳後修飾が行われないなどの問題にしばしば遭遇す
る。このような場合これらの問題を避けるため、バキュ
ロウイルスを用いて昆虫培養細胞にタンパク質を作らせ
る方法が広く行われている。しかし、この系では発現す
るタンパク質の量が少ないという問題にしばしば悩まさ
れる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、バキュロウイルスを用いて昆虫又は昆虫培養細胞で
タンパク質を発現させる場合にタンパク質の発現量が低
いという上記の課題を解決する方法を提供することにあ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、複数の生
物種由来のトロポミオシンタンパク質を昆虫細胞で発現
させたところ、驚くべきことに、ロブスター由来のトロ
ポミオシンの発現量のみが著しく多く、例えば、ウサギ
由来のものと比較して、30倍以上にものぼった。本発明
者らはこの知見に基づいて、さらに研究を重ねたとこ
ろ、ロブスター由来の非翻訳ポリヌクレオチド配列にタ
ンパク質発現を増加させる機能が存在することを発見し
た。本発明はこれらの知見に基づき、さらに研究を重ね
て完成するに至ったものである。

【０００５】すなわち、本発明の第１の態様において
は、その下流に置かれたコーディング配列の発現を増加
させる機能を有する、ロブスターの非翻訳領域由来の配
列番号：１に記載の塩基配列が提供される。また、配列
番号：１に記載の塩基配列において１若しくは数個のヌ
クレオチドが欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩
基配列であって、その下流に置かれたコーディング配列
の発現を増加させる機能を有する塩基配列もすべて本発
明の範囲内に含まれる。

【０００６】本発明の第２の態様においては、配列番
号：１に記載の前記配列又は配列番号：１に記載の塩基
配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、
置換、挿入及び／又は付加された塩基配列であって、そ
の下流に置かれたコーディング配列の発現を増加させる
機能を有する塩基配列、及びその下流に連結された目的
のポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列をバキュロウイ
ルス由来のプロモーター配列の下流に挿入して得られる
トランスファーベクターが提供される。このようなバキ
ュロウイルス由来のプロモーター配列としては、ポリヘ
ドリン遺伝子配列が例示できる。このプロモーターはト
ランスファーベクターをバキュロウイルスゲノム中に組
み込むためのものである。このようなバキュロウイルス
由来のプロモーターを含むベクターとしては、例えばｐ
ＶＬ１３９２ベクターが挙げられる。このベクターを用
いる場合は、配列番号：１に記載の本発明の配列等及び
その下流に連結された目的のポリぺプチドをコードする
ＤＮＡ配列を、そのマルチクローニングサイトに挿入す
ることが好ましい。

【０００７】本発明の第３の態様においては、本発明の
トランスファーベクター由来の、目的のポリぺプチドの
発現に関連のある塩基配列を生体中で相同組換えにより
組み込んで構築した、目的のポリぺプチドを発現するこ
とができる組換えバキュロウイルスゲノムが提供され
る。この相同組換えは昆虫又は昆虫培養細胞内で起こる
ものであっても、酵母細胞や大腸菌細胞内で起こるもの
であってもよい。また、前記昆虫としては蚕が好まし
く、昆虫培養細胞としてはＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞又
は High five（商標）細胞（イン・ビトロゲン社）が好
ましい。また、相同組換えの代わりに大腸菌細胞内でト
ランスポゾン由来のトランスエレメントにより目的のポ
リぺプチドの発現に関連のある塩基配列をバキュロウイ
ルスゲノム中に挿入することもできる。そのためには、
市販のキットを利用することができる。

【０００８】本発明の第４の態様においては、本発明の
組換えバキュロウイルスゲノムを有する組換えバキュロ
ウイルスが提供される。この組換えバキュロウイルス
は、本発明の第３の態様において調製された組換えバキ
ュロウイルスゲノムを、バキュロウイルスが宿主とする
ことができる昆虫又は昆虫培養細胞内にトランスフェク
ションすることにより得ることができる。

【０００９】本発明の第５の態様においては、本発明の
組換えバキュロウイルスを昆虫又は昆虫培養細胞に感染
させて目的のポリぺプチドをその細胞中で発現させ、そ
して発現したポリぺプチドを回収することによる目的ポ
リぺプチドを生産する方法が提供される。

【０００１０】上記の本発明の第２〜第５の態様におけ
る目的のポリぺプチドとしては、トロポミオシンのほか
に、ルシフェラーゼ、インターフェロンβ、インターフ
ェロンγ、インターロイキン１α，インターロイキン１
β、インターロイキン２、インターロイキン３、インタ
ーロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン
６、ウシ・ソマトトロピン、エリスロポエチン、顆粒球
コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ・コロニー刺
激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、血液凝固
第VII 因子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、
血液凝固第XIII因子、骨成長因子、コロニー刺激因子、
上皮細胞成長因子、成長ホルモン放出因子、繊維芽細胞
増殖因子、ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチベー
ター、トランスフォーミング成長因子、トロンボポエチ
ンなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではな
い。上記の中でも、糖タンパク質である、インターフェ
ロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン１α，
インターロイキン１β、インターロイキン５、エリスロ
ポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファ
ージ・コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺
激因子、血液凝固第VII 因子、血液凝固第VIII因子、血
液凝固第IX因子、血液凝固第XIII因子、ティッシュ・プ
ラスミノーゲン・アクチベーターなど、及びトロンボポ
エチンなどが本発明の目的タンパク質として好ましい。

【００１１】

【発明の実施の形態】ポリぺプチド発現を増加させる機
能を有する本発明の配列は、ロブスター由来の非翻訳リ
ーダー配列、すなわちａａｃｔｃｃｔａａａ ａａａｃ
ｃｇｃｃａｃ ｃ （配列番号：１）である。そしてこ
の配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠
失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列であっ
て、その下流に置かれたコーディング配列の発現を増加
させる機能を有する塩基配列も本発明の対象に含まれ
る。この配列は常法に従って、化学的に合成することも
できるし、ロブスターのトロポミオシンｃＤＮＡから得
ることもできる。

【００１２】本発明のポリぺプチド発現用トランスファ
ーベクターは次のようにして得ることができる。すなわ
ち、配列番号：１に記載の本発明の配列及びその下流に
連結された目的のポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列
であって、下記のマルチクローニングサイトに対応する
制限部位を有するものを常法に従って調製し、これをバ
キュロゴールド・トランスフェクション・キット（ファ
ーミンジェン社製）添付のｐＶＬ１３９２ベクターのマ
ルチクローニングサイト、例えばＸｂａＩサイトとＢａ
ｍＨＩサイトの間に挿入することにより調製することが
できる。あるいは、別法として、上記のようにして構築
したトロポミオシン発現用トランスファーベクターをＮ
ｃｏＩ−ＢａｍＨＩで消化してロブスターのトロポミオ
シンの翻訳領域を除き、これに目的のポリぺプチドをコ
ードするｃＤＮＡを挿入することにより目的のポリぺプ
チド発現用トランスファーベクターを一般的に構築する
ことができる。こうして得られるポリぺプチド発現用ト
ランスファーベクターの１例の概要を、図１に模式的に
示す。図中、ＸｂａＩサイトとコーディング配列の間の
２１塩基対が配列番号：１に記載の本発明のロブスター
由来の非翻訳リーダー配列である。この配列はその一部
であっても、又はこの配列若しくはその一部を含むポリ
ヌクレオチドであっても、この配列が示す発現増加機
能、すなわち、この配列の下流に連結されたコーディン
グ配列がコードするポリぺプチドの発現を顕著に増大さ
せる機能を保持するかぎり本発明に使用することができ
る。

【００１３】本発明のポリぺプチド発現用トランスファ
ーベクター中で本発明の配列の下流に連結されるコーデ
ィング配列がコードするポリぺプチドとしては、例え
ば、トロポミオシン、インターフェロンβ、インターフ
ェロンγ、インターロイキン１α，インターロイキン１
β、インターロイキン２、インターロイキン３、インタ
ーロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン
６、ウシ・ソマトトロピン、エリスロポエチン、顆粒球
コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ・コロニー刺
激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、血液凝固
第VII 因子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、
血液凝固第XIII因子、骨成長因子、コロニー刺激因子、
上皮細胞成長因子、成長ホルモン放出因子、繊維芽細胞
増殖因子、ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチベー
ター、トランスフォーミング成長因子、トロンボポエチ
ンなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではな
い。上記の中でも、糖タンパク質である、インターフェ
ロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン１α，
インターロイキン１β、インターロイキン５、エリスロ
ポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファ
ージ・コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺
激因子、血液凝固第VII 因子、血液凝固第VIII因子、血
液凝固第IX因子、血液凝固第XIII因子、ティッシュ・プ
ラスミノーゲン・アクチベーターなど、及びトロンボポ
エチンなどが本発明の目的タンパク質として好ましい。

【００１４】本発明の組換えバキュロウイルスは次のよ
うにして構築される。前記のポリぺプチド発現用トラン
スファーベクターを生体細胞中でバキュロウイルスと相
同組換えさせることにより前記ポリぺプチド発現用トラ
ンスファーベクターのポリぺプチド発現に関連する配列
をバキュロウイルス中に組み込ませ、ついで目的の組換
えバキュロウイルスを選択する方法により構築すること
ができる。相同組換えを行わせる生体細胞としては、バ
キュロウイルスの宿主となる昆虫又は昆虫培養細胞が好
ましいが、酵母細胞や大腸菌細胞を使用する方法も開発
されている。昆虫としては蚕が好ましい。

【００１５】昆虫培養細胞内で相同組換えを行わせる場
合は、例えば、昆虫培養細胞としてＳｆ９細胞、Ｓｆ２
１細胞、又は High five（商標）細胞を用い、ファーミ
ンジェン社製のバキュロゴールド・トランスフェクショ
ン・キットにより、添付のプロトコルに従ってトランス
フェクションを行い、常法に従って、プラークアッセイ
法により組換えバキュロウイルスをスクリーニングする
方法が本発明にも使用できる。

【００１６】また、酵母細胞内での相同組換えを利用す
る場合の組換えバキュロウイルスゲノムの単離は、例え
ば、グローバー及びヘイムズによる記載（D. M. Glover
andB. D. Hames, DNA Cloning 2 Expression Systems,
Second Ed., A PracticalApproach) に従って行うこと
ができる。

【００１７】また、大腸菌内での組換えバキュロウイル
スゲノムを経由する組換えバキュロウイルスの作成は、
例えば、ギブコＢＲＬ・Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ・バキュ
ロウイルス発現システム（ライフ・テック社）を用いて
行うことができる。簡単に述べると、１）発現したいタ
ンパク質をコードする遺伝子を、フレームが合うように
専用の組換えドナープラスミドに挿入し、２）得られた
ベクターを用い大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃを形質転換し、
３）抗生物質やβ−ガラクトシダーゼによるスクリーニ
ングにかけ、組換え体を得、４）得られた組換え体から
組換えＢａｃｍｉｄ・ＤＮＡを回収し、ＰＣＲにより確
認し、そして５）得られた組換えＢａｃｍｉｄ・ＤＮＡ
を昆虫細胞にトランスフェクションし、５〜７日間培養
を行って、目的の組換えバキュロウイルスを得ることが
できる。

【００１８】こうしてえられる組換えバキュロウイルス
は必要に応じて増幅し、培地中に含まれる牛胎児血清濃
度が低い場合、終濃度が約４％以上になるように牛胎児
血清を加え、ポリぺプチド発現に使用するまで４℃で保
存することが通常好ましい。また、長期的な保存は、小
分けして−８０℃で行うことが好ましい。

【００１９】本発明の組換えバキュロウイルスを用いて
目的のポリぺプチドを生産するには通常次のようにして
行う。まず、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞を培養し、
細胞の濃度が適当な濃度に達したときに、十分な感染多
重度で上記の組換えバキュロウイルス溶液を加え、さら
に適当な時間培養を続けた後、遠心分離により細胞を集
める。次いで、低張細胞破砕溶液中で細胞を破砕し、そ
の遠心分離上清から目的のタンパク質を常法に従って単
離精製する。また、膜蛋白質等を発現させたりしたとき
は界面活性剤を含む溶液中で細胞を破砕する。

【００２０】本発明の配列（配列番号：１）の下流にあ
るコーディング配列の発現に及ぼす効果は、トロポミオ
シン又はルシフェラーゼを目的ポリぺプチドとして検討
した結果（詳細は実施例で述べる）から明らかである。
すなわち、まず、ウサギ骨格筋由来のトロポミオシンｃ
ＤＮＡ又はホタル由来の変異型ルシフェラーゼＤＮＡ
を、常法（クルーエ，ランほか、Journal of Muscle Re
search and Cell Motility 16, 103-110 (1995))に従っ
て、ｐＡｃＣ４トランスファーベクターに挿入し、これ
をバキュロウイルスに組み込んで、Ｓｆ９細胞中で発現
させたところ、トロポミオシンの発現量は約２０〜３０
ｍｇ／３リットルであった。これに対し、ロブスターの
トロポミオシンのコーディング配列の上流に本発明の配
列（配列番号：１）を有する組換えバキュロウイルスで
トロポミオシンを発現させた場合は、トロポミオシンの
発現量は約６００〜１２００ｍｇ／３リットルに達し、
その量は本発明の配列を含まない系で発現させたウサギ
のトロポミオシンの発現量の約３０倍〜４０倍にも及ん
だ。さらに、ウサギ骨格筋由来のトロポミオシンｃＤＮ
Ａを、本発明の配列（配列番号：１）を含むトロポミオ
シン発現用トランスファーベクターに挿入し、相同組換
えにより構築したウサギのトロポミオシンｃＤＮＡの上
流に本発明の配列を含む組換えバキュロウイルスで発現
させた場合も本発明の配列を含まない組換えバキュロウ
イルスで発現させた場合と異なり、本発明の配列を含む
ロブスター由来のトロポミオシンの発現量とほぼ同等の
トロポミオシン発現が観察された。また、ルシフェラー
ゼの発現においては、充分な条件検討がなされていない
が、本発明の配列を含む系で発現させた場合は、ルシフ
ェラーゼの発現量は、本発明の配列を含まない系で発現
させた場合の少なくとも約７倍に達した。これらの観察
は、本発明の２１塩基対の非翻訳配列がその下流に連結
したコーディング配列の発現を数１０倍まで増大させる
効果を有することを示すものである。

【００２１】

【実施例】基本的な遺伝子操作は、サムブルック、フリ
ッチュ及びマルアティス著「モレキュラー・クローニン
グ：ア・ラボラトリー・マニュアル」第２版（１９８９
年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、コールド・スプリング・ハーバー・ニューヨークに
従って行った。基本的な昆虫培養細胞であるバキュロウ
イルスの取扱いについては、以下のマニュアルによっ
た。オライリー、ミラー及びルッコウ著「バキュロウイ
ルス発現ベクター：ア・ラボラトリー・マニュアル（１
９９２年）」、フリーマン・アンド・コウ．、ニューヨ
ーク。サマーズ及びスミス著「ア・マニュアル・オブ・
メソッズ・フォア・バキュロウイルス・ベクターズ・ア
ンド・インセクト・セル・カルチャー・プロシーデュ
ア、テキサス・アグリカルチュラル・エクスペリメント
・ステーション・ブレタンＮｏ．１５５５。

【００２２】実施例１ロブスター筋肉由来のトロポミオシン発現用トランスフ
ァーベクターの構築 ロブスター筋肉由来のトロポミオシンｃＤＮＡ０．２μ
ｇと、以下の２種類の合成ＤＮＡ、すなわち、ggtctaga
aa ctcctaaaaa accgccacc (配列番号：２）及びttggatc
cga gagtgtttag tagccagac（配列番号：３）の各１００
ピコモル、宝酒造製のＥｘＴａｑポリメラーゼ１μｌ、
ポリメラーゼ添付の１０×バッファー１０μｌ、ｄＮＴ
Ｐミックス８μｌを０．５ｍｌのチューブに加え、さら
に蒸留水を加え最終的にチューブの中の溶液を１００μ
ｌにした。その後、チューブをアトー社製ＰＣＲ装置ザ
イモリアクターIIにより、９３℃で５分、各サイクルが
９３℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分の２５サイ
クル、７２℃で１０分の反応プログラムによりＰＣＲを
行った。このときのＰＣＲ生成物は、制限酵素ＸｂａＩ
サイト、ロブスター筋肉由来トロポミオシン翻訳開始点
上流の２１塩基対の非翻訳領域、全翻訳領域、及び制限
酵素ＢａｍＨＩサイトを含む。ＰＣＲ生成物及びトラン
スファーベクターのｐＶＬ１３９２を制限酵素ＸｂａＩ
／ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化した後、０．８％の
ＴＡＥ−アガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動の
後、臭化エチジウムで染色を行い、トランスイルミネー
ター上でＤＮＡバンドの検出を行った。トロポミオシン
ｃＤＮＡ断片、及びｐＶＬ１３９２のバンドをカッター
ナイフにより切り出し、ジーン・クリーンIIキット（バ
イオ１０１社）によりＤＮＡを抽出した。これらのＤＮ
Ａを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加
え、１６℃で一晩反応を行った。反応の後、大腸菌に形
質転換を行い、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で展開
しコロニーを形成させた。できたコロニーを爪楊枝で拾
い、サークル・グロウ培地（バイオ１０１社）で培養を
行い、十分に大腸菌を生育させた後、キアゲン社製プラ
スミド・マキシ・プレプ・キットを用いてトランスファ
ーベクターの調製を行った。このトランスファーベクタ
ー（図１）は、ポリヘドリンプロモーター下流のポリヘ
ドリン起源の開始コドンが壊れており、さらに下流のＸ
ｂａＩサイトからＢａｍＨＩサイトまでの間に、２１塩
基対の非翻訳領域を含むロブスター由来トロポミオシン
遺伝子が挿入されたものである。

【００２３】比較例１ウサギ骨格筋由来のトロポミオシン発現用トランスファ
ーベクターの構築 ウサギ骨格筋由来のトロポミオシンｃＤＮＡ及びトラン
スファーベクターｐＡｃＣ４を、制限酵素ＮｃｏＩ／Ｂ
ａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化した後、０．８％のＴＡ
Ｅ−アガロースゲル電気泳動を行った。このとき、ｃＤ
ＮＡ電気泳動の後、臭化エチジウムで染色を行い、トラ
ンスイルミネーター上でＤＮＡバンドの検出を行った。
トロポミオシンｃＤＮＡ断片、及びｐＡｃＣ４のバンド
をカッターナイフで切り出し、ジーン・クリーンIIキッ
ト（バイオ１０１社）によりＤＮＡを抽出した。これら
のＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
及び添付のバッファーを加え、１６℃で一晩反応を行っ
た。反応後、大腸菌に形質転換を行いアンピシリン含有
ＬＢ寒天培地上に展開し、コロニーを形成させた。でき
たコロニーを爪楊枝で拾い、サークル・グロウ培地（バ
イオ１０１社）で培養を行い、十分に大腸菌を生育させ
た後、キアゲン社製プラスミド・マキシ・プレプ・キッ
トを用いてトランスファーベクターの調製を行った。こ
のトランスファーベクター（図２）は、ポリヘドリンプ
ロモーター下流のポリヘドリン起源の開始コドンからウ
サギ由来のトロポミオシン遺伝子が挿入されたものであ
る。

【００２４】実施例２ロブスタートロポミオシン由来の２１塩基対の非翻訳領
域を含むウサギ骨格筋由来のトロポミオシン発現用トラ
ンスファーベクターの構築 これは、上述のウサギ骨格筋由来のトロポミオシン発現
用トランスファーベクターの構築と同様に行った。異な
る点は、トランスファーベクターｐＡｃＣ４ではなく、
ロブスター筋肉由来のトロポミオシン発現用トランスフ
ァーベクターを、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化してロブ
スターのトロポミオシンの翻訳領域を除いたものに、ウ
サギ骨格筋由来のｃＤＮＡを挿入したことである。この
トランスファーベクター（図３）は、ポリヘドリンプロ
モーター下流のポリヘドリン起源の開始コドンが壊れて
おり、さらに下流のＸｂａＩサイトの下流に隣接するロ
ブスタートロポミオシン遺伝子由来の２１塩基対の非翻
訳領域の下流に、ウサギ由来のトロポミオシン遺伝子が
挿入されたものである。

【００２５】実施例３組換えバキュロウイルスの作成・増幅 実施例１、比較例１及び実施例２で構築したトランスフ
ァーベクターを用い、ファルミンゲン社製のバキュロゴ
ールド・トランスフェクション・キットにより、添付の
プロトコル通りＳｆ９細胞のトランスフェクションを行
った。その後、以下のプラークアッセイ法により、組換
えウイルスのスクリーニングを行った。

【００２６】＜プラークアッセイ＞ （１）１０％ＦＢＳ（シグマ社製の牛胎児血清・非働化
済）含有ＴＮＭ−ＦＨ培地で培養したＳｆ９細胞を１ｍ
ｌ当たり５×１０⁵ 個に同培地で希釈する。 （２）ファルコン社製６ｃｍ細胞培養用プレート（Ｎ
ｏ．３００２）に４ｍｌの（１）で調製した細胞を蒔
く。 （３）２７℃に３０分間静置する。 （４）培地を吸い取り、代わりにウイルスを適当な濃度
に１０％ＦＢＳ含有ＴＮＭ−ＦＨ培地で希釈したウイル
ス液２ｍｌを加える。 （５）２７℃に１時間静置する。 （６）ウイルス液を吸い取り、代わりに５０℃の４ｍｌ
の１．５％低融点寒天・１０％ＦＢＳ含有ＴＮＭ−ＦＨ
培地を加え、寒天が固まるまで室温で静置する。 （７）２７℃で４日間静置培養した後に、５０℃の２ｍ
ｌの０．０１％ニュートラルレッド・０．７５％低融点
寒天・１０％ＦＢＳ含有ＴＮＭ−ＦＨ培地を重層し、寒
天が固まるまで室温で静置する。 （８）２７℃で４時間静置する。 （９）プラークは白く抜けるのでパスツールピペットに
より単一プラークを選ぶ。 以上の方法で、スクリーニングを行った後に、ウイルス
の増幅を以下の方法により３段階で行った。

【００２７】＜ウイルス増幅その１＞ （１）単一のプラークからもう一度プラークアッセイを
行う。 （２）１０％ＦＢＳ含有ＴＮＭ−ＦＨ培地で培養したＳ
ｆ９細胞を１ｍｌ当たり５×１０⁴ 個に同培地で希釈し
たＳｆ９細胞２．５ｍｌを、ファルコン社製６穴プレー
ト（Ｎｏ．３０４６）に入れる。 （３）（１）で調製したプラークを１穴当たり４個ずつ
入れる。 （４）２７℃で５日間静置培養する。 （５）ファルコン社製１５ｍｌ遠心チューブ（Ｎｏ．２
０９７）に培養液を移し、１，２００Ｇで１０分間遠心
分離を行い、上清のウイルス液を回収する。

【００２８】＜ウイルス増幅その２＞ （１）１０％ＦＢＳ含有ＴＮＭ−ＦＨ培地で培養したＳ
ｆ９細胞を１ｍｌ当たり４×１０⁵ 個に同培地で希釈し
たＳｆ９細胞１０ｍｌを、コースター社製２５ｃｍ² フ
ラスコ（Ｎｏ．３０５５）２個に各５ｍｌずつ入れる。 （２）（１）に２０ｍｌの＜ウイルス増幅その１＞で増
幅したウイルスを加える。 （３）２７℃で７〜１０日間静置培養する。 （４）フラスコ二つ分の培養液を併せて、ファルコン社
製１５ｍｌ遠心チューブに移し、１，２００Ｇで１０分
間遠心分離を行い、上清のウイルス液を回収する。

【００２９】＜ウイルス増幅その３＞ （１）ベルコ社製の３リッターのスピナーフラスコに、
８５０〜９００ｍｌの０．２％プルロニックＦ６８（ギ
ブコ社製）含有修正Ｓｆ９００II培地（９０％ギブコ社
製Ｓｆ９００II培地・９％ギブコ社製グレースインセク
トメディウムサプリメンテッド・１％ＦＢＳ）中でＳｆ
９細胞を細胞の濃度が１ｍｌ当たり１．８〜２．０×１
０⁶ 個に達するまで２７℃で攪拌培養する。攪拌は和研
薬社製マグネティックスターラーで約９０〜１００ｒｐ
ｍの速度で行う。 （２）＜ウイルス増幅その２＞で増幅したウイルス液を
５ｍｌ加える。 （３）２７℃で７〜１０日間静置培養する。 （４）培養液を合わせて、ファルコン社製２２５ｍｌ遠
心チューブ（Ｎｏ．２０７５）に移し、１，２００Ｇで
１０分間遠心分離を行い、上清のウイルス液を回収す
る。 （５）このウイルス液に終濃度が４％になるようにＦＢ
Ｓを加え、４℃で保存する。 （６）同時に、上述のプラークアッセイ法によりウイル
スのタイターを検定する。

【００３０】実施例４バキュロウイルス−Ｓｆ９細胞によるポリぺプチドの発
現 和研薬社製セルマスターコントローラーを用いて行っ
た。ベルコ社製の３リッターのスピナーフラスコに、３
リッターの０．２％プルロニックＦ６８（ギブコ社製）
含有修正Ｓｆ９００II培地中でＳｆ９細胞を２７℃で攪
拌培養する。このとき、酸素濃度は水の飽和酸素濃度に
対して６０〜７０％の間でコントロールされており、ま
た、攪拌はベルコ社製マグネティックスターラーで約７
０〜８０ｒｐｍの速度で行った。細胞の濃度が１ｍｌ当
たり１．８〜２．０×１０⁶ 個に達したとき、感染多重
度が約２．０になるように＜ウイルス増幅その３＞で調
製したウイルス溶液を加え、そのままで４８〜５２時間
攪拌培養を続けた。その後、遠心分離操作で細胞を集め
た。そのとき、発現チェック用に培養液１０ｍｌをファ
ルコン社製１５ｍｌ遠心チューブに移し、１，５００Ｇ
で１０分間遠心分離を行い細胞を集めた。

【００３１】発現チェック 上述の発現チェック用に集めた細胞に、５００μｌの低
張細胞破砕溶液（２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ）を加え、ピペッティン
グにより細胞を壊し、１．５ｍｌのチューブに移し、ト
ミー社製遠心分離機（ＭＸ−１６０）で、１５，０００
ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った。その上清を集め、
９５℃で１０分間インキュベートした。その後室温でサ
ンプルをゆっくり冷やし、トミー社製遠心分離機で１
５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。その上清
１０μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。このときのア
クリルアミドの濃度は１５％で行った。泳動後、クマシ
ーブリリアントグリーンで染色を行い、バイオラッド社
製ゲルドック２０００によりトロポミオシンに相当する
バンドのデンシトメトリーにより発現量を検定した。

【００３２】発現したトロポミオシンの粗精製 上述の方法でトロポミオシンを発現させたＳｆ９細胞を
以下の方法により処理して発現トロポミオシンの粗精製
を行い、次いでタンパク質濃度の測定を行い、発現量の
検討を行った。 ＜ウサギ骨格筋由来のトロポミオシンの場合＞ （１）回収した細胞に、１００ｍｌの低張細胞破砕溶液
（２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、
５ｍＭのＤＴＴ）を加え、ピペッティングにより細胞を
壊し、３８，０００Ｇ、３０分間遠心分離を行い上清を
集める。 （２）終濃度３５％の硫酸アンモニウムを加え、３０分
以上攪拌した後、３８，０００Ｇ、３０分間遠心分離を
行い上清を集める。 （３）終濃度７０％の硫酸アンモニウムを加え、３０分
以上攪拌した後、３８，０００Ｇ、３０分間遠心分離を
行い上清を捨てる。 （４）沈澱を１００〜１５０ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸
ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴで溶か
した後、同液で透析を行う。 （５）ガラスビーカーに移し、９０℃で温浴させる。試
料に温度計を入れておきその温度を測定し、温度が８５
℃に達してから１０分後に試料を室温に戻し、ゆっくり
冷やす。室温に戻ったら、３８，０００Ｇ、３０分間遠
心分離を行い上清を集める。 （６）ｐＨメーターでｐＨをモニターしながら、前操作
の上清に塩酸を加えていきｐＨを４．５に合わせ、３
８，０００Ｇ、３０分間遠心分離を行い上清を捨てる。 （７）沈澱を約５０ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．
０、０．５ｍＭのＤＴＴで溶かした後、同液で透析を行
う。 （８）マイクロビュレット法によりタンパク質濃度の測
定を行い、総蛋白量を測定する。同時に、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（発現チェック参照）を行い、同様にデンシトメト
リーから、総タンパク質におけるトロポミオシンの割合
を測定しトロポミオシン量も見積もった。

【００３３】＜ロブスター由来のトロポミオシンの精製
＞ 上記の方法に若干の修正を加えた。修正点は以下の通り
であった。 （ａ）（１）の低張細胞破砕溶液を５００ｍｌ用いて細
胞を破砕したこと。 （ｂ）（１）と（２）の操作の間に、終濃度が０．１Ｍ
になるように塩化ナトリウムを加えたこと。 （ｃ）（４）での沈澱を溶かす溶液の量を２００〜２５
０ｍｌにしたこと。 （ｄ）（７）での沈澱を溶かす溶液の量を約１５０ｍｌ
にしたこと。

【００３４】実施例５ロブスター由来のトロポミオシンの発現 本発明の２１塩基対の非翻訳配列を含まない組換えバキ
ュロウイルスで発現させた比較例２に示したウサギ骨格
筋由来のトロポミオシン発現と比べて、本発明の２１塩
基対の非翻訳配列を含む組換えバキュロウイルスで発現
させたロブスターのトロポミオシンの発現レベルは非常
に高く、アクリルアミドゲル上で、トロポミオシンに相
当する位置のデンシティは平均１２３ＯＤＵ（optical
densityunit) （ｎ＝３）であった。また、粗精製後の
３リッター培養分の総蛋白量は、約０．８〜１．５ｇで
あり、デンシトメトリーによるトロポミオシンの割合は
全体の約８０％と見積もることができた。ここで、トロ
ポミオシンの発現量を見積もると、３リッターで約０．
６〜１．２ｇ程度であった。本発明の２１塩基対の非翻
訳配列を含まない比較例２のウサギでのデータと比べる
と、ＯＤＵの比較で約１０倍、粗精製後の比較で約３０
倍以上のタンパク質発現が確認された。

【００３５】実施例６ロブスターのトロポミオシン遺伝子由来の２１塩基対の
非翻訳配列を含むバキュロウイルスベクターを用いたウ
サギ骨格筋由来のトロポミオシン発現 ウサギ由来のトロポミオシンを発現させ、上記の発現チ
ェックを行った。アクリルアミドゲル上で、トロポミオ
シンに相当する位置のデンシティは平均１０７ＯＤＵ
（ｎ＝３）であった。これらの試料については粗精製は
行っていないが、２１塩基対の非翻訳配列を含まない比
較例の場合とのＯＤＵの比較では、約９倍のタンパク質
発現が確認できた。

【００３６】比較例２本発明の２１塩基対の非翻訳配列を含まない組換えバキ
ュロウイルスベクターを用いたウサギ骨格筋由来のトロ
ポミオシンの発現 ウサギ由来のトロポミオシンを発現させ、上記の発現チ
ェックを行った。アクリルアミドゲル上で、トロポミオ
シンに相当する位置のデンシティ（ＯＤＵ）は平均１２
であった。また、粗精製後の３リッター培養分の総蛋白
量は約１００〜１５０ｍｇであり、デンシトメトリーに
よるトロポミオシンの割合は全体の約２０％と見積もる
ことができた。ここで、トロポミオシンの発現量を見積
もると３リッターで２０〜３０ｍｇ程度であった。

【００３７】実施例７ホタル由来変異型ルシフェラーゼ発現用トランスファー
ベクターの構築 ｐＧＬ３−ベーシックベクター（プロメガ社）と、以下
の２種類の合成ＤＮＡ、すなわち、ctgttggtaaagccacca
tgg (配列番号：４）及びggatccttacacggcgatctttccgc
（配列番号：５）を各50ピコモル、宝酒造製のＥｘＴａ
ｑポリメラーゼ１μｌ、ポリメラーゼ添付の１０×バッ
ファー５μｌ、ｄＮＴＰミックス４μｌを0.2 ｍｌのチ
ューブに加え、さらに蒸留水を加え最終的にチューブの
中の溶液を５０μｌにした。その後、チューブをパーキ
ンエルマー社製ＰＣＲ装置モデル9700により、９３℃で
５分、各サイクルが９３℃で１分、５５℃で２分、７２
℃で１分の２５サイクル、７２℃で１０分の反応プログ
ラムによりＰＣＲを行った。このときのＰＣＲ生成物
は、制限酵素ＮｃｏＩサイト、全翻訳領域、及び制限酵
素ＢａｍＨＩサイトを含む。ＰＣＲ生成物及びトランス
ファーベクターｐＡｃＣ４を、制限酵素ＮｃｏＩ／Ｂａ
ｍＨＩ（宝酒造社製）で消化した後、０．８％のＴＡＥ
−アガロースゲル電気泳動を行った。この電気泳動の
後、臭化エチジウムで染色を行い、トランスイルミネー
ター上でＤＮＡバンドの検出を行った。変異型ルシフェ
ラーゼＤＮＡ断片、及びｐＡｃＣ４のバンドをカッター
ナイフで切り出し、ジーン・クリーンIIキット（バイオ
１０１社）によりＤＮＡを抽出した。

【００３８】これらのＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）及び添付のバッファーを加え、１６
℃で一晩反応を行った。反応後、大腸菌に形質転換を行
いアンピシリン含有ＬＢ寒天培地上に展開し、コロニー
を形成させた。できたコロニーを爪楊枝で拾い、サーク
ル・グロウ培地（バイオ１０１社）で培養を行い、十分
に大腸菌を生育させた後、キアゲン社製プラスミド・マ
キシ・プレプ・キットを用いてトランスファーベクター
の調製を行った。このトランスファーベクターは、ポリ
ヘドリンプロモーター下流のポリヘドリン起源の開始コ
ドンからホタル由来の変異型ルシフェラーゼ遺伝子が挿
入されたものである。

【００３９】実施例８ロブスタートロポミオシン由来の２１塩基対の非翻訳領
域を含むホタル由来変異型ルシフェラーゼ発現用トラン
スファーベクターの構築 これは、上述のホタル由来変異型ルシフェラーゼ発現用
トランスファーベクターの構築と同様に行った。異なる
点は、トランスファーベクターｐＡｃＣ４ではなく、ロ
ブスター筋肉由来のトロポミオシン発現用トランスファ
ーベクターを、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化してロブス
ターのトロポミオシンの翻訳領域を除いたものに、ホタ
ル由来変異型ルシフェラーゼ遺伝子を挿入したことであ
る。このトランスファーベクターは、ポリヘドリンプロ
モーター下流のポリヘドリン起源の開始コドンが壊れて
おり、さらに下流のＸｂａＩサイトの下流に隣接するロ
ブスタートロポミオシン遺伝子由来の２１塩基対の非翻
訳領域の下流に、ホタル由来変異型ルシフェラーゼ遺伝
子が挿入されたものである。

【００４０】組換えバキュロウイルスの作成・増幅 上記のホタル由来変異型ルシフェラーゼ発現用トランス
ファーベクター又はロブスタートロポミオシン由来の２
１塩基対の非翻訳領域を含むホタル由来変異型ルシフェ
ラーゼ発現用トランスファーベクターを用いる組換えバ
キュロウイルスの作成及びその増幅は実施例３に記載し
た手順に従い、プラークアッセイ、ウイルス増殖その
１、ウイルス増殖その２、及びウイルス増殖その３をそ
れぞれ行った。

【００４１】＜ホタル由来変異型ルシフェラーゼの発現
＞培地１０ｍｌ中の7.5×10⁶個のＳｆ９細胞を、１０ｃ
ｍシャーレに固定した。次いで、ｍｏｉが２になるよう
にウイルス増幅その３で作成したウイルスを感染させ、
２７℃で２時間インキュベートした。培地を取り除きあ
らたに１０ｍｌの修正 Sf900II培地を加え２７℃で４８
時間培養した。細胞をシャーレからはがしてファルコン
社製１５ｍｌ遠心チューブに移し、１，２００Ｇで１０
分間遠心分離を行い、上清を捨てた。得られた細胞に、
５００μｌの低張細胞破砕溶液II（２０ｍＭトリス塩
酸，ｐＨ 8.0、５ｍＭの２−メルカプトエタノール) を
加え、ピペッティングにより細胞を壊し、１．５ｍｌの
チューブに移し、トミー社製遠心分離機（ＭＸ−１６
０）で、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行っ
た。その上清を集め、上述の低張細胞破砕溶液IIで１０
００倍に希釈した。この１０００倍希釈液２０μｌをル
ミノメーターキュベットに添加し、プロメガ社製ルシフ
ェラーゼ・アッセイ試薬１００μｌをオートインジェク
ターを利用して混合し、混合８秒後から10秒間の発光を
積算したものをＲＬＵとした。その結果、ロブスター由
来リーダー配列を持つ場合１５２０８．４ＲＬＵ（ｎ＝
５）、持たない場合は２１６２．０ＲＬＵ（ｎ＝５）で
あり、リーダー配列がある場合は、ない場合に比べて約
７倍の活性を示した。

【００４２】

【発明の効果】本発明のポリヌクレオチド配列（配列番
号：１）若しくはその一部又はこれらを含むポリヌクレ
オチド配列の下流に目的のポリぺプチドをコードするコ
ーディング配列を連結することにより、目的のポリぺプ
チドの発現を顕著に増加させることができる。また、本
発明のトランスファーベクター又は本発明の組換えバキ
ュロウイルスを用いて目的のポリぺプチドを生体細胞中
で発現させることにより目的のポリぺプチドを容易に大
量生産することができる。

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> RIKEN <120> A method for producing polypeptides <130> RJH13- <160> 5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homarus americanus <400> 1 aactcctaaa aaaccgccac c 21 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ggtctagaaa ctcctaaaaa accgccacc 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ttggatccga gagtgtttag tagccagac 29 <210> ４ <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ctgttggtaa agccaccatg g 21 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggatccttac acggcgatct ttccgc 26

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ベクターｐＶＬ１３９２のマルチクロ
ーニングサイトのＸｂａＩサイトとＢａｍＨＩサイトの
間にロブスター由来のトロポミオシンｃＤＮＡを挿入し
て構築したトランスファーベクターの模式図である。ト
ロポミオシンのコーディング配列の上流側でＸｂａＩサ
イトの下流側にトロポミオシンｃＤＮＡ由来の２１塩基
対の非翻訳領域が存在することが示されている。なお、
ポリヘドリンプロモーターの開始コドンは壊れている。

【図２】図２は、ベクターｐＡｃＣ４のＮｃｏＩサイト
とＢａｍＨＩサイトの間にウサギ骨格筋のα−トロポミ
オシンｃＤＮＡを挿入して構築したトランスファーベク
ターの模式図である。このベクターでは、ＮｃｏＩサイ
トの直ぐ下流側にトロポミオシンのコーディング配列が
連結されている。

【図３】図３は、ベクターｐＶＬ１３９２のマルチクロ
ーニングサイトのＸｂａＩサイトとＢａｍＨＩサイトの
間にウサギ骨格筋由来のα−トロポミオシンｃＤＮＡを
挿入して構築したトランスファーベクターの模式図であ
る。トロポミオシンのコーディング配列の上流側でＸｂ
ａＩサイトの下流側にトロポミオシンｃＤＮＡ由来の２
１塩基対の非翻訳領域が存在することが示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 前田 佳代 兵庫県揖保郡新宮町光都２−３−21 (72)発明者 前田 雄一郎 兵庫県揖保郡新宮町光都２−３−21 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA20 BA08 BA80 CA04 CA20 DA02 EA02 EA04 FA01 FA02 GA11 GA18 HA20 4B064 AG01 CA10 CA19 CC01 CC03 CC12 CC24 CE02 CE04 CE06 CE14 DA01 DA13 DA16 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 BB01 BC03 BC09 BC14 BC26 BD01 BD14 BD15 BD17 CA24 CA43 CA44 CA46

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に記載のロブスター由来の
   非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれたコー
   ディング配列の発現を増加させる機能を有する塩基配
   列。
2. 【請求項２】 配列番号：１に記載の塩基配列におい
   て、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入
   及び／又は付加された塩基配列であって、その下流に置
   かれたコーディング配列の発現を増加させる機能を有す
   る塩基配列。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２記載の塩基配列及
   びその下流に連結された目的のポリぺプチドをコードす
   るＤＮＡ配列をバキュロウイルス由来のプロモーター配
   列の下流に挿入して得られるトランスファーベクター。
4. 【請求項４】 前記バキュロウイルス由来のプロモータ
   ー配列がポリヘドリン遺伝子配列である請求項３記載の
   トランスファーベクター。
5. 【請求項５】 請求項３又は請求項４記載のトランスフ
   ァーベクター由来の前記ポリぺプチドの発現に関連のあ
   るＤＮＡ配列を生体内相同組換え、又はトランスポゾン
   由来のトランスエレメントによる挿入により組み込ん
   だ、目的のポリぺプチドを発現することができる組換え
   バキュロウイルスゲノム。
6. 【請求項６】 前記相同組換えが、バキュロウイルスが
   宿主とすることができる昆虫又は昆虫培養細胞内で起こ
   るものである請求項５記載の組換えバキュロウイルスゲ
   ノム。
7. 【請求項７】 前記昆虫が蚕である請求項６記載の組換
   えバキュロウイルスゲノム。
8. 【請求項８】 前記昆虫培養細胞がＳｆ９、Ｓｆ２１、
   又は High five（商標）細胞である請求項６記載の組換
   えバキュロウイルスゲノム。
9. 【請求項９】 前記相同組換えが、酵母細胞内で起こる
   ものである請求項５記載の組換えバキュロウイルスゲノ
   ム。
10. 【請求項１０】 前記相同組換え又はトランスポゾン由
    来のトランスエレメントによる挿入が大腸菌細胞内で起
    こるものである請求項５記載の組換えバキュロウイルス
    ゲノム。
11. 【請求項１１】 請求項５〜請求項１０いずれか１項に
    記載の組換えウイルスゲノムを有する組換えバキュロウ
    イルス。
12. 【請求項１２】 請求項５〜請求項１０いずれか１項に
    記載の組換えバキュロウイルスゲノムを、バキュロウイ
    ルスが宿主とすることができる昆虫又は昆虫培養細胞に
    トランスフェクションして得られる組換えバキュロウイ
    ルス。
13. 【請求項１３】 請求項１１又は請求項１２記載の組換
    えバキュロウイルスを昆虫又は昆虫培養細胞に感染さ
    せ、この細胞内で目的のポリぺプチドを発現させる工
    程、発現したポリぺプチドを回収する工程を含む前記ポ
    リぺプチドの生産方法。
14. 【請求項１４】 前記昆虫が蚕である請求項１３記載の
    方法。
15. 【請求項１５】 前記昆虫培養細胞がＳｆ９、Ｓｆ２１
    又は High five（商標）細胞である請求項１３記載の方
    法。
16. 【請求項１６】 配列番号：１記載の塩基配列、又はこ
    の配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、
    置換、挿入及び／又は付加された塩基配列であってその
    下流に置かれたコーディング配列の発現を増加させる機
    能を有する塩基配列を、目的のポリぺプチドをコードす
    る塩基配列の開始コドンの上流側に連結したトランスフ
    ァーベクターを調製する工程、次いで前工程で得られた
    トランスファーベクター中の目的ポリぺプチドの発現に
    関連する塩基配列を昆虫又は昆虫培養細胞内での相同組
    換えにより又は大腸菌細胞内で相同組換え若しくはトラ
    ンスポゾン由来のトランスエレメントによる挿入により
    バキュロウイルスに組み込んで組換えバキュロウイルス
    ゲノムを調製する工程、こうして得られた組換えバキュ
    ロウイルスゲノムをバキュロウイルスが宿主とし得る昆
    虫又は昆虫培養細胞にトランスフェクションして組換え
    バキュロウイルスを調製する工程、こうして得られた組
    換えバキュロウイルスを昆虫又は昆虫培養細胞に感染さ
    せ、この細胞内で目的のポリぺプチドを発現させる工
    程、そして発現された目的のポリぺプチドを回収する工
    程、を含むポリぺプチドの生産方法。