MXPA98007441A - Citocina designada lerk-8 - Google Patents

Abstract

La invención es dirigida a una proteína designada Lerk-8, DNA que codifica la Lerk-8, y células huésped transformadas con DNA de Lerk-8. También se proporcionan anticuerpos que son inmunoreactivos con Lerk-8. La proteína Lerk-8 se liga a los receptores de superficie celular conocidos como elk y hek.

Description

CITOC1NA DESIGNADA LERK-8 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas conocidas como ias cinasas de tirosina de receptor tienen una actividad de cinasa intrínseca que es activada sobre la unión del ligando. Esta clase de proteínas está caracterizada por motivos estructurales conservados dentro de los dominios catalíticos (Hanks et al. , Science, 242:42, 1988) y puede ser subdividida en familias basadas en características estructurales de las regiones N-terminal para el dominio catalítico. La familia eph de receptores, nombrada después del primer miembro aislado (Hirai et al., Science 238:1717, 1987) es la subfamilia más grande de cinasas de tirosina de receptor. Entre los miembros de esta familia están cek'4 de pollo (Sajjadi et al. ?ew Biol. 3:769, 1991) y ce1<5 (Pasquale, E.B. , Cell Regulation 2:523: 1991 ); mek4 de murino (Sajjadi et al. , supra), bsk {Zhou et -al., J. Nevrosci. Re . , 37:123, 1994), nuk (Henkemeyer et al. , Oncogene 9: 1001 , 1994), y sek (Gilardi-Hebenstreit et al., Oncogene 7:2499, 1992); élk de rata (Letwin et al., Oncogene 6: 1057, 1991 ), ehk-1 y ehk-2 (Maisonpierre et al. , Oncogene 8:3277, 1993): y hek humano (Boyd et al., J. Biol. Chem., 267:3262, 1992; Wicfcs et al. , PNAS USA, 89: 1611 , 1992), hek2 (Bohme et al. , Oncogene 8:2857, 1993) eck (Lindberg et al. Mol. Ceíl. Biol. 10:6316, 199O), y erk (Chan et al. , supra).

Las proteínas de esta subfamilia no solo se relacionan en sus dominios citoplásmicos, sino también en sus dominios extracelulares, los cuales son 41 a 68% idénticos. De manera interesante, las distribuciones de tejido de estos varios receptores, son diversas. Debido a que muchas cinasas de tirosina de receptor epti-relacionadas son expresadas principalmente en el cerebro, se ha postulado que estos receptores y sus ligando pueden ser involucrados en el crecimiento, diferenciación y supervivencia de las neuronas. Aquellos ligandos que han sido identificados para las cinasas de tirosina de receptor son un grupo diverso de proteínas que afectan el crecimiento, diferenciación y supervivencia de células que expresan los receptores. Se ha encontrado que ciertos lígandos se unen a más de un receptor de la familia eph. Ejemplos de los ligandos para hek y elk son los que se describen a continuación. La identificación de ligandos adicionales para hek y elk que puede existir podría probar ser útil en la investigación de la naturaleza de procesos celulares regulados por señalamiento a través de estos receptores. Si se desea la intensificación o inhibición de una señal biológica particular mediada a través de estos receptores, es ventajoso identificar cada una de las proteínas que pueden jugar un papel en la transducción de tales señales. Además, se sabe que ciertas proteínas pueden ligarse a receptores sin iniciar 1a transducción de la señal, incluyendo proteína antagonista de receptor de interleukin-1 (Eisenberg et al., Nature 343:341 , 1990; Hannum et a1. , Nature 343:336, 1990; y Cárter et al., Nature 344:633, 1990). También es deseable la identificación de proteínas adicionales que ligan hek o elk, con el fin de determinar si cualquiera de tales proteínas funciona como un antagonista.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a una novedosa citocina designada Lerk-8. Lerk-8 se liga a los receptores de superficie celular conocidos como hek y elk, los cuales son miembros de la familia eph/elk ante? descrita de cínasas de lirosina de receptor. Se proporcionan en la presente las proteínas de Lerk-8 purificadas, junto con DNAs aislados que codifican Lerk-8, vectores de expresión comprendiendo el DNA de Lerk-8, y células huésped transformadas con los vectpres de expresión. Los procesos para producir Lerk-8 incluyen cultivar tales células huésped transformadas bajo condiciones que promueven la expresión de los polipéptidos de Lerk-8, y recuperar la Lerk-8. Esta invención también abarca anticuerpos que son dirigidos contra Lerk-8.

PESCRI CroWO?TALLAPA Ü LA INVENCIÓN Se proporciona en 1a pTe ente una novedosa citocrna designada Lerk-8. Esta citocina se liga a las cinasas de tirosina de receptor conocidas como elk y hek. La presente invención abarca DNA que codifica Lerk-8, vectores de expresión comprendiendo el DNA de Lerk-8, y células huésped transformadas con los vectores de expresión. Un método para producir polipéptidos Lerk-8 comprende cultivar las células huésped transformadas bajo condiciones que conducen a la expresión de Lerk-8, y recuperar la Lerk-8 expresada. Se describen los polfpéptidos Lerk-8 purificados tanto en forma soluble como ligada a la membrana.

Los polipéptidos Lerk-8 o fragmentos inmunogénicos de los mismos pueden ser empleados como inmupógepos para generar anticuerpos que son inmunoreactivos con los mismos. En una modalidad de la invención, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Un cDNA que codifica Lerk-8 humano fue aislado como se describe en el ejemplo 1. La secuencia de nucteútidos de este cDIMA de 1_erk-8 se presenta en SEQ ID NO:1 , y la secuencia de aminoácidos codificada con ella se presenta en SEO ID NO:2. Esta proteína Lerk-8 comprende un péptido de señal N-terminal (aminoácidos -27 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 197), una región transmembrana (aminoácidos 198 a 224), y un dominio citoplásmico (aminoácidos 225 a 313). El peso molecular calculado de la proteína Lerk-8 humana madura (aminoácidos 1 a 313 de SEQ 1D tíO:2) es aproximadamente 33 kilodaltones, y el punto isoeléctrico (pl) es 8.46. Una modalidad de la presente invención se dirige de esta manera, a una proteína Lerk-8 humana purificada caracterizada por un peso molecular calculado de aproximadamente 33 krlOdaltones y un p1 xle 8.46, en donde 1a secuencia de aminoácidos N-terminal de una forma madura de la proteína es Leu-Ser-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Trp-Asn-Ser-A1a-Asn- (aiminoácidos 1-12 de SEQ ID NO.2). El peso molecular calculado se basa en el peso molecular de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos especificada, exclusivo de cualquier glicosilación. La persona experta reconocerá que las formas glicosiladas de la proteína tendrán un peso molecular mayor.

También son proporcionados los fragmentos Lerk-8, por ejemplo, fragmentos que retienen la capacidad para ligar hek o elk. Ejemplos de tales fragmentos son polipéptidos Lerk-8 solubles. La presente invención proporciona tanto formas de Lerk-8 ligadas a la membrana celular como solubles (secretadas). Los polipéptidos Lerk-8 solubles incluyen él dominio de ligadura de receptor de un Lerk-8, pero carecen de la región transmembrana que podría causar retención del polipéptido en una membrana celular. En una modalidad, un Lerk-8 soluble comprende el dominio extracelular entero (por ejemplo, aminoácidos 1 a T97 del Lerk-8 humano de SEQ ID NO:2). En otra alternativa, el polipéptido soluble es un fragmento del dominio extracelular de Lerk-8 que retiene la capacidad para ligar elk o hek. Se cree que la porción del dominio extracelular que es muy importante para ligadura de receptor, incluye los aminoácidos 1 a 142 de SEQ ID NO:2. El resto del dominio extracelular (aminoácidos 143 a 197) constituye una región espaciadora. Ejemplos de polipéptidos Lerk-8 humanos solubles incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos truncados en el extremo C, de manera que el aminoácido C-terminal es cualquiera de los residuos entre o incluyendo los residuos en la posiciones 142 a 197 de SEQ ID NO:2. En otras palabras, tales polipéptidos Lerk-8 solubles comprenden aminoácidos 1 a y de SEQ ID NO:2, en donde y es un entero desde 142 hasta 197. Lerk-8 soluble puede ser identificado (y distinguido a partir de sus contrapartes de ligadura de membrana no solubles) al separar células intactas que expresan un polipéptido Lerk-8 a partir del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, y ensayando el medio (sobrenadante) para la presencia de la proteína deseada. La presencia de Lerk-8 en el medio indica que la proteína fue secretada a partir de las células, y así, es una Torma soluble dé la proteína deseada. Las formas solubles de Lerk-8 poseen ciertas ventajas sobre la forma ligada a la membrana de la proteína. Se facilita 1a purificación de la proteína a partir de células huésped recombinantes, ya que las proteínas solubles son secretadas de las células. Además, generalmente, las proteínas solubles son más adecuadas para ciertas aplicaciones, por ejemplo, para administración intravenosa. Cuando se expresa inicialmente dentro de una célula huésped, los polipéptidos Lerk-8 solubles comprenden de manera conveniente, el péptido de señal natural o uno de los péptidos de señal o líder heterólogos descritos más adelante, el cual es funcional dentro de las células huésped empleadas. Las secuencias de DNA aisladas que codifican proteínas Lerk-8 solubles, son abarcadas por la presente invención. Lerk-8 truncado, incluyendo polipéptidos solubles, puede prepararse por cualquiera de un número de técnicas convencionales. Una secuencia de DNA que codifica un Lerk-8 truncado, puede ser químicamente sintetizado usando técnicas conocidas. Fragmentos de DNA también pueden ser producidos mediante digestión de endonucleasa de restricción de una secuencia de DNA clonada de longitud completa, y aislados mediante electroforesis en geles de agarosa. Pueden utilizarse los oligonucleótidos que reconstruyen el extremo 5' o 3' de un fragmento de DNA a un punto deseado. Los enlazadores que contienen sitios de corte de endonucleasa de restricción pueden ser empleados para insertar el fragmento de DNA deseado en un vector de expresión. El procedimiento de reacción en cadena de poíimerasa (PCR) bien conocido, también puede ser empleado para amplificar un fragmento de DNA que codifica un fragmento de proteína particular. Los iniciadores que definen los términos deseados del fragmento de DNA son empleados en la PCR. Como una alternativa adicional, pueden emplearse técnicas de mutagénesis conocidas para insertar un codón de paro en un punto deseado, por ejemplo, inmediatamente corriente abajo del codón para el último aminoácido del dominio de ligadura de receptor. Una etiqueta de secuencia expresada (EST) contiene regiones de identidad con SEQ ID NO: 1 (ver el ejemplo 1). El registro de base de datos de computadora para esta EST (acceso no. H 10006) presenta una secuencia de DNA de 454 nucleótidos de longitud. Cuando la secuencia EST H10006 es alineada con SEQ ID NO: 1 , se encontraron regiones de identidad entre los nucleótidos 663 y 1118 de SEQ ID NO: 1. Ciertos nucleótidos en EST H1OO06 son no identificados (es decir, son designados "N" en el registro de base de datos porque su identidad era desconocida). La secuencia EST contiene nucleótidos insertados no encontrados en las posiciones correspondientes en SEQ ID NO: 1 , así como supresiones y desigualdades cuando se compara con SEQ ID NO:1. Ningún marco de lectura es identificado en el archivo de base de datos para ia EST, y la secuencia carece de un codón de iniciación. Además, las inserciones y supresiones antes mencionadas provocarían desplazamientos en el marco de lectura, comparados con el marco de lectura de la secuencia de Lerk-8 de SEQ ID NO: 1. Sin embargo, aún si un marco de lectura ha sido dilucidado e Identificado, y los ajustes hechos para los nucleótidos, insertados, suprimidos y no identificados, un trasladado de EST H 10006 carecería de uno de los cuatro residuos de cisteína que son conservados en las otras proteínas Lerk (descritas más adelante), y también carecería de otros residuos conservados. Se cree que las cuatro cisteínas conservadas son importantes para la propiedad de ligadura a elk y hek. Se han descubierto otras proteínas que se ligan tanto a hek como elk, y son designadas Lerk-1 a Lerk-7 [por las siglas en inglés, ligands of the eph-related junases (Mgandos de las cinasas relacionadas con eph)]. Lerks 2 y 5 son proteínas transmembrana tipo 1 (como los es Lerk-8), mientras que Lerks 1 , 3, 4, 6 y 7 están sujetas a la membrana celular mediante enlace GP El porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos de estas seis proteínas varía desde aproximadamente 24 hasta 59%, y las proteínas tienen cada una cuatro residuos de cisteína conservados. Holzman et al. (Mol. Cell. Biol. 10:5830, 1990) reportaron la clonación de cDNA para una proteína llamada B61. La capacidad de B61 para ligarse a elk y a hek fue descubierta subsecuentemente, y se le dio a la proteína B61 la designación alternativa de Lerk-1 (Beckmann et al., EMBO J 13:3757, 1994). También se ha reportado que B61 es un ligando para la cinasa de tirosina de receptor descrita conocida como eck (Bartley et al., Nature 368:558, 1994).

Lerk-2, también conocida como ligando elk, es descrita en la solicitud de PCT WO 94/11384. Lerk-3 y erk-4, también conocidos como ligandos hek, son ambas descritas en WO 95/06065, Lerk-5 es descrita en WO 96/01839, Lerk 6 en WO 96/10911 , y Lerk-7 en WO 96/17925. El porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de Lerk-8 humana de SEQ ID NO:2 con 1a secuencia de aminoácidos de longitud completa de otras diversas proteínas, es como sigue, en donde "h" representa humano, "m" representa ratón, y *r" representa rata: h Lerk-1 25.14 hLerk-2 40.80 rLerk-2 369.69 mLerk-2 40.00 hLerk-3 24.88 hLerk-4 25.41 hLerkd 41.23 mLerk-5 42.07 mLerk-6 26.18 h Lerk-7 24.88 Como se usa en la presente, el término "Lerk-8" se refiere a un género de polipéptidos que son substancialmente homólogos a la proteína Lerk-8 humana descrita en el ejemplo 1. Los polipéptidos comprenden, de preferencia, una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica, y más preferiblemente por lo menos 90% idéntica, a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.2, como se describe adicionalmente más adelante. Los pofipéptidos Lerk-8 son capaces de ligarse a los receptores antes descritos designados hek y elk. Ciertos usos de Lerk-8 surgen de su capacidad par ligarse a elk o hek, como se describe en más detalle más adelante. Las proteínas y ácidos nucleicos Lerk-8 humanos están dentro del alcance de la presente invención, como son proteínas y ácidos nucleicos Lerk-8 derivados de otras especies de mamífero que incluyen pero no están limitadas a especies de murino, bovinas, porcinas, equinas o de varios primates. Debido a la degeneración conocida del código genético, en donde más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de DNA puede varia de la mostrada en SEQ ID NO: 1 y todavía codificar una proteína Lerk-8 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEO TD NO:2. Tales variantes de secuencias de DNA pueden resultar de mutaciones silenciosas (por ejemplo, que ocurren durante la amplificación de FCR), o pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia natural. La presente invención proporciona, de esta manera, secuencias de DNA aisladas seleccionadas de secuencias de DNA de Lerk-8 naturales (por ejemplo, cDNA comprendiendo la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:1) y DNA que es degenerado como un resultado del código genético para una secuencia de DNA de Lerk-8 natural. Los polipéptidos Lerk-8 proporcionados en la presente, incluyen variantes de polipéptidos Lerk-8 naturales que retienen una actividad biológica de una Lerk-8 natural. Tales variantes incluyen polipéptidos que son substancialmente homólogos a lerk-8 natural, pero los cuales tienen una secuencia de aminoácidos diferente de aquélla de una Lerk-8 natural debido a una o más supresiones, inserciones o substituciones. De igual manera, los DNAs que codifican Lerk-8 de la presente invención incluyen variantes que difieren de una secuencia de DNA de Lerk-8 natural debido a una o más supresiones, inserciones o substituciones, pero que codifican un polip^ptido Lerk-8 biológicamente activo. ?l término "biológicamente activo" como se refiere a Lerk-8, indica que Lerk-8 es capaz de ligarse a hek o a elk. Las secuencias de aminoácidos o DNA variantes de preferencia son por lo menos 80% idénticas a una secuencia de Lerk-8 natural, muy preferiblemente por lo menos 90% idéntica. El porcentaje de identidad puede ser determinado, por ejemplo, al comparar la información de secuencia usando el programa de computadora GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucí. Acids Res. 12:287, 1984) y disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros de omisión preferidos para el programa GAP incluyen: (1 ) una matriz de comparación uñaría (conteniendo un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación de peso de Gribskov y Burgess, Nucí. Acids Res. 14:6745, 1986, como fue descrito por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) una pena de 3.0 para cada abertura y una pena de 0.10 adicional por cada símbolo en cada abertura; y (3) sin pena para cada abertura final. Modalidades adicionales de secuencias de aminoácidos variantes son aquéllas que comprenden substituciones conservadoras, significando que uno o más residuos de aminoácidos de una Lerk-8 natural es reemplazado por un residuo diferente, pero que el polipéptido Lerk-8 substituido de manera conservadora, retiene una actividad biológica deseadei de la proteína natural (por ejemplo, la capacidad para ligar elk o hek). Ejemplos de substituciones conservadoras incluyen la substitución de residuos que no alteran la estructura secundaria o terciaria de la proteína. Un aminoácido dado puede ser reemplazado por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. Ejemplos de substituciones conservadoras incluyen la substitución de un residuo alifático por otro, tal como Me, Val, Leu o Ala por otro, o substituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Son bien conocidas otras substituciones conservadoras, por ejemplo, que involucran substituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares. La invención incluye además polipéptidos Lerk-8 con o sin glicosilación de patrones naturales asociados. Lerk-8 expresado en sistemas de expresión de levadura o de mamífero (por ejemplo, células COS-7) puede ser similar a o significativamente diferente de un polipéptido Lerk-8 natural en un patrón de glicosilación y peso molecular, dependiendo de la elección de sistema de expresión. La expresión de polipéptidos Lerk-8 en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas. Los sitios de N-glicosilación pueden ser modificados para evitar la glicosilación, permitiendo que la expresión de un análogo de carbohidrato reducido más homogéneo en sistemas de expresión de levadura y mamífero. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos son caracterizados por una terna de aminoácidos Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro y Y es Ser o Thr. La proteína Lerk-8 humana de SEQ ID NO:2 comprende — una de tales ternas, en los aminoácidos 183-185 de SEQ ID NO:2. Las substituciones, adiciones o supresiones apropiadas a la secuencia de nucleótidos que codifican estas ternas resultarán en la prevención de unión de residuos de carbohidratos a la cadena lateral de Asn. La alteración de un simple necleótido, elegido de manera que Asn sea reemplazado por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Procedimientos conocidos para la inactivación de sitios de N-giicosilación en proteínas incluye aquéllos descritos en la patente estadounidense 5,071 ,972, y EP 276,846. En otro ejemplo de variantes, las secuencias que codifican residuos Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden ser alterados para provocar que los residuos Cys sean suprimidos o reemplazados con otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos sobre la renaturalización. Los residuos de cisteína que corresponden a las cuatro cisteínas que se conservan entre las proteínas Lerk son encontrados en las posiciones 35, 65, 77 y 129 de SEQ ID NO:2. Estas cuatro cisteínas permanecen deseablemente sin alterar en las variantes de Lerk-8. Otras variantes son preparadas mediante modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para intensificar la expresión en sistemas de levadura en los cuales está presente la actividad de proteasa KEX2. Los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 son inactivados al suprimir, adicionar o substituir residuos para alterar pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys- Arg para eliminar la ocurrencia de estos residuos básicos adyacentes. La Lerk-8 humana contiene tales pares de residuos básicos adyacentes en los aminoácidos 13-14, 63-64, T51 -152, 225-226, y 227-228 de SEQ ID NO:2. Las parejas Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles al corte de KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa un acercamiento preferido y conservados para inactivar los sitios KEX2. Las variantes de Lerk-8 que ocurren de manera natural también son abarcadas por la invención. Ejemplos de tales variantes son las proteínas que resultan de casos de empalme de mRNA alterno o de corte proteolítico de la proteína Lerk-8. Los empalmes alternos de mRNA pueden, por ejemplo, producir una proteína Lerk-8 truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble que ocurre de manera natura) de la proteína. Variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N o C sobre la expresión en diferentes tipos de células huésped, debidos a la remoción proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína Lerk-8 (generalmente a partir de los aminoácidos terminales 1-5). Así, se proporcionan específicamente en la presente las proteínas Lerk-8 en las cuales el residuo N-terminal es cualquiera de los aminoácidos 1 a 5 de SEQ ID NO:2, y el residuo C-terminal es cualquiera de los aminoácidos 308 a 313 de SEQ ID NO:2. Para Lerk-8 soluble, el residuo C-terminal puede ser cualquiera de los aminoácidos 192 a 197 de SEQ ID NO:2. Las proteínas Lerk-8, en las cuales las diferencias de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 son atribuíbles a polimorfismo genético (variación alélica entre los individuos que producen la proteína, también se contemplan en la presente. Un cDNA de Lerk-8 aislado incluía una substitución de nucleótido simple cuando se comparó con el cDNA descrito en el ejemplo 1. La secuencia de DNA de Lerk-8 variante difiere de la secuencia de DNA presentada en SEQ ID NO:1 , en que el nucleótido en la posición 1370 de la variante es citosina (C), en lugar de la guanina (G) encontrada en esa posipión en SEQ ID NO: 1. Con respecto a la discusión anterior del péptido de señal y varios dominios de la proteína Lerk-8, el técnico experto reconocerá que los límites antes descritos de tales regiones de la proteína son aproximados. Los límites de la región transmembrana (los cuales pueden ser predichos al usar programas de computadora disponibles para ese propósito) pueden diferer de aquéllos antes descritos. Así, se contemplan en la presente los polipéptidos Lerk-8 solubles, en los cuales los extremos C del dominio extracelular difiere del residuo así identificado antes. Como otra ilustración, el corte de un péptido de señal puede ocurrir en sitios diferentes a aquéllos predichos por programa de computadora. Además, se reconoce que una preparación de proteína puede comprender una mezcla de moléculas de proteína teniendo diferentes aminoácidos N-terminales, debido al corte del péptido de señal en más de un sitio. El análisis de computadora de la proteína Lerk-8 humana indica que el corte del péptido de señal muy probablemente ocurrirá después del 4 aminoácido -1 de SEQ ID NO:2. Cuatro sitios de corte de péptidos de señal alternativos predichos por programa de computadora son (en orden descendiente de probabilidad) ubicados después de los residuos 3, -5, 2 y -2 de SEQ ID NO:2. Así, se proporcionan en la presente polipéptidos Lerk-8 humanos maduros, en los cuales el aminoácido N-terminal es seleccionado de los residuos en las posiciones 4, -4, 3 y -1 , además de la modalidad en la cual el aminoácido N-terminal es el residuo en la posición 1. Las variantes y derivados de proteínas Lerk-8 naturales, pueden prepararse mediante mutación de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos Lerk-8 naturales. Las mutaciones pueden ser introducidas en lugares particulares al sintetizar oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia natural. Siguiendo la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, substitución o supresión deseada. De manera alternativa, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis de sitio específico dirigida por oligonucleótidos. Métodos para hacer tales alteraciones incluyen aquéllos descritos por Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Enero T985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981 ); Kunkel et al (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); y patentes estadounidenses Nos. 4,518,584 y 4,737,462. Lerk-8 puede ser modificada para crear derivados de lerk-8 al formar conjugados covalentes o agregados con otras porciones químicas, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes de Lerk-8 pueden ser preparados al enlazar las porciones químicas a grupos rtprciünales ^ las cadenas laterales de aminoácidos Lerk-8 o en los extremos N o C de un polipéptido Lerk-8 o el dominio extracelular del mismo. Otros derivados de Lerk-8 dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregados de polipéptidos Lerk-8 con otras proteínas o polipéptidos, tal como por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminal o C-terminal. Las fusiones de pólipéptido Lerk-8 pueden comprender péptidos adicionados para facilitar la purificación e identificación de Lerk-8. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-Kís o 1os péptidos de identificación antigénicos descritos en la patente estadounidense No. 5,011 ,912 y en Hopp et al, Bio/Technology 6:1204, ?988. Uno de tales péptidos es el péptido Flag®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO:3), el cual es altamente antigénico y proporciona un epitope reversiblemente ligado a un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo un ensayo rápido y fácil purificación de proteína recombinante expresada. Un hibridoma de murino designado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que liga el péptido Flag® en la presencia de ciertos cationes de metal divalente, como se describe en la patente estadounidense 5,011 ,912, incorporada en la presente por referencia. La línea de célula de hibridoma 4E11 ha sido depositada con the American Type Culture Collection bajo el acceso no. HB 9259. Los anticuerpos monoclonates que ligan el péptido Flag® están disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems División, New Haven, Connecticut.

Las proteínas Lerk-8 (incluyendo fragmentos y variantes) pueden ser probadas por la capacidad para ligar hek o elk en cualquier ensayo adecuado. La actividad biológica de una variante de lerk-8 puede ser determinada, por ejemplo, al ensayar la capacidad de la variante para competir con una Lerk-8 natural para ligarse a hek o elk (es decir, ensayos de ligadura competitiva). Los ensayos de ligadura competitiva pueden ser realizados siguiendo la metodología convencional. Los reactivos que pueden ser empleados en ensayos de ligadura competitivos incluyen radiomarcado, células que expresan hek/elk intactas y Lerk-8 soluble. Por ejemplo, Lerk-8 natural soluble iradiomarcada puede usarse competir con una variante de Lerk-8 soluble para ligarse a hék o elk ligadas a la superficie celular. ?n lugar de células intactas, una podría substituir una proteína de fusión elk/Fc o hek/Fc soluble ligada a una fase sólida a través de la interacción de Proteína A o Proteína G (en la fase sólida) con la porción Fc. Las columnas de cromatografía que contienen Proteína A y Protelna G incluyen aquéllas disponibles de Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ. Otro tipo de ensayo de ligadura competitiva utiliza hek o elk solubles radio marcadas, tal como una proteína de fusión elk/Fc o hek/Fc soluble, y células intactas que expresan Lerk-8. Todavía en otra alternativa, una Lerk-8 puede ser ensayada por la capacidad para competir con una de las otras proteínas Lerk (Lerks 1 a 7, descritas antes) para ligarse a elk o hek. Los resultados cualitativos pueden ser obtenidos mediante ensayos de ligadura de placa autorradiográficos competitivos, mientras que gráficas Scatchard (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660, 1949) pueden sier utilizadas para generar resultados cuantitativos. Es posible que la Lerk-8 de la presente invención se ligará a otros receptores de la familia eph {ver la sección de antecedentes). Tal ligadura puede ser analizada usando un ensayo adecuado análogo a aquéllos descritos antes. Los usos de Lerk-8 que surgen de la capacidad para ligar elk y hek incluyen, pero no están limitados a, lo siguiente: Lerk-3 encuentra uso como un reactivo de purificación de proteína. Los polipéptidos Lerk-8 pueden ser unidos a un materíal de soporte sólido y usarse para purificar proteínas hek o elk mediante cromatografía de afinidad. En modalidades particulares, fragmentos o proteínas da fusión Lerk-8 (por ejemplo, fusiones Lerk-8/Fc) conteniendo el dominio de ligadura de receptor de Lerk-8 son unidos a un soporte sólido mediante procedimientos convencionales. Como un ejemplo, están disponibles las columnas de cromatografía que contienen grupos funcionales que reaccionarán con grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos de proteínas (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, ?l). Las proteínas de fusión Lerk-8/Fc pueden unirse a columnas de cromatografía que contienen Proteína A o Proteíma G a través de la interacción con la porción Fc. Las proteínas Lerk-8 también encuentran uso para purificar o identificar células que expresan hek o elk en la superficie de la célula. La lerk-8 (o fragmento o fusión de la misma) es ligada a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía de columna o un substrato adecuado similar. Por ejemplo, microesferas magnéticas pueden ser recubiertas con Lerk-8 y sostenidas en un recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezcla de células que contienen células que expresan hek/elk se ponen en contacto con la fase sólida que tiene lerk-8 en la misma. Las células que expresan hek o elk en la superficie celular se ligan a la Lerk-8 fijada, y las células sin ligar son retiradas entonces por lavado. De manera alternativa, mezclas de células que se sospecha que contengan células hek/elk+ se incuban primero con Lerk-8 biotinilada. Los periodos de incubación típicamente son por lo menos de una hora de duración para asegurar la ligadura suficiente a hek/elk. La mezcla resultante se pasa entonces a través de una columna empacada con perlas cubiertas de avidina, por lo cual la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la ligadura de la célula a las perlas. Los procedimientos para usar perlas cubiertas por avidina son conocidos (ver Berenson, et al. J. Cell. Biochem. , 10D:239, 1986). El lavado de material sin ligar y la liberación de las células ligadas se realiza usando métodos convencionales. La población de células así purificadas puede ser usada en varios estudios in vitro o procedimientos in vivo, por ejemplo, para repoblar tejidos en un mamífero. Par ilustrar, células neurales que expresan elk pueden aislarse mediante el procedimiento precedente, entonces administrarse a un mamífero afligido con un desorden neurodegenerativo. Las células Hek+ incluyen ciertas células de leucemia (identificadas abajo). Las células de leucemia aisladas pueden usarse en estudios de los efectos de varios medicamentos en las células, por ejemplo.

Para identificar tipos adicionales de células que expresan hek o elk en la superficie de células, Lerk-8 puede ser conjugada a una porción detectable, tal como un radionucleótido. Como un ejemplo, puede realizarse un radiomarcado con 12SI por cualquiera de varias metodologías estándares que producen una molécula 1 Sl-Lerk-8 funcional marcada para alta actividad específica. Otras porciones detectables incluyen enzimas que pueden catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica. Las células a ser probadas para expresión de hek/elk se ponen en contacto con Lerk-8 marcada. Después de la incubación, Lerk-8 marcada sin ligar es removida y se determina la presencia o ausencia de la porción detectable en las células. Las proteínas Lerk-8 también encuentran uso para medir la actividad biológica de proteínas elk o hek en términos de su afinidad de ligadura para Lerk-8. Las proteínas Lerk-8 pueden ser empleadas de esta manera por aquéllos que conducen estudios de "aseguramiento de calidad", por ejemplo, para monitorear la vida de anaquel y estabilidad de proteínas elk o hek bajo condiciones diferentes. Para ilustrar, Lerk-8 pueden emplearse en un estudio de afinidad de ligadura para medir la actividad biológica de una proteína elk que ha sido almacenado a temperaturas diferentes, o producidos en diferentes tipos de células. También pueden usarse para determinar si la actividad biológica es retenida después de modificación de una proteína elk o hek (por ejemplo, modificación química, truncación, mutación, etc). La afinidad de ligadura de la proteína elk modificada para Lerk-8 es comparada con aquélla de una proteína elk sin modificar para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones en la actividad biológica de elk. Asimismo, la actividad biológica de una proteína hek puede ser valorada usando Lerk-8. La actividad biológica de una proteína elk o hek puede ser indagada antes de usarse en un estudio de investigación, por ejemplo. Los polipéptidos Lerk-8 también encuentran uso como portadores para entregar agentes unidos a eso a células que soportan el receptor de superficie de células elk o hek. La expresión de antígeno hek ha sido reportada para ciertas líneas de células de leucemia, incluyendo las líneas de células de leucemia de células T humanas designados JM y HSB-2 y |a línea de células de leucemia de células pre-B humanas designada LK63 (Wicks et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 1611 , 1992; Boyd et al., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992). Las proteínas Lerk-8 pueden ser usadas para entregar agentes de diagnóstico o terapéuticos para estas células ( o a otro tipos de células encontrados para expresar hek o elk en la superficie de células) en procedimientos in vitro o in vivo. Un ejemplo de tal uso es para exponer una línea de células leucémicas hek* a un conjugado de agente terapéutico/Lerk-8 para valorar si el agente exhibe citotoxicídad hacia las células leucémicas. Un número de agentes terapéuticos diferentes unidos a Lerk-8 puede ser incluido en un ensayo para detectar y comparar el efecto citotóxico de los agentes en las células leucémicas. Los conjugados de Lerk-8/agente diagnóstico pueden ser empleados para detectar la presencia de células hek+ in vitro o in vivo. Los agentes detectables (diagnóstico) y terapéuticos que pueden unirse a un polipéptido Lerk-8 incluyen, pero no están limitados a, medicamentos, toxinas, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares, siendo elegido el agente particular de acuerdo a la solicitud pretendida. Los ejemplos de medicamentos incluyen aquéllos usados para tratar varias formas de cáncer, por ejemplo, mostazas de nitrógeno tales como mostaza de nitrógeno de L-fenilalanína o ciclofosfamida, agentes Intercalantes tales como cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos tal como 5-fluorouracilo, alcaloides de vincapervinca tal como vincristina, y antibióticos tales como bleomicina, doxorubicina, daunorubicina, y derivados de los mismos. Entre las toxinas se encuentran rictpa, abrina, toxina cie difteria, «xstsxma A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactivadoras ribosomales, micotoximas tales como tricotecenas, y derivados y fragmentos (por ejemplo, cadenas simples) de los mismos. Los radionúclidos adecuados para uso diagnóstico incluyen, pero no están limitados a, 1 3l, 131l, 99mTc, i 11 ln, y 76Br. Los radionúclidos adecuados para uso terapéutico incluyen, pero no están limitados a, 131l, 211At, 77Br, 1ßßRe, 1 ß8Re, í12Pb, 12Bi, 109Pd, 6 Cu, y 6 Cu. Tales agentes pueden unirse a la Lerk-8 por cualquier procedimiento convencional adecuado. Lerk-8, al ser una proteína, comprende grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos que, por ejemplo, pueden hacerse reaccionar con grupos funcionales en un agente deseado para formar ligaduras covalentes. De manera alterantiva, la proteína o agente puede ser derivado para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivación puede involucrar la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponibles para unir varias moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conoce un número de técnicas para proteínas de radiomarcado. Los metales de radionúclidos pueden unirse a Lerk-8, por ejemplo, al usar un agente quelante bifuncional adecuado. Los conjugados que comprenden Lerk-8 y un agente diagnóstico o terapéutico adecuado (de preferencia enlazado de manera covalente) son preparados de esta manera. Los conjugados son administrados o empleados de otra manera en una cantidad apropiada para la aplicación particular. Otro uso de la Lerk-8 de la presente invención es como una herramienta de investigación para estudiar el papel que Lerk-8, en conjunción con elk o hek, puede jugar en el crecimiento o diferenciación de células que portan el receptor elk o hek. Los polipépfidos Lerk-8 de la presente invención también pueden emplearse en ensayos in vitro, para detección de elk o Lerk-8 o las interacciones de los mismos. De igual manera, Lerk-8 encuentra uso en ensayos para hek o la interacción de Lerk-8 con hek. Se ha sugerido la posibilidad de que hek juegue un papel en la tumorigénesis (Boyd et al., supra). Ei DNA de lerk-8 y los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para desarrollar tratamientos para cualquier desorden mediado (directa o indirectamente) por Lerk-8 defectuosos o cantidades insuficientes de Lerk-8. Los polipéptidos Lerk-8 pueden administrarse a un mamífero afligido con tal desorden. De manera alternativa, puede tomarse una aproximación de terapia de genes. La descripción en la presente de secuencias de nucleótidos de Lerk-8 naturales permite la detección de genes de Lerk-8 defectuosos, y el reemplazamiento de ios mismos con genes que codifican Lerk-8 normales. Los genes defectuosos pueden ser detectados en ensayos diagnósticos in vitro, y por comparación de una secuencia de nucleótidos de Lerk-8 natural descrita en la presente con aquélla de un gene de Lerk-8 derivado de una persona que se sospecha que alberga un defecto en este gene. Como se discutió antes, cuando varios tejidos de ratas fueron analizados para mRNA de elk, los transcriptos fueron detectados solo en cerebro y teste (Lhotak et al. , supra). La expresión de receptores para proteínas Lerk en tejidos neurales ha conducido a la investigación de los papeles que las proteínas Lerk pueden jugar en el desarrollo o regeneración del sistema nervioso. Lerk-7 ha sido reportado por estar involucrado en guía de axones y formación de paquetes de axones (Winslow et al. , Neuron 14:973-381 , 1995; Drescher et al , Ce11 32:359-370, 1995). El Lerk-8 de la presente invención puede emplearse en estudios de los efectos de ligadura de lerk-8 a receptores en tejido neural. Se puede investigar el papel que Lerk-8 puede jugar para inducir o regular procesos; asociados con el sistema nervioso. Lerk-8 puede administrarse in vivo para regular o promover el desarrollo del sistema nervioso. Ciertas de las proteínas Lerk antes descritos han sido reportadas pro poseer propiedades neuroprotectoras, por ejemplo, proteger neuronas hipocampales contra excitotoxicidad mediada por glutamato. Se ha establecido el envolvimiento de un componentes excitotóxicos en un número de desórdenes del sistema neural. La sensibilidad a glutamato es una función normal en el sistema nervioso central en desarrollo y maduro (CNS). Sin embargo, además de su papel normal en la plasticidad y transmisión sináptica excitatoria, el glutamato puede mediar también o participar de otra manera en un número de estados disfuncionales de CNS, incluyendo pero no limitando a, la enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Huntington, Parkinsonismo, apoplejía (isquemia), epilepsia, y demencia relacionada con A1DS (revisado en Meldrum y Garthwaite, Trends Pharmacol. Sci 1 1 :379, 1990; Choi, J. Neurosci. 10:2493, 1990; Lipton et al. , Neurpn 7:111 , 1991 ; y Andersson at al , ?ur. J. Neurosci. 3:66, 1991). Los polipéptidos Lerk-8 proporcionados en la presente, encuentran uso en un método para tratar desórdenes de tejido neural, involucrando poner en contacto el tejido neural con Lerk-8. Tales desórdenes incluyen lesión a tejido neural, o enfermedades neurológicas, ya sea crónicas o agudas. Ejemplos de tales desórdenes incluyen, pero no están limitados a, las condiciones antes descritas que involucran disfunción del CNS. Lerk-8 puede ser administrada a un mamífero, incluyendo un humano, afectado con tal condición. Se ha encontrado que ciertas de las proteínas Lerk promueve la angiogénesis. Asimismo, lerk-8 puede encontrar uso para promover la angiogénesis, la cual puede ser benéfica para curar heridas, estimular la neovascularización de tejidos injertados o tratar cualquier condición en la cual se desea que la angiogénesis aumente. Se proporcionan en la presente composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un polipéptido Lerk-8 de la presente invención, en combinación con otros componentes tales como un diluyente, portador, o excipiente fisiológicamente aceptable. Lerk-8 puede formularse de acuerdo a los métodos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Lerk-8 puede combinarse en mezcla, ya sea como el material activo único o con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (por ejemplo, solución salina, Tris-HCl, acetato, y soluciones amortiguadas de fosfato), conservadores (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emuls?ficantes, solubilizadores, auxiliares y/o portadores. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmacéuticas incluyen aquéllos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16" ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA. Además, tales composiciones pueden contener Lerk-8 en complejo con polietilen glicol (PEG), iones metálicos o incorporados a compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano, etc., o incorporados en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, trazas de eritrocitos o esferoblastos. Tales composiciones influencian el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de evacuación in vivo de Lerk-8, y son elegidos de esta manera de acuerdo a la aplicación pretendida. También se puede conjugar Lerk-8 con anticuerpos dirigidos contra receptores específicos de tejido, ligandos o antígenos, o acoplados a ligandos de receptores de tejido específico. También puede encontrar uso la Lerk-8 expresado en la superficie de una célula. Tales composiciones pueden contener un polipéptido Lerk-8 en cualquier forma descrita en la presente, tales como, proteínas naturales, variantes, derivados, oligómeros, y fragmentos biológicamente activos. En una modalidad, la composición comprende un polipéptido Lerk-8 soluble, de preferencia un oligómero que comprende polipéptidos Lerk-8 solubles. Lerk-8 puede ser administrado en cualquier manera adecuada, por ejemplo, de manera tópica, parenteral o por inhalación. El término "parenteral" incluye inyección, por ejemplo, por rutas subcutáneas, intravenosas o intramusculares, también incluyendo la administración localizada, por ejemplo en un sitio de enfermedad o lesión. La liberación sostenida de implantes también es contemplada. Un experto en la técnica pertinente reconocerá que dosificaciones adecuadas variarán, dependiendo de factores tales como la naturaleza del desorden a ser tratado, el peso corporal, edad y condición general del paciente, y la ruta de administración. Las dosis preliminares pueden ser determinadas de acuerdo a pruebas animales y la graduación de dosificaciones para administración humana se realiza de acuerdo a las prácticas aceptadas por la técnica.

Formas oligoméricas de Lerk-8 Los oligómeros que contienen polipéptidos Lerk-8 están abarcados en la presente invención. Los oligómeros de Lerk-8 pueden estar en la forma de dímeros, trímeros u oligómeros enlazados covalentemente o enlazados no covalentemente. Una modalidad de la invención es dirigida a oligómeros que comprenden múltiples polipéptidos Lerk-8 unidos via interacciones covalentes o no covalentes entre porciones de péptidos fusionadas con los polipéptidos Lerk-8. Tales pépfidos pueden ser péptldos enlazadores (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Cierres de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de pofipéptidos de Lerk-8 unidos a los mismos, como se describe en más detalle más adelante. En modalidades particulares, los oligómeros comprenden desde dos hasta cuatro polipéptidos Lerk-8. Las porciones de Lerk-8 del oligómero pueden ser polipéptídos solubles, como se describió antes. Como una alternativa, un oligómero Lerk-8 es preparado usando polipéptidos derivados de 1nmunog1obu1ínas. Se ha descrito 1a preparación de proteínas que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados para varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio de Fc), por ejemplo por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 191); Byrn et a1. (Nature 344 677, 1990); y Hstlenbaugh y aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusión Proteins", en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.13.1 - T9. 9.11 , 1992). Una modalidad de la presente invención es dirigida a un dímero de Lerk-8 comprendiendo dos proteínas de afusión creadas a1 fusionar Lerk-8 a la región Fc de un anticuerpo. El polipéptido Fc de preferencia es fusionado al extremo C de una Lerk-8 soluble. Un gene de fusión que codifica la proteína de fusión Lerk-8/Fc es insertado en un vector de expresión apropiado. Las proteínas de fusión Lerk-8/Fc son expresadas en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y se permite que se congreguen mucho como moléculas de anticuerpo, sobre las cuales se forman las ligaduras de disulfuro entrecadena entre las porciones Fc para producir Lerk-8 divalente. Se proporcionan en la presente proteínas de fusión que comprenden un polipéptido Lerk-8 Tusionado a un póíipéptido Te derivado de un anticuerpo. También se proporciona el DNA que codifica tales proteínas de fusión, así como dímeros que contienen dos proteínas de Tusión unidas via ligaduras de disulfuro entre las porciones Fc de las mismas. El término "polipéptído Fc" como es usado en la presente incluye formas de muteína y naturales de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. Las formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región de articulación que promueve la dimerización, también son incluidas. Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la aplicación de FCT WO 33/10151 , es un polipéptido de cadena simple que se extiende de la región de articulación N-termlnal al extremo C natural de la región Fc de un anticuerpo lgG1 humano. Otro polipéptido Fc útil es la muteína Fc descrita en la patente estadounidense 5,457,035, y en Baum et al. , (EMBO J. 13:3992-4001 , 1994). La Secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a aquélla de la secuencia Fc natural presentada en WO 93/10151 , excepto que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. La muteína exhibe afinidad reducida para receptores Fc. En otras modalidades, Lerk-8 puede ser substituida para la porción variable de un anticuerpo de cadena pesada o ligera. Si las proteínas de fusión son hechas tanto con cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero Lerk-8 con tantas como cuatro regiones extracelulares de Lerk-8. Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprenden polipéptidos Lerk-8 múltiples, con o sin enlazadores de péptido (péptidos espaciadores). Entre los enlazadores de péptido adecuados están aquéllos descritos en las patentes estadounidense 4,751 ,180 y 4,935,233, los cuales se incorporan en la presente por referencia. Una secuencia de DNA que codifica un enlazador de péptido deseado puede ser insertado entre, y en el mismo marco de lectura como, las secuencias de DNA que codifican Lerk-8, usando cualquier técnica convencional adecuada. Por ejemplo, un oligonucleótido químicamente sintetizado que codifica el enlazador puede ser ligado entre las secuencias que codifican Lerk-8. En una modalidad, una proteína de fusión comprende de dos a cuatro polipéptidos Lerk-8 solubles, separados por enlazadores de péptido. Otro método para preparar lerk-8 oligomérico involucra el uso de un cierre de leucina. Los dominios de cierre de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Los cierres de leucina fueron identificados originalmente en varias proteínas que se ligan a DNA (Landschuiz et al., Science 240: 1759, 1988), y han sido encontrados desde entonces en una variedad de proteínas diferentes. Entre los cierres de leucina conocidos se encuentran los péptidos que ocurren de manera natural y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cierre de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud de PCT WO 94/10308, el cierre de leucina derivado de la proteína D surfactante de pulmón (SPD) descrita en Hoppe et al. (FEBS Letters 344:191 , 1994) y solicitud de patente estadounidense serial no. 08/446,922, incorporado en la presente por referencia. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido Lerk-8 soluble fusionado a un péptido de cierre de leucína se expresan en células huésped adecuadas, y la Lerk-8 oligomérica soluble que se forma es recuperada del sobrenadante de cultivo. Lerk-8 oligomérica tiene la propiedad de sitios de ligadura bivalentes, trivalentes, etc., para elk o hek. Las proteínas de fusión antes descritas comprendiendo porciones Fc (y oligómeros formados de los mismos) ofrecen la ventaja de fácil purificación mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G.

Sistemas de expresión Células huésped para expresión de polipéptidos Lerk-8 incluyen procariotes, levaduras o células eucarióticas superiores. Se describen los vectores de expresión y clonación apropiados para usarse con huéspedes celulares bacterianos, fúngales, de levadura y mamíferos, por ejemplo, en Pouweis et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1í 85). Los sistemas de traslación libres de células también pueden ser empleados para producir polipéptidos Lerk-8 usando RNAs derivados de constructos de DNA descritos en la presente. El vector de expresión puede incluir DNA que codifica un péptido de señal o líder fusionado al extremo N de un polipéptido Lerk-8. E1 péptido de señal o líder dirige co- o post-traslacionalmente la transferencia de de Lerk-8 a partir de su sitio de síntesis a un sitio dentro o fuera de la membrana celular o pared celular. El péptido de señal o líder es cortado del polipéptido Lerk-8 maduro. La elección de un péptido de señal o líder es dependiente del tipo de célula huésped que va a ser empleado. Células huésped procarióticas adecuadas para 1a transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras diversas especies dentro de 1os géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphilococcus. En una célula huésped procariótica, tal como E. coli, un pofipéptido Lerk-8 puede Incluir un residuo de metionlna N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula hqésped procariótica. La Met N-terminal puede ser cortada a partir del polipéptido Lerk-8 recombinante expresado. Los polipéptidos Lerk-8 pueden ser expresados en células huésped de levadura, de preferencia del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). Otros géneros de levadura, tales como Pichia, K. lactis o Kluyveromyces, también pueden ser empleados. Los vectores de levadura pueden contener un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura de 2µ, una secuencia que se replica de manera autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencia para terminación de transcripción, y un gene marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entro otros, promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al , J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al. , J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et al. , Biochem. 17:4900, 1978), tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosf ofructocí nasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoclnasa. Otra alternativa es el promotor ADH2 represible con glucosa descrito por Russell pt al. (J. Biol. Chem. 258r2674, 1 82) y Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Otros vectores y promotores adecuados para usarse en la expresión de levadura son descritos adicionalmente en Hitzeman, EPA-73,657 o en Fleer et al., Gene, 107:285-195 (1991); y van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135-133 {1390). Los vectores de lanzadera repücables tanto en levadura como E. coli pueden ser construidos al insertar secuencias de DNA de pBR322 para la selección y re plica ción en E. coli (gene Ampr y origen de replicación) en los vectores de levadura antes descritos Una secuencia líder adecuada (por ejemplo, el líder de a-factor de Saccharomyces) puede ser empleada para dirigir la secreción del polipéptido Lerk-8 de células de levadura. La secuencia líder de a-factor se inserta generalmente antre la secuencia promotora y 1a secuencia de gene estructural. Ver, por ejemplo, Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 31:5330, 1384; patente estadounidense 4,546,082; y EP 324,274. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recsmbmantes a partir de huéspedes de levadura son conocidas por aquéllos de habilidad en la técnica. Una secuencia líder pueden modificarse cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gene estructural. Los protocolos de transformación de levadura son conocidos por aquéllos de habilidad en la técnica. Uno de tales protocolos es descrito por Hinnen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes de Trp+ en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste de 0.67% de base de nitrógeno de levadura, 0.5% de ácidos casamino, 2% de glucosa, 10 µg/ml de adenina y 20 µg/ml de uracilo. Las células huésped de levadura transformadas por vectores conteniendo la secuencia de promotor ADH2 pueden hacerse crecer para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste de 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa complementada con 80 µg/ml de uracilo. La desrepresión del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa es agotada del medio. Sistemas de cultivo de células huésped de mamífero o insecto también podrían usarse para expresar polipéptidos Lerk-8 recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos son revisadas por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Las líneas de células establecidas de origen mamífero también pueden emplearse. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea CAS-7 de células de riñon de mono (ATCC CRL 1651 ; Gluzman et al., Cell 23:175, 1981 ), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, la línea de células BHK (ATCC CRL 3 ), y la línea de células CV-T/EBNA-1 {ATCC CRL 10478) derivadas de la línea de células de riñon de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como se describió por McMaban et al. XEMBO J. 10:2821 , 1991). Las secuencias de control de transcripción y traslación de vectores de expresión de células huésped de mamífero pueden ser cortadas de genomas virales. Las secuencias promotoras comúnmente usadas y secuencias intensificadoras se derivan de virus de Pstío a, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de DNA derivadas del genoma viral de 3V40, por ejemplo, los sitios e origen, , promotor temprano y tardío, intensificador, empalme y poliadenilación de SV40 pueden ser usados para proporcionar otros elementos genéticos para expresión de una secuencia de genes estructurales en una célula huésped de mamífero. Los promotores tempranos y tardíos vírales son particularmente útiles porque ambos son fácilmente obtenidos de un genoma viral como un ragmento, el cuaTtambién puede contener un origen viral de replicación (Fiers et al. , Nature 273: 113, 1978). También se pueden usar fragmentos de SV40 más grandes o más pequeños, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 bp (pares de bases) que se extiende del sitio Hind ttl tiacia el sitio Bgl I ubicado an e1 sitio de origen viral de SV40 de replicación. Ejemplos de vectores de expresión para usarse en células huésped de mamífero son aquéllos construidos como se describe por okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un sistema útil para expresión de alto nivel estable de cDNAs de mamífero en células epiteliales mamarias de murino C127 puede ser construido substancialmente como es descrito por Cosman et al. (Mol.. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de alta expresión útil, PMLSV N 1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312:768, 1984, ha sido depositado como ATCC 39890. Otros vectores de expresión adecuados para usarse en células huésped de mamífero son PDC201 (Sims et al. , Science 241 :585, 1988), pDC302 (Mosley et al. , Cell, 59:335, 1989), ppC406 (McMahan et al.. EMBO J. 10:2821 , 1331). hav-eo {Dower et al. , . Immunol. 142:4314, 1989), y los vectores descritos en EP-A-0367566 y WO 91/18982. Las alternativas adicionales son vectores derivados de retrovirus. En lugar de la secuencia de señal natural, una secuencia de señal heteróloga puede ser adicionada, tal como la secuencia de señal para IL-7 descrita en la patente estadounidense 4,965, 195; la secuencia de señal para el receptor IL-2 descrita por Cosman et al. , Nature "312:768 {T984); el péptido de señal de receptor IL-4 descrito en EO 367-566; el péptido de señal de receptor 1L-1 tipo I descrito en la patente estadounidense 4,968,607; y el péptido de señal de receptor IL-2 tipo II descrito en EP 460,846.

Purificación de proteína Lerk-8 Los polipéptidos Lerk-8 de la presente invención pueden ser producidos mediante sistemas de expresión recombinantes como se describió antes, o purificados a partir de células que ocurren de manera natural. Un proceso para producir Lerk-8 comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión comprendiendo una secuencia de DNA que codifica Lerk-8 bajo condiciones suficientes para promover la expresión de Lerk-8. Lerk-8 es recuperado entonces a partir del medio de cultivo o extractos de células, dependiendo del sistema de expresión empleado y si la Lerk-8 es secretada de las células. En una modalidad, una proteína Lerk-8 humana comprende 1a secuencia de aminoácidos de la proteína que es expresada por células huésped transformadas con un vector de expresión que contiene el cDNA de lerk-8 encontrado en la especie ATCC 97441. Como es conocido por la persona experta, los procedimientos para purificar una proteína recombinantes variarán de acuerdo a factores tales comp el tipo de células Tiuésped empleadas y de si la proteína recombinante es secretada o no en el medio de cultivo. Otras consideraciones incluyen los tipos de contaminantes que van a ser removidos, los cuales pueden variar de acuerdo a las células huésped particulares empleadas para expresar la protéína deseada. Por ejemplo, cuando sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante son empleados, el medio de cultivo puede ser concentrado primero usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipor Pellicon. Siguiendo el paso de concentración, el concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación tal como una matriz de filtración de gel. De manera alternativa, una resina de intercambio de aniones puede ser empleada, por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos dietilaminoetil (DEAD) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros materiales de soporte comúnmente empleados en la purificación de proteína. De manera alternativa, un paso de intercambio de cationes puede ser empleado. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices ipsstubles que comprendiendo grupos sulfopropilo o carboximetilo. Los grupos sulfopropilo son preferidos. Además, se puede emplear uno o más pasos de cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios RP-tt PLC hidrofóbicos {pro ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo pendientes u otros grupos alifáticos). Algunos o todos los pasos de purificación anterior, en varias combinaciones, pueden ser empleados para proporcionar una proteína Lerk-8 purificada. Una alternativa adicional es 1a cromatografía de afinidad, que emplea una matriz de cromatografía que contiene hek, elk o un anticuerpo que liga Lerk-8. Los polipéptídos lerk-8 pueden ser recuperados desde una columna de afinidad que usa técnicas convencionales, (por ejemplo, levigación en un amortiguador de sal alto), cuando se dializa en un amortiguador de sal menor para usarse. La proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano puede ser aislada mediante rotura inicial de las células huésped, centrifugación, extracción de pellas de células si un polipéptido insoluble, o del fluido sobrenadante si un polipéptido soluble, seguido por uno o más pasos de concentración, salado, intercambio de iones, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, se puede emplear RP-HPLC para pasos de purificación final. Las células microbianas pueden ser fracturadas por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica, o uso de agentes de lisis de células.

En células huésped de levadura, lerk-8 se expresa de preferencia como un polipéptido secretado, para simplificar la purificación. Los polipéptidos recombinantes secretados a partir de una fermentación de células huésped de levadura pueden ser purificados por métodos análogos para aquéllos descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171 , 1984). Urdal et al. describen dos pasos de HPLC de fase inversa, secuenciales, para purificación de 1L-2 humana recombinante en una columna HPLC preparatoria. El grado deseado de pureza depende del uso pretendido de la proteína. Se desea un grado relativamente alto de pureza cuando la proteína va a ser administrada in vivo, por ejemplo, De manera ventajosa, los polipéptidos Lerk-8 son purificados de manera que ninguna banda de proteína correspondiente a otras proteínas (no Lerk-8) son detectables sobre el análisis por electroforesis de gél de póliagrilamlda con SDS (SDS-PAGE). El experto en el campo pertinente reconocerá que bandas múltiples correspondientes a 1a prsteína lerk-8 pueden ser visualizadas por SDS-PAGE, debido a glicosilación diferencial, procesamiento post-traslacional diferencial y similares, como se discutió antes. Muy preferiblemente, Lerk-8 es purificado a homogeneidad substancial, como se indica por una banda de próteína simple sobre e1 análisis por SDSPAGE. La banda de proteína puede ser visualizada mediante manchado con plata, manchado con azul Coomassíe, o (si la protelna está radiomarcada) por autorradiografía. Ácidos nucleicos y usos de los mismos La presente invención proporciona ácidos nucleicos de Lerk-8 aislados útiles en la producción de poüpéptidos Lerk-8, como se discutió antes. Tales ácidos nucleicos incluyen, pero no están limitados a, el DNA de Lerk-8 humano de SEQ ID NO:! , tanto en forma de filamento simple como filamento doble, así como el complemento de RNA del mismo. El DNA de Lerk-8 de la presente invención incluye, por ejemplo, cDNA, DNA genómico, DNA químicamente sintetizado, DNA amplificado por PCR, y combina?iones de los mismos. El DNA genómico puede ser aislado mediante técnicas convencionales usando el cDNA aislado en el ejemplo 1 , o un fragmento adecuado del mismo, como una sonda. Modalidades particulares de DNAs que codifican Lerk-8 incluyen un DNA comprendiendo los nucleótídos 398 a 1420 de SEQ ID NO: 1 (codificando Lerk-8 humana de longitud completa, incluyendo el péptido de señal N-terminal) y un DNA que comprénde los nucleótidos 479 a 1420 de SEQ ID NO: 1 (codificando Lerk-8 humana madura de longitud completa). Modalidades particulares de DNA que codifican una Lerk-8 humana soluble son un DNA que comprende los nucleótidos 398 a 1069 de SEQ ID NO: 1 (codificando el péptido de señal y el dominio extracelular) o comprendiendo los nucleótidos 479 a 1069 de SEQ ID NO:1 (codificando el dominio extracelular). La presente invención proporciona además fragmentos de secuencias de nucleótidos de lerk-8. Tales fragmentos comprenden deseablemente por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos contiguos de una secuencia de DNA de Lerk-8, por ejemplo, por lo menos 17 nucleótidos consecutivos de una secuencia de Lerk-8 humana presentada en SEQ ID NO:1. Los complementos de RNA y DNA de dichos fragmentos son proporcionados en la presente, junto con formas de filamento simple y filamento doble del DNA de Lerk-8. Entre los usos de tales fragmentos de ácidos nucleicos de Lerk-8 está el uso como una sonda. Tales sondas pueden ser empleadas en procedimientos de hibridación para aislar DNA de Lerk-8 de especies mamíferas adicionales. Como un ejemplo, puede emplearse una sonda que corresponde al dominio extracelular de un Lerk-8. Las sondas también encuentran uso para detectar 1a presencia de ácidos nucleicos de lerk-8 en ensayos in vitro y en tales procedimientos como Northern y Southern blots. Los tipos de células que expresan Lerk-8 pueden ser Identificados. Tales procedimientos son bien conocidos, y el experto puede elegir una sonda de longitud adecuada, dependiendo de la aplicación particular pretendida. En modalidades particulares, las moléculas de ácidos nucleicos de Lerk-8 comprenden por lo menos 30 nucleótídos contiguos de la secuencia de DNA de SEQ ID NO:1 , o el complemento de RNA o DNA de la misma. Las sondas pueden ser marcadas (por ejemplo, con P32) mediante técnicas convencionales. Los fragmentos de ácidos nucleicos de Lerk-8 también encuentran uso como iniciadores, por ejemplo, en reacciones de cadena de polimerasa (PCR). Los iniciadores 5' y 3' que corresponden a los extremos de un DNA de Lerk-8 deseado (por ejemplo, un DNA que codifica un Lerk-8 soluble) se emplean para aislar y amplificar el DNA, usando técnicas de PCR convencionales. ?3 Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de Lerk-8 incluyen oligonucleótidos de sentido o antlsentido comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos de filamento simple (ya sea RNA o DNA) capaz de ligarse a sepuencias de mRNA de Lerk-8 objetivo (sentido) o DNA de Lerk-8 (antisentido). Los oligonucleótidos de sentido o antisentido, de acuerdo a la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación de cDNA de Lerk-8. Tal fragmento generalmente comprende por lo enos aproximadamente 14 nucleótidos, de preferencia desde aproximadamente 14 hasta aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un o?igonucleótido de antisentido o sentido, basado sobre una secuencia de cDNA codificando una proteína dada, se describe en, por ejemplo, Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988). La ligadura de oligonucleótidos de antisentido o sentido a secuencias de ácidos nucleicos objetivo resulta en la formación de duplos que bloqµean la transcripción o traslación de la secuencia objetivo por uno o varios medios, incluyendo degradación intensificada de los duplos, terminación prematura de transcripción o traslación, o por otros medios. Los oligonucleótidos de antisentido pueden ser usados de esta manera para bloquear la expresión de proteínas Lerk-8. Los oligonucleófidos de sentido o antisentido comprenden además oligonucleótidos teniendo esqueletos de fosfodiéster de azúcar modificado (u otros enlaces de azúcar, tales como aquéllos descritos en WO91/06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia por ser capaz de ligarse a secuencias de nucleótidds objetivo. Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleófidos los cuales están enlazados covalentemente a porciones orgánicas, tales como aquéllas descritas en WO 90/10448, y otras porciones que aumentan la afinidad d l oligonucleótido por una secuencia de ácidos nucleicos objetivo, tal como poli-(L-lisina). Todavía más, agentes intercalantes, tal como elipticina, y agentes alquilantes o complejos de metal pueden ser unidos a oligonucleótidos de sentido o antisentiido para modificar las especificidades de ligadura del oligonucleótido de sentido o antisentido para la secuencia de nucleótidos objetivo. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido pueden ser introducidos en una célula conteniendo 1a secuencia de ácidos nucleicos objetivo por cualquier método de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, transfección de DNA mediada por CaPO4, electroporación, o al usar vectores de transferencia de genes tales como virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un oligonucleótido de sentido o antisentido es insertado en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos objetivo se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquéllos derivados de los retrovirus de murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641). Los oligonucleótidos de sentido o antisentido también pueden ser introducidos en una célula conteniendo la secuencia de nucleótidos objetivo mediante la formación de un conjugado con una molécula que une ligando, como se describe en WP 91/04753. Las moléculas que unen ligandos adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, receptores de superficie de células, factores de crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que se unen a receptores de superficie celular. De preferencia, la conjugación de la molécula que une ligando no interfiere substancíalmente con la capacidad de la molécula que une ligando para unirse a su receptor o molécula correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. De manera alternativa, un oligonucleótido de sentido o antisentido puede ser introducido en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleico:.» objetivo mediante la formación de un complejo de oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido de sentido o antisentido-Upido, se disocia de preferencia, dentro de la célula mediante una lipasa endógena.

Anticuerpos Se proporcionan en la presente los anticuerpos que son inmunoreactivos con polipéptidos Lerk-8. Tales anticuerpos se unen específicamente a Lerk-8, ya que los anticuerpos se ligan a Lerk-8 vía los sitios de ligadura de antígeno del anticuerpo (como se opone a la ligadura no específica). Los anticuerpos policlonales y monoclonales pueden ser preparados mediante técnicas convencionales. Ver, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, Kennet et al. (eds), Pleunm Press, Nueva ?ork (1930); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra Lerk-8 es ilustrada adicionalmente en el ejemplo 3. Los fragmentos de ligadura de antígeno de tales anticuerpos, los cuales pueden ser producidos mediante técnicas convencionales, también son abarcados por la presente invención. Ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no están limitados a, fragmentos Fab, F(ab'), y F(ab')2. También se proporcionan fragmentos de anticuerpos y derivados producidos por técnicas de ingeniería genética. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales de murino. Tales anticuerpos humanizados pueden ser preparados mediante técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos son administrados a humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo de murino (o solo el sitio de ligadura de antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de ligadura de antígeno de un anticuerpo monoclonal de murino y un fragmento de región variable (careciendo del sitio de ligadura de antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y adicionalmente diseñados, incluyen aquéllos descritos en Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technolog ' 7:934, T989), y Winter y Harñs \TJPS 14:139, Mayo, 1993). Entre los usos de los anticuerpos está el uso en ensayos para detectar la presencia de poüpéptidos Lerk-8, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos también pueden ser empleados para purificar proteínas Lerk-8 mediante cromatografía por Inmunoafinidad. Esos anticuerpos que adicionalmente pueden bloquear la ligadura de Lerk-8 a receptores (por ejemplo, eík o hek) pueden ser usados para inhibir una actividad biológica mediada por la ligadura de Lerk-8 a los receptores. Tal anticuerpo puede ser empleado en un procedimiento in vitro, o ser administrado in vivo para inhibir una actividad biológica mediada por Lerk-8. Los desórdenes mediados o exacerbados (directa o indirectamente) por la ligadura de Lerk-8 a receptores de superficie celular son tratados de esta manera. Se proporcionan en la presente las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que está dirigido contra Lerk-8, y un diluyente, excipiente o portador adecuados. Los componentes adecuados de tales composiciones son como se describió antes para composiciones que contienen proteínas Lerk-8.

También se proporcionan en la presente los conjugados que comprenden un agente terapéutico o detectable (por ejemplo, diagnóstico), unido a un anticuerpo dirigido contra lerk-8. Ejemplos de tales agentes son presentados antes. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vitro o in vivo. Los siguientes ejemplos son proporcionados para ilustrar de manera adicional, las modalidades particulares de la invención, y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de fa presente invención.

EJEMPLO 1 : Clonación de cDNA de Lerk-8 humano Un cDNA que codifica una Lerk-8 humana de la presente invención fue aislada mediante el siguiente procedimiento. Una búsqueda del banco de datos de secuencias GenBank (tfasta), usando secuencias de aminoácidos de Lerk-2 y Lerk-5 como términos de búsqueda, identificó un EST (acceso no. HT0O067) exhibiendo homología significativa. Usando los marcos de lectura de Lerks 2 y 5 como guías (para ajustar desplazamientos de marco y codones de paro que resultarían de las inserciones y supresiones en el EST, comparado con las secuencias de lerk-2 y Lerk-5), un trasladado de EST fue dilucidado, la alineación de este trasladado de EST con secuencias de aminoácidos de Lerk-2 y Lerk-5 reveló una identidad de secuencia de aproximadamente 50% tanto con Lerk-2 como Lerk-5, en las regiones que se traslapan. La segunda, tercera y cuarta cisteínas que son conservadas en las Lerks 1 -7 fueron identificadas en el trasladado de EST.

Los oligonucleótidos basados en EST fueron sintetizados para usarse como iniciadores 5' y 3' en una reacción en cadena de pólimerasa (PCR). Los iniciadores definieron los términos de un fragmento interno de 100 pp de EST. DNA de genotecas de cDNA humanas en un vector de fago ? se usó como la plantilla en la PCR. Los fragmentos de DNA del tamaño esperado (110bp) fueron amplificados a partir de tres de las genotecas de cDNA, las cuales fueron derivadas de cerebro fetal, fibroblasto dérmico y tumor pancreático. Los mismos dos oligonucleótidos usados como iniciadores en la PCR fueron marcados en el extremo con 32P para usarse como sondas. La genoteca de cDNA de fibroblasto dérmico humano se clasificó con las sondas al permitir la hidridación a 63°C, seguido por lavado a 63°C en 1x SSC. Se aisló un clon de hibridación, designado ?1. La región de codificación de este clon corresponde a los nucleótidos 500 a 1420 de SEQ ID NO: 1 , la cual codifica los aminoácidos 8 a 313 de SEQ ID NO:2. Un fragmento de este clon fue amplificado mediante PCR, marcado y usado como una sonda para clasificar la genoteca de cDNA de cerebro fetal humana (hibridación a 63°C, seguido por lavado a 63°C en 1x SSC). Se aislaron tres clones de hibridación, y se determinaron las secuencias de DNA. Un clon, designado ?2, incluyó una región de codificación de longitud completa. La secuencia de nucleótidos del cDNA de Lerk-8 humana del clon ?2, y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma, se presentan en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente. La proteína Lerk-8 humana de SEQ ID NO:2 comprende un péptido de señal N-terminal (aminoácidos -27 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 197), una región transmembrana (aminoácidos 198 a 224), y un dominio citoplásmico (aminoácidos 225 a 313). Las muestras de un Usado de células conteniendo un vector de fago recombinante (?gt10 conteniendo el cDNA de Lerk-8 humano del clon ?2 insertado en el sitio de restricción EcoRl del vector), fueron depositadas con the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Las muestras fueron depositadas el 14 de Tebrero de 1996, bajo 1os términos del Tratado de Budapest, y se les asignó el número de acceso ATCC 97441.

EJEMPLO 2: Estudio de ligadura La ligadura de Lerk-8 a elk o hek puede ser valorada en un ensayo de ligadura convencional. Un procedimiento adecuado es como sigue. Un DNA y secuencia de aminoácidos codificada para cDNA de elk de rata, se describe en Lhotak et al. (Mol. Cell. Biol. 11 :2496), 1991 ), incorporado en la presente por referencia, la proteína etk de rata tiene un dominio extracelular de 538 aminoácidos, un dominio transmembrana de 25 aminoácidos, y un dominio citoplásmico de 419 aminoácidos. Una secuencia de aminoácidos codificada para cDNA de hek humano es presentada en Wicks et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1611 , 1992) , incorporado en la presente por referencia. Esta proteína hek comprende (desde los extremos N a C) un dominio extracelular de 521 aminoácidos, un dominio transmembrana de 24 aminoácidos, y un dominio citoplásmico de 418 aminoácidos.

Las proteínas de fusión hek/Fc y elk/Fc solubles recombinantes, se preparan mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, como se describe en la solicitud de PCT WO 96/01839, incorporado en la presente por referencia. Las proteínas de Tusión elk/Fc y hék/Fc son purificadas mediante cromatografía de afinidad, usando una columna de sefarosa de proteína A. Se preparan las células que expresan Lerk-8 recombinante en la superficie celular. EI DNA de Lerk-8 puede ser amplificado mediante PCR. Los iniciadores empleados en PCR son seleccionados para definir los términos de la región de codificación del ONA de lerk-8, y también adicionan un sitio de restricción Xho I en el extremo 5| y un sitio Not I en el extremo 3' del DNA amplificado. Los productos de reacción de PCR son digeridos con Xho I y Not I y se insertan en un vector de expresión cortado con Sal I (el cual es compatible con Xho I) y Not I. El vector de expresión, designado pDC410, es un veptor de expresión de mamífero que también se replica en E. coli, y es similar a pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10:2821 , 1991 ). El SITIO DE clonación múltiple pDC4 0 (mes) difere de aquél de pDC406 porque contiene sitios de restricción adicionales y tres codones de paro (uno en cada marco de lectura). Un promotor de pólimerasa T7 corriente debajo de mes facilita la secuenciación de DNA insertado en mes. Además, el origen EVB de replicación es reemplazado por DNA que codifican el antigeno de SV40 grande T (manejado desde un promotor SV40) en pDC410. Las células CV1 -EBNA-1 en placas de 10 cm2 son transfectadas con el vector de expresión recombinante conteniendo el DNA de Lerk-8. La línea de células CV-T/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) constitutivamente expresa antígeno-1 nuclear EBV manejado desde el intensif i?ador/promotor inmedlato-temprano de CMV. CV1-EBNA-1 Tue derivado de la línea de células de riñon de Mono Verde africano CV-1 (ATCC CCI 70), como fue descrito por McWahan et a. (EMBO J. 10:2821 , 1991). Las células transfectadas son cultivadas durante 24 horas, y las células pn cada placa fueron divididas entonces en una placa de 24 cavidades. Después de cultivar una 48 horas adicionales, las células transfectadas (aproximadamente 4 x 10" células/cavidad) son lavadas con BM-NFDM, el cual es un medio de ligadura (RPMI 1640 conteniendo 25 mg/ml de albúmina de suero de bovino, 2 mg/ml de azída de sodio, 20 mTVI de Hepes pH 7.2) al cual se han adicionado 50 mg/ml de leche seca descremada. Las células son incubadas entonces durante 1 hora a 37°C con varias concentraciones de la proteína de fusión elk/Fc o proteína de fusión hek/Fc antes descritas. Las células se lavan entonces y se incuban con una concentración de saturación constante de una IgG anti-humana de ratón con 1 sl en medio de ligadura, con agitación suave durante 1 hora a 37°C. Después de lavado extensivo, las células son liberadas vía tripsinización. La IgG anti-humana de ratón empleada antes, es dirigida contra la región Fc de la IgG humana y puede ser obtenida de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. , West Grove, PA. El anticuerpo es radioyodinado usando el método de cloramipa-T estándar. El anticuerpo se ligará a la porción de Fc de cualquier proteína de fusión elk/Fc o hek/Fc que se haya ligado a las células. En todos los ensayos, la ligadura no específica de 125l-anticuerpo es ensayada en la ausencia de elk/Fc (o hek/Fc), así como en la presencia de elk/Fc (o hek/Fc) y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo de IgG anti-humana de ratón sin marcar. El 1 5l-anticuerpo ligado a la célula es cuantificado en un contador Packarcl Autogamma. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci 51 :660, 1949) son generados en RS/1 (BBN Sofware, Boston, MA) corrida en una computadora Microvax.

EJEMPLO 3: Anticuerpos monclonales que 1iaanT-erk-8 Este ejemplo ilustra un método para preparar anticuerpos monoclonales que ligan Lerk-8. Los inmunógenos adecuados que pueden ser empleados para generar tales anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, proteína Lerk-8 purificada o un fragmento inmunogénico de la misma, tal como, el dominio extracelular, o proteínas de fusión conteniendo Lerk-8 (por ejemplo, una proteína de fusión Lerk-8/Fc soluble). Lerk-8 purificada puede ser usada para generar anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con la misma, usando técnicas convencionales, tales como aquéllas descritas en la patente estadounidense 4,411 ,993. Brevemente, fos ratones son inmunizados con inmunógeno de Lerk-8 emulsificado en auxiliar de Freund completo, e inyectados en cantidades que varían desde 10-100 µg subcutánea o intraperitonealmente. Diez a doce días después, los animales inmunizados son reforzados con Letk-8 adicional emuísrficada en auxiliar de Freund incompleto. Los ratones son periódicamente reforzados posteriormente un un programa de inmunización semanal o bí-semanal. Las muestras de suero son tomadas periódicamente mediante sangrado retro-orbital o excisión de la punta de la cola para probar los anticuerpos de Lerk-8 mediante ensayo de dot blot, ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Enlazado a Enzima) p inhibición de ligadura de hek o elk. Siguiendo la detección de un título de anticuerpo apropiado, a los animales positivos se les proporciona una última inyección intravenosa de Lerk-8 en solución salina. Tres a cuatro días después, los animales son sacrificados, se recolectan las células del bazo, y las células del bazo se fusionan a una línea de células de mieloma de murino, por ejemplo, NS1 o de preferencia P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, las cuales son platinadas en placas de microtítulo múltiples en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de bazo. Las células de hibridoma son clasificadas mediante ELISA para su reactividad contra Lerk-8 Pura mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall et al., Immunochem. 8:871 , 1971 y en la patente estadounidense 4,703,004. Una técnica de clasificación preferida es la técnica de captura de anticuerpo descrita por Beckman et al. , (J. Immunol. 144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas pueden ser inyectadas intraperitonealmente en ratones BALB/c singeneicos para producir ascitis conteniendo altas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-Lerk-8. De manera alternativa, se pueden hacer crecer células de hibridoma in vitro en matraces o botellas de cilindro mediante varias técnicas, los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis de ratón pueden ser purificados mediante precipitación de sulfato de amonio. Seguido por cromatografía de exclusión en gel. De manera alternativa, la cromatografía de afinidad basada sobre la ligadura de anticuerpo a Proteína A o proteína G, también puede ser usada, como puede ser usada la cromatografía por afinidad basada sobre la ligadura a Lerk-8.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Cerreti, Douglas P. (ii) TITULO DE LA ÍNVENCTON: Citocina designada lerk-8 (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 3 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINARIO: Kathryn A. Anderson, Immunex Corporation (B) CALLE: 51 University Street (C) CIUDAD: Seattle (D) ESTADO: WA (E) PAÍS: EU (F) CÓDIGO POSTA1: 98T01 (v) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDÍO: DISCO FLEXIBLE (B) COMPUTADORA: Apple Power Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Sistema operativo Apple 7.5.3 (D) PAQUETERÍA: Microsoft Word para Power Macintosh 6.0.1 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: -- a ser asignado - (B) FECHA DE PRESENTACION:19 de marzo de 1997 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGE TE: (A) NOMBRE: Anderson, Kathryn A. (B) NUMERO DE REGISTRO: 32, 172 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: 2839-WO (ix) INFORMARON DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: (206) 587-0430 (B) TELEFAX: (206) 233-0644 (C) TELEX: 756822 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1708 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE INMEOiATA: (B) CLON: huLerkß (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 398..1420 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) UBICACIÓN: 479-1417 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sig_péptido (B) UBICACIÓN: 398..478 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 AATTCCGGCC CTTAGCCCGC TGCCCTCAAT CCCAGCGAGG CTGGGGCTCC GGCTCGGCGC 60 CCCCTTCCTC GCTCCCTGGT CCGGCGCCCC ATGCCGCCCC CGCCCGGTCC CCGGCTCCCC 120 CAGTCCCCCA CTTAGGCGGG CTCACAGATC CCGGGGTGCT GGCGCGTGGG CCGGGGGCGC 180 GTAGGGCGCC TGCAGACGGC CCCTGGAAGG GCTCTGGTGG GGCTGAGCGC TCTGCCGCGG 240 GGGCGCGGGC ACAGCAGGAA GCAGGTCCGC GTGGGCGCTG GGGGCATCAG CTACCGGGGT 300 GGTCCGGGCT GAAGAGCCAG GCAGCCAAGG CAGCCACCCC GGGGGGTGGG CGACTTTGGG 360 GGAGTTGGTG CCCCGCCCCC CAGGCCTTGG CGGGGTC ATG GGG CCC CCC CAT TCT 415 Met Gly Pro Pro His Ser -27 -25 GGG CCG GGG GGC GTG CGA GTC GGG GCC CTG CTG CTG CTG GGG GTT TTG 463 Gly Pro Gly Gly Val Arg Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu -20 , -15 -10 GGG CTG GTG TCT GGG CTC AGC CTG GAG CCT GTC TAC TGG AAC TCG GCG 511 Gly Leu Val Ser Gly Leu Ser Leu Glu Pro Val Tyr Trp Asn Ser Ala -5 1 5 10 AAT AAG AGG TTC CAG GCA GAG GGT GGT TAT GTG CTG TAC CCT CAG ATC 559 Asn Lys Arg Phe Gln Ala Glu Gly Gly Tyr Val Leu Tyr Pro C-ln He 15 20 25 GGG GAC CGG CTA GAC CTG CTC TGC CCC CGG GCC CGG CCT CCT GGC CCT 607 Gly Asp Arg Leu Asp Leu Leu Cys Pro Arg Ala Arg Pro Pro Gly Ero 30 • 35 40 CAC TCC TCT CCT AAT TAT GAG TTC TAC AAG CTG TAC CTG GTA GGG GGT 655 His Ser Ser Pro Asn Tyr Glu Phe Tyr Lys Leu Tyr Leu Val Gly Gly 45 50 55 GCT CAG GGC CGG CGC TGT GAG GCA CCC CCT GCC CCA AAC CTC CTT CTC 703 Ala Gln Gly Arg Arg Cys Glu Ala Pro Pro Ala Pro Asn Leu Leu Leu •60 65 , 70 75 -ACT TGT GAT CGC CCA GAC CTG GAT CTC CGC TTC ACC ATC AAG TTC CAG 751 Thr Cys Asp Arg Pro Asp Leu Asp Leu Arg Phe Thr lie Lys Phe Gln 80 85 90 GAG TAT AGC CCT AAT CTC TGG GGC CAC GAG TTC CGC TCG CAC CAC GAT 799 Glu Tyr Ser Pro Asn Leu Trp Gly His Glu Phe Arg Ser His His Asp 95 100 105 TAC TAC ATC ATT GCC ACA TCG GAT GGG ACC CGG GAG GGC CTG GAG AGC 8 7 Tyr Tyr lie He Ala Thr Ser Asp Gly Thr Arg Glu Gly Leu Glu Ser 110 " 11*5 120 CTG CAG GGA GGT GTG TGC CTA ACC AGA GGC ATG AAG GTG CTT CTC CGA 895 Leu Gln Gly Gly Val Cys Leu Thr Arg Gly Met Lys Val Leu Leu Arg 125 130 135 GTG GGA CAA AGT CCC CGA GGA GGG GCT GTC CCC CGA AAA CCT GTG TCT 9 3 Val Gly Gln Ser Pro Arg Gly Gly Ala Val Pro Arg Lys Pro Val Ser 140 145 150 155 GAA ATG CCC ATG GAA AGA GAC CGA GGG GCÁ GCC CAC AGC CTG GAG CCT 991 Glu Met Pro Met Glu Arg Asp Arg Gly Ala Ala His Ser Leu Glu Pro 160 165 170 GGG AAG GAG AAC CTG CCA GGT GAC CCC ACC AGC AAT GCA ACC TCC CGG 1039 Gly Lys Glu Asn Leu Pro Gly Asp Pro Thr Ser Asn Ala Thr Ser Arg 175 180 185 GGT GCT GAA GGC CCC CTG CCC CCT CCC AGC ATG CCT GCA GTG GCT GGG 1087 Gly Ala Glu Gly Pro Leu Pro Pro Pro Ser Met Pro Ala Val Ala Gly 190 195 200 GCA GCA GGG GGG CTG GCG CTG CTC TTG CTG GGC GTG GCA GGG GCT GGG 1135 Ala Ala Gly Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Gly Val Ala Gly Ala Gly 205 210 215 GGT GCC ATG TGT TGG CGG AGA CGG CGG GCC AAG CCT TCG GAG AGT CGC 1183 Gly Ala Met Cys Trp Arg Arg Arg Arg Ala Lys Pro Ser Glu Ser Arg 220 ' 225 230 235 CAC CCT GGT CCT GGC TCC TTC GGG AGG GGA GGG TCT CTG GGC CTG GGG 1231 His Pro Gly Pro Gly Ser Phe Gly Arg Gly Gly Ser Leu- Gly Leu Gly 240 245 250 GGT GGA GGT GGG ATG GGA CCT CGG GAG GCT GAG CCT GGG GAG CTA GGG 1279 Gly Gly Gly Gly Met Gly Pro Arg Glu Ala Glu Pro Gly Glu Leu Gly 255 260 265 ATA GCT CTG CGG GGT GGC GGG GCT GCA GAT CCC CCC TTC TGC CCC CAC 1327 He Ala Leu Arg Gly Gly Gly Ala Ala Asp Pro Pro Phe Cys Pro H'is 270 275 280 TAT GAG AAG GTG AGT GGT GAC TAT GGG CAT CCT GTG TAT ATC GTG CAG 1375 Tyr Glu Lys Val Ser Gly Asp Tyr Gly His Pro Val Tyr He Val Gln 285 290 295 GAT GGG CCC CCC CAG AGC CCT CCA AAC ATC TAC TAC AAG GTA TGA 1420 Asp Gly Pro Pro Gln Ser Pro Pro Asn He Tyr Tyr Lys Val * 300 305 f 310 GGGCTCCTCT CACGTGGCTA TCCTGAATCC AGCCCTTCTT GGGGTGCTCC TCCAGTTTAA 1480 TTCCTGGTTT GAGGGACACC TCTAACATCT CGGCCCCCTG TGCCCCCCCA GCCCCTTCAC 1540 TCCTCCCGGC TGCTGTCCTC GTCTCCACTT TTAGGATTCC TTAGGATTCC CACTGCCCCA 1600 CTTCCTGCCC TCCCGTTTGG CCATGGGTGC CCCCCTCTGT CTCAGTGTCC CTGGATCCTT 1660 TTTCCTTGGG GAGGGGCACA GGCTCAGCCT CCTCTCTGAC CATGCCGG 1708 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 341 aminoácidos (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2 Met Gly Pro Pro His Ser Gly Pro Gly Gly Val Arg Val Giy Ala Leu -27 -25 -20 -15 Leu Leu Leu Gly Val Leu Gly Leu Val Ser Gly Leu Ser Leu Glu Pro -10 -5 1 5 Val Tyr Trp Asn Ser Ala Asn Lys- Arg Phe Gln Ala Glu Gly Gly Tyr 10 15 20 Val Leu Tyr Pro Gln He Gly Asp Arg Leu Asp Leu Leu Cys Pro Arg 25 30 35 Ala Arg Pro Pro Gly Pro His Ser Ser Pro Asn Tyr Glu Phe Tyr Lys 40 45 50 Leu Tyr Leu Val Gly Gly Ala Gln Gly Arg Arg Cys Glu Ala Pro Pro 55 60 65 Ala Pro Asn Leu Leu Leu Thr Cys Asp Arg Pro Asp Leu Asp Leu Arg 70 75 80 85 Phe Thr He Lys Phe Gln Glu Tyr Ser Pro Asn Leu Trp Gly His Glu 90 95 100 Phe Arg Ser His His Asp Tyr Tyr He He Ala Thr Ser Asp Gly Thr 105 110 115 Arg Glu Gly Leu Glu Ser Leu Gln Gly Gly Val Cys Leu Thr Arg Gly 120 125 130 Met Lys Val Leu Leu Arg Val Gly Gln Ser Pro Arg Gly 'Gly Ala Val 135 140 145 Pro Arg Lys Pro Val Ser Glu Met Pro Met Glu Arg Asp Arg Gly Ala 150 155 160 165 Ala His Ser Leu Glu Pro Gly Lys Glu Asn Leu Pro Gly Asp Pro Thr 170 175 " " 180 Ser Asn Ala, Thr Se: Arg Gly Ala Glu Gly Pro Leu P: o Pro Pro Ser *185 190 195 Met Pro Ala Val Ala Gly Ala Ala Gly Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu 200 205 210 Gly Val Ala Gly Aia Gly Gly Ala Met Cys Trp Arg Arg Arg Arg Ala 215 220 " " 225 Lys Pro Ser Glu Ser Arg His Pro Gly Pro Gly Ser Phe Gly Arg Gly 230 235 240 245 Gly Ser Leu Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Met Gly Pro Arg Glu Ala 250 255 260 Glu Pro Gly Glu Leu Gly He Ala Leu Arg Gly Gly Gly Ala Ala Asp 265 270 275 Pro Pro Phe Cys Pro His Tyr Gly Lys Val Ser Gly Asp Tyr Gly His 280 285 290 Pro Val Tyr He Val Gln Asp Gly Pro Pro Gln Ser Pro Pro Asn He 295 300 305 Tyr Tyr Lys Val * 310 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) HIPOTÉTICA: NO (vi) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: póptido FLAG (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEO ID NO:3 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un DNA aislado que codifica un polipéptido Lerk-8 que liga hek o elk, en donde dicho poíipéptido Lerk-8 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de los residuos -27 a 313 de SEQ ID NO:2 y los residuos 1 a 313 de SEQ ID NO:2. 2. Un DNA de la reivindicación 1 , en donde dicho polipéptido Lerk-8 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de los residuos -27 a 313 de SEQ ID NO:2, y los residuos 1 a 313 de SEQ ID NO:

2.

3. Un DNA de la reivindicación 2, en donde dicho polipéptido Lerk-8 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los residuos -27 a 313 de SEQ ID NO:2 y los residuos 1 a 313 de SEQ ID NO:2.

4. Un DNA de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho polipéptido Lerk-8 ocurre de manera natural.

5. Un DNA aislado que codifica un polipéptido Lerk-8 humano maduro que liga hek o elk, en donde dicho polipéptido Lerk-8 es caracterizado por: a) un peso molecular calculado de aproximadamente 33 kilodaltones; b) un punto isoeléctrico (pl) de aproximadamente 8.46; y c) una secuencia de aminoácidos N-terminal Leu-Ser-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr- Trp-Asn-Ser-Ala-Asn- (aminoácidos 1-12 de SEQ ID NO:2).

6. Un DNA aislado que codifica un polipéptido Lerk-8 soluble que liga hek o elk, ep donde dicho polipéptido Lerk-8 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de residuos -27 a x de 5EQ tD NO:2 y residuos 1 a x de SEQ ID NO:2, en donde x representa un entero de 142 a 197, incluso.

7. Un DNA de la reivindicación 6, en donde dicho polipéptido Lerk-8 soluble comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de residuos -27 a x de SEQ ID NO:2 y residuos 1 a x de SEQ ID NO:2, en donde x representa un entero de 142 a 197, incluso.

8. Un DNA aislado que codifica un polipéptido Lerk-8 seleccionado del grupo que consiste de: a) el polipéptido Lerk-8 humano de SEQ ID NO:2; y b) un fragmento del polipéptido de (a), en donde dicho fragmento es capaz de ligar elk o hek.

9. Un DNA de la reivindicación 8, en donde dicho fragmento es un fragmento soluble.

10. Un vector de expresión que comprende un DNA de la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9.

11. Una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 10.

12. Un proceso para producir un polipéptido Lerk-8, comprendiendo cultivar una célula huésped de la reivindicación 11 bajo condiciones que promuevan la expresión del polipéptido Lerk-8, y recuperar el polipéptido Lerk-8.

13. Un polipéptido Lerk-8 purificado, en donde dicho polipéptido es codificado por un DNA de acuerdo a la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 0 9.

14. Un polipéptido Lerk-8 purificado comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es por 1o menos 80% idéntica a la secuencia de residuos 1 a 313 de SEQ ID NO:2.

15. Un polipéptido Lerk-8 de la reivindicación 14, comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 9 7o Idéntica a la secuencia de residuos 1 a 313 de SEQ ID NO:2.

16. Un polipéptido Lerk-8 de la reivindicación 15, comprendiendo la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 313 de SEQ ID NO:2.

17. Un polipéptido Lerk-8 de la reivindicación 15, en donde dicho Lerk-8 comprende aminoácidos 1 a 297 y 299 a través de 313 de SEQ ID NO:2, en donde el residuo en 1a posición 298 es leucína.

18. Una proteína Lerk-8 humana purificada que liga hek o elk, en donde una forma madura de dicha protei na es caracterizada por: a) un peso molecular calculado de aproximadamente 33 kilodaltones; b) un punto isoeléctrico (pl) de aproximadamente 8.46; y c) una secuencia de aminoácidos N-terminal Leu-Ser-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr- Trp-Asn-Ser-Ala-Asn- (aminoácidos 1 -12 de SEQ ID NO:2).

19. Un polipéptido Lerk-8 soluble, purificado, que liga hek o elk, en donde dicho polipéptido Lerk-8 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de residuos 1 a x de SEQ ID NO:2, en donde x representa un entero de 142 a 197, incluso.

20. Un polipéptido Lerk-8 soluble de la reivindicación 19, en donde dicho Lerk-8 cpmprende la secuencia de residuos 1 a x de SEQ ID NO:2, en donde x representa un entero desde 142 a 197, incluso.

21. Un polipéptido Lerk-8 purificado seleccionado del grupo que consiste de: a) el polipéptido Lerk-8 humano de SEQ ID NO:2; y b) un fragmento del polipéptido de (a), en donde dicho fragmento es capaz de ligar elk o hek.

22. Un polipéptido Lerk-8 de la reivindicación 21 , en donde dicho fragmento es un fragmento soluble.

23. Un oligómero que comprende desde dos hasta cuatro polipéptidos Lerk-8 de la reivindicación 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 , 21 o 22.

24. Un oligómero de la reivindicación 23, en donde dicho oligómero es un dímeiro comprendiendo dos proteínas de fusión Lerk-8/Fc solubles.

25. Una composición farmacéutica comprendiendo un polipéptido Lerk-8 u oligómero de la reivindicación 13, 14, 15, 18, 17, 18, 19, 21 , 21 , 22, 23, 24, o 25, y un diluyente, excipiente o portador adecuado.

26. Un anticuerpo que es dirigido contra un polipéptido Lerk-8 de la reivindicación 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 31 , o 22.

27. Un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 26, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.