MXPA97004173A - Citoquina designada lcer-7 - Google Patents
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Abstract
La invención se dirige a una proteína designada Lcer-7, ADN que codifica el Lcer-7 y células huésped transformadas con ADN de Lcer-7. También se proveen anticuerpos dirigidos contra Lcer-7. La proteína de Lcer-7 se une a los receptores de superficie celular conocidos como cle y ceh.
Description
CITOQUINA DESIGNADA LCER-7 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas conocidas como el receptor de cinasas de tirosina tienen una actividad de cinasa intrínseca que se activa con la unión del ligando. Esta clase de proteínas se caracteriza por motivos estructurales conservados dentro de los dominios catalíticos (Hanks y otros, Science, 242, 1988) y pueden subdividirse en familias basado en aspectos estructurales de las regiones N-terminales al dominio catalítico. La familia eph de receptores, nombrada después del primer miembro aislado (Hirai y otros, Science 238:1717, 1987) es la subfamilia más larga de receptor de cinasas de tirosina. Entre los miembros de esta familia hay cec4 (Sajjadi y otros, New Biol 3:769, 1991) y cec5 (Pasquale, E.B., Cell Regulation 2: 523, 1991) de pollo; cem4 (Sajjadi y otros, supra), csb (Zhou y otros, J. Neurosci. Res., 37:129, 1994), cun (Henkemeyer y otros, Oncogene 9: 1001, 1994), y ees (Gilradi-Hebenstreit y otros, Oncogene 7:2499, 1992); ele (Letwin y otros, Oncogene 3.:621, 1988; Olhotak y otros, Mol. Cell. Biol. ü:2496, 1991), cee (Chan y otros, Oncogene 6:1057, 1991), che-1 y che-2 (Maisonpierre y otros, Oncogene 8:3277, 1993); de ratas; y ceh (Boyd y otros, J. Biol. Chem., 267:3262. 1992; Wicks y otros, PNAS USA, 89:1611, 1992), ceh2 (Bohme y otros, Oncogene 8:2857, 1993), cce (Lindberg y otros, Mol. Cell. Biol. 1_0:6316, 1990 = y erk (Chan y otros, supra) de humanos.
Las proteínas de esta subfamilia se relacionan no solo en sus dominios citoplásmicos, sino también en sus dominios extracelulares que son de 41 a 68% idénticos, De manera interesante, las distribuciones de tejido de estos diferentes receptores son diversas. Por ejemplo, la expresión de ele mARN se ha reportado que está limitada a testículos y cerebro (Lhotak otros, supra), mientras que cce no solo se encuentra que está en estos dos mismos tejidos, sino también en pulmones, intestino, riñon, bazo, ovarios y piel. Debido a que la mayoría de las cinasas de tirosina de receptor relacionado con eph principalmente se expresan en el cerebro, se ha postulado que estos receptores y sus ligandos pueden estar implicados en el crecimiento, diferenciación y sobrevivencia de neuronas. La glicoproteína de superficie celular designada ceh (cinasa similar a eph/cle de seres humanos) se purificó por Boyd y otros (J. Biol. Chem., 267:3262, 1992). Un anticuerpo monoclonal inmunoreactivo con ceh se uso para estudiar la expresión de ceh en un número de tipos de células humanas (Boyd y otros, supra). El antígeno ceh se detectó en la línea celular de leucemia de células pre-B humanas LK63 (la línea celular empleada como el inmunógeno contra el cual se elevó el anticuerpo) y la línea celular de leucemia de células T humanas, JM. La línea celular de linfoma Raji B mostró expresión de antígenos ceh débil y las líneas celulares restantes probadas (tanto líneas celulares normales como tumorales, entre las cuales las líneas celulares hemopoyéticas incluyeron las líneas de células pre-B y T) fueron consistentemente negativas De los especímenes de biopsia de tejido normal y tumoral que también se probaron para expresión de antígeno ceh, ninguno de los tejidos normales fue positivo y solo una proporción baja de los tumores hematopoyéticos fue positiva. La expresión de transcripciones de ceh en las líneas celulares
LK63 y JM descritas antes, así como la línea celular de leucemia de células T humanas HSB-2, se ha demostrado por análisis de secado Northern (Wicks y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 89:1611, 1992). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para un clon de ADNc de ceh aislado, también se presentaron en Wicks y otros, supra. Un clon parcial de la proteína de superficie celular designada ele, se descubrió primero en un banco de expresión de ADNc de cerebro de rata que se tamizó para proteínas que expresan actividad de cinasa de tirosina (Letwin y otros, Oncogene, 3:621, 1988). Después, una secuencia mixta que mide toda la región de codificación de ele se derivó de clones parciales aislados de un banco de ADNc de cerebro de rata y un banco del cerebro cerebelar de ratas usando el clon parcial como una sonda (Lhotak y otros, Mol. Cell. Biol. 1 .:2496, 1991). Aquellos ligandos que han sido identificados para las cinasas de tirosina del receptor son un grupo diverso de proteínas que afectan el crecimiento, diferenciación y sobrevivencia de células que esperan los receptores. Debido a la homología de los receptores en la familia de eph, un lingando dado para un receptor específico también se puede unir a otros receptores. Se han aislado ligandos para ceh y ele, como se trata con mas detalle en seguida. La identificación de ligandos adicionales para ceh y ele que puede existir, podría probar ser útiles para investigar la naturaleza de procesos celulares regulados por señalamiento a través de estos receptores. Si se desea el aumento o inhibición de una señal biológica particular mediada a través de estos receptores, es ventajoso identificar cada una de las proteínas que puede jugar un papel en la transducción de dichas señales. Además, se sabe que ciertas proteínas pueden unirse a los receptores sin iniciar la transducción de señales, incluyendo proteína de antagonista de receptor de interleucina-1 (Eisenbertg y otros, Nature 343:341 , 1990; Hannum y otros, Nature 343:336, 1990; y Cárter y otros, Nature 344:633, 1990). La identificación de proteínas adicionales que se unen a ceh o ele también es conveniente con el fin de determinar si dichas proteínas funcionan como antagonistas. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a una citoquina novedosa designada Lcer-7. Las proteínas Lcer-7 purificadas se proveen en la presente, junto con ADNc aislado que codifica Lcer-7, vectores de expresión que comprender el ADN Lcer-7 y las células huésped transformadas con los vectores de expresión. Los procesos para producir Lcer-7 incluyen inocular dichas células huésped transformadas bajo condiciones que promueven la expresión de Lcer-7.
Los polipéptidos Lcer-7 se unen a los receptores de superficie celular conocida como ceh, ele, y cce, que se describen antes. La invención también abarca modalidades que se unen específicamente a polipéptidos Lcer-7. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente se provee una citoquina novedosa designada Lcer-7. Esta citoquina se une a las cinasas de tirosina receptora conocidas como ele, ceh y cce. La presente invención abarca ADN que codifica Lcer-7, vectores de expresión que comprenden el ADN de Lcer-7 y células huésped transformadas con los vectores de expresión. Un método para producir polipéptidos Lcer-7 comprenden cultivar las células huésped transformadas bajo condiciones que conducen a la expresión de Lcer-7 y recuperan el Lcer-7 expresado. Se describen polipéptidos de Lcer-7 purificados en forma soluble y unida a membrana. Los polipéptidos de Lcer-7 o fragmentos inmunogénicos de los mismos, se pueden emplear como inmunógenos para generar anticuerpos que son inmuoreactivos con los mismos. En una modalidad de la invención, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. El ADNc que codifica Lcer-7 de seres humanos se ha aislado de un banco de ADNc de cerebro fetal de humanos como se describe en el ejemplo 1. La secuencia de nucleótidos de la región de codificación de este ADNc de Lcer-7 se presenta en SEC ID NO.4 y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma se presenta en SEC ID NO:5. Esta proteína Lcer-7 comprende un péptido de señal N-terminal (aminoácidos de -20 a -1 de SEC ID NO:5), un dominio de unión de receptor extracelular (aminoácidos de 1 a 133), una región separadora (aminoácidos 134 a 183) y un tramo C-terminal de residuos hidrofóbicos (aminoácidos 194-208). Se prevé que Lcer-7 se fija a la superficie celular vía unión de glicosil-fosfatidilinositol (GPI). Los sujetadores de membrana de GPI, incluyendo la estructura química y procesamiento de los mismos, se describen en Ferguson. M. y A. Williams, Rev. Biochem., 57: 285, 1988 (incorporada aquí por referencia). Cuando se expresó inicialmente, ciertas proteínas comprenden un dominio hidrofóbico C-terminal que contiene señales para sujeción de GPI. Un sitio de separación está localizado corriente arriba, con frecuencia de alrededor de 10-12 aminoácidos corriente arriba de la terminación N del dominio hidrofóbico. El procesamiento post-traslacional incluye separación de la proteína en este sitio de separación, Un sujetador de GPI se une al aminoácido C-terminal recién expuesto de la proteína procesada, madura. Por lo tanto, cuando se expresan las proteínas Lcer-7 en células que reconocen señales de sujeción de GPI, toda la longitud de secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:5 representa una forma de precursor de la proteína. El sitio de unión de GPI previsto en la proteína Lcer-7 es el residuo de asparagina en la posición 183. Después de separar la proteína (durante el procesamiento post-traslacional), este residuo de asparagina se vuelve la terminación C de la proteína procesada. Una porción de GPI se une a este residuo de asparagina. Esta predicción del sitio de separación probable está basado en secuencias de consenso encontradas en otras proteínas sujetas por GPI. Es posible que la separación se presente en otro lugar corriente arriba de la región hidrofóbica. La presente invención provee ambas formas unida a membrana celular y soluble (secretada) de Lcer-7. Los polipéptidos de Lcer-7 solubles incluye el dominio de unión por el receptor de un Lcer-7 nativo, pero carece de la señal de GPI que podría ocasionar retención del polipéptido en una membrana celular. Los polipéptidos de Lcer-7 solubles abarcados por la invención, retienen la capacidad de unirse al receptor che o ele. El Lcer-7 soluble también puede incluir la región separadora o parte del dominio hidrofóbico, siempre y cuando se pueda secretar la proteína soluble Lcer-7. Lcer-7 soluble puede identificarse (y distinguirse de sus contrapartes unidas por membrana no solubles) separando las células intactas que expresan un polipéptido Lcer-7 del medio de cultivo, v.gr., por centrifugación y analizando el medio (sobrenadante) para la presencia de la proteína deseada. La presencia de Lcer-7 en el medio indica que la proteína se secretó de las células y, por lo tanto, es una forma soluble de la proteína deseada. Las formas solubles de Lcer-7 poseen ciertas ventajas sobre la forma unida por membrana de la proteína. Se facilita la purificación de la proteína de las células huésped recombinantes, dado que las proteínas se secretan de las células. Además, las proteínas solubles generalmente son más adecuadas para ciertas aplicaciones, v.gr., para administración intravenosa. Las proteínas Lcer-7 solubles se truncan en la terminación C.
La supresión del dominio hidrofóbico se piensa que es suficiente para evitar la sujeción con GPI de la proteína a la membrana celular, aunque la proteína puede ser truncada adicionalmente para suprimir el aminoácido que constituye el sitio de unión de GPI. Ejemplos de polipéptidos de Lcer-7 humanos solubles incluyen, pero no están limitado a, polipéptidos truncados en la terminación C de manera que el aminoácido C-terminal es uno de aquellos entre o incluyendo los residuos en las posiciones 133 y 193 de la SEC ID NO:5. En modalidades particulares, los polipéptidos Lcer-7 solubles incluyen aquellos que comprenden aminoácidos 1-133, 1-182, 1-185 o 1-193 de SEC ID NO: 5. Para ilustrar una modalidad, se preparó un vector de expresión que codifica una proteína de fusión recombinante comprendiendo los aminoácidos -20 a 185 de SEC ID NO:5, seguido por un péptido codificado por una secuencia de sitio de clonación de vectores múltiples, seguido por un polipéptido de región de Fe (derivado de un anticuerpo). Esta proteína de fusión se secretó de las células huésped en las cuales se expresión y exhibió actividad biológica como se evidencia uniéndose a cce. En otra alternativa, el polipéptido soluble es un fragmento del dominio de unión del receptor Lcer-7 que tiene la capacidad de unir ele o ceh.
Cuando se expresa inicialmente dentro de una célula huésped, los polipéptidos Lcer-7 solubles comprenden ventajosamente el péptido de señal nativa o uno de los péptidos de señal heteróloga descritos en seguida que es funcional dentro de las células huésped empleadas. La presente invención abarca secuencias de ADN aisladas que codifican proteínas Lcer-7 solubles. Los fragmentos de Lcer-7, incluyendo polipéptidos solubles, se pueden preparar mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales. Una secuencia de ADN que codifica un Lcer-7 truncado puede sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas. También se pueden producir fragmentos de ADN mediante digestión de endonucleasa de restricción de una secuencia de ADN clonado de longitud completa y aislare mediante electroforesis en geles de agarosa. Se pueden usar los oligonucleótidos que reconstruyen las terminaciones 5' o 3' de un fragmento de ADN a un punto deseado. Se pueden emplear eslabonadores que contienen sitio(s) de separación de endonucleasa de restricción para insertar el fragmento deseado de ADN en un vector de expresión. También se puede emplear el procedimiento de reacción de cadena de polimerasa (RCP) para amplificar un fragmento de ADN codificando un fragmento particular de proteína. Los iniciadores que definen las terminaciones deseadas del fragmento de ADN se emplean en la RCP. Como una alternativa adicional, se pueden emplear técnicas de mutagénesis conocidas para insertar un codón sin sentido en un punto deseado, v.gr., inmediatamente corriente abajo del codón para el último aminoácido del dominio de unión por el receptor. Se han descubierto otras proteínas que se unen tanto a ceh como a ele y se designan Lcer-1 a Lcer-6 (Mgandos de las cinasas relacionadas con e_ph). Los Leer 2 y 5 son proteínas de transmembrana del tipo 1, mientras que las Lcers 1, 3, 4, y 6 se sujeta a la membrana celular por eslabonamiento de BPI. La identidad porcentual de las secuencias de aminoácidos de estas seis proteínas varío de 30 a 59% y las proteínas tiene cada una cuatro residuos de cisteína conservados. Las siguientes referencias y solicitudes de patentes que describen Lcers 1-6 se incorporan aquí por referencia. Holzman y otros (Mol. Cell. Biol. 10:5830, 1990) reportó la clonación de ADNc para una proteína llamada B61. La capacidad de B61 para unirse a ele y a ceh se descubrió subsecuentemente y a la proteína B61 se le dio una designación alternativa Lcer-1 (Beckmann y otros, EMBO J. 13:3757, 1994). También se ha reportado que B61 es un ligando para la cinasa de tirosina receptora descrita antes conocida como cce (Bartley y otros, Nature 368:558, 1994). Lcer-2, también conocido como ligando ele, se describió en la solicitud de PCT WO 94/11384. Ambas Lcer-3 y Lcer-4 se describen en la solicitud de patente copendiente Serie No. 08/240,124, presentada el 9 de mayo de 1994. Lcer-5 se describió en la solicitud de patente copendiente Serie No. 08/271,948, presentada el 8 de julio de 1994.
El ADN y proteínas de Lcer-6 se describieron en la solicitud copendiente de E.U.A. Serie no. 08/318,393, presentada el 5 de octubre de 1994. Un clon de ADNc de Lcer-6 de murinos designado ?13 se asiló de un banco de ADNc embriónico de murinos de 11.5 días. Una secuencia substancialmente completa de ADN de la región de codificación del clon ?13 de ADNc y la secuencia de aminoácidos por o tanto codificada, se presentan en la presente en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2, respectivamente. El marco de lectura abierto dentro de esta secuencia codifica una proteína de 184 aminoácidos. El primer aminoácido de SEC ID NO:2 (Ala) se piensa que está localizado en o muy cerca de la terminación N natura. Un lisato de células que contiene el ADN del clon ?13 (el ADNc de Lcer-6 en ?gt10) fue depositado en American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA el 15 de julio de 1994 y se le asignó el número de acceso ATCC 75829. El ADNc de Lcer-7 de humanos de la presente invención se descubrió durante un intento para aislar ADNc que codifica el homólogo humano de Lcer-6 de murinos. Un fragmento de ADN de Lcer-6 de ratón se usó como una sonda para tamizar un banco de ADNc humano en un intento para clonar Lcer-6 humano. Sorprendentemente, un clon de ADNc aislado codificó una proteína novedosa, el Lcer-7 de la presente invención. La identidad porcentual de la secuencia de aminoácidos de Lcer-7 humano de SEC ID NO:5 con una secuencia de aminoácidos de longitud completa de varias proteínas diferentes es la siguiente, en donde "h" representa humano, "m" representa ratón y "r" representa rata: h Lcer-1 45.771 h Lcer-2 27.602 r Lcer-2 25.676 m Lcer-2 26.126 h Lcer-3 42.342 h Lcer-4 42.000 h Lcer-5 25.792 m Lcer-5 25.114 m Lcer-6 55.330 Como se usa en la presente, el término "Lcer-7" se refiere a un género de polipéptídos que son substancialmente homólogos a la proteína Lcer-7 humana descrita en el ejemplo 1. Los polipéptidos preferiblemente comprenden una secuencia de aminoácidos que por lo menos es 80% idéntica y más preferiblemente 94% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:5, como se describe adicionalmente en seguida. Los polipéptidos de Lcer-7 son capaces de unir los receptores descritos antes designados ceh y ele. ciertos usos de Lcer-7 fluyen de su capacidad para unirse a ele o ceh, como se describe en mas detalle más adelante. Lcer-7 también se une al receptor designado cce (para cinasa de células epiteliales), la cual se describe en Lindberg y Hunter (Mol. Cell. Biol. 70:6316, 1990), incorporada aquí por referencia, cce se expresa predominantemente en líneas celulares de origen epitelial y en tejidos que contienen una proporción significativa de células epiteliales (Lindberg y Hunter, supra). Las células que expresan cce incluyen tipos de células tanto normales como cancerígenas (Lindberg y Hunter, supra). Los usos adicionales de Lcer-7 fluyen de su capacidad para unirse a cce, como se describe más adelante. Los ácidos nucleicos y proteínas de Lcer-7 humano se proporcionan en la presente. También dentro del alcance de la presente invención están los ácidos nucleicos y proteínas de Lcer-7 derivados de otras especies de mamíferos que incluyen pero no están limitados a murinos, bovinos, porcinos, equinos o varias especiales de primates. Los polipéptidos de Lcer-7 provistos en la presente incluyen variantes de polipéptidos de Lcer-7 nativos que retienen una actividad biológica de un Lcer-7 nativo. El término "variantes de Lcer-7" como se usan en la presente, se refiere a polipéptidos que substancialmente son homólogos a Lcer-7 nativo, pero que tienen una secuencia de aminoácidos diferente de la de un Lcer-7 nativo debido a una o más supresiones, inserciones o substituciones. Así mismos, el Lcer-7 que codifica ADNs de la presente invención, incluyen variantes que difieren de una secuencia de ADN de Lcer-7 nativo debido a una o más supresiones, inserciones o substituciones, pero que codifican un polipéptido Lcer-7 nativo. El término "biológicamente activo" en cuanto a lo que se refiere a Lcer-7, indica que Lcer-7 es capaz de unirse a ceh o ele.
La variante de ADN o secuencias de aminoácidos variantes preferiblemente son por lo menos 80% idénticas a una secuencia de Lcer-7 nativa, más preferiblemente por lo menos 90% idénticas. La identidad porcentual se puede determinar por ejemplo, comparando información de secuencias usando el programa de computación GAP, versión 6.0 descrita por Devereux y otros (Nucí. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros preferidos por omisión para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (conteniendo un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos y la matriz de comparación evaluada de Gricsbov y Burgess, Nucí. Acids Res. 14:6745, 1986, como se describió por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pags. 353-358, 1979; (2) una desventaja de 3.0 por cada espacio y una desventaja de 0.10 adicional por cada símbolo en cada espacio; y (3) ninguna desventaja para espacios extremos. La variante de polipéptidos Lcer-7 incluyen por lo tanto, fragmentos de Lcer-7 que retienen la capacidad de unir ceh o ele. Ejemplos de polipéptidos de Lcer-7 truncados dentro del alcance de la presente invención son polipéptidos solubles (secretados). Las modalidades adicionales de secuencias de aminoácidos variables son aquellas que comprenden substituciones conservadores, significando que un residuo de aminoácido dado se reemplaza por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. Ejemplos de substituciones conservadoras incluyen substitución de un resido alifático por otro, tal como lie, Val, Leu, o Ala unos por otros, o substituciones de un residuo polar por otro, así como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras substituciones conservadoras, por ejemplo, substituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas. Un Lcer-7 que contiene substitución(es) de aminoácidos, se considera en la presente por ser conservadoramente substituido cuando el polipéptido no nativo resultante retiene una actividad biológica deseada de Lcer-7 nativo. La invención además incluye polipéptidos de Lcer-7 con o sin glicosilación de patrón nativo asociado. Lcer-7 expresado en levadura o sistemas de expresión de mamíferos (v.gr., células COS-7) puede ser similar a, o significativamente diferente de un polipéptido de Lcer-7 nativo en peso molecular y patrón de glicosilación dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos de Lcer-7 de expresión en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, provee moléculas no glicosiladas. Los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular de Lcer- 7 pueden modificarse para impedir la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de carbohidrato reducido, más homogéneo, en sistemas de expresión de mamíferos y levadura. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triple de aminoácido Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Por y Y es Ser o Thr. La proteína Lcer-7 humana de SEC ID NO: 5 comprende uno de dichos tripletes, en los aminoácidos 17-19 de SEC ID NO: 5. Las substituciones, adiciones o supresiones apropiadas para la secuencia de nucleicos que codifica estos tripletes dará como resultado la prevención de unión de residuos de carbohidratos a la cadena lateral de ASN. La alteración de un nucleótido sencillo, elegido de manera que Asn se reemplaza por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Los procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen aquellos descritos en la Patente de E.U.A. 5,071,972 y EP 276,846, incorporada aquí por referencia. En otro ejemplo de variantes, las secuencias que codifican residuos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden alterarse para ocasionar que los residuos de Cys sean borrados o reemplazados con otros aminoácidos, evitando la formación de puentes de disulfuro intramolecular incorrectos durante la renaturalización. Los residuos de cisteína que corresponden a las cuatro cisteínas que se conservan entre las proteínas de Leer y se encuentran en las posiciones 42, 70, 82 y 131 de SEC ID NO:5. Para mantener la actividad biológica de la proteína nativa, estas cuatro cisteínas permanecen deseablemente no alteradas. Otras variantes se preparan mediante la modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para incrementar a expresión en sistemas de levaduras en los cuales está presente la actividad de proteasa KEX2. La EP 212,914 describe el uso de mutagénesis específica para sitio para inactivar los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de proteasa de KEX2 se inactivan suprimiendo, añadiendo o substituyendo residuos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg con el fin de eliminar la presentación de estos residuos básicos adyacentes. Los pares de Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la separación de KEX2 y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys, representa un enfoque conservador y preferido para inactivar los sitios KEX2. El Lcer-7 humano contiene dos sitios de procesamiento de proteasa KEX2, en los aminoácidos 78-79 y 128-129 de SEC ID NO:5. Las variantes o alelos de Lcer-7 presentes en la naturaleza, también .están abarcados por la invención. Ejemplos de dichas variantes son proteínas que resultan de los eventos de división de ARNm alterno o de separación proteolítíca de la proteína Lcer-7, en donde se retiene la propiedad de unión con ele o hec. La división alterna de ARMn puede dar una proteína de Lcer-7 truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble presente en la naturaleza de la proteína, por ejemplo. Las variaciones que se atribuyen a la proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en las terminaciones N o C durante la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la remoción proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína Lcer-7 (generalmente de los aminoácidos 1-5 terminales).
Con respecto a la discusión anterior del péptido de señalamiento y varios dominios de la proteína de Lcer-7, el artesano experto reconocerá que los límites descritos antes de dichas regiones de la proteína son aproximados. Por ejemplo, aunque están disponibles los programas de computadora que predicen el sitio de separación de un péptido de señalamiento, puede presentarse la separación en sitios diferentes a aquellos previstos. Además, se reconoce que una preparación de proteína puede comprender una mezcla de moléculas de proteína que tienen diferentes aminoácidos N-terminales, debido a la separación del péptido de señalamiento en más de un sitio. Además, el procesamiento post-traslacional puede variar de acuerdo con el sistema de expresión particular empleado. Por lo tanto, el aminoácido N- o C-terminal de una proteína recombinante puede variar, por ejemplo, de acuerdo con el tipo de células huésped en las cuales se expresó la proteína. Las variantes y derivados de proteínas de Lcer-7 nativos pueden prepararse por mutación de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de Lcer-7 nativos. Las mutaciones pueden introduciré en lugares particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, confinada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, substitución o supresión de aminoácidos deseados. Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específicos de sitio dirigidos a oligonucleótidos para introducir una mutación deseada. Los método para hacer dichas alteraciones incluyen aquellas descritas por Walder y otros (Gene 42.: 133, 1986); Bauer y otros (Gene 37:73. 1985) Graik (BioTechniques, Enero de 1985, 12-19); Smith y otros, (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Ntl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel y otros (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); y Patentes de E.U.A. Nos. 4,518,584 y 4,737,462. Lcer-7 se puede modificar para crear derivados de Lcer-7 formando conjugados covalentes o agregados con otras porciones químicas, tales como grupos de glícosilo, lípidos, fosfato, grupos de acetilo y similares. Los derivados covalentes de Lcer-7 pueden preparase uniendo las porciones químicas a grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos de Lcer-7 o en la terminación N o terminación C de un polipéptido de Lcer-7 o el dominio extracelular de los mismos. Otros derivados de Lcer-7 dentro del alcance de esa invención incluyen conjugados covalentes o agregados de polipéptidos de Lcer-7 con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante síntesis en cultivo recombinante con fusiones N-terminales o C-terminales. Las fusiones de polipéptidos de Lcer-7 pueden comprender péptidos adicionados para facilitar la purificación e identificación de Lcer-7. Dichos péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de indentificación antigénica descritos en la Patente de E.U.A. NO.
,011,912 y en Hopp y otros, Bio/Technology 6: 124, 1988. Uno de dichos péptidos es el péptido de Flag®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que es altamente antigénico y provee un epítope unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo el análisis rápido y fácil purificación de proteína recombinante expresada. Un hibridoma de murinos designado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que une el péptido Flag® en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la Patente de E.U.A. 5,011,912, incorporada aquí por referencia. La línea celular del hibridoma 4E11 se ha depositado con la American Type Culture Collection bajo el acceso no. HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se unen al péptido de Flag® están disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems División, New Haven, Connecticut. Debido a la degeneración conocida del código genérico, en donde más de un codón puede codificar los mismos aminoácidos, una secuencia de ADN puede variar de la mostrada en la SEC ID NO: 4 y aún codificar una proteína Lcer-7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5. Dichas variantes de secuencias de ADN pueden resultar de mutaciones silenciosas (v.gr., que se presentan durante la amplificación de PCR) o pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa. La presente invención provee por lo tanto secuencias de ADN seleccionadas de secuencias de ADN de Lcer-7 (v.gr., ADNc que comprenden la secuencia de nucleótidos presentadas en SEC ID NO: 4) y ADN que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de ADN de Lcer-7. Las variantes de Lcer-7 que tienen la capacidad de unirse a ceh o ele pueden identificarse mediante cualquier análisis adecuado. La actividad biológica de una variante de Lcer-7 puede determinarse, por ejemplo, analizando la capacidad de la variante para compararse con un Lcer-7 nativo para unirse a ceh o ele (es decir, análisis de unión competitivo). El análisis de unión competitivo puede realizarse siguiendo la metodología convencional. Los reactivos que pueden emplearse en análisis de unión competitivos, incluyen Lcer-7 soluble, radiomarcado y células de expresión de ceh/cle intactas. Por ejemplo, el Lcer-7 nativo radiomarcado puede usarse para compararse con una variante de Lcer-7 para unirse a ceh o ele unidos a la superficie celular. En lugar de células intactas, se podría substituir una proteína de fusión de ceh-Fc o cle/Fc soluble unida a una fase sólida a través de la interacción de Proteína A o Proteína G con la porción de Fe. Las columnas de cromatografía que contienen Proteína A y Proteína G incluyen aquellas disponibles de Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ. Otro tipo de análisis de unión competitivo utiliza ceh o ele soluble radiomarcado, tal como una proteína de fusión de ceh/Fc o cle/Fc soluble y células intactas que expresan Lcer-7. Se pueden obtener resultados cualitativos mediante análisis de unión de placa autoradiográficos o se pueden usar gráficas de Scarchard para generar resultados cuantitativos. La actividad biológica de una proteína Lcer-7 nativa o fragmento de la misma expresada en un sistema de expresión particular puede confirmarse usando análisis de unión de competencia. Por ejemplo, se puede analizar el Lcer-7 para la capacidad de competir con una de las otras proteínas de Leer (v.gr., Lcer-6) para unirse a ele o ceh. Lcer-7 también se une al receptor conocido como cce (Lindberg y Hunter, Mol. Cell. Biol. 70:6316, 1990). Es posible que el Lcer-7 de la presente invención se una a otros receptores de la familia de eph (ver la sección anterior). Dicha unión puede analizarse usando un análogo de análisis adecuado a aquellos descritos antes y en los ejemplo s4 y 7. Los usos de Lcer-7 que fluyen de la capacidad para unirse a ele, ceh, y cce, incluyen pero no están limitados lo siguiente. Lcer-7 encuentra uso como un reactivo de purificación de proteínas. Los polipéptidos de Lcer-7 pueden unirse a un material de soporte sólido y usarse para purificar proteínas de ceh, ele, o cce mediante cromatografía de afinidad. En ciertas modalidades, los fragmentos de Lcer-7 o proteínas de fusión (v.gr., fusiones de Lcer-7/Fc) que contienen el dominio de unión con el receptor de Lcer-7 se unen al soporte sólido. Los polipéptidos de Lcer-7 pueden unirse a un material de soporte sólido mediante procedimientos convencionales. Como un ejemplo, las columnas de cromatografía que contienen grupos funcionales que reaccionarán con grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos de proteínas están disponibles (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Las proteínas de fusión Lcer-7/Fc se pueden unir a las columnas de cromatografía que contienen Proteína A o proteína G mediante la interacción con la porción de Fe. Las proteínas de Lcer-7 también encuentran uso para purificar células que expresan ceh, ele, o cce en la superficie celular. El Lcer-7 (o fragmentos de fusiones del mismo) se unen a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un substrato similar adecuado. Por ejemplo, microesferas magnéticas se pueden revestir con Lcer-7 y mantener en un recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezclas de células que contienen células que expresan ceh/cle/cce se ponen en contacto con la fase sólida que tiene Lcer-7 sobre las mismas. Las células que expresan ceh o ele o cce en la superficie celular se unen al Lcer-7 fijo y las células no unidas se lavan. Este método de afinidad-unión es útil para purificar ó identificar dichas células que expresan ceh/cle/cce. Los métodos para liberar las células seleccionadas positivamente de la fase sólida son conocidas en la técnica y abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Las enzimas adecuadas son no tóxicas y no dañinas para las células y se dirigen preferiblemente a la separación de proteínas ceh o ele o cce, liberando así la suspensión de células resultante del material Lcer-7 "extraño". La población de células purificada, especialmente si se obtiene de tejido fetal, pueden usarse para repoblar los tejidos maduros (adultos). Por ejemplo, las células neuronales que expresan ele pueden aislarse mediante el procedimiento anterior, administrado después a un mamífero que sufre de un trastorno neurodegenerativo. Alternativamente, las mezclas de células que se sospecha que contienen células ceh/cle+ pueden incubarse primero con Lcer-7 biotinilado. Los períodos de incubación normalmente tienen por lo menos una hora de duración para asegurar la unión suficiente a ceh/cle. La mezcla resultante después se pasa a través de una columna empacada con perlas revestidas con avidina, por lo que la alta afinidad de biotina para avidina provee la unión de la célula a las perlas. El uso de perlas revestidas con avidina se conoce en la técnica. Ver Berenson, y otros, J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). El lavado de material no unido y la liberación de las células unidas se lleva a cabo usando métodos convencionales. Por lo tanto, Lcer-7 puede emplearse para separar o purificar los tipos celulares descritos antes expresando ceh o ele. Lcer-7 también encuentra uso para identificar tipos adicionales de células que expresan ceh o ele en la superficie celular Lcer-7 se puede conjugar a una porción detectable tal como un radionucleótido para detectar células que expresan ceh/cle. Como un ejemplo, el radiomarcado con 125Y puede realizarse mediante cualesquiera metodologías normales que producen una molécula de Lcer-7 con 125l marcada a una actividad alta específica. Se puede usar otra porción detectable tal como una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorometrica, de biotina o avidina. Las células que se van a probar para expresión de ceh/cle se pueden poner en contacto con Lcer-7 marcado. Después de la incubación, se remueve el Lcer-7 marcado no unido y se determina la presencia o ausencia de la porción detectable en las células. Las proteínas de Lcer-7 también se pueden emplear para medir la actividad biológica de proteínas de ele o ceh en términos de su afinidad de unión para Lcer-7. Las proteínas de Lcer-7 por lo tanto encuentran uso como reactivos que se pueden emplear por aquellos que llevan a cabo estudios de "seguridad de calidad", v.gr., para monitorear la vida de almacenamiento y estabilidad de la proteína de ele o ceh bajo diferentes condiciones. Como ejemplos adicionales, Lcer-7 se usa para determinar si la actividad biológica se retiene después de la modificación de una proteína de ele o ceh (v.gr., modificación, truncación, mutación, químicas etc.). Por ejemplo, la actividad biológica de una proteína de ele o ceh por lo tanto, puede asegurarse antes de que se use en un estudio de investigación, o posiblemente en la clínica. Para ilustrar, se emplea Lcer-7 en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de una proteína de ele que se ha almacenada a diferentes temperaturas, o producido en diferente tipos celulares. La afinidad de unión de la proteína ele modificada para Lcer-7 se compara con la de una proteína de ele no modificada para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones en la actividad biológica de ele. Así mismo, la actividad biológica de una proteína de ceh puede evaluarse usando Lcer-7. Los polipéptidos de Lcer-7 también encuentran uso como vehículos para suministrar agentes unidos a los mismos a células que tiene el receptor de superficie celular de ele o ceh. La expresión del antígeno de ceh se ha reportado para ciertas líneas celulares leucémicas, incluyendo la línea celular de leucemia de células T humana designada JM y la línea celular de leucemia de células pre-B humana designada LK63 (Boyd y otros, J. Biol Chem. 267:3262, 1992, y Wicks y otros, Proc. Nati. Acad Sci. USA, 89 _1611 , 1992) Las proteínas de Lcer-7, por lo tanto, se pueden usar para suministrar agentes de diagnóstico terapéuticos a estas células ( u otros tipos de células encontrados para expresar ceh o ele en la superficie celular) en procedimientos in vitro o in vivo. Un ejemplo de dicho uso es exponer una línea de células leucémicas ceh+ a un conjugado de agente terapéutico/Lcer-7 para evaluar si el agente exhibe citotoxicidad hacia las células leucémicas. Un número de diferentes agentes terapéuticos unidos a Lcer-7 pueden incluirse en un análisis para detectar o comparar el efecto citotóxico de los agentes de las células leucémicas. Los conjugados de agentes de Lcer-7/diagnóstico pueden emplearse para detectar la presencia de células de ceh+ m vitro o m vivo Los agentes de diagnóstico y terapéuticos que se pueden unir a un polipéptido de Lcer-7 incluyen, peor no están limitados a, fármacos, toxinas, radionúclidos, cromóforos, enzimas que analizan una reacción colorimétrica o fluorométrica y similares, con el agente particular siendo elegido de acuerdo con la aplicación pretendida. Ejemplos de fármacos incluyen aquellos usados para tratar varias formas de cáncer, v.gr., mostazas de nitrógeno tales como mostaza de nitrógeno de L-fenilalanina o ciclofosfamida, intercalando agentes tales como cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos tales como 5-fluoracilo, alcaloides de vincapervinca tales como vincristina y antibióticos tales como bleomicina, doxoruicina, daunorubicina y derivados de los mismos. Entre las toxinas hay toxinas de ricina, abrina difteria, endotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas de inactivación ribosomal, micotoxinas tales como tricotecenos y derivados y fragmentos de los mismos, (v.gr., cadenas sencillas). Los radionúclidos adecuados para uso de diagnóstico incluyen, pero no están limitados a, 1 3l, 131l, 99mTc, 111ln y 76Br. Los radionúclidos adecuados para uso terapéutico incluyen pero no están limitados a, 131l, 211AT, 77Br, 186Re, 187Re, 212Pb, 212Bi, 109Pd, S4Cu, y 67Cu. Dichos agentes pueden unirse al Lcer-7 mediante cualquier procedimiento convencional adecuado. Lcer-7 siendo una proteína, comprende grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos que se pueden hacer reaccionar con grupos funcionales en un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. Alternativamente, la proteína o agente puede derivarse para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivación puede implicar la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponibles para unir varias moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conoce cierto número de técnicas para radiomarcar proteínas. Los metales de radionúclidos pueden unirse a Lcer-7 usando, por ejemplo, una gente quelatador bifuncíonal adecuado. Por lo tanto, se preparan conjugados que comprenden Lcer-7 y un agente de diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente unido covalentemente). Los conjugados se administran o emplean de otra manera en una cantidad apropiada para la aplicación particular.
Otro uso del Lcer-7 de la presente invención es una herramienta de investigación para estudiar el papel que puede jugar Lcer-7, junto con ele o ceh, para el crecimiento o diferenciación de las células que tienen el receptor de ele o ceh. Los polipéptidos de Lcer-7 de la presente invención también se pueden emplear en análisis in vitro para detectar ele o Lcer-7 o las interacciones de los mismos. Así mismo, Lcer-7 encuentra uso en análisis para ceh o la interacción de Lcer-7 con ceh. Se ha sugerido la posibilidad de que ceh juegue un papel en tumorogénesis, (Boyd y otros, supra). La proteína de Lcer-7 es útil para investigar cuál efecto puede tener la unión de Lcer-7 con ceh sobre la tumorogénesis. Mientras se ilustran en la presente ciertos usos de Lcer-7 con respecto a las propiedades de unión con ele o unión con ceh de Lcer-7, se debe entender que los usos análogos surgen de la capacidad de Lcer-7 para unirse con cce. Ejemplos de los tipos de células cancerígenas que expresan cce son la línea de células de carcinoma epiteliales humanas HeLa, una línea de células de carcinoma epidérmicas humanas designadas A431 (Linddberg y Hunter, supra), líneas celulares de melanoma (Easty y otros, Cáncer Research 55:2528, 1995) y la línea celular de carcinoma de adenoclon humano HT29. Lcer-7 se puede usar para suministrar agentes de diagnóstico o terapéuticos a dichas células, como se trató antes, con respecto a células que tienen ceh. Los ácidos nucleicos de Lcer-7 se pueden emplear para detectar defectos en el gen Lcer-7, v.gr, en un análisis un vitro realizado en muestras de ADN derivadas de un individuo que se va a probar para dicho defecto. El ADN de la presente invención puede emplearse para reemplazar genes defectuosos de Lcer-7, v.gr., en procedimientos de terapia de genes. Como se trató antes, cuando se analizaron varios tejidos de ratas para ARNm de ele, solo se detectaron transcripciones en cerebro y testículos (Lhothak y otros, supra). La unión de Lcer-7 a ele en tejido nervioso puede ejercer un efecto neuroprotector o neurotrófiieo. Lcer-7 encuentra uso como un reactivo de cultivo de tejidos. Una proteína de Lcer-7 puede añadirse a neuronas cultivadas in viro para incrementar la viabilidad o prolongar la vida de las neuronas cultivadas, facilitando así los estudios de investigación y el tratamiento clínico posible de tejido nervioso.
Se ha encontrado que la proteína Lcer-2 descrita antes, ejerce un efecto neurotrófico sobre neuronas del hipocamo y protege a las neuronas contra la excitotoxicidad mediada por glutamato. Así mismo, Lcer-7 puede exhibir propiedades neuroprotectoras o neurotróficas. Lcer-7 por lo tanto puede encontrar uso en un método para tratar trastornos de tejido nervioso, implicando poner en contacto el tejido nervioso con Lcer-7. Dichos trastornos incluyen daño o enfermeades neurológicas, ya sea crónicas o agudas. El uso de Lcer-7 para preparar un medicamento para tratar la enfermead o daño de tejido nervioso se contempla en la presente. Las composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un polipéptido de Lcer-7 de la presente invención, en combinación con otros componentes tales como un diluyente, vehículo o excipiente adecuado, se prevén en la presente: Lcer-7 puede formularse entonces de acuerdo con métodos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Lcer-7 puede combinarse en mezcla, ya sea como el único material activo con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (v.gr., solución salina, Tris-HCl, acetato y soluciones de fosfato con pH regulado), emulsificantes, solubilizantes, auxiliares y/o vehículos. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaeutical Sciences, 16th de, 1980, Mack Publishing Company. Además, dichas composiciones pueden contener Lcer-7 acomplejado con glicol polietilénico (PEG), iones metálicos o incorporadas en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano, etc., o incorporadas en liposomas, microemulsiones, micelios, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas o esferobalstos de eritrocitos. Dichas composiciones influenciarán el estado físico, solubilidad, estabilidad, régimen de liberación in vivo y régimen de eliminación in vivo de Lcer-7, y por lo tanto se eligen de acuerdo a la aplicación pretendida. Como una alternativa, Lcer-7 es GPI-unido a un substrato, en donde el substrato se compone de material fisiológicamente aceptable que tiene una composición química adecuada para unir el Lcer-7 mediante ligaduras de GPI. El Lcer-7 que tiene el substrato puede ser implantado quirúrgicamente. El Lcer-7 también puede ser conjugado para anticuerpos contra receptores específicos para tejido, ligandos o antígenos, o acoplarse a ligandos de receptores específicos para tejidos. Dichas composiciones pueden contener un polipéptido de Lcer-7 en cualquier forma descrita en la presente, tal como proteínas nativas, variantes, derivados, fragmentos biológicamente activos u oligómeros. En una modalidad, la composición comprende un polipéptido de Lcer-7 soluble. Lcer-7 puede administrarse en alguna manera adecuada, v.gr., tópicamente, parenteralmente o por inhalación. El término "parenteral" incluye inyección, v.gr., por rutas subcutáneas, intravenosas o intramusculares, incluyendo también inyección localizada, v.gr., en el sitio de enfermedad o daño. La liberación sostenida de implantes también se contempla. Las dosis adecuadas y concentraciones de fármaco deseadas contenidas en las composiciones, puede varar dependiendo de muchos factores, incluyendo el uso pretendido, el peso corporal y edad del paciente, y ruta de administración. Las dosis preliminares pueden determinarse de acuerdo con pruebas de animales y la escala de dosis para administración a seres humanos se puede realizar de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. Formas Oliaoméricas de Lcer-7 En la presente invención se abarcan los polipéptidos de Lcer-7 en la forma de oligómeros, tales como dímeros, trimeros u oligómeros superiores unidos covalentemente o no unidos covalentemente. Dichos oligómeros pueden estar presentes en la naturaleza o pueden producirse por tecnología de ADN recombinante. Los oligómeros se pueden unir por ligaduras de disulfuro formadas entre residuos de cisteína en diferentes polipéptidos de Lcer-7. Los oligómeros de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, oligómeros que comprenden de dos a cuatro polipéptidos de Lcer-7. En una modalidad, los polipéptidos de Lcer-7 son solubles. Como una alternativa, el oligómero de Lcer-7 se preparó usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el domino de FC) se ha descrito, v.gr., por Ashkenazi y otros (PNAS USA 83:10535, 1991), Byrn y otros (Nature 344:677, 1990) y Hollenbaugh y otros (Current Protocols in Immunofogy, suppl. 4, 1992, pags. 10.19.1-10.19.11), incorporada aquí por referencia. Una modalidad de la presente invención se dirige a un dímero de Lcer-7 creado fusionando Lcer-7 a la región de Fe de un anticuerpo (v.gr., lgG1) en una forma que no interfiere con la unión de Lcer-7 al dominio de unión con el lingando de ceh o ele. El polipéptido de Fe se fusiona preferiblemente con la terminación C de un Lcer-7 soluble que comprende solo el dominio extracelular. Una fusión de genes que codifica la proteína de fusión de Lcer-7/Fc se inserta en un vector de expresión apropiado. Las proteínas de fusión de Lcer-7/Fc se expresan en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante y se dejan ensamblar muchas moléculas de anticuerpos similares, sobre las cuales se forman uniones de disulfuro de intercadenas entre polipéptidos de Fe, dando Lcer-7 divalente. Si se forman proteínas de fusión tanto con cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de Lcer-7 con tantas como cuatro regiones extracelulares de Lcer-7. En la presente se proveen proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de Lcer-7 fusionado con un polipéptido de Fe derivado de un anticuerpo. También se provee ADN que codifica dichas proteínas de fusión, así como dímeros que contienen dos proteínas de fusión se unen vía ligaduras de disulfuro entre las porciones de Fe de los mismos. El término "polipéptido de FC" como se usa en la presente, incluye formas nativas y de muteína de polipéptidos derivados de la región de FC de un anticuerpo. También se incluyen las formas truncadas de dichos polipéptidos que contienen la región de gancho que promueve la dimerización. Un polipéptido de Fe adecuado, descrito en la solicitud de PCT O 93/1011, es un polipéptido de una sola cadena que se extiende de la región de gancho N-terminal a la terminación C nativa. Una muteina de este polipéptido de FC se describe en el ejemplo tres siguiente. La muteína exhibe afinidad reducida para receptores de Fe. Un método para preparar Lcer-7 oligo érico implica el uso de un cierre de leucina. Los dominios de cierre de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentra. Los cierres de leucina fueron identificados originalmente en varias proteínas de unión de ADN (Landschuiz y otros, Science 240:1759, 1988) y por lo tanto se han encontrado en una variedad de diferentes proteínas. Entre los cierres de leucina conocidos están los péptidos presentes en la naturaleza y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cierres de leucina útiles para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud de TCP WO94/10308, incorporada aquí por referencia. En una modalidad, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido de Lcer-7 soluble fusionado a un péptido que se dimeriza o trimeriza en solución, se expresan en células huésped adecuadas. Los oligómeros de Lcer-7 solubles se recuperan del medio de cultivo. Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples polipéptidos de Lcer-7, con o sin péptidos separadores entre las porciones de Lcer-7. Dichas proteínas de fusión se producen mediante tecnología de ADN recombinante. En una modalidad, una proteína de fusión comprende dos o más polipéptidos de Lcer-7 solubles, separados por enlazadores de péptidos. Los oligómeros tienen la propiedad de sitios de unión bivalentes, trivalentes, etc., para ele o ceh. Además, las proteínas de fusión descritas antes que comprenden porciones de Fe (y oligómeros formados de las mismas) ofrecen la ventaja de purificación fácil mediante cromatografia de afinidad en columnas de Proteínas o Proteína G. Sistemas de Expresión Las células huésped adecuadas para polipéptidos de expresión de Lcer-7 incluyen procariontes, levaduras o células eucarióticas superiores. Los vectores de clonación y expresión apropiados para usarse con huéspedes de células bacterianas, fúngicas, de levaduras y de mamíferos, se describen por ejemplo, en Pouwles y otros, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). Los sistemas de traslación sin células también se pueden emplear para producir polipéptidos de Lcer-7 usando ARNs derivados de construcciones de ADN descritas en la presente.
El vector de expresión puede incluir ADN que codifica una péptido señalador o guía fusionado con la terminación N de un polipéptido de Lcer-7. El péptido señalador o guía dirige cotraslacionalmente o post-traslacionalmente la trasferencia de Lcer-7 de su sitio de síntesis a un sitio adentro o afuera de la membrana celular o pared celular. El péptido señalador o guía se separa del polipéptido de Lcer-7 maduro. La elección de péptido de señal o guía depende del tipo de célula huésped que se va a emplear. Las células huésped procarióticas adecuadas para transformación, incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras varias especies dentro el género de Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula huésped procariótica, tal como E. coli, un polipéptido de Lcer-7 puede incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. La Met N-terminal puede separarse del polipéptido de Lcer-7 recombinante expresado. Los polipéptidos de Lcer-7 pueden expresarse en células huésped de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (v.gr., S. cerevisiae). Otros géneros de levadura, tales como Pichia, K. Lactis o Kluyveromyces. Los vectores de levadura pueden contener un origen de secuencia de replicación de un plasmido de levadura de 2 µ, una secuencia de replicación autónoma (SRA), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de transcripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotienina, cinasa de 3-fosfoglicerato (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicol íticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y otros, Biochem. 17.:4900, 1978) tales como enolasa, deshidrogenasa de giceraldehído-3-fosfato, hexocinasa, descarboxilasa de piruvato, fosfofructocinasa, isomerasa de glucosa-6-fosfato, mutasa de 3-fosfoglicerato, cinasa de piruvato, isomerasa de triosafosfato, isomerasa de fosfoglucosa y glucocinasa. Otra alternativa es el promotor de ADH2 de represión de glucosa descrito por Russell y otros (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier y otros (Nature 300:724, 1982). Otros vectores y promotores adecuados para usarse en expresión de levaduras se describen además en Hitzeman, EPA-73,657 o en Fleer y otros, Gene, 107:285-195 (1991); y van den Berg y otros, Bio/Technology, 8:135-139 (1990). Los vectores de lanzamiento replicables tanto en levaduras como E. coli pueden construirse insertando secuencias de ADN de pBR322 para selección y replicación en £. coli (gen de Ampr y origen de replicación) en los vectores de levadura descritos antes. Una secuencia adecuada de guía (v.gr, la guía de factor a de Saccharomyces) se puede emplear para dirigir la secreción del polipéptido de Lcer-7 de las células de levaduras La secuencia guía del factor a generalmente se inserta entre la secuencia del promotor y la secuencia de gen estructura. Ver, v.gr., Kurjan y otros, Cell 30:933, 1982; Bitter y otrs, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; Patente de E.U.A. 4,546,082; y EP 324,274. Otras secuencias de guía adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de huéspedes de levadura son conocidos por aquellos con experiencia en la materia. Una secuencia guía puede modificarse cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia de guía para el gen estructural. Los protocolos de transformación de levaduras son conocidos por aquellos con experiencia en la materia. Uno de dichos protocolos se describe por Hinnen y otros, Proc. Nati. Acad., Sci. Usa 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen y otros, selecciona los transformantes de Trp+ en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste de base de nitrógeno de 0.67% de levadura, 0.5% de casaminoácidos, 2% de glucosa, 10 µg/ml de adenina y 20 µg/ml de uracilo. Las células huésped de levadura transformadas por vectores que contienen secuencia de promotor de ADH2 pueden desarrollarse induciendo la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste de 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 2% de glucosa suplementada con 80 µg/ml de adenina y 80 µg/ml de uracilo. La desrepresión del promotor de AdH2 se presenta cuando la glucosa se escapa del medio. Los sistemas de cultivos de células huésped de mamíferos o insectos también se podrían emplear para expresar polipéptidos de Lcer-7 recombinantes. Los sistemas de baculovirus para producción de proteínas heterólogas en células de insectos se revisan por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Las líneas celulares establecidas de origen de mamíferos también se pueden emplear. Ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos adecuadas incluyen la línea de COS-7 de células de riñon de monos (ATCC CRL 1651; Gluzman y otros, Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovarios de hámster chinos (OHC), células de HeLA, la línea celular de BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular de CV-1/EBNA derivada de la línea celular de riñon de mono verde africano CV1 (ATC CCL 70) como se describió por McMahan y otros (EMBO J. 10:2821, 1991). Las secuencias de control transcripcional y traslacional para vectores de expresión de células huésped de mamíferos se pueden sacar de genomas virales. Las secuencias de promotores y secuencias mejoradoras usadas comúnmente y derivadas del virus de Polyoma, Adenovirus 2, Virus de Simio 40 (VS40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral de VS40, por ejemplo, promotor temprano y tardío de origen de VS40, incrementador, separador y sitios de poliadenilación se pueden usar para proveer otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural en una célula huésped de mamíferos. Los promotores tempranos y tardíos virales son particularmente útiles dado que ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen viral de replicación (Fiers y otros, Nature 273: 113, 1978). También se pueden usar fragmentos más pequeños o mas grandes de VS40, siempre y cuando se incluya la secuencias de aproximadamente 250 pb que se extiende del sitio de Hind lll hacia el sitio de Bgl I localizado en el origen viral de VS40 del sitio de replicación. Ejemplos de vectores de expresión para usarse en células huésped de mamíferos, se pueden construir como se describió por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un sistema útil para la expresión de alto nivel estable de ADNc de mamíferos en células epiteliales de mamíferos murinos C127, se pueden construir substancialmente como se describe por Cosman y otros (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de alta expresión útil, PMLVS N1/N4, descrito por Cosman y otros, Nature 312:768, 1984, se ha depositado como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamíferos útiles se describen en la EP-A-0367566, y en WO 91/18982, incorporadas aquí por referencia. Los vectores se pueden derivar de retroviruses. En lugar de la secuencia de señal nativa, se puede añadir una secuencia de señal heteróloga, tal como la secuencia de señal para IL-7 descrita en la Patente de Estados Unidos 4,965,195; la secuencia de señal para el receptor IL-2 descrita en Cosman y otros, Nature 312:768 (1984); el péptido de señal IL-4 descrito en EP 367,566, el péptido de señal de receptor IL-1 tipo I, descrito en la Patente de E.U.A. 4,968,607; y el péptido de receptor IL-1 tipo II descrito en la EP 460,846. Proteína de Lcer-7 Los polipéptidos de Lcer-7 de la presente invención se pueden producir por sistemas de expresión recombinantes como se describió antes, o purificarse de células que se presentan en la naturaleza. Un proceso para producir Lcer-7 comprende inocular una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica Lcer-7 bajo condiciones suficientes para promover la expresión de Lcer-7. Lcer-7 entonces se recupera del medio de cultivo o extractos de célula, dependiendo del sistema de expresión empleado. En una modalidad, una proteína de Lcer-7 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína que se expresa por células huésped transformadas con un vector de expresión que contiene el ADNc de Lcer-7 en la cepa ATCC 75959. Como se sabe por el experto, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variará de acuerdo con dichos factores como el tipo de células huésped empleadas y en donde se secrete o no la proteína recombinante en el medio de cultivo. Otras consideraciones incluyen los tipos de contaminantes que se van a remover, los cuales pueden variar de acuerdo con las células huésped particulares empleadas para expresar la proteína deseada.
Por ejemplo, cuando se emplean los sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo primero se puede concentrar usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración de Amicon o Millipore Pellicon. Siguiendo el paso de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como una matriz de filtración de gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos de dietilaminoetilo (DEAE) pendiente. Las matrices pueden ser materiales de soporte de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros, empleados comúnmente en purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear un paso de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos de sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos de sulfopropilo. Además, se pueden emplear uno o más pasos de cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (RP-CLAR) que usan medio de RP-CLAR hidrofóbico (v.gr., gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes u otros grupos alifáticos). Algunos o todos los pasos de purificación anteriores en varias combinaciones, se pueden emplear para proveer una proteína de Lcer-7 purificada. Una alternativa adicional es cromatografía de afinidad, que emplea una matriz de cromatografía que contiene ceh, ele, o un anticuerpo reactivo con Lcer-7. Los polipéptidos de Lcer-7 se pueden recuperar de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, (v.gr., elución en una solución reguladora de pH con alto contenido de sal) se dializó después en una solución reguladora de pH con bajo contenido de sal para usarse. La proteína recombínante producida en cultivo bacteriano se puede aislar mediante interrupción inicial de las células huésped, centrifugación, extracción de pellas celulares si es un polipéptido insoluble o del fluido sobrenadante si es un polipéptido soluble, seguido por una o más etapas de cromatografía por concentración, desalamiento, intercambio iónico, purificación por afinidad o exclusión de tamaño. Finalmente, se puede emplear RP-CLAR para pasos de purificación finales. Las células microbianas se pueden alterar por algún método conveniente, incluyendo ciclización de congelamiento-descongelamiento, tratamiento con sonido, alteración semántica o uso de agentes de lisado de células. Preferiblemente Lcer-7 se expresa como un polipéptido secretado en células huésped de levadura, con el fin de simplificar la purificación. El polipéptido recombinante secretado dé una fermentación de células huésped de levadura se puede purificar mediante métodos análogos a lo descritos por Urdal y otros (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal y otros describe dos pasos de CLAR de fase inversa, secuenciales, para la purificación de IL-2 recombinante humano en una columna preparativa de CLAR. El grado deseado de pureza depende del uso pretendido de la proteína. Un grado relativamente alto de pureza se desea cuando la proteína se va a administrar in vivo, por ejemplo. Ventajosamente, los polipéptidos de Lcer-7 se purifican de manera que no se detectan bandas de proteínas que corresponden a otras proteínas por ele análisis de electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida ( DS-PAGE). Se reconocerá por alguien experto en el campo pertinente que las bandas múltiples que corresponden a la proteína Lcer-7 se pueden visualizar por SDS-PAGE, debido a la glicosilación diferencial, el procesamiento post-traslacional diferencial y similares, como se trató antes. Una preparación de proteína de Lcer-7 se considera que se purifica mientras no se visualicen bandas que corresponden a diferentes proteínas (que no sean de Lcer-7). Más preferiblemente, Lcer-7 se purifica para homogeneidad substancial, como se indica por una sola banda de proteína mediante análisis por SDS-PAGE. Ácidos Nucleicos La presente invención provee ácidos nucleicos de Lcer-7 aislados. Dichos ácidos nucleicos incluyen, pero no están limitados al ADN de Lcer-7 humano de la SEC ID NO: 4, en forma de un hilo y doble hilo, así como el complemento de ARN del mismo. El ADN de Lcer-7 de la presente invención incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PRC, y combinaciones de los mismos. El ADN Genómico puede aislarse mediante técnicas convencionales usando el ADNc aislado en el ejemplo 1 o un fragmento adecuado del mismo como una sonda. La presente invención además provee fragmentos de las secuencias de nucleótidos de Lcer-7 presentados en la presente.
Dichos fragmentos convenientemente comprenden por lo menos aproximadamente 14, preferiblemente, por lo menos 17, nucleótidos consecutivos de la secuencia presentada en SEC ID NO:4. Los complementos de ADN y ARN de dichos fragmentos se prevén en la presente, junto con formas de un solo hilo y doble hilo del ADN de Lcer-7. Entre los usos de dichos fragmentos de ácidos nucleicos de Lcer-7 se usan como una sonda o un iniciador. Dichas osndas se pueden emplear en procedimientos de hibridización de especies cruzadas para aislar ADN de Lcer-7 de especies de mamíferos adicionales. Como ejemplo, se puede emplear una sonda que corresponde al dominio extracelular de un Lcer-7. Los sondas también encuentran uso para detectar la presencia de ácidos nucleicos de Lcer-7 en análisis in vitro y en dichos proceso como secado de Northern y Southern. Los tipos celulares que expresan Lcer-7 pueden ser identificados. Dichos procesos son bien conocidos y el experto puede elegir una sonda de longitud adecuada, dependiendo de la aplicación particular pretendida. Las sondas se pueden marcar (v.gr., con 32P) mediante técnicas convencionales. Los oligonucléotidos que corresponden a los segmentos de ácidos nucleicos de Lcer-7 encuentran uso como iniciadores, en procedimientos tales como reacción en cadena de polimerasa (RCP). Por ejemplo, los iniciadores 5' y 3' que corresponden a las terminaciones de una secuencia de Lcer-7 deseada (v.gr., un fragmento de Lcer-7) se emplean para aislar y amplificar la secuencia en un procedimiento de RCP convencional. Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de Lcer-7 incluyen oligonucleótidos de contrasentido o de sentido que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de un solo hilo (ya sea ARN o ADN) capaces de unirse a secuencias blanco de ARNm de Lcer-7 (sentido) o ADN de Lcer-7 (contrasentido). Los oligonucleótidos de contrasentido o de sentido de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación de ADNc de Lcer-7. Dicho fragmento comprende generalmente por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a alrededor de 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido de contrasentido o de sentidos, basado en una secuencia de ADNc que codifican una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol y otros (BioTechniques 6:958, 1988). La unión de oligonucleótidos de contrasentido o sentido a secuencias de ácidos nucleicos blanco da como resultado la formación de duplos que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia blanco por uno o varios medios, incluyendo degradación incrementada de duplos, terminación prematura de transcripción o traslación o mediante otros medios. Los oligonucléotidos de contrasentido por lo tanto se pueden usar para bloquear la expresión de proteínas de Lcer-7. Los oligonucleótidos de contrasentido o de sentido comprenden además oiigonucleótidos que tienen estructuras de la base de fosfodiésteres de azúcar modificadas (u otras ligadura de azúcar, tales como las descritas en WO 91/06629) y en donde dichas ligaduras de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Dichos oligonucleótidos con ligaduras de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir degradación enzimática) pero retienen especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a las secuencias de nucleótidos blanco. Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o contrasentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están unidos covalentemente a porciones orgánicas, tales como las descritas en WO 90/10448, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácidos nucleicos blanco tales como poli-(L-lisina). Además, los agentes de intercalamiento, tales como elipticina, y agentes de adenilación o complejos metálicos, se pueden unir a los oligonucleótidos de sentido o contrasentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido de contrasentido o sentido para la secuencia de nucléotidos blanco. Los oligonucléotidos se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos blanco por cualquier método de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO4, electroporación mediante el uso de vectores de transferencia de genes tales como virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un oligonucléotido de contrasentido o de sentido se inserta en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos blanco se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquellos derivados de los retrovirus de murinos M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de doble copia designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641). Los oligonucléotidos de sentido o contrasentido también se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de nucléotidos blanco para la formación de un conjugado con una molécula de unión de ligandos, como se describió en WO 91/04753. Las moléculas de unión de ligandos adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas u otros ligandos que se unen a los receptores de superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión del ligando no interfiere substancialmente con la capacidad del la molécula de unión del ligando para unirlo a su molécula o receptor correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o contrasentido o su versión conjugada en la célula. Alternativamente, un oligonucleótido de sentido o contrasentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico blanco mediante la formación de un complejo de oligonucleótido-lipido, como se describió en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido-lípido de sentido o contrasentido preferiblemente se disocia dentro de la célula por una lipasa endógena. Anticuerpos Se proveen anticuerpos son inmunorreactivos con los polipéptidos de Lcer-7 descritos en la presente. Dichos anticuerpos se unen específicamente a Lcer-7 en que los anticuerpos unidos a
Lcer-7 vía los sitios de unión de antígenos del anticuerpo (contrario a unión no específica). Los anticuerpos policlonales y monoclonales se pueden preparar mediante técnicas convencionales. Ver, por ejemplo,
Monoclonal Antibodies, Hybridomes: A New Dimensión in Biological
Analysis, Kennet y otros (eds.) Plenum Press, New York (1980); y
Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor; NY, (1988). La producción de anticuerpos monoclonales que son inmunorreactivos con Lcer-7 se ilustra además en el siguiente ejemplo 5. Los fragmentos de unión de antígenos de dichos anticuerpos, que pueden producirse mediante técnicas convencionales, también se abarcan por la presente invención. Ejemplos de dichos fragmentos incluyen, pero no están limitados a, fragmentos de Fab. F(ab'), y
F(ab')2. También se proveen fragmentos de anticuerpos y derivados producidos por técnicas de ingeniería genética. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, v.gr., versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales de murinos Dichos anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas y ofrecen la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo de murinos (o solo el sitio de unión de antígenos de los mismos) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión de antígenos de un anticuerpo monoclonal de murinos y un fragmento de región variable (careciendo del sitio de unión con el antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales químicos y trabajados adicionalmente, incluyen aquellos descritos en Riechmann y otros (Nature 332:323, 1988). Liu y otros (PNAS 84:3439, 1987), Larrick y otros (Bio/Technology 7:934, 1989) y Winter y Harris (TIPS 74:139, mayo, 1993). Entre los usos de los anticuerpos están el uso en análisis para detectar la presencia de polipéptidos de Lcer-7, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos también se pueden emplear para purificar proteínas de Lcer-7 mediante cromatografía de inmunoafinidad. Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar más las modalidades particulares de la invención y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la presente invención. EJEMPLO 1 Clonación de ADNc de Lcer-7 Humano El ADNc que codifica un Lcer-7 humano de la presente invención se aisló mediante el siguiente procedimiento. En resumen, el ADN de Lcer-7 se identificó durante el tamizado de un banco de
ADNc de cerebro fetal humano con una sonda que se derivó de un ADNc de murino desigando Lcer-6. El ADN de Lcer-6 y proteínas se describieron antes y en la solicitud de E.U.A. copendiente serie no. 08/318,393, presentada el 5 de octubre de 1994, que se incorpora aquí por referencia. El ADN y secuencias de aminoácidos codificadas para un ADNc de Lcer-6 de murinos se presentan en la presente como SEC ID NOS: 1 y 2. Un banco de ADNc que consiste de ADNc de cerebro fetal de humano en el vector de fago ?gtIO se compró de Clonetech Laboratories, Inc. Palo Alto, California. Un fragmento de ADN de Lcer-6 de murinos se aisló por RCP para usarse como una sonda. El fragmento de ADNc de Lcer-6 que contiene nucleótidos 11 a 443 de SEC ID NO: 1. Un iniciador empleado en el RCP añadido a un sitio de unión de polimerasa de ARN T3
(CTTTAGTGAGGGTTAATCTATAG) (SEC ID NO: 3) al extremo 3 del fragmento de ADN de Lcer-6 amplificado. La sonda se marcó con 32P dCTP usando la técnica de iniciación aleatoria, después se dejó hibridizar a los grupos comunes de ADNc derivados del banco. La hibridización se llevó a cabo a 55°C durante la noche en 6 x SSC. Los filtros se lavaron después a 0.5XSSC/0.1% SDS a 55°C durante aproximadamente dos horas. Los grupos comunes de hibridización se identificaron y se repitió el tamizado en grupos comunes sucesivamente más pequeños, bajo las mismas condiciones Un clon de hibridización individual, desigando clon #16, se purificó después del tercer tamizado. Se determinó la secuencia de ADN del clon #16. Sorprendentemente, el clon codificó una proteína humana novedosa designada en la presente Lcer-7, en lugar de codificar el homólogo humano de Lcer-6. La secuencia de nucleótidos de la región de codificación del ADNc de Lcer-7 humano y la secuencia de aminoácido codificada por la misma, se describen en SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 5, respectivamente. La proteína de Lcer-7 humana de
SEC ID NO: 5 comprende un péptido de señal N-terminal
(aminoácidos de -20 a -1), un dominio de unión de receptor extracelular (aminoácidos de 1 a 133), una región separadora
(aminoácidos de 134 a 183) y una región hidrofóbica C-terminal (aminoácidos 194-208). Las muestras de un lisato celular que contiene un vector de fago recombinante (?gt10 que contiene el ADNc de Lcer-7 humano del clon #16 insertado en el sitio de restricción Eco Rl del vector) se depositaron en American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Las muestras se depositaron el 7 de diciembre de 1994, bajo los términos del Tratado de Budapest, y el acceso cedido no. ATCC 75959. EJEMPLO 2 Preparación de Proteína de Fusión cle-Fc Soluble Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión soluble de cle-Fc. Esta proteína de fusión puede emplearse en el análisis de unión descrito en la presente. Un ADN y secuencia de aminoácidos codificada para ADNc de ele de ratas se presenta en Lhotak y otros (Mol. Cell, Biol. 77:2496, 1991), incorporada aquí por referencia. La proteína de Cíe de rata tiene un dominio extracelular de 538 aminoácidos, un domino de transmembrana de 25 aminoácidos, y un dominio citoplásmico de 419 aminoácidos. Un fragmento de ADNc de ele de ratas se fusionó en el extremo 5' de ADNc que codifica la porción de Fe de un anticuerpo de IgGI de humano. Un sitio de separación de endonucleasa de restricción ASP718 se introdujo corriente arriba de la región de codificación de ele. Se aisló un fragmento de Asp 718-Bglll (que comprende todo el dominio extracelular, la región de transmembrana y una porción del dominio citoplásmico). El ADN que codifica una sola cadena de oligopéptido comprendiendo la región de FC de un anticuerpo de lgG1 humano se clonó en el sitio de Spel de pBluescript SK®, un vector de clonación que está comercialmente disponible de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Caifornia. Este vector de plásmido es replicable en E. coli y contiene un segmento de poliligador que incluye 21 sitios únicos de restricción. La secuencia de nucleótidos del ADN clonado, junto con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de Fe codificado por el mismo, se describen en la solicitud de TCP WO 93/10151 y también se presentan en SEC ID NO:7 y SEC ID NO:8. Un sitio único de Bg/\l se ha introducido y abarca los codones para los aminoácidos tres y cuatro del polipéptido Fe. El polipéptido Fe codificado se extiende desde la región de gancho N-terminal a la terminación C nativa, es decir, es una región de Fe de anticuerpo de longitud esencialmente completa. El fragmento de ADNc de Asp718-Bgll I ele descrito antes, se clonó en el vector de pBluescript SK® que contiene el ADNc de Fe, de manera que el ADNc de ele se coloca corriente arriba del ADNc de Fe. El ADN de un solo hilo derivado de la fusión de gen resultante se mutagenizó mediante el método escrito en Kunkel (Proc. Nati, Acad. Sci. USA 82:488, 1985) y Kunkel y otros (Methods in Enzymol. 154:367, 1987) con el fin de fusionar perfectamente todo el dominio extracelular de ele a la secuencia de Fe. El ADN mutagenizado se secuenció para confirmar que los nucleótidos apropiados se han removido (es decir, que la región de transmembrana y ADN de dominio citoplásmico parcial se suprimieron) y que las secuencias de ele y Fe estuvieron en el mismo marco de lectura. La proteína de fusión de cle:Fc preferiblemente se sintetizó en células huésped de mamíferos, tales como células de CV1-EBNA O COS-7. La fusión del gen de cle:Fc se sacó e insertó en un vector de expresión de mamíferos designado HAV-EO (Dower y otros, J.
Immunol. 142:4314, 1989). Las células huésped de mamíferos se transfectaron con el vector de expresión recombinante resultante y se cultivaron para permitir la expresión temporal de la proteína de fusión que se secretó en el medio de cultivo vía el péptido de señal de ele. La proteína de fusión de cle:Fc se purificó mediante cromatografía de afinidad, usando una columna de sefarosa de proteína A. EJEMPLO 3 Preparación de Proteína de Fusión de ceh:Fc Soluble Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión de ceh:Fc soluble. Esta proteína de fusión se puede emplear en el análisis de unión descrito en la presente. El ADN y secuencia de aminoácido codificada para ADNc de ceh humano se presenta en Wicks y otros (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89_:1611, 1992), incorporada aquí por referencia. Esta proteína de ceh comprende (de terminaciones N a C) un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. Dos fragmentos de ADN, uno que codifica un fragmento N-terminal del dominio extracelular de ceh y el otro que codifica un fragmento C-terminal del domino extracelular de ceh, se aislaron por las reacciones en cadena de polimerasa (RCP) conducidas bajo condiciones normales, usando iniciadores de oligonucléotidos basados en la secuencia de nucleótidos publicada por Wicks y otros, Sív ra. El modelo para el RCP fue ADNc preparado a partir de ARNm aislado de una línea de células leucémicas de células T humana designada CCRF-HSH-2 (ATCC CCL-120.1). Los productos de RCP que contienen el extremo 5' del ADN ceh se digirieron con Spel y H indi 11 para aislar un fragmento de ADN que se extiende del extremo 5' de la secuencia de ceh humano maduro (es decir, que carece de ADN que codifica la secuencia de señal) a un sitio Hindlll encontrado en el gen de ceh. Los productos de PCR que contienen el extremo 3' del ADN de dominio extracelular ceh, se digirieron con Hindlll y Clal para aislar un fragmento que se extiende desde el sitio Hindlll interno a un sitio de Clal justo corriente abajo del extremo 3' de la secuencia que codifica el dominio extracelular de ceh. El sitio de Clal es un sitio de clonación múltiple (scm) introducido justo corriente abajo del dominio extracelular. Se aisló ADN que codifica una muteína para la región de Fe de un anticuerpo de lgG1 de humano. El ADN de muteína de Fe y el polipéptido codificado por el mismo se describieron en la solicitud de patente de E.U.A. Serie no. 08/097,827, titulada "Novel Cytokine Which is a Ligand for OX40" presentada el 23 de julio de 1993, cuya solicitud se incorpora aquí por referencia. El ADN de muteina se derivó de un ADN que codifica polipéptido de Fe nativo de ADN por mutagénesis dirigida por sitio conducida esencialmente como se describió por Deng y Nicholoff, Anal. Biochem. 200:81 (1992). La secuencia de aminoácidos para el polipéptido de muteína de Fe es idéntica a la del polipéptido de FC nativo en la solicitud de TCP WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. Esta Fe de muteína exhibe afinidad reducida para receptores de inmnuoglobulina. El vector recombinante que contiene el ADN de muteina de Fe se separó con Clal y Notl, que separó en vector en una región de poliligador inmediatamente corriente arriba y corriente abajo, respectivamente, del inserto de ADN de muteína de Fe. Se aisló el fragmento que codifica para muteína Fe deseado. Un vector de expresión de mamíferos designado SMAG4 se separó con Spel y Notl. El vector de SMAG4 comprende una secuencia que codifica para péptidos de señal de interleucina-7 de murínos (descrita en la Patente de E.U A. 4,965,1895) insertada en el vector de alta expresión de mamíferos pDC201 (descrito en Sims y otros, Science 241:585, 1988) y en solicitud de TCP WO 89/03884), que también es capaz de replicarse en E. coli. Spll separa el vector inmediatamente corriente abajo de la secuencia que codifica para péptidos de señal de IL-7. Notl separa aproximadamente 155 pb corriente abajo del sitio de Spel en un sitio de clonación múltiple del vector. Se aisló el fragmento de Spel/Notl grande que contiene las secuencias de vectores y el ADN que codifica para péptidos de señal de IL-7. Una ligación de cuatro direcciones se condujo para insertar los dos fragmentos de ADN que codifican para ceh y el fragmento de ADN que codifica para muteina de Fe descrito antes en el vector de expresión de SMAG4 separado en Spel/Notl Las células de E. coli se transfectaron con la mezcla de ligación y el vector recombinante deseado se aisló a partir de las mismas. El vector aislado codifica una proteína de fusión que comprende (de terminación N a C) el péptido de señal IL-7 de murinos, el dominio extracelular de ceh, cuatro aminoácidos codificados por el scm introducido y la muteína de Fe. El vector de expresión se co-transfectó después con el plásmido pSV3.NEO en las células de C1/EBNa. La línea celular de CV1/EVNA (ATCC CRL 10478) se derivó de una línea celular de riñon de monos como se describe en McMahan y otros (EMBO J. 10:2821 , 1991). El vector pSV3.NEO expresa el antígeno T SV40 que no se produce por las células huésped. El vector pSV3.NEO es similar a pSV3 (Mulligan y Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. USA _78:2072, 1981), pero adicionalmente contiene un gen de resistencia de neomicina. Las células transformadas se cultivaron para permitir la expresión temporal de la proteína de fusión que se secreta en el medio de cultivo vía el péptido de señal de IL-7 de murinos. EJEMPLO 4: Estudio de Unión La unión de Lcer-7 a ele o ceh puede evaluarse usando el siguiente análisis. Se prepararon las células que expresan Lcer-7 en la superficie celular. El ADN de Lcer-7 se amplificó por PCR. Los iniciadores empleados en el RCP se seleccionaron para definir la terminación de la región de codificación del ADN de Lcer-7 y también incluyen un sitio de restricción Xho I en el extremo 5' y sitio Not I en el extremo 3' del ADN amplificado. El iniciador 5' incluye adicionalmente una secuencia Kozak de consenso corriente arriba del codón de iniciación. Los productos de reacción se digirieron con Xho I y Not I y se insertaron en un vector de expresión pDC410, que se separó con Sal I (que es compatible con Xho I) y Not I. pDC410, un vector de expresión de mamíferos que también se replica en E. coli, es similar a pDC406 (McMahan y otros, EMBO J. 70:2821, 1991). El sitio de clonación múltiple pDC410 (scm) difiere de pDC406 en que contiene sitios de restricción adicionales y tres codones sin sentido (uno en cada marco de lectura). Un promotor de polimerasa T7 corriente abajo del scm facilita la secuenciación de ADN insertado en el scm. Además, el origen de EBV de replicación se reemplaza por ADN que codifica el antígeno T grande de SV40 (derivado de un promotor de SV40) en pDC410. Las células de CV1IEBNA-1 en placas de 10 cm2 se transfectan con el vector de expresión recombinante que contiene ADN de Lcer-7. La línea celular de C-l/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expresa constitutivamente antígeno nuclear -1 de EBV derivado de incrementador/promotor inmediatamente temprano de CMV. El CV1-EBNa-l se deriva de la línea celular de riñon de Mono Verde Africano CV-I (ATCC CCL 70), como se describió por McMahan y otros (EMBO J. 10:2821, 1991). Las células transfectadas se cultivan durante 24 horas y las células en cada placa se dividen después en una placa de 24 pozos. Después de cultivar durante 48 horas adicionales, se llevó a cabo un análisis de unión mediante el siguiente procedimiento. Las células transfectadas (aproximadamente 4x10 células/pozo) se lavaron con BM-NFDM, que es el medio de unión (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero de bovinos, 2 mg/ml de azida de sodio, 20 mM de Hepes pH 7.2) al cual se añadieron 50 mg/ml de leche seca sin grasa. Las células se incubaron durante 1 horas a 37°C con varias concentraciones de proteína de fusión de cle:Fc preparada en el Ejemplo 2 o la proteína de fusión de ceh:Fc preparada en el Ejemplo 3. Las células se lavaron después y se incubaron con una concentración de saturación constante de un IgG anti-humano de 125l-ratón en medio de unión, con agitación suave durante 1 horas a 37°C. Después de un lavado extenso, se liberaron las células vía tripsinización. El IgG anti-humano de ratón anterior, se dirigió contra la región de Fe del IgG humano y se puede obtener de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. West Grove, PA. El anticuerpo está radioyodado usando el método de cloramina-T normal. El anticuerpo se unirá a la porción de Fe de cualquier proteína de fusión de cle:Fc o ceh:Fc que se une a las células. En todos los análisis, se analizó el anticuerpo de 12SI en ausencia de cle:Fc (o ceh:Fc), así como en presencia de cle:Fc (o ceh:Fc) y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo de IgG anti-humano de ratón no marcado. La unión celular de anticuerpo con 125l se cuantificó en un contador Packard Autogamma. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:5660, 1949) se generaron en operación de RS/1 (BBN Software, Boston, MA) en una computadora Microvax. EJEMPLO 5 Anticuerpos Monoclonales que se unen a Lcer-7 Este ejemplo ilustra un método para preparar anticuerpos monoclonales que se unen a Lcer-7. Los inmunógenos que se pueden emplear para generar dichos anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, proteína de Lcer-7 purificada o un fragmento inmunogénico de la misma tal como el dominio extracelular, proteínas de fusión que contienen Lcer-7 (v.gr., una proteína de fusión de Lcer-7/Fc), o células que expresan Lcer-7 en la superficie celular. El Lcer-7 purificado se puede usar para generar anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con los mismos, usando técnicas convencionales tales como las descritas en la Patente de E.U.A. 4,411,993. En resumen, los ratones son inmunizados con inmunógeno de Lcer-7 emulsificado en auxiliar completo de Leer e inyectado en cantidades que varían de 10-100 µg subcutáneamente o intraperitonealmente. De diez a doce días después, los animales inmunizados se elevaron con Lcer-7 adicionales emulsificados en auxiliar incompleto de Freund. Los ratones se elevaron periódicamente después en un programa de inmunización de una a dos semanas. Las muestras de suero se tomaron periódicamente por sangrado retro-orbital o excisión de la punta de la cola para probar los anticuerpos de Lcer-7 para análisis de secado por puntos, ELISA (Análisis de Inmunoabsorbente unido a Enzima) o inhibición de unión de ceh o ele. Después de la detección de una titulación de anticuerpo apropiado, a los animales positivos se les proveyó una última inyección intravenosa de Lcer-7 en solución salina. De tres a cuatro días después, se sacrificaron los animales, se recopilaron células del bazo y las células del bazo se fusionaron con una línea celular de mieloma de murinos, v.gr, NSI o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se inoculan en placas en múltiples placas de microtitulación en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma de híbridos de células del bazo. Las células del hibridoma se tamizaron por ELISA para reactividad contra Lcer-7 purificado mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall y otros, Immunochem. 8:871, 1971 y en la Patente de E.U.A. 4,703,004. Una técnica preferida de tamizado es la técnica de captura de anticuerpos descrita en Beckmann y otros (J. Immunol. 144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones BALB/c singénicos para producir ascitos que contienen altas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-Lcer-7. Alternativamente, las células de hibridoma que pueden desarrollarse in vitro en matraces o botellas redondas por varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitas de ratones se pueden purificar por precipitación de sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión de gel. Alternativamente, la cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a Proteína A o Proteína G también se puede usar, como la cromatografía de afinidad puede basarse en la unión a Lcer-7. EJEMPLO 6 Secado de Southern El secado de Southern genómico de humanos y murinos se realizaron para demostrar que los Lcer-7 de humanos y Lcer-6 de murinos no son homólogos. La prueba de ADN de humanos con Lcer-7 de humanos o Lcer-6 de murinos dio como resultado las siguientes bandas de hibridización (en kbp): Lcer-7 [EcoR1 (12.5, 9, 6, 4, 2.5) y BamHl (13 y 9)]; Lcer-6 [EcoR1 (5) y Bam H1 (5.3)]. Las pruebas de ADN genómico de murinos da como resultado las siguientes bandas de hibridización: Lcer-7 [EcoR1 (12.5, 6) y BamHl (18.6)]; Lcer-6 [EcoR1 (18) y BamHl (2.7, 2,2). Dado que las bandas de hibridización de Lcer-7 y Lcer-6 no son idénticas, estos ADNc definen genes únicos. EJEMPLO 7: Estudio de Unión La afinidad de unión de Lcer-7 para ele o para ceh se determinó en el siguiente análisis. ADNc que codifica el polipéptido de Lcer-7 de longitud completa de SEC ID NO:5 se insertó en SF CA, un vector de expresión de mamíferos que también se replica en E.
co//L El vector de SF CAV se describe en la solicitud de PCT WO 93/19777. Las células de CV-1 EBNA-1 (descritas en el ejemplo 3) en placas de 10 cm2 se transfectaron con el vector de expresión recombinante que contiene ADN de Lcer-7. Las células transfectadas se cultivaron durante 24 horas y las células en cada placa se dividieron después en una placa de 24 pozos. Después de cultivar durante 48 horas adicionales, se llevó a cabo un análisis de unión mediante el siguiente procedimiento. Las células transfectadas (aproximadamente 4 x 104 células/pozo) se lavaron con BM-NFDM, que es el medio de unión (RPM1 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero de bovinos, 2 mg/ml de azida de sodio y 20 mM de Hepes pH 7.2) al cual se habían añadido 50 mg/ml de leche seca sin grasa. Las células se incubaron después durante 1 hora a 37°C con varias concentraciones de una proteína de fusión de cle:Fc o ceh:Fc soluble. La proteína de fusión de ceh:Fc se preparó como se describió en el Ejemplo 3. L proteína de fusión de cle:Fc se preparó mediante los procedimientos análogos al descrito en el ejemplo 2, excepto que el polipéptido Fe de muteina descrita en el ejemplo 3 se substituyó por el polipéptido de Fe nativo. Los células se lavaron, se incubaron con una concentración de saturación constante (20 ng/ml) de un IgG anti-humano 125l-ratón en medio de unión con agitación suave durante 1 horas a 37°C. Después de lavado extensivo, las células cultivaron por tripsinización.
El IgG anti-humano de ratón empleado antes se dirige contra la región Fe de IgG humano y está disponible de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo se trató con radioyodo usando el método de cloramida T normal. El anticuerpo se unirá a la porción de Fe de cualquier proteína de fusión de cle:Fc o ceh:Fc que se unió a las células. En todos los análisis, no se analizó ninguna unión no específica de 125L-anticuerpo en la ausenica de cle:F'c (o ceh:Fc), así como en presencia de cle:Fc (o ceh:Fc) y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo de IgG anti-humano de ratón no marcado. El 25l-anticuerpo unido a la célula se cuantificó en un contador
Autogama Packard. Los cálculos de afinidad (Scatchardk, Ann. N.Y.
Acad. Sci. 51:660, 1949) se generaron en RS/1 (BBN Sofware,
Boston, MA) corrido en una computadora Microvax. Los resultados fueron los siguientes. La unión de cle:Fc para las células que expresan Lcer-7 se caracterizó por un patrón bifásico, con constantes de afinidad (Ka) calculado por ser Ka1 = 1.06 x 10* y Ka2 = 4.95 x 107. La unión de ceh:Fc exhibió una sola clase afinidad para unir (Ka=5.0x10 ).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA LISTA DE SECUENCIAS
SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2 presentan la secuencia de ADN de un ADNc clonado que codifica una proteína designada Lcer-6 y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma, respectivamente, Un fragmento del ADN de SEC ID NO:1 se uso como una sonda para aislar el ADN de Lcer-7 de la presente invención, como se describió en el ejemplo 1. SEC ID NO:3 presenta la secuencia de ADN de un sitio de unión de polimerasa de ARN T3, como se describió en el ejemplo 1. SEC ID NO:4 y SEC ID NO:5 en la secuencia de ADN de un
ADNc de Lcer-7 humano clonado y la secuencia de aminoácidos que codifica al mismo respectivamente. El aislamiento de este ADNc se describió en el ejemplo 1. SEC ID NO:6 presenta la secuencia de aminoácidos el péptido Flag®. SEC ID NO:7 y SEC ID NO:8 presentan el ADN y secuencias de aminoácidos codificados, respectivamente, de un ADNc clonado que codifica la región de Fe de un anticuerpo de lgG1 humano.
LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Cerretti, Douglas P. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Citoquina Designada Lcer-7
(iii NUMERO DE SECUENCIAS: 8 (iv DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A DESTINATARIO: Immunex Corporation (B CALLE: 51 University Street (C CIUDAD: Seattle (D ESTADO: WA (E PAÍS: EUA (F ZP: 98101 (V FORMA LEÍBLE DE LA COMPUTADORA: (A TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B COMPUTADORA: Apple Macintosh (C SISTEMA OPERATIVO: System 7.1 (D SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi DATOS DE SOLICITUD ACTUAL (A NUMERO DE SOLICITUD: (B FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-DIC-1995 (C CLASIFICACIÓN: (vi ) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A NUMERO DE SOLICITUD: US 08/351,025 (B FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-DIC-1994 (C ) CLASIFICACIÓN (D) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/396,946 (E) FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-MAR-1995
(F) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Anderson, Kathryn A. (B) NUMERO DE REGISTRO: 32,172 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: 2829-WO (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUICACION: (A) TELEFONO: (206) 587-0430 (B) TELEFAX: (206)233-0644 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 555 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C ) NO. HILERAS: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) CONTRASENTIDO: NO (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: LCER-6 (¡x) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1. 552 (ix) DESCRI PCI ÓN DE SEC U ENC IA : S EC I D N O : 1 :
GCC CGG GCC AAC GCT GAC CGA TAC GCA GTC TAC TGG AAC CGT AGC AAC 48
Ala Arg Ala Asn Ala Asp Arg Tyr Ala Val Tyr Trp Asn Arg Ser Asn
1 5 10 15 CCC AGG TTT CAG GTG AGC GCT GTG GGT GAT GGC GGC GGC TAT ACC GTG 96
Pro Arg Phe Gln Val Ser Ala Val Gly Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Val 20 25 30 GAG GTG AGC ATC AAC GAC TAC CTG GAT ATC TAC TGC CCA CAC TAC GGG 144
Glu Val Ser He Asn Asp Tyr Leu Asp He Tyr Cys • •Pro His Tyr Gly 35 40 45 GCG CCG CTG CCC CCG GCT GAG CGC ATG GAG CGG TAC ATC CTG TAC ATG 192
Ala Pro Leu Pro Pro Ala Glu Arg Met Glu Arg Tyr He Leu Tyr Met 50 55 60 GTG AAT GGT GAG GGC CAC GCC TCC TGT GAC CAC CGG CAG CGA GGC TTC 240
Val Asn Gly Glu Gly His Ala Ser Cys Asp His Arg Gln Arg Gly Phe
65 70 75 80
AAG CGC TGG GAA TGC AAC CGG CCC GCA GCG CCC GGG GGA CCC CTC AAG 268
Lys Arg rp Glu Cys Aí 1 Arg Pro Ala Ala Pro Gly Gly Pro Leu Lys 85 90 95 TTC TCA GAG AAG TTC CAÁ CTC TTC ACC CCC TTT CC CTG GGC TTT GAG 336
Phe Ser Glu Lys Phe Gln Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe Glu 100 105 11 TC CGG CCT GGC CAC G?A TAC TAC TAC ATC TCT GCC ACÁ CCT CCC AAC 384
Phe Arg Pro Gly His 31u Tyr Tyr Tyr He Ser A^a Thr Pro Pro Asn 115 120 125 CTC GTG GAC CGA CCC TGC CTG CGA CTC AAG GTT TAT GTG CGT CCA ACC 432
Leu Val Asp Arg Pro Cys Leu Arg Leu Lys Val Tyr Val Arg Pro Thr 130 135 140 AAT GAG ACC CTG TAT G;. GCT CCA GAG CCC ATC TTC ACC AGT AAC AGC 480
Asn Glu Thr Leu Ty Giu Ala Pro Glu Pro He Phe Thr Ser Asn Ser
145 150 155 160
TCC TGC AGC GGC CTG GGT GGC TGC CAC CTC TTC CTC ACC ACC GTC CCT 528
Ser Cys Ser Gly Leu Gly Gly Cys His Leu Phe Leu Thr Thr Val Pro 16 170 175 GTG CTG TGG TCC CTT CTG GGC TCC TAG 555
Val Leu Trp Ser Leu Leu Gly Ser 180 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 184 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
Ala Arg Ala Asn Ala Asp Arg Tyr Ala Val Tyr Trp Asn Arg Ser Asn 1 5 10 15
Pro Arg Phe Gln Val Ser Ala Val Gly Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Val 20 25 30 Glu Val Ser He Asn Asp Tyr Leu Asp He Tyr Cys Pro His Tyr Gly
40 45 Ala Pro Leu Pro Pro Ala Glu Arg Met Glu Arg Tyr He Leu Tyr Met 50 55 60 Val Asn Gly Glu Gly His Ala Ser Cys Asp His Arg Gln Arg Gly Phe 65 70 75 80
Lys Arg Trp Glu Cys Asn Arg Pro Ala Ala Pro Gly Gly Pro Leu Lys 85 90 95
Phe Ser Glu Lys Phe Gln Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe Glu 100 105 110 Phe Arg Pro Gly His Glu Tyr Tyr Tyr He Ser Ala Thr Pro Pro Asn 115 120 125 Leu Val Asp Arg Pro Cys Leu Arg Leu Lys Val Tyr Val Arg Pro Thr
130 135 140 Asn Glu Thr Leu Tyr Glu Ala Pro Glu Pro He Phe Thr Ser Asn Ser 145 150 155 160
Ser Cys Ser Gly Leu Gly Gly Cys His Leu Phe Leu Thr Thr Val Pro 165 170 175
Val Leu Trp Ser Leu Leu Gly Ser 180 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C ) NO. HILERAS: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3: CTTTAGTGAG GGTTAATCTA TAG 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 687 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C ) NO. HILERAS: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) CONTRASENTIDO: NO (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: huLcer7 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) . UBICACIÓN: 1. 687 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
ATG TTG CAC GTG- GAG ATG TTG ACG CTG GTG TTT CTG GTG CTC TGG ATG 48 Met Leu His Val Glu Met Leu Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Trp Met -20 -15 -10 -5
TGT GTG TTC AGC CAG G?C CCG GGC TCC AAG GCC GTC GCC GAC CGC TAC 96 Cys Val Phe Ser Gln Asp Pro Gly Ser Lys Ala Va-1 Ala Asp Arg Tyr 1 5 10 GCT GTC TAC TGG AAC AGC AGC AAC CCC AGA TTC CAG AGG GGT GAC TAC 144 Ala Val Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Pro Are Phe Gln Arg Gly Asp Tyr 15 20 25 CAT ATT GAT GTC TG:' ATC AAT GAC TAC CTG GAT GTT TTC TGC CCT CAC 192 His He Asp Val Cyr; He Asn Asp Tyr Leu Asp Val Phe Cys Pro His 30 35 40 TAT GAG GAC TCC GTC CCA GAA GAT AAG ACT GAG CGC TAT GTC CTC TAC 240 Tyr Glu Asp Ser Val Pío Glu Asp Lys Thr Glu Arg Tyr Val Leu Tyr 45 50 55 60 ATG GTG AAC TTT GAT GGC TAC AGT GCC TGC GAC CAC ACT TCC AAA GGG 288 Met Val Asn Phe Asp Gly Tyr Ser Ala Cys Asp His Thr Ser Lys Gly 65 70 75 TTC AAG AGA TGG GAA TGT AAC CGG CCT CAC TCT CCA AAT GGA CCG CTG 336 Phe Lys Arg Trp Glu Cys Asn Arg Pro His Ser Pro Asn Gly Pro Leu 80 85 90 AAG TTC TCT GAA AAA TTC CAG CTC TTC ACT CCC TTT TCT CTA GGA TTT 384 Lys Phe Ser Glu Lys Phe Gln Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe 95 100 105 GAA TTC AGG CCA GGC CGA GAA TAT TTC TAC ATC TCC TCT GCA ATC CCA 432 Glu Phe Arg Pro Gly Arg Glu Tyr Phe Tyr He Ser Ser Ala He Pro 110 115 120 GAT AAT GGA AGA AGG TCC TGT CTA AAG CTC AAA GTC TTT GTG AGA CCA 480 Asp Asn Gly Arg Arg Ser Cys Leu Lys Leu Lys Val Phe Val Arg Pro 125 130 135 140
ACÁ AAT AGC TGT ATG AAA ACT ATA GGT GTT CAT GAT CGT GTT TTC GAT 528 Thr Asn Ser Cys Met Lys Thr He Gly Val His Asp Arg Val Phe Asp 145 150 155 GTT AAC GAC AAA GTA GAA AAT TCA TTA GAA CCA GCA GAT GAC ACC GTA 576 Val Asn Asp Lys Val Glu Asn Ser Leu Glu Pro Ala Asp Asp Thr Val 160 165 170 CAT GAG TCA GCC GAG CCA TCC CGC GGC GAG AAC GCG GCA CAÁ ACÁ CCA 624 His Glu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Gly Glu Asn Ala Ala Gln Thr Pro 175 180 185 AGG ATA CCC AGC CGC CTT TTG GCA ATC CTA CTG TTC CTC CTG GCG ATG 672 Arg He Pro Ser Arg Leu Leu Ala He Leu Leu Phe Leu Leu Ala Met 190 195 200 CTT TTG ACÁ TTA TAG 687
Leu Leu Thr Leu 205 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 228 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5.
Met Leu His Val Glu Met Leu Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Trp Met
-20 -15 -10 -5
Cys Val Phe Ser Gln Asp Pro Gly Ser Lys Ala Val Ala Asp Arg Tyr 5 10 Ala Val Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Pro Arg Phe Gln Arg Gly Asp Tyr 15 20 25
His He Asp Val Cys He Asn Asp Tyr Leu Asp Val Phe Cys Pro His 30 35 40 Tyr Glu Asp Ser Val Pro Glu Asp Lys Thr Glu Arg Tyr Val Leu Tyr 45 50 55 60
Met Val Asn Phe Asp Gly Tyr Ser Ala Cys Asp His Thr Ser Lys Gly 65 70 75
Phe Lys Arg Trp Glu Cys Asn Arg Pro His Ser Pro Asn Gly Pro Leu 80 85 90 Lys Phe Ser Glu Lys Phe Gln Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe
95 100 105 Glu Phe Arg Pro Gly Arg Glu Tyr Phe Tyr He Ser Ser Ala He Pro 110 115 120 Asp Asn Gly Arg Arg Ser Cys Leu Lys Leu Lys Val Phe Val Arg Pro
125 130 135 140
Thr Asn Ser Cys Met Lys Thr He Gly Val His Asp- Arg Val Phe Asp 145 150 155
Val Asn Asp Lys Val Glu Asn Ser Leu Glu Pro Ala Asp Asp Thr Val 160 165 170 His Glu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Gly Glu Asn Ala Ala Gln Thr Pro
175 180 185 Arg He Pro Ser Arg Leu Leu Ala He Leu Leu Phe Leu Leu Ala Met
190 195 200 Leu Leu Thr Leu 205
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C ) No. HILERAS: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) CONTRASENTIDO: NO (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: péptido FLAG (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6: Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 705 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C ) NO. HILERAS: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TI PO DE MOLÉCU LA: ADNc a AR Nm (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) CONTRASENTIDO: NO (vii) FU ENTE I N MEDIATA: (B) CLON : hlgG Fe (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) U BICACIÓN : 1 ..699 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
GAG CCC AGA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACÁ TGC CCA CCG TGC CCA GCA 48
Glu Pro Arg Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15 CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC 96
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACÁ TGC GTG GTG 144
Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG 192
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACÁ AAG CCG CGG GAG GAG CAG 240
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 * 75 80
TAC AAC AGC ACG TAC CGG GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG 288
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAC TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC 336
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 CTC CCA GCC CCC ATG C?G AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC 384
Leu Pro Ala Pro Met Gln Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC .CGG GAT GAG CTG ACC 432
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGG 480
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
CAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC 528
His He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC 576
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC 624
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG 672
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGAACTAGT 705
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 232 aminoácidos (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
Glu Pro Arg Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Glv Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met I?e Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His GJ u Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyi: Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Met Gln Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160
His He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230
Claims (26)
- REIVINDICACIONES 1. Un ADN aislado que codifica un polipéptido de Lcer-7 que se une a ceh o ele, en donde dicho polipéptido de Lcer-7 comprende una secuencia de aminoácidos que por lo menos es 80% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de residuos -20 a 208 de SEC ID NO:5 y residuos 1 a 208 de SEC ID NO:5.
- 2. Un ADN de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido de Lcer-7 comprende una secuencia de aminoácidos que por lo menos es 90% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de residuos -20 a 208 de SEC ID NO: 5 y residuos 1 a 288 de SEC ID NO:5.
- 3. Un ADN de la reivindicación 2, en donde dicho polipéptido de Lcer-7 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de residuos -20 a 208 de SEC ID NO:5 y residuos 1 a 208 de SEC ID NO:5. 4. Un ADN de la reivindicación 3, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de nucleótidos 1-687 de SEC ID NO: 4 y nucleótidos 61-687 de SEC ID NO:
- 4.
- 5. Un ADN aislado que codifica un polipéptido de Lcer-7 que se une a ceh o ele, en donde dicho polipéptido de Lcer-7 comprende una secuencia de aminoácidos que por lo menos es 80% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de residuos -20 a x de SEC ID NO:5 y residuos 1 a x de SEC ID NO:5, en donde x representa un número entero de entre 133 y 193, inclusive.
- 6. Un ADN de la reivindicación 5, en donde dicho polipéptido de Lcer-7 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de residuos -20 a 133, -20 a 182, -20 a 193, 1 a 133, 1 a 182, y 1 a 193 de SEC ID NO:5. 7. Un vector de expresión que comprende una secuencia de
- ADN de acuerdo con la reivindicación 1.
- 8. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 3.
- 9. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 5.
- 10. Una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 7.
- 11. Una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 8.
- 12. Una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 9.
- 13. Un proceso para producir un polipéptido de Lcer-7, comprendiendo inocular una célula huésped de la reivindicación 10, bajo condiciones que promueven la expresión de dicho polipéptido de Lcer-7 y recuperar el polipéptido de Lcer-7.
- 14. Un proceso para producir un polipéptido de Lcer-7, comprendiendo inocular una célula huésped de la reivindicación 11, bajo condiciones que promueven la expresión de dicho polipéptido de Lcer-7 y recuperar el polipéptido de Lcer-7.
- 15. Un proceso para producir un polipéptido de Lcer-7, comprendiendo inocular una célula huésped de la reivindicación 12, bajo condiciones que promueven la expresión de dicho polipéptido de Lcer-7 y recuperar el polipéptido de Lcer-7.
- 16. Un polipéptido de Lcer-7 purificado codificado por un ADN de la reivindicación 1.
- 17. Un polipéptido de Lcer-7 que comprende una secuencia de aminoácidos que por lo menos es 90% idéntica a la secuencia de residuos de aminoácidos de 1a 208 de SEC ID NO.5.
- 18. Un polipéptido de Lcer-7 de la reivindicación 17, que comprende la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 208 de SEC ID NO:5.
- 19. Un polipéptido de Lcer-7 soluble purificado que se une a ceh o ele, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que por lo menos es 80% idéntica a la secuencia de los residuos de 1 a x de SEC ID NO:5, en donde x representa un número entero de 133 y 193, inclusive.
- 20. Un polipéptido de Lcer-7 soluble de la reivindicación 19, en donde dicho polipéptido de Lcer-7 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de residuos 1-133, 1-182 y 1-193 de SEC ID NO:5.
- 21. Un polipéptido de Lcer-7 purificado, caracterizado por una secuencia de aminoácidos N-terminal de Gln-Asp-Por-Gly-Ser-Lys-Ala-Val-A-a-Asp-Arg-Tyr-Ala-Val-Tyr-.
- 22. Una proteína de Lcer-7 que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada del inserto de ADNc de Lcer-7 del vector recombinante en ATCC 75959.
- 23. Un anticuerpo que es inmunorreactivo con un polipéptido de Lcer-7 de acuerdo con la reivindicación 16.
- 24. Un anticuerpo que es inmunoreactivo con un polipéptido de Lcer-7 de acuerdo con la reivindicación 18.
- 25. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 23 ó 24, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
- 26. Un método para suministrar un agente de diagnóstico o terapéutico a una célula que expresa un receptor seleccionado de ceh, ele, o cce en la superficie celular, comprendiendo poner en contacto dicha célula como un conjugado que comprende un polipéptido de Lcer-7 de acuerdo con la reivindicación 16 y un agente de diagnóstico o terapéutico.
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