CN1162267A - 用于脉管系统特异性凝血的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

公开了特异性血液凝结的各种组合物和方法。这是通过肿瘤脉管系统的特异性体内凝血，从而使肿瘤退化来举证的，其中用双特异性抗体位点特异性传递促凝剂。用于脉管系统特异性凝血的方法和组合物。

Description

用于脉管系统特异性凝血的方法和组合物

本发明领域

本发明主要涉及血管和凝血领域。更具体地说，本发明提供了用于特异性凝血的各种生长因子为基础的并免疫的试剂，包括双特异性抗体。

相关现有技术的描述

在过去的30年间，已经实现了在肿瘤疾病化疗方面的进步。这包括一些在开发新化疗药物上的进展，更具体地说发展了用于同时施用药物的治疗方法。对细胞和组织水平上肿瘤形成的过程以及基本抗肿瘤药物之作用机制的较清晰理解使得在许多肿瘤疾病，包括绒膜瘤，肾胚性癌肉瘤，急性白血病，横纹肌肉瘤，成视网膜细胞瘤，霍奇金病和伯基特淋巴瘤的化疗方面取得了进展。尽管在少数肿瘤方面取得了进展，但许多最常规的人类癌症仍能有效地抵御化疗的干扰。

在任何治疗方案中必须面对的一个重要的基本问题是“全部细胞杀死”的概念。提出所述概念是为了有一个有效的治疗方案，不论它是外科的还是化疗方法或两种情况兼而言之，必须是所有所谓“促克隆形成的”恶性细胞(即有不受控制的生长能力的细胞)的全部细胞杀死，然后取代可以除去的任何肿瘤基质。由于最终需要开发可以达到全部杀死细胞目的的治疗药物和方案，所以一些类型的肿瘤比要治疗的其它肿瘤更有反应。例如，与固体肿瘤如癌症相比，软组织肿瘤(如淋巴瘤)和血液以及血液形成器官的肿瘤(如白血病)总的来讲对化疗治疗的反应性更强。

软组织和血液肿瘤对化疗有易感性的原因是淋巴瘤和白血病细胞对化疗干扰的生理可接近性更大。简单地讲，与到达软组织肿瘤和血液中肿瘤相比，大多数化疗药物很难到达固体肿瘤的所有细胞，因此，更难到达全部杀死细胞的目的。提高化疗药物的剂量通常会导致毒副作用，这通常会限制常规抗肿瘤药物的有效性。

开发成功的抗肿瘤药物的策略包括设计选择性杀死肿瘤细胞，而如果有的话，将对正常组织相对没有不良影响的药物。虽然肿瘤组织和正常组织之间很少有质的差别，但这一目标很难达到。正因为此，这些年来大多数研究都集中在鉴定可作为化疗和诊断免疫靶物的肿瘤特异“标记抗原”。已经将许多肿瘤特异性或准肿瘤特异性(“肿瘤相关的”)标记物被鉴定为可以由特异性抗体识别的肿瘤细胞抗原。不幸的是，在这种情况下，肿瘤特异性抗体其自身不能发挥充分的抗肿瘤作用以使其用于癌症治疗。

最近，已经使用了免疫毒素以试图选择性地击中靶癌细胞。免疫毒素为特异性击靶剂(通常是针对肿瘤的抗体或片段)与细胞毒剂，如毒素部分的共轭物。设计击靶剂以使其将毒素引至携带靶抗原的细胞并将所述细胞杀死。现已发展了“第二代”免疫毒素，例如使用去糖基化的蓖麻毒素A链以防止肝捕获免疫毒素并降低肝毒性(Blakey et al.，1987a；b)的那些，和带有新交联剂以使免疫毒素在体内的稳定性更高的那些(Thorpe etal.，1988)。

已证明免疫毒素在治疗小鼠(Thorpe et al.，1988；Ghetie etal.，1991；Griffin et al.，1988a；b)和人(Vitetta et al.，1991)淋巴瘤和白血病方面是有效的。然而，淋巴样瘤形成特别适合于用免疫毒素治疗，因为血中免疫毒素相对容易进入肿瘤细胞。其也可能靶向正常淋巴样抗原，因为在治疗过程中与恶性细胞一起被杀死的正常淋巴细胞从没有靶抗原的祖代迅速再生。

与其在淋巴瘤中的效力相反，已证明免疫毒素在固体肿瘤的治疗中相对无效(Weiner et al.，1989；Byers et al.，1989)。造成这种情况的主要原因是固体肿瘤通常对于抗体大小的分子是不可渗透的：在人的研究中，低于0.001％注射剂量/g肿瘤的比吸收值并非不常见(Sands etal.1988；Epenetos et al.，1986)。另一主要问题是抗原缺陷型突变体不会被免疫毒素杀死，而且会再生(Thorpe et al.，1988)。

此外，由于一些原因，进入肿瘤中的抗体不会均匀分布。首先，肿瘤细胞和纤维肿瘤基质的堆集密度对于大分子运输存在难以克服的物理障碍，而且与缺乏淋巴管道相结合，在肿瘤核心产生升高的间质压，降低了外渗和液体对流(Baxter et al.，1991；Jain，1990)。第二，在大多数肿瘤中血管的分布是无秩序和不均匀的，因此，有些肿瘤细胞因大的扩散距离而与外渗的抗体分开(Jain，1990)。第三，进入肿瘤的所有抗体会被首先碰到的肿瘤细胞的血管周围区吸收，因此没有抗体到达更远位点的肿瘤细胞(Baxter et al.，1991；Kennel et al.，1991)。

因此，显然，非常需要开发治疗固体肿瘤的新方法。一种方法涉及将药物靶向肿瘤的脉管系统，而不是肿瘤细胞。固体肿瘤生长主要依赖于肿瘤的脉管系统，而如果提供了氧，营养物质和其他生长因子，而且代谢产物的溢出合适，肿瘤细胞就可保持生长。的确，已经观察到，现有的治疗方法已经有脉管介导的作用机制(作为其作用的一部分)(Denekamp，1990)。

本发明人提出靶向脉管系统可使肿瘤的生命维持过程受到抑制，从而导致肿瘤生长率降低或导致肿瘤细胞死亡。这种方法比直接靶向肿瘤细胞有许多优点。首先，静脉内施用的治疗药物可直接进入靶细胞，使得高百分比的注射剂量迅速定位(Kennel et al.，1991)。第二，由于各毛细血管给其周围肿瘤‘带’中的成千上万的细胞提供氧和营养物质，所以即使有限的损坏肿瘤脉管系统也可以使肿瘤细胞大量死亡(Denekamp，1990；Denekamp，1984)。最后，没有靶抗原的突变体内皮细胞的过度生长不大可能，因为它们是正常细胞。

目前，主要接受的是成功地靶向肿瘤维管，其需要识别肿瘤内皮细胞而不是正常组织中之细胞的抗体。尽管已经得到了一些抗体(duijvestijn etal.，1987；Hagemeier et al.，1986；Bruland et al.，1986；Murray etal.，1989；Schlingemann et al.，1985)，但没有一个有高度的特异性。另外，除上述提到的毒素外，还未报道有任何具体的药物，表明具有作为靶向维管之抗体共轭物中的第二药物的潜力。因此，不幸的是，尽管靶向维管有一定理论优势，但尚未开发出结合了这些优点的有效方法。

本发明综述

本发明通过提供用于特异性凝结的新组合物和方法，例如在肿瘤脉管系统中的凝血，且仅有有限的副作用而克服了现有技术的不足。总的来说，本发明涉及各种基于新免疫和生长因子的双特异性组合物以及其制备和使用的方法，所述组合物能够刺激与疾病相关之脉管系统中的凝血。

本发明提供了可称之为“双特异性结合配体”的结合配体。所述配体含有通常与疾病相关之靶细胞(如肿瘤细胞)，或与所述细胞有关之组分；与疾病有关之脉管系统的一些组分(如肿瘤脉管系统)；或与疾病相关基质的组分或有关组分结合的“第一结合区”。第一结合区与“凝结剂”可操作相连，该凝结剂可以是凝结因子本身或可以是能够与凝血因子结合的第二结合区。

将本发明的结合配体描述成“双特异性”，因为它们“至少”是双特异性的，即它们最少含有两个不同的功能区。在本发明范围内还包括使用其他构建体的组合物和方法，如三特异性和多特异性结合配体。本发明还包括本文描述的双特异性凝血配体与其他有效物结合的组合物，试剂盒和方法，例如其他基于免疫学-和生长因子的组合物，抗原-诱导剂，免疫刺激剂，免疫抑制剂，化疗药物等。

第一结合区和任何第二结合区可以是抗体或其片段。本文所用的，术语“抗体”广义地指任何免疫结合剂如IgG，IgM，Ig，IgD和IgE。通常IgG，和IgM是优选的，因为它们是生理条件下最常用的抗体，而且因为在实验室条件下很容易制备。认为单克隆抗体(MAbs)有特定的优点，例如重现性和大规模生产，而且它们的使用通常是优选的。基因工程的抗体，如重组抗体和人化的抗体也在本发明的范围内。

若将抗体的抗原结合区用作结合和靶向剂，就可以使用完整的抗体分子。另外，可以使用抗原功能结合区，例如抗体Fv，scFv(单链Fv)，Fab’，Fab，Dab或F(ab’)₂片段。制备并使用各种抗体为基础的构建体的技术是本领域熟知的，而且将在本文作进一步描述。

形成结合配体凝血因子部分以便它保持显著的功能，即当将其传递到靶区时，它是一种仍能保持其促进血液凝集或结块之能力的形式。然而，在特定的实施方案中，结合配体的凝血因子区比例如天然促凝剂配对物的活性低，但在传递到靶区后，所述因子将会达到所需的活性水平。一种所述实施例是没有Gla修饰的维生素K-依赖性的凝血因子，其在双特异性配体的第一结合区与膜环境结合后，会产生显著的功能活性。

若用第二结合区与凝血因子结合，通常的选择是，它识别凝血因子上的位点，但不会明显损伤其诱导凝血的能力。此外，若凝血因子与第一结合剂共价相连，通常使用与其凝血功能位点不同的位点以连接分子。

本发明的双特异性配体的“第一结合区”可以是任何与设计的靶位点(即与肿瘤区相关的位点或其中需要凝血的其他疾病位点)结合的组分。在靶向肿瘤的情况下，通常靶分子以比在非肿瘤位点高的浓度存在于肿瘤位点。在特定优选的实施方案中，将靶分子，不论是否是与肿瘤相关的细胞，肿瘤维管细胞，肿瘤-相关的基质或其他组分限制于所述细胞或其他肿瘤-相关的组织，但这不是本发明的要求。

从这点看，应注意肿瘤脉管系统是“促血栓形成的”，而且是倾向于凝血的。因此设想靶促凝剂可能优先促凝肿瘤脉管系统但不凝集正常组织脉管系统，即使其他正常细胞或身体组分，特别是正常内皮细胞或均匀基质表达显著水平的靶分子。因此认为该方法用于人如作为治疗癌症的方法比将毒素靶向于肿瘤脉管系统的方法更安全。

在特定的实施方案中，用于本发明的第一结合区可以针对肿瘤细胞组分或与肿瘤细胞相关的组分。在通常靶向肿瘤细胞时，认为第一结合配体会使双特异性结合配体的凝血因子组分在最靠近血管的肿瘤细胞周围血管中浓缩，因此引发肿瘤血管的凝集，得到双特异性结合配体的显著效用。

因此第一结合区可以是与肿瘤细胞结合的组分，如抗体或其他试剂。“与肿瘤细胞结合”的试剂在本文中被定义为与任何可接近肿瘤细胞的组分或肿瘤细胞组分结合，或与其自身结合之组分结合的配体，或如本文进一步描述的与肿瘤细胞有关的配体。

设想大部分的所述肿瘤-结合配体是与细胞表面肿瘤抗原或标记物结合的试剂特别是抗体。许多所述抗原是已知的，且许多抗体都用于抗原结合和靶向肿瘤。因此，本发明包括与鉴定的肿瘤细胞表面抗原(如表I所列的)结合的第一结合区，如抗体的抗原结合区，和优先或特异性地与完整肿瘤细胞结合的第一结合区，如与在表II中所列的肿瘤细胞结合。

目前肿瘤细胞结合区的优选实例是含有抗体的抗原结合区的那些，它们与细胞表面肿瘤抗原p185^HER2，牛奶粘蛋白核心蛋白，TAG-72，Lewis或癌胚抗原(CEA)结合。另一组目前优选的肿瘤细胞结合区是含有与肿瘤相关抗原结合之抗体的抗原结合区的那些，所述肿瘤相关抗原与抗体9.2.27，OV-TL3，B3，KS1/4，260F9或D612结合。

抗体9.2.27与高M_r黑瘤抗原结合，OV-TL3和MOv18均与卵巢相关的抗原结合，B3和KS1/4与癌抗原结合，260G9与乳腺癌结合，D612与结肠直肠癌结合。与同D612，B3或KS1/4相同的抗原结合的抗原结合部分是特别优选的。D612在美国专利5183756中作了描述，而且ATCC保藏号为HB9796；B3在美国专利5242813中作了描述，而且ATCC保藏号为HB10573；重组和嵌合KS1/4抗体在美国专利4975368中作了描述；以上文献均引入本文作为参考。

在靶向肿瘤细胞中，若肿瘤标记物是一组分，如受体，已经鉴定了其生物学配体，则配体本身也可以用作靶向剂，而不用抗体。也可以使用所述配体的活性片段或结合区。

本发明中可以使用的第一结合区还可以是与配体结合的组分，所述配体与肿瘤细胞标记物有关。例如，若所述的肿瘤抗原是细胞表面受体，则体内的肿瘤细胞会有与其表面结合的相应生物学配体，如激素，细胞因子或生长因子并可作为靶。这包括循环中的配体和可以由肿瘤细胞产生，然后与细胞表面结合的“旁分泌型”配体。

因此，本发明还包括与配体结合的第一结合区，如抗体和其片段，所述配体与鉴定了的肿瘤细胞表面抗原，如在表I中所列的那些结合，或优先或特异性地与一种或多种完整肿瘤细胞结合。另外，也可以用受体本身或优选基团工程的或可溶形式的受体或受体结合区作为双特异性凝血配体的结合区。

在进一步的实施方案中，第一结合区可以是与靶分子结合的组分，靶分子在疾病位点而不是肿瘤位点特异性或优先表达。与其他疾病细胞相关的举证性的靶分子包括例如，与良性前列腺增生(BPH)有关的PSA和与增殖性糖尿病视网膜病相关的FGF。据认为患有上述疾病之一的动物或患者可从在疾病位点特异性诱导凝血得到益处。

本文中“疾病细胞”的含义，即它是与疾病或紊乱有关的细胞，所述细胞表达，或是与可靶向的组分有关的，与在非疾病位点和细胞中的其水平相比，所述可靶向的组分以高浓度存在于疾病位点和细胞中。这包括与疾病位点中的脉管系统有关的可靶向组分。

用于靶向并将促凝剂载过到其他疾病位点的举证性第一结合区包括抗体，如与FGF结合的抗PSA(BPH)，和GF82，GF673H3。在FGF受体的情况下，可以使用与相关受体结合的生物学结合配体，如FGF。如下文所述，也可以使用抗维管靶的抗体。若“疾病细胞”本身与强或特有的标记抗原无关，则基质或内皮细胞的靶向给治疗其他疾病提供了有力的方法。

在进一步的实施方案中，本发明的第一结合区可以是能与疾病-相关之脉管系统的组分结合的组分，即其中特异性凝血对动物或患者有利的脉管系统区。目前优选能够特异性或优先与肿瘤脉管系统相关之组分结合的第一结合区。“肿瘤脉管系统的组分”包括可以与这些细胞表面受体或分子结合的肿瘤脉管系统内皮细胞表面分子或任何组分，如生长因子。

特定优选的结合配体是与细胞表面受体结合的抗体和其片段和与这些受体的相应生物学配体结合的抗体。举证性的抗体是与MHCII型蛋白质，VEGF/VPF受体，FGF受体，TGFβ受体，TIE(酪氨酸激酶-免疫球蛋白-表皮生长因子样受体，包括TIE-1和TIE-2)，VCAM-1，P-选择蛋白(selectin)，E-选择蛋白，α_vβ₃整合蛋白，多效蛋白，内皮唾酸蛋白和内皮胶质蛋白。

含有与内皮胶质蛋白结合之抗体的抗原结合区的第一结合区是一组优选的试剂。举证性实例是与同单克隆抗体TEC-4或单克隆抗体TEC-11相同之表位结合的抗体和片段。

与VEGF受体结合的抗体的抗原结合区是另一组优选的试剂。这些具体的举证性实例是与同单克隆抗体3E11，3E7，5G6，4D8，10B10或TEC-110相同的表位结合的抗体和片段。也可以使用结合特异性基本上与称为1B4，4B7，1B8，2C9，7D9，12D2，12D7，12E10，5E5，8E5，5E11，7E11，3F5，10F3，1F4，2F8，2F9，2F10，1G6，1G11，3G9，9G11，10G9，GV97，GV39，GV97γ，GV39γGV59或GV14中的任何一种相同的抗VEGF抗体。适宜的抗VEGF抗体还包括4.6.1，A3.13.1，A4.3.1和B.6.2(Kim et al.，1992)；SBS94.1(OncogeneScience)；G143-264和G143-856(Pharmingen)。

其他有用的抗体是与配体结合的抗体，所述配体与肿瘤脉管系统细胞表面受体结合。与VEGF/VPF，FGF，TGFβ结合的抗体，与TIE，肿瘤相关的纤连蛋白异构体，分散因子，肝细胞生长因子(HGF)，血小板因子4(PF4)，PDGF(包括PDGFa和PDGFb)和TIMP(金属蛋白酶的组织抑制剂，包括TIMP-1，TIMP-2和TIMP-3)结合的配体可用于在这些实施方案中，与VEGF/VPF，FGF，TGFβ结合的抗体，与TIE，肿瘤相关的纤连蛋白异构体结合的配体常常是优选的。

在进一步的实施方案中，对肿瘤脉管系统特异性的标记物可以是已经被诱导的那些，即通过人工特异性地操作其表达，使得随后用利用结合配体，如抗体击靶。

举证性的可诱导抗原包括用细胞因子，如IL-1，IL-4，TNF-α，TGF-β或IFN-γ可诱导的那些，其可以由单核细胞，巨噬细胞，肥大细胞，辅助T细胞，CD8阳性T细胞，NK细胞或甚至肿瘤细胞释放。诱导靶的实例是E-选择蛋白，VCAM-1，ICAM-1，内皮胶质蛋白和MHC II型抗原。当使用MHC II型诱导时，通常需要在正常组织中抑制MHC II型，这可用环孢菌素，如环孢菌素A(CsA)或功能等同试剂达到。

其他的可诱导抗原包括由促凝剂，如凝血酶，IX/IXa因子，X/Xa因子，纤维蛋白溶酶或金属蛋白酶(基质金属蛋白酶，MMP)诱导的那些。通常使用由凝血酶可诱导的抗原。这组抗原包括P-选择蛋白，E-选择蛋白，PDGF和ICAM-1，而P-选择蛋白和/或E-选择蛋白的诱导和击靶通常是优选的。

也可以使用与存在于配体-受体复合物(但没有单个配体和受体)上的表位结合的抗体。所述抗体可识别并与细胞表面存在的配体-受体复合物结合，但不与游离配体或非复合受体结合。因此，本文所用的“配体-受体复合物”指当配体如生长因子，特异性地与其受体，如生长因子受体结合时产生的所得复合物。其实例为VEGF/VEGF受体复合物。

认为所述配体-受体复合物以比在非肿瘤相关内皮细胞上显著高的数量存在于肿瘤相关的内皮细胞上，因此可以用抗-复合物抗体击靶。抗-复合物抗体包括与同单克隆抗体2E5，3E5或4E5相同的表位结合的那些抗体和其片段。

在进一步的实施方案中，在本发明中所用的第一结合区将与疾病相关的基质的组分，如肿瘤相关之基质的组分结合。这包括与基膜组分，激活的血小板和可诱导的肿瘤基质组分，特别是用促凝剂，如凝血酶可诱导的那些结合的抗体之抗原结合区。“激活的血小板”在本文中指肿瘤基质的组分，其一个原因是当被激活时，它们与基质结合。

目前，肿瘤相关之基质的优选可击靶组分是肿瘤相关的纤连蛋白异构体。纤连蛋白异构体是与受体的整合蛋白家族结合的配体。肿瘤相关的纤连蛋白异构体是可得到的，如通过Mab BC-1识别。因此Mab和相似特异性的其他物质是用于本发明优选的试剂。纤连蛋白异构体(虽然是基质组分)与内皮细胞结合，因此在本发明中认为其是可击靶的维管内皮细胞-结合配体。

另一组优选的抗-基质抗体是与在纤维蛋白原上的RIBS(受体-诱导的结合位点)结合的那些。RIBS是可击靶抗原，其表达是在基质中，由激活的血小板控制。在激活的血小板上与LIBS(配体-诱导的结合位点)结合的抗体也是有用的。

另一组有用的抗体是与腱生蛋白(在各种良性和恶性肿瘤基质中表达的一种大分子量细胞外糖蛋白)结合的那些。因此可以用Shrestha等人(1994)描述的抗体和143DB7C8(由tumoinen & Kallioninen(1994)描述的)作为凝血配体(coaguligands)的结合部分。

“疾病-和肿瘤相关之基质的组分”包括各种细胞类型，基质组分，有效物以及其他分子组分，所述其他分子组分可以认为是最窄“基质”定义的外延，但仍然是与疾病区，如肿瘤优先相关的可击靶部分。

因此，第一结合区可以是抗体或与平滑肌细胞，周皮细胞，成纤维细胞，巨噬细胞，浸润淋巴细胞或白细胞结合的配体。第一结合区还可以与结缔组织的组分结合，并包括抗体和与例如纤维蛋白，蛋白多糖，糖蛋白，胶原蛋白和阴离子多糖如肝素和肝素样化合物结合的配体。

在其他优选的实施方案中，本发明的脉管系统和基质结合配体是其自身生物学配体或其部分的结合区，而不是抗体。“生物学配体”在这种意义上是指结合或与细胞表面分子如受体相连的那些分子，所述细胞表面分子可进入到基质中或位于脉管细胞上，如细胞因子，激素，生长因子等。可以使用任何所述的生长因子或配体，只要它与疾病相关的基质或脉管系统结合即可，例如与肿瘤脉管系统内皮细胞表面上的特异性生物学受体结合。

在本发明的这些方面适用的适宜生长因子包括，例如，VEGF/VPF(脉管内皮生长因子/脉管渗透性因子)，FGF(蛋白质的成纤维细胞生长因子家族)，TGFβ(转化生长因子B)，与TIE(一种肿瘤相关的纤连蛋白异构体)，分散因子，肝细胞生长因子(HGF)，血小板因子4(PF4)，PDGF(血小板衍生的生长因子)，TIMP或甚至IL-8，IL-6或XIIIa因子结合的配体。VEGF/VPF和FGF经常是优选的。

还包括了靶向内皮细胞结合的组分，如细胞因子或生长因子，它们带有与已知受体为基础的结合配体构建体。通常若用受体作为靶向组分，就使用截断的或可溶形式的受体。在所述实施方案中，特别优选的击靶内皮细胞结合的组分是二聚配体，如VEGF。优选的一种二聚体组分是可在原位与细胞表面受体结合，剩下二聚体其它组分可结合双特异性凝血配体的可溶性受体部分。

使用包括至少一个能够与疾病相关之脉管系统组分结合的击靶区的双特异性，或三-或多特异性配体的优点是，脉管内皮细胞和疾病相关的试剂如激活的血小板在不同的疾病，特别是不同肿瘤中是相似的。这种现象使得用一种药物治疗多种疾病和不同类型的癌症成为可能，而不需针对每个个体疾病患者特定的肿瘤类型再选择药物。

因此本发明的组合物和方法适用于治疗有脉管组分的良性和恶性疾病。所述脉管系统相关的疾病包括良性如BPH，糖尿病视网膜病，血管再狭窄，房室瓣杂音(AVM)，脑膜瘤，血管瘤，新脉管(neovascular)青光眼和牛皮癣。在这组中还包括滑膜炎，皮炎，子宫内膜炎，血管纤维瘤，风湿关节炎，动脉粥样硬化斑，角膜移植新血管生成，血友病关节，肥厚性瘢痕，osler-weber综合症，化脓性肉芽肿，晶体后纤维增生症，硬皮病，砂眼和脉管粘附。已知上述疾病有共同的血管依赖性病理学，因此，认为在所述疾病位点进行凝血会有益处。

本发明的双特异性结合配体凝血因子共轭物可以是其中两个或多个共价相连的共轭物。例如，通过采用生化交联剂，优选在血液中有适当稳定性的，如SMPT。所述组分可以用熟知的抗生物素蛋白(或链霉素抗生物素蛋白)和生物素组合来连接。各种交联剂，抗生物素蛋白：生物素组合物和混合物以及制备共轭物的技术是本领域熟知的并将在本文进一步描述。

另外，所述双特异性凝血剂可以是通过分子生物学技术，即通过将编码结合配体或区域的基因(或cDNA)与编码凝血因子的基因(或cDNA)相连而制备的融合蛋白。这是本领域熟知的并将在本文进一步描述。通常制备的表达载体，在同一阅读框架中含有编码第一结合区的DNA片段(其可操作性地与编码凝血因子的DNA片段相连)并表达重组宿主细胞中载体的DNA片段，从而生产编码的融合蛋白。

用于本发明的凝血因子可以包含维生素K依赖性凝血因子，例如，II/IIa因子，VII/VIIa因子，IX/IXa因子，或X/Xa因子。还可以使用V/Va因子，VIII/VIII因子，XI/XIa因子，XII/XIIa因子和XIII/XIIIa因子。

特定方面涉及没有Gla修饰的维生素K依赖性凝血因子。可以通过在原核宿主细胞(所述细胞不能影响Glu到Gla的修饰)表达维生素K依赖性凝血因子编码基因来制备所述因子。还可以通过制备工程凝血因子基因，然后在有效的任何重组宿主细胞中表达所述的工程基因来生产所述因子，所述工程凝血因子基因编码缺乏必需的或“对应的”谷氨酸残基的维生素K依赖性凝血因子。同样，通过处理维生素K依赖性凝血因子蛋白质以除去或改变相应的谷氨酸残基可以制备所述凝血因子。

用于本发明结合配体的优选凝血因子是组织因子和组织因子衍生物。一组有用的组织因子是在激活VII因子方面有缺陷的突变体。通过改变通常在氨基酸序列中约157到约167之间区域的一个或多个氨基酸而使组织因子在激活VII因子方面产生缺陷。举证性的突变体是将158位的Trp换成Ala；将162位Ser换成Ala；将164位Gly换成Ala的突变体；以及将158位的Trp换成Arg，将162位Ser换成Ala的双突变体。

优选的组织因子衍生物是截断的组织因子，二聚体或甚至聚合的组织因子和二聚的或多聚的，截断的组织因子。

本发明还提供了新组织因子构建体，含有与至少一种其他组织因子或衍生物可操作相连的组织因子或衍生物。截断的组织因子是优选的，而经修饰后含有疏水膜插入部分的截断的组织因子是特别优选的。

如本文所定义的，“疏水膜插入部分”是控制组织因子插入或与膜接触的一个或多个单位。本发明的疏水膜插入部分用基本上疏水的氨基酸区，如约3到约20个疏水氨基酸来说明，也可以用脂肪酸来说明。

疏水氨基酸可以位于截断组织因子N-或C-末端的任-端，或附加所述分子的另一点。若使用疏水氨基酸，则有利地是可以通过分子生物学技术将其插入分子。同样，可通过合成化学技术将疏水氨基酸或脂肪酸加到组织因子中。

在本发明的组织因子二聚体，三聚体和聚合物中，可以经例如二硫键，硫醚或肽键将各组织因子或衍生物可操作相连。在特定的实施方案中，经在血浆或在打算使用的生理学环境中基本上稳定的键连接组织因子单位。这是以本发明人证明组织因子二聚体形式有最大的生物学活性的概念为基础。但是，由于在本发明方法中已知组织因子单体是有活性的，因此，不需要稳定的键。

可以修饰在二聚体和多聚体中的一个或多个组织因子或截断的组织因子以含有末端半胱氨酸残基或适用于将组织因子构建体与第二种试剂，如结合区相连接的另一部分。

含有包括可选择性裂解的氨基酸序列之肽的组织因子单体，截断的组织因子和组织因子二聚体以及多聚体形成了本发明的另一方面。包括用于尿激酶，血纤维蛋白溶酶，凝血酶，IXa因子，Xa因子或金属蛋白酶，如间质胶原蛋白酶，明胶酶或溶基质素之裂解位点的肽接头是特别优选的。

因此可以将组织因子单体，平截的组织因子，组织因子二聚体和多聚体以及任何促凝剂经生物学可释放的键与第二种试剂如抗体，抗体的抗原结合区，配体或受体相连。包括用于上述蛋白酶之裂解位点的肽接头的选择是以例如肿瘤环境中存在所述蛋白酶为基础的。预计将双特异性同源性试剂或配体载运到肿瘤位点会引起裂解，导致凝血因子的相对特异性释放。

本发明的具体构建体是在序列中含有操作连接的系列单位的那些：半胱氨酸残基，选择性可裂解的肽接头，延伸的疏水氨基酸，第一个平截的组织因子和第二个平截的组织因子；或在序列中：第一个半胱氨酸残基，选择性可裂解的肽接头，第一个疏水氨基酸区，第一个平截的组织因子和第二个平截的组织因子和第二个疏水氨基酸区；其中可以或不必将每个构建体与第二种试剂如抗体，配体或受体相连。

其他适宜的凝血因子是Russell氏蝰蛇毒X因子激活剂；激活血小板的化合物，如凝血恶烷A₂和凝血噁烷A₂合成酶；以及血纤维蛋白溶解抑制剂，如α₂抗纤维蛋白溶酶。

本发明还包括结合配体，其中凝血因子不与共轭物共价相连，但通过结合第二结合区与其非共价相连，所述第二结合区与构建体的击靶剂可操作相连。适宜的“第二结合区”包括具有凝血因子结合特异性的抗体的抗原结合位点，包括抗体的功能部分，如scFv，Fv，Fab’，Fab和F(ab’)₂片段。

因此设想了含抗体或其片段的结合配体，所述抗体或其片段直接抗维生素K依赖性凝血因子II/IIa因子，VII/VIIa因子，IX/IXa因子，或X/Xa因子；没有Gla修饰的维生素K依赖性凝血因子，组织因子，突变体组织因子，截断的组织因子，二聚体组织因子，聚合组织因子，二聚体截断的组织因子；前激肽释放酶；V/Va因子，VIII/VIIIa，XI/XIa因子，XII/XIIa因子，XIII/XIIIa因子；Russell氏蝰蛇毒X因子激活剂，血栓噁烷A₂或α₂-抗血纤维蛋白溶酶。

可以将非共价结合的凝血剂与凝血因子结合或“预复合”以便在施用后，可以用它们将外源凝血因子载运到动物的疾病位点，如肿瘤脉管系统。同样，也可以以“非复合的”形式将含凝血因子特异性的第二结合区的结合配体施用于动物，并仍能发挥功能达到特异性地凝血；在这种情况下，所述试剂将积累循环中的(外源)凝血因子并在疾病或肿瘤位点浓缩它。

就“凝血因子”或凝血剂而言，这些可以是外源凝血因子和其衍生物，或所述因子外源加入的变体，包括重组变体。由于促凝剂(在本发明中为“凝血配体”)在靶向疾病限制低于100％的标记物后不产生显著的副作用，因此它们比毒素(免疫毒素)有截然不同的优点。此外，所用的促凝剂常常是人源的，因此，产生的免疫原性问题比外源毒素，如蓖麻毒蛋白A链少。

尽管不限于所述组合物，但本发明重要的组合物实例是双特异性抗体，所述抗体含有与疾病细胞或疾病相关之脉管系统标记物的组分结合的第一抗原结合区和与凝血因子结合的第二抗原结合区。本发明还提供了所述双特异性抗体的scFv，Fv，Fab’，Fab和F(ab’)₂片段。目前所述双特异性抗体的一个优选实例是含有抗MHC II型抗原结合位点和抗组织因子的另一结合位点的抗体。

在进一步的实施方案中，本发明提供了含有任何上述药物可接受形式之结合配体和双特异性抗体或其混合物的药物组合物和治疗试剂盒。这包括药物组合物和试剂盒，其中结合配体含有与凝血因子共价相连的第一结合区，在结合配体中，也可以第一结合区与第二结合区共价相连，而第二结合区再结合凝血因子-不论结合发生在施用于动物之前或之后均可。

还设想了包括本发明双特异性，三特异性或多特异性结合配体之组合的药物组合物和治疗试剂盒。这包括其中一种结合配体是抗疾病细胞或肿瘤细胞的，而另一种是抗疾病相关基质之脉管系统内皮细胞标记物或组分的组合。在本发明的组合物和试剂盒中还可以包括其他不同的组分，如抗体，免疫毒素，免疫有效物，化疗剂等。

试剂盒还可包括抗原抑制剂，如环孢菌素，以用于抑制已知在正常组织内皮细胞中的抗原表达；和/或用于诱导疾病相关的脉管内皮细胞或基质表达可击靶抗体的“诱导剂”，击靶抗原如E-选择蛋白，P-选择蛋白或MHCII型抗原。举证性的诱导剂包括结合疾病或肿瘤抗原并产生IFN-γ的T细胞克隆，从用所述试剂盒处理的动物中分离所述克隆是目前优选的。

优选的诱导剂是与疾病或肿瘤细胞抗原，或甚至基质组分，以及能够产生细胞因子，促凝剂或其他因子(它们可诱导所需靶抗原的表达)的有效物细胞结合的双特异性抗体。目前，一组优选的双特异性抗体是与肿瘤抗原和活化抗原CD4或CD16结合的那些，以刺激单核细胞，巨噬细胞或肥大细胞的IL-1生产；以及与肿瘤抗原和活性抗原CD2，CD3或CD28，优选CD28结合的抗体，以刺激NK细胞或优选T细胞的IFN-γ的生产。

第二组优选的双特异性抗体是与肿瘤抗原或肿瘤基质的组分，以及组织因子，组织因子衍生物，凝血酶原，VII/VIIa因子，IX/IXa因子，X/Xa因子，XI/VIa因子或Russell氏蝰蛇毒X因子激活剂结合的抗体，以刺激凝血酶的生产。含有所述双特异性抗体作为第一“诱导”组合物的试剂盒通常包括含有结合配体的第二药物组合物，所述结合配体含有与P-选择蛋白或E-选择蛋白结合的的第一结合区。

用一种或多种适宜的容器装置以及分散在单个包装中的不同容器，可以将本发明的双特异性配体和其他组分很方便地分份并包装。在下文将进一步描述药物组合物和试剂盒。

尽管本发明在载运促凝剂以及疾病治疗方面有显著的临床应用，但它还有许多体外用途。这些包括例如以双特异性化合物的特定抗体，配体或受体的结合能力为基础的各种检测方法。因此，可以将本发明的双特异性凝血配体用于标准结合检测和方法中，如在免疫印迹，Western印迹，点印迹，RIA，ELISA，免疫组织化学，荧光激活细胞分类(FACS)，免疫沉淀，亲和层析等，下文将进一步描述。

在其他的实施方案中，本发明涉及将促凝剂载运到疾病相关的脉管系统的方法，可以用于治疗疾病，如糖尿病视网膜病，血管再狭窄，AVM，血管瘤，新脉管青光眼，牛皮癣和类风湿性关节炎，以及有脉管化的肿瘤组分的肿瘤。所述方法通常包括将药物组合物施用于患有脉管组分疾病的动物，包括人，所述药物组合物含有至少一种上述的双特异性结合配体。

以有效促进疾病位点，如固体肿瘤的脉管系统中血液凝集的量和途径施用所述组合物。根据本发明的公开，如优选的实施方案和详细的实施例，有效剂量是本领域专业人员熟知的。非肠道给药经常是适宜的，其他方法是例如将药物注射到脉管化的肿瘤位点。

通过施用含有共价结合的凝血因子的结合配体以及通过施用含有非共价结合的凝血因子的结合配体，本发明的方法可载运外源凝血因子，所述非共价结合的凝血因子与双特异性配体或抗体的第二结合区复合。

本发明的方法还包括将内源凝血因子载运到疾病或肿瘤脉管系统的方法。这是通过给动物或患者施用结合配体而达到的，所述结合配体含有与内源凝血因子结合并在疾病相关的或肿瘤脉管系统浓缩所述因子的第二结合区。

在其他的方法学实施方案中，设想特异性地诱导肿瘤脉管系统或基质的标记物，然后用结合配体，如抗体击靶。举证性的可诱导抗原包括E-选择素，P-选择蛋白，MHC II型抗原，VCAM-1，ICAM-1，内皮胶质蛋白，有LAM-1反应性的配体，脉管地址素以及其他粘附分子，E-选择蛋白和MHC II型抗原目前是优选的。

当诱导并随后靶向MHC II型蛋白质时，通常需要在正常组织中抑制MHC II型。用环孢菌素或功能等同物可以完成MHC II型的抑制。然后用环孢菌素非依赖性方法，如通过将疾病相关的脉管系统暴露于释放诱导细胞因子IFN-γ的动物效应细胞，通常为辅助T细胞或NK细胞，从而在疾病相关的脉管内皮细胞中诱导MHC II型分子。

激活的单核细胞，巨噬细胞，甚至肥大细胞是能够产生诱导E-选择蛋白的细胞因子(IL-1；TNF-α；TNFβ)的效应细胞；而辅助T细胞，CD-8阳性T细胞和NK细胞能够产生诱导MHC II型的IFN-γ。通过给动物施用与效应细胞表面激活抗原结合的激活抗体，可以激活在疾病位点的单核细胞/巨噬细胞以产生IL-1，或激活疾病相关的辅助T细胞或NK细胞以产生IFN-γ。举证性的激活抗原包括用于单核细胞/巨噬细胞的CD14和CD16(用于IgE的FcR)和用于T细胞的CD2，CD3和CD28；而CD14和CD28分别优选用于特定的实施方案中。

为了达到特异性激活和诱导的目的，目前优选的方法是用与效应细胞激活抗原，如CD14或CD28，以及疾病或肿瘤细胞抗原均结合的双特异性抗体。这些双特异性抗体将定位于疾病或肿瘤位点，然后分别激活单核细胞/巨噬细胞和T细胞。在靶疾病或肿瘤组分附近激活的效应细胞将诱导细胞因子，在此情况下，分别是IL-1和IFN-γ。

通过给动物施用抗-CD4抗体可以抑制正常组织中的MHC II型；这种功能是通过动物的T细胞抑制IFN-γ生产，从而抑制MHC II型表达。通过仅将疾病位点暴露于IFN-γ，就可以再在疾病相关的脉管内皮细胞中诱导MHC II型分子。达到这一目的的一种方法是给动物施用与疾病位点的抗原结合的生产IFN-γ的T细胞克隆。生产IFN-γ的T细胞优选是从动物的疾病位点得到的浸润白细胞，如在体外扩展的肿瘤浸润白细胞(TIL)。

还提供了用双特异性抗体只在局部环境，如在肿瘤位点诱导促凝剂，如凝血酶生产的方法。这通常是通过给动物施用含有双特异性抗体的药物组合物而达到的，所述双特异性抗体与肿瘤细胞或肿瘤基质的组分，组织因子，组织因子衍生物，凝血酶原，VII/VIIa因子，IX/IXa因子，X/Xa因子，XI/XIa因子或Russell氏蝰蛇毒X因子激活剂结合。然后将与E-选择蛋白，  P-选择蛋白结合的抗体与凝血因子或与凝血因子结合的第二结合区相连，然后引入到动物血液中。

更常规的组合治疗方案也是可能的，例如将本发明的肿瘤凝血因子与现有的抗肿瘤治疗，如与放疗或化疗相结合，或通过使用第二种免疫试剂，如抗肿瘤免疫毒素。也可以将用于良性疾病的新治疗方法与目前使用的其他治疗方法相结合。

附图的简要描述

下列附图构成本发明说明书的一部分，并用其对本发明的特定方面作进一步的说明。参考这些附图中的一个或多个，并结合本文中具体实施方案的详细说明，可以更好地理解本发明。图1 经B21-2/10H10双特异性抗体，将tTF限制到A20细胞的范围。在4℃，存在叠氮化钠的条件下，将A20细胞与不同浓度的B21-2/10H10(□)，SFR8/10H10(·)或B21-2/OX7(○)加过量的¹²⁵I-tTF培育1小时。按实施例II所述确定与细胞有关的¹²⁵I-tTF的数量。图2  每个A20细胞限定的tTF分子数量与诱导血浆凝血能力之间的关系。在4℃，存在叠氮化钠的条件下，将A20细胞与不同浓度的B21-2/10H10加过量tTF培育1小时。洗涤细胞，加热到37℃，加入钙和小鼠血浆，记录形成第一条纤维蛋白链的时间(横轴)。进行相同的研究，其中在4℃，将A20细胞与不同浓度的双特异性抗体加¹²⁵I-tTF培育1小时，然后按实施例II所述确定与细胞特异性结合的tTF数量(纵轴)。加到未处理的A20细胞中的血浆(即0tTF分子/细胞)在190秒内凝集。图3A，图3B，图3C和图3D。在施用凝血配体后，血管血栓形成和肿瘤坏死的时间。给每组3只有直径为0.8cm的C1300(Muγ)肿瘤的小鼠静脉内注射14μgB21-2/10H10和11μgtTF组成的凝结配体。图3A；在注射前：血管是未受损的，肿瘤细胞是健康的。图3B；0.5小时：通过肿瘤的血管形成了血栓；肿瘤细胞是健康的。图3C；4小时：在所有肿瘤血管中均存在稠密的血栓，肿瘤细胞在分裂，并发展成致密的核。在肿瘤间质组织中红细胞是可见的。图3D；24小时：在肿瘤中产生大量肿瘤坏死。箭头表明血管。图4。通过肿瘤脉管系统介导的凝血配体治疗而诱导的固体肿瘤退化。给有直径为0.8cm的C1300(Muγ)肿瘤的Na/nu小鼠静脉内注射与tTF(11μg)混合的14μgB21-2/10H10，间隔1星期(箭头)(□)。对照组小鼠只接受等剂量的tTF(·)，仅B21-2/10H10(○)或稀释剂(■)。接受等剂量同型匹配的对照双特异性抗体(SFR8/10H10，OX7，或B21-2/10H10)和tTF的其他对照组对只接受tTF的动物中的那些有相似的肿瘤反应。每组小鼠有7或8只。图5 举证性抗体-tTF构建体。该图表明通过经二硫键键合化学衍生的抗体与化学衍生的tTF，也可通过键合各种TF或TF二聚体与抗体和其片段而合成的共轭物。图6 与A20细胞结合时，tTF共轭物的凝血活性。在4℃，存在叠氮化钠的条件下，将A20细胞与不同浓度的B21-2/10H10双特异性+H₆[tTF]以1∶1的比率预混1小时(□)，并与B21-2抗体-H₆C[tTF](●)，B21-2抗体-H₆[tTF](▲)培育1小时。洗涤细胞，加热到37℃，加入钙和小鼠血清，记录形成第一条纤维蛋白链的时间。将结果表示成不存在tTF时的凝血时间，以％表示。图7 抗肿瘤细胞tTF共轭物的凝血活性。与TF9-6B4和TF8-5G9抗体预培育的LS174T细胞(■)，Widr细胞(·)和H460细胞(▲)在4℃，存在叠氮化钠的条件下，与不同浓度的D612抗体-H₆C[tTF](■)，KS1/4抗体-H₆[tTF](·)，和XMMCO791抗体-H₆[tTF](▲)培育1小时。洗涤细胞，加热到37℃，加入钙和小鼠，记录形成第一条纤维蛋白链的时间。将结果表示成不存在tTF时的凝血时间，以％表示。图8 II/IIa因子，VII/VIIa因子，IX/IXa因子和X/Xa因子的Gla区(γ-羧基谷氨酸)。箭头表示信号肽和原肽的裂解位点和激活裂解位点(斜箭头)。

优选实施方案的详细描述

尽管他们在淋巴瘤和白血病的治疗方面表现出了很大的潜力(Lowder et al.，1987；Vitetta et al.，1991)，但单克隆抗体(MAbs)和免疫毒素(ITs)在抗癌症和其他固体肿瘤(Byers & Baldwin，1988；Abrams& Oldham，1985)(人类中90％以上的癌症均是固体肿瘤)的临床试验中表明是相当程度无效的。造成这一情况的主要原因是大分子不能很容易地进到固体肿瘤中(Sand，1988；Epenetos et al.，1986)，而且一旦进入到肿瘤中，由于在肿瘤细胞(Dvorak et al.，1991)之间存在紧密的接合，并存在纤维基质(Baxter et al.，1991)间质压梯度(Jain et al.，1991)以及接合位点障碍(Juweid et a.，1992)，也不能均匀地分散。

在发展治疗固体肿瘤的新方法中，靶向肿瘤脉管系统而不是肿瘤细胞本身的方法似乎有更特定的优点。例如通过肿瘤脉管系统特异性纤维蛋白的形成而诱导血流通过肿瘤的障碍就可以干扰在肿瘤位点流入和流出，因此产生抗肿瘤作用。通过改变在肿瘤相关血管中的促凝剂原-纤维蛋白溶解平衡，可以抑制对肿瘤的血液供应，从而有利于通过特异性地暴露于凝血剂的凝血过程。

本发明提供了用于影响特异性血液凝集的方法，如通过肿瘤特异性凝血。这是通过双特异性或多特异性结合配体而达到的，在所述接合配体中，至少一种组分是免疫学或生长因子为基础的靶组分，而至少另一种组分能够直接或间接刺激凝血。A   靶向的疾病位点

将由本发明提供的组合物和方法广泛地用于治疗任何有脉管组分的疾病，如良性或恶性肿瘤。所述脉管系统相关的疾病包括BPH，糖尿病视网膜病，血管再狭窄，房室瓣杂音(AVM)，脑膜瘤，血管瘤，新脉管(neovascular)青光眼和牛皮癣；以及子宫内膜炎，血管纤维瘤，关节炎，动脉粥样硬化斑，角膜移植新血管生成，血友病关节，肥厚性瘢痕，osler-weber综合症，化脓性肉芽肿，晶体后纤维增生症，硬皮病，砂眼和脉管粘附，滑膜炎，皮炎。

典型的脉管化肿瘤是需要血管组分提供氧和营养物质的固体肿瘤，特别是癌。可以用本发明治疗的举证性的固体肿瘤包括，但不限于肺癌，乳腺癌，卵巢癌，胃癌，胰腺癌，喉癌，，食管癌，睾丸癌，肝癌，腮腺癌，胆管癌，结肠癌，直肠癌，颈癌，子宫癌，子宫内膜癌，肾癌，膀胱癌，前列腺癌，甲状腺癌，鳞片状细胞癌，腺癌，小细胞癌，黑素瘤，神经胶瘤，神经母细胞瘤等。

本发明双特异性剂的一个结合区是能够将凝血剂载运到肿瘤区的组分，即能够定位在肿瘤位点内，如上所述的那些。由于凝血剂更广的分布与严重的副作用(如已知用毒素部分发生的)无关，所以对双特异性配体的靶部分的要求不太严格。因此，靶剂可针对肿瘤细胞的组分；肿瘤脉管系统；与肿瘤细胞结合，或通常与肿瘤细胞相关的组分；与肿瘤脉管系统结合，或通常与肿瘤脉管系统相关的组分；肿瘤细胞外基质的组分；甚至在肿瘤脉管系统中发现的各种类型细胞。

由于肿瘤脉管系统是‘促凝血的’而且易于凝血，所以减轻了很严格击靶的负担，如用免疫毒素而产生的。因此，达到特异性击靶意味着相对于在非肿瘤位点的脉管系统，可加速在肿瘤脉管系统的凝血。因此特异性击靶是与击靶剂的生物分布特性有关的功能术语，而不是纯生理学术语，而且有可能有用的靶不完全限于肿瘤，而且在施用后有效促进肿瘤特异性凝血的击靶配体可能会在身体的其他位点中发现。1   肿瘤细胞靶

用含有能够与肿瘤细胞的相对特异性标记物结合之区域的双特异性配体，可以靶向形成肿瘤的恶性细胞。在肿瘤细胞的结合从而将相关的凝血剂定位于肿瘤时，可达到特异性凝血目的。此外，预期这将是促进凝血的特别有效的方法，由于血管周围肿瘤细胞的生理易接近性，有可能在最靠近血管的肿瘤细胞周围浓缩双特异性试剂。

已经描述的许多所谓“肿瘤抗原”，其中的任何一种均可用作与本发明有关的靶。在本文表I中列出了大量举证性的固体肿瘤相关的抗原。抗所述抗原的抗体的制备和用途是本领域熟知的，而且在表I中还列出了举证性抗体。

鉴定靶肿瘤的另一种方法是基于肿瘤细胞本身的特征，而不是由细胞表达的抗原的生物化学特性。因此，表II是为了说明可公开得到的(从ATCC目录)人肿瘤细胞系。

表II中所列的信息是实例，而不是为了以年代或范围进行限定。人们可以参照任何年代的ATCC目录以鉴定其他适宜的细胞系。另外，如果需要特定的细胞类型，得到所述细胞的方法，和/或它们可马上得到的途径是本领域的专业人员熟知的。因此，分析科学文献很容易揭示出需靶向任何肿瘤细胞的适宜细胞。

                    表I  实质肿瘤的标记抗原和对应的单克隆抗体

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
				A：妇科GY	‘CA 125’＞200 kD粘蛋白GP	OC 125	Kabawat et al.，1983；Szymendera，1986
卵巢	80 Kd GP	OC 133	Masuko et al，Cancer Res.，1984
				卵巢	‘SGA’360 Kd GP	OMI	de Krester et al.，1986
卵巢	H高Mr粘蛋白	Mo v1	Miotti et al，Cancer Res.，1985
				卵巢	H高Mr粘蛋白/糖脂	Mo v2	Miotti et al，Cancer Res.，1985
卵巢	NS	3C2	Tsuji et al.，Cancer Res.，1985
				卵巢	NS	4C7	Tsuji et al.，Cancer Res.，1985
卵巢	H高Mr粘蛋白	ID3	Gangopadhyay et al.，1985
				卵巢	H高Mr粘蛋白	DU-PAN-2	Lan et al.，1985
GY	7700 Kd GP	F 36/22	Croghan et al.，1984
				卵巢	‘gp 68’48 Kd GP	4F7/7A10	Bhattacharya  et al.，1984
GY	40，42kD GP	OV-TL3	poels et al.，1986
				GY	‘TAC-72’高Mr粘蛋白	B72.3	Thor et al.，1986

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
				卵巢	300-400 Kd GP	DF3	Kufe et al.，1984
卵巢	60 Kd GP	2C8/2F7	Bhattacharya et al.，1985
				GY	105 Kd GP	MF 116	Mattes et al.，1984
卵巢	38-40 kD GP	MOv18	Miotti et al.，1987
				GY	‘CEA’180 Kd GP	CEA 11-H5	Wagener et al.，1984
卵巢	CA 19-9 or GICA	CA 19-9(1116NS 19-9)	Atkinson et al.，1982
				卵巢	‘PLAp’67 Kd GP	H17-E2	McDicken et al.，1985
卵巢	72 Kd	791T/36	Perkins  et al.，1985
				卵巢	69 Kd pLAp	NDOG2	Sunderland et al.，1984
卵巢	未知的 Mr PLAP	H317	Johnson et al.，1981
				卵巢	p185HER2	4D5，  3H4，7C2，  6E9，2C4，  7F3，2H11， 3E8，5B8，  7D3，SB8	Shepard et al.，1991
子宫卵巢	HMFG-2	HMFG2	Epenetos et al.，1982
				GY	HMFG-2	3.14.A3	Burchell et al.，1983

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
				B：乳腺	330-450 Kd GP	DF3	Hayes et al.，1985
	NS	NCRC-11	Ellis et al.，1984
					37kD	3C6F9	Mandeville et al.，1987
	NS	MBE6	Teramoto et al.，1982
					NS	CLNH5	Glassy et al.，1983
	47 Kd GP	MAC 40/43	Kjeldsen et al.，1986
					高gh Mr GP	EMA	Sloane et al.，1981
	高lh Mr GP	HMFG1 HFMG2	Arklie  et al.，1981
					NS	3.15.C3	Arklie et al.，1981
	NS	M3，M8，M24	Foster et al.，1982
					1(Ma)血液基团Ags	M18	Foster et al.，1984
	NS	67-D-11	Rasmussen et al.，1982
					雌激素受体	D547Sp，D75P3，H222	Kinsel et al.，1989
	EGF受体	Anti-EGF	Sainsbury et al.，1985
					层粘连蛋白受体	LR-3	Horan Hand et al.，1985
	erb B-2 p185	TA1	Gusterson et al.，1988
					NS	H59	Hendler et al.，1981

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
					126 Kd GP	10-3D-2	Soule et al.，1983
	NS	HmAB1，2	Imam et al.，1984；Schlom et al.，1985
					NS	MBR 1，2，3	Menard et al.，1983
	95 Kd	24·17·1	Thompson et al.，1983
					100 Kd	24·17·2(3E1·2)	Croghan et al.，1983
	NS	F36/22.M7/105	Croghan  et al.，1984
					24  Kd	C11，G3，H7	Adams et al.，1983
	90 Kd GP	B6·2	Colcher et al.，1981
					CEA & 180 Kd GP	B1·1	Colcher et al.，1983
	类似于Ca19-9的结肠和胰粘蛋白	Cam 17·1	Imperial Cancer Research TechnologyMAb listing
					牛奶粘蛋白核心蛋白	SM3	Imperial  Cancer Research TechnologyMab listing
	牛奶粘蛋白核心蛋白	SM4	Imperial Cancer Research TechnologyMab listing
					亲和力纯化的牛奶粘蛋白	C-Mul(566)	Imperial  Cancer Research TechnologyMab listing

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
					p185HER2	4D5   3H4，7C2， 6E9，2C4， 7F3，2H11，3E8，5B8， 7D3，5B8	Shepard et al.，1991
	CA 125＞200 Kd GP	OC 125	Kabawat  et al.，1985
					高 Mr粘蛋白/糖脂	MO v2	Miotti et al.，1985
	高 Mr粘蛋白	DU-PAN-2	Lan et al.，1984
					‘gp48’48 Kd GP	4F7/7A10	Bhattacharya  et al.，1984
	300-400 Kd GP	DF3	Kufe et al.，1984
					‘TAG-72’高 Mr粘蛋白	B72·3	Thor et al.，1986
	‘CEA’180 Kd GP	cccccCEA 11	Wagener et al.，1984
					‘PLAP’67 Kd GP	H17-E2	McDicken et al.，1985
	HMFG-2＞400 Kd GP	3·14·A3	Burchell et al.，1983
					NS	FO23C5	Riva et al.，1988
C：直肠结肠	TAG-72高 Mr粘蛋白	B72·3	Colcher et al.，1987
					GP37	(17-1A)1083-17-1A	Paul et al.，1986

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
					表面    GP	CO17-1A	LoBuglio et al.，1988
	CEA	ZCE-025	Patt et al.，1988
					CEA	AB2	Griffin et al.，1988a
	细胞表面    AG	HT-29-15	Cohn et al.，1987
					分泌的上皮	250-30.6	Leydem et al.，1986
	表面糖脂	44X14	Gallagher et al.，1986
					NS	A7	Takahashi et al.，1988
	NS	GA73·3	Munz et al.，1986
					NS	791T/36	Farrans et al.，1982
	细胞膜和细胞质Ag	28A32	Smith et al.，1987
					CEA和长春花碱酰胺	28.19.8	Corvalen，1987
	gp72	X MMCO-791	Byers et al.，1987
					高  Mr粘蛋白	DU-PAN-2	Lan et al.，1985
	高  Mr粘蛋白	ID3	Gangopadhyay et al.，1985
					CEA 180 Kd GP	CEA 11-H5	Wagener et al.，1984
	60 Kd GP	2C8/2F7	Bhattacharya et al.，1985

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
					CA-19-9(or GICA)	CA-19-9(1116NS 19-9)	Atkinson et al.，1982
	Lewis a	PR5C5	Imperial Cancer Research TechnologyMab Listing
					Lewis a	PR4D2	Imperial  Cancer Research TechnologyMab Listing
	结肠粘液	PR4D1	Imperial Cancer Research TechnologyMab Listing
				D：黑表瘤	p97a	4·1	Woodbury et al.，1980
	p97a	8·2 M17	Brown，et al.，1981a
					p97b	96·5	Brown，et al.，1981a
	p97c	118·1，133·2，(113·2)	Btown，et al.，1981a
					p97c	L1，L10，R10(R19)	Brown et al.，1981b
	p97d	I12	Brown et al.，1981b
					p97e	K5	Brown et al.，1981b
	p155	6·1	Loop et al.，1981
					GD3去唾酸神经节苷脂	R24	Dippold et al.，1980

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
					p210，p60，p250	5·1	Loop et al.，1981
	p280 p440	225.28S	Wilson et al.，1981
					GP 94，75，70  &25	465.12S	Wilson et al.，1981
	P240-P250，P450	9·2·27	Reisfeld et al.，1982
					100，77，75 Kd	F11	Chee et al.，1982
	94  Kd	376.96S	Imai et al.，1982
					4 GP链	465.12S	Imai et al.，1982；Wilson et al.，1981
	GP 74	15·75	Johnson & Reithmuller，1982
					GP 49	15·95	Johnson & Reithmuller，1982
	230 Kd	Mel-14	Carrel et al.，1982
					92 Kd	Mel-12	Carrel et al.，1982
	70 Kd	Me3-TB7	Carrel et al.，1:387，1982
					类似于9·2·27 AG的HMW MAA	225.28SD	Kantor et al.，1982
	类似于9·2·27 AG的HMW MAA	763.24TS	Kantor et al.，1982
					类似于376·96S 465·12S的GP95	705F6	Stuhlmiller et al.，1982
	GP125	436910	Saxton et al.，1982

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
					CD41	M148	Imperial  Cancer Research TechnologyMab listing
E：胃肠道	高Mr粘蛋白	ID3	Gangopadhyay et al.，1985
				胰腺，胃
胰腺，胃	高Mr粘蛋白	DU-PAN-2	Lan et al.，1985
				胰腺	NS	OV-TL3	Poels et al.，1984
胰腺，胃，食管	‘TAG-72’高Mr粘蛋白	B72·3	Thor et al.，1986
				胃	‘CEA’180 Kd GP	CEA 11-H5	Wageneret al.，1984
胰腺	HMFG-2＞400 Kd GP	3·14·A3	Burchellet al.，1983
				G·I·	NS	C COLI	Lemkin et al.，1984
胰腺，胃	CA 19-9(or GICA)	CA-19-9(1116NS 19-9)and CA50	Szymendera，1986
				胰腺	CA125 GP	OC125	Szymendera，1986

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
F：  肺	p185HER2	4D5  3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8， 7D3，SB8	Shepard et al.，1991
				非小细胞肺癌
					高Mr粘蛋白/glycolipid	MO v2	Miotti et al.，1985
		‘TAC-72’高h Mr粘蛋白	B72·3	Thor et al.，1986
					高 Mr粘蛋白	DU-PAN-2	Lan et al.，1985
		‘CEA’180 kD GP	CEA 11-H5	Wagener et al.，1984
恶性神经胶质瘤					从85HG-22细胞得到的细胞抗原	MUC 8-22	Stavrou，1990
		从85HG-63细胞，得到的细胞表面Ag	MUC 2-63	Stavrou，1990
					从85HG-39细胞得到的细胞表面Ag	MUC 2-39	Stavrou，1990

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
					从86HG-63细胞得到的细胞表面Ag	MUC 7-39	Stavrou，1990
G：混杂的	p53	PAb 240PAb 246PAb 1801	Imperial Cancer Research TechnologyMaB Listing
				小园细胞肿瘤	神经细胞粘附分子	ERIC·1	Imperial Cancer Research TechnologyMaB Listing
成神经管细胞瘤成神经细胞瘤横纹肌肉瘤		M148	Imperial  Cancer Research TechnologyMaB Listing
				成神经细胞瘤		FMH25	Imperial  Cancer Research TechrologyMaB Listing
肾癌和成胶质细胞瘤	p155	6·1	Loop et al.，1981
				膀胱和喉癌	＂Ca抗原 ＂350-390 kD	CA1	Ashall et al.，1982
成神经细胞瘤	GD2	3F8	Cheung et al.，1986
				前列腺	gp48 48 kD GP	4F7/7A10	Bhattacharya et al.，1984
前列腺	60 kD GP	2C8/2F7	Bhattacharya et al.，1985

表I续

肿瘤位点	抗原同一性/特征	单克隆抗体	参考文献
				甲状腺	‘CEA’180 kD GP	CEA 11-H5	Wagener et al.，1984

                                 表II人肿瘤细胞系和来源

ATTCHTB编号	细胞系	肿瘤型
			12345910111213141516	J82RT4ScaBERT24TCCSUP5637SK-N-MCSK-N-SHSW 1088Sw 1783U-87 MGU-118 MGU-138 MG	移形细胞癌，膀胱移形细胞癌，膀胱鳞状细胞癌，膀胱移形细胞癌，膀胱移形细胞癌，膀胱，原发IV级癌，膀胱，原发性成神经细胞瘤，眶上区的转移瘤成神经细胞瘤，到骨髓的转移瘤星形细胞瘤星形细胞瘤成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，  III级成胶质细胞瘤成胶质细胞瘤

171819202223242527303132333435363738

U-373 MGY79BT-20BT-474MCF7MDA-MB-134-VIMDA-MD-157MDA-MB-175-VIIMDA-MB-361SK-BR-3C-33AHT-3ME-180MS751SiHaJEG-3Caco-2HT-29

成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，III级成视网膜细胞瘤癌，乳腺导管癌，乳腺乳腺癌，胸膜渗出乳腺，导管瘤，胸膜渗出乳腺髓质，癌，胸膜渗出乳腺，导管癌，胸膜渗出腺癌，乳腺，到脑的转移瘤腺癌，乳腺，恶性胸膜渗出癌，子宫颈癌，子宫颈，到淋巴结的转移瘤表皮样癌，子宫颈，到网膜的转移瘤表皮样癌，子宫颈，到淋巴结的转移瘤鳞状细胞癌，子宫颈绒毛癌腺癌，结肠腺癌，结肠，  II级中度分化的

39404143444546474849525354555657

SK-CO-1HuTu 80A-253FaDuA-498A-704Caki-1Caki-2SK-NEP-1SW 839SK-HEP-1A-427Calu-1Calu-3Calu-6SK-LU-1

腺癌，结肠，腹水腺癌，十二指肠表皮样癌，颌下腺鳞状细胞癌，咽部癌，肾腺癌，肾透明细胞癌，与肾原发性一致，到皮肤的转移瘤透明细胞癌，与原发性肾一致肾胚性癌肉瘤，胸膜渗出腺癌，肾腺癌，肝，腹水癌，肺III级表皮样癌，肝，转移到胸膜的转移瘤腺瘤，肺，胸膜渗出未分化癌，可能在肺腺癌，与不太分化的III级一致的肺

5859606162636466676869707172737576

SK-MES-1Sw 900EB1EB2P3HR-1HT-144Malme-3MRPMI-7951SK-MEL-1SK-MEL-2SK-MEL-3SK-MEL-5SK-MEL-24SK-MEL-28SK-MEL-31Caov-3Caov-4

鳞状癌，肺，胸膜渗出鳞状细胞癌，肺伯基特淋巴瘤，上额骨上伯基特淋巴瘤，卵巢伯基特淋巴瘤，腹水恶性黑素瘤，转移到皮下的转移瘤恶性黑素瘤，转移到肺的转移瘤恶性黑素瘤，转移到淋巴结的转移瘤恶性黑素瘤，转移到淋巴系统的转移瘤恶性黑素瘤，转移到大腿皮肤的转移瘤恶性黑素瘤，转移到淋巴结的转移瘤恶性黑素瘤，转移到腋结的转移瘤恶性黑素瘤，转移到结的转移瘤恶性黑素瘤恶性黑素瘤腺癌，卵巢，与原发性一致腺癌，卵巢，到输卵管浆膜下层的转移瘤

7778798081828586889192939496102103104105

SK-OV-3SW 626Capan-1Capan-2DU 145A-204Saos-2SK-ES-1SK-LMS-1SW 684SW 872SW 982SW 1353U-2 OSMalme-3KATO IIICate-1BTera-1

腺癌，卵巢，恶性腹水腺癌，卵巢腺癌，胰腺，到肝的转移瘤腺癌，胰腺癌，前列腺，转移到脑横纹肌肉瘤骨原性内瘤，原发性退行发育骨肉瘤对肉瘤，骨平滑肌肉瘤，外阴，原发性纤维肉瘤脂肉瘤腋窝滑膜肉瘤软骨肉瘤，肱骨骨原性肉瘤，骨原发性皮肤成纤维细胞瘤胃癌胚癌，睾丸，转移到淋巴结的转移瘤胚癌，恶性，与转移到肺一致

106107111112113114115117118119120121122123124125

Tera-2Sw 579AN3 CAHEC-1-AHEC-1-BSK-UT-1SK-UT-1BSW 954SW 962NCI-H69NCI-H128BT-483BT-549DU4475HBL-100Hs 578 Bst

胚癌，恶性，与转移到肺一致甲状腺癌子宫内腺癌，转移瘤子宫内腺癌子宫内腺腺癌子宫，混合的中层肿瘤，与III级平滑肌肉瘤一致子宫，混合的中层肿瘤，与III级平滑肌肉瘤一致鳞状细胞癌，外阴癌，外阴，在淋巴结转移瘤小细胞癌，肺小细胞癌，肺导管癌，乳腺导管癌，乳腺转移皮肤瘤，乳腺癌乳腺乳腺，正常

126127128129130131132133134135137138140142144146147148

Hs 578TMDA-MB-330MDa-MB-415MDA-MB-435SMDA-MB-436MDA-MB-453MDA-MB-468T-47DHs 766THs 746THs 695THs 683Hs 294THs 602JARHs 445Hs 700TH4

导管癌，乳腺癌，乳腺腺癌，乳腺导管癌，乳腺腺癌，乳腺癌，乳腺腺癌，乳腺导管癌，胸膜渗出癌，胰腺，转移到淋巴结癌，胃，转移到左腿无黑色素黑素瘤，转移到淋巴结神经胶质瘤黑素瘤，转移到淋巴结淋巴瘤绒膜癌，胎盘淋巴样，Hodgkin’s病腺癌，转移到肾盂神经胶质瘤，脑

151152153157158160161163166168169171172173174175176177

Hs 696Hs 913THs 729FHS 738LuFHS 173WeFHS 738B1NIH：OVCAR-3Hs 67RD-ESChaGo K-1WERI-Rb-1NCI-H446NCI-H209NCI-H146NCI-H441NCI-H82H9NCI-H460

原发性腺癌，未知，到骶骨的转移瘤纤维肉瘤，到肺的转移瘤横纹肌肉瘤，左腿肺，正常胎水全胚胎，正常的膀胱，正常胎儿卵巢，腺癌胸腺，正常Ewing氏肉瘤支气管癌皮下转移瘤，人成视网膜细胞瘤小细胞癌，肺小细胞癌，肺小细胞癌，肺乳头状腺癌，肺小细胞癌，肺T细胞淋巴瘤大细胞癌，肺

178179180181182183184185186187188189

NCI-H596NCI-H676BNCI-H345NCI-H820NCI-H520NCI-H661NCI-H510AD283 MedDaoyD341 MedAML-193MV4-11

腺鳞状癌，肺腺癌，肺小细胞癌，肺乳头状腺癌，肺鳞状细胞癌，肺大细胞癌，肺小细胞瘤，肺动脉外源，转移瘤成神经管细胞瘤成神经管细胞瘤成神经管细胞瘤急性单核细胞白血病白血病双表型

缩写：Abs，抗体；Ags，抗原；EGF，表皮生长因子；GI，胃肠；GICA，胃肠相关的抗原；GP，糖蛋白；GY，妇科学；HMFG，人牛奶脂肪小球；Kd，千道尔顿；Mabs，单克隆抗体；M_r，分子量，NS，未说明；PLAP，胎盘碱性磷酸酶；TAG，肿瘤相关糖蛋白；CEA，癌胚抗原。脚注：CA19-9Ag(GICA)是sialosylfucosyllactotetraosylceramide，也称为涎酸基化和Lewis五糖基神经酰胺或涎酸基化的乳-N-fuco五糖II；认为p97 Ags是硫酸软骨素蛋白多糖；认为有9.2.27反应性的抗原是与硫酸软骨素蛋白多糖相关的涎酸基化的糖蛋白；除非说明，GY可以包括子宫颈癌，子宫颈内膜癌，子宫内膜癌，输卵管癌，卵巢癌，阴道癌或混合的缪氏肿瘤；除非说明GI可包括肝癌，小肠癌，脾癌，胰腺癌，胃癌和食管癌。(a)抗肿瘤细胞抗体

识别肿瘤抗原靶的直接方法是用对特定抗原有结合亲和性的抗体。直接抗固体肿瘤抗原的许多抗体是已知的。在表I中列出了特定的有用的抗肿瘤抗体。然而，由于本领域专业人员熟知，在表I中所列的一些抗体没有适宜的生物化学特性或不可能有足够的肿瘤特异性以用于治疗。一个实例是识别胞质抗原的MUC8-22。这些抗体通常只用在研究性实施方案中，如在模型系统或筛选试验中。

一般来说，用于本发明这些方面的抗体优选可识别易进入细胞表面并由肿瘤细胞优先或特异性表达的抗原。所述抗体优先表现出高亲和性，如K_d为＜200nM，优选＜100nM，而与保持生命的正常组织，如心，肾，脑，肝，骨髓，结肠，乳腺，前列腺，甲状腺，膀胱，肺，肾上腺，肌肉，神经纤维，胰腺，皮肤或其他保持生命的器官或人体组织中的一种或多种没有明显的反应性。“保持生命的”组织从低反应性的角度看，对于本发明目的是最重要的，其包括心，肾，中枢神经或外周神经系统组织以及肝。本文所用的术语“显著反应性”指当在适宜免疫组织化学的条件下，用于特定组织时，抗体或抗体片段不染色或只与少数分布于大部分阴性细胞区中阳性细胞产生可忽略的染色。

用于本发明的表I中的特定有潜力的抗体是对固体肿瘤有高度选择性的那些。例如，与在许多乳腺，肺和结肠直肠癌表面上选择性发现的TAG72和HER-2原致癌基因蛋白质结合的抗体(Thor et al.，1986；Colcher etal.，1987；shepard et al.，1991)；Mov18，OV-TL3和与牛奶蛋白核心蛋白和人奶脂肪小体结合的抗体(Miotti et al.1985；Burchell et al.，1983)；以及与高M1黑素瘤抗原结合的抗体9.2.27(Reisfeld et al.，1982)。其他有用的抗体是抗叶酸结合蛋白质(已知在几乎所有卵巢癌中同源表达的)抗体；抗在鳞状细胞癌和大部分神经胶瘤中过表达的癌基因的erb家族；以及正在进行临床前和临床评估的抗体。

在现有技术常规实施的标准临床前试验后，认为B3，KSI/4，CC49，260F9，XMMCO-791，D612和SM3适用于临床实施方案。B3(美国专利5242813；Brinkmann et al.，1991)的ATCC登记号为HB10573；KSI/4可以按美国专利4975369制备；D612(美国专利5183756)的ATCC登记号为HB9796。

定义肿瘤相关靶的另一种方法是以肿瘤细胞的特征而言，而不是描述细胞表达的抗原的生物化学特性。因此，本发明人设想可以用与在表II中所列的肿瘤细胞优先结合的任何抗体作为双特异性配体的击靶组分。如上定义，优先的肿瘤细胞结合又以对肿瘤细胞表现出高度亲和性而与保持生命正常细胞或组织没有显著反应性的抗体为基础。

因此本发明提供了生产抗体的数种方法，所述抗体用于本文描述的击靶凝血方法。为了生产肿瘤细胞特异性抗体，人们用含肿瘤抗原的组合物(下文将更详细地描述)免疫动物，用适宜的特异性选择所得的抗体。免疫组合物可含有纯化的，或部分纯化的表I中的任何抗原制品；组合物，如膜制品，用于富集表I中的任何抗原；在表II中所列的任何细胞；或包括表II中所列的任何类型细胞的细胞混合物或种群。

当然，不考虑抗体来源，在本发明的人的治疗中，人们宁愿预先确保临床击靶的肿瘤表达最终所选的抗原。这是通过利用相当直接的检测方法，包括抗原检测肿瘤组织样品，如外科活检，或可能检测正在循环中的脱落抗原而达到的。用免疫学筛选试验如ELISA(酶联免疫吸附试验)很容易完成，其中要检测来自杂交瘤“库”的抗体结合亲和性对抗肿瘤的反应性。然后选用有适宜肿瘤选择性和亲和性的抗体制备本发明的双特异性抗体。

由于熟知的交叉反应现象，认为有用的抗体可以归因于免疫方法，除其中源抗原是从人细胞中得到的外，其中最初施用的抗原来自动物，如小鼠或灵长类。若用人源抗原，则可以从人肿瘤细胞系中得到它们，或通过从特定患者的生物学样品中得到而制备。的确，用于发展对患者肿瘤是“常规剪切的”的抗体的方法是熟知的(Stevenson et al.，1990)，而且，认为它们丁与本发明结合使用。(b)其他的肿瘤细胞靶和结合配体

除使用抗体外，还可以使用通过与肿瘤细胞抗原结合而将凝血剂载运到达肿瘤位点的其他配体。对于是过表达受体(雌酮受体，EGF受体)或突变体受体而言，可以用相应的配体作为击靶剂。

在内皮细胞受体配体类似的方式中，可以是与肿瘤细胞特异性或优先结合的组分。例如若肿瘤抗原是过表达的受体，则可以用特异性配体体内包被肿瘤细胞。然后用抗配体的抗体或用受体自身的形式靶向配体。这些击靶剂的具体实例是抗TIE-1或TIE-2配体的抗体，抗血小板因子4的抗体，以及白细胞粘附结合蛋白。2其他疾病靶

在其他实施方案中，第一结合区可以是与靶分子结合的组分，所述靶分子在疾病位点而不是肿瘤位点特异性或优先表达。

与其他疾病细胞相关的举证性靶分子包括，例如，与牛皮癣有关的白细胞粘附分子；与增生性糖尿病视网膜病有关的FGF；与各种疾病的活化内皮有关的血小板因子4；和与血管增生性疾病有关的VEGF。认为患有上述疾病之一的动物或患者可以从在疾病位点的特异性诱导的凝血中得到益处。

已知如Klagsburn & Folkman(1990)所述，用本文所述的双特异性配体还可以治疗普通的血管依赖性病理学的疾病。具体地说，血管内皮细胞靶向配体或基质靶向的配体可用于达到在疾病位点的凝血。目前尤其包括治疗BPH，糖尿病视网膜病，血管再狭窄，血管粘附，AVM，脑膜瘤，血管瘤，新血管青光眼，类风湿性关节炎和牛皮癣。3疾病相关的脉管系统细胞靶

脉管系统的细胞可用作本发明的靶。在这些情况下，双特异性配体的一个结合区能够与易接近的标记物结合，所述标记物是由疾病相关的脉管系统内皮细胞优先表达的。由于脉管内皮细胞靠近疾病区和局部异常生理过程的产物，所以有可能检测脉管标记物。例如，将肿瘤脉管内皮细胞暴露于改变了内皮细胞表型的肿瘤细胞和肿瘤衍生的产物。

已知肿瘤细胞可产生肿瘤衍生的产物，如淋巴因子，单核细胞因子，集落刺激因子，生长因子和血管生成因子，它们作用于附近的脉管内皮细胞(Kandel et al.，1991；Folkman，1985a，b)和细胞因子(Burrows etal.，1991；Ruco et al.，1990；Bordenet al.，1990)。肿瘤产物结合内皮细胞并选择性地诱导特定分子的表达。这就是这些诱导的分子，用由本发明的特定方面提供的肿瘤内皮特异性促凝剂传递可以靶向它们。在肿瘤中，脉管内皮细胞以远大于在各种正常组织30倍的速率增殖(Denekamp etal.，1982)，表明与增殖有关的决定基也可以作为肿瘤脉管内皮细胞的标记物。

在本发明的特定实施方案中，双特异性配体的击靶组分是对肿瘤脉管系统有相对高度的特异性的组分。可将这些击靶组分定义为与在肿瘤内皮中表达，但在正常内皮细胞表面很少或不表达的分子结合的组分。用免疫染色组织切片的标准方法可以评估所述特异性，而所述方法对本领域专业人员来说是常规的。

然而，如上所述，本发明的一个优点是对选择性的要求不如现有技术，特别是用免疫毒素的那些方法中所需的严格，原因是与因毒素的错击靶而产生的结果相比，凝血剂错击靶有关的副作用是最小的。

因此，通常认为用本发明的双特异性配体或抗体击靶的分子是以比在正常内皮细胞上高的水平并在肿瘤脉管系统表达的分子。(a)在疾病中的脉管内皮细胞标记物

本文将已知在疾病位点或环境中的脉管内皮细胞表面上优先表达的分子称为“天然疾病相关的脉管内皮细胞标记物”。用该术语是为了简单地说明在疾病中表达的内皮细胞组分，所述疾病是与增加的或不适宜的血管生成或内皮细胞增殖有关。一个具体的实例是肿瘤内皮细胞组分，它们是应答肿瘤衍生的因子而在原位表达的。还将这些组分称为“天然诱导的肿瘤内皮细胞标记”。

在肿瘤脉管系统内或上均可浓缩VEGF/VPF(脉管内皮生长因子/脉管渗透性因子)和FGF家族的组分。因此相应的受体为攻击肿瘤脉管系统提供了潜在的靶。例如，已知VEGF受体在肿瘤内皮细胞上向上调节，而在正常组织的内皮细胞中相反，在啮齿类和人中均是如此(Thieme etal.1995)。这可能是氧不足(肿瘤微环境的特征)的结果(Leith etla.，1992)。在暴露于氧不足的内皮细胞上的FGF受体向上调节3倍，因此认为在肿瘤中向上调节(Bicknell and Harris et al.，1992)。

在正在分裂的细胞上TGFβ(转化生长因子β)受体(endoglin)在内皮细胞上向上调节，并提供了另一个靶。本发明人之一发现endoglin在培养中，在激活的和正在分裂的HUVEC上向上调节，并在新血管形成的内皮细胞上的人组织，包括广泛的固体肿瘤和胎儿胎盘上被强表达。相反，在大多数各种非恶性成年组织的内皮细胞中很少或没有endoglin。重要的是，认为endoglin表达与乳腺中的肿瘤进展相关，如由良性纤维腺瘤和结合低水平TEC-4和TEC-11抗体的早期癌，和结合高水平这些抗体的导管内癌和侵染性癌所表明的。

其他天然疾病相关的脉管内皮细胞标记物包括TIE，VCAM-1，P-选择蛋白，E-S-选择蛋白，α_vβ₃整合蛋白，多效蛋白和内皮唾酸蛋白，用本发明可以靶中其中的每一个。(b)细胞因子诱导的脉管内皮细胞标记物

由于疾病过程的性质，经常是导致体内局部功能失调，可用方法来控制疾病位点，而使其他组织相对不受影响。这在恶性和良性肿瘤是特别理想的，它们存在于动物的不同部位。例如，可以操作肿瘤环境以产生肿瘤脉管内皮细胞特异性的其他标记物。这些方法通常是模拟在固体肿瘤中天然发生的那些，而且还包括局部产生的信号剂，如生长因子或细胞因子，它们在靠近脉管内皮细胞的表面特异性地诱导特定分子的表达。

本文将在疾病或肿瘤环境脉管内皮细胞表面人工诱导表达的一组分子称为“可诱导的内皮细胞标记物”，或特异性地诱导的肿瘤内皮细胞标记物。该术语指人工诱导的，即作为人手工操作的结果而诱导的那些标记物，而不是作为动物中疾病或肿瘤发展过程的部分而诱导的那些。如上述所定义的，选择术语“可诱导的标记物”在本发明申请文章中是为了简单说明，尽管“天然标记物”也是被如肿瘤衍生的试剂诱导的。

因此，尽管不需要实施本发明，但用于选择性引发疾病相关脉管系统表面上的脉管内皮细胞抗原靶的技术也是可以得到的，如果需要，可以与本发明相结合。这些技术包括操作抗原表达或细胞表面呈现以便在疾病相关的脉管系统表面表达或可提供靶抗原，而所述抗原在正常内皮的表面上是不表达或不易接近或不能结合或至少在较低的程度上是如此。

用肿瘤衍生的细胞因子(Burrows et al.，1991；/Ruco et al.，1990)和血管生成因子(Mignatti et al.，1991)可诱导肿瘤内皮标记物。在肿瘤内皮中可被特异性地诱导，然后用本发明提供的双特异性凝血配体击靶的细胞表面标记物的实例包括在表II中所列的那些(Bevilacqua etal.，1987；Dustin et al.，1986；Oxborn et al.，1989；Collins et al.，1984)。

在表III中还说明了诱导所述标记物的机制；诱导或“中间产物细胞因子”，如IL-1和IFN-γ；以及白细胞类型和相关的细胞因子激活的分子，其击靶将会导致细胞因子的释放。在特异性标记的诱导中，通常需要双特异性的“细胞因子诱导的”或“抗原诱导的”抗体。所述抗体选择性地诱导在肿瘤局部释放适宜的细胞因子，因此可选择性地诱导由脉管内皮细胞表达的所需靶抗原。肿瘤和细胞因子产生的白细胞的双特异性抗体交联细胞由此激活白细胞以释放细胞因子。

制备并使用如这些的双特异性抗体部分是基于以前已经表明的识别CD3，CD14和CD16以及CD28的交联抗体在与第二抗原交联后引发选择性地产生细胞因子这一事实(Qian et al.，1991)。在本发明的文章中，由于只成功地激活了肿瘤细胞交联的白细胞来释放细胞因子，所以将细胞因子的释放限于肿瘤局部。因此将所需标记，如S-选择蛋白的表达相似地限于肿瘤脉管系统的内皮。

                                            表III

                                       可能诱导的血管靶

可诱导的内皮细胞分子	首字母缩写	亚型/别名(分子家族)	诱导细胞因子	生产那些细胞因子的白细胞	当用单克隆抗体激活细胞生产细胞因子时的白细胞分子
						内皮白细胞粘附分子	ELAM-1E-选择素	＂(选择素)	IL-1，TNF-α，(TNF-β)细菌内毒素	单核细胞	CD14
巨噬细胞	CD14
		肥大细胞	FcR for IgE
脉管细胞粘附分子	VCAM-1			可诱导细胞粘附分子(免疫球蛋白家族)	细菌内毒素IL-1，TNF-α					单核细胞	CD14
		巨噬细胞	CD14
						肥大细胞	IgE的FcR
		TNF-β，IL-4	辅助细胞					CD2，CD3，CD28
					TNF	细胞	IgG(CD16)的FcR

表III续

可诱导的内皮细胞分子	首字母缩写	亚型/别名(分子家族)	诱导细胞因子	生产那些细胞因子的白细胞	当用单克隆抗体激活细胞生产细胞因子时的白细胞分子
						细胞间粘附分子-1	ICAM-1	＂(免疫球蛋白家族)	IL-1，TNF-α，(细菌内毒素)	单核细胞	CD14
巨噬细胞	CD15
		肥大细胞	FcR for IgE
TNF-β，IFNy	T辅助细胞			CD2，CD3，CD28
		NK细胞	FcR for lgG(CD16)
	脉管细胞粘附分子			LAM-1剂	MEL-14剂(小鼠)				II-1，TNF-α(细菌内毒素)	单核细胞	CD14
巨噬细胞		CD14
			肥大细胞			IgE的FcR
主要组织相容性复合物II抗原		MHC II型					HLA-DRHLA-DP    ·人HLA-DQI-A    ·小鼠I-E	IFN-y		T辅助细胞	CD2，CD3，CD28
	细胞		IgG的FcR(CD16)

重要的是要注意到，从表III所列的可能诱导的标记中，E-选择蛋白和MHC II型抗原，如HLA-DR和HLA-DQ(Collins et al.，1984)到目前为止在临床实施方案方面是最优选的靶。表III的其他粘附分子在正常组织，通常在淋巴样器官和内皮上中似乎有不同程度的表达，用其击靶可能只适宜在动物模型中或在可以抑制其在正常组织上的表达而不会有显著副作用的情况。击靶E-选择蛋白和MHC II型抗原是优选的，这是由于在肿瘤相关的内皮中，其可最直接地选择性地促进这些抗原的表达。E  选择蛋白(选择蛋白)

靶向在正常内皮表面上不表达的抗原是最直接的诱导方法。E-选择蛋白是一种粘附分子，其在正常内皮脉管系统或其他人细胞中不表达，但通过细胞因子如IL-1，TNF，淋巴毒素和细菌内毒素的作用(Bevilacqua et al.，1987)可在内皮细胞表面上诱导(Cotran etal.，1986)。它不被IEN-γ的诱导。因此通过选择性地传递所述细胞因子，或通过使用在肿瘤环境中引起选择性释放所述细胞因子的组合物，可以在肿瘤内皮中选择性地诱导E-选择蛋白的表达。

双特异性抗体是能够在肿瘤位点，而不在体内的其他位点引起选择性释放一种或多种前述或其他适宜细胞因子的组合物的一个实例。本文将所述双特异性抗体称为“抗原-诱导的抗体”，当然有别于本发明的有击靶和凝血组分的任何双特异性抗体。设计抗原-诱导的抗体来将细胞因子效应细胞，如单核细胞/巨噬细胞谱系，T细胞和/或NK细胞或肥大细胞与被靶向的固体肿瘤的肿瘤细胞交联。然后所述交联会使定位的细胞因子释放到交联位点，即肿瘤中。

有效的抗原-诱导的抗体一方面识别肿瘤细胞表面的抗原(如在表I中所类的那些)，而另一方面又识别在所选的白细胞表面上的“细胞因子激活的”抗原。术语“细胞因子激活的”抗原指当通过效应分子，如抗体或其片段或其天然试剂或合成的类似物结合时，在白细胞表面上各种已知分子中的任何一种，它在另一种细胞上是可溶的因子或膜结合的配对受体，且促进白细胞释放细胞因子。细胞因子激活的分子的实例包括CD14(LPS受体)和IgE的FcR，它激活IL-1和TNFα的释放；CD16，CD2或CD3或CD28分别激活IFNγ和TNFβ的释放。

一旦导入到患肿瘤的动物血液中，所述抗原一结合的双特异性抗体将与肿瘤内的肿瘤细胞结合，将那些肿瘤细胞与渗入肿瘤的效应细胞，如单核细胞/巨噬细胞交联，此后影响肿瘤内细胞因子的选择性释放。然而重要的是，不交联肿瘤和白细胞，抗原-结合的抗体就不影响细胞因子的释放。因此，在除肿瘤以外的体内部分，就没有细胞因子的释放，因此，只在肿瘤内皮表达细胞因子诱导的分子，如E-选择蛋白。

大量有用的“细胞因子激活的”抗原是已知的，当与适宜的双特异性抗体交联时，会导致交联的白细胞释放细胞因子。通常用于该目的的优选的靶是CD14，它在单核细胞和巨噬细胞的表面上。当CD14被交联后，它刺激单核细胞/巨噬细胞释放IL-1(Schutt et al.，1988；Chem etal.，1990)，和其他可能的细胞因子，这些细胞因子反过来刺激E-选择蛋白出现在附近的脉管系统上。与E-选择蛋白诱导和击靶交联的其他可能的靶包括用于IgE的FcR，其在肥大细胞上发现的；用于IgG(CD16)的FcR，其在NK细胞上发现的；以及CD2，CD3或CD28，其在T细胞表面发现的。在这些中，由于与其他类型的白细胞相比，固体肿瘤的单核细胞/巨噬细胞渗入相对普遍，所以CD14通常是优选的。

在举证性的诱导实施方案中，可将双特异性(Fab’-Fab’)抗-CD14/抗肿瘤抗体(如抗-CEA，抗高Mr黑素瘤抗原OV-TL3的9.2.27抗体或抗卵巢相关抗原的Mov 18抗体)注射到动物的肿瘤上。利用其肿瘤结合活性，抗体定位在肿瘤中，然后通过交联其CD14抗原而激活肿瘤中的单核细胞或巨噬细胞(schutt et al.，1988；Chen et al.，1990)。被激活的单核细胞/巨噬细胞有杀肿瘤活性(Palleroni et al.，1991)并释放IL-1和丁NF，然后迅速诱导在肿瘤脉管内皮细胞上的E-选择蛋白抗原(Bevilacqua et al.，1987；Pober et al.，1991)。MHCII型抗原

设想用于本发明的第二组优选的可诱导标记物是MHC II型抗原(Collins et al.，1984)，包括HLA-DP和HLA-DQ。II型抗原在包括人的数种动物大多数正常组织中的脉管内皮细胞上均表达。体外研究(Collins et al.，1984；Daar et al.，1984；O’Connell et al.，1990)和体内研究(Groenewegen et al.，1985)已经表明脉管内皮细胞表达II型抗原需要连续存在由TH1细胞，至少由NK细胞和CD8⁺T细胞加工的IFN-γ。

MHC II型抗原对脉管内皮细胞不是特有的，其还可在B细胞上，激活T细胞，单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，及特定的内皮细胞上构成性地表达，均是在小鼠(Hammerling，1976)和人中(Daar et al.，1984)。由于MHCII型抗原在“正常”内皮上表达，所以其击靶不象E-选择蛋白那样直接。然而，利用与免疫抑制剂，如环孢菌素A(CsA)结合，有可能诱导并靶向MHC II型抗原，所述免疫抑制剂可有效抑制II型抗原在正常组织中的表达(Groenewegen et al.，1985)。CsA通过防止激活T细胞和NK细胞来发挥作用(Groenewegen et al.，1985；DeFranco 1991)，由此降低IFN-γ的基础浓度，所述浓度低于在内皮上保持II型抗原表达所需的浓度。

其他各种与CsA相关的环孢菌素，包括环孢菌素A，B，C，D，G等，它们也有免疫抑制作用，并表明了抑制II型表达的能力。其他相似有用的试剂包括FK506和钠巴霉素。

因此，诱导并击靶MHC II型的实施方案要求用一定剂量的有效抑制II型表达的CsA和其他免疫抑制剂预处理患肿瘤的动物。在CsA的情况下，所述剂量通常是约10-约30mg/kg体重。一旦在正常组织中受到抑制后，就可以通过使用双特异性抗体在肿瘤内皮中选择性地诱导II型抗原。

在这种情况下，抗原-诱导双特异性抗体对肿瘤细胞标记物和在效应细胞表面发现的活化抗原有特异性，所述效应细胞能够诱导IFN-γ生产。所述效应细胞通常是辅助T细胞(T_H)或自然杀伤细胞(NK)。在这些实施方案中，如果使用CD16，T细胞或NK细胞必需存在于肿瘤中以产生细胞因子中间产物，即用IFN-γ达到II型抗原表达的目的，而用其他细胞因子不能达到所述目的。因此，为了实施本发明的该方面，人们要选择CD2，CD3，CD28，最优选CD28作为用于通过抗原-诱导的双特异性抗体击靶的细胞因子激活抗原。

应在肿瘤中激活的T细胞是与脉管系统相邻的那些，由于这是最易接近细胞的区域，而且在此将能够最好地浓缩双特异性抗体。然后激活的T细胞将分泌IFN-γ，其可诱导在相邻的肿瘤脉管系统上的II抗原。

目前使用有一个指向肿瘤抗原的臂，而另一臂指向CD28的双特异性抗体(Fab’-Fab’)是优选的。当与第二信号(由例如IL-1提供的，IL-1均是由肿瘤细胞分泌的，(Burrows et al.，1991；Ruco et al.，1990))结合时，所述抗体将在肿瘤T细胞上交联CD28抗原，并已表明通过CA²⁺非依赖性的非CsA可抑制途径激活了T细胞(Hess et al.，1991；June etal.，1987；Bjorndahl et al.，1989)。

制备抗各种细胞因子激活分子的抗体是本领域熟知的。例如现已由数个实验室描述了如何制备和使用具有经白细胞诱导生产细胞因子之能力的抗-CD14和抗-CD28单克隆抗体(分别见Schutt et al.，1988；Chen etal.，1990，和June et al.，1990，的综述)。此外，通过其他机制和其他激活抗原制备刺激白细胞释放细胞因子的抗体也是熟知的(Clark etal.，1986；Geppert et al.，1990)。

在其他实施方案中，本发明人设想了另一种抑制II型分子表达，而选择性引发II型分子在肿瘤局部表达的方法。该方法不使用CsA和双特异性激活的抗体，优点是通过利用如抗-CD4抗体，通过T细胞抑制IFN-γ生产从而有效抑制II型分子的表达(Street et al.，1989)。利用所述实施方案，通过施用抗-CD4而抑制IFN-γ生产，从而主要抑制II型表达。用例如只在肿瘤内可激活的肿瘤特异性T细胞，只在肿瘤位点中诱导II型。

在该治疗方式中，人们通常用一定剂量的抗CD-4预处理动物或人患者，所述剂量可以有效抑制IFN-γ生产并由此抑制II型分子的表达。有效剂量是例如，约4-约10mg/kg体重。在抑制了II型表达后，然后人们将制备生产IFN-γ的T细胞克隆(如T_h1或细胞毒T淋巴细胞，CTL)并将其导入到血流中，所述T细胞克隆对肿瘤细胞表面表达的抗原有特异性。这些T细胞定位于肿瘤中，由于其抗原的识别能力，在所述识别后，将释放IFN-γ。用这种方法，将细胞因子的释放限于肿瘤内，因此将II型分子表达限于肿瘤脉管系统。

从外周血可以得到生产IFN-γ的T细胞(Mazzocchi et al.，1990)然而，优选的来源是肿瘤内(Fox et al.，1990)。目前制备所述T细胞克隆的优选方法是从患者体内取出部分肿瘤；若需要的话，用胶原蛋白酶消化，来分离细胞；用密度梯度离心富集渗入肿瘤的白细胞，然后，通过例如用特异性抗体和组分处理去掉其他白细胞亚组；然后在体外扩增渗入肿瘤的白细胞以提供生产IFN-γ的克隆。所述克隆必需与患者是免疫相容的，因此可以使患者很好地耐受。

通过每14天确定每个克隆的细胞因子分泌模式，然后再从扩增的白细胞中筛选生产高IFN-γ的T细胞克隆，会达到更特别的益处。到此为止，以引起细胞间接分裂或抗原性的方式将剩余的克隆刺激24小时，用例如特异性的夹层ELISA技术检测其培养上清液(Cherwinski et al.，1989)是否存在IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5和IL-10。选择分泌高水平IL-2和IFN-γ的克隆，它们是T_H1克隆的特征细胞因子分泌模式。用增殖试验确定肿瘤特异性。

此外，人们更愿用抗-CD4抗体和抗-CD4 Fab，因为在注射后24小时，它们就可从体内消除，因此不会抑制随后施用的识别肿瘤的T细胞克隆。有肿瘤特异性的T细胞克隆的制备方法通常是本领域熟知的，如通过生产并表征来自淋巴细胞渗入固体黑素瘤肿瘤的T细胞克隆来说明(Maeda et al.1991)。

可使用任一种MHC II型抑制-诱导方法，其他的益处可能是归因于静脉内注射的抗II型抗体不会到达除肝和脾外的正常器官中的内皮细胞或单核细胞/巨噬细胞。这可能是因为在大多数正常组织器官中的脉管内皮是紧密的，而不象肝和脾中的是有小孔的，因此抗体必须通过基膜扩散到Il型阳性细胞中。另外，例如在交联后，任何B细胞减少均可能产生，但这不大可能成为显著的问题，因为这些细胞可以从II型阴性祖代再补充(Lowe et al.，1986)。甚至B细胞被杀死，如在B淋巴瘤患者中发生的，也不会产生明显的害处(Vieteea et al.，1991)。

总之，尽管本发明的肿瘤凝血组合物和抗体很简单，而且不需要为其操作性而导入抗原，但还是设想将抗原-诱导的双特异性抗体与本发明结合使用。通常在本发明的双特异性凝血配体之前施用所述抗体。

总的来说，越是“致免疫的”肿瘤，越适宜于MHC II型方法，所述方法包括例如，通过抗-CD28/抗肿瘤双特异性抗体交联在肿瘤中的T细胞，因为这些肿瘤更有可能是被T细胞渗入的，而这是该方法有效的前提。致免疫固体肿瘤的实例包括肾癌，黑素瘤，少数乳腺和结肠癌，以及可能还有胰腺，胃，肝，肺和神经胶质肿瘤癌。将这些肿瘤称为“致免疫的”是因为，有迹象表明，它们在宿主中可引出免疫反应，而且已经发现它们适合于细胞免疫治疗(Yamaue et al.，1990)。在黑素瘤和大肠癌的情况下，用于这方面最优选的抗体是B72.3(抗-TAG-72)和PRSC5/PR4C2(抗-Lewis a)或9.2.27(抗高Mr黑素瘤抗原)。

对于所有来源的大多数固体肿瘤来说，使用巨噬细胞/单核细胞中间产物的抗-CD4方法都是更适宜的。这是因为，大多数肿瘤在巨噬细胞中富集。巨噬细胞富集的肿瘤的实例包括大多数乳腺癌，结肠癌和肺癌。用于这些方面的优选的抗肿瘤抗体是抗-HER-2，B72.3，SM-3，HMFG-2和SWA11(Smith et al.，1989)。(c)促凝剂可诱导的标记物

促凝剂，如凝血酶，IX/IXa因子，X/Xa因子，纤维蛋白溶酶和金属蛋白酶，如间质胶原蛋白酶，基质溶素和明胶酶也可诱导特定的标记物。具体地说，凝血酶可诱导E-选择蛋白，P-选择蛋白，PDGF和ICAM-1(Sugama et al，1992；shankar et al.，1994)。

因此，为了进行所述诱导，将使用抗促凝剂/抗肿瘤双特异性抗体。将抗体经其肿瘤结合活性而定位在肿瘤中。然后在肿瘤中浓缩促凝剂，如凝血酶，从而在肿瘤脉管内皮细胞上诱导E-选择蛋白和P-选择蛋白(Sugama et al，1992；shankar et al.，1994)。

另外，用截断的组织因子靶向肿瘤细胞或内皮也会在肿瘤内诱发凝血酶沉积。随着凝血酶的沉积，将在肿瘤脉管内皮细胞上诱导E-选择蛋白和P-选择蛋白。(d)脉管内皮细胞标记物的抗体

识别疾病相关的脉管系统靶的直接方法，不论是在天然环境中诱导的，还是人工方法诱导的，均是利用对特定细胞表面受体，分子或抗原有结合亲和性的抗体。这些抗体包括抗所有已知存在于例如肿瘤脉管内皮细胞上的细胞表面组分的抗体，在应答肿瘤衍生的因子中被诱导或过分表达的抗体，以及人工操作后诱导的抗体。表IV和表V总结了有用的抗体和其特性。

                                         表IV

                   含抗人肿瘤脉管系统抗体的脉管系统染色图的总结

抗体	抗原	参考文献	染色的肿瘤类型	染色的肿瘤血管	正常血管反应性
						抗i-vWF	VIII R Ag		100	100	在所有的上均强
FB5	骨肉瘤相关的抗原蛋白	Rettig & old	30	10-20	淋巴样器官
						TP3	80 kDa异构体	Bruland	50	10-30	在小BV上强
BC-1	纤维蛋白连接素	Zardi	60	10-30	无
						TV-1	纤维蛋白连接素	Epstein	100	100	在所有的上均强
LM 609	αvβe受体	Cheneoh	85	70-80	在所有上培养
						TEC 11	endoglin	Thorpe；	100	100	在大部分上弱
TEC 110	VEGF	Thorpe；	100	100	在大部分上弱

                                            表V

                                抗EC mAbs在人肿瘤上的比较

肿瘤类型	n	TEC 110	TEC 11	FB-5	TP-3	BC-1	TV-1	LM 609
									消化胃肠腮腺	93	++++	++++	+---	++++(SMALL)	+-	++ND	++ND
生殖乳卵巢子宫	142	+++++	++++++	---	ND++(SMALL)	++++++	++++++	-++
									呼吸肺	3	++	++	+	ND	++	++	+
淋巴Hodgkins	2	++	++	-	+	-	+-++	+

在本发明中可以使用的另两种抗体是由Rettig等人(1992)和Wang等人(1993)描述的未知功能的不相关抗原的抗体，所述抗原在人肿瘤脉管系统中而不在大多数正常组织中表达。

在本发明中还可以使用由Kim等人(1993)描述的抗体，特别是由于所述抗体抑制体内的血管生成和肿瘤生长。

还可以使用以前未表明对人肿瘤有特异性的抗体。例如Venkateswaran等人(1992)描述了抗FGF MAb的生产。Xu等人(1992)开发并表征了一组抗FGF受体(flg)异构体的16异构体和区域特异性多克隆和单克隆抗体。Massoglia等人(1987)还报道了抗FGFMAb。(e)生产抗疾病脉管系统的抗体

除使用已知的抗体，如上述的那些和其他已知的在科学文献中公开的抗体外，人们还可以用标准免疫方法，如在下文将更详细描述的方法来生产新抗体。为了产生抗已知疾病相关脉管标记抗原的抗体，用含有抗原的致免疫组合物来免疫动物。这可是膜制品，包括或富集的，抗原，抗原的相对纯化的形式，从细胞或膜中分离的；高度纯化形式的抗原，通过使用如天然抗原提取的不同纯化步骤而得到的或从重组宿主细胞中得到的重组形式的抗原。

本发明还提供了另一种方法来生产抗存在于疾病相关脉管系统内皮细胞上之抗原的抗体，所述方法甚至适用于抗原的生物化学特性未知的情况。这些方法通过产生抗肿瘤脉管系统内皮细胞的抗体来举例说明。用这种方式进行抗体生产的第一种方法是使用从动物或人患者之肿瘤位点得到的脉管内皮细胞制品。人们用所述细胞制品简单免疫试验动物，然后收集由此而生产的抗体。这种方法最有用的形式是若随后筛选特异性抗体，则可以用常规杂交瘤技术，然后筛选抗肿瘤脉管内皮细胞的抗体。

上述方法的发展是体外模拟肿瘤脉管系统现象，而且不需细胞纯化。使用这种方法时，将内皮细胞经肿瘤衍生的产物处理，，如可以从肿瘤条件下的介质，细胞培养而不是动物中得到。该方法通常包括用肿瘤条件培养基刺激内皮细胞，用受到刺激的内皮细胞作为免疫原制备抗体收集物。再用如常规的单克隆抗体技术或其他技术如组合的免疫球蛋白噬菌粒文库筛选特异性抗体，所述文库是由从免疫动物的脾中分离的RNA而制备的。人们选择优先识别肿瘤刺激的脉管内皮的特异性抗体，所述抗体与肿瘤相关内皮细胞的反应比与正常成人组织的反应更强。

从这点考虑，认为可以使用的受刺激的内皮细胞包括，如人脐静脉内皮细胞(HUVE)，人表皮微血管内皮细胞(HDEMC)，隐静脉内皮细胞，人网膜脂肪内皮细胞，其他人微血管内皮细胞，人脑毛细血管内皮细胞等。还设想用肿瘤条件培养基刺激来自另一种的内皮细胞，并用作免疫原产生杂交瘤，从而生产抗体，即产生与肿瘤刺激的人脉管内皮细胞交叉反应的抗体，和/或用于临床前模式的抗体。

本文将“肿瘤条件培养基”定义为含有一种或多种肿瘤衍生的细胞因子，淋巴因子或其他效应分子的组合物或培养基，如培养基。最典型的是，从所选的肿瘤细胞已经生长的培养基制备肿瘤条件培养基，因此富集肿瘤衍生的产物。培养基的类型不是特别重要的，只要它至少开始含有支持肿瘤细胞生长的适宜营养物质和条件即可。当然，还可从肿瘤条件培养基中提取，甚至分离物质，并将一种或多种提取产物应用于内皮细胞。

至于用于制备培养基的肿瘤类型，当然，人们更愿使用模拟或类似最终将用本发明分析或治疗之肿瘤的肿瘤。因此，例如，若研制了治疗乳腺癌的方法，人们就要使用乳腺癌细胞如ZR-75-1，T47D，SKBR3，MDA-MB-231。在结肠直肠肿瘤的情况下，人们可以利用HT29癌，以及DLD-1，HCT116或甚至SW48或SW122。在肺癌的情况下，人们会提到利用NCI-H69，SW2，NCI H23，NCI H460，NCI H69或NCI H82。在黑素瘤的情况下，适宜的实例是DX.3，A375，SKMEL-23，HMB-2，MJM，T8或当然还有VUP。在任何上述情况下，进一步认为，人们甚至可以使用从待治疗肿瘤产生的细胞，即活检得到的细胞。

制备后，例如，通过在存在肿瘤条件培养基(或从其衍生的产物)的条件下，培养所选的内皮细胞，从而用肿瘤条件培养基刺激肿瘤内皮特异性标记物出现在内皮细胞表面上。再有，认为所用的内皮细胞类型并不重要，只要它通常代表与特定肿瘤的脉管系统相关的内皮即可，而所述特定肿瘤是最终待治疗或待诊断的。本发明人优选使用人脐静脉内皮细胞(HUVE)，人表皮微血管内皮细胞(HDEMC，Karasek，1989)，即这些细胞是人源的，对细胞生长因子和血管生成因子反应且很容易得到。然而，在本发明的实施中，可以使用任何能够在体外培养的内皮细胞，并总能得到有益的结果。人们可以提到利用如EA，hy9.26，ECV304，人隐静脉内皮细胞等。

用肿瘤衍生的产物刺激后，就用内皮细胞作为免疫原制备单克隆抗体(MAb)。用于制备抗抗原细胞表面标记之MAb的技术很直接，而且用本领域专业人员熟知的技术很容易完成，由Kohler & Milstern(1975)的技术来举例说明(下文将进一步描述)。

总而言之，用受刺激的内皮细胞制备MAb的优选方法包括下列过程：在组织培养中使衍生于人肿瘤的细胞或细胞系生长≥4天。从肿瘤细胞培养物中取出组织培养上清液(肿瘤条件培养基)，然后以50％(v/v)的终浓度加到HUVEC培养物中。培养2天后，非酶促收集HUVEC，并将1-2×10⁶个细胞腹膜内注射到小鼠中。以两星期的间隔，将所述过程重复3次，最后经静脉内途径免疫。3天后，收集脾细胞，然后与SP2/0骨髓瘤细胞通过标准方法(Kohler & Milstern，1975)融合，通过限制稀释克隆具有适宜反应性的生产抗体的杂交瘤。

从杂交瘤的所得收集物来看，人们要筛选生产抗体的多种杂交瘤中的一种，所述抗体识别激活之脉管内皮的程度大于它识别未激活之脉管内皮的程度。一种目标是鉴定基本上没有正常内皮结合亲和性的抗体。但是，与现有技术相反，在本发明中该特性并不重要。在任何情况下，人们通常通过用ELISA，RIA，IRMA，IIF或相似的免疫检测方法筛选来鉴定适宜的生产抗体的杂交瘤，它们抗一种或多种肿瘤激活的内皮细胞。一旦鉴定了候选者，就要对非活化的或“正常”内皮或其他正常组织或细胞检测是否没有反应性。用所述方法，排除对特定应用具有不需要高水平正常交叉反应性的生产抗体的杂交瘤。(f) 抗-endoglin抗体

用实施上述技术，已经制备并分离了对肿瘤脉管内皮有相对特异性的抗体。在一个特定的实施例中，用HT29癌细胞制备条件培养基，然后用其刺激培养中的HUVE细胞。然后用HT29激活的HUVE细胞作为免疫原制备杂交瘤库，用HT29-激活的HUVE细胞并通过人肿瘤和正常组织切片的免疫组织学分析而进行ELISA筛选。从该库中筛选识别肿瘤脉管内皮细胞抗原的抗体。

用上述方法得到称为肿瘤内皮细胞抗体4和肿瘤内皮细胞抗体11(TEC4和TEC11)的MAb。最终确定由TEC4和TEC11识别的抗原是分子endoglin。由TEC4和TEC11识别的endoglin上的表位存在于被刺激的HUVE细胞的细胞表面上，而在未被刺激的细胞表面上最少(或免疫可接近的)。以前已经得到了抗endoglin的MAb。然而，通过FACS分析与HUVEC或TCM激活的HUVEC细胞表面决定基或剪接免疫荧光表明，由TEC-4和TEC-11识别的表位不同于以前称为44G4抗体的那些(Gougos & letarte，1988)。

尽管可以将任何已知的抗-endoglin抗体(如Gougos&letarte，1988；Gougos et al.，1992；O’Conell et al.，1992；Buhring etal.，1991)与本发明结合使用，但认为TEC-4和TEC-11是特别适宜的。这是因为它们在广泛的固体肿瘤(以及数种慢性炎症疾病和胎儿胎盘中)以中等或强的程度标记毛细和小静脉内皮细胞，而在大多数正常健康成人组织种只有相当弱的染色。TEC-11是特别优选的，因为它与非内皮细胞基本没有反应性。此外，TEC-4和TEC-11均是组分固定的，这使它们有潜力诱发选择性地溶胞肿瘤脉管床中的内皮细胞。

认为在本发明种还可以使用与Mab TEC-4和TEC-11交叉反应的抗体，即在与TEC-4或TEC-11相同的表位与endoglin结合的那些。鉴定抗体或在与TEC-4或TEC-11相同的表位同endoglin结合的抗体是相当简单的事。用其中可以评估抗体竞争的各种免疫筛选试验中的任何一种都可以很容易地确定。例如若待检测的试验抗体是从不同于TEC-4或TEC-11的来源，如兔，或甚至不同的同族型，如IgG1或IgG3得到的，则可以使用竞争ELISA。在一个竞争ELISA的实施方案中，在用于ELISA平板上的抗原包被的孔之前，将TEC-4或TEC-11与不同量的试验抗体预混合。利用抗鼠或抗-IgM二级抗体，可以检测只结合了TEC-4或TEC-11的抗体-通过存在识别与TEC-4或TEC-11相同的表位，可以还原所述结合。

为了完成TEC-4或TEC-11和任何试验抗体之间的抗体竞争研完，人们首先用可检测标记，如生物素或酶或放射性标记来标记TEC-4或TEC-11以便能够随后进行鉴定。在这些情况下，将标记抗体与待检测的试验抗体以不同的比例(如1∶1，1∶10，和1；100)保温，在一段时间后，检测标记的TEC-4或TEC-11的反应性，并将其与对照值比较，在对照中，保温时没有潜在的竞争抗体(试验)。

检测方法可以是以抗体结合为基础的免疫学检测方法中的任何一种，如在生物素化抗体的情况下，通过检测其标记，或利用产色底物与酶标记相结合或通过简单地检测放射性标记就可以检测TEC-4或TEC-11抗体。结合与TEC-4或TEC-11相同的表位的抗体能够有效地进行竞争结合，因此，如由在标记抗体结合中的还原所表明的，将显著还原TEC-4或TEC-11结合。在本发明中，将标记的TEC-4或TEC-11抗体与试验抗体混合后，确定剩余反应性的适宜方法包括如使用人endoglin的ELISA，RIA或Western印迹；endoglin的免疫沉淀；表达人endoglin之重组细胞的ELISA，RIA或免疫荧光染色；与HUVEC或TCM-激活的HUVEC细胞表面决定基间接免疫荧光的反应性和FACS分析。后一种方法是最优选的，而且用其表明由TEC-4和TEC-11识别的表位不同于44G4(Gougos & letarte，1988)。

在没有任何试验抗体时，标记TEC-4或TEC-11抗体的反应性是对照高值。通过将标记的抗体与未标记的相同抗体保温而得到对照低值，此时将发生竞争，并还原标记抗体的结合。存在试验抗体时，标记抗体反应性的显著降低是试验抗体识别相同表位的标志，即与标记抗体“交叉反应”的表位。在本发明申请的所述方面，将“显著降低”定义为以约1∶1的比例至少约10-50％，或更优选的，以1∶100的比例等于或远大于约90％的可重复(即连续观察到)的结合降低。

如在上文TEC-4和TEC-11内容中所述的，可以将“交叉反应检测”用于本发明的任何抗体。因此在与任何本文所列的抗体相同的表位，与肿瘤细胞组分，肿瘤脉管系统组分，肿瘤细胞相关组分，肿瘤脉管系统相关组分，肿瘤细胞外机制组分或本文所列的任何类型的细胞结合的抗体，当与凝血剂结合形成双配体时，均在本发明的抗体范围内。(g)脉管内皮细胞结合配体的用途

也可以用与内皮细胞表面分析如生长因子受体结合或反应的生物学配体作为击靶组分。

在这种意义上可作为有用的靶的生长因子或配体包括VEGF/VPF，FCF，TGFβ，与TIE结合的配体，肿瘤项目纤连蛋白异构体，分散因子，肝细胞生长因子(HGF)，血小板因子4(PF4)，PDGF和TIMP。

特别优选的靶是VEGF/VPF，蛋白质的FGF家族和TGFβ。Abraham等人(1986)克隆了FGF，因此它是可得到的重组蛋白质。如由Ferrara等人(1991)报道的，已经克隆了分别有121，165，189和206个氨基酸的四种VEGF。(h)击靶结合配体

也可以将抗体或特异性击靶配体指向与疾病位点，如肿瘤的脉管内皮细胞表面结合的任何组分。由肿瘤衍生的配体和抗原，如生长因子来举证说明所述组分，所述肿瘤衍生的配体和抗原与已经存在于内皮细胞上的特异性细胞表面受体，或为应答肿瘤环境而已经在所述细胞上被诱导或过表达的受体结合。也将肿瘤脉管系统相关靶称为肿瘤衍生的内皮细胞结合因子。

可部分成功到达的疾病靶所需的特异性水平是因为将诱导局部内皮细胞表达或出现在正常内皮上不存在或表达不足或遮蔽的受体。对于肿瘤来说，将产生更高的特异性，因为在肿瘤中的内皮细胞将捕获肿瘤衍生的因子，并使其与细胞表面结合，从而降低了其他组织可获得的配体量。当与通过分散在血液和组织液池中而进一步稀释的因子或配体结合时，预期正常组织中的内皮细胞只会结合极少的所述因子。因此，从操作上来讲，可以用细胞表面结合配体或因子作为肿瘤内皮细胞标记。

除由肿瘤细胞本身制备外，肿瘤内皮细胞结合因子还可来源于渗入肿瘤的其他类型的细胞，如巨噬细胞和肥大细胞，或可以由血小板加工而在肿瘤内活化。

认为可用作肿瘤脉管系统相关靶的其他生长因子或配体包括EGF，FGF，BEGF，TGFβ，HGF(NaKamura，1991)，angiotropin，TGF-α，TNF-α，PD-ECGF和TIE结合配体(Bicknell andHarris，1992)。目前优选的靶是VEGF/VPF，蛋白质的FGF家族，转化生长因子-β(TGF-β)，TGF-α，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)angiotropin，血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；TIE激活配体；多效蛋白。

本发明的另一方面是使用只对配体-受体复合物上的表位有特异性的击靶抗体或其结合区，所述表位没有未结合形式的个体(游离)配体和受体。这些抗体识别并结合当配体，如生长因子与其受体，如生长因子受体结合而产生的特有构型，以形成特异性的结合复合物。所述表位不存在于未复合形式的配体或受体上。

本发明人认为，这些抗体结合的配体-受体复合物以比非肿瘤相关内皮细胞上显著高的量存在于肿瘤相关内皮细胞上。因此所述抗体作为击靶剂是有用的，而且还将提高本发明双特异性促凝剂的特异性。(I)受体构建体

还可将内皮细胞表面受体的可溶性结合区用作本发明的击靶配体。所述概念通常是以熟知的夹层结合现象为基础的，所述夹层结合现象已经用许多体外和体内结合方法进行了研究。简单地说，由于内皮细胞表达特异性受体，所以细胞结合并吸附对应的配体，然后配体可与导入到该系统中的其他受体构建体结合。

已经在前文鉴定了许多有用的内皮细胞受体，VEGFNPF，FGF，TCFβ，TIE-1和TIE-2是特别优选的靶。可以对这些受体中的每个进行操作以形成用作击靶配体的可溶性结合区。4  疾病相关的基质细胞靶(a) 细胞外基质/基质靶

Birembaut等人(1985)描述了在肿瘤病理学中基膜标记的用途。这些研究表明在肿瘤病理学中，破坏了基膜(BM)标记，IV型胶原蛋白，层粘连蛋白(LM)，硫酸类肝素硫酸代表蛋白多糖(HSP)和纤维蛋白连接素(FN)的分布。Burtin等人(1983)还描述了人迁移淋巴结种基膜和结缔组织抗体的改变。

用于本发明优选的靶是RIBS。ugarova等人(1993)报道了在纤维蛋白原种发生的构型变化，而且是由其与血小板膜糖蛋白GPIIb-IIIa的相互作用而引发的。在活化血小板上纤维蛋白原与膜糖蛋白GPIIb-IIIa的结合导致了血小板凝集。这种相互作用导致以受体-诱导所结合位点，RIBS(由结合的而不是游离配体表达的表位)的表达为迹象的纤维蛋白原构型的变化。

ugarova等人(1993)已经定位了两种RIBS表位。一个序列位于γ112-119，并由Mb 9G9识别；第二个是在Aα95-98的RGDF序列，由mAb 155B16识别。通过将纤维蛋白原吸附到塑料表面，然后用纤维蛋白溶酶消化也可以揭示这些表位。蛋白水解暴露表位与裂解Aα链羧基-末端以形成X₂片段是一致的。在纤维蛋白原Aα95-98RGDF序列的不可接近性表明，该序列不参与该分子与GPIIb-IIIa开始的结合。

纤维蛋白原与其受体的结合改变了Aα链羧基-末端的构型，暴露位于在该分子D和E区之间的复绕连接物片段的序列，产生了RIBS表位。就实施而言，认为RIBS序列可作为用凝血配体击靶的表位。因此，使用Mab 9F9和155B16是有利的，可以是由Zamarron等人(1991)描述的抗体。(b)抗细胞靶

本发明有其他优点，可以用其通过用它们击靶在疾病区域内发现的细胞而将促凝剂引导到疾病相关的脉管系统。

血小板通过粘附于受伤的血管壁并在受伤位点积累，而参与了止血和凝血。尽管在血管受伤位点血小板的沉积是在生理条件下，造成除血初级抑制的主要原因，但它可导致血管闭合，同时在生理条件下确保局部缺血的组织破坏，并有血栓栓塞形成。

血小板与其环境和彼此的相互作用代表了在细胞表面开始的复合过程。因此，表面膜在外部介质，包括血管壁和血浆组分与内部血小板之间提供了反应界面。

用本发明可以击靶p-155，一种在激活的血小板上表达的多聚体血小板蛋白质(Hayward et al.，1991)。提供复合位点生物化学和形态学变化，血小板对大量刺激作出反应。这些变化包括在生理过程中的粘附，聚集和凝血。血小板激活生产了可以由单克隆抗体识别的膜变化。认为单克隆抗体JS-1(Hayward et al.，1991)是一种所述抗体，可用作凝血配体的一部分。

配体-诱导的结合位点(LIBS)是仅在配体结合引起受体改变形状，介导随后的生物学过程后在细胞表面受体上表达的位点。可以将这些看作RIBS的配对物，而且是本发明优选使用的靶。

Frelinger等人(1990；1991)已经开发了13种抗-LIBS抗体，根据本发明，可以用其中的任何一种将促凝剂传递到疾病或肿瘤位点。还可以使用鼠单克隆抗血小板抗体MA-TSPI-1(抗人血小板反应素)和MA-PMI-2，MA-PMI-1和Dewerchin等人(1991)的MA-LIBS-1(抗人血小板糖蛋白IIb/IIIa)上的LIBS，以及Heyene等人(1994)的RUU2.41和LIBS-1；Tomiyama等人(1992)的OP-G2和Ab-15。B   凝血剂

本发明双特异性剂的第二臂或成分是能够促进凝血的组分。“凝血促进剂”可以是凝血因子，间接刺激凝血的因子或它们可以是能够结合并释放凝血因子或间接刺激凝血的因子之第二结合区形式。

1  凝血因子

根据本发明可以使用各种凝血因子，有下列试剂来举证说明。若凝血因子与第一结合剂共价相连，则用不同于其功能凝血位点的位点来连接所述分子。在下列各节还描述了不同于凝血因子的活性位点或功能区的适宜的连接区。

(a)  组织因子

组织因子(TF)是能够引发血液凝集的一种试剂。TF是外来凝血途径的激活剂，在正常生理条件下与血液不直接接触(Osterud etal.，1986；Nemerson，1988；Broze，1992；Ruf & Edington，1994)。然而，在血管损伤或用特定细胞因子或内毒素激活时，通过(亚)内皮细胞(Weisset al.，1989)或通过特定的血细胞(Warr et al.，1990)TF将暴露于血液。然后TF将与VIIa因子复合，它在正常条件的循环中在血液中是低浓度的(wildgoose et al.，1992)，然后TF/VIIa因子复合物通过将X因子激活成Xa因子而引发凝血级联反应。级联反应最终将形成纤维蛋白。

为了所述系列过程的发生，需将TF：VIIa复合物与磷脂表面相连，此后组装凝血-启始复合物与IX因子或X因子(Ruf et al.，1991；Paborskyet al.1991；Bach et al.，1986)。由于此原因，截断的TF(或tTF)(从中通过剪切基因而除去了跨膜和胞质区)是可溶性蛋白质，有100/1000的天然TFX因子-激活活性(Ruf et al.，1991)。

(b)凝块因子

也可以在本发明中使用凝血酶，V/Va因子和衍生物，VIII/VIIIa因子和衍生物，X/Xa因子和衍生物，XI/XIa因子和衍生物，XII/XIIa因子和衍生物，XIII/XIIIa因子和衍生物，X因子激活剂和V因子激活剂。

(c)毒物促凝剂

Williams和Esnouf在1962年表明Russell氏蝰蛇毒含有促凝剂蛋白质。Kisiel(1979)分离了激活V因子的毒物糖蛋白；而Di Scipio等人)1977(表明来自毒物的蛋白酶激活人X因子。X因子激活剂是可用于本发明的组分。

已经生产了对存在于Russell氏蝰蛇毒种的X因子激活剂有特异性的单克隆抗体(如Pukrittayakamee et al.，1983)，并可用其将试剂载运到体内的特异性靶位点。

(d)前列腺素和合成酶

通过在血小板微粒体种环氧酶和血栓恶烷合成酶的系列作用，从内过氧化物形成血栓噁烷A₂。由血小板很容易生产血栓噁烷A₂，根据其产生血小板凝集的能力，它是一种潜在的血管收缩剂(Whittle et al.，1981)。

认为血栓恶烷A₂和其活性类似物均可用于本发明。Bhagwat等人(1985)描述了生产血栓噁烷A₂的合成方法。由Ohuchida等人(1981)描述的血栓噁烷A₂类似物(特别是化合物2)特别适用于本发明。

也可以用合成血小板-激活的前列腺素的血栓噁烷合成酶和其他酶在本发明种作为“促凝剂”。Shen和Tai(1986 a；b)描述了血栓噁烷合成酶的单克隆抗体和其免疫亲和纯化方法；Wang等人(1991)报道了人血栓噁烷合成酶的cDNA。

(e)纤维蛋白溶解抑制剂

α2-抗纤维蛋白溶酶或α2-抗纤维蛋白溶酶抑制剂是天然存在于人血浆中的蛋白酶抑制剂，其功能是有效抑制由纤维蛋白溶酶原激活剂诱导的纤维蛋白凝块的溶解(Moroi & Aoke，1976)。α2-抗纤维蛋白溶酶是特别强的抑制剂，而且可用于本发明。

Moroi & Aoke(1976)首先描述了可以纯化α2-抗纤维蛋白溶酶。还有其他纯化方法，如在纤维蛋白溶酶原-Sepharose上进行亲和层析，在DEAE-Sephadex上进行离子交换层析，在Concanavalin-A-Sepharose上进行层析；或在Sepharose柱上进行亲和层析，该柱带有弹性蛋白酶-消化的纤维蛋白溶酶原制剂，该制剂在纤维蛋白溶酶A-链上含有三个N-末端的三环结合，然后用凝胶过滤(分别为Wiman & Collen1977；Wiman，1980)

由于可以得到α2-抗纤维蛋白溶酶的cDNA序列(Tone etal.，1977)，所以生产α2-抗纤维蛋白溶酶的优选方法是经重组表达。

还可以得到抗α2-抗纤维蛋白溶酶的单克隆抗体，可以将其用在本发明双特异性结合配体实施方案中。例如，Hattey等人(1987)描述了两种抗α2-抗纤维蛋白溶酶的Mab，MPW2AP和MPW3AP。报道这些Mab种的每个均可与天然α2-抗纤维蛋白溶酶同样好地进行反应，所以都可以用它们将外源α2-抗纤维蛋白溶酶传递到靶位点或在击靶区域内积累内生α2-抗纤维蛋白溶酶并浓缩它。也可以使用其他抗体如Mimuro和其同事描述的JTPI-2。

2  结合凝血因子的试剂

本发明的另一组双特异性凝血配体是其中击靶区不直接与凝血因子相连，而与结合凝血因子的第二结合区相连的那些。

若用第二结合区结合并传递凝血因子，则选择结合区以便不会明显损伤其诱导凝血的能力。在损伤方法中，适用于结合的凝血因子区通常是与适用于同击靶区(如前文所述)共价相连的那些区域相同。

然而，即可以预期这类双特异性配体在传递到肿瘤位点或区域后会释放凝血因子，所以在适用于结合第二结合剂或抗体的凝血因子区域中更有弹性。另一个优点是在输入tTF前，可将双特异性抗体预定位，所述tTF可诱导所需的tTF量，并因此生产毒性。

适用于该方法的适宜的第二结合区通常是具有凝血因子结合特异性之抗体的抗原结合位点，包括抗体的功能部分，如scFc，Fv，Fab’，Fab和F(ab’)₂片段。

含有抗体或其片段的双特异性结合配体抗组织因子，凝血酶，前激肽释放酶，V/Va因子，VIII/VIIIa因子，X/Xa因子，XI/XIa因子，XII/XIIa因子，XIII/XIIIa因子，Russell氏蝰蛇毒，血栓恶烷A₂，或α2-抗纤维蛋白溶酶，是本发明该方面实施方案的举证。C   连接方法

第一击靶区和第二凝血区可操作相连以使各区完成其所需的功能而没有明显损伤。因此击靶区能够与所选的靶(如从肿瘤环境靶种选择的)结合，而凝血区能够直接或间接，例如通过释放结合的因子而促进血液凝集或凝块。

为了评估击靶区的结合功能，全部的要求是完成结合试验以确保双特异性配体仍以基本上与未复合的第一结合区相同的方式与击靶组分结合。适宜的结合试验是通常在免疫结合试验中见到的，其中第一击靶区是抗体，和/或其他其他生物化学结合试验，如用¹²⁵I标记的蛋白质或其他放射性标记的组分，用来评估配体-受体结合以产生Scatchard作图等。

在所述试验中可以以许多形式提供靶抗原或组分，包括从天然或重组源纯化的蛋白质，膜富集的制品，完整的细胞和组织切片。通常若使用蛋白质组合物，则将其固定了固体支持物，如为滴定板，膜，或甚至柱基质上。通常还优选使用反映生理靶的靶组合物，因此由于所述靶益处与细胞相关的，所以利用包括完整细胞的组合物(包括组织和细胞本身)是优选的。

可以确定双特异性复合物结合功能的各种免疫学试验包括如Western印迹，ELISA，使用固定细胞的ELISA，免疫组合化学和荧光激活细胞分类术(FACS)。所有所述试验的实施是本领域专业人员熟知的，而且将在本文进一步描述。

用任何上述或其他结合试验评估双特异性化合物的击靶区结合功能是简单的事，其中最经常的是，在相同的条件下，双特异性配体和未复合的第一结合区进行平行实验，以便能够进行比较。有效的双特异性配体将与靶结合而没有明显的损伤，即用基本上与未复合的第一结合区相同的方法。取未复合的结合区试验结果为100％的参考值，如本文所用的，双特异性配体的“基本结合”指双特异性配体表现出至少约50％的结合，更优选的是约50％到约80％结合之间，最优选的在约80％到约100％结合之间。

若双特异性配体包括与促凝剂结合的第二结合区，例如，它是双特异性抗体，其他有用的试验是同时评估双特异性配体两个臂的结合功能的那些。例如通过评估靶细胞的放射性标记的促凝剂经桥键与双特异性配体或抗体的结合可以完成。如实施例II所述，所述试验由tTF与靶细胞利用B21-2/10H10双特异性抗体的结合来举证。

确定双特异性配体的凝血剂功能也是简单的事。在此所有要求就是用双特异性配体完成凝血试验，并确保它以基本上与未复合凝血剂相同的方式，发挥促进凝血的功能。这对于“凝血剂”是理想的，所述凝血剂是凝血因子本身以及是与凝血因子结合的第二结合区的那些。自然，在后一种情况下，在体外或体内试验中，将双特异性配体与凝血因子预复合以便与第二结合区结合。

一种适宜的凝血试验是其中将双特异性配体(如果需要，与促凝剂预复合的)与血浆样品混合。在所述试验中，纤维蛋白链的出现是凝血的标志。因此预期有效的双特异性配体将会减少纤维蛋白链出现的时间，特别是与对照水平相比，将显著降低消失的时间。

上述试验的改变包括在有效结合，洗涤细胞以除去非特异性结合的组分，然后将洗涤的细胞重悬于血浆的条件下，并经一段足够的时间，首先将适宜的靶细胞暴露于双特异性配体。预期只有用双特异性配体包被的细胞才能降低纤维蛋白链在试验中出现的时间。这类试验是优选的，即其本身就是评估双特异性构建体功能，即先击靶细胞，然后定位凝血的试验。

为了比较双特异性化合物与未复合的凝血剂的凝血功能，可以再进行平行试验。有效的双特异性配体将发挥促进凝血的功能而没有明显的损伤，即将以基本上与未复合的凝血剂相同的方式发挥功能。以未复合的促凝剂试验结果为100％参考值，如本文所用的，“基本功能”指双特异性配体表现出至少约50％的凝血作用，而更优选的在约50％到约80％的凝血作用之间，且最佳在约80％到约100％的凝血作用之间。

可以用合成化学技术或重组DNA技术连接双特异性配体的两个功能区。常规使用这些技术中的每种技术，并将在实施例I并通过在下文的详细说明而进一步举证。

1  生物化学交联剂

将抗体或其他击靶组分与凝血剂的连接通常使用与为制备免疫毒素而发展的相同技术。然而，重要的优点在本发明技术中是明显的，而生理上得到特定量的未复合的凝血剂不是特别重要的。因此，对任何交联剂的稳定需要不如对其他构建体，如免疫毒素中所用的连接剂的需求那样严格。因此，可以认为这是一个通常的准则，即适用于免疫毒素的任何生物化学交联剂也适用于本发明，而且还可以考虑其他连接剂。

除毒素外，已经将各种其他化疗和药理学试剂与抗体相连以形成已经表明了药理学功能的共轭物(参见如Vaickus et al.，1991)。已经研究的举证性抗肿瘤剂包括羟基柔毛霉素，正定霉素，氨甲蝶呤和长者碱等(Dillman et al.，1988；Pietersz et al.，1988)。此外，已经描述了其他试剂如新制癌菌素(Kimura et al.，1983)，大分子霉素(Manabe et al.，1984)，三亚胺醌(Ghose，1982)和α-鹅膏菌素(Davis & Preston，1981)。在前述科学文献中描述的连接技术也适用于本发明。

用交联剂形成桥键，将两种不同分子功能基团，如结合剂和凝血剂连接在一起。为了逐步连接两种不同的蛋白质，可以使用异双功能交联剂来消除不需要的同聚物形成(表VI)。

                                    表VI

                               异双功能交联剂

连接剂	与…反应	优点和应用	间隔壁长度/交联后
				SMPT	伯胺巯基	·很稳定	11.2A
SPDP	伯胺巯基	·硫酸盐化·可裂解交联	6.8A
				LC-SPDP	伯胺巯基	·扩展间隔臂	15.6A
硫代-LC-SPDP	伯胺巯基	·扩展间隔臂·水溶性的	15.6A
				SMCC	伯胺巯基	·稳定的马来酰亚胺反应基团·酶抗体共轭·半抗原载体蛋白共轭	11.6A
硫代-SMCC	伯胺巯基	·稳定的马来酰亚胺反应基团·水溶性的·酶抗体共轭	11.6A
				MBS	伯胺巯基	·酶抗体共轭·半抗原载体蛋白共轭	9.9A
硫代-MBS	伯胺巯基	·水溶性的	9.9A

表VI续

连接剂	与…反应	优点和应用	间隔壁长度/交联后
				SIAB	伯胺巯基	·酶抗体共轭	10.6A
硫代-SIAB	伯胺巯基	·水溶性的	10.6A
				SMPB	伯胺巯基	·扩展的间断臂·酶抗体共轭	14.5A
硫代-SMPB	伯胺巯基	·扩展的间断臂·水溶性的	14.5A
				EDC/硫代-NHS	伯胺羧基	·半抗原载体共轭	0
ABH	无选择性的碳水化合物	·与糖基团反应	11.9A

举证性的异双功能交联剂含有两个反应基团：一个与伯胺基团(如N-羟基琥珀酰亚胺)反应，而另一个与硫代基团(如吡啶基二硫键，马来酰亚胺，卤素等)反应。通过伯胺反应基团，交联剂可以与一种蛋白质(如所选的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，而通过硫代反应基团，已经连接了第一种蛋白质的交联剂与另一蛋白质(如促凝剂)中的半胱氨酸反应。

因此，可以看到，优选促凝剂或促凝剂结合区通常含有或经衍生含有用于交联的功能基团。这种要求不应被看作是一种限制，因为在该方法中可以使用许多基团。例如，可用伯或仲胺基团，酰肼或肼基团，羧基醇，磷酸酯或烷基化基团进行结合或交联。就总的连接技术而言，人们可参照Ghose & Blair(1987)。

在交联剂的两个反应基团之间的间隔臂可以有各种长度和化学组分。间隔臂越长，共轭物组分的弹性越好，而在桥键中有些特定组分(如苯基团)会使反应基团有额外的稳定性或对各方面作用的化学连接抗性增强(如二硫键对还原剂的抗性)。也可以使用肽间隔基，如L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala。

优选使用在血液中有合理稳定性的交联剂。许多含二硫键连接剂是已知的，可以用其成功地共轭靶和凝血剂。证明含二硫键(受到空间阻碍)的连接剂在体内有更高的稳定性，可防止促凝剂在与作用位点结合前就释放。因此这些连接剂是优选的连接剂。

用于免疫毒素最优选的交联剂是SMPT，它是含二硫键的双功能交联剂，所述二硫键通过邻接的苯环和甲基基团而受到空间阻碍。二硫键硬脂似的阻碍会保护键的功能，防止可能存在于组织和血液中的硫醇盐阴离子如谷胱甘肽的攻击，由此有助于防止在将粘附剂传递到肿瘤位点之前就形成共轭物。可将SMPT剂与本发明的双特异性凝血配体结合使用。

SMPT交联剂以及许多其他已知的交联剂有能力提供交联功能基团如半胱氨酸或伯胺的SH(如赖氨酸的ε氨基)。另一种可能的交联剂包括含有可裂解的二硫键如磺基琥珀酰亚氨基-2-(P-叠氮基水杨酰胺)乙基-1，3’-二硫代丙酸酯的杂双功能光反应性叠氮基苯。N-羟基-琥珀酰亚氨基与伯氨基反应，而叠氮基苯(光解后)非选择性地与任何氨基残基反应。

除位阻的交联剂外，在本发明种也可以使用非位阻的交联剂。其他有用的交联剂(认为不含有或产生受保护的二硫键)包括SATA，SPDP和2亚氨基硫烷(2-iminothiolane)(Wawrzynczak & Thorpe，1987)。所述交联剂的使用是本领域熟知的。

共轭后，通常纯化双特异性剂以便将共轭物与非共轭的击靶剂或促凝剂以及其他污染物分开。重要的是除去非共轭的击靶剂以避免共轭的和非共轭的种之间对抗原的可能的竞争。有许多纯化技术可以提供有足够纯度的共轭物以使它们有临床用途。按大小分离，如凝胶过滤，凝胶渗透或HPLC通常是最有用的。也可以使用其他层析技术如BlueOSepharose分离。

2  重组融合蛋白

本发明的双特异性靶向促凝剂还可以是由分子生物学技术制备的融合蛋白。利用重组DNA技术达到所述目的现在对于本领域专业人员来说是标准实践。这些方法包括如体外重组DNA技术，合成技术，体内重组/遗传重组。另外，可以用自动合成仪完成DNA和RNA的合成(参见，例如，在Sambrook et al.，1989中描述的技术；和Ausubel et al.，1989)。

总而言之，为了制备融合蛋白，人们将编码结合配体或其他击靶区的DNA编码区，如基因或cDNA与编码凝血因子或促凝剂结合区的DNA编码区(即基因或cDNA)相连。这通常包括制备表达载体，所述载体在相同阅读框架中含有编码第一结合区的第一DNA片段，它与编码凝血因子的第二DNA片段可操作相连。以全部核酸的翻译将产生本发明所需的双特异性化合物的方式连接所述序列。表达载体含有一个或多个启动子上游的插入DNA区，它们可启动DNA的转录并可促进编码重组蛋白质的表达。这就是“重组表达”的意思。

若特定结合区或促凝剂是优选的，而编码DNA不能立即得到，就可以用“分子克隆”技术来得到，其中从DNA文库(如cDNA或基因组文库)中分离编码所需蛋白质的DNA分子。在所述方法中，如用表达筛选方法筛选适宜的DNA文库，所述筛选方法使用抗蛋白质的抗体或利用活性检测。另外，筛选可以是以寡核苷酸探针的杂交为基础的，所述探针是从考虑蛋白质的部分氨基酸序列或从编码相关蛋白质之基因的DNA序列设计的。所述筛选方法的操作是本领域专业人员熟知的，而且在科学文献，如由Sambrood等人(1989)作了详细描述。

若经重组DNA技术产生，则将本发明的击靶剂/凝血剂化合物称为“融合蛋白”。应理解所述融合蛋白含有至少一种如本发明定义的击靶剂和凝血剂，而且所述试剂可操作相连。融合蛋白还可包括其他的肽序列，如与击靶剂和凝血剂化合物可操作相连的间隔，只要所述其他序列不是明显地影响所得融合蛋白的击靶或凝血活性即可。

应理解重组双特异性蛋白质配体不同于通过化学交联所谓天然产生的蛋白质而形成的那些双特异性构建体。具体地说，翻译后修饰的程度，如糖基化和磷酸化在相同两种蛋白质之间的重组融合和化学融合是不同的。然而这不是个显著的问题，因为在用于临床前本领域专业人员可以其它数据确定并预料道所需重组融合蛋白的功能。

重组表达的一个优点是可以很容易地操作连接区以便，容易得到其长度和/或氨基酸组成。如果需要，可以提供不可裂解的肽间隔以便操作连接本发明的两种试剂。同样，可以将具有特有裂解位点的肽插入到这两种组分之间。

在具体情况下，如果需要，可以提供操作连接击靶剂和凝血剂的肽间隔，它能够折叠成二硫键环结构。然后在环内蛋白水解裂解产生异二聚体多肽，其中只通过一个二硫键连接击靶剂和凝血剂(参见，例如，Lordetal.，1992)  。

可以用许多标准技术构建含适宜核酸和转录/翻译控制序列的表达载体以便在各种宿主-表达系统种达到表达蛋白质的目的。可用于表达的细胞包括，但不限于用含有击靶剂/促凝剂编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，如细菌(如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌)，用含有击靶剂/促凝剂编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如糖酵母，Pichia)；用含有击靶剂/促凝剂编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫系统；用含有击靶剂/促凝剂编码序列的病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有击靶剂/促凝剂编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；和含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(如COS，CHO，BHK，293，3T3)，所述构建体含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。

在细菌系统中，根据待表达的击靶剂/凝血剂构建体有利于选择许多表达载体。例如若要生产大量的双特异性剂，则需要指导高水平表达易纯化的融合蛋白产物的载体。所述载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，1983)，其中将击靶剂/促凝剂编码序列逐个与载体框架中的lac Z编码区相连以便提供还含有部分lac Z产物的融合蛋白；pIN载体(Inouye et al.，1985；Van Heeke et al.，1989)；等。也可以用pGEX载体表达前述的多肽，如还含有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的作为融合蛋白的击靶剂/促凝剂组合。总而言之，所述融合蛋白是可溶的，而且通过吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠上，然后在不存在谷胱甘肽的条件下洗脱而从溶解的细胞中很容易纯化。设计pGEX以包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点以便可以从GST部分释放出全部融合蛋白的结合剂/促凝剂蛋白。

在有用的昆虫系统中，用AcNPV作为载体表达外源基因。所述病毒在秋粘虫细胞中生长。将击靶剂/促凝剂编码序列克隆到所述病毒的非必需区(如多角体蛋白)中，并位于AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下。成功地插入双特异性配体编码序列导致多角体蛋白基因失活，同时生产非闭合的重组病毒(即没有与多角体蛋白基因编码的蛋白被膜的病毒)。然后用这些重组病毒感染秋粘虫细胞，在所述细胞中将表达插入的基因(如参见Smith et al.，1983；^★美国专利No4215051，Smith)。

哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多病毒为基础的表达系统。若用腺病毒作为表达载体，则将击靶剂/促凝剂编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合物，如晚期启动子和三部分组成的前导序列相连。然后通过体外或体内重组将嵌合基因插入到腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必需区(如E1或E3)将导致重组病毒在感染的宿主内存活并能够表达双特异性蛋白质(例如，参见Logan et al.，1984)。

还需要特异性的启始信号来有效翻译插入的击靶剂/凝血剂编码序列。这些信号包括ATG启始密码子和相邻的序列。还要提供内源翻译控制信号，包ATG启始密码子。本领域专业人员应能够很容易确定并提供所需的信号。熟知启始密码子必须与所需编码序列的阅读框架在相(或框架)中以确保翻译完整的插入片段。这些内源翻译控制信号和启始密码子可以是各种来源的，可以是天然的和合成的。通过包含使用适宜的转录增强子元件，转录终止子等可以提高表达的效率(见Bittner et al.，1987)。

另外，还可以选择宿主细胞菌株，使其调节插入序列的表达，或以所需的特异性方式修饰并加工基因产物。蛋白质产物的所述修饰(如糖基化)和加工(如裂解)对于蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞有特征性和特异性的机制来翻译后加工并修饰蛋白质。可以选择适宜的细胞系或宿主系统以确保正确修饰并加工所表达的外源蛋白质。为了达到此目的，可以使用具有适当加工初级转录本之细胞机制，基因产物糖基化和磷酸化的真核细胞。所述哺乳动物细胞包括但不限于CHO，VERO，BHK，HeLa，COS，MDCK，293，3T3，WI38等。

从长期来讲，高产率生产重组蛋白质，稳定表达是优选的。例如可以制备稳定表达编码击靶剂/促凝剂配体之构建体的细胞系。不使用含有病毒复制源的表达载体，可以用由适宜的表达控制元件(如启动子，增强子，序列，转录终止子，多聚腺苷酸化位点等)控制的击靶剂/促凝剂DNA和可选择标记来转化宿主细胞。在导入外源DNA后，使制备的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后换到选择培养基中。在重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性，并使细胞将质粒稳定地整合到其染色体中，然后生长形成集中点，反过来，可以将其克隆并扩展成细胞系。

可以使用许多选择系统，包括但不限于可以分别在tk-，hgprt-或aprt-细胞中使用单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，1977)，次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶和腺嘌呤转磷酸核糖基酶。还可以用抗代谢产物抗性作为dhfr(赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler et al.，1980；O’Hare et al.，1981))；gpt(赋予赋予霉酚酸抗性(Mulligan et al.，1981)；赋予氨基糖苷G-418抗性的neo(Colberregarapin et al.，1981)；以及赋予潮霉素抗性的hygro(Santerre et al.，1984)的选择基础。D   抗体

若用抗体作为双特异性配体中的一部分或两部分，则通常就要根据肿瘤类型和所选的凝血配体来选择抗体。然而，通过应用特定类型的抗体可以达到某种特定的优点。例如若希望IgG基础的抗体表现出比Fab’配对物更好的结合能力和较慢的血液清理粘粒，通常Fab’片段基的组合物就表现出更好的组织穿透能力。

1  单克隆抗体

制备并表征抗体的方法是本领域熟知的(参见如^★Antibodies：ALaboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory，1988)。

生产单克隆抗体(MAb)的方法通常也是从用于制备多克隆抗体的相同的细胞系开始。简而言之，用本发明的免疫组合物免疫动物而制备多克隆抗体，在免疫耐受化(immunotolerizing)之前或不需免疫耐受取决于所用的抗原组合物和方法(如耐受正常细胞种群，然后用肿瘤细胞种群免疫)。可以用许多种动物生产抗血清。通常用于生产抗-抗血清的动物是兔，小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠或山羊。由于兔有相对大量的血液，所以优选兔来生产多克隆抗体。

正如本领域熟知的，给定的组合物其免疫原性可以不同。因此通常需要加强宿主免疫系统，这可以通过将肽或多肽免疫原与载体偶联而达到。举证性的和优选的载体是匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)和牛需求白蛋白(BSA)。也可以用其他白蛋白如卵白蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白作为载体。将多肽与载体蛋白共轭的方法是本领域熟知的，并包括戊二醛，m-maleimidobencoyl-N-羟基琥珀酰亚胺酯，碳化二亚胺和bis-biazotized联苯胺。

正如本领域熟知的，利用免疫反应的非特异性刺激剂(称为佐剂)可以提高特定免疫原组合物的免疫原性。举证性的和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有杀死的结核杆菌的免疫反应非特异性刺激剂)，不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。

用于生产多克隆抗体的免疫原组合物的量随免疫原的性质以及将免疫的动物而不同。可以利用不同的途径施用免疫原(皮下，肌肉内，皮内，静脉内和腹膜内)。在免疫后的不同点取免疫动物的血液可以监测多克隆抗体的生产。也可以进行第二次加强注射。重复加强和滴定的过程直到达到适宜的滴定度。若得到所需的滴定度水平，从被免疫的动物中取血，然后交联血清并贮存，和/或可以用所述动物生产Mab。

可以用熟知的技术，如在^★美国专利4196265(该文献引入本文作为参考)举证的那些来制备Mab。通常所述技术包括用所选的免疫原组合物，如纯化的或部分纯化的肿瘤细胞或脉管内皮细胞蛋白质，多肽，肽或完整的细胞组合物免疫适宜的动物。以有效刺激生产抗体之细胞的方法来施用免疫组合物。啮齿类动物，如小鼠和大鼠是优选的，而也可以使用兔，羊，蛙细胞。使用大鼠可以提供特定的优点(^★Goding，1986，pp.60-61)，但小鼠是优选的，而BALB/c小鼠是最优选的，由于这是最常规使用的，并通常有较高百分比的稳定融合。

免疫后，在Mab的生产方法中，选择具有生产抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)。从活检的脾，扁桃体或淋巴结或从外周血液样品中得到这些细胞。脾细胞和外周血液细胞是优选的，前者是因为它们是生产抗体细胞的丰富来源，而所述细胞是正在分裂中的成浆细胞阶段，而后者是因为外周血很容易得到。通常，免疫一组动物，取出有最高抗体滴定度的动物的脾，然后用针管匀浆脾而得到脾淋巴细胞。通常来自免疫小鼠的脾含有约5×10⁷到2×10⁸个淋巴细胞。

然后将来自免疫动物的产生抗体的B淋巴细胞与不死的骨髓瘤细胞融合，通常是与免疫动物相同的种。在杂交瘤生产融合方法中适用的骨髓瘤细胞系优选是不产生抗体的，有高融合效率，然后能够在特定的选择培养基中生长的酶缺陷型，所述培养基只能使所需的融合细胞(杂交瘤)生长。

可以使用任何一种骨髓瘤，这是本领域专业人员熟知的(^★Goding，pp.65-66，1986；^★Campbell，pp.75-83，1984)。例如若被免疫的动物是小鼠，则人们可以用P3-X63/Ag8，X63-Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，人们可以使用R210.Rcy3，Y3-Ag1.2.3，IR983F，4B219或上述所列小鼠细胞系中的任何一种；以及U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMv2和UC729-6在与人细胞融合中均是有用的。

一种优选的鼠骨髓瘤细胞是A63-A68，653黑素瘤细胞系，它很容易从ATCC得到。另一种可以使用的小鼠细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性小鼠鼠骨髓瘤SP2/0非产生者细胞系。

制备抗体-生产脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞和杂交物的方法通常是在存在促进细胞膜融合的试剂(化学或电的)的条件下，将体细胞与骨髓瘤细胞以4∶1的比例混合，所述比例可以分别在20∶1到1∶1之间变化。已经由Khler & Milstein(1975；1976)描述了使用仙台病毒的方法，以及由Gefter等人(1977)描述的使用聚乙二醇(PEG)的方法。使用电诱导的融合方法也是适宜的(^★Goding，pp.71-74，1986)。

融合方法通常以低频率，约1×10^-6到1×10^-8生产活的杂交物。然而，这并不是问题，因为活的融合杂交物是通过在选择培养基中培养亲本，未融合的细胞(特别是正常继续无限分裂的未融合的骨髓瘤细胞)中分化的。所述选择培养基通常是含有阻断在组织培养基中重新合成核苷酸之试剂的培养基。举证性的和优选的试剂是氨基喋呤，氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基喋呤和氨甲蝶呤阻断重新合成嘌呤和嘧啶，而重氮丝氨酸只阻断嘌呤的合成。若用氨基喋呤或氨甲蝶呤，则用次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源补充培养基(HAT培养基)。若用重氮丝氨酸，则用次黄嘌呤补充培养基。

优选的选择培养基是HAT。只有能够操纵核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶，如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)方面是缺陷的，因此，它们不能存活。而B细胞可以控制该途径，但它们在培养中有有限的生命期，通常在约两周内死亡。因此，只有能够在选择培养基种存活的细胞才是由骨髓瘤和B细胞形成的杂交物。

所述培养提供了从中筛选特异性杂交瘤的杂交瘤种群。通常通过在微滴定板中培养单-克隆稀释的细胞，然后检测单个克隆上清液(在约2-3周后)是否有所需的反应性，由此完成杂交瘤的筛选。所述检测应是敏感的，简单和快速的，如放射性免疫检测，酶免疫检测，细胞毒性检测，噬菌斑试验，点免疫结合试验等。

然后系列稀释所选的杂交瘤，并将其克隆到生产抗体的单个细胞系中，所述克隆可以无限增殖以提供Mab。可以用两种基本方法研完细胞系的生产。将杂交瘤样品注射(经常是到腹腔内)到组织相容的动物中，用所述动物提供用于原融合的体细胞和骨髓瘤细胞。注射后的动物产生了肿瘤，所述肿瘤分泌由融合的细胞杂交物生产的特异性单克隆抗体。然后收集动物体液，如血清或腹水，以便以高浓度提供Mab。还可以在体外培养个体细胞系，若自然将Mab分泌到培养基中，从中就很容易得到高浓度Mab。可以纯化用任何一种方法生产的Mab，如果需要，可用过滤，离心和各种层析方法，如HPLC或亲和层析。

本发明人还设想用分子克隆方法生产单克隆。为达到此目的，由从免疫动物的脾中分裂的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，通过使用表达抗原和对照细胞，如正常-对肿瘤细胞的跟踪拍摄而筛选表达适宜抗体的噬菌粒。这种方法比常规杂交瘤技术的有利的是可以生产约10⁴倍的抗体，而且用单轮筛选，而用H和L链组合产生新的特异性，这又可以进一步提高发现适宜抗体的机会。

若在本发明中用Mab，则它们可以是人，鼠，猴，大鼠，仓鼠，鸡甚至兔源的。本发明设想使用人抗体，来自小鼠，大鼠，或其他种的“人化”或嵌合抗体，带有人恒定和/或可变区，以及其他重组抗体及其片段。当然，由于试剂容易制备并容易得到，通常鼠单克隆抗体是优选的。2   抗体的功能结合区

击靶剂抗体或抗体片段(如Fab’，Fab，F(ab’)₂，Fv或scFv)的来源或衍生对于实施本发明不是特别重要的，只要实际用于制备双特异性配体的抗体或片段表现出所需的结合特性即可。

可以使用其中除去了Fv片段的抗体制剂。通过控制蛋白水解可以完成免疫球蛋白分子的片段化，尽管所述条件随种和免疫球蛋白型或亚型的不同变化。二价F(ab’)₂片段通常比二价Fab或Fab’片段更优选。Fab

可以通过用非特异性硫羟蛋白酶，木瓜蛋白酶蛋白水解全部的免疫球蛋白得到Fab片段。首先通过还原在含有半胱氨酸，2-巯基乙醇或二硫苏糖醇的活性位点内的巯基而使木瓜酶活化。应用EDTA(2mM)螯合除去在原种酶中的重金属以确保有最大的酶活性。通常以1∶100的重量比将酶与底物混合在一起。保温后，通过用碘乙酰胺将硫羟基不可逆地烷基化，或简单地通过透析可以停止反应。用SDS-PAGE监测消化的完全程度，用蛋白质A-Sepharose或离子交换层析分离各组分。F(ab’)₂

从兔和人源IgG制备F(ab’)₂片段的常用方法限于用胃蛋白酶蛋白水解(Procotocol7.3.2)。在37℃，pH 4.5的乙酸盐缓冲液中100x抗体过量w/w的条件表明，在重链间的二硫键的C-末端侧裂解抗体。小鼠IgG的消化率随亚型所不同而不同，没有些未消化的或完全降解的IgG可能很难得到高产率的活性F(ab’)₂片段。具体说，IgG_2b对完全降解是高度敏感的。其他亚型为得到最佳结果要求有不同的保温条件。

用胃蛋白酶消化IgG需要的条件包括在0.1M乙酸盐缓冲液，pH4.5中透析，然后与1％w/w胃蛋白酶保温4小时；如果先在4℃对0.1M甲酸盐缓冲液，pH2.8透析，然后用乙酸盐缓冲液透析，就可以改善IgG₁和IgG_2a的消化。在37℃将IgG_2b在0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.8中与葡萄球菌V8蛋白酶(3％w/w)保温4小时的结果一致。

3   双特异性抗体

总而言之，制备双特异性抗体的方法是本领域熟知的，正如由Glennie等人(1987)举证的。临床上已经用双特异性抗体。治疗癌患者(Baueret al.，1991)。制备双特异性抗体的一种方法包括分别制备具有靶肿瘤抗原特异性的抗体，另一方面，制备凝血剂(或其他所需的靶，如活化抗原)特异性的抗体。

还发展了特别用作免疫治疗剂的双特异性抗体。正如前文与抗原一诱导一起提到的，对交联淋巴细胞和肿瘤抗原开发了特定的这些抗体(Nelson，1991；Segal et al.，1992)。实例包括在CD3结合T细胞和肿瘤抗原的嵌合分子，然后在接近靶细胞的附近，通过生理交联的TCR/CD3复合物引发淋巴细胞激活作用(Staerz et al.，1985；Perez etal.1985；1986a；1986b；Ting et al.，1988)。

的确，已经报道癌，淋巴瘤，白血病和黑素瘤的肿瘤细胞对双特异性抗体介导的T细胞杀死是敏感的(Nelson，1991；Segal et al.，1992；deLeij etal.，1991)。已经将这些双特异性抗体用于抗各种肿瘤靶的I期临床试验。尽管它们不是本发明的新组合物，但还设想将双特异性交联抗体与本文描述的双特异性凝血配体结合使用。可以按参考文献，如deLeij等人(1991)；Clark等人(1991)；Rivoltini等人(1992)；Bolhuis等人(1992)和Nitta等人(1990)的描述施用双特异性交联抗体。

制备双特异性抗体的各种方法是本领域熟知的，Glennie等人(1987)的方法包括从两种所选的抗体制备肽F(ab’γ)₂片段，然后分别将其还原以提供不同的Fab’_γsH。在待偶联的两种组分中的一种上的SH基团用交联剂如O-亚苯基二马来酰亚胺烷基化以便在一种组分上提供游离马来酰亚胺。然后将所述组分用硫醚键与另一组分共轭以得到所需的F(ab’γ)₂异共轭物。

由于容易制备，产率高而且可重复生产，Glennie等人(1987)的方法对于制备双特异性抗体通常是优选的，然而，还有许多可以使用并有本发明人构想的其他方法。例如其中用SPDP或蛋白质A完成交联的其他技术是已知的，或制备三特异性构建体(Titus et al.，1987；Tutt etal.，1991)  。

生产双特异性抗体的另一种方法是融合两种杂交瘤以形成四瘤(quadroma)(Flavell et al.，1991，1992；Pimm et al.，1992；Freuch etal.，1991；Embleton et al.，1991)。如本文所用的，用术语“四瘤”描述两种B细胞杂交瘤的生产性融合。用现在的标准技术，将生产杂交瘤的两种抗体融合以得到子代细胞，然后筛选表达两组克隆型免疫球蛋白基因的那些细胞。

生产四瘤的优选方法包括筛选至少一种亲本杂交瘤的一种酶缺陷型突变体。然后将第一突变体杂交瘤细胞系与第二种杂交瘤细胞融合，已经将所述第二种杂交瘤细胞致死地暴露于如碘乙酰胺，使其不能继续存活。细胞融合通过从致死处理的杂交瘤中获得其酶缺陷型的基因而救活了第一杂交瘤，而通过与第一杂交瘤融合而救活了第二杂交瘤。优选的是，但不需要融合相同型的免疫球蛋白，而是不同亚型的。混合的亚型抗体可以允许使用另一种检测方法来分离优选的四瘤。

更详细地说，发展和筛选四瘤的一种方法包括得到分泌第一种所选MAb的杂交瘤，使其对于必需的代谢酶，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)是缺陷型的。为了得到杂交瘤的缺陷突变体，使细胞在存在增加浓度的8-氮鸟嘌呤(1×10^-7M到1×10^-5M)下生长。通过限制稀释盐克隆突变体，然后检测其次黄嘌呤/氨基喋呤/胸苷(HAT)敏感性。培养基可以含有例如用10％FCS，2mML-管酰胺和1mM青霉素-链霉素补充的DMEM。

用生产第二种所需MAb的互补杂交瘤细胞系通过标准细胞融合技术(Galfre et al.，1981)，或通过使用由Clark等人(1988)描述的方法产生四瘤。简而言之，将4.5×10⁷HAT-敏感性第一种细胞与2.8×10⁷HAT-抗性的第二种细胞在融合前于冰上混合30分钟，所述第二种细胞已经用致死剂量的不可逆生物化学抑制剂碘乙酰胺(5mM在磷酸缓冲的盐中)预处理过。用聚乙二醇(PEG)诱导细胞融合，然后将细胞铺在96孔的培养板上。用含HAT的培养基筛选四瘤。用例如固相同型特异性ELISA和同型特异性免疫荧光染色鉴定含双特异性抗体的培养基。

在一种鉴定双特异性抗体的鉴定实施方案中，用与亲本杂交瘤抗体特异性反应并与两种抗体均没有交叉反应的试剂包被微滴定板的孔(Falcon，Becton Dickinson Labware)。洗涤所述板，将其阻断，然后将待检测的上清液加到各孔中。将平板在室温保温2小时，去掉上清液，洗涤平板，加入稀释的碱金属磷酸酶-抗-抗体共轭物，在室温保温2小时。洗涤平板，将磷酸酶底物如P-硝基苯磷酸酯(Sigma，St.Louis)加到各孔中。将平板保温，将3NNaOH加到各孔中以终止反应，用E LISA阅读器确定OD₄₁₀值。

在另一种鉴定实施方案中，使用由聚-L-赖氨酸预处理的微滴定板与各孔中的靶细胞之一结合，然后例如用戊二醛固定细胞，接着检测双特异性抗体其与完整细胞结合的能力。另外，可以将FACS，免疫荧光染色，个体型特异性抗体，抗原结合竞争使用以及其他抗体表征中本领域常用的方法与本发明结合使用来检测优选的四瘤。

分离四瘤后，纯化双特异性抗体以与其他细胞产物分开。这可以通过各种蛋白质分离方法完成，这些方法是免疫球蛋白纯化领域的专业人员熟知的。制备并表征抗体的方法也是本领域熟知的(参见如^★Antibodies：ALaboratory Manual，1988)。

例如，使从筛选的四瘤的上清液通过蛋白质A或蛋白质G sepharose柱以结合IgG((取决于同型)。然后用例如pH5.0的柠檬酸盐缓冲液洗脱结合的抗体。将含BsAb的洗脱部分对等渗缓冲液进行透析。另外，还可以使洗脱物通过抗-免疫球蛋白-sepharose柱。然后用3.5M氯化镁洗脱BsAb。然后例如通过上述靶细胞的同型特异性ELISA和免疫荧光染色试验来检测用这种方法纯化的BsAb的结合活性。

还可以纯化BsAb和亲本抗体，并用SDS-PAGE电泳分离，然后用银或考马斯染色。在亲本抗体的分子量比其他的高时，这是可能的，其中BsAb带迁移到两种亲本抗体的中间。样品的还原表明存在有两种不同明显分子量的重链。

此外，总来说现在可以用重组技术制备抗体，有可能制备编码有所需的双特异性抗体的重组抗体基因(Van Duk et al.，1989)。因此筛选了有最优结合特征的单克隆抗体后，就可以通过免疫筛选噬菌体表达文库分离编码这些抗体的基因(Oi&Morrison，1986；Winter & Milstern，1991)。然后通过重排Fab编码区，可以得到适宜的前构建体。E   结合试验

尽管本发明在动物和人治疗方案中有显著的实用性，但是，它还有其他的实践用途。这些用途通常与双特异性化合物的特异性结合能力有关。在本发明的所有化合物中，至少包括一种击靶和结合成分，如抗体，配体，受体等，所得的双特异性构建体可以用在基本上所有的可以使用源抗体，配体或受体等的结合实施方案中。在任何结合试验中，促凝剂或其他结合区的存在不会使第一结合区的实用性无效。

如可以将双特异性凝血配体用于标准结合试验中，如免疫印迹，Western印迹以及其他其中将抗原固定到固体支持基质，如硝酸纤维素，尼龙或其组合上的试验。可以用它们简单地作为“抗体组分”或用其提供更特异性的检测方法以检测抗引起不可接受的高背景的标准第二试剂的抗原。当所研究的抗原本身是免疫球蛋白或在方法中使用其他抗体时，这是特别有用的，下文将以ELISA为例举证。

还可以将双特异性结合配体与新鲜冷冻的和福尔马林固定的，石蜡包埋的组织块一起使用，用于免疫组织化学；荧光激活细胞分类术，流式细胞计数或流式显微荧光测量法；免疫沉淀可从复合混合物中分离靶抗原，其中由于其形成细胞点阵的能力，它们甚至不需要第二基质偶联的试剂就可以沉淀；在抗原或细胞纯化实施方案中，如亲和层析，在特定情况下甚至包括同时一步快速纯化一种或多种细胞种群；以及在许多其他结合试验中，根据本文所给的信息，这些试验对于本领域专业人员来说是熟知的。

例如，可以在ELISA试验中用本发明的双特异性配体。在本领域中许多类型的ELISA是熟知的，而且以常规方式实施。根据待完成的特定类型的ELISA和待检测的“抗原”(组分)可以在任何结合步骤中使用双特异性配体。因此可用所述配体包被平板，以竞争结合位点，作为提供标准曲线的抗原，作为一级结合配体，作为二级结合配体或甚至作为四级或其他结合配体。完成ELISA的许多方式都是本领域熟知的，用下文讨论的举证性方式进一步说明。

在一种ELISA形式中，将结合靶，通常是抗体本身，固定在所选的表面上，优选表现产蛋白质亲和性的表面如聚苯乙烯微滴定板。洗涤除去不完全吸附的物质后，要用非特异性蛋白质结合或包被试验平板，就试验抗血清而言，已知所述蛋白质是抗原中性的，如牛血清白蛋白(BSA)，酪蛋白或奶粉溶液。这可以阻断在固定表面上的非特异性吸附位点，因此减少因抗血清与表面的非特异性结合而引起的背景。

在这些类型的ELISA中，通常称为夹层ELISA，用平板结合的抗体“捕获”抗原。第一抗体与孔结合后，用非反应性物质包被以减少背景，洗涤除去未结合的物质，在本发明的举证性实施方案中，将固定的表面与含有待检和/或待滴定的抗原材料的试验样品以完成免疫复合物(抗原/抗体)形成的方式接触。这些实施方案对于检测临床样品或生物学提取物中的配体是特别有用的。优选用BSA，牛γ球蛋白(BGG)溶液以及磷酸缓冲的盐(PBS)和洗涤剂，如吐温稀释所述样品。

优选在25℃-37℃的温度内，将分层的抗血清保温2-4小时。保温后，洗涤抗血清接触的表面以除去未免疫复合的物质。优选的洗涤过程包括用溶液如PBS/吐温，或硼酸缓冲液洗涤。

在结合的抗原和试验样品之间形成特异性的免疫复合物后，洗涤，通过与二级特异性结合组分(通常是抗体基的组分)进行相同的复合可以确定免疫复合物的形成和数量。在具体的实施方案中，在该步骤中使用本发明的双特异性配体。然后完成其他的特异性结合和洗涤步骤。

为了提供检测方法，在本发明的举证性实施方案中，使用第三种抗体，它与可检测标记如相关的酶相连，在与适宜的产色底物保温后，将产生颜色。第三种标记的抗体对双特异性配体的组分有结合亲和性。在适宜的结合和洗涤步骤后，通过检测标记，如通过与产色底物，如脲和溴甲酚红紫或2，2’-连氮基-二(3-乙基-苯基噻唑啉-6-磺酸[ABTS]以及H₂O₂保温，以确定最终的免疫复合物。通过测量颜色产生的程度，如用可见光光谱测量仪进行定量。

用双特异性凝血配体作为二级检测试剂与上述ELISA结合有明显的优点。例如它可以利用部分双特异性配体特异性的第四种标记抗体，所述部分不同于通常击靶的典型的抗体恒定区。具体地说，可以使用双特异性构建体促凝剂部分(或促凝剂结合区)特异性的三级结合配体。检测免疫复合物形成的这种新方法有改善的特异性，这在三级抗体可以与用于包被平板的源物质交叉反应和结合，即源抗体，而不是只与所需的二级抗体结合的情况下，在夹层ELISA中是特别有用的。通过指导标记的三级组分到双特异性配体的非抗体部分，或甚至到新抗原的结合区，就可以避免非特异性结合以及不正常的高背景问题。

通过研究其凝血能力，双特异性配体的其他实践用途将是显然的。由于所有设想的化合物能够诱导凝血作用，因此，例如作为对照，在涉及凝血作用作为组成的任何试验中，都可以使用所述的化合物。在所述试验中，击靶组分的存在不会使促凝剂的实用性无效，因为各组分是独立于其他组分发挥功能的。F   组织因子结合双特异性抗体的有效应用

如前文所述，组织因子(TF)是一种能够引起血液凝集的试剂。在脉管损伤或由特定的细胞因子激活后，TF就暴露于血液中。然后将可得到的TF与VIIa因子复合以引发最终导致纤维蛋白形成的凝血级联反应。

在一个举证性实施方案中，本发明人合成了双特异性抗体，在一个抗原结合位点上，它们具有肿瘤脉管系统内皮细胞上抗原的特异性，在另一个抗原位点上，它们具有人TF细胞外区特异性。以前表明，具有人TF特异性的抗体与有高度亲和性的TF结合，而不干扰VIIa因子复合过程或TF/vIIa活性(Morrissey et al.，1988)。不用全长的人TF，本发明人使用截断形式(tTF)，它没有胞质和跨膜区。截断的TF没有凝血诱导活性，而仍能够复合VIIa因子，这可能是因为它不能与膜表面复合，其后可以组装凝血-启始复合物，包括因子X。

用于分析所述肿瘤脉管系统内皮细胞特异性击靶构建体的小鼠模型是最近建立的。模型，其中通过由肿瘤细胞分泌的IFN-γ进行诱导，而在肿瘤脉管系统上表达正常组织脉管系统中没有的MHC II型抗原(Burrowset al.，1992；Burrows&thorpe，1993)。已经表明，静脉内施用的抗II型抗体迅速定位，并强烈地对抗肿瘤脉管系统(urrows et al.，1992)。

本发明人在本文表明在带C1300(Muγ)肿瘤的小鼠中，抗-MHCII型/抗-TF双特异性抗体当与tTF一起施用时，在肿瘤脉管系统内能够特异性诱导凝血。的确，静脉内施用抗体：tTF复合物诱导肿瘤脉管系统迅速地形成血栓，并在70％的动物中有完全的肿瘤退化。仅双特异性抗体，或仅tTF，或者存在或不存在tTF时任何同型匹配的对照抗体都不能引发相同的作用。这表明B21-2/10H10双特异性抗体可以作为能够连接靶细胞和tTF的“凝血配体”以便tTF能够激活X阴性并启始凝血级联反应。还表明凝血配体在治疗固体肿瘤中成功的迹象。G   药物组合物和试剂盒

本发明的药物组合物通常含有有效量的溶解或分散在药物可接受的载体或水介质中的双特异性凝血配体。

术语“药物学或药物学可接受的”指当适宜地施用给动物或人时，不会产生不利的，过敏的或其他有害反应的分子实体或组合物。如本文所用的，“药物学可接受的载体”包括任何以及所有溶剂，分散介质，被膜，抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸附延迟剂等。将所述介质和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除到目前为止与活性成分不相容的常规介质或试剂外，可以预期其在治疗组合物中的应用。也可以将补充的活性成分掺入到所述组合物中。1   非肠道的制剂

经常将本发明的双特异性配体配制用于非肠道施用，如配制用于静脉内，肌肉内，皮下或其他这样的途径注射，包括直接注入到肿瘤或疾病位点。含有肿瘤击靶促凝剂作为活性成分的水溶液的制备方法从本发明的公开来看是本领域专业人员熟知的。通常可以将所述组合物制备成可注射的，液体溶液或悬浮液；固体形式，适用于在注射前，加入液体后制备成溶液或悬浮液；而且也可将所述制品乳化。

在水中，适宜地与表面活性剂，如羟基丙基纤维素混合可以制备活性化合物作为游离基或药物可接受的盐的溶液。还可以用甘油，液体乙二醇和其混合物和油制备分散剂。在常规的贮存和施用条件下，这些制品含有防止微生物生长的防腐剂。

适用于注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂；包括芝麻油，花生油或含水丙二醇的配方；和用于当即制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必需是无菌的，而且必需液体化到在针管中容易存在的程度。在制备和贮存条件下必需是稳定的的，而且必需防腐以能够抗微生物，如细菌和真菌的污染。

可以将双特异性配体或抗体配制成中性或盐形式的组合物。药物可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)，是与无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸，如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等形成的。可以从无机碱如氢氧化钠，钾，氨，钙或铁，以及有机碱如异丙基胺，三甲基胺，组氨酸，脯氨酸等衍生与游离羧基形成的盐。

载体可以是含例如水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂户分散介质，适宜的其混合物，和植物油。通过包被如卵磷脂，通过在分散情况下保持所需的颗粒大小，和通过施用表面活性剂可以保持适当的流动性。各种抗细菌和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸，氯代丁醇，酚，山梨酸，乙基汞硫代水杨酸钠等可以抑制微生物。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。在组合物中使用延迟吸附的试剂，如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射组合物的吸附。

将活性化合物以需要的量和各种上述其他成分一起按需要掺入到适宜的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常将各种灭菌的活性成分和上述需要的其他成分掺入到含基本分散结合介质的无菌载体中而制备分散剂。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，这得到活性成分加任何其他来自前述其无菌过滤溶液中之其他所需成分的粉末。

配制后，以与剂量配方相容的方式和治疗有效的剂量施用溶液。很容易以各种剂量形式施用制品，如上述注射溶液，但也可以使用药物释放胶囊。

本发明适宜的药物组合物通常包括根据所需的用途，一定量的符号与可接受的药物稀释剂或赋形剂，如无菌水溶液混合的双特异性配体，以得到一定范围的终浓度。制备技术通常是本领域熟知的，由Remington’sPharmaeutical Sciences，16th Ed.Mack Publishing Company，1980(该文献引入本文作为参考)来举证说明。应当理解，应当将内毒素污染保持在最小的安全水平内，如低于0.5ng/mg蛋白质。此外，对于人施用，制品应当符合按FDA署的生物标准要求的无菌，致热原性，一般安全性和纯度标准。

如在本文详细描述的研究中所表明的，用动物模型很容易确定治疗有效量(参见实施例III)。在转到临床环境前，通常用带固体肿瘤的试验动物优化适宜的治疗剂量。在预测有效抗癌策略中，已知所述模型是很可靠的。例如，在实施例III中所用的带固体肿瘤的小鼠就广泛地用于临床前试验。

本发明人已经用带C1300(Mo8)肿瘤的小鼠确定毒性范围和双特异性的最佳运转范围，以得到最佳抗肿瘤效果，而毒性最小。

目前认为，当经IV途径以每周约1次的频率施用时，治疗癌症有效剂量在约0.1mg/kg-2mg/kg之间，优选的在约0.8mg/kg-1.2mg/kg之间。根据带待治疗主体的条件，必需对剂量作出某些修改。合理施用的人在任何情况下都会决定个体的适宜剂量。在本领域中按常规完成所述优化和调整，而不用进行过分的试验。

应当记住本发明的一方面是涉及通过施用未复合的双特异性结合配体而将凝血剂传递到肿瘤位点，所述配体在肿瘤位点内从循环中积累内生凝血因子并将其浓缩。在这些情况下，所用的药物组合物将含有带有击靶和促凝剂结合区的配体，但通常是与上述相同的那些。

除非肠道施用，如静脉内或肌肉内注射化合物外，也可以制备其他药物学可接受的形式，如用于口服的片剂或定时释放的胶囊，脂质体形式等。根据待治疗的条件，也可以用其他药物制品。例如适用于治疗病理学疾病如皮炎的牛皮癣的局部制剂和用于糖尿病视网膜病的眼制剂。2   口服制剂

在一些实施方案中，可以口服施用活性化合物。这是基于药物对消化酶蛋白水解有抗性或已经产生抗性。所述化合物包括化学设计或修饰的试剂；右旋肽基试剂，脂质体制剂；和定时释放以避免肽酶和脂酶降解的胶囊制剂。

对于口服来说，可以将双特异性化合物与例如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体一起施用，或将它们包到硬或软壳的明胶胶囊中或压成片剂或制剂掺入到食物中。对于口服施用，可以将活性化合物与赋形剂混合，以口服片剂，颊剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮剂，糖浆，糯米纸囊剂等的形式使用。所述组合物和制剂应含有至少0.1％的活性双特异性促凝剂。当然所述组合物和制剂的百分比可以变化，而且方便地在约2-约60％单位重量之间变化。在所述治疗用的组合物中，活性化合物的量是得到适宜剂量的量。

片剂，锭剂，粒剂，胶囊等还可含有如下成分：结合剂，如黄蓍胶，阿拉伯胶，玉米淀粉，或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉，马铃薯淀粉，藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；可以加入甜味剂，如蔗糖，乳糖或糖精或调味剂，如薄荷，冬青油或樱桃调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除含有上述物质外，它还可以含有液体载体。

可以将各种其他物质作为涂层或修饰剂量单位的外观。例如可以用紫胶，糖或同时用两者包衣片剂，丸或胶囊。酏剂和糖浆可以含有活性化合物，作为甜味剂的蔗糖，和作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯，着色剂和调味剂，如樱桃或橙调味剂。当然，在制备任何剂量单位中所用的任何材料均应是药物学纯的并且所用的量基本上没有毒性。另外，可以将活性化合物掺入到保持释放的制剂和配方中。3   脂质体制剂

如果需要，还可以将本发明的双特异性凝血配体配制成脂质体制剂。在掺入本发明的促凝剂生产脂质体制剂时，可以使用下列信息。当分散在水中时，磷脂形成脂质体，这决定于脂与水的摩尔比。脂质体的物理特征取决于pH，离子强度和二价阳离子的存在。脂质体对离子和极性物质有低渗透性，但在温度提高时，会有一个显著改变其渗透性的相过渡。所述相过渡包括紧密堆集的，有序结构(称为胶状态)变化到松散堆集的，有序度低的结构(称为液体状态)。这会在特征性的相过渡温度发生，并导致对离子，糖和药物的渗透性提高。

除温度外，暴露于蛋白质可以改变脂质体的渗透性。一些可溶性蛋白质如细胞色素C可结合，变形并穿透双分子层，由此引起渗透性的改变。胆甾醇抑制蛋白质的这种穿透，这显然是通过磷脂更紧密的堆集引起的。用于本发明的最有用脂质体制剂含有胆甾醇或PEG。

捕获溶质的能力随不同的脂质体而不同。例如多层囊(MLV)在捕获溶质时是中度有效的，但小的单层囊(SUV)是无效的。SUV在大小分布上提供了均一性和重现性的优点，然而，用大的单层囊(LUV)可以在大小和捕获之间达到妥协。通过蒸发醚可制备这些，而且它们比MLV在溶质捕获时有效3-4倍。

除脂质体特征外，在捕获化合物中，一种重要的决定因素是化合物本身的物理化学特性。将极性化合物在水溶液空间捕获，非极性化合物与泡囊的脂双分子层结合。通过渗透，或当双分子层被破坏时释放极性化合物，但非极性化合物保持与双分子层有关，除非它通过温度或暴露于脂蛋白质而受到破坏。两种类型均在相过渡温度有最大的流出率。

脂质体经四种不同的机制与细胞相互作用：通过网状内皮相同的吞噬细胞如巨噬细胞和嗜中性白细胞的内吞作用；通过非特异性的弱疏水或静电力或通过与细胞表面组分的特异性相互作用而吸附到细胞表面；通过将脂质体的脂双分子层掺入到浆膜中，与浆细胞膜融合，同时将脂质体内含物释放到胞质中；通过将脂质体脂转移到细胞或亚细胞膜，或反之亦然，且与脂质体内含物无关。经常很难决定哪个机制在运做，且同时可有一个以上机制在运做。

静脉内注射脂质体的结果和沉积取决于其物理特性，如大小，流动性和表面电荷。它们可以在组织中保持数小时或数天，这取决于它们的组成，在血液中的半衰期从数分钟到数小时。较大的脂质体，如MLV和LUV可被网状内皮系统迅速吸收，但循环系统的生理学限制了所述大分子在大多数位点的流出。只有在有大开口或孔存在于毛细内皮中时，如肝或脾的窦状隙时，它们才能流出。因此这些器官是吸收的主要位点。另一方面，SUV有较广的组织分布，但在肝和脾中仍是高度分离的。总之，这种在体内的行为表明脂质体只在那些器官和接近其大小的组织中浓缩。由于这显然包括血液，因此这对其与本发明结合使用不是限制。

在另一实施方案中，可以将本发明的双特异性组分与脂质体表面混合以便将药物直接送到位于靶细胞表面上的特异性抗原受体处。也可以用碳水化合物决定基(在细胞-细胞识别，相互作用和粘附中起重要作用糖蛋白或糖脂细胞-表面组分)作为识别位点，因为它们有潜力将脂质体送到特定的细胞类型。主要的是利用静脉内注射脂质体制剂，但其他施用途径也是可行的。4   局部制剂

也完成了用于局部使用的双特异性促凝剂的制剂，如用在乳膏，软膏和凝胶中。制备油质的或水可溶性软膏基的方法也是本领域专业人员熟知的。例如，这些组合物可以包括植物油，动物脂肪，更优选从石油中得到的半固体烃。所用的特定组分包括白软膏，黄软膏，鲸蜡基酯蜡，油酸，橄榄油，石蜡，凡士林，白凡士林，鲸蜡，淀粉甘油，白蜡，黄蜡，羊毛脂，无水羊毛脂和单月桂酸甘油酯。

还可以使用各种水溶性软膏基，包括甘油醚和衍生物，聚乙二醇，硬脂酸-40-聚烃氧基酯和聚乙氧基醚。如果需要甚至可以通过皮肤传递，如使用跨皮斑(transdermal patches)，离子等渗疗法或电运输(Electrotransport)。

5 眼用制剂

还可以将本发明的双特异性凝血配体配制成适宜作为眼用溶液使用的药物组合物。所述眼用溶液例如可用于治疗糖尿病视网膜病。因此，为了治疗糖尿病视网膜病将本发明的双特异性共轭物以按常规制药工艺，参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”15版，p1488-1501(Mack Publishing Co.，Easton，PA)而制备的眼用制剂形式施用到需要进行治疗的患者的眼部。

眼用制剂含有占药物可接受的溶液，悬浮液或软膏的0.01-1％重，优选0.05-0.5％重的浓度的新双特异性促凝剂或其药用盐。根据所用的特定化合物，待治疗主体的症状等必需改变浓度，且负责治疗的人确定最适用于个体主体的浓度。眼用制剂优选是无菌水溶液，如果需要，还含有辅助成分，如防腐剂，缓冲液，张力剂，抗氧化剂和稳定剂，非离子湿润剂或澄清剂，增粘剂等。

在所述溶液中适用的防腐剂包括苯并烷鎓氯(benzalkoniumchloride)，苯并乙氧鎓氯(benzethonium chloride)，氯代丁醇，乙基汞硫代水杨酸钠等。适宜的缓冲液包括硼酸，碳酸氢钠和钾，硼酸钠和钾，碳酸钠和钾，乙酸钠，磷酸二氢钠等，它们以足以保持pH在约pH6-约pH8，优选在在约pH7-约pH7.5之间的量存在。适宜的张力剂是葡聚糖40，葡聚糖70，右旋糖，甘油，氯化钾，聚乙二醇，氯化钠等，眼用溶液的氯化钠相当于0.9±0.2％。

适宜的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，硫脲等。适宜的湿润剂和澄清剂包括多乙氧基醚，polysorbate 20，polyoxamer282和tyloxapol。适宜的增粘剂包括葡聚糖40，葡聚糖70，明胶，甘油，羟基乙基纤维素，羟甲基丙基纤维素，羊毛脂，甲基纤维素，凡士林，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羧基甲基纤维素等。还根据治疗的需要，用常规方法，例如以用眼滴液或浴液的形式将眼用制剂局部施用到患者的眼部。6   治疗试剂盒

本发明还提供了含有本文所述双特异性凝血配体的治疗试剂盒。所述试剂盒在适宜的容器中通常含有至少一种本发明的双特异性配体的药用配方。所述试剂盒还含有其他药用配方，如含其他双特异性凝血配体的那些，它们通常有不同的击靶组分；额外的未复合的凝血因子；用于例如抗原诱导的双特异性抗体，T细胞，或其他功能组分；用于抗原抑制的组分，如环孢菌素；不同的抗肿瘤位点抗体或免疫毒素；任何一种或多种化疗药物。

优选用于组合试剂盒的试剂是诱导剂，它们能够诱导疾病相关脉管的内皮细胞表达可击靶的抗原，如E-选择蛋白或MHC II型抗原。诱导剂可包括与疾病或肿瘤抗原结合并产生IFN-γ的T细胞克隆。优选的诱导剂包括与疾病或肿瘤细胞抗原和能够通过细胞因子的加工而诱导靶抗原表达之效应细胞结合的双特异性抗体。

因此，本发明还包括在适宜的容器中，试剂盒包括含有双特异性抗体的第一种药物组合物和含有双特异性配体的第二种药物组合物，所述双特异性抗体与效应细胞表面上激活的抗原，即单核细胞/巨噬细胞，肥大细胞，T细胞或NK细胞，以及在疾病细胞表面上抗原结合；而所述双特异性配体含有与由激活的效应细胞或其细胞因子诱导的内皮细胞抗原结合的第一结合区，其中第一结合区与凝血因子或与凝血因子结合的第二结合区可操纵相连。

优选包括第一种药物组合物的试剂盒，所述药物组合物含有与激活的抗原CD14，CD16(IgE的FcR)，CD2，CD3，CD28或T细胞受体抗原结合的双特异性抗体，而CD14或CD28结合双特异性抗体更优选。单核细胞/巨噬细胞或肥大细胞经CD14或CD16结合而得到激活，这会导致诱导E-选择蛋白的IL-1产生；而经CD2，CD3或CD28结合激活的T细胞导致诱导MHC II型的IFN-γ产生。因此，优选包含含有双特异性配体之第二种药物组合物的试剂盒，所述双特异性配体含有与E-选择蛋白或MHCII型抗原结合的第一结合区。

所述试剂盒可以只有一个容器，它含有双特异性凝血配体，同时含有或不含有任何其他组合物，或它们可以有不同的容器用于各种所需的试剂。还包括制备双特异性凝血配体所需之不同组分的试剂盒。

若以一种或多种液体溶液形式提供试剂盒的组分，则液体溶液是含水溶液，而无菌水溶液是特别优选的。然而，可以以干粉末形式提供所述试剂盒的组分。若以干粉末提供试剂或组分时，通过加入适宜的溶剂可以重组粉末。还可以将溶剂放在另一容器中。

所述试剂盒通常包括至少一种小瓶，试验试管，烧瓶，瓶，注射器或其他容器，其中可放入双特异性凝血配体和任何其他所需试剂，优选适宜的等分放置。若包括其他组分，所述试剂盒还通常含有第二个小瓶或放置它们的其他容器，以便给予公开的所需剂量。所述试剂盒还含有用于含有无菌，药用缓冲液或其他稀释剂的第二/第三个容器。

所述试剂盒还可以含有将双特异性配体施用于动物或患者的装置，如一个或多个针头或注射器，或甚至眼用滴剂或其他所述装置，用其可将制剂注射到动物中或施用于身体的疾病部位。本发明的试剂盒通常还包括含商用小瓶等和其他组分的装置，如所需小瓶和其他装置放置在注射或吹模塑料容器中。

将用下列实施例来说明本发明的优选实施方案。本领域专业人员应理解，在实施例中公开的技术代表了本发明人为很好实施本发明而公开的技术，因此认为可构成其实施的优选方式。但是，本领域专业人员应从本发明的公开中理解公开的在具体实施方案中可完成的许多改变仍可得到相似的结果，而不会偏离本发明的精神和范围。实施例  I合成双特异性凝血抗体

本发明实施例描述了合成能够特异性地将促凝剂引导到肿瘤位点的双特异性抗体，即“凝血配体”。A   材料和方法1   试剂

从Sigma Chemical Co.St.Louis MO得到胃蛋白酶(A；EC3.4.23.1)，Ellmans试剂(ER；5，5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸，DNTE)，2-巯基乙醇(2-ME)，亚砷酸钠(NaAsO₂)和兔脑凝血激酶(丙酮粉末)。从Pharmacia LKB(Piseataway，NJ)购买Sephadex G-25和G-100。2   人类截断的组织因子(tTF)

用两种不同方法中的一种制备重组人类截断的TF(tTF)。方法I：构建大肠杆菌表达载体。用PCR扩增编码tTF的cDNA(1-218残基)，使用的引物是5’-5′-GAAGAAGGGATCCTGGTGCCTCGTGGTTCTGGCACTACAAATACT-3′

(5’-引物；SEQ ID NO：28)和5′-CTGGCCTCAAGCTTAACGGAATTCACCTTT-3′(3’-引物；SEQ ID NO：29)，它们可以加入cDNA凝血酶裂解位点上游的编码序列。用BamHI和HindIII裂解PCR产物，然后连接在表达载体pTrcHisC(Invitrogen)的BamHI和HindIII位点之间。

用裂解连接混合物转化DH5α细胞，在存在氨苄青霉素的条件下筛选后，分离重组质粒。用重组质粒pTrcHisC-tTF转化大肠杆菌株BL21，用所得的转化体进行蛋白质表达。方法I：从大肠杆菌中表达，重折叠并纯化tTF。使用经pTrc-HisC-tTF转化的BL21细胞表达多聚(his)-tTF融合蛋白。使接种培养基(在LB培养基的10ml)在37℃振荡过夜。

将接种培养基加到生长培养基中，然后在37℃振荡生长。当在550nm的光密度达到ca.0.5时，加入10ml100mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷。在37℃继续振荡培养基ca.20小时(到稳定期)。

离心(10000xg，20分钟)收集细胞，按如下分离包涵体(试剂的量以每g细胞浆计)。将细胞浆悬浮在4ml10mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，1mM MgCl₂，0.17mg/ml PMSF，2单位母鸡蛋白溶菌酶(Sigma)中。加入benzonase(250单位，EM Science)，将悬浮液在室温缓慢混合1.5小时，然后以12000g离心15分钟。

将小球重悬在10mM Tris，pH7.5，1mMEDTA，3％NP40(20ml)，以50％的力声波处理1分钟，以12000xg离心20分钟。将小球重悬在水中，以50％的力声波处理20-30秒钟，以12000xg离心20分钟。重复水洗涤，通过在室温过夜缓慢混合，将最后高度富集包涵体的小球悬在6M盐酸胍，0.5M NaCl，20mM磷酸盐，10mMβ-巯基乙醇，pH8.0(每g包涵体9ml)中。

将悬浮液以2000xg离心20分钟，然后将上清液载到腈乙酸镍(Ni-NTA，Quigen)柱上。用pH8然后是pH7的相同的6M乙酸胍缓冲液连续洗涤所述柱，然后通过将pH降到4而洗脱蛋白质。

收集含融合蛋白的Ni-NTA柱馏分，然后加入二硫苏糖醇到50mM。将所述溶液在室温过夜保持，然后用6M脲，50mMTris，0.02％叠氮化钠，pH8.0将蛋白质浓度稀释到ca.1mg/ml，于4℃用10-20体积的相同缓冲液透析。将缓冲液换成2M脲，50mM Tris，300mM NaCl，2.5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，0.02％叠氮化钠，pH8.0(折叠缓冲液)。再继续透析2天，用新鲜的折叠缓冲液代替所述缓冲液，然后再继续透析2天。

然后用20mMTEA(pH7.5)广泛地透析所述溶液，从透析袋中取出，用人凝血酶(ca.每500份重组蛋白用1份，w/w)在室温过夜处理，然后负载到HR-10/10mono-Q阴离子交换柱上。用含NACl的20mMTEA缓冲液洗脱tTF蛋白质，所述NACl的浓度从0-150mM在30分钟内线性增加(流速为3ml/分钟)。方法II：制备tTF互补DNA(cDNA)。用来自J-82细胞(人膀胱癌)的RNA克隆tTF。用GlassMax^TM RNA微分离试剂(Gibco BRL)分离总RNA。用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer)将RNA反转录成cDNA。用下列引物，相同的试剂盒扩增tTF cDNA。5’引物：  5′GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG CTT

CTG GCA CTA CAA ATA CT3’引物：  5′TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT(SEQ ID NO：2)

划线的序列编码tTF的N-末端和C-末端。5’引物中剩余的序列是NcoI的限制位点，用于将tTF克隆到表达载体中，并编码凝血酶的裂解位点。3’引物中的序列是HindIII位点，用于将tTF克隆到表达载体中。按制造商的说明完成PCR扩增。简而言之，用75μM dNTP；0.6μM引物，1.5mM MgCl₂，在95℃30秒，55℃30秒，在72℃30秒完成30个循环。方法II。载体构建体。用大肠杆菌表达载体H₆ pQE-60表达tTF(Lee etal.，1994)。将PCR扩增的tTF cDNA插入到NcoI和HindIII位点之间。H₆ pQE-60有一内插的(His)₆编码序列以便表达的蛋白质在N-末端有一(His)₆序列，可以在Ni-NTA柱上纯化。方法II：tTF纯化。将含H₆ pQE-60DNA的tTF转化到大肠杆菌TG-1细胞中。使细胞生长到OD₆₀₀＝0.5，将IPTG加到30μM以诱导tTF生产。在30℃振荡培养18小时后收集细胞。用6MGu-HCl将细胞小球变性，然后将溶解产物负载到Ni-NTA柱(Qiagen)上。用6M脲洗涤结合的tTF，在室温用6M-1M脲梯度将tTF重折叠16小时。用洗涤缓冲液(0.05NaH₂PO₄，0.3M NaCl，10％甘油)洗涤柱，然用在洗涤缓冲液中0.2M咪唑(imidozode)洗脱tTF。

浓缩洗脱的tTF，然后负载到G-75柱上。收集tTF单聚体，用凝血酶处理以除去H₆肽。这通过将1份凝血酶加入到500份tTF(w/w)中而完成，在室温裂解18小时。通过使混合物通过苯并脒Sepharose 6B凝血酶亲和柱(Pharmacia)而tTF除去凝血酶。

所述tTF与来自酵母或中国仓鼠卵巢细胞的重组tTF有相同的能力，均能结合VIIa因子并提高VIIa因子的催化能力(Ruf et al.，1991)。当用在十二烷基磺酸钠中的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时，它可以跑出分子量约为24 KD的单组分。3   单克隆抗体

从ATCC得到B21-2(TIB-229)杂交瘤和SFR8-B6杂交瘤(HB-152，下文称为SFR8)。两种杂交瘤均分泌大鼠IgG2b抗体，所述抗体是用蛋白质G亲和层析从培养上清液中纯化的。B21-2抗体与在A20细胞以及在C1300(Muγ)转染肿瘤的脉管系统上表达的I-A^d抗原反应，所述肿瘤是在BALB/c/nu/nu小鼠中生长的。SFR8抗体抗HLA-Bw6表位，并作为B21-2抗体的同型匹配的负对照。

TF9/10H10(称为10H10)，小鼠IgGL与人TF反应而不影响TF/VIIa因子活性，并按Morrissey等人(1988)所述生产。

细胞系MRC OX7(称为OX7)从A.F.Williams(MRC CellularImmunology Unit，University of Oxford，Oxford，England)博士处得到。它分泌OX7抗体，识别在T淋巴细胞上的Thy1.1抗原的小鼠IgG1抗体。用它作为TF9/10H10的同型匹配负对照。

所有抗体均是通过蛋白质G亲和层析从培养上清液中纯化的。4   合成双特异性抗体

在37℃用2％(w/v)胃蛋白酶消化它们的反应性IgGs5-9小时而得到F(ab’)₂片段，然后用Sephadex G100层析纯化。按照Brennan等人(1985)的方法，稍作修改，来合成双特异性抗体B21-2/10H10，SFR8/10H10和B21-2/OX7。

按照Breunan等人(1985)的方法，稍作修改，来合成双特异性抗体B21-2/10H10，SFR8/10H10和B21-2/OX7。总之，通过用胃蛋白酶消化而从IgG抗体得到F(ab’)₂片段，然后用Sephadex G100层析纯化至均一。用在0.1M磷酸钠缓冲液，pH6.8中的5mM2-巯基乙醇还原F(ab’)₂片段，所述缓冲液含1mMEDTA(PBSEhchy)和9mMNaAsO₂。加入Ellman试剂(ER)以得到25mM的终浓度，在20℃3小时后，将Ellman-衍生的Fab’片段(Fab’-ER)在Sephadex G25柱上用PBSE与未反应的ER分离。

为了形成双特异性抗体，将从一种抗体衍生的Fab’-ER在超滤细胞中浓缩到2.5mg/ml，然后在20℃用10mM巯基乙醇还原1小时。将所得的Fab’-ER在Sephadex G25柱上用PBSE过滤，然后与等摩尔来自第二种抗体的Fab’-ER混合。通过超滤将混合物浓缩到约3mg/ml，然后在20℃搅拌16小时。将反应产物在Sephadex G100柱上分离，将含双特异性抗体的馏分(110kDa)浓缩到1mg/ml，然后于4℃用0.02&叠氮化钠贮存。B   结果1   分析双特异性抗体

通过使用Pharmacia  LKB-Phastsystem(Pharmacia  LKB，Piscataway，NJ)，用4-15％梯度凝胶，通过SDS-PAGE电泳，确定F(ab’)₂片段和双特异性制剂的分子量。用FACS分析(实施例II)确定双特异性以及异二聚体对同二聚体的百分比。

通过SDS-PAGE电泳(以及FACS，实施例II)分析双特异性抗体表明B21-2/10H10双特异抗体含少于4％任何一种来源的同二聚体，和＜10％的片段，该片段分子量为140KD或55KD。约10％的制剂含有140KD片段，可能是粘附有额外轻链(任何一种来源)的构建体。实施例II凝血抗体的体外结合和功能

本实施例表明了凝血抗体(凝血配体)的双特异性，而且表明了特异性结合，用所述凝血配体在体外进行细胞传递和凝血作用。A   材料和方法1   细胞

从美国典型微生物保藏中心(ATCC，Rockville，MD；TIB-208)购买A20细胞系，它是I-A^d阳性BALB/c B细胞淋巴瘤。使A20细胞在用10％(v/v)胎牛血清(FCS)，0.2mML-谷氨酰胺，200单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素，18mM Hepes，0.1mM非必需氨基酸混合物和1mM丙酮酸钠补充的DMEM(下文产物完全DMEM；所有试剂均是从LifeTechnologies，Gaitherburg，MD得到的)上生长。将2-ME加到完全DMEM中，A20细胞的终浓度为0.064mM。在90％空气/10％CO₂的潮湿环境中，于37℃保持培养物。

从ATCC得到J82，表达TF的人胆囊癌(HTB-1)。使细胞在完全DMEM中粘附生长。

从自发肿瘤中建立C1300成神经细胞瘤，它是在A/Jax小鼠(Dunham& Stewart，1953)中产生的。通过使用IFN-γ表达反转录病毒pSVX(Muγ△As)  (Watanabe et al.，1989)的鼠IFN-γ基因转染C1300成神经细胞瘤细胞衍生C1300(Muγ)12系，下文称为C1300(Muγ)。从Y.Watanabe博士(日本东京大学分子微生物学系)处得到IFN-γ表达反转录病毒。

将C1300(Muγ)12细胞保持在用10％(v/v)胎牛血清(FCS)，2.4mM L-谷氨酰胺，200单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素，0.1mM非必需氨基酸混合物，1mM丙酮酸钠，18μM Hepes和1mg/mlG418(Geneticin；Sigma)补充的Dulbecco’s改性的Eagle培养基(DMEM)中。在37℃，90％空气/10％CO₂的潮湿环境中保持培养物。

从MacLennan教授(英国伯明翰大学试验病理学系)处得到Thy1.1-表达AKR-A小鼠T淋巴瘤细胞系，然后使其在完全DMEM中生长。2   间接免疫荧光

将A20细胞以4×10⁶个细胞/ml重悬在PBS/0.2％BSA/0.02％叠氮化钠(下文称为FACS缓冲液)。在缓和的条件下，用PBS/EDTA(0.2％w/v)将J82细胞从烧瓶中释放出来，然后以4×10⁶个细胞/ml重悬在FACS缓冲液中。将50μl的细胞悬浮液加到50μl最佳系列稀释的一级抗体中，所述抗体在圆底的96孔平板中的孔中。在RT保温15分钟后，用FACS缓冲液将细胞洗涤3次。除去最后的上清液后，将与荧光素异硫氰酸盐(FITC)共轭的50μl二级抗体，以1∶20用FACS缓冲液稀释，加到细胞中。在RT将细胞再保温15分钟，然后用FACS缓冲液洗涤3次。用FACScan(Becton  Dickenson，Fullerton，CA)测量与细胞有关的荧光。用Lysis II程序分析数据。当用FITC-抗-大鼠免疫球蛋白作为二级抗体时，加入正常小鼠血清(10％v/v)以阻断与小鼠细胞的非特异性交叉反应。3   蛋白质的放射性标记

按Mason & Williams(1980)描述的氯胺T方法(方法2)标记蛋白质与¹²⁵I。在G25上纯化碘化的产物，然后，于-70℃贮存，若是单克隆抗体，则在存在5％DMSO和5mg/ml牛IgG的条件下，若是tTF，则条件是5％DMSO和5mg/ml BSA。比活性的范围在2.5μCi/μg-4.8μCi/μg之间。4   结合研究

按Mason & Williams(1980)描述的氯胺T方法(方法2)标记蛋白质与¹²⁵I以使比活性为2.5-4.8μCi/μg之间。将在PBS中的A20细胞以2×10⁶个细胞/ml分散在50μl体积96孔圆底微滴定板的孔中，所述PBS含有2mg/ml和0.02％叠氮化钠。向孔中加入在相同缓冲液中，有一定浓度范围(8-0.02μg/ml)的25μl双特异性抗体。

将在相同缓冲液中，8μg/ml的25μl¹²⁵I-tTF加到各孔中，tTF过量。在4℃将平板振荡并保温1小时。然后用含2mg/ml BSA的0.9％(w/v)NaCl将平板中的细胞洗涤3次。将孔中的物质吸出，与邻苯二甲酸二丁酯和双(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯油的10∶11混合物一起放到微离心管中。然后将所述试管以7500g离心1.5分钟，然后在液氮中猝冷。切掉含细胞的尖。用γ计数器测量在细胞小球和上清液中的放射性。5   凝血试验

在相同的条件下，使用与上述结合试验相同的微平板，除加入未标记的tTF代替¹²⁵I-tTF外。在4℃保温1小时后，按前述将细胞洗涤3次，然后重悬在75μl含2mg/ml BSA和12.5mMCaCl₂的0.9％NaCl中。将孔中的物质转移到5ml干净的塑料试管中，然后到热到37℃。在37℃，向各试管中加入30μl柠檬酸化的小鼠血浆。记录第一条纤维蛋白链形成的时间。B   结果1   抗体双特异性

通过使用J82细胞(TF阳性)作靶细胞和用FITC-抗-小鼠免疫球蛋白的FACS说明SFR8/10H10的双特异性。用FITC-抗-小鼠免疫球蛋白说明SFR8的存在。平均荧光强度-浓度曲线与两种菌株的均一致，说明在双特异性制剂中均存在小鼠和大鼠臂。2   抗体结合

用¹²⁵I标记的B21-2Fab’和SFR8 Fab’的结合研究表明，21.5nM是B21-2Fab’与A20细胞结合的饱和浓度。与A20细胞非特异性结合的SFR8 Fab’，每细胞结合的分子数量，在21.5nM低于50000，而B21-2Fab’的是530000。3   促凝剂传递和限制

与对照抗体相比，以研究通过B21-2/10H10双特异性抗体tTF与A20细胞桥接的能力，将A20细胞与双特异性抗体和所示浓度的¹²⁵I-tTF一起保温。当tTF的平均310000个分子与每个A20细胞结合时，在双特异性抗体浓度为10nM(1μg/ml)或更高时达到饱和。由于通过同型匹配的对照双特异性抗体，SFR8/10H10或B21-2/OX7没有介导tTF结合，所以结合是特异性的，所述对照抗体只有限制tTF所需的两种特异性中的一种(图1)。4   凝血作用

通过双特异性抗体研究tTF与A29细胞的结合是否能够诱导凝血作用，本发明人首先将A20细胞与21.5nM的双特异性抗体和69mM tTF保温。对凝血时间的影响结果列在表VII中。这些第一次研究表明用B21-2/10H10和tTF复合物包被的A20细胞能够诱导纤维蛋白形成：它将凝血时间从140秒(在所用的具体条件下，不加入抗体或TF时小鼠血浆在CaCl₂中凝血的时间)缩短到60秒。相反，对照双特异性抗体不诱导凝血的活化作用：在这些情况下，凝血时间是140秒。

后来的研究证明并扩展了开始的结果。加到tTF已经用B21-2/10H10限制的A20细胞中的小鼠血浆迅速凝集。在加入血浆后36秒看见纤维蛋白链，而加到未处理的A20细胞中的血浆用164秒(表VII)。只有抗tTF被限制到细胞上后，才诱导凝血作用：用仅与tTF，同二聚体F(ab’)₂，Fab’片段或仅有限制tTF所需之两种特异性中的一种的双特异性抗体保温的细胞，对凝血时间没有影响。

在限制于各A20细胞的tTF分子平均数量的对数和那些细胞诱导小鼠血浆凝集的迅速性之间有线性关系(图2)。带300000个tTF分子/细胞在40秒内诱导那些作用，但甚至用20000个分子/细胞的凝血作用也比用未处理的细胞的(190秒)显著快。表VII  用双特异性抗体将tTF限于A20细胞诱导的小鼠血浆的凝血作用

加入的试剂¹            凝血时间²(秒)

无                       164±4

B21-2/10H10+tTF          36±2

B21-2/10H10              163±2

tTF                      163±3

B21-2/OX7+tTF            165±4

SFR8/10H10+tTF           154±5

10H10F(ab’)₂+tTF       160±3

10H10Fab’+tTF           162±2

B21-2F(ab’)₂+tTF       168±4

B21-2Fab’+tTF           165±4

在4℃，0.2％叠氮化钠中，将双特异性抗体F(ab’)₂和Fab’片段(0.33μg/10⁵细胞/100μl)和tTF(0.17μg/10⁵细胞/100μl)与A20细胞保温。洗涤细胞，加热到37℃，加入钙和血浆，记录第一条纤维蛋白链形成的时间。三个值的算术平均±标准误差实施例  III体内特异性肿瘤脉管系统特异性的凝血作用

本实施例描述体内肿瘤脉管系统的特异性凝血作用，这是在施用双特异性抗体后，凝血配体作为人组织因子的传递载体而产生的。A   材料和方法1   试剂

通过心穿刺得到小鼠血，然后收集在1/10体积3.8％缓冲的柠檬酸盐中。以3000g将血液离心10分钟，然后将血浆以小等份猝冷，于-70℃贮存。2   动物

从Simonsen(Gilroy，CA)得到BALB/c nu/nu小鼠，然后在SPF条件下保持。3   C1300(Muγ)小鼠模型和治疗

肿瘤模型是以前描述的(Burrows et al.，1992；Burrows &Thorpe，1993)，但有三处改变。第一，使用了不同的抗体，B21-2。该抗体识别I-A^d，但不识别I-E^d，不象以前用的均识别这两种分子的M5/114抗体。B21-2抗体在亲和性上比M5/114约大10倍。第二，使用以前用的C1300(Muγ)12系的亚系，是在BALB/cnu/nu小鼠中继续生长的。将以前用的C1300(Muγ)12细胞与未转染的C1300细胞混合以形成继续生长的肿瘤。新的亚系，称为C1300(Muγ)t1P3，在下文将称为C1300(Muγ)。第三，不需将四环素加到小鼠的饮用水中来防止肠细菌在胃肠内皮上诱导I-A^d。与免疫毒素不同，凝血配体不会损伤表达I-A^d的肠内皮。

为了建立固体肿瘤，将1.5×10⁷C1300(Muγ)皮下注射到BALB/cnu/nu小鼠的右前肋。当肿瘤的直径为0.8cm时，将小鼠随机分成每组含7-8只小鼠的不同治疗组。

在总体积2.5 ml0.9％^NaCl中，混合双特异性抗体(140μg)和tTF(110μg)而制备凝血配体，然后将其在4℃放1小时。然后往小鼠静脉内注射0.25ml的该混合物(即14μg的双特异性抗体+11μgtTF)。其他小鼠仅接受14μg的双特异性抗体或11μg的tTF。在约45秒内缓慢注射到尾静脉内，然后第二次将200μl盐注射到相同的静脉内。如果快速注射(1-2秒)就会看到尾静脉的血栓形成，而用这种注射方法就不会形成血栓。7天后，重复治疗。

以规则的间隔测量垂直肿瘤的直径，按下列等式估算肿瘤体积：体积＝较小的直径2×较大的直径×π/6

通过用Mann-Whitney-Wicoxon非参数试验对两个样品进行检测以测定肿瘤体积差异的统计学显著性(Gibbons，1976)。

为了进行组织病理学分析，在治疗后的不同时间用甲氧氟烷麻醉动物，用肝素化的盐通过灌注放血。静脉内注射500 IU的肝素，用甲氧氟烷麻醉动物，用PBS以0.6mls/分钟的流速灌注全身循环系统，直到将肝的血液清除干净。切出肿瘤和正常组织，然后用福尔马林固定(4％v/v)。切组织的石蜡切片，用标准Martius Scarlet Blue(MSB)三色技术染色以检测纤维蛋白，然后用苏木精和曙红染色进行细胞形态学分析。B   结果1   改进的肿瘤模型

为了改进前述的C1300(Muγ)肿瘤模型(Burrows et la.，1992)，本发明人将C1300(Muγ)细胞系亚克隆到不与其亲本细胞，C1300混合就可生长，但仍在肿瘤内皮细胞上表达I-A^dMHC II型抗原的细胞系。本发明人使用抗-I-A^d抗体(B21-2)，它比在该模型原始采用的抗-I-A^d抗体(M5/114.15.2)的对其抗原的亲和性高5-10倍，是用FACS确定的。用该新抗-I-A^d抗体进行体内分布研究表明与M5/114.15.2有相同的组织分布图。在肿瘤脉管内皮中，见到了用B21-2的强烈染色，在肝星形细胞，脾的边缘区和小和大肠中的某些区域中有轻到中度染色。在其他正常组织的血管没有被染色。2   确定适宜的体内剂量

静脉内注射到小鼠尾静脉的最大耐受剂量是16μgB21-2/10H10+11μgtTF。在该剂量，小鼠的体重不会减轻，而且有正常的外表和活动水平。在20μgB21-2/10H10+16μgtTF的较高剂量，10只中的2只小鼠最终消除了局部皮出血。用较低的剂量进行体内研究。静脉内施用50μg时，截断的TF本身没有毒性。3   在肿瘤脉管系统的特异性凝血和梗塞

静脉内施用由B21-2/10H10(20μg)和tTF(16μg)组成的凝血配体给带有固体C1300(Muγ)肿瘤的小鼠会在30分钟内引起肿瘤呈现变黑的，皮下出血现象。在注射凝血配体后30分钟，肿瘤内过程的时间组织学研究表明，在所有肿瘤区内的所有血管都形成了血栓(图3)。血管中有血小板聚集，堆集的红细胞和纤维蛋白。此时，肿瘤细胞是健康的，在形态学上明显不同于在未处理小鼠中的肿瘤细胞(图3A)。

在4小时末，肿瘤细胞破坏的迹象明显。大部分肿瘤细胞开始与其他细胞分开，而且形成致密的核(图3C)。在肿瘤间隙间均能观察到红细胞。在24小时末，在肿瘤内可见发展的肿瘤坏死(图3D)。在72小时末，肿瘤的完整中心区域形成了形态学不同的碎片。

在检测的3个肿瘤中的一个中，在肿瘤的外围，见到5-10层厚的可见的肿瘤细胞边缘，损伤外围渗入周围正常组织中。相同肿瘤系列切片的免疫组织化学检测表明，肿瘤渗入区中的血管没有II型抗原。

对照小鼠的肿瘤只接受B21-2/10H10双特异性抗体(20μg)，注射30分钟后24小时前没有梗塞迹象。只接受tTF或与B21-2/OX7或SFR8/10H10结合的小鼠的肿瘤在注射后30分钟，没有梗塞的迹象，但在注射24小时后，在肿瘤中的极少血管(约20％的血管)内有梗塞。其在肿瘤的核中最普遍。

在施用凝血配体或tTF后的30分钟，4小时和24小时，带肿瘤小鼠的肝，肾，肺，肠，心，脑，肾上腺，胰腺和脾的石蜡切片中没有见到血栓或形态不正常。4   固体肿瘤的肿瘤退化

图4表明代表性抗肿瘤研究的结果，其中将由B21-2/10H10和tTF组成的凝血配体施用给有0.8cm直径的肿瘤的小鼠。肿瘤退化到其肿瘤前大小的一半。在重复治疗的第7天，肿瘤进一步退化，通常是完全退化。在5/7的动物中，有完全退化。在4-6个月后，2只小鼠复发。当与所有其他组比较时，中心抗治疗效果在统计学上有高显著性(P＜0.001)。

只用tTF或用与tTF同型匹配的双特异性抗体，SFR8/10H10或B21-2/OX7治疗的小鼠中的肿瘤，其生长比只接受抗体或稀释剂组中的那些更缓慢。在12-14天，中心差异在统计学上是显著的〔P＜0.05〕。因此，用B21-2/10H10凝血配体见到的部分抗肿瘤作用可归因于tTF本身的轻微非特异性作用。

在研究结束时，给2只用稀释剂治疗过的并有很大的2.0cm³和2.7cm³肿瘤(即其体重的10-15％)的小鼠进行凝血配体治疗。2个肿瘤均完全减小，尽管后来，在肿瘤生长的原位点又长出了肿瘤。C   讨论

本发明的研究表明可溶性人tTF(实践上没有能力诱导凝血作用)，当用肿瘤内皮细胞双特异性抗体击靶时，成为用于肿瘤脉管系统的有力凝血酶原。体外那些研究表明tTF血栓形成活性的恢复是通过其与细胞表面上的抗原交联而介导的。

tTF以高亲和性结合VII和VIIa因子，并提高了VIIa的催化活性，但不会诱导血浆的凝血作用，因为tTF：VIIa复合物必须是与膜表面相关的，这样才能有效激活IX和X因子(Ruf，et al.，1991；Krishnaswamy etla.，1992)。利用双特异性抗体将tTF：VIIa限制于细胞表面，通过将tTF：VIIa带到膜附近而恢复了其诱导凝血的能力：膜磷脂提供了表面，在其上，含有IX或X因子的凝血-启始复合物可以组装，然后有效地产生凝块过程中的中间产物。

该带II型-表达脉管系统之肿瘤的小鼠施用抗II型的凝血配体会迅速在肿瘤内引起相关的血栓形成。然后在大部分动物中产生肿瘤的梗塞和完全的肿瘤退化。在没有完全退化的动物中，肿瘤从肿瘤外周的肿瘤细胞存活边缘又长出来，其中肿瘤外周已渗入到周围正常组织中。在肿瘤生长边缘的血管没有II型抗原，因此解释了用凝血配体不能使中心血管产生血栓形成。看来这些存活的细胞已经被作用于肿瘤细胞本身的共施用药物杀死，如以前发现的(Burrows & Thorpe，1993)。

凝血配体的抗肿瘤作用相似于用免疫毒素在相同肿瘤模型中得到的，损伤免疫毒素是由抗II型抗体和去糖基化的蓖麻毒素A链组成的(Burrows & Thorpe，1993)。两种试剂之间的一个区别就是其作用速度。凝血配体诱导肿瘤血管的血栓形成不超过30分钟，而免疫毒素要花6小时才能达到相同的作用。免疫毒素作用更慢是因为血栓形成是因关闭蛋白质缓冲而引起的内皮细胞损伤的二级作用结果。

免疫毒素和凝血配体之间第二个且重要的区别是它们有不同的毒性副作用。免疫毒素引起II型-表达胃肠内皮致死性破坏，重复施用抗生素可以抑制肠细菌的II型诱导作用。凝血配体不会引起胃肠损伤，如预期的，在血液外没有凝块因子，但以高剂量施用时，在个别小鼠种会引起凝血病理。

在该报告中描述的发现表明了人凝血-诱导蛋白质击靶肿瘤脉管系统的治疗潜力。为了进行临床应用，就需要抗体或其他配体需与固体肿瘤脉管内皮细胞表面存在的分子结合，而所述分子不存在于正常组织的内皮细胞上。通过治疗衍生的血管生成因子(Folkman，1985)或细胞因子(Burrows et al.，1991；ruco et al.，1990〔可以直接诱导治疗内皮标记，或以新脉管形成过程中，内皮细胞的迅速组织(Denekamp & Hobson，1982)和迁移(Folkman，1985)有关。

已经描述了数种候选抗体。抗endoglin的抗体TEC-11是一个具体的实例，它选择性地与人肿瘤内皮细胞结合。

其他抗体包括抗内皮唾酸蛋白的FB5(Rettig et al.，1992)，抗endoglin样分子的E-9(Wang et la.，1993)，抗纤连蛋白异构体的BC1(Carnemolla et la.，1989)和抗骨肉瘤相关抗原的TP-1和TP-3(Bruland et la.，1988)。已经报告CD34在迁移内皮细胞上和肿瘤和胎儿组织中出芽毛细血管的ablumina过程中向上调节(Schlingemann etal.，1990)。脉管内皮细胞生长因子(VEGF)受体在肿瘤血管内向上调节(Plate et al.，1993；Brown et  al.，1993)，可能是应答氧不足(Thiemeet al.，1995)，而且在肿瘤血管内选择性浓缩VEGF(Dvorak etal.，1991)。

建议凝血-诱导蛋白质靶向肿瘤和其他肿瘤内皮细胞标记而诱导肿瘤梗塞是治疗固体肿瘤有价值的新方法。具体是将人(或人化)抗体与人凝血蛋白质偶联产生全人凝血配体，因此可以重复治疗过程以抑制初级肿瘤和其转移瘤。实施例  IV合成截断的组织因子(tTF)构建体

本文将tTF称为成熟组织因子蛋白质的细胞外区(成熟蛋白质的氨基酸1-219；SEQ ID NO：23)。SEQ ID NO：23由例如SEQ ID NO：22编码。A   H₆〔tTF〕

H₆ Ala Met Ala〔tTF〕。按如下制备tTF互补DNA：用来自H-82细胞(人膀胱癌)的RNA克隆tTF。用GlassMax^TMRNA微分离试剂(Gibco BRL)分离总RNA。用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkinelmer)将RNA转录成cDNA。用相同的试剂盒扩增tTF cDNA，用下列两种引物：5’引物：5’GTC ATG CCA TGG CCT CAG GCA CTA CAA(SEQ IDNO：1)3’引物：5’TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT(SEQ ID NO；2)

划线的序列编码tTF的N-末端。在5’引物中的剩余序列是NcoI的限制位点，可以将tTF克隆到表达载体中。在3’引物中的序列是将tTF克隆到表达载体中的HindIII位点。按制造商说明完成PCR扩增。总之，用75  uMdNTP；0.6 uM引物，1.5 mM MgCl₂，在95℃30秒，在55℃30秒，在72℃30秒完成30个循环。

用大肠杆菌表达载体H₆pQE-60表达tTF(Lee et al.，1994)。将PCR扩增的tTF cDNA插入到NcoI和HindIII位点之间。H₆pQE-序列有内插的(His)₆编码序列以便表达的蛋白质在N-末端有(His)₆，它可在Ni-NTA柱上纯化。

为了纯化tTF，将含H₆pQE-60 DNA的tTF转化到大肠杆菌TG-1细胞中。使细胞生长到OD₆₀₀＝0.5，加入IPTG，达到30 uM，以诱导tTF生产。在30℃振荡18小时后，收集细胞。用6M Gu-HCl变性细胞沉淀，将溶解产物负载到Ni-NTA柱上(Qiagen)。用6M脲洗涤结合的tTF，用6M-1M梯度的脲在室温将tTF再折叠16小时。用洗涤缓冲液(0.05NaH₂PO₄，0.3M NaCl，10％甘油)洗涤所述柱，用在洗涤缓冲液中的0.2M味唑(Imidozole)洗脱tTF。浓缩洗脱的tTF，然后负载到G-75柱上。收集tTF单聚体。B   tTF

Gly(tTF)。用在前面节中描述的相同方法制备GlytTF互补DNA(cDNA)，除PCR中用下列引物代替5’引物。5’引物：5’GTC ATG CAA TGG CCC TGG TGC CTC GTG CTT CTGGCA CTA CAA ATA CT(SEQ ID NO：3)

划线的序列编码tTF的N-末端。剩余的序列编码NciI限制位点，它是凝血酶的裂解位点。

H₆pQE-60表达载体和蛋白质的纯化方法与上述的相同，除用凝血酶处理最终的蛋白质产物以除去H₆肽外。通过将1份凝血酶(Sigma)加到500份tTF(w/w)中而完成，在室温经18小时完成裂解。使混合物通过苯并脒Sepha rose 6B凝血酶亲和柱(Pharmacia)而从tTF中除去凝血酶。C   半胱氨酸修饰的tTF

用N或C-末端半胱氨酸修饰tTF构建体以便更早地通过二硫键共轭衍生的抗体。

H₆C〔tTF。按前述制备所述DNA，除在PCR中用下列引物代替5’引物外。5’引物：5’GTC ATG CCA TGG CCT GCT CAG GCA CTA CAA ATACTG TG(SEQ ID NO：4)

所有过程均与上述一致，除用可交换的氧化/还原剂保护N-末端cys外。

C〔tTF〕。Gly ser Cys〔tTF2-219〕。按前述制备所述DNA，除在PCR中用下列引物代替5’引物外。5’引物：5’GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTTGCG GCA CTA CAA ATA CT(SEQ ID NO：5)

载体构建体和蛋白质纯化与用于(His)₆Ala Met Ala Cys(tTF)构建体的相同，除用凝血酶进行处理以除去上述(His)₆外。

H₆〔tTF〕C。(His)₆Ala Met Ala Cys(tTF)Cys。用在(His)₆AMA〔tTF〕中描述的相同方法制备DNA，除用下列引物代替3’引物外。3’引物：5’TGA CAA GCT TAG CAT TCT CTG AAG TCC CCC TTTCT(SEQ ID NO：6)

划线的序列编码tTF的C-末端。剩余的序列含有用于将tTF克隆到表达载体中的HindIII限制位点。

所有过程均与在tTF节中描述的相同，除在6 MGu-HCl变性溶液中用10mMβ-ME，并用可交换的氧化/还原剂保护C-膜半胱氨酸外。

用相同的方法制备其他〔tTF〕Cys单聚体，如〔tTF1-220〕Cys，〔tTF1-221〕Cys和〔tTF1-222〕Cys。D   C接头〔tTF〕

再构建C接头〔tTF〕，Gly-Ser-Cys-(Gly)₄-Ser-(Gly)₄-Ser-(Gly)₄-Ser-〔tTF〕。按如下用两步PCR方法制备cDNA：

PCR1：扩增接头DNA

用下列引物扩增编码NcoI位点，凝血酶裂解位点，半胱氨酸，接头和tTFN-末端的cDNA：5’引物：5’GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT GCGGA GGC GGT GGA TCA GGC(SEQ ID NO：7)3’引物：5’AGT ATT TGT AGT GCC TGA GGA TCC GCC ACC TCCACT(SEQ ID NO：8)

划线的序列编码连接肽。在PCR中所用的DNA模板是编码下列接头的双链DNA。序列：GGA GGC GGT GGA TCA GGC GGT GGA GGT AGT GGAGGT GGC GGA TCC(SEQ ID NO：9)

按在tTF节中的描述用相同的PCR条件。将95bp扩增产物与PCR2中的tTF DNA连接。

PCR2：将Cys-连接DNA与tTF DNA相连。在PCR中所用的DNA模板是两个重叠的DNA：来自上述PCR1的95 bpDNA和tTFDNA。所用的引物是下列引物：5’引物：5’GTC ATG CCA TGG CCC TG(SEQ ID NO：10)3’引物：5’TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT(SEQ ID NO：11)

用NcoI和HindIII消化740 bp的最终PCR产物，然后插入到在tTF节中的H₆pQE 60中。

载体构建体和蛋白质纯化方法均与在C〔tTF〕节中描述的相同。实施例  V合成二聚组织因子

本发明人认为，在启始凝血方面，组织因子二聚体可能比单聚体更有效。这可能是因为在J82膀胱癌细胞表面上的天然组织因子可能作为二聚体而存在(Fair et al.，1987)。一个VII或VIIa因子分子与一个组织因子分子的结合可促进另一VII或VIIa因子与另一组织因子的结合(Fair etal.，1987；Bach et al.，1986)。此外，组织因子表明与细胞因子受体成员的结构同源性(Edgington et al.，1991)，其中的一些二聚形成活性受体(Davies and Wlodawer，1995)。因此本发明人按如下合成TF二聚体。A  〔tTF〕接头〔tTF〕

制备有Gly(tTF)(Gly)₄Ser(Gly)₄Ser(Gly)₄Ser〔tTF〕结构的Gly〔tTF〕接头〔tTF〕。分别扩增2个DNA片段，然后连接并插入到下列载体中：

PCR1：制备tTF和接头DNA的5’那半。在PCR中用下列引物：5’引物：5’GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTTGCG GCA CTA CAA ATA CT(SEQ ID NO：12)3’引物：5’CGC GGA TCC ACC GCC ACC AGA TCC ACC GCC TCCTTC TCT GAA TTC CCC TTT CT(SEQ ID NO：13)

用Gly〔tTF〕DNA作为DNA模板。其他的PCR条件是在tTF节中描述的那些。

PCR2：制备接头DNA的3’那半和tTF DNA。在PCR中用下列引物：5’引物：5’CGC GGA TCC GGC GGT GGA GGC TCT TCA GGC ACTACA AAT ACT GT(SEQ ID NO：14)3’引物：5’TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ ID NO：15)

在PCR中用tTF DNA为模板。用NcoI和BamH消化来自PCR 1的产物。用HindIII和BamH1消化来自PCR2的产物。用NcoI和HindIII-消化的H₆pQE 60DNA连接消化的PCR1和PCR2 DNA。

对于载体构建体和蛋白质纯化，方法与在Gly〔tTF〕节中描述的相同。B   Cys〔tTF〕接头〔tTF〕

构建有Ser Gly Cys[tTF 2-219](Gly)₄Ser(Gly)₄Ser(Gly)₄Ser〔tTF〕结构的Cys〔tTF〕接头〔tTF〕。在通过使用下列引物的PCR制备DNA：5’引物：5’GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTTGCG GCA CTA CAA ATA CT(SEQ ID NO：16)3’引物：5’TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ ID NO：17)

用〔tTF〕接头〔tTF〕DNA作为模板。其他的PCR条件与在tTF节中描述的相同。载体构建体和蛋白质纯化均按在H₆C〔tTF〕纯化中的描述。C   〔tTF〕接头〔tTF〕cys

制备有蛋白质结构〔tTF〕(Gly)₄ Ser(Gly)₄Ser(Gly)₄Ser〔tTF〕Cys的〔tTF〕接头〔tTF〕cys。通过用下列引物的PCR制备DNA：5’引物：5’GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT GCACTA CAA ATA CT  (SEQ ID NO：18)3’引物：5’TGA CAA GCT TAG CAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ ID NO：19)。

用〔tTF〕接头〔tTF〕DNA作为模板。其他的PCR条件与在tTF节中描述的相同。再按〔tTF〕cys节中的描述完成载体构建体和蛋白质纯化。D   化学共轭的二聚体

将〔tTF〕cys单聚体化学共轭以形成〔tTF〕Cys-Cys〔tTF〕二聚体。在室温将等摩尔的DTT加到保护的〔tTF〕Cys中，经1小时，去保护，然后暴露在〔tTF〕CysC-末端的半胱氨酸。将等摩尔保护的〔tTF〕Cys加到DTT/〔tTF〕Cys混合物中，然后在室温继续保温18小时。在G-75凝胶过滤柱上纯化二聚体。

用相同的方法将Cys〔tTF〕单聚体化学共轭以形成二聚体。实施例VI合成组织因子突变体

描述两种tTF突变体，它们没有将tTF-结合VII因子转变成VIIa因子的能力。与VII因子相比，在血浆中的VIIa因子少30倍(Morrisseyet al.，1993)。因此，循环中的突变体TF应不太能启始凝血作用，因此有很低的毒性。在凝血配体中，一旦通过将抗体与肿瘤位点相连，而将突变体tTF定位后，注射VIIa因子以交换tTF结合的VII因子。存在VIIa因子的条件下，突变体是有活性的。A  〔tTF〕G164A

“〔tTF〕G164A”含有Ala取代tTF164(Gly)氨基酸的突变体蛋白质结构。用Chameleon双链位点介导的诱变试剂盒(Stratagene)产生所述突变体。DNA模板是Gly〔tTF〕DNA，诱变引物的序列是：5’ CAA GTT CAG CCA AGA AAAC(SEQ ID NO：20)

在Gly〔tTF〕的纯化中用上述的载体构建体和蛋白质纯化方法。B   〔tTF〕W158R S162A

〔tTF〕W158R S162A是双突变体，其中用Arg取代tTF的氨基酸158(Trp)，而用Ala取代氨基酸162(Ser)。使用与用于〔tTF〕G164A相同的诱变方法。诱变引物是：5’ACA CTT TAT TAT CGG AAA TCT TCA GCT TCA GGA AAG(SEQ ID NO：21)

使用用于纯化Gly〔tTF〕的前述载体构建体和蛋白质纯化方法。实施例  VII合成组织因子共轭物A   通过将化学衍生的抗体与化学衍生的tTF经二硫键相连而合成抗体tTF共轭物(如在图5中举证的)。

在室温将抗体与5倍摩尔过量的琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基α-(2-吡啶基二硫)甲苯(SMPT)反应1小时以得到平均每个抗体分子有2个吡啶二硫化物基团的衍生抗体。用凝胶渗透层析纯化衍生的抗体。

在室温，将比抗体过量2.5倍摩尔的tTF与45倍摩尔过量的2-亚氨基硫烷(2IT)反应1小时以产生每个tTF分子平均有1.5个巯基的tTF。用凝胶渗透层析纯化衍生的tTF，紧接着与衍生的抗体混合。

在室温将混合物反应72小时，然后用于SephacrylS-300柱以便将抗体-tTF共轭物与游离tTF分开，然后释放吡啶-2-硫酮。在抗-tTF柱上用亲和层析将共轭物与游离抗体分开。最终共轭物产物的优势分子种是用由SDS-PAGE分析的含少量多取代的共轭物(Mr≥约202000)的单取代的抗体-tTF共轭物(Mr约176000)。B   将半胱氨酸修饰的tTF与衍生的抗体共轭

通过直接将半胱氨酸修饰的tTF与化学衍生的抗体经二硫键耦合合成抗体-C〔tTF〕和〔tTF〕C(如图5中举证的)。

在室温将抗体与12倍摩尔过量的2IT反应1小时以产生每个抗体分子有平均1.5个巯基团的衍生抗体。用凝胶渗透层析纯化衍生的抗体，紧接着与2倍摩尔过量的半胱氨酸-修饰的tTF混合。将混合物放在室温下反应24小时，然后按上述用凝胶渗透和亲和层析纯化共轭物。

最终共轭物产物的优势分子种类是用由SDS-PAGE分析的含少量多取代的共轭物(Mr≥约202000)的单取代的抗体-tTF共轭物(Mr约176000)。C   将半胱氨酸-修饰的tTF与Fab’片段共轭

制备抗体Fab’-C〔tTF〕和〔tTF〕C共轭物。所述共轭物在体内更有效，由于其有限的内部化能力，它们比二价共轭物在细胞表面上保留更长的时间。将Fab’片段与2倍摩尔过量的半胱氨酸-修饰的tTF混合24小时，然后按上述用凝胶渗透和亲和层析纯化所述共轭物。DtTF共轭物的凝血能力

用B21-单克隆抗体制备tTF共轭物，所述抗体与在A20细胞表面上表达的II型抗原结合。用化学衍生的tTF和半胱氨酸-修饰的tTF制备共轭物，在其与A20细胞表面结合后，确定所述共轭物在CaCl₂中凝集小鼠血浆的能力。

两种B21-2共轭物以剂量依赖方式缩短了小鼠血浆在CaCl₂中(对照)的凝血时间。当将tTF用双特异性抗体B21-2/10H10限于A20细胞表面时，tTF共轭物在凝血作用方面有相似的提高。E   抗-肿瘤细胞tTF共轭物

已经知道，当tTF击靶肿瘤脉管内皮细胞时，它在肿瘤血管内诱导了凝血作用(实施例I到实施例III)。本发明人认为，如果tTF击靶肿瘤细胞的表面，则凝血作用应在肿瘤血管内诱导。

按上述“tTF共轭物制备”节中的描述，将三种抗肿瘤细胞抗体，KS1/4，D612和XMMCO-791与tTF共轭。KS1/4是从R.Reisfeld(在scripps Research Institute，Department of Immunology，LaJolla，California，)博士得到的，而且还在美国专利4975369中作了描述；D612是从J.Schlom博士(NCI，Laboratory of Tumor Immunology andbiology，Bethesda，Maryland)处得到的，而且在美国专利5183756中作了描述，可从ATCC杂交瘤细胞系保藏号No.HB 9796的培养上清液中得到的；XMMCO-791是从ATCC购买的杂交瘤细胞系的组织培养上清液中纯化的。

用人结肠癌细胞系Widr作为KS1/4的靶细胞。从ATCC购买Widr细胞，然后在10％(v/v)CO₂空气中，保持在用10％(v/v)胎牛血清，L-谷氨酰胺和抗生素补充的DMEM中。用人结肠癌细胞系LS147T作为D612的靶细胞。H460细胞是从Adi Gazdar博士(simmons Cancercenter，University of Texas Southwestern Medical Center，Dallas，Texas)处得到，而且保持在用10％(v/v)胎牛血清，L-谷氨酰胺和抗生素补充的DMEM中。这三种细胞系均生长粘附单层。

检测共轭物与表达相关靶抗体结合时，其改善小鼠血浆在CaCl₂中凝集时间的能力。用在PBS中的0.05％(w/v)从组织培养烧瓶中取出肿瘤细胞。将细胞与TF9-6B4和TF8-5G9抗体预培养以中和任何天然组织因子活性(Morrisey et al.，1988)，然后按有关A20细胞所述完成凝血试验。

当与其靶细胞系结合时，所有三种共轭物以剂量依赖方式均缩短了小鼠血浆在CaCl₂(对照)的凝集时间(图7)，表明当tTF击靶细胞表面时，加速了在肿瘤细胞表面的凝血作用。实施例VIII合成组织因子前药

举证性的tTF前药有下列结构：tTF1 ₂₁₉(X)_n1(Y)_n2Z配体，其中tTF_1 219代表TF减胞质和跨膜区；X代表有n1氨基酸(AA)长(1-20AA)的疏水跨膜区；Y代表n2个AA长的亲水蛋白酶识别序列(确保适宜的蛋白酶识别的足够的AA)；Z代表二硫键硫酯或其他连接基团，如(Cys)_1-2；配体代表抗体或其他识别肿瘤细胞，肿瘤EC，结缔组织(基质)或基层标记的击靶部分。

静脉内注射tTF前药，使其定位于疾病组织(即肿瘤)。一旦定位于疾病组织，内生蛋白酶(即金属蛋白酶，凝血酶，Xa因子，VIIa因子，IXa因子，纤维蛋白溶酶)将裂解前药的亲水蛋白酶识别序列，这可以使疏水跨膜序列插入到局部细胞膜内。在尾部插入到膜中后，tTF将恢复其凝血-诱导特性，在疾病组织的脉管系统中导致凝块的形成。实施例IX合成没有Gla修饰的凝血因子

认为维生素-K-药理学凝血因子(II/IIa因子，VII/VIIa因子，IX/IXa因子和X/Xa因子)修饰对于形成凝血配体是有用的。没有Gla修饰的凝血因子是差的促凝剂，因为未修饰的因子不能与脂膜有效相连：经配体使因子击靶肿瘤的脉管系统或其他位点应将因子带到细胞表面的附近，而且能在那位点进行凝血作用。

通过修饰现存的GLu(谷氨酸)残基而对“Gla”进行翻译后加工。通过表达所述基因可以制备没有Gla修饰的维生素-K-依赖性凝血因子(II/IIa因子，VII/VIIa因子，IX/IXa因子和X/Xa因子)，所述基因在宿主，如细菌中编码它们，它不将Glu修饰成Gla。在SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27中分别包括了编码了II/IIa因子，VII/VIIa因子，IX/IXa因子和X/Xa因子的DNA序列。因此，原核表达是简单的。

通过突变任何上述序列(SEQ ID N0：24，SEQ ID N0：25，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27)以便基本上在任何宿主细胞中，在表达该基因前，将相应的Glu残基变成另一个氨基酸从而制备所述没有Gla的因子。待改变的密码子是GAG密码子(GAA还编码Glu，而且将其避开)。用VII因子作为实例，“Gla”通常定位于216-325区。编码第一个Gla的三联体在SEQ ID NO：25的231，而最后一个在SEQ IDNO：25的318。用分子生物学技术很容易改变GAG编码子。

图8表示上述维生素-K-依赖性凝血因子的Gla区位于相似的区域。因此，突变任何在SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：27中的所谓“相应”Glu是简单的。

提供密码子的下列表以便在修饰给定的编码Gla密码子或序列时能够进行突变。氨基酸                 密码子丙氨酸      Ala    A    GCA    GCC   GCG  GCU半胶氨酸    Cys    C    UGC    UGU天冬氨酸    Asp    D    GAC    GAU谷氨酸      Glu    E    GAA    GAG苯丙氨酸  Phe    F    UUC    UUU甘氨酸    Gly    G    GGA    GGC    GGG  GGU组氨酸    His    H    CAC    CAU异亮氨酸  Ile    I    AUA    AUC    AUU赖氨酸    Lys    K    AAA    AAG亮氨酸    Leu    L    UUA    UUG    CUA  CUC  CUG CUU甲硫氨酸  Met    M    AUG天冬酰胺  Asn    N    AAC    AAU脯氨酸    Pro    P    CCA    CCC    CCG  CCU谷氨酰胺  Gln    Q    CAA    CAG精氨酸    Arg    R    AGA    AGG    CGA  CGC  CGG  CGU丝氨酸    Ser    S    AGC    AGU    UCA  UCC  UCG  UCU苏氨酸    Thr    T    ACA    ACC    ACG  ACU缬氨酸    Val    V    GUA    GUC    GUG  GUU色氨酸    Trp    W    UGG酪氨酸    Tyr    Y    UAC    UAU

点特异性诱变是用于制备各没有Gla修饰的维生素-K-依赖性凝血因子的技术，其通过特异性诱变基础DNA，然后将一个或多个核苷酸序列导入到DNA中。

点特异性诱导可以通过使用特异性寡核苷酸序列以及足够量的邻接核苷酸而生产突变体，以提供足够大小的引物序列和序列组合以形成稳定的双螺旋，所述序列编码所需突变体的DNA序列，所述双螺旋在待连接的缺失接口的两侧。通常约17-25个核苷酸长的引物是优选的，且要改变在所述序列接口两侧的约5-10个残基。

通常，点特异性诱变技术是本领域熟知的，由如Adelman等人(1983)的文献和由上述TF突变研究举证的。通常所述技术使用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。在定点诱变中有用的典型载体包括如M13噬菌体(Messing et al.，1981)。这些噬菌体是市售的，而且其他用途通常是本领域熟知的。在定点诱变中常规使用双链质粒，这将来自质粒的所需基因转移到噬菌体中。

通常，通过首先得到单链载体或溶解双链载体中两个链的一部分来完成保温的定点诱变，所述双链载体包括在其序列中的编码维生素-K-依赖性凝血因子的DNA序列。制备含有所需突变序列的寡核苷酸引物，通常是例如用Crea等人(1978)的方法合成。然后将该引物与单链载体退火，然后经DNA聚合酶如大肠杆菌聚合酶以合成带突变的链。因此形成异双螺旋，其中一条链编码原非突变序列，而第二条链含所要的突变。然后用所述异双螺旋载体转化适宜的细胞，如大肠杆菌细胞，然后筛选克隆，它们包括带突变序列的重组载体。实施例  X其他抗肿瘤脉管系统抗体

本实施例描述了生产抗肿瘤衍生的内皮细胞“结合因子”的抗体，所述“结合因子”用于区别肿瘤脉管系统和正常组织脉管系统。具体描述的是生产抗脉管渗透因子(VPF)的抗体，也称为脉管内皮细胞生长因子(VEGF)，也抗bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)。

有关FGF的详细内容，人们可以参考Gomez-Pinilla和Cotman(1992；Nishikawa等人(1992)，他们描述了碱性成纤维细胞生长因子；Xu等人(1992)涉及表达和分析FGF；Reilly等人(1989)涉及单克隆抗体；Dixon等人(1989)涉及FGF检测和表征；Matsuzaki等人(1989)涉及抗肝素-结合生长因子的单克隆抗体；而Herblin和Gross(19929讨论了在与脉管系统有关的熟知肿瘤上，bFGF的结合位点。

在本发明研究中，用与结合菌素(纯化的蛋白质衍生物，PPD)或甲状腺球蛋白载体偶联的人VEGF，小鼠VEGF，豚鼠VEGF，人bFGF，小鼠bFGF，或豚鼠bFGF的N-末端高度免疫的兔。所述肽有25-26个氨基酸长，用半胱氨酸作为C-末端残基在肽合成仪上合成。在与Sephraose基质偶联的肽柱上亲和纯化抗血清。

用ELISA和其在豚鼠肿瘤和正常组织冷冻切片上的染色图谱来鉴定VEGF抗体。豚鼠VEGF和人VEGF的多克隆抗体分别与豚鼠L10肿瘤和各种人肿瘤(腮腺，卵巢，哺乳动物癌)冷冻切片上的大多数脉管内皮细胞反应。抗人VEGF抗体染色在正常人肾小球和肝中的内皮细胞周围的肾小球(mesangial)细胞，但不染色正常人胃，腿肌肉和脾中的血管。抗豚鼠VEGF抗体不染色任何正常组织，包括肾，脑，脾，心，精囊，肺，大肠，胸腺，前列腺，肝，睾丸和骨骼肌中的内皮细胞。

人FGF的多克隆抗体染色在腮腺和卵巢癌中的内皮细胞，而不是在哺乳动物癌中的那些。抗人FGF抗体染色人肾中的肾小球内皮细胞，而不是正常胃，腿和脾中的内皮细胞。

通过用与PPD或甲状腺球蛋白偶联的N-末端序列肽(在肽C-末端的半胱氨酸)免疫BALB/c小鼠来制备抗豚鼠VEGF，人VEGF和豚鼠bFGF的单克隆抗体。在下列列出了定义序列的合成肽免疫原，它们分别由SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32表示：豚鼠VEGF人VEGF豚鼠bFGF通过将甲状腺球蛋白与琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)衍生，然后与肽反应来共轭所述肽。这产生了经硫醚键与甲状腺球蛋白连接的具有一个多个肽序列的共轭物。

具体地说，用下列方法得到抗上述序列的单克隆抗体：用肽-PPD或肽-甲状腺系列注射到数个位点而免疫BALB/c小鼠，取出脾，按Morrow等人(1991)公开的方法，用聚乙二醇将脾细胞与P3xG3Ag8.653分散细胞瘤融合。按如下筛选个体杂交瘤上清液：第一次筛选：在肽-甲状腺-包被的平板上的ELISA。第二次筛选：在经SMCC与甲状腺球蛋白相连的半胱氨酸上的ELISA。第三次筛选：豚鼠系10肿瘤或人腮腺癌冷冻切片的间接免疫过氧化物酶染色。第四次筛选：各种恶性和正常豚鼠和人组织的冷冻切片中间接的免疫过氧化物酶染色。

筛选结合肽-甲状腺球蛋白而不结合半胱氨酸-甲状腺球蛋白的抗体，它们在恶性肿瘤中与内皮细胞结合得比其与正常组织内皮细胞的结合更紧密(表VIII)。

                                  表VIII

                            单克隆抗体的反应性

MoAB	免疫原+	型	与肿瘤内皮的反应性		肿瘤反应性图*
									豚鼠	人
GV14	gp VEGF	IgM	+	+	某些肿瘤肿胞
						GV35	gp VEGF	IgM	±	±	肿瘤细胞，在BV上弱
GV39	gp VEGF	IgM	+	+	BV和某些肿瘤细胞
						G59	gp VEGF	IgM	+	+	BV和某些肿瘤细胞
GV97	gp VEGF	IgM	+	+	BV，在肿瘤细胞上弱
						HV55	hu VEGF	IgM	？	+	基膜，某些BV
GF67	gp FGF	IgM	+	+	BV和肿瘤细胞
						GF82	gp FGF	IgM	+	+	BV和肿瘤细胞

^*BV＝血管    +gp＝豚鼠    hu＝人A   人和豚鼠组织切片的GV97染色

抗豚鼠VEGF N-末端的GV97抗体与各种人恶性(表IX)和正常(表X)组织中的内皮细胞结合。

与恶性肿瘤内皮细胞的结合超过与正常组织内皮细胞中的结合。

在豚鼠肿瘤(系10肝细胞癌)和正常组织中内皮细胞的染色与用人组织观察到的分布和强度相同(表XI)。

在表中，+表示阳性，与阴性相反的结果。数字2+，3+和4+指提高力量的阳性信号，这是在该研究领域中常用的。

                                         表IX在人肿瘤上的抗GPVEGF

		纯化的GV97
										肿瘤    组织	20ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/mlor2ug/ml	0.5ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
消化道
										92-01-A073食管癌		2+	1+	+/-	-ve			4+	4+
M4腮腺						4+
										87-07-A134腮腺癌		3+	2+	+/-	-ve			3+	4+
M5腮腺						4+
										88-04-A010腮腺腺瘤		1-2+	1+	-ve	-ve				1-3+
90-11-B319结肠到肝的腺癌						3-4+		3-4+
										94-02-B021C结肠的腺癌						3-4+		3-4+
93-10-A333正常结肠的腺癌	4+	2-4+	1-4+	-ve-1+		4+			3+

表IX续

		纯化的GV97
										肿瘤    组织	20ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/mlor2ug/ml	0.5ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
93-02-B004结肠绒毛状和腺癌性息肉	4+	3-4+	2-4+	1-2+		3-4+		2-3+
										93-02-A130结肠癌的平滑肌肉瘤		3+	2+	+/--1+	-ve	4+		4+	3-4+
93-02-B020胃癌		4+	2+	2-3+	-ve-1+			1-2+	4+
										93-04-A221胰腺癌		3-4+	2-3+	1-2+	-ve-0.5+			4+	4+
94-04-A390直肠腺癌		4+	3+	1-2+	1+				3+
										93-12-A160舌癌腺癌		1-2+	+/-	-ve	-ve			3+	3+
101-84a胃印记环癌(101-84b对)		3+	2+	-ve-1+	-ve	最多1-2+但少数3-4+			3+
										90-05-A172胃腺癌		4+	3+	1-2+	-ve-1+			-ve	3+

表IX续

		纯化的         GV97
										肿瘤    组织	20ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/mlor2ug/ml	0.5ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV5 9supt.
生殖道
										91-10-A115外阴鳞状细胞癌	1-4+	1-3+	1-2+	1-2+		1-4+			1-3+
93-03-A343前列腺癌		+/--3-4+	+/-列2-3+	+/-列1-2+	+/-			3-4+	3-4+
										肌肉
										免疫系统
										泌尿系统
93-10-B002肾细胞癌						2+			3+
										90-01-A225肾细胞癌		4+	4+	3-4+大多数	1-3+一些	3-4+		3+	3-4+
93-01-A257膀胱的过渡细胞癌	3-4+	2-3+	1-2+	+/-		2-3+			2-3+

表IX续

		纯化的GV97
										肿瘤    组织UE	20ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/mlor2ug/ml	0.5ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
内分泌系统
										94-01-A246肾上腺嗜铬细胞瘤	4+	4+	3-4+	3+		4+			3-4+
93-11-A074肾上腺皮质癌	3-4+	3-4+	2-3+	1+		3-4+			4+
										呼吸系统
93-08-N009肺腺癌						3-4+		3-4+	3-4+
										92-10-A316鳞状细胞癌		4+	3-4+	1-2+	-ve-0.5+			4+	4+
03-05-A065肺腺癌		4+	3-4+	-ve-1+	1+			3+	3+
										中枢神经系统
94-01-A299神经鞘瘤到淋巴结的恶性转移瘤	4+	4+	4+	3-4+		4+			3-4+
										92-10-A139脑膜瘤	4+	3-4+	2-3+	1-2+		4+			3-4+

表IX续

		纯化的    GV97
										肿瘤    组织	20ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/mlor2ug/ml	0.5ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
91-12-A013脑膜瘤	4+	2-3+	-ve-3+	+/-		4+			3+
										93-03-A361非典型脑膜瘤		4+	4+	3+	2+	4+			3+
皮系统
										94-04-V037皮肤鳞状细胞癌W/正常		-ve  列4+	-ve  列3+	-ve  列1+	-ve			2-3+	2-3+
89-02-225腿肉瘤		4+	3-4+	1+	1+			4+	2+
										肌肉肿瘤

表X    在人正常组织上的抗-GPVEGF

		纯化的GV97
										肿瘤  组织	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
消化系统
										91-01-A128膀胱W/膀胱炎		3+	2+	1+	-ve			2-3+	2-3+
94-02-B020未包括的结晶						2-3+		2-3+
										92-01-A292 N.结肠	4+	4+	4+	3-4+		4+			3-4+
93-10-A116 N.结肠	Z-4+	1-4+	1-3+	-ve-2+	-ve	3-4+		2-3+	3-4+
										90-06-A116 N.结肠						3+许多		2+
93-02-A350 N.食管		3-4+	3+	1+	+/-			4+	4+
										93-05-A503 N.肠梗阻						4+			4+

表X续

		纯化的GV97
										肿瘤  组织	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
94-03-A244 N.肝		4+	1-3+	-ve-1+	-ve			4+	4+
										90-02-B132 N.肝	1+of afew	+/-	-ve	-ve	-ve	1-3+	2-3+	2-3+	2-3+
94-01-A181N.胰腺		1-4+	1-3+	1-3+少数	-ve				3-4+
										90-05-D008 N.胰腺		2-4+	1-3+	+/-	-ve			2-3+	2-3+
93-05-A174 N.腮腺		2+少数	1-2+少数	1+少数	-ve	-ve		3+少数	2-3+
										94-04-A391 N.小肠		1-3+	-ve-2+	-ve	-ve				3+
88-06-107 N.胃	3+	2+	+l-	-ve		3-4+			3+
										101-84b N.胃(101-84 对)		3-4+在主要部分和周边部分	2-3+在主要部分和3-4+周边部分	+1-在主要部分和2+周边部分	-ve在主要部分和1+周边部分	3+			3-4+

表X续

		纯化的GV97
										肿瘤    组织	20ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
90-11-B337 N.胃		2-3+	+/--1+	-ve	-ve			3+	3+
										生殖道
93-04-A041 N.乳腺						4+		3+
										94-02-A197 N.乳腺W/囊变性纤维瘤变化						4+		3+
93-02-A051Breastw/fihrocysticchange		-ve-1+	-ve	-ve	-ve			+/-	+/-2+
										93-02-A103Breastw/fibrocyst.change	4+	3+	2+	1+
92-11-A006 N.外宫颈	2+大多数	1-2+大多数	0.5+	-ve	-ve	1-2+一些			3+大多数

表X续

		纯化的GV97
										肿瘤  组织	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
91-03-A207N.外宫颈		2.5+	1.5+	1+	.5+				2-3+
										92-02-A139 N.卵巢W/黄体	1+在大部分2+但在一个区	-ve在大部分区但：1+在一个区	-ve	-ve		-ve在大部分区但3-4+在一个区			-ve在大部分区但3-4在一个区
93-06-A11B N.前列腺		1+of a few	-ve	-ve	-ve				3+
										93-11-A317d前列腺碎片		3-4+	2-3+	-ve-3+	-ve-1+			3-4+	3-4+
93-02-A315精囊		0.5-1+	0.5+	-ve	-ve			1+	1.2+
										92-04-A069 N.睾丸		1+	+/-	+/-	+/-			1-2+
91-04-A117输尿管W/炎症		1+	+/-	-ve	-ve			+/--1+	3-4+

表X续

		纯化的GV97
										肿瘤  组织	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
肌肉E
										94-01-A065 N.心		34+	2+	+/-	-ve			3-4+	4+
91-07-D007 N.骨骼肌	1-4+	1-3+	1-2+	-ve	-ve	1-3+			1-3+
										95-03-A395 N.骨骼肌		4+	3-4+	1-2+	0.5-1+			4+	4+
免疫系统
										90-01-A077 N.淋巴结	2-3+	2+	1+    一些	-ve	-ve	2-3+			3-4+
90-08-A022 N.淋巴结		大多数1+但少数4+	大多数0.5+但a few2+	大多数-ve但少数2+	大多数ve but a少数0.5-1+			3+	3+
										91-03-A057 N.淋巴结e		2+	1+	+/-	-ve			3-4+	3-4+
91-09-B017 E无关的淋巴结		3+	2+	+/--1+	-ve			2-3+	2-3+

表X续

		纯化的GV97
										肿瘤    组织	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
93-07-A236 N.Spicen		3-4+	3-4+	-ve-3+	-ve				2-4+
										93-07-252 N.spicen		3+	1+	+/-	-ve			2-3+
内分泌系统
										94-04-A252 N.肾上腺W/髓质和皮质	4+	4+	3-4+	1-2+		4+			3+
93-05-A086 N.肾上腺髓质		大多数-ve少数1-2+	大多数-ve少数1-2+	-ve	-ve			2-3+	3-4+
										92-03-A157甲状腺增生		1+	+/-	+/-	-ve			4+	4+
91-03-B019 N.甲状腺		-ve-3+	-ve-2+	-ve-1+	-ve			2-3+	2-3+
										泌尿系统

表X续

		纯化的GV97
										肿瘤  组织IE	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
93-09-A048 N.肾						4+			2-3+
										91-11-A075 N.肾		4+	3+	2+	1+	4+在肾小球上		4+在肾小球上	4+在肾小球上i
93-10-B001 N.肾		4+	3+	+/-	-ve	4+在肾小球上		4+在肾小球上	4+在肾小球上i
										皮系统
92-08-A029 N.乳房皮肤		+/-to 4+	+/-to 3+	+/-to 1+	+/-			2+	2+
										89-02-257软骨边2SS		4+	3-4+	2-3+	1-2+			1+	3-4+
呼吸系统
										93-05-A203 N.肺		-ve-2+	-ve-1+	+/-	-ve			2+	3+

表X续

		纯化的GV97
										肿瘤    组织	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	GV97supt.	GV14	GV39	GV59supt.
92-12-A263 N.支气管		2-3+w/导管染色3-4+	1-2+wl导管染色2-3+	-ve	-ve				2-3+

                                表XI    直接在6-8周龄GP组织上免疫组织化学染色的9F7抗VEGF染色图

		纯化的GV97
									组织	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	9F7 supt.	3F9 supt.	5F9 supt.
消化系统
									肝		2+	1-2+	+/-	+/-		1-2+	1-2+
肠	4+	3+	2+	1+			4+m淋巴样，余下的不同于	4+m淋巴样，余下的不同于
									胰腺	1+许多和3+在胰岛细胞中
小肠	4+of许多和4+在淋巴样	2-3+许多和4+inlymphoid.rest diff.than fVlll	1-2+of许多和l4+inlymphoid,rest diff.than fVlll	+/-许多和4+inlymphoid，restdiff.than fVlll			3+of一些和l4+在淋巴样中	3+of一些和4+在淋巴样中

表XI续

		Purified GV97
									组织	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	9F7 supt.	3F9 supt.	5F9 supt.
胃	3-4+	1-2+大多数上偶尔3+	+/-大多数上偶尔2+	+/-大多数上偶尔1+			3-4+一些VIII因子	3-4+一些VIII因子
									生殖系统
睾丸
									肌肉和皮系统
心	-ve	-ve	-ve	-ve			3-4+一些VIII因子	3-4+一些VIII因子
									肌肉
皮肤	1-2+在脂肪层和3-4+在细胞层	1+在脂肪层和3-4+在细胞层	+/-在脂肪层和3-4+少数在细胞层	+/-在脂肪层和1-2+少数在细胞层			3+	3+

表XI续

		纯化的GV97
									组织	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	9F7 supt.	3F9 supt.	5F9 supt.
免疫系统
									脾	4+	3+	2+	-ve			4+	4+
胸腺
									泌尿系统
肾	肾小球4+	肾小球3-4+	肾小球2-3+	肾小球 1-2+			肾小球3-4+	肾小球3-4+
									内分泌系统
肾上腺
									呼吸系统
肺
									神经系统
小脑	4+	2+	+/-大多数1+of afew	+/-大多数and 1+of afew			4+	4+

表IX续

		纯化的  GV97
									肿瘤：	20 ug/ml	10ug/ml	5ug/ml	1ug/ml or2ug/ml	0.5 ug/ml	9F7 supt.	3F9 supt.	5F9 supt.
肿瘤
									肿瘤	4+	4+	3-4+	2-3+(2)		4+		3+

B   没有GV97与可溶性人VEGF的反应性

为了鉴定对VEGF，VEGF受体(F1K-1)特异性抗体或与受体结合(或复合的)特异的抗体VEGF，发展了ELISA筛选方法。所述方法如下；

首先，用以10μg/ml在敏化缓冲液中的100μl/孔FLK/seap包被96孔ELISA(平板)。过夜保温后，用PBS将平板洗涤两次，在4℃过夜。然后用250μl/孔PBS+CAH(5％)溶液将FLK/seap包被的平板在37℃阻断1小时。除去阻断溶液，

然后在室温用4小时或在4℃过夜，将阻断的平板与2μg/ml的100μl/孔VEGF-165(在酵母中生产的VEGF165个氨基酸的形式，所述酵母是从Ramakrishna博士，University of Minnesota得到的)及0.1mg/ml肝素保温。收集VEGF溶液，然后用PBS吐温(0.10％)洗涤平板。接着，将100μl/孔的杂交瘤融合上清液加到孔中，在32℃保温1小时。所述上清液保温后，用PBS吐温将平板洗涤3次，然后与100μl/孔的二级抗体(KPL，以1∶1000在PBS吐温+CAH(5％)的Gt抗-小鼠IgG)在37℃保温1小时。

二级抗体保温后，用PBS吐温将平板洗涤4次，与100μl/孔底物(溶解在柠檬酸缓冲液+H₂O₂中的Substrate Sigma OPD)保温20分钟，在Cambridge Technology Microplate Reader(Model 7520)上，于490nm读数。筛选作为阳性有上述适宜对照孔的吸收值的孔，并进行表征。

发现GV97不与VEGF-包被的ELISA平板结合，重组人VEGF也不与GV97包被的ELISA平板结合。可溶性的重组人VEGF不会阻断5μg/ml的GV97与组织切片中肿瘤内皮的结合，甚至为50μg/ml时也不会。

这些数据表明，GV97识别在重组人VEGF中的VEGF表位，但当VEGF与其内皮细胞上的受体结合时，就很容易接近了。C   GV97在带系10的豚鼠中的定位

与从组织切片得到的染色数据相反，在注射到带系10的豚鼠中后，GV97抗体选择性地定位于肿瘤内皮细胞(表XII)。在肿瘤内皮细胞中的染色是中度的，且检测不到在各种器官的正常内皮中的染色。D   抗-bFGF选择性地结合肿瘤内皮细胞

GV97和GF82(抗豚鼠bFGFN-末端)与豚鼠系10肿瘤冷冻切片中的内皮细胞和在两种人恶性肿瘤中的内皮细胞强烈反应(表XIII)，相反，在各种豚鼠正常组织的内皮细胞中只观察到相对弱的染色。

表XII.将GV97注射到含GP的肿瘤中

组织	GV97 10 ug/ml	GV 97 20 ug/ml注射的血清体积
			消化系统
肝	2+	-ve
			肠	3+	可能0.5-1+少数
胰腺	+/-许多2+在胰瘤细胞中	可能0.5-1+少数
			小肠	2-3+许多4+在淋巴样中，剩余与VIII因子不同	+/-
胃	1-2+最偶然中3+	可能0.5+少数
			生殖系统
睾丸		+/-
			肌肉和皮系统
心	-ve	-ve
			肌肉		-ve
皮肤	1+在脂肪层和3-4+在细胞层
			免疫系统
脾	3+	可能少数1+
			胸腺
泌尿系统
			肾	肾小球3-4+
内分泌系统
			肾上腺	4+	-ve

呼吸系统
			肺	2+	-ve
神经系统
			组织	GV97 10 ug/ml	GV97 20 ug/ml注射的血清体积
小脑	2+	-ve
			肿瘤
肿瘤	4+	2-3+

表XIII.在GP组织上染色的抗一GP FGF抗体

GP组织	GF 67	GF 82
			消化系统
肝	ND	ND
			肠	+/-	+/-
胰腺	2-3+	2+
			小肠	+/-	+/-
胃	ND	ND
			生殖系统
睾丸	ND	ND
			肌肉和肠系统
心脏	2-3+	1+
			肌肉	+/-	1+
皮肤	ND	ND
			免疫系统
脾	3+	-ve
			胸腺
泌尿系统

肾	1-2+	-ve
			内分泌系统
肾上腺	1-2+	+/-
			呼吸系统
肺	1-2+	2-3+
			神经系统
小脑	1+	-1+
			肿瘤
人肿瘤	4+	4+
			人肿瘤
嗜铬细胞瘤	4+	4+
			神经鞘瘤	4+	4+

实施例  XI人治疗方法

本实施例涉及使用本发明的双特异性抗体和凝血配体的人治疗方法。这些配体在各种人癌症以及甚至其他疾病，如良性前列腺增生和类风湿性关节炎的临床治疗中是有用的，其中，中期或长期抑制血液流动是有利的。

双特异性配体在抗癌症治疗中是特别有用的工具。从本文所列的数据中，包括动物研究，以及本领域考虑治疗淋巴瘤(Glennie et al.，1988)的知识，可以简单地发展T细胞击靶(Nolan & Kennedy，1990)和药物击靶(Paulus，1985)的适宜剂量和治疗方案。

自然，在广泛地使用前，还要完成其他动物研究和临床试验。完成临床试验的各种条件，包括患者的治疗和监测，从本发明的公开来看都是本领域专业人员已知的。列出下列资料作为建立所述试验的准则。

所选用于研究的患者至少对一种常规治疗过程应答失败，而且患有用物理监测，实验室技术，或放射性方法确定的可观测疾病。若使用鼠单克隆抗体部分，患者对小鼠免疫球蛋白不应有过敏史。在进入研究前至少2星期应停止任何化疗。

就双特异性配体的施用而言，发现使用带有三腔的内存中心静脉管是有益的。应用例如0.22μm滤器过滤双特异性配体，然后例如用盐适宜地稀释到100ml的终体积。使用前，还可应用相似的方法过滤试验样品，通过测定A₂₈₀而在过滤前和后评估其浓度。预期的回收率应在87-99％的范围内，然后可以考虑调整蛋白质损失。

可以在约4-24小时的一段时间内施用双特异性配体，每个患者以2-7天的间隔接受2-4次输注。还可以通过在7天的时间内以稳定速率输注来完成施用。以任何剂量给的输注应取决于所观察到的任何毒性。因此，如果在任何单次输注或在特定的时间内以稳定的速度输注后有II级毒性，就应使用其他剂量或停止所述的稳定速度的输注，除非毒性降低。将增加剂量的双特异性凝血配体施用给患者，直到约60％的患者有在任何目录中不可接受的III级或IV级毒性。将所述值的2/3剂量就可定义为安全剂量。

当然在治疗前和最多间隔1个月时，应进行身体监测，肿瘤测量和实验室试验。实验室试验应包括全血计数，血清肌酐，肌酸激酶，电解质，脲，氮，SGOT，胆红素，白蛋白，和总血清蛋白。应用放射性免疫监测评价治疗后最多60天所取的血清样品，以监测是否存在完整的双特异性配体或其组分和抗配体任何部分或两部分的抗体。用标准监测，如ELISA或RIA对血清进行免疫性分析可以提供待评价治疗药物的药代动力学和清除率。

为了评价抗肿瘤反应，认为应在最后一次输注后48小时-1星期，并再在30天检测患者。当存在明显的疾病时，在治疗期间内每天，完成治疗后1星期和在30天测量所有肿块的垂直直径。为了测量不明显的疾病，在48小时到1星期，然后再在30天以1cm间隔对胸，腹腔和骨盆进行系列CT扫描。用来自疾病位点的活检或血液或适宜的液体样品对组织样品进行组织学评价和/或通过流式细胞计数进行评价。

用可接受的测量方法确定临床反应。例如在治疗后1个月，用所有可测量肿瘤的消失定义为完全反应。而部分反应是在治疗后1个月，所有可评价的肿瘤的直径总数有50％降低或更大的降低，同时肿瘤位点没有扩大。相似的，混合反应是在治疗后1个月，所有可测量肿瘤的直径有50％降低或更大的降低，而在一个或多个位点有发展。

从本发明的公开看，可以制备本文公开和要求保护的所有组合物并实施其中的方法，而不必进行过分的试验。若已经以优选实施方案的形式描述了本发明的组合物和方法，那么对于本领域专业人员显而易见的是对所述组合物，方法以及方法中的步骤和序列可以进行的改变而不会偏离本发明的概念，精神和范围。更具体地说，显而易见的是化学和生理学相关的特定试剂可以被本文描述的试剂所取代，但仍会得到相同或相似的结果。所有对于本领域专业人员显而易见的所述相似的取代物和修饰都确实在所附权利要求所定义的本发明的精神，范围和概念内。参考文献

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                                                      序列表(1)一般资料：

(i)申请：

姓名：BOARD OF REGENTS，THE UNIVERSITY OF TEXAS

      SYSTEM

街道：201 West 7th Street

城市：Austin

州：Texas

国家：美国

邮编：78701

电话号码：(512)499-4462

电传：(512)499-4523

和

姓名：THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE

街道：10666 North Torrey Pines Road

城市：LaJolla

州：California

国家：美国

邮编：92037

(ii)发明人：THORPE，Philip E.

            EDGINGTON，Thomas S.

(iii)发明题目：脉管系统特异性凝血的方法和组合物

(iv)序列数：32

(v)相关地址：

(A)收件人：Arnold.White&Durkee

(B)街道：P.O.Box 4433

(C)城市：Houston

(D)州：Texas

(E)国家：USA

(F)邮编：77210(vi)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容的

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS，ASCII(vii)当前的申请资料：

(A)申请号：PCT/US95/07439

(B)申请日：07-JUN-1995

(C)分类号：未知(viii)在先申请资料：

(A)申请号：US 08/273,567

(B)申请日：11-JUL-1994(ix)代理人/代理资料：

(A)姓名：PARKER，DAVIDL

(B)登记号：32,165

(C)文献/档案号：UTFD433P--(x)通讯资料：

(A)电话：(512)418-3000

(B)电传：(713)789-2679

(C)传真：79-0924(2)SEQ ID NO：1的资料

(i)序列特征：

     (A)长度：27个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

     (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1

GTCATGCCAT GGCCTCAGGC ACTACAA    27(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

   (A)长度：32个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2

TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCCTTT CT    32(2)SEQ ID NO：3的资料  (i)序列特征：

(A)长度：47个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3

GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGCTT CTGGCACTACAAATACT                                      47(2)SEQ ID NO：4的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：38个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4

GTCATGCCAT GGCCTGCTCA GGCACTACAA ATACTGTG 38(2)SEQ ID NO：5的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：50个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

    (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5

GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCACTACAAATACT                                   50(2)SEQ ID NO：6的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：35个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6

TGACAAGCTT AGCATTCTCT GAATTCCCCC TTTCT    35(2)SEQ ID NO：7的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：50个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7

GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTTGCGGAGGCGG TGGATCAGGC             50(2)SEQ ID NO：8的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：36个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8

AGTATTTGTA GTGCCTGAGG ATCCGCCACC TCCACT 36(2)SEQ ID NO：9的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：45个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

    (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：  SEQ ID NO：9

GGAGGCGGTG GATCAGGCGG TGGAGGTAGTGGAGGTGGCG GATCC                  45(2)SEQ ID NO：10的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：17个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

    (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10

GTCATGCCAT GGCCCTG           17(2)SEQ ID NO：11的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：32个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”

   (xi)序列描述：SEQ ID NO：11

TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCCTTT CT          32(2)SEQ ID NO：12的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：50个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12

GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCACTACAAATACT                                   50(2)SEQ ID NO：13的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：53个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13

CGCGGATCCA CCGCCACCAG ATCCACCGCC TCCTTCTCTGAATTCCCCTT TCT                               53(2)SEQ ID NO：14的资料(i)序列特征：

   (A)长度：44个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”(xi)序列描述：SEQ ID NO：14

CGCGGATCCG GCGGTGGAGG CTCTTCAGGC ACTACAAATACTGT                                         44(2)SEQ ID NO：15的资料(i)序列特征：

   (A)长度：31个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15

TGACAAGCTT ATTCTCAGAA TTCCCCTTTC T       31(2)SEQ ID NO：16的资料(i)序列特征：

   (A)长度：50个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

  (A)描述：/desc＝“DNA”(xi)序列描述：SEQ ID NO：16

GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCACTACAAATACT                                   50(2)SEQ ID NO：17的资料(i)序列特征：

   (A)长度：31个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”(xi)序列描述：SEQ ID NO：17

TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTC T       31(2)SEQ ID NO：18的资料(i)序列特征：

   (A)长度：44个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

  (A)描述：/desc＝“DNA”(xi)序列描述：SEQ ID NO：18

GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT GCACTACAAATACT                                         44(2)SEQ ID NO：19的资料(i)序列特征：

   (A)长度：34个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

  (A)描述：/desc＝“DNA”(xi)序列描述：SEQ ID NO：19

TGACAAGCTT AGCATTCTCT GAATTCCCCT TTCT    34(2)SEQ ID NO：20的资料   (i)序列特征：

   (A)长度：19个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

  (A)描述：/desc＝“DNA”(xi)序列描述：SEQ ID NO：20

CAAGTTCAGC CAAGAAAAC                     19(2)SEQ ID NO：21的资料(i)序列特征：

   (A)长度：36个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”(xi)序列描述：SEQ ID NO：21

ACACTTTATT ATCGGAAATC TTCAGCTTCA GGAAAG  36(2)SEQ ID NO：22的资料(i)序列特征：

   (A)长度：657个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：22TCAGGCACTA CAAATACTGT GGCAGCATAT AATTTAACTT GGAAATCAAC TAATTTCAAG           60ACAATTTTGG AGTGGGAACC CAAACCCGTC AATCAAGTCT ACACTGTTCA AATAAGCACT          120AAGTCAGGAG ATTGGAAAAG CAAATGCTTT TACACAACAG ACACAGAGTG TGACCTCACC          180GACGAGATTG TGAAGGATGT GAAGCAGACG TACTTGGCAC GGGTCTTCTC CTACCCGGCA          240GGGAATGTGG AGAGCACCGG TTCTGCTGGG GAGCCTCTGT ATGAGAACTC CCCAGAGTTC          300ACACCTTACC TGGAGACAAA CCTCGGACAG CCAACAATTC AGAGTTTTGA ACAGGTGGGA          360ACAAAAGTGA ATGTGACCGT AGAAGATGAA CGGACTTTAG TCAGAAGGAA CAACACTTTC          420CTAAGCCTCC GGGATGTTTT TGGCAAGGAC TTAATTTATA CACTTTATTA TTGGAAATCT          480TCAAGTTCAG GAAAGAAAAC AGCCAAAACA AACACTAATG AGTTTTTGAT TGATGTGGAT          540AAAGGAGAAA ACTACTGTTT CAGTGTTCAA GCAGTGATTC CCTCCCGAAC AGTTAACCGG          600AAGAGTACAG ACAGCCCGGT AGAGTGTATG GGCCAGGAGA AAGGGGAATT CAGAGAA             657(2)SEQ ID NO：23的资料(i)序列特征：

   (A)长度：219个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：

   (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1               5                   10                  15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln

        20                  25                  30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys

    35                  40                  45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val

50                  55                  60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65                  70                  75                  80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn

            85                  90                  95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr

        100                 105                 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu

    115                 120                 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg

130                 135                 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145                 150                 155                 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu

            165                 170                 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val

       180                  185                 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu

    195                 200                 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu

210                 215(2)SEQ ID NO：24的资料(i)序列特征：

   (A)长度：1947个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：  SEQ ID NO：24TGCAGCTGCC TGGCTGCCTG GCCCTGGCTG CCCTGTGTAG CCTTGTGCAC AGCCAGCATG        60TGTTCCTGGC TCCTCAGCAA GCACGGTCGC TGCTCCAGCG GGTCCGGCGA GCCAACACCT       120TCTTGGAGGA GGTGCGCAAG GGCAACCTAG AGCGAGAGTG CGTGGAGGAG ACGTGCAGCT       180ACGAGGAGGC CTTCGAGGCT CTGGAGTCCT CCACGGCTAC GGATGTGTTC TGGGCCAAGT       240ACACAGCTTG TGAGACAGCG AGGACGCCTC GAGATAAGCT TGCTGCATGT CTGGAAGGTA       300ACTGTGCTGA GGGTCTGGGT ACGAACTACC GAGGGCATGT GAACATCACC CGGTCAGGCA       360TTGAGTGCCA GCTATGGAGG AGTCGCTACC CACATAAGCC TGAAATCAAC TCCACTACCC       420ATCCTGGGGC CGACCTACAG GAGAATTTCT GCCGCAACCC CGACAGCAGC AACACGGGAC       480CCTGGTGCTA CACTACAGAC CCCACCGTGA GGAGGCAGGA ATGCAGCATC CCTGTCTGTG       540GCCAGGATCA AGTCACTGTA GCGATGACTC CACGCTCCGA AGGCTCCAGT GTGAATCTGT       600CACCTCCATT GGAGCAGTGT GTCCCTGATC GGGGGCAGCA GTACCAGGGG CGCCTGGCGG       660TGACCACACA TGGGCTCCCC TGCCTGGCCT GGGCCAGCGC ACAGGCCAAG GCCCTGAGCA       720AGCACCAGGA CTTCAACTCA GCTGTGCAGC TGGTGGAGAA CTTCTGCCGC AACCCAGACG       780GGGATGAGGA GGGCGTGTGG TGCTATGTGG CCGGGAAGCC TGGCGACTTT GGGTACTGCG       840ACCTCAACTA TTGTGAGGAG GCCGTGGAGG AGGAGACAGG AGATGGGCTG GATGAGGACT       900CAGACAGGGC CATCGAAGGG CGTACCGCCA CAAGTGAGTA CCAGACTTTC TTCAATCCGA             960GGACCTTTGG CTCGGGAGAG GCAGACTGTG GGCTGCGACC TCTGTTCGAG AAGAAGTCGC            1020TGGAGGACAA AACCGAAAGA GAGCTCCTGG AATCCTACAT CGACGGGCGC ATTGTGGAGG            1080GCTCGGATGC AGAGATCGGC ATGTCACCTT GGCAGGTGAT GCTTTTCCGG AAGAGTCCCC            1140AGGAGCTGCT GTGTGGGGCC AGCCTCATCA GTGACCGCTG GGTCCTCACC GCCGCCCACT            1200GCCTCCTGTA CCCGCCCTGG GACAAGAACT TCACCGAGAA TGACCTTCTG GTGCGCATTG            1260GCAAGCACTC CCGCACCAGG TACGAGCGAA ACATTGAAAA GATATCCATG TTGGAAAAGA            1320TCTACATCCA CCCCAGGTAC AACTGGCGGG AGAACCTGGA CCGGGACATT GCCCTGATGA            1380AGCTGAAGAA GCCTGTTGCC TTCAGTGACT ACATTCACCC TGTGTGTCTG CCCGACAGGG            1440AGACGGCAGC CAGCTTGCTC CAGGCTGGAT ACAAGGGGCG GGTGACAGGC TGGGGCAACC            1500TGAAGGAGAC GTGGACAGCC AACGTTGGTA AGGGGCAGCC CAGTGTCCTG CAGGTGGTGA            1560ACCTGCCCAT TGTGGAGCGG CCGGTCTGCA AGGACTCCAC CCGGATCCGC ATCACTGACA            1620ACATGTTCTG TGCTGGTTAC AAGCCTGATG AAGGGAAACG AGGGGATGCC TGTGAAGGTG            1680ACAGTGGGGG ACCCTTTGTC ATGAAGAGCC CCTTTAACAA CCGCTGGTAT CAAATGGGCA            1740TCGTCTCATG GGGTGAAGGC TGTGACCGGG ATGGGAAATA TGGCTTCTAC ACACATGTGT            1800TCCGCCTGAA GAAGTGGATA CAGAAGGTCA TTGATCAGTT TGGAGAGTAG GGGGCCACTC            1860ATATTCTGGG CTCCTGGAAC CAATCCCGTG AAAGAATTAT TTTTGTGTTT CTAAAACTAT            1920GGTTCCCAAT AAAAGTGACT CTCAGCG                                                1947(2)SEQ ID NO：25的资料(i)序列特征：

   (A)长度：2462个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：25TCAACAGGCA GGGGCAGCAC TGCAGAGATT TCATCATGGT CTCCCAGGCC CTCAGGCTCC         60TCTGCCTTCT GCTTGGGCTT CAGGGCTGCC TGGCTGCAGG CGGGGTCGCT AAGGCCTCAG        120GAGGAGAAAC ACGGGACATG CCGTGGAAGC CGGGGCCTCA CAGAGTCTTC GTAACCCAGG        180AGGAAGCCCA CGGCGTCCTG CACCGGCGCC GGCGCGCCAA CGCGTTCCTG GAGGAGCTGC       240GGCCGGGCTC CCTGGAGAGG GAGTGCAAGG AGGAGCAGTG CTCCTTCGAG GAGGCCCGGG       300AGATCTTCAA GGACGCGGAG AGGACGAAGC TGTTCTGGAT TTCTTACAGT GATGGGGACC       360AGTGTGCCTC AAGTCCATGC CAGAATGGGG GCTCCTGCAA GGACCAGCTC CAGTCCTATA       420TCTGCTTCTG CCTCCCTGCC TTCGAGGGCC GGAACTGTGA GACGCACAAG GATGACCAGC       480TGATCTGTGT GAACGAGAAC GGCGGCTGTG AGCAGTACTG CAGTGACCAC ACGGGCACCA       540AGCGCTCCTG TCGGTGCCAC GAGGGGTACT CTCTGCTGGC AGACGGGGTG TCCTGCACAC       600CCACAGTTGA ATATCCATGT GGAAAAATAC CTATTCTAGA AAAAAGAAAT GCCAGCAAAC       660CCCAAGGCCG AATTGTGGGG GGCAAGGTGT GCCCCAAAGG GGAGTGTCCA TGGCAGGTCC       720TGTTGTTGGT GAATGGAGCT CAGTTGTGTG GGGGGACCCT GATCAACACC ATCTGGGTGG       780TCTCCGCGGC CCACTGTTTC GACAAAATCA AGAACTGGAG GAACCTGATC GCGGTGCTGG       840GCGAGCACGA CCTCAGCGAG CACGACGGGG ATGAGCAGAG CCGGCGGGTG GCGCAGGTCA       900TCATCCCCAG CACGTACGTC CCGGGCACCA CCAACCACGA CATCGCGCTG CTCCGCCTGC             960ACCAGCCCGT GGTCCTCACT GACCATGTGG TGCCCCTCTG CCTGCCCGAA CGGACGTTCT            1020CTGAGAGGAC GCTGGCCTTC GTGCGCTTCT CATTGGTCAG CGGCTGGGGC CAGCTGCTGG            1080ACCGTGGCGC CACGGCCCTG GAGCTCATGG TGCTCAACGT GCCCCGGCTG ATGACCCAGG            1140ACTGCCTGCA GCAGTCACGG AAGGTGGGAG ACTCCCCAAA TATCACGGAG TACATGTTCT            1200GTGCCGGCTA CTCGGATGGC AGCAAGGACT CCTGCAAGGG GGACAGTGGA GGCCCACATG            1260CCACCCACTA CCGGGGCACG TGGTACCTGA CGGGCATCGT CAGCTGGGGC CAGGGCTGCG            1320CAACCGTGGG CCACTTTGGG GTGTACACCA GGGTCTCCCA GTACATCGAG TGGCTGCAAA            1380AGCTCATGCG CTCAGAGCCA CGCCCAGGAG TCCTCCTGCG AGCCCCATTT CCCTAGCCCA            1440GCAGCCCTGG CCTGTGGAGA GAAAGCCAAG GCTGCGTCGA ACTGTCCTGG CACCAAATCC            1500CATATATTCT TCTGCAGTTA ATGGGGTAGA GGAGGGCATG GGAGGGAGGG AGAGGTGGGG            1560AGGGAGACAG AGACAGAAAC AGAGAGAGAC AGAGACAGAG AGAGACTGAG GGAGAGACTC            1620TGAGGACATG GAGAGAGACT CAAAGAGACT CCAAGATTCA AAGAGACTAA TAGAGACACA            1680GAGATGGAAT AGAAAAGATG AGAGGCAGAG GCAGACAGGC GCTGGACAGA GGGGCAGGGG            1740AGTGCCAAGG TTGTCCTGGA GGCAGACAGC CCAGCTGAGC CTCCTTACCT CCCTTCAGCC            1800AAGCCCCACC TGCACGTGAT CTGCTGGCCC TCAGGCTGCT GCTCTGCCTT CATTGCTGGA            1860GACAGTAGAG GCATGAACAC ACATGGATGC ACACACACAC ACGCCAATGC ACACACACAG            1920AGATATGCAC ACACACGGAT GCACACACAG ATGGTCACAC AGAGATACGC AAACACACCG            1980ATGCACACGC ACATAGAGAT ATGCACACAC AGATGCACAC ACAGATATAC ACATGGATGC            2040ACGCACATGC CAATGCACGC ACACATCAGT GCACACGGAT GCACAGAGAT ATGCACACAC            2100CGATGTGCGC ACACACAGAT ATGCACACAC ATGGATGAGC ACACACACAC CAAGTGCGCA            2160CACACACCGA TGTACACACA CAGATGCACA CACAGATGCA CACACACCGA TGCTGACTCC            2220ATGTGTGCTG TCCTCTGAAG GCGGTTGTTT AGCTCTCACT TTTCTGGTTC TTATCCATTA            2280TCATCTTCAC TTCAGACAAT TCAGAAGCAT CACCATGCAT GGTGGCGAAT GCCCCCAAAC            2340TCTCCCCCAA ATGTATTTCT CCCTTCGCTG GGTGCCGGGC TGCACAGACT ATTCCCCACC            2400TGCTTCCCAG CTTCACAATA AACGGCTGCG TCTCCTCCGC ACACCTGTGG TGCCTGCCAC            2460CC                                                                           2462(2)SEQ ID NO：26的资料(i)序列特征：

   (A)长度：1437个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：26ATGCAGCGCG TGAACATGAT CATGGCAGAA TCACCAAGCC TCATCACCAT CTGCCTTTTA              60GGATATCTAC TCAGTGCTGA ATGTACAGTT TTTCTTGATC ATGAAAACGC CAACAAAATT             120CTGAATCGGC CAAAGAGGTA TAATTCAGGT AAATTGGAAG AGTTTGTTCA AGGGAACCTT             180GAGAGAGAAT GTATGGAAGA AAAGTGTAGT TTTGAAGAAC CACGAGAAGT TTTTGAAAAC               240ACTGAAAAGA CAACTGAATT TTGGAAGCAG TATGTTGATG GAGATCAGTG TGAGTCCAAT               300CCATGTTTAA ATGGCGGCAG TTGCAAGGAT GACATTAATT CCTATGAATG TTGGTGTCCC               360TTTGGATTTG AAGGAAAGAA CTGTGAATTA GATGTAACAT GTAACATTAA GAATGGCAGA               420TGCGAGCAGT TTTGTAAAAA TAGTGCTGAT AACAAGGTGG TTTGCTCCTG TACTGAGGGA               480TATCGACTTG CAGAAAACCA GAAGTCCTGT GAACCAGCAG TGCCATTTCC ATGTGGAAGA               540GTTTCTGTTT CACAAACTTC TAAGCTCACC CGTGCTGAGG CTGTTTTTCC TGATGTGGAC               600TATGTAAATC CTACTGAAGC TGAAACCATT TTGGATAACA TCACTCAAGG CACCCAATCA               660TTTAATGACT TCACTCGGGT TGTTGGTGGA GAAGATGCCA AACCAGGTCA ATTCCCTTGG               720CAGGTTGTTT TGAATGGTAA AGTTGATGCA TTCTGTGGAG GCTCTATCGT TAATGAAAAA               780TGGATTGTAA CTGCTGCCCA CTGTGTTGAA ACTGGTGTTA AAATTACAGT TGTCGCAGGT               840GAACATAATA TTGAGGAGAC AGAACATACA GAGCAAAAGC GAAATGTGAT TCGAGCAATT               900ATTCCTCACC ACAACTACAA TGCAGCTATT AATAAGTACA ACCATGACAT TGCCCTTCTG             960GAACTGGACG AACCCTTAGT GCTAAACAGC TACGTTACAC CTATTTGCAT TGCTGACAAG            1020GAATACACGA ACATCTTCCT CAAATTTGGA TCTGGCTATG TAAGTGGCTG GGCAAGAGTC            1080TTCCACAAAG GGAGATCAGC TTTAGTTCTT CAGTACCTTA GAGTTCCACT TGTTGACCGA            1140GCCACATGTC TTCGATCTAC AAAGTTCACC ATCTATAACA ACATGTTCTG TGCTGGCTTC            1200CATGAAGGAG GTAGAGATTC ATGTCAAGGA GATAGTGGGG GACCCCATGT TACTGAAGTG            1260GAAGGGACCA GTTTCTTAAC TGGAATTATT AGCTGGGGTG AAGAGTGTGC AATGAAAGGC            1320AAATATGGAA TATATACCAA GGTATCCCGG TATGTCAACT GGATTAAGGA AAAAACAAAG            1380CTCACTTAAT GAAAGATGGA TTTCCAAGGT TAATTCATTG GAATTGAAAA TTAACAG               1437(2)SEQ ID NO：27的资料(i)序列特征：

   (A)长度：1126个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：27GGATTCGAAG GCAAAAACTG TGAATTATTC ACACGGAAGC TCTGCAGCCT GGACAACGGG                60GACTGTGACC AGTTCTGCCA CGAGGAACAG AACTCTGTGG TGTGCTCCTG CGCCCGCGGG               120TACACCCTGG CTGACAACGG CAAGGCCTGC ATTCCCACAG GGCCCTACCC CTGTGGGAAA               180CAGACCCTGG AACGCAGGAA GAGGTCAGTG GCCCAGGCCA CCAGCAGCAG CGGGGAGGCC               240CCTGACAGCA TCACATGGAA GCCATATGAT GCAGCCGACC TGGACCCCAC CGAGAACCCC               300TTCGACCTGC TTGACTTCAA CCAGACGCAG CCTGAGAGGG GCGACAACAA CCTCACCAGG               360ATCGTGGGAG GCCAGGAATG CAAGGACGGG GAGTGTCCCT GGCAGGCCCT GCTCATCAAT               420GAGGAAAACG AGGGTTTCTG TGGTGGAACC ATTCTGAGCG AGTTCTACAT CCTAACGGCA               480GCCCACTGTC TCTACCAAGC CAAGAGATTC GAAGGGGACC GGAACACGGA GCAGGAGGAG               540GGCGGTGAGG CGGTGCACGA GGTGGAGGTG GTCATCAAGC ACAACCGGTT CACAAAGGAG               600ACCTATGACT TCGACATCGC CGTGCTCCGG CTCAAGACCC CCATCACCTT CCGCATGAAC               660GTGGCGCCTG CCTGCCTCCC CGAGCGTGAC TGGGCCGAGT CCACGCTGAT GACGCAGAAG               720ACGGGGATTG TGAGCGGCTT CGGGCGCACC CACGAGAAGG GCCGGCAGTC CACCAGGCTC               780AAGATGCTGG AGGTGCCCTA CGTGGACCGC AACAGCTGCA AGCTGTCCAG CAGCTTCATC               840ATCACCCAGA ACATGTTCTG TGCCGGCTAC GACACCAAGC AGGAGGATGC CTGCCAGGGG               900GACAGCGGGG GCCCGCACGT CACCCGCTTC AAGGACACCT ACTTCGTGAC AGGCATCGTC               960AGCTGGGGAG AGGGCTGTGC CCGTAAGGGG AAGTACGGGA TCTACACCAA GGTCACCGCC              1020TTCCTCAAGT GGATCGACAG GTCCATGAAA ACCAGGGGCT TGCCCAAGGC CAAGAGCCAT              1080GCCCCGGAGG TCATAACGTC CTCTCCATTA AAGTGAGATC CCACTC                             1126(2)SEQ ID NO：28的资料(i)序列特征：

   (A)长度：45个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”(xi)序列描述：SEQ ID NO：28GAGAAGGGA TCCTGGTGCC TCGTGGTTCT GGCACTACAAATACT                                   45(2)SEQ ID NO：29的资料(i)序列特征：

   (A)长度：30个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸

   (A)描述：/desc＝“DNA”(xi)序列描述：SEQ ID NO：29CTGGCCTCAA GCTTAACGGA ATTCACCTTT                          30(2)SEQ ID NO：30的资料(i)序列特征：

   (A)长度：25个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：30Ala Pro Met Ala Glu Gly Glu Gln Lys Pro Arg Glu Val Val Lys Phe1               5                   10                  15Met Asp Val Tyr Lys Arg Ser Tyr Cys

        20                  25(2)SEQ ID NO：31的资料(i)序列特征：

   (A)长度：26个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：31Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys1               5                   10              15Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys

        20                  25(2)SEQ ID NO：32的资料(i)序列特征：

   (A)长度：25个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：32Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Gly Gly1               5                   10              15Asp Gly Gly Ala Phe Ala Pro Gly Cys

        20                  25

Claims (172)

1  结合配体，含有：

(a)与疾病细胞，疾病相关的脉管系统或疾病相关基质的组分结合的第一结合区；与第一结合区可操纵相连的

(b)与凝血因子结合的凝血因子或第二结合区。

2  权利要求1的结合配体，其中所述第一结合区含有IgG抗体，IgM抗体或抗体的抗原结合区。

3  权利要求2的结合配体，其中，所述第一结合区含有抗体的scFv，Fv，Fab’；Fab或F(ab’)₂片段。

4  权利要求2的结合配体，其中所述第一结合区含有与肿瘤细胞，肿瘤脉管系统组分或肿瘤基质组分结合之抗体的抗原结合区。

5  权利要求4的结合配体，其中，所述第一结合区含有与肿瘤细胞表面抗原结合之抗体的抗原结合区。

6  权利要求5的结合配体，其中所述第一结合区含有与肿瘤抗原p185^HER2，牛奶粘蛋白核心蛋白，TAG-72，Lewis a，癌胚抗原(CEA)或肿瘤相关抗原结合之抗体的抗原结合区，所述肿瘤相关抗原与选自9.2.27，OV-TL3，MOv18，B3，KS1/4，260F9和D612的抗体结合。

7  权利要求4的结合配体，其中所述第一结合区含有与肿瘤脉管系统组分结合的抗体之抗原结合区。

8  权利要求7的结合配体，其中，所述第一结合区含有与肿瘤脉管系统细胞表面受体结合之抗体的抗原结合区。

9  权利要求的结合配体，其中，所述第一结合区含有与MHC II型蛋白质，VEGF/VPF受体，FGF受体，TGFβ，TIE，VCAM-1，P-选择蛋白，E-选择蛋白，α_vβ₃整合蛋白，多效蛋白，内皮唾酸蛋白或endoglin结合之抗体的抗原结合区。

10  权利要求9的结合配体，其中所述第一结合区含有与endoglin结合之抗体的抗原结合区。

11  权利要求10的结合配体，其中，所述第一结合区含有抗体的抗原结合区，所述抗原结合区与单克隆抗体TEC-4或单克隆抗体TEC-11相同的表位结合。

12  权利要求9的结合配体，其中所述结合区含有与VEGF受体结合之抗体的抗原结合区。

13  权利要求12的结合配体，其中所述第一结合区含有抗体的抗原结合区，所述抗原结合区与单克隆抗体3E11，3E7，5G6，4D8或10B10相同的表位结合。

14  权利要求12的结合配体，其中，所述第一结合区含有抗体的抗原结合区，所述抗原结合区与单克隆抗体TEC-110相同的表位结合。

15  权利要求7的结合配体，其中所述第一结合区含有与配体结合之抗体的抗原结合区，所述配体与肿瘤脉管系统细胞表面受体结合。

16  权利要求15的结合配体，其中所述第一结合区含有与VEGF/VPF，FGF，TGFβ，结合TIE的配体，肿瘤相关纤连蛋白异构体，微因子，肝细胞生长因子(HGF)，血小板因子4(PF4)，PDGF或TIMP结合的抗体的抗原结合区。

17  权利要求16的结合配体，其中所述第一结合区含有VEGF/VPF，FGF，TGFβ，结合TIE的配体，肿瘤相关纤连蛋白异构体结合的抗体的抗原结合区。

18  权利要求7的结合配体，其中所述第一结合区含有与可诱导肿瘤脉管系统组分结合之抗体的抗原结合区。

19  权利要求18的结合配体，其中所述第一结合区含有与用促凝剂诱导的肿瘤脉管系统组分结合之抗体的抗原结合区。

20  权利要求19的结合配体，其中所述第一结合区含有与用凝血酶诱导的肿瘤脉管系统组分结合之抗体的抗原结合区。

21  权利要求20的结合配体，其中所述第一结合区含有与P-选择蛋白或E-选择蛋白结合之抗体可抗原结合区。

22  权利要求18的结合配体，其中所述第一结合区含有与用细胞因子诱导的肿瘤脉管系统组分结合之抗体的抗原结合区。

23  权利要求22的结合配体，其中所述第一结合区含有与用细胞因子诱导的由单核细胞，巨噬细胞，肥大细胞，辅助T细胞，CD8-阳性T细胞或NK细胞释放的肿瘤脉管系统组分结合之抗体的抗原结合区。

24  权利要求22的结合配体，其中所述第一结合区含有与用细胞因子IL1，IL-4，TNF-α，TNF-β或IFN-γ诱导的肿瘤脉管系统组分结合之抗体的抗原结合区。

25  权利要求22的结合配体，其中所述第一结合区含有与E-选择蛋白，VCAM-1，ICAM-1，endoglin或MHC II型抗原结合之抗体的抗原结合区。

26  权利要求25的结合配体，其中所述第一结合区含有与E-选择蛋白结合之抗体的抗原结合区。

27  权利要求25的结合配体，其中其中所述第一结合区含有结合MHC II型抗原结合之抗体的抗原结合区。

28  权利要求7的结合配体，其中所述第一结合区含有与配体：受体复合物结合之，但当所述配体或受体不在配体：受体复合物中时，不与配体或受体结合之抗体的抗原结合区。

29  权利要求28的结合配体，其中所述第一结合区含有与单克隆抗体2E5，3E5或4E5相同的表位结合之抗体的抗原结合区。

30  权利要求4的结合配体，其中所述第一结合区含有与肿瘤基质结合之抗体的抗原结合区。

31  权利要求30的结合配体，其中所述第一结合区含有与腱生蛋白结合之抗体的抗原结合区。

32  权利要求30的结合配体，其中所述第一结合区含有与基膜组分结合之抗体的抗原结合区。

33  权利要求30的结合配体，其中所述第一结合区含有与激活的血小板结合之抗体的抗原结合区。

34  权利要求30的结合配体，其中所述第一结合区含有与可诱导的肿瘤基质组分结合之抗体的抗原结合区。

35  权利要求34的结合配体，其中所述第一结合区含有与用促凝剂诱导的肿瘤基质组分结合之抗体的抗原结合区。

36  权利要求35的结合配体，其中所述第一结合区含有与用凝血酶诱导的肿瘤基质组分结合之抗体的抗原结合区。

37  权利要求36的结合配体，其中所述第一结合区含有与RIBS结合之抗体的抗原结合区。

38  权利要求1的结合配体，其中所述第一结合区含有与疾病细胞或疾病相关脉管系统的组分结合的配体或受体。

39  权利要求38的结合配体，其中所述第一结合区含有与肿瘤细胞表面受体或与结合肿瘤细胞表面分子结合之配体结合的受体的可溶性结合区的配体。

40  权利要求38的结合配体，其中所述第一结合区含有与肿瘤脉管系统结合的配体或受体。

41  权利要求40的结合配体，其中所述第一结合区含有结合肿瘤脉管系统内皮细胞表面受体的配体。

42  权利要求41的结合配体，其中其中所述第一结合区含有与VEGF/VPF，FGF，TGFβ，结合TIE的配体，肿瘤相关纤连蛋白异构体，分散因子，肝细胞生长因子(HGF)，血小板因子4(PF4)，PDGF或TIMP结合的抗体的抗原结合区。

43  权利要求42的结合配体，其中所述第一结合区含有VEGF/VPF。

44  权利要求42的结合配体，其中所述第一结合区含有FGF。

45  权利要求40的结合配体，其中所述第一结合区含有与配体结合的受体的可溶性结合区，所述配体与肿瘤脉管系统内皮细胞表面受体结合。

46  权利要求45的结合配体，其中所述第一结合区含有VEGF/VPF受体的可溶性结合区。

47  权利要求1的结合配体，其中所述第一结合区与凝血因子可操纵相连。

48  权利要求47的结合配体，其中所述凝血因子含有维生素K-依赖性凝血因子II/IIa，VII/VIIa因子，IX/IXa因子或X/Xa因子。

49  权利要求48的结合配体，其中所述凝血因子含有没有Gla修饰的维生素K-依赖性凝血因子。

50  权利要求49的结合配体，其中通过在原核宿主细胞中表达编码维生素K-依赖性凝血因子的基因而制备所述凝血因子。

51  权利要求49的结合配体，其中通过处理维生素K-依赖性凝血因子蛋白质以除去或改变相应的谷氨酸残基而制备所述凝血因子。

52  权利要求49的结合配体，其中通过制备工程的凝血因子基因，然后在重组宿主细胞中表达所述基因而制备所述凝血因子，所述基因编码没有相应谷氨酸残基的维生素K-依赖性凝血因子。

53  权利要求47的结合配体，其中所述凝血因子含有组织因子或组织因子衍生物。

54  权利要求53的结合配体，其中所述凝血因子含有有激活VII因子能力的缺陷型的突变组织因子。

55  权利要求54的结合配体，其中所述凝血因子含有组织因子，所述组织因子在约157到约167之间的氨基酸有一突变。

56  权利要求55的结合配体，其中所述凝血因子含有突变体组织因子，其中将158位的Trp换成Arg；其中将162位的Ser换成Ala；其中将158位的Trp换成Arg；其中将162位的Ser换成Ala。

57  权利要求53的结合配体，其中所述凝血因子含有截断的组织因子。

58  权利要求57的结合配体，其中所述凝血因子含有二聚的截断的组织因子。

59  权利要求47的结合配体，其中所述凝血因子含有Russell氏蝰蛇毒因子X激活剂。

60  权利要求47的结合配体，其中所述凝血因子含有激活血小板的化合物。

61  权利要求60的结合配体，其中，所述凝血因子含有血栓噁烷A₂或血栓噁烷A₂合成酶。

62  权利要求47的结合配体，其中，所述凝血因子含有纤维蛋白溶解抑制剂。

63  权利要求62的结合配体，其中所述凝血因子含有α2-抗纤维蛋白溶酶。

64  权利要求1的结合配体，其中所述第一结合区与结合凝血因子的第二结合区可操作相连。

65  权利要求64的结合配体，还含有与所述第二结合区结合的凝血因子。

66  权利要求64的结合配体，其中所述第二结合区含有结合凝血因子之抗体的抗原结合区。

67  权利要求66的结合配体，其中所述第二结合区含有IgG抗体，IgM抗体或抗体的ScFv，Fv，Fab’，Fab，F(ab’)₂片段。

68  权利要求66的结合配体，其中所述第二结合区含有结合维生素K-依赖性凝血因子II/IIa，因子VII/VIIa，因子IX/IXa或因子X/Xa的抗体的抗原结合区。

69  权利要求68的结合配体，其中所述第二结合区含有结合没有Gla修饰的维生素K-依赖性凝血因子之抗体的抗原结合区。

70  权利要求66的结合配体，其中所述第二结合区含有结合组织因子之抗体的抗原结合区。

71  权利要求70的结合配体，其中所述第二结合区含有结合突变体组织因子之抗体的抗原结合区。

72  权利要求70的结合配体，其中所述第二结合区含有结合截断的组织因子之抗体的抗原结合区。

73  权利要求72的结合配体，其中所述第二结合区含有结合二聚截断的组织因子之抗体的抗原结合区。

74  权利要求66的结合配体，其中所述第二结合区含有结合Russell氏蝰蛇毒X因子激活剂，血栓噁烷A₂或α2-抗纤维蛋白溶酶之抗体的抗原结合区。

75  权利要求1的结合配体，其中所述第一结合区与所述凝血因子或与第二结合区经共价键可操作相连。

76  权利要求75的结合配体，其中所述第一结合区与所述凝血因子或与第二结合区经化学交联剂可操作相连。

77  权利要求75的结合配体，其中所述结合配体是通过在宿主细胞中表达重组载体而制备的融合蛋白，其中所述载体在同一阅读框架中含有编码与编码所述凝血因子或第二结合区之DNA片段可操作相连之第一结合区的DNA片段。

78  权利要求1的结合配体，其中所述第一结合区用抗生物素蛋白：生物素组合与所述凝血因子或所述第二结合区可操作相连。

79  权利要求1的结合配体，其中还定义为双特异性抗体，其含有结合肿瘤细胞，肿瘤相关脉管系统自组分或肿瘤相关基质之组分的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区与结合凝血因子的第二抗原结合区可操作相连。

80  权利要求79的结合配体，还定义为双特异性抗体的IgG抗体，IgM抗体或抗体的ScFv，Fv，Fab’，Fab，F(ab’)₂片段。

81  权利要求79的结合配体，还定义为双特异性抗体其含有结合MHXII型蛋白质的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区与结合截断的组织因子的第二抗原结合区可操作相连。

82  结合配体，含有：

(a)与疾病细胞，疾病相关的脉管系统或疾病相关基质的组分结合的第一结合区；与第一结合区可操纵相连的

(b)与工程凝血因子结合的工程凝血因子或第二结合区。

83  权利要求82的结合配体，其中所述工程凝血因子是没有Gla修饰的维生素K-依赖性促凝剂。

84  权利要求83的结合配体，其中所述工程凝血因子是没有Gla修饰的II/IIa因子，VII/VIIa因子，IX/IXa因子或X/Xa因子。

85  权利要求83的结合配体，其中所述工程凝血因子是通过在原核宿主细胞中表达维生素K-依赖性凝血因子而制备的。

86  权利要求83的结合配体，其中通过处理维生素K-依赖性凝血因子蛋白质以除去或改变相应的谷氨酸残基而制备所述工程凝血因子。

87  权利要求83的结合配体，其中通过制备工程的凝血因子基因，然后在重组宿主细胞中表达所述基因而制备所述工程凝血因子，所述基因编码没有相应谷氨酸残基的维生素K-依赖性凝血因子。

88  权利要求82的结合配体，其中所述工程凝血因子是含有与第二组织因或衍生物可操作相连之第一组织因子或衍生物的组织因子构建体。

89  权利要求88的结合配体，其中所述组织因子构建体含有截断的组织因子。

90  权利要求89的结合配体，其中所述组织因子构建体含有疏水膜插入部分。

91  权利要求90的结合配体，其中所述组织因子构建体含有截断的组织因子，所述截断的组织因子包括约3-约20个疏水氨基酸区。

92  权利要求91的结合配体，其中所述组织因子构建体含有截断的组织因子，所述截断的组织因子包括位于截断的组织因子N-或C-末端的疏水氨基酸区。

93  权利要求90的结合配体，其中所述组织因子构建体含有包括脂肪酸的截断的组织因子。

94  权利要求90的结合配体，其中所述组织因子构建体含有两个截断的组织因子，每个均包括膜插入部分。

95  权利要求88的结合配体，其中所述组织因子构建体含有经二硫键，硫醚或肽键可操作相连的第一和第二组织因子或衍生物。

96  权利要求82的结合配体，其中所述第一结合区与结合工程凝血因子的第二结合区可操作相连。

97  权利要求82的结合配体，其中所述第一结合区与工程凝血因子可操作相连。

98  权利要求97的结合配体，其中所述第一结合区经生物学可释放键与所述工程凝血因子相连。

99  权利要求98的结合配体，其中所述第一结合区经选择性可裂解肽键与所述工程凝血因子相连。

100 权利要求99的结合配体，其中所述第一结合区经肽接头与所述工程凝血因子相连，所述肽接头包括脲激酶，纤维蛋白溶酶，凝血酶，IXa因子，Xa因子或金属蛋白酶的裂解位点。

101 组织因子构建体，含有与第二组织因子或衍生物可操作相连的第一组织因子或衍生物。

102 权利要求101的组织因子构建体，含有可操作相连的第一，第二和第三组织因子或组织因子衍生物。

103  权利要求102的组织因子构建体，含有约5个可操作相连的组织因子或组织因子衍生物。

104  权利要求103的组织因子构建体，含有约10个可操作相连的组织因子或组织因子衍生物。

105  权利要求104的组织因子构建体，含有约20个可操作相连的组织因子或组织因子衍生物。

106  权利要求101的组织因子构建体，含有截断的组织因子。

107  权利要求106的组织因子构建体，含有包含疏水膜插入部分的截断的组织因子。

108  权利要求107的组织因子构建体，含有包含约3-约20个氨基酸区的截断的组织因子。

109  权利要求108的组织因子构建体，含有包含位于截断组织因子N-或C-末端的疏水氨基酸区的截断的组织因子。

110  权利要求107的组织因子构建体，含有包含脂肪酸的截断的组织因子。

111  权利要求107的组织因子构建体，含有两个截断的组织因子，每个包括疏水膜插入部分。

112  权利要求101的组织因子构建体，含有被修饰后含末端半胱氨酸残基的截断的组织因子。

113  权利要求112的组织因子构建体，含有两个截断的组织因子，每个都经过了修饰以含有一末端半‘胱氨酸残基。

114  权利要求112的组织因子构建体，还含有与所述半’胱氨酸残基可操作相连的抗体或抗体的抗原结合区。

115  权利要求106的组织因子构建体，含有被修饰后含有选择性可裂解的肽键的截断的组织因子。

116  权利要求115的组织因子构建体，其中所述选择性可裂解肽接头包括脲激酶，纤维蛋白溶酶，凝血酶，IXa因子，Xa因子或金属蛋白酶的裂解位点。

117  权利要求116的组织因子构建体，其中所述选择性可裂解肽接头包括间质胶原蛋白酶，明胶酶或溶基质素的裂解位点。

118  权利要求115的组织因子构建体，还含有与所述选择性裂解肽接头可操纵相连的抗体或抗体的抗原结合区。

119  权利要求101的组织因子构建体，含有在序列中可操纵相连的系列单位：半胱氨酸残基，选择性可裂解肽接头，疏水氨基酸区，第一截断的组织因子和第二截断的组织因子。

120  权利要求119的组织因子构建体，含有在序列中可操纵相连的系列单位：半胱氨酸残基，选择性可裂解肽接头，第一疏水氨基酸区，第一截断的组织因子和第二截断的组织因子，第二疏水氨基酸区。

121  权利要求119的组织因子，还含有与所述半胱氨酸残基可操纵相连的抗体或抗体的抗原结合区。

122  药物组合物，其含有药用形式的结合配体，所述结合配体含有：

(a)与疾病细胞，疾病相关的脉管系统或疾病相关基质的组分结合的第一结合区；与第一结合区可操纵相连的

(b)与凝血因子结合的凝血因子或第二结合区。

123  权利要求122的药物组合物，其中所述结合配体含有与凝血因子共价相连的第一结合区。

124  权利要求122的药物组合物，其中所述结合配体含有与结合凝血因子的第二结合区共价相连的第一结合区。

125  权利要求124的药物组合物，其中所述结合配体还含有与所述第二结合区非共价结合的凝血因子。

126  权利要求124的药物组合物，其中所述结合配体是双特异性抗体。

127  权利要求122的药物组合物，其中所述第一结合区与组织因子，组织因子衍生物或结合组织因子或组织因子衍生物之抗体的抗原结合区相连。

128  试剂盒在适宜的容器中含有：

(a)含有能够在疾病相连脉管系统或疾病相连基质中诱导表达靶抗原之生物学试剂的第一药物组合物；和

(b)含有结合配体的第二药物组合物，所述结合配体含有

(i)与疾病细胞，疾病相关的脉管系统或疾病相关基质的组分结合的第一结合区；与第一结合区可操纵相连的

(ii)与凝血因子结合的凝血因子或第二结合区。

129  权利要求128的试剂盒，其中所述第一药物组合物含有能够诱导靶抗原在疾病相连脉管内皮细胞上表达的生物学试剂。

130  权利要求128的试剂盒，其中所述第一药物组合物含有结合白细胞细胞表面上激活之抗原和脉管化肿瘤之肿瘤细胞细胞表面上的肿瘤抗原的双特异性抗体。

131  权利要求130的试剂盒，其中所述第一药物组合物含有结合激活的抗原CD2，CD3，CD14，CD16(IgE的FcR)，CD28或T细胞受体抗原的双特异性抗体。

132  权利要求131的试剂盒，其中所述第一药物组合物含有结合CD14并诱导单核细胞/巨噬细胞表达IL-1的双特异性抗体。

133  权利要求132的试剂盒，其中所述第二药物组合物含有包括结合E-选择蛋白之第一结合区的结合配体。

134  权利要求131的试剂盒，其中所述第一药物组合物含有结合CD28并诱导Y细胞表达IFN-γ的双特异性抗体。

135  权利要求134的试剂盒，其中所述第二药物组合物含有包含结合MHCII型抗原之第一结合区的结合配体。

136  权利要求134的试剂盒，还包含第三药物组合物，所述药物组合物含有能够抑制MHCII型抗原在正常组织脉管内皮细胞中的表达。

137  权利要求136的试剂盒，还含有包括环孢菌素的第三药物组合物。

138  权利要求130的试剂盒，其中所述第一药物组合物含有双特异性抗体，所述双特异性抗体结合肿瘤抗原p185^HER2，牛奶核心蛋白，TAG-72，Lewis a癌胚抗原(CEA)或结合选自9.2.27，OV-TL3，MOv18，B3，KS1/4260F9和D612的抗体的肿瘤相关抗原。

139  权利要求128的试剂盒，其中所述第一药物组合物含有能够诱导靶抗体在疾病相关基质组分中表达的生物学试剂。

140  权利要求139的试剂盒，其中所述第一药物组合物含有结合肿瘤细胞或肿瘤基质组分以及组织因子，组织因子衍生物凝血酶原，VII/VIIa因子，IX/IXa因子，X/Xa因子，XI/XIa因子，或Russell氏蝰蛇毒X因子激活剂的双特异性抗体。

141  权利要求140的试剂盒，其中所述第二药物组合物含有包括与P-选择蛋白结合之第一结合区的结合配体。

142  权利要求140的试剂盒，其中所述第二药物组合物含有包括与E-选择蛋白结合之第一结合区的结合配体。

143  结合配体在制备将凝血因子传递到疾病相关脉管系统中的药物的用途，所述结合配体含有：

(a)与疾病细胞，疾病相关的脉管系统或疾病相关基质的组分结合的第一结合区；与第一结合区可操纵相连的

(b)与凝血因子结合的凝血因子或第二结合区。

144  根据权利要求143的用途，其中将所述结合配体用于制备将外源凝血因子传递到疾病相关的脉管系统，所述结合配体含有与凝血因子共价相连的第一结合区。

145  根据权利要求143的用途，其中将所述结合配体用于制备将外源凝血因子传递到疾病相关的脉管系统，所述结合配体含有与第二结合区共价相连的第一结合区，所述第二结合区与凝血因子非共价相连。

146  根据权利要求143的用途，其中将所述结合配体用于制备将外源凝血因子传递到疾病相关的脉管系统，所述结合配体含有与第二结合区共价相连的第一结合区，所述第二结合区结合外源凝血因子并在将所述药物施用于所述动物后，在所述疾病相连的脉管系统浓缩所述因子。

147  根据权利要求143的用途，其中打算用所述药物治疗前列腺增生(BPH)，糖尿病视网膜病，血管再狭窄，动静脉畸形(AVM)，血管瘤，新血管青光眼，类风湿性关节炎或牛皮癣。

148  根据权利要求143的用途，其中打算将所述药物用于治疗患脉管化肿瘤的动物。

149  根据权利要求148的用途，其中将所述药物在诱导可击靶的组分在动物的肿瘤相关脉管系统或肿瘤相关基质中表达后使用，其中所述药物含有包括结合诱导的可击靶组分之第一结合区的结合配体。

150  根据权利要求149的用途，其中用细胞因子在肿瘤相关的脉管系统中诱导表达可击靶的组分。

151  根据权利要求150的用途，其中用由动物白细胞释放的细胞因子在肿瘤相关脉管系统中诱导表达可击靶组分。

152  根据权利要求151的用途，其中用由动物单核细胞，巨噬细胞，肥大细胞，辅助T细胞，CD8-阳性T细胞或NK细胞释放的细胞因子在肿瘤相关脉管系统中诱导表达可击靶组分。

153  根据权利要求151的用途，其中用细胞因子IL-1，IL-4，TNF-α，YNF-β，IFN-γ在肿瘤相关脉管系统中诱导表达可击靶组分。

154  根据权利要求151的用途，其中通过给动物施用药物组合物来激活动物的白细胞以释放细胞因子，所述药物组合物含有结合白细胞细胞表面激活抗原的激活抗体。

155  根据权利要求154的用途，其中所述激活抗体结合白细胞细胞表面激活抗原CD2，CD3，CD14，CD16，IgE的FcR，CD28或T细胞受体抗原。

156  根据权利要求154的用途，其中激活的抗体是结合并交联激活的动物肿瘤内白细胞和肿瘤细胞的双特异性抗体。

157  根据权利要求156的用途，其中所述激活抗体是结合CD14或CD28，并结合肿瘤细胞细胞表面抗原的双特异性抗体。

158  根据权利要求150的用途，其中在肿瘤相关的脉管系统中诱导表达E-选择蛋白，VCAM-1，ICAM-1，endoglin或MHCII型抗原。

159  根据权利要求158的用途，其中在肿瘤相关的脉管系统中诱导表达E-选择蛋白。

160  根据权利要求158的用途，其中在肿瘤相关的脉管系统中诱导表达MHCII型抗原。

161  根据权利要求160的用途，其中通过给动物施用环孢菌素来抑制动物正常组织内内皮细胞表达MHCII型抗原；随后通过给动物施用结合CD28和肿瘤细胞细胞表面抗原的双特异性抗体来诱导MHCII型抗原在肿瘤相关脉管系统中的表达。

162  根据权利要求160的用途，其中通过给动物施用抑制IFN-γ在T细胞中生产的抗-CD4抗体来抑制动物正常组织中内皮细胞的MHC II型抗原表达；随后通过给动物施用在疾病位点结合抗原的生产IFN-γ的T细胞来诱导在肿瘤相关脉管系统中表达MHC II型抗原。

163  根据权利要求162的用途，其中用包括下列步骤的方法制备生产IFN-γ的T细胞克隆：

(a)从动物的疾病位点取出组织切片；

(b)从疾病位点提取渗入的白细胞；和

(c)体外扩增渗入的白细胞以提供生产IFN-γ的克隆。

164  根据权利要求149的用途，其中用凝血酶诱导在肿瘤相关脉管系统中表达可击靶的组分。

165  根据权利要求164的用途，其中通过给动物施用药物组合物来诱导凝血酶的生产，所述药物组合物含有结合肿瘤细胞或肿瘤基质组分以及组织因子，组织因子衍生物凝血酶原，VII/VIIa因子，IX/IXa因子，X/Xa因子，XI/XIa因子，或Russell氏蝰蛇毒X因子激活剂的双特异性抗体。

166  根据权利要求164的用途，其中在肿瘤相关脉管系统中诱导P-选择蛋白的表达。

167  根据权利要求164的用途，其中在肿瘤相关脉管系统中诱导E-选择蛋白的表达。

168  凝血结合配体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述结合配体含有：

(a)与疾病细胞，疾病相关的脉管系统或疾病相关基质的组分结合的第一结合区；与第一结合区可操纵相连的

(b)与凝血因子结合的凝血因子或第二结合区。

169  根据权利要求168的用途，其中将所述药物配制用于非肠道施用。

170  权利要求168的用途，其中配制所述药物用于注射到脉管化的肿瘤位点。

171  根据权利要求160的用途，其中所述药物适用于人患者。

172  根据权利要求168的用途，其中所述凝血结合配体含有与组织因子，截断的组织因子，二聚组织因子或结合组织因子或组织因子衍生物之抗体的抗原结合区的第一结合区。

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