JP3699477B2 - 細胞表面受容体ｈｅｋに結合するサイトカイン - Google Patents
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Description
発明の背景
受容体チロシンキナーゼとして知られる蛋白質は、リガンドとの結合によって活性化される固有のキナーゼ活性を有している。このクラスの蛋白質は、触媒領域内の保存された構造上のモチーフにより特徴付けられ（Hanks等、Science,242:42,1988）、触媒領域から5'側の領域の構造上の特徴に基づき、様々なファミリーに分類することが可能である。
Boyd等（J.Biol.Chem.,267:3262,1992）は、チロシンキナーゼ活性を示す細胞表面グリコプロテインを精製した。N-末端アミノ酸配列から、この蛋白質はeph/elkファミリーのメンバーと同定され，この蛋白質はそれゆえhek（ヒトeph/elk-様キナーゼ）と命名された。hekと免疫反応するモノクローナル抗体が、多くのヒト細胞型に於けるhek発現の研究に用いられた（Boyd等、上記）。hek抗原は、ヒトpre-B細胞の白血病細胞系LK63（抗体作製の為の免疫原として用いられた細胞系）及びヒトT-細胞の白血病細胞系JMに於いて検出された。Raji Bリンパ細胞系は、弱いhek抗原発現を示し、試験された残りの細胞系（正常細胞及び腫瘍細胞の両者で、pre-B及びT-細胞系を含む造血細胞系）では一貫して陰性であった。正常組織及び腫瘍組織の生体組織検査用標本をhek抗原発現に関しても試験したが、正常組織のどれもが陽性でなく、造血腫瘍組織の非常に低い比率の部分のみが陽性であった。
上記LK63とJM細胞系、さらにヒトT-細胞の白血病細胞系HSB-2に於けるhek転写産物の発現は、ノザンブロット分析によって証明されている（Wicks等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:1611,1992）。単離されたhek cDNAクローンに対するヌクレオチド及びアミノの配列は、上記Wicks等により発表されている。
hek蛋白質は、次のものを含む多数の他の受容体チロシンキナーゼと非常に近い関係にある：elk(Letwin等、Oncogene 3:621,1988及びLhotak等、Mol.Cell.Biol.11:2496,1991)；hekホモログmek4及びcek4(Sajjadi等、New Biol.3:769,1991);eek(Chan等、Oncogene 6:1057,1991)；erk(Chan等、上記）；eck(Lindberg等、Mol.Cell.Biol.10:6316,1990)；cek5(Pasquale,E.B.Cell Regulation 2:523,1991)；及びeph(Hirai等、Science 238:1717,1987)。このサブファミリーの蛋白質は、それらの細胞質領域のみでなく細胞外領域に於いても近縁にあり、41から68%同一である。興味深いことに、これら各種の受容体の組織分布は、多様である。例えば、elk mRNAの発現は、精巣及び脳に限られていることが報告されており（Lhotak等、上記）、それに対し、eckは、それら同じ二つの組織のみならず肺、腸、腎臓、脾臓、卵巣及び皮膚においても見出だされている。
受容体チロシンキナーゼに対するリガンドは、受容体を発現している細胞の増殖、分化及び生存に影響する蛋白質の多様なグループである。今日まで、hekに対するリガンドは、発見されていない。hekを結合する単数または複数の推定上のリガンドの同定は、hek蛋白質により制御される細胞プロセスの性質を研究上で有用性を証明するであろう。
発明の概要
本発明は、hekとして知られる細胞表面受容体に結合するhekリガンド（hek-L）と命名される新規のサイトカインを提供する。更に本発明は、hek-L蛋白質をコードする単離されたDNA、単離されたDNAを含む発現ベクター、及びhek-L蛋白質の発現に適した条件下で発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによるhek-L生産方法を提供する。hek-L蛋白質又は、それの免疫原断片に対する抗体も開示されている。
発明の詳細な説明
hekとして知られる細胞表面蛋白質に結合する新規な蛋白質リガンドをコードするcDNAが本発明に於いて単離された。又、hekリガンド（hek-L）cDNAを含む発現ベクター及びhek-Lの発現に適した条件下で発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによる組換えhek-Lポリペプチドの製造方法並びに発現したhek-Lの回収法も提供される。精製されたhek-L蛋白質は、該蛋白質の可溶型も含め本発明に包含される。
本発明は、又、hek-L免疫原に特異的な抗体を生み出す免疫原として作用することが可能なhek-L又はそれの抗原断片を提供する。従ってhek-L又はそれの抗原断片に特異的なモノクロナル抗体は調製可能である。
本発明により開示される新規なサイトカインは、受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーである細胞表面受容体hekに対するリガンドである。本発明のhekリガンドの一つの用途としては、hek受容体を有する細胞の増殖または分化に於いて、hekと結合することにより果たされるであろうhek-Lの役割を調査するための研究道具があげられる。細胞上でのhek-Lのhekへの結合により開始され得る生物学的シグナルを研究することができる。腫瘍発生に於いてhek何等かの役割を担っている可能性が示唆されている（Boyd等、上記）。本明細書中で提供されるhekリガンドは、hek-Lの同種の受容体への結合が腫瘍発生に於いて持ち得る効果を研究する上で有用である。
本発明のhek-Lポリペプチドは、又、hekもしくはhek-L又はそれらの相互作用を検出するin vitroでの分析にも用いることができる。hek抗原は、ある種の白血病細胞系で検出されているので、hek-Lは、その様な細胞への診断用又は細胞毒性作用物を投与する為の担体としても使用可能である。hekリガンドの上記の用途及びその他の用途は、以下に詳述される。
本発明のhek-L蛋白質は、又、elkとして知られる受容体チロシンキナーゼにも結合することがわかった。elkはLetwin等,Oncogene 3:261,1988及びLhotak等Mol.Cell.Biol.11:2496,1911により記載されている。スカッチャード分析により、実施例５に記載されているように二個のhek-Lに結合したelkの二相パターンが明らかにされた。それ故、本明細書に開示されたhek-L蛋白質は、又、例えば種々の分析操作に於いて、elkを結合させるために使用できる。しかしながら、elk-Lのelkに対するより高い親和性の観点から、その様な用途には一般的には実施例５に記載されたelkリガンド（elk-L）蛋白質が、好まれる。
実施例５に記載された結合研究は、又、elkリガンド（elk-L）がhekと結合することを明らかにした（二相結合パターン）。B61として知られる近縁蛋白質（Holzman等、Mol.Cell.Biol.10:5830,1990）は、hek（線形パターン）とelk（二相パターン）の両者と結合することが見出された。相対的な親和性は、実施例５の表Ｉ及びIIに示す。
hek-L DNAをクローン化する試みに於いて核酸源として用いるのに適した細胞を決定するために、種々のタイプの細胞が、hekを（ヒトhekとFcポリペプチド抗体からなる融合蛋白質の形で）結合する能力により選別された。ヒトT-細胞の白血病細胞系は、hek/Fc結合に陽性であり、cDNA発現ライブラリーはこれから作製された。実施例３に記載されたように、hek/Fc結合蛋白質の発現に対するクローンを選別することにより、ヒトhek-Lをコードする二個の異なるcDNAクローンを単離するのに成功した。第１のヒトhek-L cDNAクローンのDNA配列とそれによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号１及び配列番号２に示されている。第２のヒトhek-LクローンのDNA及びそれによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号３及び配列番号４に示されている。ヒトhek-L cDNAクローンのヌクレオチド及びそれによりコードされるアミノ酸配列の両者と、Genbank及びSwissprotデータベースとの比較は、hekリガンドの配列が固有であることを示した。二つのクローンによってコードされたhek-結合蛋白質のアミノ酸配列は38%同一である。
ヒトhek-L cDNAを、第１の陽性なクローンから単離し、ストラタジーンクローニングシステム社、カリフォルニア州、ラホーヤ（Stratagene Cloning System,La Jolla,CA）より入手可能なクローニングベクターpBLUESCRIPT（登録商標）SK(-)の（マルチクローニングサイト領域の）Bam HI部位に挿入した。得られた組換えベクターは、A2/pBSと命名され、E.coli DH5α細胞に入れられて1993年8月11日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）に寄託され寄託番号ATCC 69384が与えられた。ヒトhek-L cDNAを、第２の陽性なクローンから単離しpBLUESCRIPT（登録商標）SK(-)のBam HI部位に挿入した。得られた組換えベクターは、C6/pBSと命名され、E.Coli DH5α細胞に入れられて1993年8月25日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、寄託番号ATCC 69395が与えられた。両寄託は、ブタペスト条約（Budapest Treaty）の条項にもとずき行われた。
配列番号２の（クローンA2のcDNAによりコードされた）hek-Lは、N-末端シグナルペプチド（アミノ酸-19から-1まで）、細胞外領域（アミノ酸1から202まで）及びアミノ酸203から始まるC-末端疎水性領域からなる。配列番号４の（クローンC6のcDNAによりコードされた）hek-Lは、N-末端シグナルペプチド（アミノ酸-22から-1まで）、細胞外領域（アミノ酸1から160まで）、及びアミノ酸161から始まるC-末端疎水性領域からなる。
クローンA2及びC6によって発現されたhek-L蛋白質は、グリコシル−フォスファチジルイノシトール（GPI）リンケージによって細胞表面に固定されていることが知られている。GPI膜アンカーは、化学構造とその加工を含め、Ferguson,M.及びA.Williamsによって記載されている（Ann.Rev.Biochem.,57:285,1988、本明細書中に参考文献として取込まれる）。発現された当初は、ある蛋白質はGPIアンカーのシグナルを含むC-末端疎水性領域からなっている。切断部位は、疎水性領域のN-末端の上流（約10-12アミノ酸上流であることが多い）に位置する。翻訳後加工は、この切断部位での切断を含む。GPIアンカーは、加工された成熟蛋白質の新たにむき出しになったC-末端アミノ酸に接着する。それ故、hek-L蛋白質が疎水性領域にあるGPIアンカーシグナルを認識する細胞で発現するとき、配列番号２及び４のアミノ酸配列の全ては、該蛋白質の前駆体となる。
GPIアンカー蛋白質から得られた共通配列から、本発明のhek-L蛋白質の有望な切断部位は、配列番号２のアミノ酸194と195の間、及び配列番号４のアミノ酸148と149の間である。蛋白質の切断後、GPIの分子は、今や加工された蛋白質のC-末端となったセリン残基に接着する（配列番号２のアミノ酸194及び配列番号４のアミノ酸148）。切断は、hek-L蛋白質の疎水性領域の上流のどこででも起こり得る。
本明細書で使用する用語"hek-L"は、hekと結合することができ、配列番号２又は配列番号４のhek-L蛋白質と相同性（好ましくは最低80%相同）を示す一群のポリペプチドである。ヒトhek-Lは、マウス、ラット、ウシ、ブタ又はその他の霊長類の種を含む（但しそれ等に限定しないが）他の哺乳動物種由来のhek-L蛋白質と同様、本発明の範囲内である。本明細書で使用されているように、用語"hek-L"は、蛋白質の膜結合型及び可溶型（分泌型）の両者を含む。hek-結合の性質を保持するトランケイトされた蛋白質は、本発明に包含される。その様なトランケートされた蛋白質は、例えば疎水性領域を欠き細胞外（受容体結合）領域のみからなる可溶性hek-Lを含む。
ヒトhek-L cDNAを、放射性標識し、種間ハイブリダイゼーションによるほかの哺乳動物のhek-L cDNAの単離の為のプローブとして使用できる。例えば、他の哺乳動物種のT-細胞白血病細胞系から得られたcDNAライブラリーを、放射性標識されたヒトhek-L cDNAを用いスクリーニングして、陽性なクローンを単離することもできる。或いは、種々の細胞系から単離されたmRNAを、ノザンハイブリダイゼーションによりスクリーニングして、hek-L遺伝子のクローン化に用いるのに適した哺乳動物のhek-L mRNAのソースを決定することができる。
hek/Fc融合蛋白質は、下記実施例２及び３に記載したスクリーニング操作に用いられるが、hekは、hek-L蛋白質の発現に関してのクローン及び細胞系候補のスクリーニングに用いることができる。しかし、hek/Fc融合蛋白質は、容易に精製できると言う利点を提供する。更に、ジスルフィド結合が２個の独立した融合蛋白鎖のFc領域間に形成され、二量体を作る。
他の抗体Fc領域は、実施例１に記載したようにヒトIgG1 Fc領域ムテインと置換することができる。他の適切なFc領域としては、プロテインＡ又はプロテインＧに高い親和性で結合可能なものがあり、マウスIgG1のFc領域またはヒトIgG1 Fc領域の断片、例えば、鎖間ジスルフィド結合が形成されるよう少なくともヒンジ領域を持つ断片が含まれる。
本発明の一つの態様は、可溶性hek-Lポリペプチドを提供する。可溶性hek-Lポリペプチドは、ネイティブなhek-Lの細胞外領域の全部又は一部からなるが、細胞膜にポリペプチドを繋げておくためのシグナルを含めた疎水性領域を欠く。可溶性hek-Lポリペプチドは、好都合なことに、最初合成されたとき分泌を促進するネイティブな（又はヘテロな）シグナルペプチドを含んでいるが、シグナルペプチドは、細胞からhek-Lが分泌されるとき切断される。使用できる可溶性hek-Lポリペプチドは、hek受容体を結合する能力を保持する。可溶性hek-Lは、又、可溶性hek-L蛋白質が分泌され得ることを条件に疎水性領域の一部を含むこともできる。
可溶性hek-Lは、所望の蛋白質を発現した細胞を無傷のまま細胞培養培地から、例えば遠心分離により分離し、培地（上清液）を求める蛋白質の存在に関して分析することにより、同定できる（そして非可溶性の膜結合型のものから区別することができる）。培地中のhek-Lの存在は、蛋白質が細胞から分泌されたこと、従ってそれが求める蛋白質の可溶型であることを示す。可溶性hek-Lは、この蛋白質の、例えばオルタナティブスプライシングから生じた、天然に存在する型でもよい。更に、GPIリンクされたhek-Lは、細胞表面から培養培地に、例えばプロテアーゼ又は他の酵素の働きによって、放出又は流出され得る。
hek-Lの可溶型の使用は、ある種の応用に好都合である。可溶性蛋白質が細胞から分泌されるため組換え宿主細胞からの蛋白質の精製は容易になる。更に、可溶性蛋白質は、一般的に静脈からの投与により適している。
可溶性hek-Lポリペプチドの実施例は、ネイティブなhek-L蛋白質の全ての細胞外領域からなるものを含む。そのような可溶性蛋白質の一つは、配列番号２のアミノ酸1から202までを含み、他の一つは、配列番号４のアミノ酸1から160までを含む。最初に宿主細胞内で発現させる際に、可溶性蛋白質は、使用する宿主細胞内で機能する下記のヘテロなシグナルペプチドの一つを付加的に含んでいてもよい。或いは、蛋白質は、hek-Lが配列番号２のアミノ酸-19から202まで又は配列番号４のアミノ酸-22から160までを含んでいたように、最初からネイティブなシグナルペプチドを含んでいてもよい。可溶性hek-L蛋白質は、GPI接着部位として働くアミノ酸を含むところまでC-末端を欠失するようにトランケートされていてもよい。実施例は、上で議論されたように、配列番号２のアミノ酸1-193又は配列番号４のアミノ酸1-147を含む蛋白質を含む。GPI接着部位は欠失されていてもよいが、疎水性領域の欠失が、細胞膜への蛋白質のGPIアンカーを妨げるには十分であると考えられている。更なる態様では、蛋白質はC-末端をトランケートして、C-末端アミノ酸が配列番号２のアミノ酸193と202間、又は配列番号４のアミノ酸147と160間のどのアミノ酸となっても良い。可溶性hek-L蛋白質をコードするDNA配列は、本発明に包含される。
可溶性ポリペプチドを含めトランケートされたhek-Lは、多数の従来の技術のいずれによっても調製できる。希望するDNA配列は、既知の技術を用いて化学的に合成できる。DNA断片もまたクローン化されたDNA配列の全長を制限エンドヌクレアーゼ消化で作り出すことができ、アガロースゲルでの電気泳動により分離できる。DNA断片の5'又は3'末端を希望する位置に再構築するオリゴヌクレオチドは、合成できる。オリゴヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を希望するコード配列の上流に含み、開始コドン（ATG）をコード配列の5'末端に位置させることができる。良く知られた複製連鎖反応法も、希望する蛋白質断片をコードするDNA配列を単離するため使用できる。更なる代替として、既知の変異導入の技術を用いて、希望する位置に、例えば細胞外領域の最後のアミノ酸のコドンの直ぐ下流に、終止コドンを挿入できる。
本発明の或る態様は、配列番号１のヌクレオチド83-796（全コード領域）、83-745（シグナルペプチド及び細胞外領域をコードする）、140-796（シグナルペプチドを除く蛋白質をコードする）、及び140-745（細胞外領域をコードする）からなるグループから選択されたヌクレオチド配列を含む単離されたDNAを提供する。又、配列番号３のヌクレオチド28-630（全コード領域）、28-573（シグナルペプチド及び細胞外領域をコードする）、94-630（シグナルペプチドを除く蛋白質をコードする）、及び94-573（細胞外領域をコードする）からなるグループから選択されたヌクレオチド配列を含む単離されたDNAも提供する。配列番号２及び配列番号４の蛋白質の生物学的活性のある断片をコードするDNAも、C-末端でトランケートされた上述のhek-L蛋白質をコードするDNAを含めて（但しそれ等に限定はされないが）提供される。
本発明のhek-L DNAは、cDNA、化学的に合成されたDNA、PCRにより単離されたDNA、ゲノムDNA、及びそれらの組合わせを含む。ゲノムhek-L DNAは、標準的な技術を用い、クローンA2又はC6のcDNAへのハイブリダイゼーションにより単離できる。
本発明は、組換え及び非組換えの両方の精製されたhek-Lポリペプチドを提供する。希望する生物学的活性（例えば、hekと結合する能力）を保持する、ネイティブなhek-L蛋白質の変異体及び誘導体も、又本発明の範囲に含まれる。本発明の一つの態様に於いて、成熟hek-L蛋白質は、N-末端アミノ酸配列Leu-Leu-Ala-Gln-Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Asnにより特徴付けられる。他の一つの態様に於いて、成熟hek-L蛋白質は、N-末端アミノ酸配列Gly-Ser-Ser-Leu-Arg-His-Val-Val-Tyr-Trp-Asn-Serにより特徴付けられる。
hek-L変異体は、例えば、天然のhek-Lポリペプチドのヌクレオチド配列コードの変異によって得ることができる。本明細書で言及されるhek-L変異体は、天然のhek-Lに本質的に相同なポリペプチドであるが、一つもしくはそれ以上の欠失、挿入、又は置換のため、天然のhek-L（ヒト、マウスまたは他の哺乳動物の種）のアミノ酸配列とは異なった配列を持つ。hekを結合するその様な変異体は、配列番号２及び配列番号４で提供されたアミノ酸配列を持つネイティブなhek-結合蛋白質の同等物である。
本発明の変異体DNA及びアミノ酸配列は、配列番号１−４の天然の配列のような天然のhek-L配列に対し、好ましくは最低80%同一であり、さらに好ましくは最低90%同一である。断片に対してのパーセント同一性は、断片中に存在するネイティブな配列の部分に関して計算される。本発明の或る態様は、配列番号２のアミノ酸1-194、1-202及び1-219、並びに配列番号４のアミノ酸1-148、1-160及び1-179からなるグループから選択された配列に、最低80%同一であるアミノ酸配列からなるhek-Lポリペプチドを提供する。
ネイティブなアミノ酸配列の変更は、多数の既知の技術のいずれによっても達成できる。変異は、ネイティブな配列の断片への連結を可能にする制限部位が横に付いている変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座位に導入できる。連結後、得られた再構築された配列は、希望するアミノ酸の挿入、置換又は欠失を持つ類似体をコードする。
或いは、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異導入法は、必要とされる置換、欠失又は挿入に従って変更された特定のコドンを持つ変更された遺伝子を提供するために使用できる。上述の変更を行う典型的な方法は、Walder等（Gene 42:133,1986）；Bauer等（Gene 37:73,1985）；Craik（Bio Techniques,January 1985,12-19）；Smith等（Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981）；Kunkel（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488,1985）；Kunkel等（Methods in Enzymol.154:367,1987)；及び米国特許第4,518,584号及び4,737,462号により開示され、それらは本明細書中に参考文献として取込まれる。
変異体は、保存的に置換された配列を含んでも良い。これの意味するところは、或るアミノ酸残基が、同様な生理化学的性状を持った残基により置換えられるということである。保存的置換の例は、Ile,Val,Leu又はAlaが互いに置換するような一つの脂肪族残基の他の一つとの置換、又はLysとArg間；GluとAsp間；又はGlnとAsn間のような一つの極性残基の他の一つとの置換を含む。その他のその様な保存的置換、例えば同様な疎水性の性格を持った全領域の置換は良く知られている。
hek-Lは、又グリコシル基、脂質、フォスフェート、アセチル基及びその様な他の化学成分と共有結合又は凝集結合を形成することによりhek-L誘導体を作り出すために修飾されていても良い。hek-Lの共有誘導体は、化学成分をhek-Lアミノ酸側鎖の官能基、又はhek-LポリペプチドのN-末端もしくはC-末端、又はそれらの細胞外領域に結合させることにより調製することができる。本発明に含まれるhek-Lのその他の誘導体は、N-末端又はC-末端融合体のような組換え培養での合成によるような、hek-L又はその断片の、他の蛋白質又はポリペプチドとの共有又は凝集結合体を含む。
hek-Lリガンドを最初に組換え系で発現させたとき、（ネイティブ又はヘテロな）シグナル又はリーダー配列を、hek-LポリペプチドのN-末端に含んでいても良い。シグナル又はリーダーペプチドは、翻訳時に又は翻訳後に蛋白質の合成の部位から細胞膜又は細胞壁の外側の部位への蛋白質の輸送を指令し、分泌過程で成熟蛋白質から切断される。使用される発現系に従って一般的に選択される、適切なヘテロなシグナルペプチドの実施例を、以下に記述する。
hek-Lポリペプチド融合体は、hek-Lの精製及び同定を容易にするため付加されたペプチドを含むことができる。その様なペプチドは、例えば、ポリ-His又は米国特許第5,011,912号及びHoppら、Bio/Technology 6:1204,1988により記載されている抗原同定ペプチドを含む。その様なペプチドの一つは、高度に抗原的であり発現した組換え蛋白質の迅速な分析及び容易な分離を可能にする特異的モノクローナル抗体に可逆的に結合するエピトープを提供する、FLAG（登録商標）ペプチド、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)である。このペプチドでキャップされた融合蛋白質は、又E.coliに於ける細胞内分解に抵抗できる。4E11と命名されたマウスのハイブリドーマは、（本明細書中に参考文献として取込まれる米国特許第5,011,912号に記載されるように）ある種の二価金属カチオンの存在下でペプチドDYKDDDDKを結合するモノクローナルな抗体を生産し、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託番号HB 9259として寄託された。
本発明は、更に関連するネイティブパターンのグリコシル化を伴う、又は伴わないhek-Lポリペプチドを含む。酵母又は哺乳動物の発現系（例えばCOS-7細胞）で発現したhek-Lは、発現系の選択によって分子量とグリコシル化パターンが、ネイティブなhek-Lポリペプチドと同様か又は有意に異なり得る。E.coliの様なバクテリア発現系でのhek-Lポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。
アミノ酸残基又は配列の種々の添加もしくは置換、又は生物学的活性もしくは結合に不必要な末端または内部残基又は配列の欠失をコードするDNA構築物が調製可能である。例えば、hek-L細胞外領域のN-グリコシル化部位を、哺乳動物及び酵母発現系に於いてより均質且つ炭水化物の少ない類似体を発現させるため、グリコシル化を妨げるように修飾することができる。真核生物のポリペプチドに於けるN-グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットAsn-X-Yにより性格付けられる（ここで、XはProを除くいかなるアミノ酸でもよく、YはSer又はThrである）。このトリプレットをコードするヌクレオチド配列の適切な修飾は、Asn側鎖での炭水化物残基の接着を妨げる置換、添加又は欠失をもたらす。例えば、Asnが異なった蛋白質に置き換えられるよう選ばれた１個のヌクレオチドの変更は、N-グルコシル化部位を不活化するのに十分である。蛋白質のN-グリコシル化部位を不活化する既知の方法としては、本明細書中に参考文献として取込まれる米国特許第5,071,972号及び欧州特許第276,846号に記載されている方法を含む。
３個のN-グリコシル化部位が、クローンA2によりコードされたhek-Lの配列番号２のアミノ酸19-21、48-50及び81-83で見出されている。１個のN-グリコシル化部位が、クローンC6によりコードされたhek-Lの配列番号４のアミノ酸11-13で見出されている。
他の例では、生物学的活性に必須でないCys残基をコードする配列は、再生に於ける誤った分子間ジスルフィド結合を形成しないよう、Cys残基を欠失するか又は他のアミノ酸に置換えるように変更することができる。他の変異体は、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系での発現を促進するため、隣接する二塩基性アミノ酸残基の修飾によって調製される。欧州特許第212,914号は、蛋白質のKEX2プロテアーゼ加工部位を不活化するための部位特異的変異導入の使用を開示している。KEX2プロテアーゼ加工部位は、隣接する塩基性残基の存在を排除するようArg-Arg,Arg-Lys及びLys-Argの対を変更するように、残基を欠失、添加又は置換することにより不活化される。Lys-Lys対は、KEX2切断にあまり敏感でなく、Arg-Lys又はLys-ArgのLys-Lysへの転換は、KEX2部位の不活化への保存的で好ましい解決法である。KEX2プロテアーゼ加工部位は、配列番号２のhek-Lのアミノ酸26-27、87-88及び199-200に見出されている。配列番号４のhek-Lは、アミノ酸73-74と134-135にKEX2プロテアーゼ加工部位を含む。
天然に存在するhek-L変異体は、また本発明に包含される。そのような変異体の例は、mRNAオルタナティブスプライイシング又はhek-L蛋白質のタンパク質分解切断から生じるhek結合性を保持した蛋白質である。mRNAのオルタナティブスプライシングは、例えば、蛋白質の天然に存在する可溶型のような、トランケートされてはいるが生物学的に活性のあるhek-L蛋白質を作ることもできる。タンパク質分解に起因する変異体は、例えば、hek-L蛋白質から（一般的に1-5未満アミノ酸から）の一つ又はそれ以上の末端アミノ酸の加水分解による除去による、異なったタイプの宿種細胞内での発現した際のN-又はC-末端の相違を含む。シグナルペプチドは、与えられた蛋白質の異なった位置で切断され、その結果、成熟蛋白質のN-末端アミノ酸の変異が生じ得る。。
一つの発現系に於いて、クローンC6によってコードされたhek-L蛋白質のN-末端アミノ酸は、配列番号４のアミノ酸4（Leu）であった。クローンA2から誘導された可溶性hek-L融合蛋白質の調製品の一つは、N-末端アミノ酸として配列番号２のアミノ酸2（Asn）を持つ融合蛋白質（約60%）と、配列番号２のアミノ酸1（Leu）がN-末端アミノ酸である融合蛋白質の混合物から成っていた。本発明のある態様は、それゆえN-末端アミノ酸が、配列番号４のアミノ酸1-4のいずれか又は配列番号２のアミノ酸1-12のいずれかである蛋白質（可溶性又は膜結合）に向けられた。
１個以上のコドンにより同じアミノ酸がコードできる遺伝暗号の既知の縮重のため、DNA配列は、配列番号１又は３に示されたものから変異され、それでも尚配列番号２又は４のアミノ酸配列を持つhek-L蛋白質がコードされ得る。そのような変異体DNA配列は、サイレント変異（例えば、PCR増幅に於いて起こる）から生じ得るもので、またネイティブな配列を慎重に変異導入した産物でもあり得る。
それゆえ本発明は生物学的に活性なhek-Lをコードする次の物から選択され単離されたDNA配列を提供する：（a）ネイティブな哺乳動物のhek-L遺伝子のコード領域から誘導されたDNA（例えば、配列番号１又は配列番号３に示されたヌクレオチド配列のコード領域からなるcDNA）;及び（b）（a）により規定されたDNAの遺伝暗号の結果としての縮重物で生物学的に活性なhek-LをコードするDNA。その様なDNA配列によりコードされたhek-L蛋白質は、本発明に包含される。
本発明のhek-L DNAは、cDNA、化学的に合成されたDNA、PCRにより単離されたDNA、ゲノムDNA、及びそれらの組合わせを含む。ゲノムhek-L DNAは、標準的な技術を用いた、クローンA2又はC6のcDNAのハイブリダイゼーションにより単離できる。
生物学的活性の分析
hekを結合する能力を持つ変異体は、適切な分析のいずれによっても同定できる。一般的な分析技術も、ネイティブなhek-L蛋白質のhek-結合活性の分析に有用である。hek-Lの生物学的活性は、例えば、hekのリガンド結合領域への結合の競合（即ち競合的結合分析）により決定できる。
hek-Lポリペプチドの競合的結合分析の一つの型は、放射性標識された可溶性ヒトhek-L及び細胞表面hekを発現しているインタクトな細胞を使用する。インタクトな細胞の替わりに、（hek/Fc融合蛋白質のような）融合蛋白質のFc領域とプロテインＡ又はプロテインＧとの相互作用により固体相に結合させた、可溶性hekと置換えできる。別の型の競合結合分析は、放射性標識されたhek/Fc融合蛋白質のような可溶性hek及びhek-Lを発現するインタクトな細胞を用いる。又、可溶性hek-Lは、固体相に結合されていても良い。
競合結合分析は、標準的な方法論を用いて行うことができる。例えば、表面結合hekに対する結合活性を分析するため、放射性標識されたhek-Lを用いて、推定上のhek-Lホモログと競合させることができる。定性的結果は、競合オートラジオグラフィックプレート結合分析により得ることができ、又定量的結果を得るためスカッチャードプロットを使用しても良い。
又、可溶性hekは、125Ｉで標識されたhek-Lのような検出可能な成分の存在を分析するのに適したカラムクロマトグラフマトリクスもしくは同様の基質等の固体相に、結合させることができる。固体相への結合は、例えば、hek/Fc融合蛋白質をプロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリクスと結合させることにより達成できる。
hek-L（変異体を含む）の結合上の特徴は、上述と同様の競合分析に標識された可溶性hek（例えば、125Ｉ-hek/Fc）を用いて決定できる。しかしこの場合、hek-Lを発現するインタクトな細胞又は固体の基質に結合した可溶性hek-Lを用いて、推定上のhek変異体を含む試料が標識された可溶性hekのhek-Lへの結合に対して競合する程度が測定される。
膜結合hek-Lのhek結合活性を検出するための好ましい分析法は、次のようなものである。実施例１で調製されたhek/Fc融合蛋白質と、hek/Fcを直接放射性標識することを避けるため実施例３に記載された125Ｉで標識されたマウスの抗ヒトIgG Fc抗体を用いた、改変した間接結合分析が考案された。内在的hek-Lを発現する細胞（例えば、実施例２に記述したCCRF-HSB-2細胞系）を、次のように異なる濃度のhek/Fcに晒し、次いで一定の飽和濃度の125Ｉ抗体に晒す。
CCRF-HSB-2細胞を、96穴培養プレートを用いた懸濁液培養により培養する。細胞（2×106細胞／ウエル）を、結合培地（RPMI 1640培地、1％ウシ血清アルブミン、0.2%アジ化ナトリウム及び20mM Hepes、pH7.2）中で種々の濃度のhek/Fcの存在下又は非存在下で、37℃で１時間インキュベートする。細胞を、それからPBSで一度洗浄し、125Ｉ-マウス抗ヒトIgG Fc（40ng/ml）を含む結合培地と、穏やかに攪拌しながら37℃で１時間インキュベートする。細胞と未結合の125Ｉ-抗体は、本質的にはDower等,J.Immunol.132:751(1984)によって記載されたような、フタレート油分離法により分離される。
組換え膜結合hek-Lを発現する細胞へのhek/Fc結合に関する分析は、実施例５に記載したように行うことができる。間接結合分析が使用された。
可溶性hek-Lのhek結合活性を分析する好ましい分析法は、次のようなものである。分析法は、実施例２に記載したように内在性hek-Lを発現するCCRF-HSB-2細胞系へのhek/Fc融合蛋白質の結合を阻止する可溶性hek-Lの活性を検出する。
可溶性hek-Lを発現する発現ベクターで形質転換されたCV-1/EBNA細胞からの条件付き上清液（培養液）を、96穴プレートで滴定する。hek/Fcの一定量（1μg／ウエル）が、各ウエルの結合培地内に加えられ、次いでCCRF-HSB-2細胞がウエル当たり1-2×106個加えられる。プレートを37℃で１時間インキュベートする。細胞を、PBSで二回洗浄し、それから遠心分離によりペレット化する。125Ｉ-マウス抗ヒトIgG Fcを一定濃度で各ウエルに加え、プレートを37℃で更に１時間インキュベートする。125Ｉ-マウス抗ヒトIgG Fcは、CCRF-HSB-2細胞に結合しているhek/Fcに結合する。最後のインキュベーション後、細胞は、結合した125Ｉ-マウス抗ヒトIgG Fcと遊離した物とを分離するフタレート油の入った試験管の上部に回収される。放射性活性を、ガンマ線計測器を用いて定量化する。
ｈｅｋ−Ｌの用途
本発明のhek-Lは、hekを発現する細胞を検出する結合分析に使用できる。例えば、hek-Lもしくはその細胞外領域又はそれの断片は、125Ｉのような検出可能な成分と結合させることができる。125Iによる放射性標識は、高い比活性で標識された機能的な125I-hek-L分子を得るための幾つかの標準的方法により行われる。又、ビオチン(biotin)やアビジン(avidin)のような発色分析や蛍光分析反応に触媒として働くことのできる酵素のような他の検出可能な成分を用いても良い。hek発現を試験される細胞は、標識されたhek-Lと接触させることができる。インキュベーション後、未結合の標識されたhek-Lは除去され、結合は検出可能な成分を用いて測定される。
本明細書で開示されるhekリガンド蛋白質は、又、hek-Lに対する結合親和性と言う意味での、hek蛋白質の生物学的活性を測定することにも使用できる。例示として、hek-Lは、異なる温度で貯蔵された、もしくは、異なる細胞型から生産されたhek蛋白質の、生物学的活性を測定する結合親和性の研究に使用できる。例えば、あるhek蛋白質の生物学的活性は、調査研究に使用する前にこのように確認することができる。
hek-L蛋白質は、例えば種々の条件下でのhek蛋白質の在庫可能期間及び安定性をモニターする”品質管理”の研究を行う人々により使用され得る試薬としての用途が見出だされる。hekリガンドは、hek蛋白質の修飾（例えば、化学的修飾、トランケート、変異等）後に、生物学的活性が保持されているかを決定するために使用できる。hekの生物学的活性への修飾の好ましくない結果を検出する為に、修飾されたhek蛋白質のhek-Lに対する結合親和性を非修飾hek蛋白質のそれと比較される。
hekリガンドの異なる用途は、蛋白質精製工程に於ける試薬である。hek-L又はhek-L/Fc融合蛋白質は、従来の技術により固体保持物質に付着させられ、アフィニティークロマトグラフによりhekを精製するのに使用しても良い。
hek-Lポリペプチドはまた、それに結合された薬剤をhek細胞表面抗原を持つ細胞に投与する担体としての用途も見出だす。hek抗原の発現は、JM及びHSB-2と命名されたヒトT-細胞白血病細胞系及びLK63と命名されたヒトpre-B細胞白血病細胞系(Boyd等、J.Biol.Chem.267:3262,1992、及びWicks等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,89:1611,1992)を含むある種の白血病細胞系に対し報告されている。hek-L蛋白質は、このように診断用又は治療用薬剤をその様な細胞（又は細胞表面にhekを発現することが分っている他の細胞型）にin vitroなin vivoな方法によって投与するのに使用できる。
その様な用途の一例は、薬剤が白血病細胞に対して細胞毒性を示すか否かを評価するためhek+白血病細胞系を治療用薬剤/hek-L複合体に晒すことである。hek-Lに結合された多数の種々の治療用薬剤は、その薬剤の白血病細胞に対する細胞毒性効果を検出し比較するための分析に含められる。hek-L/診断用薬剤複合体は、hek+細胞の存在を検出するためin vitro又はin vivoで使用できる。
hek-Lポリペプチドに結合しうる診断用及び治療用薬剤は、それ等に限定はされないが、次のものを含む：薬品、毒素、放射性核種、クロモフォア、蛍光性化合物、発色分析又は蛍光分析反応を触媒する酵素、等、（適用の意図に従って特定の薬剤が選択される）。薬品の例は、種々の型の癌の治療に使用されるものを含む。例えば、L-フェニルアラニン ナイトロジェンマスタード(L-phenylalanine nitrogen mustard)又はシクロホスホアミド(cyclophosphamide)のようなナイトロジェンマスタード(nitrogen mustard)、cis-ジアミノジクロロプラチナ（cis-diaminodichloroplatinum）のようなインターカレート剤(intercalating agent)、5-フルオロウラシル（5-fluorouracil）のような代謝桔抗物質(antimetabolite)、ビンクリスチン（vincristine）のようなビンカアルカロイド(vinca alkaloides)、及びブレオマイシン（bleomycin）、アドレアマイシン（doxorubicin）、ダウノルビシン(daunorubicin)のような抗生物質(antibiotics)、並びにそれらの誘導体。毒素の中ではリシン（ricin）、アブリン（abrin）、ジフテリア毒素(diphtheria toxin)、Pseudomonas aeruginosaエクソトキシンA(exotoxin A)、リボソーム不活性蛋白質（ribosomal inactivating proteins）、トリコテセンス(trichothecenes)のようなマイコトキシン（mycotoxin）及びそれらの誘導体及び断片（例えば、単鎖）である。診断用に適した放射性核種は、それ等に限定はされないが、123Ｉ、131Ｉ、99mTc、111In、及び76Brを含む。治療用に適した放射性核種は、それ等に限定はされないが、131Ｉ、211At、77Br、186Re、188Re、212Pb、212Bi、109Pd、64Cu、及び67Cuを含む。
その様な薬剤は、適当な従来の方法のいずれかでhek-Lに結合できる。蛋白質であるhek-Lは、希望する薬剤の官能基を反応し、例えば共有結合を形作ることができるようなアミノ酸側鎖官能基を含む。あるいは、蛋白質又は薬剤は、希望する反応性官能基を作り出すか、又は結合させるように誘導できる。誘導は、種々の分子を蛋白質に結合させるために入手可能な二官能性結合試薬（Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois）の一つを結合させることを含む。蛋白質の放射性標識するための技術が多数知られている。放射性核種金属は、例えば適当な二官能性キレート化剤を用いてhek-Lに結合できる。
hek-Lと適切な診断用又は治療用薬剤からなる（好ましくは共有結合した）複合体は、このようにして調製される。複合体は、特定の応用に適した量だけを投与もしくは他の形で使用される。
実施例５に記述したように、本明細書で提供されるhek-L蛋白質は、またelkとして知られる受容体を結合する能力をも有する。それ故、hek-Lは、hek-結合特性から発する上述の用途と類似のelk-結合特性から発する追加の用途を持つ。hek-Lは種々の分析でelkの検出に使用できる。hekを結合する抗体は、もし適当なら、elkのhek-Lへの結合は許容するが、hekのhek-Lへの結合は阻止する分析に使用できる。hekリガンドは、elk蛋白質の生物学的活性を、elk蛋白質またはそれの変異体のhek-Lに対する結合親和性の意味での評価に使用できる。hek-L蛋白質は、またelk蛋白質のアフィニティークロマトグラフによる精製に用途を見出だす。
ｈｅｋ−Ｌオリゴマー
本発明は、二量体又は三量体のようなオリゴマーの形のhek-Lポリペプチドを包含する。オリゴマーは、異なるhek-Lポリペプチドのシステイン残基間のジスルフィド結合によって形成される。本発明の一つの態様に於いて、hek-L二量体は、hek-Lのhekリガンド結合領域への結合を妨げること無く抗体(IgG1)のFc領域へhek-Lを融合させることにより生成される。”Fcポリペプチド”と言う用語は、天然型及び変異型（mutein）、及び二量体化を促進するヒンジ領域を含むトランケートされたFcポリペプチドを含む。Fcポリペプチドは好ましくは可溶性hek-L（細胞外領域のみからなる）のC-末端に融合される。抗体由来のポリペプチドの種々の部分へ融合したヘテロなポリペプチドからなる融合蛋白質の調製は、例えば本明細書中に参考文献として取込まれているAshkenazi等（PNAS USA 88:10535,1991）及びByrn等(Nature 344:677,1990)により記載されている。
hek-LのFcまたはFc変異型ポリペプチドへの融合は、実施例１に記載したhek/Fc変異型融合体の調製と類似の方法により調製できる。hek-L/Fc融合蛋白質をコードする遺伝子融合体は、適切な発現ベクターに挿入され宿主細胞に形質転換される。発現したhek-L/Fc融合蛋白質は、抗体分子のようなものを組立てることが可能で、その際Fcポリペプチド間で鎖間ジスルフィド結合を形成し二価のhek-Lを得る。あるいは、変異型が誘導されるネイティブなFcポリペプチドが、使用できる。
融合蛋白質が抗体の重鎖と軽鎖の両方から作られた場合、最高４個のhek-L細胞外領域を持つhek-Lオリゴマーを形成することが可能である。あるいは、米国特許第5,073,627号に記述されているようなペプチドリンカーを用いて２つの可溶性hek-L領域を結合できる。
本発明の特定の態様に於いて、配列番号１のアミノ酸-19から202まで又は配列番号３のアミノ酸-22から157までをコードするhek-L DNAを、実施例１に記述されたFc変異型をコードするDNAの5'末端に融合し、発現ベクターpDC410（実施例３に記載）に挿入した。得られた組換え発現ベクターで形質転換されたCV1-EBNA-1細胞は、可溶性hek-L/Fc融合蛋白質を発現するため培養された。
本発明は、ジスルフィドの相互作用により結合した、又はスペーサ-としてのアミノ酸結合基と共に、又は無しで、融合ポリマーとして発現したhek-L細胞外領域又はその断片のオリゴマーを提供する。例えば、hek-L細胞外領域の二量体は、IgG Fc領域結合基により結合できる。
発現系
本発明は、ｈｅｋ−Ｌの発現用の組換え発現ベクター、及びその発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。あらゆる適する発現系を用いることができる。これらベクターは、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に機能できるように連結された、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子から誘導されるものの如き、ｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列を含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列に機能的に結びついている場合、機能できるように連結していることになる。かくして、プロモーターヌクレオチド配列がｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列の転写を制御するなら、そのプロモーターヌクレオチド配列はｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列に機能できるように連結している。通常、複製起点により付与される所期の宿主細胞内で複製する能力、及び形質転換体を同定する選択遺伝子を、この発現ベクター内に追加的に組み入れることができる。
加えて、このｈｅｋ−Ｌ遺伝子にとって生来のものではない適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター内に組み入れることができる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を枠内（in frame）でｈｅｋ−Ｌ配列に融合させて、そのｈｅｋ−Ｌがまずシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにしてもよい。意図する宿主細胞内で機能性であるシグナルペプチドは、ｈｅｋ−Ｌポリペプチドの細胞外分泌を促進する。このシグナルペプチドは、細胞からｈｅｋ−Ｌが分泌されるとすぐにそのｈｅｋ−Ｌポリペプチドから切り離される。
ｈｅｋ−Ｌポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で用いるのに適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、例えば、Pouwelsら，Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York,(1985)に記載されている。無細胞翻訳系も、ここに開示したＤＮＡ構築体から誘導されるＲＮＡを用いてｈｅｋ−Ｌポリペプチドを産生するのに用いられるであろう。
原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸菌又は桿菌が含まれる。形質転換に適する原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、及びシュウドモナス属、ストレプトミセス属及びスタフィロコッカス属に属する他の様々な種が含まれる。大腸菌の如き原核宿主細胞内では、ｈｅｋ−Ｌポリペプチドは、該原核宿主細胞内での該組換えポリペプチドの発現を容易にするために、Ｎ−末端メチオニン残基を含むことができる。このＮ−末端Metは、発現された組換えｈｅｋ−Ｌポリペプチドから切り離され得る。
原核宿主細胞で用いる発現ベクターは、一般に、１又は２以上の表現型選択可能なマーカー遺伝子を含む。表現型選択可能なマーカー遺伝子というのは、例えば、抗生物質耐性を付与するタンパク質又は独立栄養要求量を供給するタンパク質をコードする遺伝子のことである。原核宿主細胞にとって有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の如き市販のプラスミドから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定する簡単な手段を提供する。適切なプロモーター及びｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列をこのｐＢＲ３２２ベクター内に挿入する。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden）及びｐＧＥＭ１（Promega Biotec,Madison,WI,USA）が含まれる。
組換え原核宿主細胞発現ベクターに広く用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Changら，Nature 275:615,1978；及びGoeddelら，Nature 281:544,1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddelら，Nucl.Acids Res.8:4057,1980；及びＥＰ−Ａ−３６７７６）及びｔａｃプロモーター（Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,p.412,1982）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰLプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λＰLプロモーターの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）内に存する）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存する）が含まれる。
また、ｈｅｋ−Ｌを酵母宿主細胞内で、好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ.セレビシエ）から発現させてもよい。ピキア（Pichia）又はクルイベロミセス（Kluyveromyces）の如き酵母の他の属も用いることができる。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多いであろう。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら，J.Biol.Chem.255:2073,1980）又は他の解糖酵素（Hessら，J.Adv.Enzyme Reg.7:149,1968；及びHollandら，Biochem.17:4900,1978）、例えば、エラノーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのためのプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他のベクター及びプロモーターは、Hitzeman,ＥＰＡ−７３,６５７に更に記載されている。他の代用物は、Russellら（J.Biol.Chem.258:2674,1982）及びBeierら（Nature 300:724,1982）により記載されたグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。大腸菌内での選択及び複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子及び複製起点）を上記の酵母ベクター内に挿入することにより、酵母及び大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターを構築することができる。
酵母α因子リーダー配列を用いて、ｈｅｋ−Ｌポリペプチドの分泌を行わせることができる。このα因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多い。例えば、Kurjanら，Cell 30:933,1982；Bitterら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330,1984；米国特許第４,５４６,０８２号；及びＥＰ３２４,２７４を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列は、当業者にとって公知である。リーダー配列は、１又は２以上の制限部位を含有するようにその３'末端の近くで修飾されていてもよい。これは、そのリーダー配列の構造遺伝子への融合を促進するであろう。
酵母形質転換手順は、当業者にとって公知である。かかる手順の１つは、Hinnenら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929,1978に記載されている。このHinnenらの手順は、選択培地中でＴｒｐ+形質転換体を選択するものであって、その選択培地は、０.６７％酵母窒素原基、０.５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
発現を誘発するために、ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を“富”培地中で生育させてもよい。富培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなる培地である。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から消費され尽くした時に起こる。
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えｈｅｋ−Ｌポリペプチドを発現することもできるであろう。昆虫細胞内での異種起源タンパク質の産生のためのバキュロウィルス系の委細が、LuckowとSummers,Bio/Technology 6:47(1988)により示されている。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。適する哺乳動物宿主細胞系の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）(Gluzmanら，Cell 23:175,1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、及びＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞系、及びアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）からMcMahanら（EMBO J.10:2821,1991）により記載された通りに誘導されたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系が含まれる。
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから切り出すことができる。広く用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウィルスから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を提供してもよい。ウィルスの初期及び後期プロモーターが特に有用である。というのは、いずれもウィルスの複製起点を含有することもできる断片としてウィルスゲノムから容易に得られるからである（Fiersら，Nature 273:113,1978）。ＳＶ４０ウィルスの複製起点部位内に位置するＨｉｎｄIII部位からＢｇｌII部位に及び約２５０ｂｐ配列が含まれることを条件として、より小さな又はより大きなＳＶ４０断片も用いることができる。
哺乳動物宿主細胞内で用いる適例となる発現ベクターは、Okayama及びBerg（Mol.Cell.Biol.3:280,1983）により開示された通りに構築することができる。Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞内の哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系は、実質的にCosmanら（Mol.Immunol.23:935,1986）により記載された通りに構築することができる。有用な高発現ベクター、つまりCosmanら，Nature 312:768,1984に記載されたＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。追加の有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、及び１９９１年５月１６日に出願された米国特許出願第０７／７０１,４１５号に記載されている。なお、これらは参照によってここに組み入れられるものとする。これらベクターをレトロウィルスから誘導することができる。
天然シグナル配列をコードするＤＮＡの代わりに、このベクターは異種起源のシグナル配列をコードするＤＮＡを含有することができる。例には、米国特許第４,９６５,１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）についてのシグナル配列；Cosmanら，Nature 312:768(1984)に記載されたインターロイキン−２レセプターについてのシグナル配列；ＥＰ３６７,５６６に記載されたインターロイキン−４シグナルペプチド；米国特許第４,９６８,６０７号に記載されたＩ型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチド；及びＥＰ４６０,８４６に記載されたII型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチドが含まれる。
タンパク質精製
本発明は、実質的に均質なｈｅｋ−Ｌタンパク質であって、上記の組換え発現系により産生させることも天然に存在する細胞から精製することもできるタンパク質を提供する。このｈｅｋ−Ｌは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析で１本のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均質なまでに精製される。
このｈｅｋ−Ｌタンパク質を産生させる１つの方法は、ｈｅｋ−ＬをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞をｈｅｋ−Ｌが発現されるような条件下で培養することを含む。次いで、ｈｅｋ−Ｌタンパク質を、用いた発現系に依存して培養基又は細胞抽出液から回収する。熟練した技術者は分かるであろうが、組換えｈｅｋ−Ｌを精製する操作は、用いた宿主細胞の型及びｈｅｋ−Ｌが培養基中に分泌されるかどうかといった要因に従って変動するであろう。
例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系を用いたときは、培養基をまず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon超濾過装置を用いて濃縮することができる。濃縮工程後は、濃縮液をゲル濾過媒体の如き精製基材に適用することができる。また、アニオン交換樹脂、例えば、基材又は支持体がペンダントのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するアニオン交換樹脂を用いてもよい。基材は、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に広く用いられる他の型であってもよい。また、カチオン交換工程を用いてもよい。適するカチオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性基材が含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントのメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる１又は２以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて、ｈｅｋ−Ｌを更に精製することができる。上述の幾つか又は全ての精製工程をいろいろに組み合わせて用いて、実質的に均質な組換えタンパク質を得ることができる。
ｈｅｋのリガンド結合ドメインを含むアフィニティカラムを用いて、発現されたｈｅｋ−Ｌポリペプチドを親和精製することも可能である。ｈｅｋ−Ｌポリペプチドを高塩類溶離緩衝液でアフィニティカラムから溶出させてから使用のために低塩類緩衝液中に透析してもよい。また、このアフィニティカラムはｈｅｋ−Ｌに結合する抗体を含むこともできる。更に別法では、アフィニティカラムは、プロテインＡカラムに結合したｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質を含む。
細菌培養で産生した組換えタンパク質は、通常、宿主細胞をまず崩壊させ、遠心分離し、不溶性ポリペプチドなら細胞沈殿物から、可溶性ポリペプチドなら上澄み液から抽出した後、１又は２以上の濃縮、塩析、イオン交換、親和精製又はサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ−ＨＰＬＣを用いてもよい。微生物細胞は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的崩壊、又は細胞溶解剤の使用を含むあらゆる簡便な方法により崩壊させることができる。
形質転換酵母宿主細胞を用いてｈｅｋ−Ｌを分泌ポリペプチドとして発現させることができる。酵母宿主細胞発酵から分泌された組換えポリペプチドは、Urdalら（J.Chromatog.296:171,1984）により開示された方法と類似の方法により精製することができる。Urdalらは、組換えヒトＩＬ−２の精製のための分取ＨＰＬＣカラムでの２連続逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。
本発明は、ｈｅｋ−Ｌポリペプチド及び薬学的に許容できるキャリヤー、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。かかる組成物は、緩衝液；アスコルビン酸の如き酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質；アミノ酸；グルコース、スクロース、又はデキストリンを含む炭水化物；ＥＤＴＡの如きキレート剤；グルタチオン；及び他の安定剤及び賦形剤を含むことができる。中性緩衝生理食塩水又は同種血清アルブミンと混合した生理食塩水が、適例となる適切は希釈剤である。
核酸断片
本発明は、更に、ここに示したｈｅｋ−Ｌヌクレオチド配列の断片を提供する。かかる断片は、望ましくは、配列番号：１又は３に示した配列の少なくとも約１４のヌクレオチドを含む。前記断片のＤＮＡ及びＲＮＡ相補体が、ｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡの一本鎖型及び二本鎖型の両方と一緒にここに提供される。
かかるｈｅｋ−Ｌ核酸断片の用途のうちの１つは、プローブとしての用途である。かかるプローブを種間（cross-species）ハイブリダイゼーション操作に用いて更なる哺乳動物種からｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡを単離することができる。一例として、ｈｅｋ−Ｌの細胞外ドメインに対応するプローブを用いることができる。これらプローブにもin vitroアッセイで及びノーザン及びサザーンブロットの如き操作でｈｅｋ−Ｌ核酸の存在を検出する用途がある。ｈｅｋ−Ｌを発現する細胞型を同定することができる。かかる操作は周知であるので、熟練した技術者は、特定の意図した用途に依存して、適する長さのプローブを選ぶことができる。
ｈｅｋ−Ｌ核酸の他の有用な断片は、一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドであって、標的ｈｅｋ−Ｌ ｍＲＮＡ（センス）又はｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できるオリゴヌクレオチドである。本発明によれば、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１又は配列番号：３に示したｈｅｋ−Ｌ ｃＤＮＡのコーディング領域の断片、又はそのＤＮＡ若しくはＲＮＡ相補体を含むことができる。そのような断片は、一般に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは約１４〜約３０のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質についてのｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを作る能力は、例えば、SteinとCohen,Cancer Res.48:2659,1988及びvan der Krolら，BioTechniques 6:958,1988に記載されている。
標的核酸配列へのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二重鎖の形成をもたらし、それは、それら二重鎖の分解の増進、転写又は翻訳の早期終結を含む幾つかの手段の１つにより又は他の手段により、翻訳（ＲＮＡ）又は転写（ＤＮＡ）を遮断する。かくして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ｈｅｋ−Ｌタンパク質の発現を遮断することができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修復された糖リン酸ジエステル主鎖（又はＷＯ９１／００６２９に記載された如き他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含む。そして、かかる糖結合は内因性ヌクレアーゼに抵抗性である。抵抗性糖結合を有するかかるオリゴヌクレオチドは、in vivoで安定である（即ち、酵素分解に抵抗できる）が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたものの如き有機部分に共有結合しているオリゴヌクレオチド、及び標的核酸配列に対するそのオリゴヌクレオチドの親和性を高めるポリ（Ｌ−リシン）の如き他の部分に共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。更になお、エリプチシン（ellipticine）の如き介在物質及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに付けて、そのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を修飾することができる。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、ＣａＰＯ4媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む何らかの遺伝子移送方法により又はエプスタイン−バーウィルスの如き遺伝子移送ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含有する細胞内に導入することができる。好ましくは、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを適するレトロウィルスベクター中に挿入してから、細胞とその挿入された配列を含有するレトロウィルスベクターとをin vivo又はex vivoのいずれかで接触させることにより、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを標的核酸配列を含有する細胞内に導入する。適するレトロウィルスベクターには、マウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ,Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから誘導されるレトロウィルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと呼ばれる二重コピーベクター（ＰＣＴ出願ＵＳ９０／０２６５６を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合性分子を有する複合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞内に導入することもできる。適するリガンド結合性分子には、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合性分子の複合化は、リガンド結合性分子のその対応する分子又はレセプターに結合する能力を実質的に妨げることがないか、又はセンス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合型が細胞内に入るのを実質的に遮断することがないものである。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ９０／１０４４８に記載されているようにオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスの形成により、標的核酸配列を含有する細胞内に導入することができる。このセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスは、好ましくは、内因性リパーゼにより細胞内で解離される。
以下の実施例は、特定の態様を説明するために示したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：可溶性ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質の調製
この実施例は、ｈｅｋリガンド（ｈｅｋ−Ｌ）をコードするｃＤＮＡクローンを単離するのに用いる可溶性ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターの構築を説明するものである。ヒトｈｅｋ ｃＤＮＡについてのＤＮＡ配列及びコードされるアミノ酸配列は、Wicksら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:1611,1992）に示されており、これは参照によりここに組み入れられるものとする。このｈｅｋタンパク質は、（Ｎ−末端からＣ−末端までに）細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む。
一方はｈｅｋの細胞外ドメインのＮ−末端断片をコードし、他方はそのｈｅｋ細胞外ドメインのＣ−末端断片をコードする２つのＤＮＡ断片を、Wicksらの前記文献により公表されたｈｅｋヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いて標準的な条件下で行った複製連鎖反応（ＰＣＲ）により単離した。このＰＣＲ用の鋳型は、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２０.１）と名付けられたヒトＴ細胞白血病細胞系から単離されたｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡであった。ｈｅｋ ＤＮＡの５'末端を含有するＰＣＲ産物をＳｐｅＩとＨｉｎｄIIIで消化して、成熟ヒトｈｅｋ配列（即ち、シグナル配列をコードするＤＮＡを欠いている配列）の５'末端からこのｈｅｋ遺伝子中に見出されるＨｉｎｄIII部位までに及ぶＤＮＡ断片を単離した。ｈｅｋ細胞外ドメインＤＮＡの３'末端を含有するＰＣＲ産物はＨｉｎｄIIIとＣｌａＩで消化して、ｈｅｋ細胞外ドメインをコードする配列の内側にあるＨｉｎｄIII部位から３'末端のすぐ下流のＣｌａＩ部位までに及ぶ断片を単離した。このＣｌａＩ部位は、この細胞外ドメインのすぐ下流に導入された多クローニング部位（ＭＣＳ）内にある。
ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分の突然変異タンパク質をコードするＤＮＡを単離した。このＦｃ突然変異タンパク質ＤＮＡ及びそれによりコードされるポリペプチドは、１９９３年７月２３日出願の“Novel Cytokine Which is a Ligand for OX40”と題された米国特許出願第０８／０９７,８２７号に記載れている。なお、この出願は参照によりここに組み入れられるものとする。この突然変異タンパク質ＤＮＡを、本質的にDengとNickoloff,Anal.Biochem.200:81(1992)に記載された通りに行った部位特異的突然変異誘発法により、天然ＦｃポリペプチドコーディングＤＮＡから誘導した。このＦｃ突然変異ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変換され、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変換され、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変換されている以外は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１１５に記載された天然Ｆｃポリペプチドの配列と同一である。この突然変異タンパク質Ｆｃは、イムノグロブリンレセプターに対して低い親和性しか示さない。
Ｆｃ突然変異タンパク質ＤＮＡを含有する組換えベクターをＣｌａＩ及びＮｏｔＩで開裂した。これらは、それぞれ該Ｆｃ突然変異タンパク質ＤＮＡ挿入物のすぐ上流と下流のポリリンカー領域内でこのベクターを開裂する。所期のＦｃ突然変異タンパク質コーディング断片を単離した。
この突然変異タンパク質Ｆｃポリペプチドは、Ｎ−末端ヒンジ部から天然Ｃ−末端に及ぶ、即ち、本質的に完全長の抗体Ｆｃ領域である。Ｆｃ領域の断片、例えば、Ｃ−末端の先端を切り取られた断片を用いることもできる。これら断片は、好ましくは、２の別々のｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃポリペプチド部分の間に鎖間ジスルフィド結合を形成してダイマーを生成できる多数のシステイン残基（少なくともヒンジ部内におけるシステイン残基）を含有する。
ＳＭＡＧ４と名付けられた哺乳動物発現ベクターをＳｐｅＩとＮｏｔＩで開裂した。このＳＭＡＧ４ベクターは、大腸菌内でも複製できる哺乳動物高発現ベクターｐＤＣ２０１（Simsら，Science 241:858,1988及びＰＣＴ出願ＷＯ８９／０３８８４に記載されている）内に挿入されたマウスインターロイキン−７シグナルペプチドコーディング配列（米国特許第４,９６５,１９５号に記載されている）を含む。ＳｐｅＩは、ＩＬ−７シグナルペプチドコーディング配列のすぐ下流で開裂する。ＮｏｔＩは、このベクターの多クローニング部位内のＳｐｅＩ部位の約１５５ｂｐ下流でこのベクターを開裂する。このベクター配列を含有する大きなＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ断片及びＩＬ−７シグナルペプチドコーディングＤＮＡを単離した。
４元連結を行って２つのｈｅｋコーディングＤＮＡ断片及び上記のＦｃ突然変異タンパク質コーディングＤＮＡ断片をこのＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ開裂ＳＭＡＧ４発現ベクター内に挿入した。大腸菌細胞をこの連結混合液で形質転換して、所期の組換えベクターをそれから単離した。この単離ベクターは、（Ｎ−末端からＣ−末端までに）マウスＩＬ−７シグナルペプチド、ｈｅｋ細胞該ドメイン、導入したｍｃｓによりコードされる４アミノ酸、及びＦｃ突然変異タンパク質を含む融合タンパク質をコードする。
次いで、この発現ベクターをプラスミドｐＳＶ３.ＮＥＯと共にＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞内に同時形質移入した。このＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４７８）は、McMahanら（EMBO J.10:2821,1991）に記載された通りにサル腎臓細胞系から誘導されたものである。ベクターｐＳＶ３.ＮＥＯは、この宿主細胞によっては産生されないＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する。このｐＳＶ３.ＮＥＯベクターは、ｐＳＶ３（MulliganとBerg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072,1981）に類似しているが、更にネオマイシン耐性遺伝子を含有する。これら形質転換細胞を培養してその融合タンパク質を一過性発現させたところ、ＩＬ−７シグナルペプチドにより培養基中に分泌された。この融合タンパク質をプロテインＡセファロースカラムで精製し、溶出させ、そして実施例２及び３に記載する通り、ｈｅｋ／Ｆｃタンパク質に結合する能力について細胞をスクリーニングするのに用いた。
実施例２：ｈｅｋ／Ｆｃ結合についての細胞のスクリーニング
ｈｅｋリガンドをクローン化しようと、種々の細胞型をｈｅｋ／Ｆｃに結合する能力についてスクリーニングして、核酸源として有用な候補となる細胞型を同定した。細胞を実施例１で調製したｈｅｋ／Ｆｃタンパク質とインキュベートしてから、ビオチニル化マウス抗ヒトＦｃ抗体に続いて、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（Becton Dickinson）とインキュベートした。細胞を各工程間で洗浄して未結合試薬を除いた。このビオチニル化抗体は、Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PAから購入したものである。この抗体は、Ｆｃγレセプターに結合したＦｃタンパク質に僅かな結合性しか示さなかった。ストレプトアビジンは、ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分に結合している抗ヒトＦｃ抗体に結合したビオチン分子に結合する。フィコエリトリンは、検出可能標識として役立つ蛍光性フィコビリタンパク質である。この標識の蛍光信号を各細胞型についてＦＡＣＳcan▲R▼フローサイトメーターを用いて測定した。
ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２０.１）と名付けられたヒトＴ細胞白血病細胞系がｈｅｋ／Ｆｃ結合について陽性であった。ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）により４回選別して、より高いレベルのｈｅｋ／Ｆｃ結合性タンパク質を発現する細胞を引き出した。
実施例３：ｈｅｋリガンドｃＤＮＡの単離
４回選別ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２細胞からｍＲＮＡを単離し、二本鎖ｃＤＮＡをこのｍＲＮＡ鋳型上で標準的方法により合成した。このｃＤＮＡをHaymerleら（Nucleic Acids Res.14:8615,1986）に記載された方法と類似のアダプター法によりｐＤＣ４１０のＢｇｌ II部位内に連結することにより、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ｐＤＣ４１０は、ｐＤＣ４０６（McMahanら，EMBO J.10:2821,1991）に類似する発現ベクターである。ｐＤＣ４１０では、ｐＤＣ４０６のＥＢＶ複製起点がＳＶ４０大型Ｔ抗原（ＳＶ４０プロモーターから誘導される）をコードするＤＮＡにより置換されている。ｐＤＣ４１０多クローニング部位（ｍｃｓ）は、ｐＤＣ４０６のものとは、それが追加の制限部位及び３つの停止コドン（各リーディングフレーム内に１ずつ）を含有する点で相違している。ｍｃｓの下流のＴ７ポリメラーゼプロモーターは、ｍｃｓ内に挿入されたＤＮＡの配列決定を容易にする。
ｐＤＣ４１０内のｃＤＮＡライブラリーで形質移入した大腸菌株ＤＨ５α細胞をプレートして、プレート当たり約２０００のコロニーとした。コロニーを各プレートから掻き取って、プールし、そして各プールからプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、約２０００コロニーに相当するプールＤＮＡを用いて、不完全集密層のＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（実施例１に記載）を形質移入した。形質移入の前に、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞は、完全培地（１０％(v/v)ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ））内に維持しておき、そして複数の単一ウェル有孔スライド（single-well chambered slide）（Lab-Tek)上に２×５０5細胞／ウェルの密度でプレートしておいた。形質移入には、ＤＥＡＥ−デキストラン処理をしてから、Luthmanら（Nucleic Acids Res.11:1295,1983）及びMcCutchanら（J.Natl.Cancer Inst.41:351,1986）に記載された操作と類似のクロロキン処理をすることを含めた。簡単に説明すると、スライドを１ｍｌヒトフィブロネクチン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）で３０分間前処理した後にＰＢＳで１回洗浄した。粘着細胞層から培地を除去して、６６.６μＭ硫酸クロロキンを含有する１.５ｍｌ完全培地と置き換えた。次いで、０.２ｍｌのＤＮＡ溶液（クロロキンを含有する完全培地中２μｇＤＮＡ,０.５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−デキストラン）をそれら細胞に加えて５時間インキュベートした。インキュベーション後、この培地を除去して、１０％ＤＭＳＯを含有する完全培地の添加によって細胞に２.５〜２０分間衝撃を与えた後、その溶液を新しい完全培地と置き換えた。これら細胞を２〜３日間培養して挿入した配列を一過性発現させた。
ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞の形質移入単層をｈｅｋ−Ｌの発現についてGaeringら（EMBO J.8:3667,1989）のスライドオートラジオグラフィー操作により下記の通りアッセイした。このアッセイに用いるために、マウス抗ヒトＦｃ抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA）をクロラミン−Ｔ法により放射性ヨウ素化した。簡単に説明すると、Ｐ６カラムをメーカーの使用説明書に従って調製した。微小分離管内で、１０μｇの抗体を１０μｌのＰＢＳ中に溶解させた。２０００μＣｉの無担体Ｎａ125Ｉを添加してその溶液をよく混合した。次いで、１５μｌの調製したばかりのクロラミン−Ｔの溶液（０.０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）中３２μｇ／ｍｌ）を添加してその混合液を室温で３０分間インキュベートした。この混合液をすぐにＰ６カラムに適用した。次いで、１００〜１５０μｌ画分の溶出液を採集することによってこのカラムから放射標識抗体を溶出させた。結合培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.２）を含有するＲＰＭＩ１６４０）をピーク画分に添加して各画分の全容量を２ｍｌにした。放射性ヨウ素化により、５〜１０×１０15ｃｐｍ／mmolタンパク質の範囲の比活性が得られた。
スライドオートラジオグラフィーは、次の通りに行った。形質移入ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（有孔スライドに粘着している）を脱脂粉乳を含む結合培地（ＢＭ−ＮＦＤＭ）（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.２）及び５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳を含有するＲＰＭＩ１６４０）で１回洗浄した。次いで、細胞をＢＭ−ＮＦＤＭ（１μｇ／ｍｌ）中でｈｅｋ／Ｆｃ（実施例１で調製したもの）と室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、これら有孔スライド内の細胞単層をＢＭ／ＮＦＤＭで３回洗浄して未結合ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質を除去してから、４０ｎｇ／ｍｌ125Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体（１：５０希釈液）と室温で１時間インキュベートした。これら細胞をＢＭ−ＮＦＤＭで３回洗浄した後、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄して未結合125Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体を除去した。細胞をＰＢＳ（ｐＨ７.３）中の２.５％グルタルアルデヒド中で室温で３０分間インキュベートすることにより固定し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして風乾した。これら細胞を含有する有孔スライドをPhosphorimager（Molecular Dynamics）上で一晩露光してから、コダックＧＴＮＢ−２写真乳剤（６倍水希釈液）に浸して暗室内で３〜５日間４℃で遮光ボックス内で露光した。次いで、これらスライドをコダックＤ１９現像剤（４０ｇ／５００ｍｌ水）中で約４分間現像し、水中で濯ぎ、そしてAgfaＧ４３３Ｃ定着液中で定着させた。これらスライドを２５〜４０の倍率の顕微鏡で個別に検査して、明るい背景と対照的なオートラジオグラフィーの銀粒子の存在により、ｈｅｋ−Ｌを発現する陽性細胞を同定した。
約２,０００ｃＤＮＡの複数プール中の約３００,０００ｃＤＮＡをスクリーニングして、ｈｅｋ／Ｆｃ結合について陽性の多数の細胞を示す形質移入体プールを同定した。次いで、陽性プールを５００のプールに分配し、そしてスライドオートラジオグラフィーにより再度スクリーニングした。陽性プールを同定し、１００のプールに分配し、そして同じ操作によりスクリーニングした。陽性プールからの個々のコロニーを、検出可能なｈｅｋ／Ｆｃ結合活性を有する表面タンパク質の合成を行う単一クローン（クローン＃Ａ２）が同定されるまでスクリーニングした。Ｃ６と名付けた第２クローンを異なる陽性プールから単離した。両方のクローンのｃＤＮＡ挿入物を配列決定した。
クローンＡ２のヒトｈｅｋリガンドｃＤＮＡのコーディング領域のヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号：１及び配列番号：２に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端シグナルペプチド（アミノ酸−１９〜−１）、細胞外ドメイン（アミノ酸１〜２０２）、及び疎水性領域を含有するＣ−末端ドメイン（アミノ酸２０３〜２１９）を含む。
ヒトｈｅｋ−Ｌ ｃＤＮＡをＢｇｌ IIでの消化によってクローンＡ２から切り出した。この切り出したｃＤＮＡをpBLUESCRIPT▲R▼SK(-)（Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA）の（多クローニング部位内の）ＢａｍＨＩ部位内にクローン化した。大腸菌ＤＨ５α細胞内のこの得られたベクター（Ａ２／ｐＢＳと名付けた）を、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９３年８月１１日に寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６９３８４が付与された。この寄託はブダペスト条約の規定の下に行った。
クローンＣ６のヒトｈｅｋリガンドｃＤＮＡのコーディング領域のヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号：３及び配列番号：４に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端シグナルペプチド（アミノ酸−２２〜−１）、細胞外ドメイン（アミノ酸１〜１６０）、及び疎水性領域を含有するＣ−末端ドメイン（アミノ酸１６１〜１７９）を含む。
ヒトｈｅｋ−Ｌ ｃＤＮＡをＢｇｌ IIでの消化によってクローンＣ６から切り出して、pBLUESCRIPT▲R▼SK(-)のＢａｍＨＩ部位内に挿入した。大腸菌ＤＨ５α細胞内のこの得られたベクター（Ｃ６／ｐＢＳと名付けた）を、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９３年８月２５日に寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６９３９５が付与された。この寄託はブダペスト条約の規定の下に行った。
熟練した技術者には分かるであろうが、ｈｅｋ−Ｌタンパク質のドメインの上記の境界は凡そのものである。例えば、クローンＡ２によりコードされるｈｅｋ−Ｌに関して、そのシグナルペプチドはアミノ酸−１９〜−１を殆ど間違いなく含んでいるだろうが、アミノ酸−１９から３までがそのシグナルペプチドを構成していることもあり得る。かくして、シグナルペプチドの開裂は、アミノ酸−１と１の間か又はアミノ酸３と４の間か又は両方の位置で起こり得る。クローンＡ２がコードするｈｅｋ−Ｌに関連してここで用いた“シグナルペプチド”及び“成熟タンパク質”という用語は、クローンＡ２又はＣ６によりコードされるｈｅｋ−Ｌポリペプチドについてここに記載した両方のいずれかのものを包含するだけでなく他のいずれかのものも包含することが了解される。
クローンＡ２及びＣ６によりコードされるｈｅｋ−Ｌタンパク質は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）基を介して細胞膜に結合していることが分かった。かくして、その疎水性ドメインは、ＧＰＩ係留のためのシグナルを含有すると考えられる。Ｃ−末端配列の開裂を含む、ＧＰＩ係留をもたらすためのタンパク質のプロセシングは上で説明されている。
実施例４：ｈｅｋ−Ｌに対するモノクローナル抗体
この実施例は、ｈｅｋ−Ｌに対するモノクローナル抗体の調製を説明するものである。ｈｅｋ−ＬをＣＯＳ−７又はＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞の如き哺乳動物宿主細胞内で発現させ、そしてｈｅｋ／Ｆｃアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製する。精製したｈｅｋ−Ｌ（又は細胞外ドメインの如きその断片又はその免疫原性ペプチド断片）を、慣用的技術、例えば、米国特許第４,４１１,９９３号に記載された技術を用いてｈｅｋ−Ｌに対するモノクローナル抗体を生成させるのに用いることができる。簡単に説明すると、完全フロイントアジュバント中に乳化させた免疫原としてのｈｅｋ−Ｌでマウスを免疫感作し、そして１０〜１００μｇの範囲の量で皮下又は腹腔内注射する。１０〜１２日後、これら免疫感作動物を完全フロイントアジュバント中に乳化させた追加のｈｅｋ−Ｌでブースター投与する。その後、１〜２週間毎の免疫感作スケジュールで、マウスに周期的にブースター投与する。ドットブロットアッセイ又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によってｈｅｋ−Ｌ抗体について試験するために、眼窩後方放血又は尾先端切除により血清サンプルを周期的に採取する。
適切な抗体力価の検出後、生理食塩水中のｈｅｋ−Ｌの静脈内注射を陽性動物に最後に１回行う。３〜４日してから、それら動物を殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をマウスメラノーマ細胞系、例えば、ＮＳ１又は好ましくはＰ３×６３Ａｇ８.６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）と融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成し、それらをＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地中で多数のマイクロタイタープレートにプレートして、未融合細胞、メラノーマハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
これらハイブリドーマ細胞を精製ｈｅｋ−Ｌに対する反応性についてＥＬＩＳＡにより、Engvallら，Immunochem.8:871,1971及び米国特許第４,７０３,００４号に開示された技術を適合させることによってスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Beckmannら（J.Immunol.144:4212,1990）に記載された抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ｈｅｋ−Ｌモノクローナル抗体を含有する腹水を生成させることができる。また、ハイブリドーマ細胞をin vitroでフラスコ又は回転ビン中で種々の技術によって増殖させることができる。マウス腹水中に産生したモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈殿させた後、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。また、プロテインＡ又はプロテインＧへの抗体の結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーも用いることができ、ｈｅｋ−Ｌへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーも同じく用いることができる。
実施例５：結合性検討
ｈｅｋに対する本発明のｈｅｋリガンドの親和性を測定した。ｈｅｋリガンドは、ｅｌｋとして知られるｈｅｋとは明確に異なるレセプターチロシンキナーゼにも結合することが分かった。ｈｅｋ又はｅｌｋに結合する他の一定のタンパク質の能力も調べた。これら検討は次の通りに行った。
ａ）ｈｅｋ結合
１２ウェルプレート中のＣＶ−１−ＥＢＮＡ−１細胞（実施例１に記載したもの）（２.５×１０5細胞／ウェル）をクローンＡ２又はＣ６（実施例３に記載した発現ベクターｐＤＣ４１０内のクローンＡ２ｃＤＮＡ又はクローンＣ６ｃＤＮＡ）で形質移入した。これら形質移入細胞を２日間培養して細胞膜上に保持されたｈｅｋ−Ｌタンパク質を発現させた。次いで、これら細胞をＢＭ−ＮＦＤＭ（実施例３を参照のこと）で洗浄し、実施例１で調製した種々の濃度のヒトｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質と室温で１時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄し、実施例３で調製した125Ｉ−標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体（４０ｎｇ／ｍｌ）と結合培地中で穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をトリプシン処理によって採取した。全てのアッセイにおいて、125Ｉ抗体の非特異的結合をｈｅｋ／Ｆｃの不存在下で並びにｈｅｋ／Ｆｃ及び２００倍モル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でアッセイした。フリーの及び細胞結合125Ｉ抗体をPackard Autogammaカウンターで定量した。親和性計算値（Scatchard,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949）をMicrovaxコンピューターでＲＳ／１（BBN Software,Boston,MA）を作動させて出した。“空”のｐＤＣ４１０ベクターで形質移入したＣＶ−１−ＥＢＮＡ−１細胞をコントロールとして同結合性検討に含めた。
２種の異なる組換えタンパク質、つまりヒトｅｌｋ−Ｌ及びヒトＢ６１を発現するＣＶ−１ ＥＢＮＡ−１細胞へのｈｅｋ／Ｆｃ結合性も、上記の実験で分析した。これら細胞をｐＤＣ４１０ベクター内のｅｌｋリガンド（ｅｌｋ−Ｌ）ｃＤＮＡ又はＢ６１ｃＤＮＡで形質移入した。発現されたタンパク質は細胞膜に結合していた。
ｅｌｋ−Ｌは、ｈｅｋのようにレセプターチロシンキナーゼのｅｐｈ／ｅｌｋファミリーのメンバーであるｅｌｋとして知られるレセプターに結合する（上の“発明の背景”の節を参照のこと）。ｅｌｋ−Ｌは、それが同じファミリーの異なるレセプター（即ち、ｈｅｋ）に結合するか否かを調べるためにこの検討に含めた。Ｂ６１として知られるタンパク質は、ＴＮＦにより誘発される新規な即時応答遺伝子（immediate-early response gene）の産物としてヒト臍静脈内皮細胞内で同定されている（Holtzmanら，Mol.Cell.Biol.10:5830,1990）。Ｂ６１は、ｅｌｋ−Ｌに対するその相同性の度合い（アミノ酸レベルで３３％同一）の故にこの検討に含めた。
単離したＢ６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列は、参照によりそっくりそのままここに組み入れられるHoltzmanらの前記文献に示されている。Ｂ６１を産生及び回収する方法も、該タンパク質の一定の構造的特徴及び特性と一緒に記載されている。ｅｌｋ−Ｌ ｃＤＮＡについてのヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列は、１９９２年１１月１３日に出願された係属中の米国特許出願第０７／９７７,６９３号に記載されている。なお、この出願は参照によりそっくりそのままここに組み入れられるものとする。ｅｌｋ−Ｌの産生及び精製も記載されており、該タンパク質の一定の機能性ドメインが同定されている。クローニングベクターpBLUESCRIPT▲R▼SK(-)（Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA）のＳｍａＩ部位（ｍｃｓ内）に挿入したヒトｅｌｋ−Ｌ ｃＤＮＡで形質転換した大腸菌ＤＨ５α細胞を１９９２年１０月９日にＡＴＣＣ６９０８５として寄託した。
この検討の結果は次の通りであった。
空のベクターは検出可能なｈｅｋ／Ｆｃ結合を示さなかった。Ｂ６１は、比較的温和な親和性で単一親和性の部類の結合性を示しつつｈｅｋ／Ｆｃに結合した。ｅｌｋ−Ｌへのｈｅｋ／Ｆｃの結合は、２種の低親和性結合成分（親和定数２.３×１０7Ｍ-1及び２.９×１０6Ｍ-1）を示す二相性パターンをもらした。ｈｅｋ／Ｆｃに対するこれら２種のｈｅｋ−Ｌタンパク質の親和性は、同等であり比較的高い。
ｂ）ｅｌｋ結合
ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質を可溶性ラットｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質に換えて上記の結合性アッセイを繰り返した。ラットｅｌｋについてのヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列は、Lhotakら（Mol.Cell.Biol.11:2496,1991）に示されている。このｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１抗体から誘導される天然Ｆｃ領域ポリペプチドに融合したｅｌｋの細胞外ドメインを含んだ。この（未標識ｅｌｋ／Ｆｃと放射標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる）間接アッセイを用いたのは、ｅｌｋ／Ｆｃの直接放射標識がその結合特異性を不活性化するからであった。
この検討の結果は次の通りであった。
ｅｌｋ／Ｆｃ結合の二相性パターンがＢ６１について２.３×１０8Ｍ-1及び７.０×１０7Ｍ-1のＫａで認められた。ｅｌｋ−Ｌを発現する形質移入細胞へのｅｌｋ／Ｆｃ結合について示された親和定数（Ｋａ）は、種々のラット神経細胞系上で発現される天然リガンドへのｅｌｋ−Ｆｃの結合について認められるものとよく整合している。ｅｌｋ／Ｆｃ結合の二相性パターンが、両方のｈｅｋリガンドについて見られる。
実施例６：相同性
完全長ヒトｅｌｋ−Ｌ、Ｂ６１、ｈｅｋリガンドＡ２、及びｈｅｋリガンドＣ６タンパク質（実施例５で記載したもの）のアミノ酸レベルでの相互の相同性を表IIIに示す。
配列表
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：1037塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル：No
（iv）アンチセンス：No
（vii)直接の起源
（Ｂ)クローン名：hek-L A2
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：83..799
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：sig peptide
（Ｂ）存在位置：83..139
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：mat peptide
（Ｂ）存在位置：140.796
（xi）配列；配列番号：１：
（2）配列番号：２の情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：238アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列；配列番号：２：
（2）配列番号：３の情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：636塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル：No
（iv）アンチセンス：No
（vii)直接の起源
（Ｂ)クローン名：hek-L C6
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：mat peptide
（Ｂ）存在位置：94..630
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：28..633
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：sig peptide
（Ｂ）存在位置：28..93
（xi）配列；配列番号：３：
（2）配列番号：４の情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：201アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列；配列番号：４：
受容体チロシンキナーゼとして知られる蛋白質は、リガンドとの結合によって活性化される固有のキナーゼ活性を有している。このクラスの蛋白質は、触媒領域内の保存された構造上のモチーフにより特徴付けられ（Hanks等、Science,242:42,1988）、触媒領域から5'側の領域の構造上の特徴に基づき、様々なファミリーに分類することが可能である。
Boyd等（J.Biol.Chem.,267:3262,1992）は、チロシンキナーゼ活性を示す細胞表面グリコプロテインを精製した。N-末端アミノ酸配列から、この蛋白質はeph/elkファミリーのメンバーと同定され，この蛋白質はそれゆえhek（ヒトeph/elk-様キナーゼ）と命名された。hekと免疫反応するモノクローナル抗体が、多くのヒト細胞型に於けるhek発現の研究に用いられた（Boyd等、上記）。hek抗原は、ヒトpre-B細胞の白血病細胞系LK63（抗体作製の為の免疫原として用いられた細胞系）及びヒトT-細胞の白血病細胞系JMに於いて検出された。Raji Bリンパ細胞系は、弱いhek抗原発現を示し、試験された残りの細胞系（正常細胞及び腫瘍細胞の両者で、pre-B及びT-細胞系を含む造血細胞系）では一貫して陰性であった。正常組織及び腫瘍組織の生体組織検査用標本をhek抗原発現に関しても試験したが、正常組織のどれもが陽性でなく、造血腫瘍組織の非常に低い比率の部分のみが陽性であった。
上記LK63とJM細胞系、さらにヒトT-細胞の白血病細胞系HSB-2に於けるhek転写産物の発現は、ノザンブロット分析によって証明されている（Wicks等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:1611,1992）。単離されたhek cDNAクローンに対するヌクレオチド及びアミノの配列は、上記Wicks等により発表されている。
hek蛋白質は、次のものを含む多数の他の受容体チロシンキナーゼと非常に近い関係にある：elk(Letwin等、Oncogene 3:621,1988及びLhotak等、Mol.Cell.Biol.11:2496,1991)；hekホモログmek4及びcek4(Sajjadi等、New Biol.3:769,1991);eek(Chan等、Oncogene 6:1057,1991)；erk(Chan等、上記）；eck(Lindberg等、Mol.Cell.Biol.10:6316,1990)；cek5(Pasquale,E.B.Cell Regulation 2:523,1991)；及びeph(Hirai等、Science 238:1717,1987)。このサブファミリーの蛋白質は、それらの細胞質領域のみでなく細胞外領域に於いても近縁にあり、41から68%同一である。興味深いことに、これら各種の受容体の組織分布は、多様である。例えば、elk mRNAの発現は、精巣及び脳に限られていることが報告されており（Lhotak等、上記）、それに対し、eckは、それら同じ二つの組織のみならず肺、腸、腎臓、脾臓、卵巣及び皮膚においても見出だされている。
受容体チロシンキナーゼに対するリガンドは、受容体を発現している細胞の増殖、分化及び生存に影響する蛋白質の多様なグループである。今日まで、hekに対するリガンドは、発見されていない。hekを結合する単数または複数の推定上のリガンドの同定は、hek蛋白質により制御される細胞プロセスの性質を研究上で有用性を証明するであろう。
発明の概要
本発明は、hekとして知られる細胞表面受容体に結合するhekリガンド（hek-L）と命名される新規のサイトカインを提供する。更に本発明は、hek-L蛋白質をコードする単離されたDNA、単離されたDNAを含む発現ベクター、及びhek-L蛋白質の発現に適した条件下で発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによるhek-L生産方法を提供する。hek-L蛋白質又は、それの免疫原断片に対する抗体も開示されている。
発明の詳細な説明
hekとして知られる細胞表面蛋白質に結合する新規な蛋白質リガンドをコードするcDNAが本発明に於いて単離された。又、hekリガンド（hek-L）cDNAを含む発現ベクター及びhek-Lの発現に適した条件下で発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによる組換えhek-Lポリペプチドの製造方法並びに発現したhek-Lの回収法も提供される。精製されたhek-L蛋白質は、該蛋白質の可溶型も含め本発明に包含される。
本発明は、又、hek-L免疫原に特異的な抗体を生み出す免疫原として作用することが可能なhek-L又はそれの抗原断片を提供する。従ってhek-L又はそれの抗原断片に特異的なモノクロナル抗体は調製可能である。
本発明により開示される新規なサイトカインは、受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーである細胞表面受容体hekに対するリガンドである。本発明のhekリガンドの一つの用途としては、hek受容体を有する細胞の増殖または分化に於いて、hekと結合することにより果たされるであろうhek-Lの役割を調査するための研究道具があげられる。細胞上でのhek-Lのhekへの結合により開始され得る生物学的シグナルを研究することができる。腫瘍発生に於いてhek何等かの役割を担っている可能性が示唆されている（Boyd等、上記）。本明細書中で提供されるhekリガンドは、hek-Lの同種の受容体への結合が腫瘍発生に於いて持ち得る効果を研究する上で有用である。
本発明のhek-Lポリペプチドは、又、hekもしくはhek-L又はそれらの相互作用を検出するin vitroでの分析にも用いることができる。hek抗原は、ある種の白血病細胞系で検出されているので、hek-Lは、その様な細胞への診断用又は細胞毒性作用物を投与する為の担体としても使用可能である。hekリガンドの上記の用途及びその他の用途は、以下に詳述される。
本発明のhek-L蛋白質は、又、elkとして知られる受容体チロシンキナーゼにも結合することがわかった。elkはLetwin等,Oncogene 3:261,1988及びLhotak等Mol.Cell.Biol.11:2496,1911により記載されている。スカッチャード分析により、実施例５に記載されているように二個のhek-Lに結合したelkの二相パターンが明らかにされた。それ故、本明細書に開示されたhek-L蛋白質は、又、例えば種々の分析操作に於いて、elkを結合させるために使用できる。しかしながら、elk-Lのelkに対するより高い親和性の観点から、その様な用途には一般的には実施例５に記載されたelkリガンド（elk-L）蛋白質が、好まれる。
実施例５に記載された結合研究は、又、elkリガンド（elk-L）がhekと結合することを明らかにした（二相結合パターン）。B61として知られる近縁蛋白質（Holzman等、Mol.Cell.Biol.10:5830,1990）は、hek（線形パターン）とelk（二相パターン）の両者と結合することが見出された。相対的な親和性は、実施例５の表Ｉ及びIIに示す。
hek-L DNAをクローン化する試みに於いて核酸源として用いるのに適した細胞を決定するために、種々のタイプの細胞が、hekを（ヒトhekとFcポリペプチド抗体からなる融合蛋白質の形で）結合する能力により選別された。ヒトT-細胞の白血病細胞系は、hek/Fc結合に陽性であり、cDNA発現ライブラリーはこれから作製された。実施例３に記載されたように、hek/Fc結合蛋白質の発現に対するクローンを選別することにより、ヒトhek-Lをコードする二個の異なるcDNAクローンを単離するのに成功した。第１のヒトhek-L cDNAクローンのDNA配列とそれによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号１及び配列番号２に示されている。第２のヒトhek-LクローンのDNA及びそれによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号３及び配列番号４に示されている。ヒトhek-L cDNAクローンのヌクレオチド及びそれによりコードされるアミノ酸配列の両者と、Genbank及びSwissprotデータベースとの比較は、hekリガンドの配列が固有であることを示した。二つのクローンによってコードされたhek-結合蛋白質のアミノ酸配列は38%同一である。
ヒトhek-L cDNAを、第１の陽性なクローンから単離し、ストラタジーンクローニングシステム社、カリフォルニア州、ラホーヤ（Stratagene Cloning System,La Jolla,CA）より入手可能なクローニングベクターpBLUESCRIPT（登録商標）SK(-)の（マルチクローニングサイト領域の）Bam HI部位に挿入した。得られた組換えベクターは、A2/pBSと命名され、E.coli DH5α細胞に入れられて1993年8月11日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）に寄託され寄託番号ATCC 69384が与えられた。ヒトhek-L cDNAを、第２の陽性なクローンから単離しpBLUESCRIPT（登録商標）SK(-)のBam HI部位に挿入した。得られた組換えベクターは、C6/pBSと命名され、E.Coli DH5α細胞に入れられて1993年8月25日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、寄託番号ATCC 69395が与えられた。両寄託は、ブタペスト条約（Budapest Treaty）の条項にもとずき行われた。
配列番号２の（クローンA2のcDNAによりコードされた）hek-Lは、N-末端シグナルペプチド（アミノ酸-19から-1まで）、細胞外領域（アミノ酸1から202まで）及びアミノ酸203から始まるC-末端疎水性領域からなる。配列番号４の（クローンC6のcDNAによりコードされた）hek-Lは、N-末端シグナルペプチド（アミノ酸-22から-1まで）、細胞外領域（アミノ酸1から160まで）、及びアミノ酸161から始まるC-末端疎水性領域からなる。
クローンA2及びC6によって発現されたhek-L蛋白質は、グリコシル−フォスファチジルイノシトール（GPI）リンケージによって細胞表面に固定されていることが知られている。GPI膜アンカーは、化学構造とその加工を含め、Ferguson,M.及びA.Williamsによって記載されている（Ann.Rev.Biochem.,57:285,1988、本明細書中に参考文献として取込まれる）。発現された当初は、ある蛋白質はGPIアンカーのシグナルを含むC-末端疎水性領域からなっている。切断部位は、疎水性領域のN-末端の上流（約10-12アミノ酸上流であることが多い）に位置する。翻訳後加工は、この切断部位での切断を含む。GPIアンカーは、加工された成熟蛋白質の新たにむき出しになったC-末端アミノ酸に接着する。それ故、hek-L蛋白質が疎水性領域にあるGPIアンカーシグナルを認識する細胞で発現するとき、配列番号２及び４のアミノ酸配列の全ては、該蛋白質の前駆体となる。
GPIアンカー蛋白質から得られた共通配列から、本発明のhek-L蛋白質の有望な切断部位は、配列番号２のアミノ酸194と195の間、及び配列番号４のアミノ酸148と149の間である。蛋白質の切断後、GPIの分子は、今や加工された蛋白質のC-末端となったセリン残基に接着する（配列番号２のアミノ酸194及び配列番号４のアミノ酸148）。切断は、hek-L蛋白質の疎水性領域の上流のどこででも起こり得る。
本明細書で使用する用語"hek-L"は、hekと結合することができ、配列番号２又は配列番号４のhek-L蛋白質と相同性（好ましくは最低80%相同）を示す一群のポリペプチドである。ヒトhek-Lは、マウス、ラット、ウシ、ブタ又はその他の霊長類の種を含む（但しそれ等に限定しないが）他の哺乳動物種由来のhek-L蛋白質と同様、本発明の範囲内である。本明細書で使用されているように、用語"hek-L"は、蛋白質の膜結合型及び可溶型（分泌型）の両者を含む。hek-結合の性質を保持するトランケイトされた蛋白質は、本発明に包含される。その様なトランケートされた蛋白質は、例えば疎水性領域を欠き細胞外（受容体結合）領域のみからなる可溶性hek-Lを含む。
ヒトhek-L cDNAを、放射性標識し、種間ハイブリダイゼーションによるほかの哺乳動物のhek-L cDNAの単離の為のプローブとして使用できる。例えば、他の哺乳動物種のT-細胞白血病細胞系から得られたcDNAライブラリーを、放射性標識されたヒトhek-L cDNAを用いスクリーニングして、陽性なクローンを単離することもできる。或いは、種々の細胞系から単離されたmRNAを、ノザンハイブリダイゼーションによりスクリーニングして、hek-L遺伝子のクローン化に用いるのに適した哺乳動物のhek-L mRNAのソースを決定することができる。
hek/Fc融合蛋白質は、下記実施例２及び３に記載したスクリーニング操作に用いられるが、hekは、hek-L蛋白質の発現に関してのクローン及び細胞系候補のスクリーニングに用いることができる。しかし、hek/Fc融合蛋白質は、容易に精製できると言う利点を提供する。更に、ジスルフィド結合が２個の独立した融合蛋白鎖のFc領域間に形成され、二量体を作る。
他の抗体Fc領域は、実施例１に記載したようにヒトIgG1 Fc領域ムテインと置換することができる。他の適切なFc領域としては、プロテインＡ又はプロテインＧに高い親和性で結合可能なものがあり、マウスIgG1のFc領域またはヒトIgG1 Fc領域の断片、例えば、鎖間ジスルフィド結合が形成されるよう少なくともヒンジ領域を持つ断片が含まれる。
本発明の一つの態様は、可溶性hek-Lポリペプチドを提供する。可溶性hek-Lポリペプチドは、ネイティブなhek-Lの細胞外領域の全部又は一部からなるが、細胞膜にポリペプチドを繋げておくためのシグナルを含めた疎水性領域を欠く。可溶性hek-Lポリペプチドは、好都合なことに、最初合成されたとき分泌を促進するネイティブな（又はヘテロな）シグナルペプチドを含んでいるが、シグナルペプチドは、細胞からhek-Lが分泌されるとき切断される。使用できる可溶性hek-Lポリペプチドは、hek受容体を結合する能力を保持する。可溶性hek-Lは、又、可溶性hek-L蛋白質が分泌され得ることを条件に疎水性領域の一部を含むこともできる。
可溶性hek-Lは、所望の蛋白質を発現した細胞を無傷のまま細胞培養培地から、例えば遠心分離により分離し、培地（上清液）を求める蛋白質の存在に関して分析することにより、同定できる（そして非可溶性の膜結合型のものから区別することができる）。培地中のhek-Lの存在は、蛋白質が細胞から分泌されたこと、従ってそれが求める蛋白質の可溶型であることを示す。可溶性hek-Lは、この蛋白質の、例えばオルタナティブスプライシングから生じた、天然に存在する型でもよい。更に、GPIリンクされたhek-Lは、細胞表面から培養培地に、例えばプロテアーゼ又は他の酵素の働きによって、放出又は流出され得る。
hek-Lの可溶型の使用は、ある種の応用に好都合である。可溶性蛋白質が細胞から分泌されるため組換え宿主細胞からの蛋白質の精製は容易になる。更に、可溶性蛋白質は、一般的に静脈からの投与により適している。
可溶性hek-Lポリペプチドの実施例は、ネイティブなhek-L蛋白質の全ての細胞外領域からなるものを含む。そのような可溶性蛋白質の一つは、配列番号２のアミノ酸1から202までを含み、他の一つは、配列番号４のアミノ酸1から160までを含む。最初に宿主細胞内で発現させる際に、可溶性蛋白質は、使用する宿主細胞内で機能する下記のヘテロなシグナルペプチドの一つを付加的に含んでいてもよい。或いは、蛋白質は、hek-Lが配列番号２のアミノ酸-19から202まで又は配列番号４のアミノ酸-22から160までを含んでいたように、最初からネイティブなシグナルペプチドを含んでいてもよい。可溶性hek-L蛋白質は、GPI接着部位として働くアミノ酸を含むところまでC-末端を欠失するようにトランケートされていてもよい。実施例は、上で議論されたように、配列番号２のアミノ酸1-193又は配列番号４のアミノ酸1-147を含む蛋白質を含む。GPI接着部位は欠失されていてもよいが、疎水性領域の欠失が、細胞膜への蛋白質のGPIアンカーを妨げるには十分であると考えられている。更なる態様では、蛋白質はC-末端をトランケートして、C-末端アミノ酸が配列番号２のアミノ酸193と202間、又は配列番号４のアミノ酸147と160間のどのアミノ酸となっても良い。可溶性hek-L蛋白質をコードするDNA配列は、本発明に包含される。
可溶性ポリペプチドを含めトランケートされたhek-Lは、多数の従来の技術のいずれによっても調製できる。希望するDNA配列は、既知の技術を用いて化学的に合成できる。DNA断片もまたクローン化されたDNA配列の全長を制限エンドヌクレアーゼ消化で作り出すことができ、アガロースゲルでの電気泳動により分離できる。DNA断片の5'又は3'末端を希望する位置に再構築するオリゴヌクレオチドは、合成できる。オリゴヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を希望するコード配列の上流に含み、開始コドン（ATG）をコード配列の5'末端に位置させることができる。良く知られた複製連鎖反応法も、希望する蛋白質断片をコードするDNA配列を単離するため使用できる。更なる代替として、既知の変異導入の技術を用いて、希望する位置に、例えば細胞外領域の最後のアミノ酸のコドンの直ぐ下流に、終止コドンを挿入できる。
本発明の或る態様は、配列番号１のヌクレオチド83-796（全コード領域）、83-745（シグナルペプチド及び細胞外領域をコードする）、140-796（シグナルペプチドを除く蛋白質をコードする）、及び140-745（細胞外領域をコードする）からなるグループから選択されたヌクレオチド配列を含む単離されたDNAを提供する。又、配列番号３のヌクレオチド28-630（全コード領域）、28-573（シグナルペプチド及び細胞外領域をコードする）、94-630（シグナルペプチドを除く蛋白質をコードする）、及び94-573（細胞外領域をコードする）からなるグループから選択されたヌクレオチド配列を含む単離されたDNAも提供する。配列番号２及び配列番号４の蛋白質の生物学的活性のある断片をコードするDNAも、C-末端でトランケートされた上述のhek-L蛋白質をコードするDNAを含めて（但しそれ等に限定はされないが）提供される。
本発明のhek-L DNAは、cDNA、化学的に合成されたDNA、PCRにより単離されたDNA、ゲノムDNA、及びそれらの組合わせを含む。ゲノムhek-L DNAは、標準的な技術を用い、クローンA2又はC6のcDNAへのハイブリダイゼーションにより単離できる。
本発明は、組換え及び非組換えの両方の精製されたhek-Lポリペプチドを提供する。希望する生物学的活性（例えば、hekと結合する能力）を保持する、ネイティブなhek-L蛋白質の変異体及び誘導体も、又本発明の範囲に含まれる。本発明の一つの態様に於いて、成熟hek-L蛋白質は、N-末端アミノ酸配列Leu-Leu-Ala-Gln-Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Asnにより特徴付けられる。他の一つの態様に於いて、成熟hek-L蛋白質は、N-末端アミノ酸配列Gly-Ser-Ser-Leu-Arg-His-Val-Val-Tyr-Trp-Asn-Serにより特徴付けられる。
hek-L変異体は、例えば、天然のhek-Lポリペプチドのヌクレオチド配列コードの変異によって得ることができる。本明細書で言及されるhek-L変異体は、天然のhek-Lに本質的に相同なポリペプチドであるが、一つもしくはそれ以上の欠失、挿入、又は置換のため、天然のhek-L（ヒト、マウスまたは他の哺乳動物の種）のアミノ酸配列とは異なった配列を持つ。hekを結合するその様な変異体は、配列番号２及び配列番号４で提供されたアミノ酸配列を持つネイティブなhek-結合蛋白質の同等物である。
本発明の変異体DNA及びアミノ酸配列は、配列番号１−４の天然の配列のような天然のhek-L配列に対し、好ましくは最低80%同一であり、さらに好ましくは最低90%同一である。断片に対してのパーセント同一性は、断片中に存在するネイティブな配列の部分に関して計算される。本発明の或る態様は、配列番号２のアミノ酸1-194、1-202及び1-219、並びに配列番号４のアミノ酸1-148、1-160及び1-179からなるグループから選択された配列に、最低80%同一であるアミノ酸配列からなるhek-Lポリペプチドを提供する。
ネイティブなアミノ酸配列の変更は、多数の既知の技術のいずれによっても達成できる。変異は、ネイティブな配列の断片への連結を可能にする制限部位が横に付いている変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座位に導入できる。連結後、得られた再構築された配列は、希望するアミノ酸の挿入、置換又は欠失を持つ類似体をコードする。
或いは、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異導入法は、必要とされる置換、欠失又は挿入に従って変更された特定のコドンを持つ変更された遺伝子を提供するために使用できる。上述の変更を行う典型的な方法は、Walder等（Gene 42:133,1986）；Bauer等（Gene 37:73,1985）；Craik（Bio Techniques,January 1985,12-19）；Smith等（Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981）；Kunkel（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488,1985）；Kunkel等（Methods in Enzymol.154:367,1987)；及び米国特許第4,518,584号及び4,737,462号により開示され、それらは本明細書中に参考文献として取込まれる。
変異体は、保存的に置換された配列を含んでも良い。これの意味するところは、或るアミノ酸残基が、同様な生理化学的性状を持った残基により置換えられるということである。保存的置換の例は、Ile,Val,Leu又はAlaが互いに置換するような一つの脂肪族残基の他の一つとの置換、又はLysとArg間；GluとAsp間；又はGlnとAsn間のような一つの極性残基の他の一つとの置換を含む。その他のその様な保存的置換、例えば同様な疎水性の性格を持った全領域の置換は良く知られている。
hek-Lは、又グリコシル基、脂質、フォスフェート、アセチル基及びその様な他の化学成分と共有結合又は凝集結合を形成することによりhek-L誘導体を作り出すために修飾されていても良い。hek-Lの共有誘導体は、化学成分をhek-Lアミノ酸側鎖の官能基、又はhek-LポリペプチドのN-末端もしくはC-末端、又はそれらの細胞外領域に結合させることにより調製することができる。本発明に含まれるhek-Lのその他の誘導体は、N-末端又はC-末端融合体のような組換え培養での合成によるような、hek-L又はその断片の、他の蛋白質又はポリペプチドとの共有又は凝集結合体を含む。
hek-Lリガンドを最初に組換え系で発現させたとき、（ネイティブ又はヘテロな）シグナル又はリーダー配列を、hek-LポリペプチドのN-末端に含んでいても良い。シグナル又はリーダーペプチドは、翻訳時に又は翻訳後に蛋白質の合成の部位から細胞膜又は細胞壁の外側の部位への蛋白質の輸送を指令し、分泌過程で成熟蛋白質から切断される。使用される発現系に従って一般的に選択される、適切なヘテロなシグナルペプチドの実施例を、以下に記述する。
hek-Lポリペプチド融合体は、hek-Lの精製及び同定を容易にするため付加されたペプチドを含むことができる。その様なペプチドは、例えば、ポリ-His又は米国特許第5,011,912号及びHoppら、Bio/Technology 6:1204,1988により記載されている抗原同定ペプチドを含む。その様なペプチドの一つは、高度に抗原的であり発現した組換え蛋白質の迅速な分析及び容易な分離を可能にする特異的モノクローナル抗体に可逆的に結合するエピトープを提供する、FLAG（登録商標）ペプチド、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)である。このペプチドでキャップされた融合蛋白質は、又E.coliに於ける細胞内分解に抵抗できる。4E11と命名されたマウスのハイブリドーマは、（本明細書中に参考文献として取込まれる米国特許第5,011,912号に記載されるように）ある種の二価金属カチオンの存在下でペプチドDYKDDDDKを結合するモノクローナルな抗体を生産し、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託番号HB 9259として寄託された。
本発明は、更に関連するネイティブパターンのグリコシル化を伴う、又は伴わないhek-Lポリペプチドを含む。酵母又は哺乳動物の発現系（例えばCOS-7細胞）で発現したhek-Lは、発現系の選択によって分子量とグリコシル化パターンが、ネイティブなhek-Lポリペプチドと同様か又は有意に異なり得る。E.coliの様なバクテリア発現系でのhek-Lポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。
アミノ酸残基又は配列の種々の添加もしくは置換、又は生物学的活性もしくは結合に不必要な末端または内部残基又は配列の欠失をコードするDNA構築物が調製可能である。例えば、hek-L細胞外領域のN-グリコシル化部位を、哺乳動物及び酵母発現系に於いてより均質且つ炭水化物の少ない類似体を発現させるため、グリコシル化を妨げるように修飾することができる。真核生物のポリペプチドに於けるN-グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットAsn-X-Yにより性格付けられる（ここで、XはProを除くいかなるアミノ酸でもよく、YはSer又はThrである）。このトリプレットをコードするヌクレオチド配列の適切な修飾は、Asn側鎖での炭水化物残基の接着を妨げる置換、添加又は欠失をもたらす。例えば、Asnが異なった蛋白質に置き換えられるよう選ばれた１個のヌクレオチドの変更は、N-グルコシル化部位を不活化するのに十分である。蛋白質のN-グリコシル化部位を不活化する既知の方法としては、本明細書中に参考文献として取込まれる米国特許第5,071,972号及び欧州特許第276,846号に記載されている方法を含む。
３個のN-グリコシル化部位が、クローンA2によりコードされたhek-Lの配列番号２のアミノ酸19-21、48-50及び81-83で見出されている。１個のN-グリコシル化部位が、クローンC6によりコードされたhek-Lの配列番号４のアミノ酸11-13で見出されている。
他の例では、生物学的活性に必須でないCys残基をコードする配列は、再生に於ける誤った分子間ジスルフィド結合を形成しないよう、Cys残基を欠失するか又は他のアミノ酸に置換えるように変更することができる。他の変異体は、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系での発現を促進するため、隣接する二塩基性アミノ酸残基の修飾によって調製される。欧州特許第212,914号は、蛋白質のKEX2プロテアーゼ加工部位を不活化するための部位特異的変異導入の使用を開示している。KEX2プロテアーゼ加工部位は、隣接する塩基性残基の存在を排除するようArg-Arg,Arg-Lys及びLys-Argの対を変更するように、残基を欠失、添加又は置換することにより不活化される。Lys-Lys対は、KEX2切断にあまり敏感でなく、Arg-Lys又はLys-ArgのLys-Lysへの転換は、KEX2部位の不活化への保存的で好ましい解決法である。KEX2プロテアーゼ加工部位は、配列番号２のhek-Lのアミノ酸26-27、87-88及び199-200に見出されている。配列番号４のhek-Lは、アミノ酸73-74と134-135にKEX2プロテアーゼ加工部位を含む。
天然に存在するhek-L変異体は、また本発明に包含される。そのような変異体の例は、mRNAオルタナティブスプライイシング又はhek-L蛋白質のタンパク質分解切断から生じるhek結合性を保持した蛋白質である。mRNAのオルタナティブスプライシングは、例えば、蛋白質の天然に存在する可溶型のような、トランケートされてはいるが生物学的に活性のあるhek-L蛋白質を作ることもできる。タンパク質分解に起因する変異体は、例えば、hek-L蛋白質から（一般的に1-5未満アミノ酸から）の一つ又はそれ以上の末端アミノ酸の加水分解による除去による、異なったタイプの宿種細胞内での発現した際のN-又はC-末端の相違を含む。シグナルペプチドは、与えられた蛋白質の異なった位置で切断され、その結果、成熟蛋白質のN-末端アミノ酸の変異が生じ得る。。
一つの発現系に於いて、クローンC6によってコードされたhek-L蛋白質のN-末端アミノ酸は、配列番号４のアミノ酸4（Leu）であった。クローンA2から誘導された可溶性hek-L融合蛋白質の調製品の一つは、N-末端アミノ酸として配列番号２のアミノ酸2（Asn）を持つ融合蛋白質（約60%）と、配列番号２のアミノ酸1（Leu）がN-末端アミノ酸である融合蛋白質の混合物から成っていた。本発明のある態様は、それゆえN-末端アミノ酸が、配列番号４のアミノ酸1-4のいずれか又は配列番号２のアミノ酸1-12のいずれかである蛋白質（可溶性又は膜結合）に向けられた。
１個以上のコドンにより同じアミノ酸がコードできる遺伝暗号の既知の縮重のため、DNA配列は、配列番号１又は３に示されたものから変異され、それでも尚配列番号２又は４のアミノ酸配列を持つhek-L蛋白質がコードされ得る。そのような変異体DNA配列は、サイレント変異（例えば、PCR増幅に於いて起こる）から生じ得るもので、またネイティブな配列を慎重に変異導入した産物でもあり得る。
それゆえ本発明は生物学的に活性なhek-Lをコードする次の物から選択され単離されたDNA配列を提供する：（a）ネイティブな哺乳動物のhek-L遺伝子のコード領域から誘導されたDNA（例えば、配列番号１又は配列番号３に示されたヌクレオチド配列のコード領域からなるcDNA）;及び（b）（a）により規定されたDNAの遺伝暗号の結果としての縮重物で生物学的に活性なhek-LをコードするDNA。その様なDNA配列によりコードされたhek-L蛋白質は、本発明に包含される。
本発明のhek-L DNAは、cDNA、化学的に合成されたDNA、PCRにより単離されたDNA、ゲノムDNA、及びそれらの組合わせを含む。ゲノムhek-L DNAは、標準的な技術を用いた、クローンA2又はC6のcDNAのハイブリダイゼーションにより単離できる。
生物学的活性の分析
hekを結合する能力を持つ変異体は、適切な分析のいずれによっても同定できる。一般的な分析技術も、ネイティブなhek-L蛋白質のhek-結合活性の分析に有用である。hek-Lの生物学的活性は、例えば、hekのリガンド結合領域への結合の競合（即ち競合的結合分析）により決定できる。
hek-Lポリペプチドの競合的結合分析の一つの型は、放射性標識された可溶性ヒトhek-L及び細胞表面hekを発現しているインタクトな細胞を使用する。インタクトな細胞の替わりに、（hek/Fc融合蛋白質のような）融合蛋白質のFc領域とプロテインＡ又はプロテインＧとの相互作用により固体相に結合させた、可溶性hekと置換えできる。別の型の競合結合分析は、放射性標識されたhek/Fc融合蛋白質のような可溶性hek及びhek-Lを発現するインタクトな細胞を用いる。又、可溶性hek-Lは、固体相に結合されていても良い。
競合結合分析は、標準的な方法論を用いて行うことができる。例えば、表面結合hekに対する結合活性を分析するため、放射性標識されたhek-Lを用いて、推定上のhek-Lホモログと競合させることができる。定性的結果は、競合オートラジオグラフィックプレート結合分析により得ることができ、又定量的結果を得るためスカッチャードプロットを使用しても良い。
又、可溶性hekは、125Ｉで標識されたhek-Lのような検出可能な成分の存在を分析するのに適したカラムクロマトグラフマトリクスもしくは同様の基質等の固体相に、結合させることができる。固体相への結合は、例えば、hek/Fc融合蛋白質をプロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリクスと結合させることにより達成できる。
hek-L（変異体を含む）の結合上の特徴は、上述と同様の競合分析に標識された可溶性hek（例えば、125Ｉ-hek/Fc）を用いて決定できる。しかしこの場合、hek-Lを発現するインタクトな細胞又は固体の基質に結合した可溶性hek-Lを用いて、推定上のhek変異体を含む試料が標識された可溶性hekのhek-Lへの結合に対して競合する程度が測定される。
膜結合hek-Lのhek結合活性を検出するための好ましい分析法は、次のようなものである。実施例１で調製されたhek/Fc融合蛋白質と、hek/Fcを直接放射性標識することを避けるため実施例３に記載された125Ｉで標識されたマウスの抗ヒトIgG Fc抗体を用いた、改変した間接結合分析が考案された。内在的hek-Lを発現する細胞（例えば、実施例２に記述したCCRF-HSB-2細胞系）を、次のように異なる濃度のhek/Fcに晒し、次いで一定の飽和濃度の125Ｉ抗体に晒す。
CCRF-HSB-2細胞を、96穴培養プレートを用いた懸濁液培養により培養する。細胞（2×106細胞／ウエル）を、結合培地（RPMI 1640培地、1％ウシ血清アルブミン、0.2%アジ化ナトリウム及び20mM Hepes、pH7.2）中で種々の濃度のhek/Fcの存在下又は非存在下で、37℃で１時間インキュベートする。細胞を、それからPBSで一度洗浄し、125Ｉ-マウス抗ヒトIgG Fc（40ng/ml）を含む結合培地と、穏やかに攪拌しながら37℃で１時間インキュベートする。細胞と未結合の125Ｉ-抗体は、本質的にはDower等,J.Immunol.132:751(1984)によって記載されたような、フタレート油分離法により分離される。
組換え膜結合hek-Lを発現する細胞へのhek/Fc結合に関する分析は、実施例５に記載したように行うことができる。間接結合分析が使用された。
可溶性hek-Lのhek結合活性を分析する好ましい分析法は、次のようなものである。分析法は、実施例２に記載したように内在性hek-Lを発現するCCRF-HSB-2細胞系へのhek/Fc融合蛋白質の結合を阻止する可溶性hek-Lの活性を検出する。
可溶性hek-Lを発現する発現ベクターで形質転換されたCV-1/EBNA細胞からの条件付き上清液（培養液）を、96穴プレートで滴定する。hek/Fcの一定量（1μg／ウエル）が、各ウエルの結合培地内に加えられ、次いでCCRF-HSB-2細胞がウエル当たり1-2×106個加えられる。プレートを37℃で１時間インキュベートする。細胞を、PBSで二回洗浄し、それから遠心分離によりペレット化する。125Ｉ-マウス抗ヒトIgG Fcを一定濃度で各ウエルに加え、プレートを37℃で更に１時間インキュベートする。125Ｉ-マウス抗ヒトIgG Fcは、CCRF-HSB-2細胞に結合しているhek/Fcに結合する。最後のインキュベーション後、細胞は、結合した125Ｉ-マウス抗ヒトIgG Fcと遊離した物とを分離するフタレート油の入った試験管の上部に回収される。放射性活性を、ガンマ線計測器を用いて定量化する。
ｈｅｋ−Ｌの用途
本発明のhek-Lは、hekを発現する細胞を検出する結合分析に使用できる。例えば、hek-Lもしくはその細胞外領域又はそれの断片は、125Ｉのような検出可能な成分と結合させることができる。125Iによる放射性標識は、高い比活性で標識された機能的な125I-hek-L分子を得るための幾つかの標準的方法により行われる。又、ビオチン(biotin)やアビジン(avidin)のような発色分析や蛍光分析反応に触媒として働くことのできる酵素のような他の検出可能な成分を用いても良い。hek発現を試験される細胞は、標識されたhek-Lと接触させることができる。インキュベーション後、未結合の標識されたhek-Lは除去され、結合は検出可能な成分を用いて測定される。
本明細書で開示されるhekリガンド蛋白質は、又、hek-Lに対する結合親和性と言う意味での、hek蛋白質の生物学的活性を測定することにも使用できる。例示として、hek-Lは、異なる温度で貯蔵された、もしくは、異なる細胞型から生産されたhek蛋白質の、生物学的活性を測定する結合親和性の研究に使用できる。例えば、あるhek蛋白質の生物学的活性は、調査研究に使用する前にこのように確認することができる。
hek-L蛋白質は、例えば種々の条件下でのhek蛋白質の在庫可能期間及び安定性をモニターする”品質管理”の研究を行う人々により使用され得る試薬としての用途が見出だされる。hekリガンドは、hek蛋白質の修飾（例えば、化学的修飾、トランケート、変異等）後に、生物学的活性が保持されているかを決定するために使用できる。hekの生物学的活性への修飾の好ましくない結果を検出する為に、修飾されたhek蛋白質のhek-Lに対する結合親和性を非修飾hek蛋白質のそれと比較される。
hekリガンドの異なる用途は、蛋白質精製工程に於ける試薬である。hek-L又はhek-L/Fc融合蛋白質は、従来の技術により固体保持物質に付着させられ、アフィニティークロマトグラフによりhekを精製するのに使用しても良い。
hek-Lポリペプチドはまた、それに結合された薬剤をhek細胞表面抗原を持つ細胞に投与する担体としての用途も見出だす。hek抗原の発現は、JM及びHSB-2と命名されたヒトT-細胞白血病細胞系及びLK63と命名されたヒトpre-B細胞白血病細胞系(Boyd等、J.Biol.Chem.267:3262,1992、及びWicks等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,89:1611,1992)を含むある種の白血病細胞系に対し報告されている。hek-L蛋白質は、このように診断用又は治療用薬剤をその様な細胞（又は細胞表面にhekを発現することが分っている他の細胞型）にin vitroなin vivoな方法によって投与するのに使用できる。
その様な用途の一例は、薬剤が白血病細胞に対して細胞毒性を示すか否かを評価するためhek+白血病細胞系を治療用薬剤/hek-L複合体に晒すことである。hek-Lに結合された多数の種々の治療用薬剤は、その薬剤の白血病細胞に対する細胞毒性効果を検出し比較するための分析に含められる。hek-L/診断用薬剤複合体は、hek+細胞の存在を検出するためin vitro又はin vivoで使用できる。
hek-Lポリペプチドに結合しうる診断用及び治療用薬剤は、それ等に限定はされないが、次のものを含む：薬品、毒素、放射性核種、クロモフォア、蛍光性化合物、発色分析又は蛍光分析反応を触媒する酵素、等、（適用の意図に従って特定の薬剤が選択される）。薬品の例は、種々の型の癌の治療に使用されるものを含む。例えば、L-フェニルアラニン ナイトロジェンマスタード(L-phenylalanine nitrogen mustard)又はシクロホスホアミド(cyclophosphamide)のようなナイトロジェンマスタード(nitrogen mustard)、cis-ジアミノジクロロプラチナ（cis-diaminodichloroplatinum）のようなインターカレート剤(intercalating agent)、5-フルオロウラシル（5-fluorouracil）のような代謝桔抗物質(antimetabolite)、ビンクリスチン（vincristine）のようなビンカアルカロイド(vinca alkaloides)、及びブレオマイシン（bleomycin）、アドレアマイシン（doxorubicin）、ダウノルビシン(daunorubicin)のような抗生物質(antibiotics)、並びにそれらの誘導体。毒素の中ではリシン（ricin）、アブリン（abrin）、ジフテリア毒素(diphtheria toxin)、Pseudomonas aeruginosaエクソトキシンA(exotoxin A)、リボソーム不活性蛋白質（ribosomal inactivating proteins）、トリコテセンス(trichothecenes)のようなマイコトキシン（mycotoxin）及びそれらの誘導体及び断片（例えば、単鎖）である。診断用に適した放射性核種は、それ等に限定はされないが、123Ｉ、131Ｉ、99mTc、111In、及び76Brを含む。治療用に適した放射性核種は、それ等に限定はされないが、131Ｉ、211At、77Br、186Re、188Re、212Pb、212Bi、109Pd、64Cu、及び67Cuを含む。
その様な薬剤は、適当な従来の方法のいずれかでhek-Lに結合できる。蛋白質であるhek-Lは、希望する薬剤の官能基を反応し、例えば共有結合を形作ることができるようなアミノ酸側鎖官能基を含む。あるいは、蛋白質又は薬剤は、希望する反応性官能基を作り出すか、又は結合させるように誘導できる。誘導は、種々の分子を蛋白質に結合させるために入手可能な二官能性結合試薬（Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois）の一つを結合させることを含む。蛋白質の放射性標識するための技術が多数知られている。放射性核種金属は、例えば適当な二官能性キレート化剤を用いてhek-Lに結合できる。
hek-Lと適切な診断用又は治療用薬剤からなる（好ましくは共有結合した）複合体は、このようにして調製される。複合体は、特定の応用に適した量だけを投与もしくは他の形で使用される。
実施例５に記述したように、本明細書で提供されるhek-L蛋白質は、またelkとして知られる受容体を結合する能力をも有する。それ故、hek-Lは、hek-結合特性から発する上述の用途と類似のelk-結合特性から発する追加の用途を持つ。hek-Lは種々の分析でelkの検出に使用できる。hekを結合する抗体は、もし適当なら、elkのhek-Lへの結合は許容するが、hekのhek-Lへの結合は阻止する分析に使用できる。hekリガンドは、elk蛋白質の生物学的活性を、elk蛋白質またはそれの変異体のhek-Lに対する結合親和性の意味での評価に使用できる。hek-L蛋白質は、またelk蛋白質のアフィニティークロマトグラフによる精製に用途を見出だす。
ｈｅｋ−Ｌオリゴマー
本発明は、二量体又は三量体のようなオリゴマーの形のhek-Lポリペプチドを包含する。オリゴマーは、異なるhek-Lポリペプチドのシステイン残基間のジスルフィド結合によって形成される。本発明の一つの態様に於いて、hek-L二量体は、hek-Lのhekリガンド結合領域への結合を妨げること無く抗体(IgG1)のFc領域へhek-Lを融合させることにより生成される。”Fcポリペプチド”と言う用語は、天然型及び変異型（mutein）、及び二量体化を促進するヒンジ領域を含むトランケートされたFcポリペプチドを含む。Fcポリペプチドは好ましくは可溶性hek-L（細胞外領域のみからなる）のC-末端に融合される。抗体由来のポリペプチドの種々の部分へ融合したヘテロなポリペプチドからなる融合蛋白質の調製は、例えば本明細書中に参考文献として取込まれているAshkenazi等（PNAS USA 88:10535,1991）及びByrn等(Nature 344:677,1990)により記載されている。
hek-LのFcまたはFc変異型ポリペプチドへの融合は、実施例１に記載したhek/Fc変異型融合体の調製と類似の方法により調製できる。hek-L/Fc融合蛋白質をコードする遺伝子融合体は、適切な発現ベクターに挿入され宿主細胞に形質転換される。発現したhek-L/Fc融合蛋白質は、抗体分子のようなものを組立てることが可能で、その際Fcポリペプチド間で鎖間ジスルフィド結合を形成し二価のhek-Lを得る。あるいは、変異型が誘導されるネイティブなFcポリペプチドが、使用できる。
融合蛋白質が抗体の重鎖と軽鎖の両方から作られた場合、最高４個のhek-L細胞外領域を持つhek-Lオリゴマーを形成することが可能である。あるいは、米国特許第5,073,627号に記述されているようなペプチドリンカーを用いて２つの可溶性hek-L領域を結合できる。
本発明の特定の態様に於いて、配列番号１のアミノ酸-19から202まで又は配列番号３のアミノ酸-22から157までをコードするhek-L DNAを、実施例１に記述されたFc変異型をコードするDNAの5'末端に融合し、発現ベクターpDC410（実施例３に記載）に挿入した。得られた組換え発現ベクターで形質転換されたCV1-EBNA-1細胞は、可溶性hek-L/Fc融合蛋白質を発現するため培養された。
本発明は、ジスルフィドの相互作用により結合した、又はスペーサ-としてのアミノ酸結合基と共に、又は無しで、融合ポリマーとして発現したhek-L細胞外領域又はその断片のオリゴマーを提供する。例えば、hek-L細胞外領域の二量体は、IgG Fc領域結合基により結合できる。
発現系
本発明は、ｈｅｋ−Ｌの発現用の組換え発現ベクター、及びその発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。あらゆる適する発現系を用いることができる。これらベクターは、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に機能できるように連結された、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子から誘導されるものの如き、ｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列を含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列に機能的に結びついている場合、機能できるように連結していることになる。かくして、プロモーターヌクレオチド配列がｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列の転写を制御するなら、そのプロモーターヌクレオチド配列はｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列に機能できるように連結している。通常、複製起点により付与される所期の宿主細胞内で複製する能力、及び形質転換体を同定する選択遺伝子を、この発現ベクター内に追加的に組み入れることができる。
加えて、このｈｅｋ−Ｌ遺伝子にとって生来のものではない適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター内に組み入れることができる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を枠内（in frame）でｈｅｋ−Ｌ配列に融合させて、そのｈｅｋ−Ｌがまずシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにしてもよい。意図する宿主細胞内で機能性であるシグナルペプチドは、ｈｅｋ−Ｌポリペプチドの細胞外分泌を促進する。このシグナルペプチドは、細胞からｈｅｋ−Ｌが分泌されるとすぐにそのｈｅｋ−Ｌポリペプチドから切り離される。
ｈｅｋ−Ｌポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で用いるのに適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、例えば、Pouwelsら，Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York,(1985)に記載されている。無細胞翻訳系も、ここに開示したＤＮＡ構築体から誘導されるＲＮＡを用いてｈｅｋ−Ｌポリペプチドを産生するのに用いられるであろう。
原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸菌又は桿菌が含まれる。形質転換に適する原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、及びシュウドモナス属、ストレプトミセス属及びスタフィロコッカス属に属する他の様々な種が含まれる。大腸菌の如き原核宿主細胞内では、ｈｅｋ−Ｌポリペプチドは、該原核宿主細胞内での該組換えポリペプチドの発現を容易にするために、Ｎ−末端メチオニン残基を含むことができる。このＮ−末端Metは、発現された組換えｈｅｋ−Ｌポリペプチドから切り離され得る。
原核宿主細胞で用いる発現ベクターは、一般に、１又は２以上の表現型選択可能なマーカー遺伝子を含む。表現型選択可能なマーカー遺伝子というのは、例えば、抗生物質耐性を付与するタンパク質又は独立栄養要求量を供給するタンパク質をコードする遺伝子のことである。原核宿主細胞にとって有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の如き市販のプラスミドから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定する簡単な手段を提供する。適切なプロモーター及びｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ配列をこのｐＢＲ３２２ベクター内に挿入する。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden）及びｐＧＥＭ１（Promega Biotec,Madison,WI,USA）が含まれる。
組換え原核宿主細胞発現ベクターに広く用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Changら，Nature 275:615,1978；及びGoeddelら，Nature 281:544,1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddelら，Nucl.Acids Res.8:4057,1980；及びＥＰ−Ａ−３６７７６）及びｔａｃプロモーター（Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,p.412,1982）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰLプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λＰLプロモーターの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）内に存する）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存する）が含まれる。
また、ｈｅｋ−Ｌを酵母宿主細胞内で、好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ.セレビシエ）から発現させてもよい。ピキア（Pichia）又はクルイベロミセス（Kluyveromyces）の如き酵母の他の属も用いることができる。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多いであろう。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら，J.Biol.Chem.255:2073,1980）又は他の解糖酵素（Hessら，J.Adv.Enzyme Reg.7:149,1968；及びHollandら，Biochem.17:4900,1978）、例えば、エラノーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのためのプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他のベクター及びプロモーターは、Hitzeman,ＥＰＡ−７３,６５７に更に記載されている。他の代用物は、Russellら（J.Biol.Chem.258:2674,1982）及びBeierら（Nature 300:724,1982）により記載されたグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。大腸菌内での選択及び複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子及び複製起点）を上記の酵母ベクター内に挿入することにより、酵母及び大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターを構築することができる。
酵母α因子リーダー配列を用いて、ｈｅｋ−Ｌポリペプチドの分泌を行わせることができる。このα因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多い。例えば、Kurjanら，Cell 30:933,1982；Bitterら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330,1984；米国特許第４,５４６,０８２号；及びＥＰ３２４,２７４を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列は、当業者にとって公知である。リーダー配列は、１又は２以上の制限部位を含有するようにその３'末端の近くで修飾されていてもよい。これは、そのリーダー配列の構造遺伝子への融合を促進するであろう。
酵母形質転換手順は、当業者にとって公知である。かかる手順の１つは、Hinnenら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929,1978に記載されている。このHinnenらの手順は、選択培地中でＴｒｐ+形質転換体を選択するものであって、その選択培地は、０.６７％酵母窒素原基、０.５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
発現を誘発するために、ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を“富”培地中で生育させてもよい。富培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなる培地である。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から消費され尽くした時に起こる。
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えｈｅｋ−Ｌポリペプチドを発現することもできるであろう。昆虫細胞内での異種起源タンパク質の産生のためのバキュロウィルス系の委細が、LuckowとSummers,Bio/Technology 6:47(1988)により示されている。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。適する哺乳動物宿主細胞系の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）(Gluzmanら，Cell 23:175,1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、及びＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞系、及びアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）からMcMahanら（EMBO J.10:2821,1991）により記載された通りに誘導されたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系が含まれる。
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから切り出すことができる。広く用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウィルスから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を提供してもよい。ウィルスの初期及び後期プロモーターが特に有用である。というのは、いずれもウィルスの複製起点を含有することもできる断片としてウィルスゲノムから容易に得られるからである（Fiersら，Nature 273:113,1978）。ＳＶ４０ウィルスの複製起点部位内に位置するＨｉｎｄIII部位からＢｇｌII部位に及び約２５０ｂｐ配列が含まれることを条件として、より小さな又はより大きなＳＶ４０断片も用いることができる。
哺乳動物宿主細胞内で用いる適例となる発現ベクターは、Okayama及びBerg（Mol.Cell.Biol.3:280,1983）により開示された通りに構築することができる。Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞内の哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系は、実質的にCosmanら（Mol.Immunol.23:935,1986）により記載された通りに構築することができる。有用な高発現ベクター、つまりCosmanら，Nature 312:768,1984に記載されたＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。追加の有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、及び１９９１年５月１６日に出願された米国特許出願第０７／７０１,４１５号に記載されている。なお、これらは参照によってここに組み入れられるものとする。これらベクターをレトロウィルスから誘導することができる。
天然シグナル配列をコードするＤＮＡの代わりに、このベクターは異種起源のシグナル配列をコードするＤＮＡを含有することができる。例には、米国特許第４,９６５,１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）についてのシグナル配列；Cosmanら，Nature 312:768(1984)に記載されたインターロイキン−２レセプターについてのシグナル配列；ＥＰ３６７,５６６に記載されたインターロイキン−４シグナルペプチド；米国特許第４,９６８,６０７号に記載されたＩ型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチド；及びＥＰ４６０,８４６に記載されたII型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチドが含まれる。
タンパク質精製
本発明は、実質的に均質なｈｅｋ−Ｌタンパク質であって、上記の組換え発現系により産生させることも天然に存在する細胞から精製することもできるタンパク質を提供する。このｈｅｋ−Ｌは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析で１本のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均質なまでに精製される。
このｈｅｋ−Ｌタンパク質を産生させる１つの方法は、ｈｅｋ−ＬをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞をｈｅｋ−Ｌが発現されるような条件下で培養することを含む。次いで、ｈｅｋ−Ｌタンパク質を、用いた発現系に依存して培養基又は細胞抽出液から回収する。熟練した技術者は分かるであろうが、組換えｈｅｋ−Ｌを精製する操作は、用いた宿主細胞の型及びｈｅｋ−Ｌが培養基中に分泌されるかどうかといった要因に従って変動するであろう。
例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系を用いたときは、培養基をまず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon超濾過装置を用いて濃縮することができる。濃縮工程後は、濃縮液をゲル濾過媒体の如き精製基材に適用することができる。また、アニオン交換樹脂、例えば、基材又は支持体がペンダントのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するアニオン交換樹脂を用いてもよい。基材は、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に広く用いられる他の型であってもよい。また、カチオン交換工程を用いてもよい。適するカチオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性基材が含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントのメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる１又は２以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて、ｈｅｋ−Ｌを更に精製することができる。上述の幾つか又は全ての精製工程をいろいろに組み合わせて用いて、実質的に均質な組換えタンパク質を得ることができる。
ｈｅｋのリガンド結合ドメインを含むアフィニティカラムを用いて、発現されたｈｅｋ−Ｌポリペプチドを親和精製することも可能である。ｈｅｋ−Ｌポリペプチドを高塩類溶離緩衝液でアフィニティカラムから溶出させてから使用のために低塩類緩衝液中に透析してもよい。また、このアフィニティカラムはｈｅｋ−Ｌに結合する抗体を含むこともできる。更に別法では、アフィニティカラムは、プロテインＡカラムに結合したｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質を含む。
細菌培養で産生した組換えタンパク質は、通常、宿主細胞をまず崩壊させ、遠心分離し、不溶性ポリペプチドなら細胞沈殿物から、可溶性ポリペプチドなら上澄み液から抽出した後、１又は２以上の濃縮、塩析、イオン交換、親和精製又はサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ−ＨＰＬＣを用いてもよい。微生物細胞は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的崩壊、又は細胞溶解剤の使用を含むあらゆる簡便な方法により崩壊させることができる。
形質転換酵母宿主細胞を用いてｈｅｋ−Ｌを分泌ポリペプチドとして発現させることができる。酵母宿主細胞発酵から分泌された組換えポリペプチドは、Urdalら（J.Chromatog.296:171,1984）により開示された方法と類似の方法により精製することができる。Urdalらは、組換えヒトＩＬ−２の精製のための分取ＨＰＬＣカラムでの２連続逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。
本発明は、ｈｅｋ−Ｌポリペプチド及び薬学的に許容できるキャリヤー、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。かかる組成物は、緩衝液；アスコルビン酸の如き酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質；アミノ酸；グルコース、スクロース、又はデキストリンを含む炭水化物；ＥＤＴＡの如きキレート剤；グルタチオン；及び他の安定剤及び賦形剤を含むことができる。中性緩衝生理食塩水又は同種血清アルブミンと混合した生理食塩水が、適例となる適切は希釈剤である。
核酸断片
本発明は、更に、ここに示したｈｅｋ−Ｌヌクレオチド配列の断片を提供する。かかる断片は、望ましくは、配列番号：１又は３に示した配列の少なくとも約１４のヌクレオチドを含む。前記断片のＤＮＡ及びＲＮＡ相補体が、ｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡの一本鎖型及び二本鎖型の両方と一緒にここに提供される。
かかるｈｅｋ−Ｌ核酸断片の用途のうちの１つは、プローブとしての用途である。かかるプローブを種間（cross-species）ハイブリダイゼーション操作に用いて更なる哺乳動物種からｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡを単離することができる。一例として、ｈｅｋ−Ｌの細胞外ドメインに対応するプローブを用いることができる。これらプローブにもin vitroアッセイで及びノーザン及びサザーンブロットの如き操作でｈｅｋ−Ｌ核酸の存在を検出する用途がある。ｈｅｋ−Ｌを発現する細胞型を同定することができる。かかる操作は周知であるので、熟練した技術者は、特定の意図した用途に依存して、適する長さのプローブを選ぶことができる。
ｈｅｋ−Ｌ核酸の他の有用な断片は、一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドであって、標的ｈｅｋ−Ｌ ｍＲＮＡ（センス）又はｈｅｋ−Ｌ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できるオリゴヌクレオチドである。本発明によれば、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１又は配列番号：３に示したｈｅｋ−Ｌ ｃＤＮＡのコーディング領域の断片、又はそのＤＮＡ若しくはＲＮＡ相補体を含むことができる。そのような断片は、一般に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは約１４〜約３０のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質についてのｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを作る能力は、例えば、SteinとCohen,Cancer Res.48:2659,1988及びvan der Krolら，BioTechniques 6:958,1988に記載されている。
標的核酸配列へのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二重鎖の形成をもたらし、それは、それら二重鎖の分解の増進、転写又は翻訳の早期終結を含む幾つかの手段の１つにより又は他の手段により、翻訳（ＲＮＡ）又は転写（ＤＮＡ）を遮断する。かくして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ｈｅｋ−Ｌタンパク質の発現を遮断することができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修復された糖リン酸ジエステル主鎖（又はＷＯ９１／００６２９に記載された如き他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含む。そして、かかる糖結合は内因性ヌクレアーゼに抵抗性である。抵抗性糖結合を有するかかるオリゴヌクレオチドは、in vivoで安定である（即ち、酵素分解に抵抗できる）が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたものの如き有機部分に共有結合しているオリゴヌクレオチド、及び標的核酸配列に対するそのオリゴヌクレオチドの親和性を高めるポリ（Ｌ−リシン）の如き他の部分に共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。更になお、エリプチシン（ellipticine）の如き介在物質及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに付けて、そのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を修飾することができる。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、ＣａＰＯ4媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む何らかの遺伝子移送方法により又はエプスタイン−バーウィルスの如き遺伝子移送ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含有する細胞内に導入することができる。好ましくは、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを適するレトロウィルスベクター中に挿入してから、細胞とその挿入された配列を含有するレトロウィルスベクターとをin vivo又はex vivoのいずれかで接触させることにより、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを標的核酸配列を含有する細胞内に導入する。適するレトロウィルスベクターには、マウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ,Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから誘導されるレトロウィルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと呼ばれる二重コピーベクター（ＰＣＴ出願ＵＳ９０／０２６５６を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合性分子を有する複合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞内に導入することもできる。適するリガンド結合性分子には、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合性分子の複合化は、リガンド結合性分子のその対応する分子又はレセプターに結合する能力を実質的に妨げることがないか、又はセンス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合型が細胞内に入るのを実質的に遮断することがないものである。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ９０／１０４４８に記載されているようにオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスの形成により、標的核酸配列を含有する細胞内に導入することができる。このセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスは、好ましくは、内因性リパーゼにより細胞内で解離される。
以下の実施例は、特定の態様を説明するために示したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：可溶性ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質の調製
この実施例は、ｈｅｋリガンド（ｈｅｋ−Ｌ）をコードするｃＤＮＡクローンを単離するのに用いる可溶性ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターの構築を説明するものである。ヒトｈｅｋ ｃＤＮＡについてのＤＮＡ配列及びコードされるアミノ酸配列は、Wicksら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:1611,1992）に示されており、これは参照によりここに組み入れられるものとする。このｈｅｋタンパク質は、（Ｎ−末端からＣ−末端までに）細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む。
一方はｈｅｋの細胞外ドメインのＮ−末端断片をコードし、他方はそのｈｅｋ細胞外ドメインのＣ−末端断片をコードする２つのＤＮＡ断片を、Wicksらの前記文献により公表されたｈｅｋヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いて標準的な条件下で行った複製連鎖反応（ＰＣＲ）により単離した。このＰＣＲ用の鋳型は、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２０.１）と名付けられたヒトＴ細胞白血病細胞系から単離されたｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡであった。ｈｅｋ ＤＮＡの５'末端を含有するＰＣＲ産物をＳｐｅＩとＨｉｎｄIIIで消化して、成熟ヒトｈｅｋ配列（即ち、シグナル配列をコードするＤＮＡを欠いている配列）の５'末端からこのｈｅｋ遺伝子中に見出されるＨｉｎｄIII部位までに及ぶＤＮＡ断片を単離した。ｈｅｋ細胞外ドメインＤＮＡの３'末端を含有するＰＣＲ産物はＨｉｎｄIIIとＣｌａＩで消化して、ｈｅｋ細胞外ドメインをコードする配列の内側にあるＨｉｎｄIII部位から３'末端のすぐ下流のＣｌａＩ部位までに及ぶ断片を単離した。このＣｌａＩ部位は、この細胞外ドメインのすぐ下流に導入された多クローニング部位（ＭＣＳ）内にある。
ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分の突然変異タンパク質をコードするＤＮＡを単離した。このＦｃ突然変異タンパク質ＤＮＡ及びそれによりコードされるポリペプチドは、１９９３年７月２３日出願の“Novel Cytokine Which is a Ligand for OX40”と題された米国特許出願第０８／０９７,８２７号に記載れている。なお、この出願は参照によりここに組み入れられるものとする。この突然変異タンパク質ＤＮＡを、本質的にDengとNickoloff,Anal.Biochem.200:81(1992)に記載された通りに行った部位特異的突然変異誘発法により、天然ＦｃポリペプチドコーディングＤＮＡから誘導した。このＦｃ突然変異ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変換され、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変換され、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変換されている以外は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１１５に記載された天然Ｆｃポリペプチドの配列と同一である。この突然変異タンパク質Ｆｃは、イムノグロブリンレセプターに対して低い親和性しか示さない。
Ｆｃ突然変異タンパク質ＤＮＡを含有する組換えベクターをＣｌａＩ及びＮｏｔＩで開裂した。これらは、それぞれ該Ｆｃ突然変異タンパク質ＤＮＡ挿入物のすぐ上流と下流のポリリンカー領域内でこのベクターを開裂する。所期のＦｃ突然変異タンパク質コーディング断片を単離した。
この突然変異タンパク質Ｆｃポリペプチドは、Ｎ−末端ヒンジ部から天然Ｃ−末端に及ぶ、即ち、本質的に完全長の抗体Ｆｃ領域である。Ｆｃ領域の断片、例えば、Ｃ−末端の先端を切り取られた断片を用いることもできる。これら断片は、好ましくは、２の別々のｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃポリペプチド部分の間に鎖間ジスルフィド結合を形成してダイマーを生成できる多数のシステイン残基（少なくともヒンジ部内におけるシステイン残基）を含有する。
ＳＭＡＧ４と名付けられた哺乳動物発現ベクターをＳｐｅＩとＮｏｔＩで開裂した。このＳＭＡＧ４ベクターは、大腸菌内でも複製できる哺乳動物高発現ベクターｐＤＣ２０１（Simsら，Science 241:858,1988及びＰＣＴ出願ＷＯ８９／０３８８４に記載されている）内に挿入されたマウスインターロイキン−７シグナルペプチドコーディング配列（米国特許第４,９６５,１９５号に記載されている）を含む。ＳｐｅＩは、ＩＬ−７シグナルペプチドコーディング配列のすぐ下流で開裂する。ＮｏｔＩは、このベクターの多クローニング部位内のＳｐｅＩ部位の約１５５ｂｐ下流でこのベクターを開裂する。このベクター配列を含有する大きなＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ断片及びＩＬ−７シグナルペプチドコーディングＤＮＡを単離した。
４元連結を行って２つのｈｅｋコーディングＤＮＡ断片及び上記のＦｃ突然変異タンパク質コーディングＤＮＡ断片をこのＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ開裂ＳＭＡＧ４発現ベクター内に挿入した。大腸菌細胞をこの連結混合液で形質転換して、所期の組換えベクターをそれから単離した。この単離ベクターは、（Ｎ−末端からＣ−末端までに）マウスＩＬ−７シグナルペプチド、ｈｅｋ細胞該ドメイン、導入したｍｃｓによりコードされる４アミノ酸、及びＦｃ突然変異タンパク質を含む融合タンパク質をコードする。
次いで、この発現ベクターをプラスミドｐＳＶ３.ＮＥＯと共にＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞内に同時形質移入した。このＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４７８）は、McMahanら（EMBO J.10:2821,1991）に記載された通りにサル腎臓細胞系から誘導されたものである。ベクターｐＳＶ３.ＮＥＯは、この宿主細胞によっては産生されないＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する。このｐＳＶ３.ＮＥＯベクターは、ｐＳＶ３（MulliganとBerg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072,1981）に類似しているが、更にネオマイシン耐性遺伝子を含有する。これら形質転換細胞を培養してその融合タンパク質を一過性発現させたところ、ＩＬ−７シグナルペプチドにより培養基中に分泌された。この融合タンパク質をプロテインＡセファロースカラムで精製し、溶出させ、そして実施例２及び３に記載する通り、ｈｅｋ／Ｆｃタンパク質に結合する能力について細胞をスクリーニングするのに用いた。
実施例２：ｈｅｋ／Ｆｃ結合についての細胞のスクリーニング
ｈｅｋリガンドをクローン化しようと、種々の細胞型をｈｅｋ／Ｆｃに結合する能力についてスクリーニングして、核酸源として有用な候補となる細胞型を同定した。細胞を実施例１で調製したｈｅｋ／Ｆｃタンパク質とインキュベートしてから、ビオチニル化マウス抗ヒトＦｃ抗体に続いて、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（Becton Dickinson）とインキュベートした。細胞を各工程間で洗浄して未結合試薬を除いた。このビオチニル化抗体は、Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PAから購入したものである。この抗体は、Ｆｃγレセプターに結合したＦｃタンパク質に僅かな結合性しか示さなかった。ストレプトアビジンは、ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分に結合している抗ヒトＦｃ抗体に結合したビオチン分子に結合する。フィコエリトリンは、検出可能標識として役立つ蛍光性フィコビリタンパク質である。この標識の蛍光信号を各細胞型についてＦＡＣＳcan▲R▼フローサイトメーターを用いて測定した。
ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２０.１）と名付けられたヒトＴ細胞白血病細胞系がｈｅｋ／Ｆｃ結合について陽性であった。ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）により４回選別して、より高いレベルのｈｅｋ／Ｆｃ結合性タンパク質を発現する細胞を引き出した。
実施例３：ｈｅｋリガンドｃＤＮＡの単離
４回選別ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２細胞からｍＲＮＡを単離し、二本鎖ｃＤＮＡをこのｍＲＮＡ鋳型上で標準的方法により合成した。このｃＤＮＡをHaymerleら（Nucleic Acids Res.14:8615,1986）に記載された方法と類似のアダプター法によりｐＤＣ４１０のＢｇｌ II部位内に連結することにより、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ｐＤＣ４１０は、ｐＤＣ４０６（McMahanら，EMBO J.10:2821,1991）に類似する発現ベクターである。ｐＤＣ４１０では、ｐＤＣ４０６のＥＢＶ複製起点がＳＶ４０大型Ｔ抗原（ＳＶ４０プロモーターから誘導される）をコードするＤＮＡにより置換されている。ｐＤＣ４１０多クローニング部位（ｍｃｓ）は、ｐＤＣ４０６のものとは、それが追加の制限部位及び３つの停止コドン（各リーディングフレーム内に１ずつ）を含有する点で相違している。ｍｃｓの下流のＴ７ポリメラーゼプロモーターは、ｍｃｓ内に挿入されたＤＮＡの配列決定を容易にする。
ｐＤＣ４１０内のｃＤＮＡライブラリーで形質移入した大腸菌株ＤＨ５α細胞をプレートして、プレート当たり約２０００のコロニーとした。コロニーを各プレートから掻き取って、プールし、そして各プールからプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、約２０００コロニーに相当するプールＤＮＡを用いて、不完全集密層のＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（実施例１に記載）を形質移入した。形質移入の前に、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞は、完全培地（１０％(v/v)ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ））内に維持しておき、そして複数の単一ウェル有孔スライド（single-well chambered slide）（Lab-Tek)上に２×５０5細胞／ウェルの密度でプレートしておいた。形質移入には、ＤＥＡＥ−デキストラン処理をしてから、Luthmanら（Nucleic Acids Res.11:1295,1983）及びMcCutchanら（J.Natl.Cancer Inst.41:351,1986）に記載された操作と類似のクロロキン処理をすることを含めた。簡単に説明すると、スライドを１ｍｌヒトフィブロネクチン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）で３０分間前処理した後にＰＢＳで１回洗浄した。粘着細胞層から培地を除去して、６６.６μＭ硫酸クロロキンを含有する１.５ｍｌ完全培地と置き換えた。次いで、０.２ｍｌのＤＮＡ溶液（クロロキンを含有する完全培地中２μｇＤＮＡ,０.５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−デキストラン）をそれら細胞に加えて５時間インキュベートした。インキュベーション後、この培地を除去して、１０％ＤＭＳＯを含有する完全培地の添加によって細胞に２.５〜２０分間衝撃を与えた後、その溶液を新しい完全培地と置き換えた。これら細胞を２〜３日間培養して挿入した配列を一過性発現させた。
ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞の形質移入単層をｈｅｋ−Ｌの発現についてGaeringら（EMBO J.8:3667,1989）のスライドオートラジオグラフィー操作により下記の通りアッセイした。このアッセイに用いるために、マウス抗ヒトＦｃ抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA）をクロラミン−Ｔ法により放射性ヨウ素化した。簡単に説明すると、Ｐ６カラムをメーカーの使用説明書に従って調製した。微小分離管内で、１０μｇの抗体を１０μｌのＰＢＳ中に溶解させた。２０００μＣｉの無担体Ｎａ125Ｉを添加してその溶液をよく混合した。次いで、１５μｌの調製したばかりのクロラミン−Ｔの溶液（０.０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）中３２μｇ／ｍｌ）を添加してその混合液を室温で３０分間インキュベートした。この混合液をすぐにＰ６カラムに適用した。次いで、１００〜１５０μｌ画分の溶出液を採集することによってこのカラムから放射標識抗体を溶出させた。結合培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.２）を含有するＲＰＭＩ１６４０）をピーク画分に添加して各画分の全容量を２ｍｌにした。放射性ヨウ素化により、５〜１０×１０15ｃｐｍ／mmolタンパク質の範囲の比活性が得られた。
スライドオートラジオグラフィーは、次の通りに行った。形質移入ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（有孔スライドに粘着している）を脱脂粉乳を含む結合培地（ＢＭ−ＮＦＤＭ）（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.２）及び５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳を含有するＲＰＭＩ１６４０）で１回洗浄した。次いで、細胞をＢＭ−ＮＦＤＭ（１μｇ／ｍｌ）中でｈｅｋ／Ｆｃ（実施例１で調製したもの）と室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、これら有孔スライド内の細胞単層をＢＭ／ＮＦＤＭで３回洗浄して未結合ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質を除去してから、４０ｎｇ／ｍｌ125Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体（１：５０希釈液）と室温で１時間インキュベートした。これら細胞をＢＭ−ＮＦＤＭで３回洗浄した後、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄して未結合125Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体を除去した。細胞をＰＢＳ（ｐＨ７.３）中の２.５％グルタルアルデヒド中で室温で３０分間インキュベートすることにより固定し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして風乾した。これら細胞を含有する有孔スライドをPhosphorimager（Molecular Dynamics）上で一晩露光してから、コダックＧＴＮＢ−２写真乳剤（６倍水希釈液）に浸して暗室内で３〜５日間４℃で遮光ボックス内で露光した。次いで、これらスライドをコダックＤ１９現像剤（４０ｇ／５００ｍｌ水）中で約４分間現像し、水中で濯ぎ、そしてAgfaＧ４３３Ｃ定着液中で定着させた。これらスライドを２５〜４０の倍率の顕微鏡で個別に検査して、明るい背景と対照的なオートラジオグラフィーの銀粒子の存在により、ｈｅｋ−Ｌを発現する陽性細胞を同定した。
約２,０００ｃＤＮＡの複数プール中の約３００,０００ｃＤＮＡをスクリーニングして、ｈｅｋ／Ｆｃ結合について陽性の多数の細胞を示す形質移入体プールを同定した。次いで、陽性プールを５００のプールに分配し、そしてスライドオートラジオグラフィーにより再度スクリーニングした。陽性プールを同定し、１００のプールに分配し、そして同じ操作によりスクリーニングした。陽性プールからの個々のコロニーを、検出可能なｈｅｋ／Ｆｃ結合活性を有する表面タンパク質の合成を行う単一クローン（クローン＃Ａ２）が同定されるまでスクリーニングした。Ｃ６と名付けた第２クローンを異なる陽性プールから単離した。両方のクローンのｃＤＮＡ挿入物を配列決定した。
クローンＡ２のヒトｈｅｋリガンドｃＤＮＡのコーディング領域のヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号：１及び配列番号：２に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端シグナルペプチド（アミノ酸−１９〜−１）、細胞外ドメイン（アミノ酸１〜２０２）、及び疎水性領域を含有するＣ−末端ドメイン（アミノ酸２０３〜２１９）を含む。
ヒトｈｅｋ−Ｌ ｃＤＮＡをＢｇｌ IIでの消化によってクローンＡ２から切り出した。この切り出したｃＤＮＡをpBLUESCRIPT▲R▼SK(-)（Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA）の（多クローニング部位内の）ＢａｍＨＩ部位内にクローン化した。大腸菌ＤＨ５α細胞内のこの得られたベクター（Ａ２／ｐＢＳと名付けた）を、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９３年８月１１日に寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６９３８４が付与された。この寄託はブダペスト条約の規定の下に行った。
クローンＣ６のヒトｈｅｋリガンドｃＤＮＡのコーディング領域のヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号：３及び配列番号：４に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端シグナルペプチド（アミノ酸−２２〜−１）、細胞外ドメイン（アミノ酸１〜１６０）、及び疎水性領域を含有するＣ−末端ドメイン（アミノ酸１６１〜１７９）を含む。
ヒトｈｅｋ−Ｌ ｃＤＮＡをＢｇｌ IIでの消化によってクローンＣ６から切り出して、pBLUESCRIPT▲R▼SK(-)のＢａｍＨＩ部位内に挿入した。大腸菌ＤＨ５α細胞内のこの得られたベクター（Ｃ６／ｐＢＳと名付けた）を、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９３年８月２５日に寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６９３９５が付与された。この寄託はブダペスト条約の規定の下に行った。
熟練した技術者には分かるであろうが、ｈｅｋ−Ｌタンパク質のドメインの上記の境界は凡そのものである。例えば、クローンＡ２によりコードされるｈｅｋ−Ｌに関して、そのシグナルペプチドはアミノ酸−１９〜−１を殆ど間違いなく含んでいるだろうが、アミノ酸−１９から３までがそのシグナルペプチドを構成していることもあり得る。かくして、シグナルペプチドの開裂は、アミノ酸−１と１の間か又はアミノ酸３と４の間か又は両方の位置で起こり得る。クローンＡ２がコードするｈｅｋ−Ｌに関連してここで用いた“シグナルペプチド”及び“成熟タンパク質”という用語は、クローンＡ２又はＣ６によりコードされるｈｅｋ−Ｌポリペプチドについてここに記載した両方のいずれかのものを包含するだけでなく他のいずれかのものも包含することが了解される。
クローンＡ２及びＣ６によりコードされるｈｅｋ−Ｌタンパク質は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）基を介して細胞膜に結合していることが分かった。かくして、その疎水性ドメインは、ＧＰＩ係留のためのシグナルを含有すると考えられる。Ｃ−末端配列の開裂を含む、ＧＰＩ係留をもたらすためのタンパク質のプロセシングは上で説明されている。
実施例４：ｈｅｋ−Ｌに対するモノクローナル抗体
この実施例は、ｈｅｋ−Ｌに対するモノクローナル抗体の調製を説明するものである。ｈｅｋ−ＬをＣＯＳ−７又はＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞の如き哺乳動物宿主細胞内で発現させ、そしてｈｅｋ／Ｆｃアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製する。精製したｈｅｋ−Ｌ（又は細胞外ドメインの如きその断片又はその免疫原性ペプチド断片）を、慣用的技術、例えば、米国特許第４,４１１,９９３号に記載された技術を用いてｈｅｋ−Ｌに対するモノクローナル抗体を生成させるのに用いることができる。簡単に説明すると、完全フロイントアジュバント中に乳化させた免疫原としてのｈｅｋ−Ｌでマウスを免疫感作し、そして１０〜１００μｇの範囲の量で皮下又は腹腔内注射する。１０〜１２日後、これら免疫感作動物を完全フロイントアジュバント中に乳化させた追加のｈｅｋ−Ｌでブースター投与する。その後、１〜２週間毎の免疫感作スケジュールで、マウスに周期的にブースター投与する。ドットブロットアッセイ又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によってｈｅｋ−Ｌ抗体について試験するために、眼窩後方放血又は尾先端切除により血清サンプルを周期的に採取する。
適切な抗体力価の検出後、生理食塩水中のｈｅｋ−Ｌの静脈内注射を陽性動物に最後に１回行う。３〜４日してから、それら動物を殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をマウスメラノーマ細胞系、例えば、ＮＳ１又は好ましくはＰ３×６３Ａｇ８.６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）と融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成し、それらをＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地中で多数のマイクロタイタープレートにプレートして、未融合細胞、メラノーマハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
これらハイブリドーマ細胞を精製ｈｅｋ−Ｌに対する反応性についてＥＬＩＳＡにより、Engvallら，Immunochem.8:871,1971及び米国特許第４,７０３,００４号に開示された技術を適合させることによってスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Beckmannら（J.Immunol.144:4212,1990）に記載された抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ｈｅｋ−Ｌモノクローナル抗体を含有する腹水を生成させることができる。また、ハイブリドーマ細胞をin vitroでフラスコ又は回転ビン中で種々の技術によって増殖させることができる。マウス腹水中に産生したモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈殿させた後、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。また、プロテインＡ又はプロテインＧへの抗体の結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーも用いることができ、ｈｅｋ−Ｌへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーも同じく用いることができる。
実施例５：結合性検討
ｈｅｋに対する本発明のｈｅｋリガンドの親和性を測定した。ｈｅｋリガンドは、ｅｌｋとして知られるｈｅｋとは明確に異なるレセプターチロシンキナーゼにも結合することが分かった。ｈｅｋ又はｅｌｋに結合する他の一定のタンパク質の能力も調べた。これら検討は次の通りに行った。
ａ）ｈｅｋ結合
１２ウェルプレート中のＣＶ−１−ＥＢＮＡ−１細胞（実施例１に記載したもの）（２.５×１０5細胞／ウェル）をクローンＡ２又はＣ６（実施例３に記載した発現ベクターｐＤＣ４１０内のクローンＡ２ｃＤＮＡ又はクローンＣ６ｃＤＮＡ）で形質移入した。これら形質移入細胞を２日間培養して細胞膜上に保持されたｈｅｋ−Ｌタンパク質を発現させた。次いで、これら細胞をＢＭ−ＮＦＤＭ（実施例３を参照のこと）で洗浄し、実施例１で調製した種々の濃度のヒトｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質と室温で１時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄し、実施例３で調製した125Ｉ−標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体（４０ｎｇ／ｍｌ）と結合培地中で穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をトリプシン処理によって採取した。全てのアッセイにおいて、125Ｉ抗体の非特異的結合をｈｅｋ／Ｆｃの不存在下で並びにｈｅｋ／Ｆｃ及び２００倍モル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でアッセイした。フリーの及び細胞結合125Ｉ抗体をPackard Autogammaカウンターで定量した。親和性計算値（Scatchard,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949）をMicrovaxコンピューターでＲＳ／１（BBN Software,Boston,MA）を作動させて出した。“空”のｐＤＣ４１０ベクターで形質移入したＣＶ−１−ＥＢＮＡ−１細胞をコントロールとして同結合性検討に含めた。
２種の異なる組換えタンパク質、つまりヒトｅｌｋ−Ｌ及びヒトＢ６１を発現するＣＶ−１ ＥＢＮＡ−１細胞へのｈｅｋ／Ｆｃ結合性も、上記の実験で分析した。これら細胞をｐＤＣ４１０ベクター内のｅｌｋリガンド（ｅｌｋ−Ｌ）ｃＤＮＡ又はＢ６１ｃＤＮＡで形質移入した。発現されたタンパク質は細胞膜に結合していた。
ｅｌｋ−Ｌは、ｈｅｋのようにレセプターチロシンキナーゼのｅｐｈ／ｅｌｋファミリーのメンバーであるｅｌｋとして知られるレセプターに結合する（上の“発明の背景”の節を参照のこと）。ｅｌｋ−Ｌは、それが同じファミリーの異なるレセプター（即ち、ｈｅｋ）に結合するか否かを調べるためにこの検討に含めた。Ｂ６１として知られるタンパク質は、ＴＮＦにより誘発される新規な即時応答遺伝子（immediate-early response gene）の産物としてヒト臍静脈内皮細胞内で同定されている（Holtzmanら，Mol.Cell.Biol.10:5830,1990）。Ｂ６１は、ｅｌｋ−Ｌに対するその相同性の度合い（アミノ酸レベルで３３％同一）の故にこの検討に含めた。
単離したＢ６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列は、参照によりそっくりそのままここに組み入れられるHoltzmanらの前記文献に示されている。Ｂ６１を産生及び回収する方法も、該タンパク質の一定の構造的特徴及び特性と一緒に記載されている。ｅｌｋ−Ｌ ｃＤＮＡについてのヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列は、１９９２年１１月１３日に出願された係属中の米国特許出願第０７／９７７,６９３号に記載されている。なお、この出願は参照によりそっくりそのままここに組み入れられるものとする。ｅｌｋ−Ｌの産生及び精製も記載されており、該タンパク質の一定の機能性ドメインが同定されている。クローニングベクターpBLUESCRIPT▲R▼SK(-)（Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA）のＳｍａＩ部位（ｍｃｓ内）に挿入したヒトｅｌｋ−Ｌ ｃＤＮＡで形質転換した大腸菌ＤＨ５α細胞を１９９２年１０月９日にＡＴＣＣ６９０８５として寄託した。
この検討の結果は次の通りであった。
ｂ）ｅｌｋ結合
ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質を可溶性ラットｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質に換えて上記の結合性アッセイを繰り返した。ラットｅｌｋについてのヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列は、Lhotakら（Mol.Cell.Biol.11:2496,1991）に示されている。このｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１抗体から誘導される天然Ｆｃ領域ポリペプチドに融合したｅｌｋの細胞外ドメインを含んだ。この（未標識ｅｌｋ／Ｆｃと放射標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる）間接アッセイを用いたのは、ｅｌｋ／Ｆｃの直接放射標識がその結合特異性を不活性化するからであった。
この検討の結果は次の通りであった。
実施例６：相同性
完全長ヒトｅｌｋ−Ｌ、Ｂ６１、ｈｅｋリガンドＡ２、及びｈｅｋリガンドＣ６タンパク質（実施例５で記載したもの）のアミノ酸レベルでの相互の相同性を表IIIに示す。
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：1037塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル：No
（iv）アンチセンス：No
（vii)直接の起源
（Ｂ)クローン名：hek-L A2
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：83..799
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：sig peptide
（Ｂ）存在位置：83..139
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：mat peptide
（Ｂ）存在位置：140.796
（xi）配列；配列番号：１：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：238アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列；配列番号：２：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：636塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル：No
（iv）アンチセンス：No
（vii)直接の起源
（Ｂ)クローン名：hek-L C6
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：mat peptide
（Ｂ）存在位置：94..630
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：28..633
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：sig peptide
（Ｂ）存在位置：28..93
（xi）配列；配列番号：３：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：201アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列；配列番号：４：
Claims (19)
- ｈｅｋに結合することができるｈｅｋリガンド（ｈｅｋ−Ｌ）ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡであって、前記ｈｅｋ−Ｌが下記の
１）配列番号：２の残基１−２１９若しくは１−２０２のアミノ酸配列；
２）配列番号：２の残基１−２１９若しくは１−２０２のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸残基の挿入、置換若しくは欠失を有するアミノ酸配列；及び
３）配列番号：１のヌクレオチド１４０−７９６若しくは１４０−７４５の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、前記ＤＮＡ。 - 前記ｈｅｋ−Ｌポリペプチドが、配列番号：２の残基１−２１９のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたＤＮＡ。
- 前記ｈｅｋ−Ｌポリペプチドが、配列番号：２の残基１−２０２のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたＤＮＡ。
- ｈｅｋ−Ｌポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡであって、前記ｈｅｋ−Ｌポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸ｚないしｘ（ここにおいて、ｚは配列番号２の１ないし１２位中のアミノ酸であり、そして、ｘは配列番号２の１９３ないし２１９位中のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含み、そしてｈｅｋに結合することができる、前記ＤＮＡ。
- 請求項１ないし４のいずれか１項のＤＮＡを含む、発現ベクター。
- ｈｅｋ−Ｌポリペプチドを製造する方法であって、請求項５のベクターで形質転換された宿主細胞をｈｅｋ−Ｌポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、そしてその培養物からｈｅｋ−Ｌポリペプチドを回収する、ことを含む方法。
- ｈｅｋに結合することができる可溶性のｈｅｋ−Ｌ及びＦｃポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡであって、前記ｈｅｋ−Ｌが下記の
１）配列番号：２の残基１−２０２のアミノ酸配列；
２）配列番号：２の残基１−２０２のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸残基の挿入、置換若しくは欠失を有するアミノ酸配列；及び
３）配列番号：１のヌクレオチド１４０−７４５の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、前記ＤＮＡ。 - 請求項７のＤＮＡを含む、発現ベクター。
- ｈｅｋ−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法であって、請求項８のベクターで形質転換された宿主細胞をｈｅｋ−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、そしてその培養物からｈｅｋ−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質を回収する、ことを含む方法。
- ｈｅｋに結合することができる精製されたｈｅｋ−Ｌポリペプチドであって、前記ｈｅｋ−Ｌが下記の
１）配列番号：２の残基１−２１９若しくは１−２０２のアミノ酸配列；
２）配列番号：２の残基１−２１９若しくは１−２０２のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸残基の挿入、置換若しくは欠失を有するアミノ酸配列；及び
３）配列番号：１のヌクレオチド１４０−７９６若しくは１４０−７４５の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド。 - 配列番号：２の残基１−２１９のアミノ酸配列を含む、請求項１０のｈｅｋ−Ｌポリペプチド。
- 配列番号：２の残基１−２０２のアミノ酸配列を含む、請求項１０のｈｅｋ−Ｌポリペプチド。
- 精製されたｈｅｋ−Ｌポリペプチドであって、前記ｈｅｋ−Ｌポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸ｚないしｘ（ここにおいて、ｚは配列番号２の１ないし１２位中のアミノ酸であり、そして、ｘは配列番号２の１９３ないし２１９位中のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含み、そしてｈｅｋに結合することができる、前記ポリペプチド。
- ＡＴＣＣ６９３８４として寄託された形質転換細胞内に含有される組換えベクター内の、配列番号：１からなるｈｅｋ−Ｌ ｃＤＮＡ挿入物によりコードされるｈｅｋ−Ｌタンパク質。
- 請求項７のＤＮＡによりコードされる融合タンパク質。
- 請求項１１のｈｅｋ−Ｌポリペプチド、又は前記ｈｅｋ−Ｌの免疫原性断片と免疫反応性である抗体であって、前記ポリペプチド及び前記免疫原性断片の双方に免疫反応性である前記抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項１７の抗体。
- ｈｅｋに結合することができる可溶性のｈｅｋ−Ｌポリペプチドを２ないし４個含むオリゴマーであって、前記可溶性ｈｅｋ−Ｌポリペプチドの各々は、下記の
１）配列番号：２の残基１−２０２のアミノ酸配列；
２）配列番号：２の残基１−２０２のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸残基の挿入、置換若しくは欠失を有するアミノ酸配列；及び
３）配列番号：１のヌクレオチド１４０−７４５の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、前記オリゴマー。 - ｈｅｋに結合することができる可溶性のｈｅｋ−Ｌポリペプチドを２ないし４個含むオリゴマーであって、前記可溶性ｈｅｋ−Ｌポリペプチドの各々は、配列番号２のアミノ酸ｚないしｘ’（ここにおいて、ｚは配列番号２の１ないし１２位中のアミノ酸であり、そして、ｘ’は配列番号２の１９３ないし２０２位中のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含む、前記オリゴマー。
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