CN107454906A - 使用凝固因子和多特异性抗体的联合治疗 - Google Patents

使用凝固因子和多特异性抗体的联合治疗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于具有出血病症的患者的疗法，所述疗法包括与抗体联合使用某些血液凝固(凝血)因子。

Description

使用凝固因子和多特异性抗体的联合治疗
技术领域
本发明涉及用于具有出血病症的患者的疗法，所述疗法包括与抗体联合使用某些血液凝固(凝血)因子。
背景技术
凝固系统
任何较大的生物体都具有血液循环系统，该系统将氧和营养物递送至不同的器官，并处理二氧化碳和废物。但是，为了使血液循环系统起作用，血管中的损伤必须快速地和有效地封闭。该功能由血液凝固系统实现，所述血液凝固系统是一个允许血液形成血小板聚集体和纤维蛋白凝胶(它们能够封闭血管损伤)的复杂机制。
在血液凝固系统中涉及的一个机制是凝固因子级联，这是一系列丝氨酸蛋白酶，它们变得连续活化并最终导致凝血酶(血液凝固系统的中枢酶)的形成。凝血酶能够将纤维蛋白原分裂成纤维蛋白，后者沉降、聚合成纤维蛋白纤维，后者形成纤维蛋白凝块。凝血酶也会活化辅因子，后者加速它自身的产生(FV和FVIII)，活化FXIII(一种转谷氨酰胺酶)，后者交联并因而稳定化纤维蛋白凝块，且凝血酶也是血小板的有效活化剂。
在凝固因子级联中，当特定辅因子(分别是FVa和FVIIIa)以它们的活性形式存在时，在凝血酶形成之前的两个步骤包含被非常加速的酶(FXa和FIXa)。如提及的，当凝血酶变得可在循环中以足以超过血浆的抑制能力的量得到时，这些辅因子被凝血酶活化(参见图1)。
出血
出血是在凝固级联的不充分活化的情况下最严重的且显著的表现之一，且可能发生在局部部位或是全身性的。局限性出血可能与伤害有关，且可能被有缺陷的止血机制进一步复杂化。凝固在出血病症中是不充分的，所述出血病症可能由先天性凝血病症、获得性凝血病症或创伤诱发的出血性病症造成。任一种凝固因子的先天性或获得性缺乏可能与出血趋势有关。
血液凝固因子缺乏
凝固因子缺乏可以导致出血并发症。该缺乏可以归因于血液稀释，即不含有凝固因子的水溶液的输液，或由低血小板数目或增加的凝固活性和因子消耗引起的血小板和/或凝固因子的损失。
凝固因子缺乏的另一个原因可以是维生素K拮抗剂(可密定或有关化合物)的应用。维生素K拮抗剂会抑制凝固因子FVII、FX、FII和FIX的γ羧基化，这使得这些因子对于凝固过程是无效的。
凝固因子缺乏的另一个原因可以是先天性基因突变，这会导致在功能上有缺陷或减少至不产生特定凝固因子。由于体内的大多数基因可以以两个拷贝(父亲和母亲基因)得到的事实，编码凝固因子的基因的突变通常不会导致严重出血表型，因为50％的凝固因子的活性通常对于患者的适当止血而言仍然是足够的。因此，通常先天性凝固因子缺乏是非常罕见的，具有两个例外：血友病A和B。
血友病A和B
凝固因子FIX和FVIII都在X染色体中编码。男性仅具有一个X染色体。因此在FVIII或FIX基因中的突变可以导致男性的出血病症表型，因为在男性中在该基因中不存在基因冗余。
血友病A(FVIII缺乏)的患病率是5,000个活出生男性中的大约1个或每10,000个活出生中的1个。尚未报道种族差别，且在2012年在不同区域登记的患者的数目包括日本的4627人、北美洲的17,482人和五个主要欧洲国家(英国、法国、德国、意大利和西班牙)的18,461人。
主要出血部位是关节内、肌肉内、皮下、口内、颅内、胃肠和鼻内。重复的关节内出血是在具有血友病A的患者中降低健康相关生活质量的主要因素，因为它可能进展为不能行走的关节病和血友病性关节病，且关节置换外科手术可能是必要的。
根据血液中的内源性FVIII活性，将血友病A的严重程度分类。具有小于1％的FVIII活性的患者具有严重疾病，具有1％至5％之间的活性的患者具有中等疾病，具有大于5％且小于40％的活性的患者具有轻度疾病。不顺从严格FVIII预防方案或没有得到FVIII产品的具有严重血友病的患者会在1个月内经历几次出血发作，具有高自发出血频率(30-40的每年出血率)，这比具有中等或轻度疾病的患者频繁得多。
获得性血友病：获得性血友病是罕见的、但是潜在地危及生命的由自身抗体(抑制剂)的产生造成的出血病症，所述自身抗体针对血浆凝固因子，最常见地是因子VIII(FVIII)，但是潜在地也针对von Willebrand因子、因子IX、V、XI、XII和XIII。
凝固因子缺乏的疗法
凝固因子缺乏的疗法在很大程度上随根本病症而变化。
在稀释凝血病中，所有凝固因子都缺失。因此，经常用新鲜冷冻血浆治疗患者，所述血浆含有所有凝固因子，也包括结构蛋白纤维蛋白原。
通常用浓缩的维生素k依赖性的凝固因子FII、FVII、FX和FIX治疗由维生素K拮抗剂的作用引起的出血。这些浓缩物被称作凝血酶原复合物浓缩物。
通常用各种因子的应用来治疗单因子缺乏，例如血友病A中的FVIII浓缩物、血友病B中的FIX浓缩物、FVII缺乏中的FVII浓缩物等。
使用凝血酶原复合物浓缩物的疗法通常不会改善血友病A患者中的凝固，因为这些具有因子FII、FVII、FX和FIX的正常浓度(因为这些患者缺乏FVIII)。凝血酶原复合物浓缩物的应用适应症也限于维生素k依赖性因子的凝固因子缺乏的反转。
单凝固因子活性对凝血酶产生的影响的分析表明，当大多数因子的凝固因子活性低于大约20％时，凝血酶产生受到很大损害，且在20-100％之间的凝固因子水平发现了对凝血酶产生的少得多的影响(Al Dieri R，等人Thromb Haemost.2002年8月；88(4)：576-82；参见其中的图1)。
使用凝固因子的促凝疗法的适应症：
由血液稀释造成的出血是相对罕见的事件，通常发生在手术中或手术后或创伤性出血以后。在这些情况下，通常通过外科手术或在重症监护中治疗患者，其中常规地进行血浆、凝固因子和其它药物的输液。
由维生素k拮抗剂造成的出血也是相对罕见的，且通常可以通过暂停维生素K拮抗剂或通过应用维生素K来控制。
与具有血友病A的患者不同，所述出血病症是一种慢性病症且因此经常进行预防性疗法。由于仅8-19小时的FVIII的短半衰期，对于预防性治疗而言，每周3次静脉内输注是必要的，这对于患者而言是麻烦的且损害生活质量。这些静脉内应用在具有血友病A的儿童中是特别麻烦的，由于较小和较大损伤在儿童中相对于成年人更频繁的发生，所述儿童对预防性治疗具有高需求。
使用FVIII的替代疗法在血友病A患者中的另一个问题是，FVIII对于严重血友病A患者而言是一种外源蛋白，相当大比例(高达30％)的患者形成针对因子FVIII的抗体(“抑制剂”)，这使得使用FVIII的疗法在许多患者中是不可行的(因为输入的FVIII在这些患者中迅速被他们的抗-FVIII抗体灭活)。
存在某些用于治疗具有血友病A和抑制剂的患者中的凝固病症的治疗策略，即应用活化的凝血酶原复合物浓缩物(aPCC，例如Baxter的)或高水平的活化的FVIIa(Novo Nordisk的)。两种策略具有缺点：由于活化的凝固因子的应用，两种药剂可以导致血栓性并发症(例如Baudo等人，Blood 120(2012)39-46报道了用rVIIa或aPCC治疗的获得性血友病患者中3.6％的血栓形成率)。(也参见Bui等人，J Thorac CardiovascSurg.124(2002)852-854，Chalwin等人；Eur J Cardiothorac Surg.34(2008)685-686，和Aledort；J Thromb Haemost.2(2004)1700-1708)。
另外，所述药剂不含有FVIII且没有替换缺失的因子FVIII活性，因此可以导致不稳定的止血作用。rFVIIa产品具有短血液半衰期，且因此需要每2-3小时静脉内施用。大约每12h应用活化的PCC直到出血停止。
抗-因子IXa/X多特异性抗体(“FVIII模拟抗体”)
为了克服用于血友病A的所述疗法的限制，已经开发了模拟FVIII的功能的抗-因子IXa/X双特异性抗体。这些抗体是双特异性的且含有FIX/FIXa的结合位点以及FX的结合位点。通过这种双特异性结合，所述抗体导致FIXa和FX的结合，这会显著地增加在没有FVIII存在下FIXa的酶效率。
抗-因子IXa/X多特异性抗体的双特异性例子描述在例如US 2013/0330345中，其使FIXa的酶活性增加5700倍，这是大约10％的加速，后者在没有血友病的个体中用FVIII的正常活性实现(参见图3)(Fay PJ.Activation of factor VIII and mechanisms ofcofactor action.Blood Rev.2004年3月；18(1)：1-15)。
在有和没有抑制剂的血友病A患者中使用抗-因子IXa/X双特异性抗体(ACE910；参见A.Muto，等人，Blood，124(2014)3165-3171))执行的临床和临床前研究中，证实了该策略非常有效地预防出血并发症。
这样的抗体用于治疗血友病A的应用与FVIII的应用相比具有三个特殊优点：
抗体具有几周的长半衰期，这与FVIII的半衰期相比长大约40-50倍。这允许每月仅应用2次来执行预防性治疗，与此相比，FVIII需要每周3次。
抗体可以作为皮下注射剂来施用，与FVIII的应用需要静脉内注射相比，这对于患者而言容易的多和更少麻烦。对于将用这些抗体替代FVIII输注进行治疗的儿童而言，这是特别真实的。
ACE910和类似抗体的应用没有造成针对FVIII的抑制剂形成。
如抗-因子IXa/X双特异性抗体ACE910在临床研究中的优良效力证实的(Abstracts 56th ASH Annual Meeting Program和Abstracts 691 Safety andProphylactic Efficacy Profiles of ACE910，a Humanized Bispecific AntibodyMimicking the FVIII Cofactor Function，in Japanese Hemophilia A Patients Bothwithout and with FVIII Inhibitors)，抗-因子IXa/X双特异性抗体在加速FIX的酶活性中的活性对于该药物在血友病A患者中的预防性应用而言是足够的。
如提及的，在没有FVIIIa存在下抗-因子IXa/X双特异性抗体的存在对FIXa活性的加速与单独FIXa的活性相比是大约5700倍，但是与在有FVIIIa存在下的FIXa活性相比弱约90％。抗-因子IXa/X双特异性抗体对FIX活性的这种中等加速非常可能在长期预防性治疗中是有益的，因为这可以导致与活化的凝血酶原复合物浓缩物或高剂量的活化的FVII的应用相比更低的血栓形成活性。
未解决的问题：
尽管已经证实使用FVIII模拟抗体的疗法可有效地用作血友病A患者的预防性治疗，但是可以想象，在某些患者中，比由这些单独抗体提供的活性更高的促凝活性是合乎需要的。这可以是例如创伤以后或在大手术过程中的情况。
一个选项是增加FVIII模拟抗体的浓度。但是，已经证实，甚至增加的抗-因子IXa/X双特异性抗体ACE910浓度不会导致与健康个体的FVIIIa活性所实现的结果相同的FIXa活性。
显然，可以想象在这些情形中应用FVIII。这在具有FVIII抑制剂的患者中不会奏效，因为这些被输入的FVIII迅速灭活。在没有抑制剂的患者中，患者可能暴露于抑制剂形成的风险。
另一个策略是另外应用活化的凝血酶原复合物浓缩物或活化的FVII。这再次将患者暴露于增加的与这些化合物有关的血栓风险。
凝固因子缺乏的疗法经常基于缺失的凝固因子的替换。这意味着，如果所有因子都由于出血和血液稀释而缺失，那么患者通常将使用新鲜冷冻血浆(FFP)接受所有因子。如果维生素k依赖性因子由于抗-维生素k疗法的并发症而缺失，那么使用凝血酶原复合物浓缩物替换维生素依赖性因子。如果FVIII缺失(即在血友病A中)，那么输入FVIII，且如果FIX缺失(即在血友病B中)，那么施用FIX。
抑制剂血友病A是一个挑战，因为它不允许替换因子VIII，这是由于以下事实：针对FVIII的抗体会迅速灭活输入的因子，并且输液也可以导致患者中的抑制剂水平的增加(由于它的免疫应答)。
在这里通常输入活化的凝固因子(活化的凝血酶原复合物浓缩物或大量活化的FVII)。这些活化的因子会恢复凝固系统活化，甚至在没有关键辅因子FVIII存在下。但是，也存在限制，因为这些药物伴有显著的血栓风险，且不总是提供可预测的和持久的止血应答。
FVIII模拟抗体是在有和没有抑制剂的血友病A患者中恢复凝固活化潜力的新策略。这些新药物模拟FVIII的作用并使FIX的活性与没有FVIII的情形相比增加约5,700倍。但是，FIXa的活性达到具有正常FVIIIa水平的生理学活性的大约10％。这最可能对于血友病A患者的预防性治疗而言是最佳的，因为FIXa活性的这种中等加速对于止血应答而言是足够的，没有增加血栓风险。
但是，仍然需要进一步加速用于特定情形的FVIII模拟抗体的促凝活性，例如在创伤以后或在大手术过程中。
发明内容
本发明提供了用于治疗血友病A的多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体与凝固因子IX联合使用。
本发明提供了用于治疗血友病A的凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
本发明提供了用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体与凝固因子IX联合使用。
本发明提供了用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
本发明提供了用于治疗血友病A的以下物质的组合
i)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和
ii)凝固因子IX。
本发明提供了用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的以下物质的组合
i)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和
ii)凝固因子IX。
本发明提供了多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，
其中所述治疗是与凝固因子IX组合。
本发明提供了凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
本发明提供了多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)用于制备药物的用途，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，
其中所述治疗是与凝固因子IX组合。
本发明提供了凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
在本发明的一个实施方案中，所述遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者遭受凝固因子VIII的先天性或获得性缺乏。
在本发明的一个实施方案中，所述缺乏通过抗体、其它抑制剂、消耗或稀释而获得。
本发明提供了根据上述实施方案中的任一个的组合、抗体或用途，
a)用于增加凝血酶产生；
b)用于增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)用于加速凝血酶产生/形成；
d)用于增加或加速凝血酶产生/形成；
e)用于加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)用于增强血液凝固；
g)用于增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)用于预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等。
本发明提供了根据上述实施方案中的任一个的组合、抗体或用途
a)其中存在增加的出血风险，
b)在外科手术或其它侵袭性手术中，和/或
c)血管损伤以后。
本发明的一个实施方案是上述的组合、抗体或用途，其中另外联合使用a)凝固因子II或b)凝固因子X、c)凝固因子II和X；或d)凝固因子II、X和VII。
本发明的一个实施方案是上述的组合、抗体或用途，其中凝固因子IX被包含在凝血酶原复合物浓缩物(PCC)中。
在本发明的一个实施方案中，这样的凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII和FX。
在本发明的一个实施方案中，这样的凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII、FX和FVII。
在本发明的一个实施方案中，上述的抗体是双特异性的，且所述结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：105、106和107各自的H链CDR1、2和3氨基酸序列(Q499的H链CDR)，和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)，且所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：126、127和128各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J327的H链CDR)和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)。
在本发明的一个实施方案中，上述的抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
在本发明的一个实施方案中，所述多特异性抗体包含：第一多肽，其包含结合血液凝固因子IX和/或活化的血液凝固因子IX的第一抗原结合位点；和第三多肽，其包含结合血液凝固因子IX和/或活化的血液凝固因子IX的第三抗原结合位点；以及第二多肽，其包含结合血液凝固因子X的第二抗原结合位点；和第四多肽，其包含结合血液凝固因子X的第四抗原结合位点。在一个实施方案中，这样的多特异性抗体包含第一多肽至第四多肽，其中所述第一多肽和所述第三多肽各自包含针对血液凝固因子IX或活化的血液凝固因子IX的抗体各自的H链或L链的抗原结合位点；且所述第二多肽和所述第四多肽各自包含针对血液凝固因子X的抗体各自的H链或L链的抗原结合位点。
令人惊讶地，我们发现将凝固因子IX(单独地或与其它凝固因子如X和/或II组合地，例如也被包括在PCC中)增加到生理学水平以上可以显著地增加用FVIII模拟抗体治疗的血友病A患者的凝血酶产生，且因此可用于治疗血友病A。这是惊人的，因为人们不能预见到将FIX水平增加到生理学水平以上会增加特别是FVIII缺乏和血友病A的样品中的凝血酶产生(因为迄今为止仅知道FIX用于增加FIX缺乏的血浆/遭受血友病B的患者中的凝血酶产生)。
增强凝血酶产生对凝固系统具有多种作用，因为凝血酶是凝固的关键酶。凝血酶将纤维蛋白原分裂成纤维蛋白且因此导致纤维蛋白凝块形成，凝血酶活化血小板。因此，凝血酶产生的增加也导致增加的纤维蛋白凝块形成和血小板活化。另外，规则的凝血酶形成也导致较低的纤维蛋白溶解潜力(借助于TAFI＝凝血酶可活化的纤维蛋白溶解抑制剂)。
本发明的方法的优点是多样的：
它允许进一步延伸FVIII模拟抗体的促凝活性。因为仅凝固因子被输入，与在活化的PCC中的活化的凝固因子和FVIIa的应用相比血栓风险更低。因为所述因子都与FVIII无关，对血友病A患者的这种治疗不存在针对FVIII的自身抗体形成的风险。
因此，通过本发明，借助于进一步增加药物的促凝效应，进一步补充了抗-因子IXa/X双特异性抗体(FVIII模拟抗体)的有价值的性能如有利的药代动力学、在FVIII抑制剂患者中的优秀活性、优良应用途径(皮下相对于静脉内)。在使用因子IXa/X双特异性抗体的连续单一疗法中，可以实现由更低凝血酶产生(相对于FVIII治疗)引起的高安全裕度。因此，本发明对于某些事件的(暂时)增加的凝血酶产生而言是特别有用的：外科手术、急性创伤等。由于与所述抗体联合使用的凝固因子IX的相对短的半衰期(25h)(相对于因子IXa/X双特异性抗体半衰期(皮下注射以后约4-5周)，增加的凝血酶产生的影响可以限于上述事件的某些时间段(而不在长期治疗过程中造成不必要的血栓形成风险)。
抗-FX/FIXa抗体与非活化的凝固因子(单独的FIX或与因子VII、X和II中的一种或几种组合的FIX)的组合不会给患者添加任何形式的有活性的凝固酶。仅当组织因子在血管损伤部位释放时，凝血酶产生可以发生(参见图2-本发明的组合的示例性方案)。
相反，使用有活性的凝固因子的疗法可以阻碍凝固过程在血管损伤部位处的局部化，这通过大约3％的显著血栓形成率证实(Baudo等人，Blood 120(2012)39-46)。
因此，本发明允许用FVIII模拟抗体治疗的患者的增加的促凝活性，这不是基于FVIII或活化的凝固因子的应用。
令人惊讶地，我们发现，维生素K依赖性因子FIX和另外例如FX和FII的应用会增加用因子IXa/X双特异性抗体治疗的血友病A血浆的凝血酶产生(和因此增加促凝活性)，尽管所述样品已经含有正常水平的这些因子。单独FIX的应用也会增加含有因子IXa/X双特异性抗体的患者样品的凝血酶产生。
本发明的方法的另一个优点是，应用的凝固因子(FII、FIX和FX)在循环中具有与FVIIa(2.5h)和FVIII(12h)相比相对长的半衰期(～65h、～25h、～40h)。
因子IXa/X双特异性抗体与凝固因子FIX、FX和/或FII的组合的另一种用途在需要促凝治疗的其它情形中也可能是有益的，诸如由直接地或间接地起作用的抗凝血剂引起的出血、在具有凝血病的患者或在经历与FVIII缺乏无关的出血并发症的患者中的外科手术。
本发明的一个方面是含有凝固因子FIX和/或和/或FII的组合物，所述凝固因子可以源自血浆捐献或使用重组蛋白生产而产生。
本发明的一个实施方案是如本文中所述的组合、抗体或用途，其中在用抗-因子IXa/X双特异性抗体治疗的血友病A患者中以10U-200U FIX/kg体重的量施用FIX。在一个实施方案中，另外，以10U-200U FX/kg体重、优选50-200U FIX/kg体重的量施用FX。
本发明的一个实施方案是如本文中所述的组合、抗体或用途，其中在用抗-因子IXa/X双特异性抗体治疗的血友病A患者中以10U-200U FIX/kg体重的量施用FIX。在一个实施方案中，另外，以10U-200U FII/kg体重的量施用FII。
本发明的一个实施方案是如本文中所述的组合、抗体或用途，其中在用抗-因子IXa/X双特异性抗体治疗的血友病A患者中以10U-200U FIX/kg体重的量施用FIX。在一个实施方案中，另外，以10U-200U FII/kg体重和10U-200U FX/kg体重的量施用FII和FX。
本发明的一个实施方案是如本文中所述的组合、抗体或用途，其中在用抗-因子IXa/X双特异性抗体治疗的血友病A患者中以10U-200U PCC/kg体重的量施用凝血酶原复合物(PCC)。
附图说明
图1是血液凝固系统的示意图：该图显示了血管的横截面。血管壁被具有抗血栓性能的内皮细胞覆盖。当血管损伤发生时，内皮细胞层断裂，且内皮下细胞暴露于血液。由此释放组织因子(TF)，其为具有强促凝活性的内皮下细胞的跨膜蛋白。TF与凝固因子FVIIa形成复合物，所述复合物然后将FX活化为FXa和将FIX活化为FIXa。组织因子途径抑制剂(TFPI)会抑制TF-FVIIa复合物对FX的直接活化，而只要辅因子FV和FVIII不以它们的活性形式存在，因子Xa和XIa的活性较慢。一旦形成游离的凝血酶，它将FV和FVIII活化为它们的活性形式，且凝血酶产生的速度极大地加速。但是，在血友病A中，FVIII缺失，且因此凝血酶产生的速度保持非常低，这导致出血并发症。
图2：显示了双特异性的抗-FX/FIXa抗体(Bsab FIX/FX)与因子IX的组合应用或者因子IX与FX和/或FII的组合的示意图。
加下划线：增加Bsab FIX/FX的促凝活性的凝固因子
图3a至3c：抗-FX/FIXa抗体添加相对于FVIII添加对缺乏凝固因子VIII的血浆样品(作为以凝固因子VIII的缺乏或机能病症为特征的疾病如例如血友病A的模型)中的凝血酶产生的对比作用。
x-轴：时间[分钟]
y-轴：凝血酶[nM]
图3a：FVIII的添加导致快速的凝血酶产生，和与缺乏FVIII的样品相比共高7倍的凝血酶产生。
图3b：Bsab FIX/FX的添加也导致凝血酶产生的显著增加，其与缺乏FVIII的样品相比高3.4倍-4.4倍。
图3c：对比补充了FVIII或Bsab FIX/FX的样品的凝血酶产生。
图4a至4b：抗-FX/FIXa抗体与FIX的组合相对于FVIII对缺乏凝固因子VIII的血浆样品(作为以凝固因子VIII的缺乏或机能病症为特征的疾病如例如血友病A的模型)中的凝血酶产生的对比作用。
x-轴：时间[分钟]
y-轴：凝血酶[nM]
图4a：FIX向用Bsab FIX/FX处理过的缺乏FVIII的血浆的组合/添加：
FIX(100％)向用Bsab FIX/FX处理过的缺乏FVIII的血浆的添加导致凝血酶产生的显著增加。另外，如在简图中所示，FIX的添加使达到峰值的时间显著缩短，即不仅使凝血酶产生增加，而且使凝血酶产生加速。如在简图中所见，用Bsab FIX/FX处理过的样品的凝血酶产生峰值以及达到峰值的时间与含有100％FVIII的样品匹配。
图4b：包含FIX的凝血酶原复合物浓缩物(PCC)向用Bsab FIX/FX处理过的缺乏FVIII的血浆的组合/添加：
PCC(1U/ml)向用Bsab FIX/FX处理过的缺乏FVIII的血浆的添加导致凝血酶产生的显著增加。在含有75μg Bsab FIX/FX/ml的样品中，这导致凝血酶产生的94％增加。在含有25μg RO5534262/ml的样品中，发现了凝血酶产生的90％增加。在两种情况下，具有PCC添加的Bsab FIX/FX处理过的样品相对于补充FVIII的样品，凝血酶产生峰值是类似的。
具体实施方式
本发明提供了用于治疗血友病A的多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体与凝固因子IX联合使用。
本发明提供了用于治疗血友病A的凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
本发明提供了用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体与凝固因子IX联合使用。
本发明提供了用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
本发明提供了用于治疗血友病A的以下物质的组合
i)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和
ii)凝固因子IX。
本发明提供了用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的以下物质的组合
i)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和
ii)凝固因子IX。
本发明提供了多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，
其中所述治疗是与凝固因子IX组合。
本发明提供了凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
本发明提供了多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)用于制备药物的用途，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，
其中所述治疗是与凝固因子IX组合。
本发明提供了凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
在本发明的一个实施方案中，所述遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者遭受凝固因子VIII的先天性或获得性缺乏。
在本发明的一个实施方案中，所述缺乏通过抗体、其它抑制剂、消耗或稀释而获得。
本发明提供了根据上述实施方案中的任一个的组合、抗体或用途，
a)用于增加凝血酶产生；
b)用于增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)用于加速凝血酶产生/形成；
d)用于增加或加速凝血酶产生/形成；
e)用于加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)用于增强血液凝固；
g)用于增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)用于预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等。
本发明提供了根据上述实施方案中的任一个的组合、抗体或用途
a)其中存在增加的出血风险，
b)在外科手术或其它侵袭性手术中，和/或
c)血管损伤以后。
本发明的一个实施方案是上述的组合、抗体或用途，其中另外联合使用a)凝固因子II或b)凝固因子X、c)凝固因子II和X；或d)凝固因子II、X和VII。
本发明的一个实施方案是上述的组合、抗体或用途，其中凝固因子IX被包含在凝血酶原复合物浓缩物(PCC)中。
在本发明的一个实施方案中，这样的凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII和FX。
在本发明的一个实施方案中，这样的凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII、FX和FVII。
在本发明的一个实施方案中，上述的抗体是双特异性的，且所述结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：105、106和107各自的H链CDR1、2和3氨基酸序列(Q499的H链CDR)和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)，且所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：126、127和128各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J327的H链CDR)和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)。
在本发明的一个实施方案中，上述的抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
在本发明的一个实施方案中，所述多特异性抗体包含：第一多肽，其包含结合血液凝固因子IX和/或活化的血液凝固因子IX的第一抗原结合位点；和第三多肽，其包含结合血液凝固因子IX和/或活化的血液凝固因子IX的第三抗原结合位点；以及第二多肽，其包含结合血液凝固因子X的第二抗原结合位点；和第四多肽，其包含结合血液凝固因子X的第四抗原结合位点。在一个实施方案中，这样的多特异性抗体包含第一多肽至第四多肽，其中所述第一多肽和所述第三多肽各自包含针对血液凝固因子IX或活化的血液凝固因子IX的抗体各自的H链或L链的抗原结合位点；且所述第二多肽和所述第四多肽各自包含针对血液凝固因子X的抗体各自的H链或L链的抗原结合位点。
在本发明的一个实施方案中，所述第一多肽的抗原结合位点包含含有由选自以下(a1)至(a11)的氨基酸序列中的任一个组成的H链CDR的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点，且所述第二多肽的抗原结合位点包含含有由选自以下(b1)至(b11)的氨基酸序列中的任一个组成的H链CDR的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点：(a1)包含SEQ ID NO：75、76和77各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q1的H链CDR)的抗原结合位点；(a2)包含SEQ ID NO：78、79和80各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q31的H链CDR)的抗原结合位点；(a3)包含SEQ ID NO：81、82和83各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q64的H链CDR)的抗原结合位点；(a4)包含SEQ ID NO：84、85和86各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q85的H链CDR)的抗原结合位点；(a5)包含SEQ ID NO：87、88和89各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q153的H链CDR)的抗原结合位点；(a6)包含SEQ ID NO：90、91和92各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q354的H链CDR)的抗原结合位点；(a7)包含SEQ ID NO：93、94和95各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q360的H链CDR)的抗原结合位点；(a8)包含SEQ ID NO：96、97和98各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q405的H链CDR)的抗原结合位点；(a9)包含SEQ ID NO：99、100和101各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q458的H链CDR)的抗原结合位点；(a10)包含SEQ ID NO：102、103和104各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q460的H链CDR)的抗原结合位点；(a11)包含SEQ ID NO：105、106和107各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q499的H链CDR)的抗原结合位点；(b1)包含SEQ ID NO：108、109和110各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J232的H链CDR)的抗原结合位点；(b2)包含SEQ ID NO：111、112和113各自的H链CDR1、2和3氨基酸序列(J259的H链CDR)的抗原结合位点；(b3)包含SEQ ID NO：114、115和116各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J268的H链CDR)的抗原结合位点；(b4)包含SEQ IDNO：117、118和119各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J300的H链CDR)的抗原结合位点；(b5)包含SEQ ID NO：120、121和122各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J321的H链CDR)的抗原结合位点；(b6)包含SEQ ID NO：123、124和125各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J326的H链CDR)的抗原结合位点；(b7)包含SEQ ID NO：126、127和128各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J327的H链CDR)的抗原结合位点；(b8)包含SEQ ID NO：129、130和131各自的H链CDR1、2和3氨基酸序列(J339的H链CDR)的抗原结合位点；(b9)包含SEQ ID NO：132、133和134各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J344的H链CDR)的抗原结合位点；(b10)包含SEQ ID NO：135、136和137各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J346的H链CDR)的抗原结合位点；和(b11)包含SEQ ID NO：174、175和176各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J142的H链CDR)的抗原结合位点。
在本发明的一个实施方案中，所述第一多肽的抗原结合位点包含含有由选自以下(a1)至(a11)的氨基酸序列中的任一个组成的H链可变区的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点，且所述第二多肽的抗原结合位点包含含有由选自以下(b1)至(b11)的氨基酸序列中的任一个组成的H链可变区的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点：(a1)包含SEQ ID NO：35的H链可变区氨基酸序列(Q1的H链可变区)的抗原结合位点；(a2)包含SEQ ID NO：36的H链可变区氨基酸序列(Q31的H链可变区)的抗原结合位点；(a3)包含SEQ ID NO：37的H链可变区氨基酸序列(Q1的H链可变区)的抗原结合位点(a4)包含SEQ ID NO：38的H链可变区氨基酸序列(Q85的H链可变区)的抗原结合位点；(a5)包含SEQID NO：39的H链可变区氨基酸序列(Q153的H链可变区)的抗原结合位点；(a6)包含SEQ IDNO：40的H链可变区氨基酸序列(Q354的H链可变区)的抗原结合位点；(a7)包含SEQ ID NO：41的H链可变区氨基酸序列(Q360的H链可变区)的抗原结合位点；(a8)包含SEQ ID NO：42的H链可变区氨基酸序列(Q405的H链可变区)的抗原结合位点；(a9)包含SEQ ID NO：43的H链可变区氨基酸序列(Q458的H链可变区)的抗原结合位点；(a10)包含SEQ ID NO：44的H链可变区氨基酸序列(Q460的H链可变区)的抗原结合位点；(a11)包含SEQ ID NO：45的H链可变区氨基酸序列(Q499的H链可变区)的抗原结合位点；(b1)包含SEQ ID NO：46的H链可变区氨基酸序列(J232的H链可变区)的抗原结合位点；(b2)包含SEQ ID NO：47的H链可变区氨基酸序列(J259的H链可变区)的抗原结合位点；(b3)包含SEQ ID NO：48的H链可变区氨基酸序列(J268的H链可变区)的抗原结合位点；(b4)包含SEQ ID NO：49的H链可变区氨基酸序列(J300的H链可变区)的抗原结合位点；(b5)包含SEQ ID NO：50的H链可变区氨基酸序列(J321的H链可变区)的抗原结合位点；(b6)包含SEQ ID NO：51的H链可变区氨基酸序列(J326的H链可变区)的抗原结合位点；(b7)包含SEQ ID NO：52的H链可变区氨基酸序列(J327的H链可变区)的抗原结合位点；(b8)包含SEQ ID NO：53的H链可变区氨基酸序列(J339的H链可变区)的抗原结合位点；(b9)包含SEQ ID NO：54的H链可变区氨基酸序列(J344的H链可变区)的抗原结合位点；(b10)包含SEQ ID NO：55的H链可变区氨基酸序列(J346的H链可变区)的抗原结合位点；和(b11)包含SEQ ID NO：172的H链可变区氨基酸序列(J142的H链可变区)的抗原结合位点。
在本发明的一个实施方案中，在所述第三多肽和所述第四多肽中包括的抗原结合位点包含含有由选自以下(c1)至(c10)的氨基酸序列中的任一个组成的L链CDR的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点：(c1)包含SEQ ID NO：138、139和140各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L2的L链CDR)的抗原结合位点；(c2)包含SEQ ID NO：141、142和143各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L45的L链CDR)的抗原结合位点；(c3)包含SEQ ID NO：144、145和146各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L248的L链CDR)的抗原结合位点；(c4)包含SEQ ID NO：147、148和149各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L324的L链CDR)的抗原结合位点；(c5)包含SEQ ID NO：150、151和152各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L334的L链CDR)的抗原结合位点；(c6)包含SEQ ID NO：153、154和155各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L377的L链CDR)的抗原结合位点；(c7)包含SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)的抗原结合位点；(c8)包含SEQ ID NO：159、160和161各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L406的L链CDR)的抗原结合位点；(c9)包含SEQ ID NO：137、138和139各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L408的L链CDR)的抗原结合位点；和(c10)包含SEQ ID NO：177、178和179各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L180的L链CDR)的抗原结合位点。
在本发明的一个实施方案中，在所述第三多肽和所述第四多肽中包括的抗原结合位点包含含有由选自以下(c1)至(c10)的氨基酸序列中的任一个组成的L链可变区的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点：(c1)包含SEQ ID NO：56的L链可变区氨基酸序列(L2的L链可变区)的抗原结合位点；(c2)包含SEQ ID NO：57的L链可变区氨基酸序列(L45的L链可变区)的抗原结合位点；(c3)包含SEQ ID NO：58的L链可变区氨基酸序列(L248的L链可变区)的抗原结合位点；(c4)包含SEQ ID NO：59的L链可变区氨基酸序列(L324的L链可变区)的抗原结合位点；(c5)包含SEQ ID NO：60的L链可变区氨基酸序列(L334的L链可变区)的抗原结合位点；(c6)包含SEQ ID NO：61的L链可变区氨基酸序列(L377的L链可变区)的抗原结合位点；(c7)包含SEQ ID NO：62的L链可变区氨基酸序列(L404的L链可变区)的抗原结合位点；(c8)包含SEQ ID NO：63的L链可变区氨基酸序列(L406的L链可变区)的抗原结合位点；(c9)包含SEQ ID NO：64的L链可变区氨基酸序列(L408的L链可变区)的抗原结合位点；和(c10)包含SEQ ID NO：173的L链可变区氨基酸序列(L180的L链可变区)的抗原结合位点。
在本发明的一个实施方案中，所述第一和第二多肽还抗体H链恒定区，且所述第三和第四多肽包含抗体L链恒定区。
在本发明的一个实施方案中，所述第一和第二多肽包含抗体H链恒定区，且所述第三和第四多肽包含抗体L链恒定区，且其中所述第三多肽和所述第四多肽是共享L链。
在本发明的一个实施方案中，所述第一多肽包含选自以下(a1)至(a14)的任一种抗体H链，所述第二多肽包含选自以下(b1)至(b12)的任一种抗体H链，且所述第三多肽和所述第四多肽包含选自以下(c1)至(c10)的任一种抗体L链：(a1)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的抗体H链(Q1-G4k)；(a2)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的抗体H链(Q31-z7)；(a3)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的抗体H链(Q64-z55)；(a4)由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的抗体H链(Q64-z7)；(a5)由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的抗体H链(Q85-G4k)；(a6)由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的抗体H链(Q153-G4k)；(a7)由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的抗体H链(Q354-z106)；(a8)由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成的抗体H链(Q360-G4k)；(a9)由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的抗体H链(Q360-z118)；(a10)由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的抗体H链(Q405-G4k)；(a11)由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的抗体H链(Q458-z106)；(a12)由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成的抗体H链(Q460-z121)；(a13)由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的抗体H链(Q499-z118)；(a14)由SEQ IDNO：20的氨基酸序列组成的抗体H链(Q499-z121)；(b1)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的抗体H链(J268-G4h)；(b2)由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的抗体H链(J321-G4h)；(b3)由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的抗体H链(J326-z107)；(b4)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的抗体H链(J344-z107)；(b5)由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成的抗体H链(J232-G4h)；(b6)由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成的抗体H链(J259-z107)；(b7)由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的抗体H链(J300-z107)；(b8)由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的抗体H链(J327-z107)；(b9)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的抗体H链(J327-z119)；(b10)由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的抗体H链(J339-z119)；(b11)由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成的抗体H链(J346-z107)；(b12)由SEQ ID NO：170的氨基酸序列组成的抗体H链(J142-G4h)；(c1)由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的抗体L链(L2-k)；(c2)由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的抗体L链(L45-k)；(c3)由SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成的抗体L链(L248-k)；(c4)由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成的抗体L链(L324-k)；(c5)由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成的抗体L链(L334-k)；(c6)由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成的抗体L链(L377-k)；(c7)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的抗体L链(L404-k)；(c8)由SEQ IDNO：33的氨基酸序列组成的抗体L链(L406-k)；(c9)由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成的抗体L链(L408-k)；和(c10)由SEQ ID NO：171的氨基酸序列组成的抗体L链(L180-k)。
在本发明的一个实施方案中，上述的抗体是以下(a)至(u)中的任一个的双特异性抗体：
(a)双特异性抗体(Q1-G4k/J268-G4h/L45-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：9的共享L链；(b)双特异性抗体(Q1-G4k/J321-G4h/L45-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：9的共享L链；(c)双特异性抗体(Q31-z7/J326-z107/L2-k)，其中所述第一多肽是由SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：8的共享L链；(d)双特异性抗体(Q64-z55/J344-z107/L45-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQID NO：9的共享L链；(e)双特异性抗体(Q64-z7/J326-z107/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(f)双特异性抗体(Q64-z7/J344-z107/L406-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：33的共享L链；(g)双特异性抗体(Q85-G4k/J268-G4h/L406-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：33的共享L链；(h)双特异性抗体(Q85-G4k/J321-G4h/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(i)双特异性抗体(Q153-G4k/J232-G4h/L406-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQID NO：21的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：33的共享L链；(j)双特异性抗体(Q354-z106/J259-z107/L324-k)，其中所述第一多肽是由SEQ IDNO：13的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：29的共享L链；(k)双特异性抗体(Q360-G4k/J232-G4h/L406-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQID NO：33的共享L链；(1)双特异性抗体(Q360-z118/J300-z107/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(m)双特异性抗体(Q405-G4k/J232-G4h/L248-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：28的共享L链；(n)双特异性抗体(Q458-z106/J346-z107/L408-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQID NO：27的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：34的共享L链；(o)双特异性抗体(Q460-z121/J327-z119/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ IDNO：18的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(p)双特异性抗体(Q499-z118/J327-z107/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(q)双特异性抗体(Q499-z118/J327-z107/L377-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：31的共享L链；(r)双特异性抗体(Q499-z118/J346-z107/L248-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：28的共享L链；(s)双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ IDNO：32的共享L链；(t)双特异性抗体(Q499-z121/J339-z119/L377-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：31的共享L链；和(u)双特异性抗体(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：170的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：171的共享L链。
本发明的一个实施方案是上述的组合、抗体或用途，其中在用多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)治疗的血友病A患者中以10U-200U FIX/kg体重的量施用所述FIX，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。本发明的一个实施方案是上述的组合、抗体或用途，其中另外以10U-200U FX/kg体重的量施用FX。本发明的一个实施方案是上述的组合、抗体或用途，其中另外以10U-200U FII/kg体重的量施用FII。本发明的一个实施方案是上述的组合、抗体或用途，其中另外以10U-200U FII/kg体重和10U-200UFX/kg体重的量施用FII和FX。本发明的一个实施方案是上述的组合、抗体或用途，其中在用多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)治疗的血友病A患者中以10U-200U PCC/kg体重的量施用凝血酶原复合物(PCC)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
本文描述的多特异性抗体和抗原结合分子包含可以特异性地结合至少两种不同类型的抗原的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点。尽管所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点没有特别限制，只要它们分别具有结合FIX和/或FIXa和FX的活性，例子包括与抗原结合所必需的位点，诸如抗体、支架分子(抗体样分子)或肽、或含有这样的位点的片段。支架分子是通过结合靶分子而表现出功能的分子，且可以使用任意多肽，只要它们是可以结合至少一种靶抗原的构象上稳定的多肽。这样的多肽的例子包括抗体可变区、纤连蛋白(WO 2002/032925)、蛋白A结构域(WO 1995/001937)、LDL受体A结构域(WO 2004/044011、WO 2005/040229)、锚蛋白(WO 2002/020565)等，以及Nygren等人(CurrentOpinion in Structural Biology，7：463-469(1997)；和Journal of Immunol Methods，290：3-28(2004))、Binz等人(Nature Biotech 23：1257-1266(2005))和Hosse等人(Protein Science 15：14-27(2006))在文献中描述的分子。此外，如在Curr Opin MolTher.2010年8月；12(4)：487-95和Drugs.2008；68(7)：901-12中提及的，可以使用可结合靶抗原的肽分子。
在本文中，多特异性抗原结合分子没有特别限制，只要它们是可以结合至少两种不同类型的抗原的分子，但是例子包括含有上述抗原结合位点的多肽，诸如抗体和支架分子以及它们的片段，和包含核酸分子和肽的适体，并且它们可以是单个分子或其多聚体。优选的多特异性抗原结合分子包括可以特异性地结合至少两种不同抗原的多特异性抗体。具有在功能上替代本发明的FVIII的活性的抗体的特别优选例子包括可以特异性地结合两种不同抗原的双特异性抗体(BsAb)(它们也可以被称作双重特异性抗体)。
在本发明中，术语“共享L链”表示可以与两个或更多个不同H链连接且表现出与每个抗原的结合能力的L链。在本文中，术语“不同H链”优选地表示针对不同抗原的抗体的H链，但是不限于此，也表示其氨基酸序列彼此不同的H链。例如，根据在WO 2006/109592中描述的方法，可以得到共享L链。
本发明的多特异性抗原结合分子(优选地双特异性抗体)是对两种或更多种不同抗原具有特异性的抗体，或包含这样的抗体的片段的分子。本发明的抗体没有特别限制，但是优选地是单克隆抗体。在本发明中使用的单克隆抗体不仅包括从动物诸如人类、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、绵羊、骆驼和猴衍生出的单克隆抗体，而且包括人工修饰的基因重组抗体诸如嵌合抗体、人源化抗体和双特异性抗体。
此外，将变成本发明的多特异性抗原结合分子的抗体的L链可以是不同的，但是优选地具有共享L链。
本发明的多特异性抗原结合分子优选地是使用基因重组技术(参见，例如，Borrebaeck CAK和Larrick JW，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，由MACMILLANPUBLISHERS LTD于1990年在英国出版)生产的重组抗体。可以如下得到重组抗体：从生产抗体的杂交瘤或抗体生产细胞(诸如敏化的淋巴细胞)克隆编码抗体的DNA，将它们插入合适的载体中，然后将它们引入宿主(宿主细胞)中以产生抗体。
此外，本发明的抗体可以不仅包括完整抗体，而且包括抗体片段和低分子量抗体(微体)和经修饰的抗体。
例如，抗体片段或微体包括双体(Db)、直链抗体和单链抗体(在下文中，也表示为scFv)分子。在本文中，“Fv”片段被定义为包含完全抗原识别位点和结合位点的最小抗体片段。
“Fv”片段是二聚体(VH-VL二聚体)，其中H链可变区(VH)和L链可变区(VL)通过非共价结合而强连接。每个可变区的三个互补性决定区(CDR)彼此相互作用以形成在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。6个CDR将抗原结合位点赋予抗体。但是，单独的一个可变区(或仅包含对抗原特异性的三个CDR的Fv的一半)可以识别并结合抗原，尽管它的亲和力低于整个结合位点的亲和力。
Fab片段(也称为F(ab))还包含L链恒定区和H链恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的差别在于，它另外包含从H链CH1区域的羧基端衍生出的几个残基，包含来自抗体的铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH表示这样的Fab′：其中它的恒定区的一个或多个半胱氨酸残基包含游离巯基。通过胃蛋白酶消化切割F(ab′)2的铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键，产生F(ab′)片段。其它化学结合的抗体片段也是本领域技术人员已知的。
双体是通过基因融合构建的二价微体(Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)；EP 404,097；WO 93/11161)。双体是由两个多肽链组成的二聚体，其中每个多肽链包含通过接头连接的L链可变区(VL)和H链可变区(VH)，所述接头足够短以防止在相同链内的这两个结构域的结合，例如，优选地2-12个氨基酸的接头，更优选地3-10个氨基酸，特别是约5个氨基酸。所述多肽链形成二聚体，因为在相同多肽上编码的VL和VH之间的接头太短不足以形成单链可变区片段。因此，双体包含两个抗原结合位点。
单链抗体或scFv抗体片段包含抗体的VH和VL区域，且这些区域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽还包含在VH和VL区域之间的多肽接头，且这使得scFv能够形成抗原结合所必需的结构(关于scFv的综述，参见Pluckthun“The Pharmacology of MonoclonalAntibodies”第113卷(Rosenburg和Moore编(Springer Verlag，New York)第269-315页，1994)。在本发明的上下文中，接头没有特别限制，只要它们不会抑制在它们的末端处连接的抗体可变区的表达。
IgG-型双特异性抗体可以由通过融合两类产生IgG抗体的杂交瘤而产生的杂合杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))分泌(Milstein C等人.Nature 1983，305：537-540)。它们还可以如下分泌：获取构成两种目标IgG的L链和H链基因，共四种基因，并将它们引入细胞中以共表达所述基因。
在该情况下，通过将合适的氨基酸置换引入至H链的CH3区域，具有H链的异质组合的IgG可以优先分泌(Ridgway JB等人.Protein Engineering 1996，9：617-621；MerchantAM等人.Nature Biotechnology 1998，16：677-681；WO 2006/106905；Davis JH等人.Protein Eng Des Se1.2010，4：195-202)。
关于L链，由于L链可变区的多样性低于H链可变区的多样性，可以得到可将结合能力赋予两条H链的共享L链。本发明的抗体包含共享L链。通过将共享L链和两条H链的基因引入细胞中，可以有效地表达双特异性的IgG。
通过化学交联Fab′，可以产生双特异性抗体。双特异性的F(ab′)2可以如下产生：例如，从抗体制备Fab′，使用它产生用邻-亚苯基二-马来酰亚胺(o-PDM)马来酰亚胺化的Fab′，然后使它与从另一种抗体制备的Fab′反应以交联源自不同抗体的Fab′(Keler T等人.Cancer Research 1997，57：4008-4014)。化学连接Fab′-硫硝基苯甲酸(TNB)衍生物和抗体片段诸如Fab′-巯基(SH)的方法也是已知的(Brennan M等人.Science 1985，229：81-83)。
还可以使用源自Fos和Jun的亮氨酸拉链替代化学交联。利用Fos和Jun对异源二聚体的优先形成，尽管它们也形成同源二聚体。表达并制备向其添加Fos亮氨酸拉链的Fab′和向其添加Jun亮氨酸拉链的另一种Fab′。将在温和条件下还原的单体Fab′-Fos和Fab′-Jun混合并反应以形成双特异性的F(ab′)2(Kostelny SA等人.J.of Immunology，1992，148：1547-53)。该方法可以不仅应用于Fab′，而且应用于scFv、Fv等。
此外，已知双特异性抗体包括sc(Fv)2诸如IgG-scFv(Protein Eng Des Sel.2010年4月；23(4)：221-8)和BiTE(Drug Discov Today 2005年9月15日；10(18)：1237-44.)、DVD-Ig(Nat Biotechnol.2007年11月；25(11)：1290-7.2007年10月14日电子公开；和MAbs.2009年7月；1(4)：339-47.2009年7月10日电子公开)，以及其它抗体(IDrugs 2010，13：698-700)包括二合一抗体(Science.2009年3月20日；323(5921)：1610-4；和Immunotherapy 2009年9月；1(5)：749-51.)、Tri-Fab、串联scFv和双体(MAbs.2009年11月；1(6)：539-547)。另外，即使当使用分子形式诸如scFv-Fc和支架-Fc时，通过优先分泌Fc的异源组合可以有效地产生双特异性抗体(Ridgway JB等人，Protein Engineering 1996，9：617-621；Merchant AM等人.Nature Biotechnology 1998，16：677-681；WO 2006/106905；和Davis JH等人，Protein Eng Des Sel.2010，4：195-202)。
也可以使用双体生产双特异性抗体。双特异性双体是两个交叉scFv片段的异源二聚体。更具体地，如下生产它：使用约5个残基的相对短接头连接源自两类抗体A和B的VH和VL而制备VH(A)-VL(B)和VH(B)-VL(A)，从而形成异源二聚体(Holliger P等人.ProcNatl.Acad.Sci.USA 1993，90：6444-6448)。
可以如下实现期望的结构：用柔性的且相对长的包含约15个残基的接头连接2个scFv(单链双体：Kipriyanov SM等人.J.of Molecular Biology.1999，293：41-56)，并进行适当的氨基酸置换(凸起-进入-孔洞：Zhu Z等人.Protein Science.1997，6：781-788；VH/VL interface engineering：Igawa T等人.Protein Eng Des Sel.2010，8：667-77)。
用柔性的且相对长的包含约15个残基的接头连接两类scFv可以产生的sc(Fv)2也可能是双特异性抗体(Mallender WD等人.J.of Biological Chemistry，1994，269：199-206)。
经修饰的抗体的例子包括与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)连接的抗体。本发明的抗体包括这样的经修饰的抗体。在本发明的上下文中，经修饰的抗体所连接的物质没有限制。这样的经修饰的抗体可以通过化学修饰得到的抗体而得到。这样的方法是本领域中非常确定的。
本发明的抗体包括人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体等，且它们的来源没有限制。它们也可以是遗传修饰的抗体，诸如嵌合抗体或人源化抗体。
用于得到人抗体的方法是本领域已知的。例如，携带人抗体基因的整个文库的转基因动物可以用期望的抗原免疫以得到期望的人抗体(参见国际专利申请WO 93/12227、WO92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096和WO 96/33735)。
还可以使用已知方法生产遗传修饰的抗体。具体地，例如，嵌合抗体可以包含免疫动物抗体的H链和L链可变区，且人抗体嵌合抗体的H链和L链恒定区可以如下得到：将编码源自免疫动物的抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接，将其插入表达载体中，然后将其引入宿主细胞中以产生所述抗体。
人源化抗体是经修饰的抗体，经常被称作“重新成形的”人抗体。通过将源自免疫动物的抗体的CDR转移至人抗体的互补性决定区而构建人源化抗体。用于这类目的的常规基因重组技术是已知的(参见欧洲专利申请公开号EP 239400；国际公开号WO96/02576；Sato K等人，Cancer Research 1993，53：851-856；国际公开号WO 99/51743)。
本发明的多特异性抗原结合分子是识别FIX和/或FIXa和FX且在功能上替代FVIII的辅因子功能的那些分子，且其特征在于，所述分子具有与hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ(描述在WO 2006/109592中，其已知是在功能上替换FVIII的双特异性抗体)相比更高的促进FXa产生的活性。此外，本发明的抗体经常具有包含抗-FIXa抗体的可变区和抗-FX抗体的可变区的结构。
本发明的多特异性抗原结合分子在功能上替换FVIII，其包含识别FIX和/或FIXa的第一抗原结合位点和识别FX的第二抗原结合位点，其中所述替换FVIII的功能的功能由与所述双特异性抗体(hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ)的活性相比更高的促进FXa产生的活性造成，所述双特异性抗体包含由SEQ ID NO：165和166组成的H链和由SEQ ID NO：167组成的共享L链。
本发明的多特异性抗原结合分子包含：含有识别FIX和/或FIXa的抗原结合位点的第一多肽和第三多肽，和含有识别FX的抗原结合位点的第二多肽和第四多肽。所述第一多肽和所述第三多肽以及所述第二多肽和所述第四多肽各自包括抗体H链的抗原结合位点和抗体L链的抗原结合位点。
例如，在本发明的多特异性抗原结合分子中，所述第一多肽和所述第三多肽包括针对FIX或FIXa的抗体的H链和L链各自的抗原结合位点；且所述第二多肽和所述第四多肽包含针对FX的抗体的H链和L链各自的抗原结合位点。
在此时，在所述第一多肽和所述第三多肽以及所述第二多肽和所述第四多肽中包括的抗体L链的抗原结合位点可以是共享L链。
包含本发明的抗体L链的抗原结合位点的多肽优选地是这样的多肽：其包含结合FIX、FIXa和/或FX的抗体L链的序列的全部或部分。
在本发明中，短语“在功能上替换FVIII”是指，识别FIX和/或FIXa和FX，并促进FX的活化(促进FXa产生)。
在本发明中，可以如下证实“促进FXa产生的活性”：使用例如包含FXIa(FIX活化酶)、FIX、FX、F合成底物S-2222(FXa的合成底物)和磷脂的测量系统，评价本发明的多特异性抗原结合分子。该测量系统表明在血友病A病例中疾病的严重程度和临床征状之间的关联(Rosen S，Andersson M，Blomback M等人.Clinical applications of a chromogenicsubstrate method for determination of FVIII activity.Thromb Haemost1985，54：811-23)。也就是说，在本测量系统中，预见到表现出较高促进FXa产生的活性的试验物会表现出针对血友病A中的出血发作的较好止血作用。由于这些结果，如果具有在功能上替换FVIII的活性的多特异性抗原结合分子是具有比hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ更高活性的分子，那么它可以产生优秀的促进血液凝固的活性，并且作为用于预防和/或治疗出血、伴随出血的疾病或由出血造成的疾病的药物组分可以得到优秀的效应。为了作为上述药物组分得到优秀的效应，例如，在US 2013/0330345的实施例2所述的条件下测量的促进FXa产生的活性优选地不小于hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ的活性，且具体地，所述活性更优选地与Q153-G4k/J142-G4h/L180-k的活性相同或不比其小。在本文中，“促进FXa产生的活性”是从抗体溶液中20分钟以后吸光度的变化减去在溶剂中20分钟以后吸光度的变化而得到的值。
本发明的一个优选实施方案是在功能上替换FVIII的多特异性抗体，其识别FIX和/或FIXa和FX。
上述本发明的多特异性抗体优选地是包含抗-FIX/FIXa抗体的H链CDR或在功能上与其等同的CDR和抗-FX抗体的H链CDR或在功能上与其等同的CDR的抗体。
在本发明的一个方面，在所述多特异性抗体与FIX的组合中，可以使用含有FIX、FII、FVII和FX的凝血酶原复合物浓缩物(4-组分PCC)，或仅或主要含有FIX、FII和FX的凝血酶原复合物浓缩物(3组分PCC)。在本发明的另一个方面，由于FVII(其可能形成对它的活性形式FVIIa的竞争)的缺少，所述3-组分PCC是本发明的组合的一个优选实施方案。除了与所述多特异性抗体组合的FIX以外，可以使用FII、FX、或FII和FX作为制备的制品混合物。除了前述蛋白以外，还可以加入结构蛋白纤维蛋白原或抗纤维蛋白溶解的药物诸如氨甲环酸或抑肽酶。
血液凝固因子可以以它们的无活性前体形式作为酶原(例如FIX)或作为活化形式(例如FIXa)存在。酶原需要生化变化(诸如显露活性部位的水解反应，或改变构型以显露活性部位)才能使它变成活性酶。所述生化变化经常发生在溶酶体中，在此处前体酶的特定部分被切割以便活化它。活化的血液凝固因子通常缩写为例如FIXa、FXa等。例如凝固因子IX的活化机制描述在Biol Chem.2009May-Jun；390(5-6)：391-400中。
本文中使用的术语“血液凝固因子”、“凝固因子”或“(血液)凝固因子”或在各种血液凝固因子编号前面的缩写形式仅“F”(例如FVIII、FIX、FX等)是可互换的，且表示人凝固系统的各种人血液凝固因子。在它们的活化形式中，它们被缩写为例如FVIIIa、FIXa、FXa。在它们的非活化形式中，它们被缩写为FVIII、FIX、FX等。
“凝固因子IX”(FIX)是一种酶原，一种无活性前体。它被加工以除去信号肽，然后被因子XIa(属于接触途径)或因子VIIa(属于组织因子途径)切割以产生双链形式，其中所述链通过二硫键连接(Di Scipio RG，等人，J.Clin.Invest.61(1978)1528-38；Taran LDBiochemistry Mosc.62(1997)685-93)。当活化成因子IXa时，在有Ca2+、膜磷脂和因子VIII辅因子存在下，它水解因子X中的一个精氨酸-异亮氨酸键以形成因子Xa。因此，本文中使用的术语“凝固因子IX”(“FIX”)表示非活化的凝固因子IX。
因子IX的缺乏会造成Christmas病(血友病B)(Biggs，R；等人British MedicalJournal 2(4799)1952 1378-82)。已经描述了因子IX的超过100个突变；一些不造成征状，但是许多导致显著的出血病症。通过Christmas′DNA的测序鉴别出原始Christmas病突变，从而揭示了将半胱氨酸变成丝氨酸的突变(Taylor，S.A.；等人，Thrombosis andhaemostasis 67(1992)63-65)。重组因子IX被用于治疗Christmas病，且可作为“BeneFIX(R)”、“Alprolix(R)”和“Rixubis(R)”(都是重组因子IX产品的商标名称)商购得到。因子IX的一些罕见突变导致升高的凝血活性，且可以导致凝血疾病，诸如深静脉血栓形成(Simioni P，等人，N.Engl.J.Med.361(2009)1671-5)。
FIX被合成为415个氨基酸长度的单个多肽链。FIX作为由以下结构域组成的无活性前体分子存在于血液中：(1)含有γ-羧基谷氨酸的结构域(“Gla结构域”)，(2)和(3)两个表皮生长因子-样结构域(“EGF-1结构域”，“EGF-2结构域”)，(4)活化肽区域(“AP区域”)，和(5)丝氨酸蛋白酶结构域。FIX在穿过内质网和高尔基体运输过程中经历广泛的翻译后修饰：信号序列的除去；维生素K依赖性的γ-谷氨酰基羧化酶(一种肝微粒体酶)对Gla结构域中的12个Glu残基的γ-羧基化；AP区域中的N-157和N-167的N-糖基化；Gla结构域中的S-53和S-61以及AP区域中的T-159、T-169、T-172和T-179的O-糖基化；EGF-1结构域中的Asp-64处的β-羟基化；在AP区域中的Tyr-155的硫酸化和Ser-158的磷酸化。
在血友病B中，所述缺乏是FIX的量或功能的缺乏。该疾病被替代疗法成功地治疗，所述替代疗法由人血浆衍生的(pdFIX)或重组凝固因子IX(rFIX)的制品的施用组成。血浆衍生的产品是凝血酶原复合物浓缩物(其在过去已经用于治疗血友病B)或经纯化的FIX浓缩物(主要亲和纯化的因子IX)。已经在翻译后修饰方面广泛地表征了rFIX。尽管与pdFIX有微小差异，但是具体活性和药理学效力是可比较的。
pdFIX和CHO衍生的rFIX之间的生化对比表明不能辨别的二级/三级结构，如通过荧光、圆二色性或分析超速离心所测量的。在翻译后修饰方面检测到微小差异。尽管在pdFIX中Gla结构域的所有12个Glu残基被占据(即转化成Gla)，在rFIX中12个位点中的仅10个被完全占据(分别是Gla-40或Gla-40和Gla-36的“低羧基化”)。N-连接的聚糖被完全唾液酸化并表现出在pdFIX中的高异质性(但是，这也可能是由于从具有不同血浆捐献的血浆库制备pdFIX的事实)；在rFIX中的低异质性和经常不完全唾液酸化。Ser-53在rFIX中被Xyl-Xyl-Gic-糖基化，而在pdFIX中，Ser-53含有另外的Xyl-Glc-糖基化(Ser-61在两种形式中含有NeuAc-Gal-GlcNAc-Fuc-)。来自CHO细胞的rFIX表现出带有唾液酸α(2-3)-半乳糖基团帽子的碳水化合物的糖基化(CHO细胞缺乏α(2-6)-唾液酸转移酶)，而pdFIX含有末端唾液酸α(2-6)-半乳糖部分。用于表达rFIX的人宿主细胞(诸如HEK 293细胞)含有α(2-3)-和α(2-6)-唾液酸转移酶；因此HEK 293衍生的rFIX在这方面不同于市售的CHO-衍生的rFIX(White等人，Thromb.Haemost.78(1)(1997)，261-265；Bond等人，Sem.Hematol.35(2)(1998)，增刊2，11-17；Bebgie等人，Thromb.Haemost.94(2005)，1138-1147)。
已经推测AP区域中的Ser-155的较低磷酸化程度和Tyr-158的较低硫酸化程度是否导致rFIX的较低体内回收率(rFIX的37.81±14.0％相对于用单克隆抗体纯化的pdFIX的52.61±12.36％(White等人(1997))。Griffith等人(J.Thromb.Haemost.5(2007)，增刊2：P-M-043)报道了N-聚糖唾液酸化对于rFIX的体内回收率而言是重要的。在WO 2007/101681A1中，提供了具有提高的体内回收率的rFIX产物，其包含至少25％和小于98％的完全磷酸化的和硫酸化的rFIX。
CHO表达的rFIX和免疫纯化的pdFIX的消除半衰期是可比较的(分别是18.10±5.10小时和17.66±5.31小时(White等人，1997))。基于报道的AP区域的缺失(del(155-177)突变体表明与野生型形式相比45％的终末分解代谢半衰期增加(Bebgie等人(2005))，Chang等人(J.Thromb.Haemost.5(2007)，增刊2：O-M-088)用神经氨酸酶和N-和O-聚糖酶处理FIX以除去N-和O-连接的碳水化合物。去糖基化的FIX具有比未处理的FIX显著更低的回收率，而去糖基化形式的回收率在rFIX和pdFIX中不是统计上不同的。因此得出结论：这提示糖基化在决定FIX的回收率中起主要作用。进一步得出结论：硫酸化/磷酸化在体内回收率中起“相对小的”作用。Chang等人没有报道关于rFIX和pdFIX的去糖基化形式的半衰期或活性数据。
在临床研究中，已经证实rFIX是安全且有效的，但是成功的治疗需要比pdFLX高20-50％的剂量。这是由于CHO衍生的rFIX比pdFIX低30-50％的体内回收率(如上所述)，这也被从临床前和临床研究(其中在不同的动物模型中对比pdFIX和rFIX)和血友病B患者的临床研究收集的药代动力学数据揭示。但是，rFIX的循环半衰期不可与pdFIX制品区分。
已经进行多种尝试来改进FIX药物，例如(对于rFIX)增加mRNA产生、减少与胶原IV的结合、增加比活性和提高回收率(通过使rFIX更类似于pdFIX)(Pipe，Sem.Thromb.Hemost.30(2)(2004)，227-237；WO 2007/101681 A1)；(对于pdFIX)富集和特异性纯化(US 5,639,857 A)。但是，仍然存在对改进的FIX制品的强需求，其可以以比常规FIX制品更低的剂量或更大的时间间隔施用以实现成功治疗。尽管现有技术中的大多数策略集中在提高回收率和增加FIX活性，目标在于延长蛋白的半衰期的策略是罕见的，主要因为rFIX和pdFIX的半衰期是相同的。这主要由于FIX蛋白对(甚至微小)化学修饰或突变的已知敏感性和将突变引入人蛋白中的潜在免疫学效应(Bebgie等人(2005)；Kaufman，Thromb.Haemost.79(1998)，1068-1079；Hansson等人，J Thromb.Haemost.3(2005)，2633-2648；Wojcik等人，Biochem.J.323(1997)，629-636)。
本文中使用的术语“凝固因子IX”(FIX)应当是具有血液凝固因子IX的典型特征的因子IX分子的任何形式。FIX应当包括来自血浆的FIX(pdFIX)和能够治愈患者中的由FIX缺乏造成的出血病症(例如血友病B)的rFIX的任何形式。FIX包含一个GIa结构域、两个EGF结构域(EGF-1和EGF-2)、一个AP区域和一个丝氨酸蛋白酶结构域。根据本发明的FIX应当具有与人pdFIX和人rFIX及其所有功能变体相同的氨基酸序列，所述功能变体即提供可比较的或提高的FIX体内活性的变体(在氨基酸序列和翻译后修饰中)。为了治愈动物中的各种FIX有关的出血病症，可以应用对应的FIX序列或在有关的动物物种中表现出足够交叉活性的那些FIX形式。此外，根据本发明的FIX表现出蛋白在体内的适当功能所必需的所有翻译后修饰。可得到大量描述FIX的功能形式的文献，例如在位置148处的天然存在的Ala/Thr交换；可以与根据本发明的水溶性亲水聚合物共价地偶联的合适FIX分子描述在例如White等人(1997)；Pipe(2004)；WO 2007/101681 A1；US 5,639,857 A；Bebgie等人(2005)；Kaufman(1998)；Hansson等人(2005)；Wojcik等人(1997)。优选地，根据本发明的FIX是重组地生产的FIX。当参考FIX使用时，术语“重组的”指示，通过异源的或非天然存在的核酸或蛋白向宿主细胞中的引入或宿主细胞中的天然核酸或蛋白的改变已经生产了FIX。因而，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因，或表达在细胞的基因组中的天然位置不存在的野生型和变体基因，或表达否则会异常地表达、低表达或根本不表达的天然基因。术语“生物生产的”FIX覆盖由生物或细胞生产的、在从这样的生物或细胞分离FIX以后不经进一步化学修饰的所有FIX形式(不可由这样的生物或细胞执行)。
商购可得的重组因子IX产品包括“BeneFIX(R)”、“Alprolix(R)(具有延长的半衰期的重组因子IX Fc融合蛋白)”和“Rixubis(R)”(用于重组因子IX产品Benefix(TM)的所有商标名称)。
经常使用稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞制备商购可得的重组因子IX产品。CHO细胞会提供糖基化和其它翻译后修饰的能力。对于这些细胞，可以在不添加动物-或人-衍生的原料的情况下维持大规模悬浮培养。在制备这些市售产品(商业名称Benefix(TM)下销售)之一时，将rFIX与内肽酶PACE/弗林蛋白酶一起共表达，且经由多个过滤和色谱步骤高度纯化。
当参考核酸的部分使用时，术语“异源”指示，所述核酸包含两个或更多个在自然界中没有发现彼此具有相同关系的子序列。在一个实施例中，该术语表示在基因组中没有处于它的天然位置的核酸。在另一个实施例中，重组地生产核酸，所述核酸具有2个或多个来自无关基因的序列，所述序列经排列以形成新的功能核酸，例如来自一种来源的启动子和来自另一种来源的编码区。类似地，异源蛋白指示，所述蛋白包含两个或更多个在自然界中没有发现彼此具有相同关系的子序列(例如融合蛋白)，或它是从异源核酸衍生出的蛋白。
由此可以修饰FIX的任何生物活性衍生物，包括定性地具有FIX的相同功能特性和/或生物学特性(诸如结合特性)和/或相同结构基础(诸如肽主链)的FIX的任何衍生物。在本申请中也包括不会消除所述多肽的生物活性(即将所述活性降低至野生型形式(＝100％)的10％以下或甚至5％以下)的FIX的多肽序列的氨基酸的微小缺失、添加和/或置换作为生物活性衍生物，特别是具有提高的比活性(超过野生型形式的100％活性)的那些。根据本发明的FIX可以源自任何脊椎动物，例如哺乳动物。在本发明的一个具体实施例中，所述FIX是人FIX。通过本领域已知的任意方法可以生产根据本发明的FIX。这可以包括本领域已知的用于通过基因工程生产重组DNA的任意方法，例如经由RNA的反转录和/或DNA的扩增。另外，编码FIX的重组DNA(例如质粒)还可以含有编码选择标记的DNA序列，所述选择标记用于选择已经被所述质粒成功地转染的细胞。在本发明的一个实施例中，所述质粒还可以如下赋予对选择标记(例如抗生素药物G418)的抗性：递送抗性基因，例如赋予对G418的抗性的neo抗性基因。
rFIX的生产可以包括本领域已知的通过转染(例如经由电穿孔或显微注射)将重组DNA引入真核细胞中的任意方法。例如，可以如下实现人FIX的重组表达：通过适当的转染方法将表达质粒引入合适的宿主细胞系中，所述表达质粒含有在一个或多个调节序列(诸如强启动子)控制下的编码人FIX的DNA序列，所述转染方法产生具有稳定地整合进基因组中的引入序列的细胞。磷酸钙共沉淀方法是可以根据本发明使用的转染方法的一个例子。
术语“氨基酸”在本发明范围内意在包括所有天然存在的L.α.-氨基酸。在本文中使用天然存在的氨基酸的单字母和三字母缩写(Lehninger，Biochemistry，第2版，WorthPublishers，New York，1995：71-92)。
本文中使用的术语“凝固因子II”(FII，凝血酶原)表示具有血液凝固因子II的典型特征的因子II分子的任何形式。血液凝固因子II是也被称作凝血酶原的酶原，且在凝固级联中被蛋白水解地切割以形成也被称作凝血酶的活化的血液凝固因子II(FIIa)，其最终导致失血的减少。凝血酶又充当将可溶性纤维蛋白原转化成纤维蛋白的不溶性条的丝氨酸蛋白酶，以及催化许多其它凝固相关的反应。
“凝血酶原复合物浓缩物”(PCC，商业名称Beriplex(R)、Octaplex(R)、Kcentra(R)、Cofact(R)，以及其它)是从新鲜-冷冻人血浆制备的血液凝固因子II、VII、IX和X、以及蛋白C和S的组合。当出血发生(例如在脑或肠中)需要快速作用以加速凝固时，使用它来逆转口服抗凝固疗法的作用。它可作为粉末和用于注射溶液的溶剂得到。
“凝固因子X”(也被称作名称Stuart-Prower因子或凝血酶原酶、血栓激酶或促凝血酶原激酶)是凝固级联的一种酶。本文中使用的术语“凝固因子X”(FX)应当是具有血液凝固因子X的典型特征的因子X分子的任何形式。因子X在肝脏中合成，且需要维生素K来实现它的合成。因子X被因子IX(与它的辅因子一起，即在复合物中被称作固有Xase的因子VIII)和因子VII(与它的辅因子一起，即在复合物中被称作非固有Xase的组织因子)活化成因子Xa。它通过在两个地方(arg-thr键和然后arg-ile键)切割凝血酶原而起作用，这产生有活性的凝血酶。当因子Xa与凝血酶原酶复合物中的活化辅因子V形成复合物时，该过程得到优化。因子Xa被蛋白Z依赖性的蛋白酶抑制剂(ZPI)即一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)灭活。蛋白Z的存在使该蛋白对因子Xa的亲和力增加1000倍，尽管因子XI的灭活不需要蛋白Z。蛋白Z的缺陷会导致增加的因子Xa活性和血栓形成倾向。因子X的半衰期是40-45小时。因子X是新鲜冷冻血浆和凝血酶原复合物和凝血酶原复合物浓缩物的组成部分。一种商购可得的浓缩物是CSL Behring制造的Factor X P Behring′。Bio ProductsLaboratory具有当前处于开发中的高纯度因子X。
因子VII(血液凝固因子VII)是造成血液在凝固级联中凝固的蛋白之一。它是丝氨酸蛋白酶类别中的一种酶。本文中使用的术语“凝固因子VII”(FVII)应当是具有血液凝固因子VII的典型特征的因子VII分子的任何形式。它的活化形式人因子VIIa的一种重组形式(依他凝血素α[经活化]，NovoSeven)被批准用于治疗血友病患者中的失控出血。当用在严重的不可控制的出血中时，已经存在安全性担忧。
因子VII(FVII)的主要作用是与组织因子(TF/凝固因子IlI/FIII)结合地开始凝固过程。发现组织因子在血管的外壁上——通常不暴露于血流。在血管损伤后，组织因子暴露于血液和循环因子VII。一旦结合至TF，FVII被不同的蛋白酶活化成FVIIa，它们包括凝血酶(因子IIa)、因子Xa、IXa、XIIa和FVIIa-TF复合物本身。因子VIIa与TF的复合物催化因子IX和因子X向有活性的蛋白酶(分别是因子IXa和因子Xa)的转化(Wajima T，等人，ClinPharmacol Ther 86(2009)。290-8)。所述因子的作用被组织因子途径抑制剂(TFPI)阻碍，后者在凝固开始以后几乎立即释放。因子VII是维生素K依赖性的；它在肝中产生。华法林或类似抗凝血剂的应用会减少FVII的肝合成。
本文中使用的术语“结合”、“识别”、“特异性地结合”或“抗-”是可互换的，且表示这样的多特异性抗体或它的抗原结合位点：其能够以足够亲和力结合各个抗原，使得所述抗体可在寻靶中用作诊断剂和/或治疗剂。优选地，如本文中所述的多特异性抗体是双特异性的，并分别结合作为第一抗原的FIX和/或FIXa(FIX的活化形式)和结合作为第二抗原的FX。在一个实施方案中，抗-Bsab FIX/FX抗体与无关的非-FIX、非-FIXa、非-FX蛋白的结合程度小于所述抗体分别与FIX、FIXa、FX的结合的约10％，如通过例如放射免疫测定(RIA)所测量的。
本文中使用的术语“抗原结合位点”表示配体实际结合的抗体分子的区域。术语“抗原结合位点”包括抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)或VH/VL对，且可以源自完整抗体或抗体片段诸如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域、Fab或(Fab)2。在本发明的一个实施方案中，每个抗原结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，且优选地通过由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的对形成，其中抗体轻链可变结构域(VL)优选地是共享L链的组成部分。
术语“其中所述治疗是与凝固因子IX组合”表示以下药剂对有关病症的联合治疗：a)多特异性抗体，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和b)凝固因子IX。所述联合治疗可以是同时的或相继的，其中优选地存在两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物活性的时间段。同时或依次(例如经由通过连续输注的静脉内(i.v.))共同施用所述多特异性抗体和FIX。
本文描述的多特异性抗原结合分子包含可以特异性地结合至少两种不同类型的抗原的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点。尽管所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点没有特别限制，只要它们分别结合FIX和/或FIXa和FX，例子包括与抗原结合所必需的位点，诸如抗体、支架分子(抗体样分子)或肽或含有这样的位点的片段。支架分子是通过结合靶分子而表现出功能的分子，且可以使用任意多肽，只要它们是可以结合至少一种靶抗原的构象上稳定的多肽。这样的多肽的例子包括
抗体可变区、纤连蛋白(WO 2002/032925)、蛋白A结构域(WO 1995/001937)、LDL受体A结构域(WO 2004/044011、WO 2005/040229)、锚蛋白(WO 2002/020565)等，以及Nygren等人(Current Opinion in Structural Biology，7：463-469(1997)；和Journal ofImmunol Methods，290：3-28(2004))、Binz等人(Nature Biotech23：1257-1266(2005))和Hosse等人(Protein Science15：14-27(2006))在文献中描述的分子。此外，如在Curr OpinMol Ther.2010年8月；12(4)：487-95和Drugs.2008；68(7)：901-12中提及的，可以使用可结合靶抗原的肽分子。
在本文中，多特异性抗原结合分子没有特别限制，只要它们是可以结合至少两种不同类型的抗原的分子，但是例子包括含有上述抗原结合位点的多肽，诸如抗体和支架分子以及它们的片段，和包含核酸分子和肽的适体，并且它们可以是单个分子或其多聚体。优选的多特异性抗原结合分子包括可以特异性地结合至少两种不同抗原的多特异性抗体。具有在功能上替代本发明的FVIII的活性的抗体的特别优选例子包括可以特异性地结合两种不同抗原的双特异性抗体(BsAb)(它们也可以被称作双重特异性抗体)。
在本发明中，术语“共享L链”表示可以与抗体的两个或更多个不同H链(重链)连接且表现出与每个抗原的结合能力抗体的L链(轻链)。在本文中，术语“不同H链”优选地表示针对不同抗原的抗体的H链，但是不限于此，也表示其氨基酸序列彼此不同的H链。例如，根据在WO 2006/109592中描述的方法，可以得到共享L链。
本发明的多特异性抗原结合分子(优选地双特异性抗体)是对两种或更多种不同抗原具有特异性的抗体，或包含这样的抗体的片段的分子。本发明的抗体没有特别限制，但是优选地是单克隆抗体。在本发明中使用的单克隆抗体不仅包括从动物诸如人类、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、绵羊、骆驼和猴衍生出的单克隆抗体，而且包括人工修饰的基因重组抗体诸如嵌合抗体、人源化抗体和双特异性抗体。
此外，将变成本发明的多特异性抗原结合分子的抗体的L链可以是不同的，但是优选地具有共享L链。
本发明的多特异性抗原结合分子优选地是使用基因重组技术(参见，例如，Borrebaeck CAK和Larrick JW，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，由MACMILLANPUBLISHERS LTD于1990年在英国出版)生产的重组抗体。可以如下得到重组抗体：从生产抗体的杂交瘤或抗体生产细胞(诸如敏化的淋巴细胞)克隆编码抗体的DNA，将它们插入合适的载体中，然后将它们引入宿主(宿主细胞)中以产生抗体。
此外，本发明的抗体可以不仅包括完整抗体，而且包括抗体片段和低分子量抗体(微体)和经修饰的抗体。
本发明的多特异性抗原结合分子是识别FIX和/或FIXa和FX且在功能上替代FVIII的辅因子功能的那些分子，且其特征在于，所述分子具有与hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ(描述在WO 2006/109592中，其已知是在功能上替换FVIII的双特异性抗体)相比更高的促进FXa产生的活性。此外，本发明的抗体经常具有包含抗-FIXa抗体的可变区和抗-FX抗体的可变区的结构。
更具体地，本发明提供了在功能上替换FVIII的多特异性抗原结合分子，其包含识别FIX和/或FIXa的第一抗原结合位点和识别FX的第二抗原结合位点，其中所述替换FVIII的功能的功能由与所述双特异性抗体(hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ)的活性相比更高的促进FXa产生的活性造成，所述双特异性抗体包含由SEQ ID NO：165和166组成的H链和由SEQ IDNO：167组成的共享L链。
本发明的多特异性抗原结合分子包含：含有识别FIX和/或FIXa的抗原结合位点的第一多肽和第三多肽，和含有识别FX的抗原结合位点的第二多肽和第四多肽。所述第一多肽和所述第三多肽以及所述第二多肽和所述第四多肽各自包括抗体H链的抗原结合位点和抗体L链的抗原结合位点。
例如，在本发明的多特异性抗原结合分子中，所述第一多肽和所述第三多肽包括针对FIX或FIXa的抗体的H链和L链各自的抗原结合位点；且所述第二多肽和所述第四多肽包含针对FX的抗体的H链和L链各自的抗原结合位点。
在此时，在所述第一多肽和所述第三多肽以及所述第二多肽和所述第四多肽中包括的抗体L链的抗原结合位点可以是共享L链。
包含本发明的抗体L链的抗原结合位点的多肽优选地是这样的多肽：其包含结合FIX、FIXa和/或FX的抗体L链的序列的全部或部分。
在本发明中，短语“在功能上替换FVIII”是指，识别FIX和/或FIXa和FX，并促进FX的活化(促进FXa产生)。
在本发明中，可以如下证实“促进FXa产生的活性”：使用例如包含FXIa(FIX活化酶)、FIX、FX、F合成底物S-2222(FXa的合成底物)和磷脂的测量系统，评价本发明的多特异性抗原结合分子。该测量系统表明在血友病A病例中疾病的严重程度和临床征状之间的关联(Rosen S，Andersson M，Blomback M等人.Clinical applications of a chromogenicsubstrate method for determination of FVIII activity.Thromb Haemost 1985，54：811-23)。也就是说，在本测量系统中，预见到表现出较高促进FXa产生的活性的试验物会表现出针对血友病A中的出血发作的较好止血作用。由于这些结果，如果具有在功能上替换FVIII的活性的多特异性抗原结合分子是具有比hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ更高活性的分子，那么它可以产生优秀的促进血液凝固的活性，并且作为用于预防和/或治疗出血、伴随出血的疾病或由出血造成的疾病的药物组分可以得到优秀的效应。为了作为上述药物组分得到优秀的效应，例如，在US 2013/0330345的实施例2所述的条件下测量的促进FXa产生的活性优选地不小于hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ的活性，且具体地，所述活性更优选地与Q153-G4k/J142-G4h/L180-k的活性相同或不比其小。在本文中，“促进FXa产生的活性”是从抗体溶液中20分钟以后吸光度的变化减去在溶剂中20分钟以后吸光度的变化而得到的值(也参见US 2013/0330345)。
在本发明的抗体、组合或用途的一个实施方案中，由于在本发明中使用的抗体在功能上替换因子FVIII，预期它们变成针对由该辅因子的活性(功能)的下降引起的疾病的有效药学试剂。上述疾病的例子包括出血、伴有出血的疾病或由出血造成的疾病。具体地，可能对血友病具有优秀治疗效果，其中出血病症由FVIII/FVIIIa功能的缺乏或下降造成。在血友病中，预期它们变成血友病A的优秀治疗剂，其中出血病症由FVIII/FVIIIa功能的遗传性缺乏或下降造成。
在本发明的上下文中，出血、伴有出血的疾病和/或由出血造成的疾病优选地表示由FVIII和/或活化的凝固因子VIII(F.VIIIa)的活性的下降或缺乏而发生和/或进展的疾病。这样的疾病包括上述的血友病A、其中出现针对FVIII/FVIIIa的抑制剂的疾病、获得性血友病、冯威里氏病等，但是对此没有特别限制。
下面列出了本发明的实施方案.
1.用于治疗血友病A的多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体与(非活化的)IX凝固因子IX联合使用。
2.用于治疗血友病A的(非活化的)凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
3.用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体与(非活化的)凝固因子IX联合使用。
4.用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的(非活化的)凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
5.用于治疗血友病A的以下组分的组合：
i)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和
ii)(非活化的)凝固因子IX。
6.用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的以下组分的组合：
i)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和
ii)(非活化的)凝固因子IX。
7.多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，
其中所述治疗与(非活化的)凝固因子IX组合。
8.(非活化的)凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
9.多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)用于制备药物的用途，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，
其中所述治疗与(非活化的)凝固因子IX组合。
10.(非活化的)凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
11.根据实施方案3、4、6、9或10所述的组合、抗体或用途，其中所述患者遭受凝固因子VIII的先天性或获得性缺乏。
12.根据实施方案11所述的组合、抗体或用途，其中所述缺乏通过抗体、其它抑制剂、消耗或稀释而获得。
13.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途，
a)用于增加凝血酶产生；
b)用于增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)用于加速凝血酶产生/形成；
d)用于增加或加速凝血酶产生/形成；
e)用于加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)用于增强血液凝固；
g)用于增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)用于预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等。
14.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途
a)其中存在增加的出血风险，
b)在外科手术或其它侵袭性手术中，和/或
c)血管损伤以后。
15.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中另外联合使用a)凝固因子II或b)凝固因子X、c)凝固因子II和X；或d)凝固因子II、X和VII。
16.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中凝固因子IX被包含在凝血酶原复合物浓缩物(PCC)中。
17.根据实施方案16所述的组合、抗体或用途，其中所述凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII和FX。
18.根据实施方案16所述的组合、抗体或用途，其中所述凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII、FX和FVII。
19.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中所述抗体是双特异性的，且所述结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点包含SEQ IDNO：105、106和107各自的H链CDR1、2和3氨基酸序列(Q499的H链CDR)和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)，且所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：126、127和128各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J327的H链CDR)和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)。
20.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
21.根据实施方案1-18中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中所述抗体包含：第一多肽，其包含结合血液凝固因子IX和/或活化的血液凝固因子IX的第一抗原结合位点；和第三多肽，其包含结合血液凝固因子IX和/或活化的血液凝固因子IX的第三抗原结合位点；以及第二多肽，其包含结合血液凝固因子X的第二抗原结合位点；和第四多肽，其包含结合血液凝固因子X的第四抗原结合位点。
22.根据实施方案21所述的组合、抗体或用途，其中所述第一多肽和所述第三多肽各自包含针对血液凝固因子IX或活化的血液凝固因子IX的抗体各自的H链或L链的抗原结合位点；且所述第二多肽和所述第四多肽各自包含针对血液凝固因子X的抗体各自的H链或L链的抗原结合位点。
23.根据实施方案21-22中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中所述第一多肽的抗原结合位点包含含有由选自以下(a1)至(a11)的氨基酸序列中的任一个组成的H链CDR的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点，且所述第二多肽的抗原结合位点包含含有由选自以下(b1)至(b11)的氨基酸序列中的任一个组成的H链CDR的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点：(a1)包含SEQ ID NO：75、76和77各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q1的H链CDR)的抗原结合位点；(a2)包含SEQ ID NO：78、79和80各自的H链CDR1、2和3氨基酸序列(Q31的H链CDR)的抗原结合位点；(a3)包含SEQ ID NO：81、82和83各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q64的H链CDR)的抗原结合位点；(a4)包含SEQ ID NO：84、85和86各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q85的H链CDR)的抗原结合位点；(a5)包含SEQ ID NO：87、88和89各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q153的H链CDR)的抗原结合位点；(a6)包含SEQ ID NO：90、91和92各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q354的H链CDR)的抗原结合位点；(a7)包含SEQ ID NO：93、94和95各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q360的H链CDR)的抗原结合位点；(a8)包含SEQ ID NO：96、97和98各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q405的H链CDR)的抗原结合位点；(a9)包含SEQ ID NO：99、100和101各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q458的H链CDR)的抗原结合位点；(a10)包含SEQ ID NO：102、103和104各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q460的H链CDR)的抗原结合位点；(a11)包含SEQ ID NO：105、106和107各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q499的H链CDR)的抗原结合位点；(b1)包含SEQ ID NO：108、109和110各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J232的H链CDR)的抗原结合位点；(b2)包含SEQID NO：111、112和113各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J259的H链CDR)的抗原结合位点；(b3)包含SEQ ID NO：114、115和116各自的H链CDR1、2和3氨基酸序列(J268的H链CDR)的抗原结合位点；(b4)包含SEQ ID NO：117、118和119各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J300的H链CDR)的抗原结合位点；(b5)包含SEQ ID NO：120、121和122各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J321的H链CDR)的抗原结合位点；(b6)包含SEQ ID NO：123、124和125各自的H链CDR1、2和3氨基酸序列(J326的H链CDR)的抗原结合位点；(b7)包含SEQ ID NO：126、127和128各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J327的H链CDR)的抗原结合位点；(b8)包含SEQ ID NO：129、130和131各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J339的H链CDR)的抗原结合位点；(b9)包含SEQ ID NO：132、133和134各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J344的H链CDR)的抗原结合位点；(b10)包含SEQ ID NO：135、136和137各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J346的H链CDR)的抗原结合位点；和(b11)包含SEQ ID NO：174、175和176各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J142的H链CDR)的抗原结合位点。
24.根据实施方案21-23中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中所述第一多肽的抗原结合位点包含含有由选自以下(a1)至(a11)的氨基酸序列中的任一个组成的H链可变区的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点，且所述第二多肽的抗原结合位点包含含有由选自以下(b1)至(b11)的氨基酸序列中的任一个组成的H链可变区的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点：(a1)包含SEQ ID NO：35的H链可变区氨基酸序列(Q1的H链可变区)的抗原结合位点；(a2)包含SEQ ID NO：36的H链可变区氨基酸序列(Q31的H链可变区)的抗原结合位点；(a3)包含SEQ ID NO：37的H链可变区氨基酸序列(Q1的H链可变区)的抗原结合位点；(a4)包含SEQ ID NO：38的H链可变区氨基酸序列(Q85的H链可变区)的抗原结合位点；(a5)包含SEQ ID NO：39的H链可变区氨基酸序列(Q153的H链可变区)的抗原结合位点；(a6)包含SEQ ID NO：40的H链可变区氨基酸序列(Q354的H链可变区)的抗原结合位点；(a7)包含SEQ ID NO：41的H链可变区氨基酸序列(Q360的H链可变区)的抗原结合位点；(a8)包含SEQ ID NO：42的H链可变区氨基酸序列(Q405的H链可变区)的抗原结合位点；(a9)包含SEQ ID NO：43的H链可变区氨基酸序列(Q458的H链可变区)的抗原结合位点；(a10)包含SEQ ID NO：44的H链可变区氨基酸序列(Q460的H链可变区)的抗原结合位点；(a11)包含SEQ ID NO：45的H链可变区氨基酸序列(Q499的H链可变区)的抗原结合位点；(b1)包含SEQ ID NO：46的H链可变区氨基酸序列(J232的H链可变区)的抗原结合位点；(b2)包含SEQ ID NO：47的H链可变区氨基酸序列(J259的H链可变区)的抗原结合位点；(b3)包含SEQ ID NO：48的H链可变区氨基酸序列(J268的H链可变区)的抗原结合位点；(b4)包含SEQID NO：49的H链可变区氨基酸序列(J300的H链可变区)的抗原结合位点；(b5)包含SEQ IDNO：50的H链可变区氨基酸序列(J321的H链可变区)的抗原结合位点；(b6)包含SEQ ID NO：51的H链可变区氨基酸序列(J326的H链可变区)的抗原结合位点；(b7)包含SEQ ID NO：52的H链可变区氨基酸序列(J327的H链可变区)的抗原结合位点；(b8)包含SEQ ID NO：53的H链可变区氨基酸序列(J339的H链可变区)的抗原结合位点；(b9)包含SEQ ID NO：54的H链可变区氨基酸序列(J344的H链可变区)的抗原结合位点；(b10)包含SEQ ID NO：55的H链可变区氨基酸序列(J346的H链可变区)的抗原结合位点；和(b11)包含SEQ ID NO：172的H链可变区氨基酸序列(J142的H链可变区)的抗原结合位点。
25.根据实施方案21-24中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中在所述第三多肽和所述第四多肽中包括的抗原结合位点包含含有由选自以下(c1)至(c10)的氨基酸序列中的任一个组成的L链CDR的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点：(c1)包含SEQ ID NO：138、139和140各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L2的L链CDR)的抗原结合位点；(c2)包含SEQ ID NO：141、142和143各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L45的L链CDR)的抗原结合位点(c3)包含SEQ ID NO：144、145和146各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L248的L链CDR)的抗原结合位点；(c4)包含SEQ ID NO：147、148和149各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L324的L链CDR)的抗原结合位点；(c5)包含SEQ ID NO：150、151和152各自的L链CDR1、2和3氨基酸序列(L3 34的L链CDR)的抗原结合位点；(c6)包含SEQ ID NO：153、154和155各自的L链CDR1、2和3氨基酸序列(L377的L链CDR)的抗原结合位点(c7)包含SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)的抗原结合位点；(c8)包含SEQ ID NO：159、160和161各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L406的L链CDR)的抗原结合位点；(c9)包含SEQ ID NO：137、138和139各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L408的L链CDR)的抗原结合位点；和(c10)包含SEQ ID NO：177、178和179各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L180的L链CDR)的抗原结合位点。
26.根据实施方案21-25中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中在所述第三多肽和所述第四多肽中包括的抗原结合位点包含含有由选自以下(c1)至(c10)的氨基酸序列中的任一个组成的L链可变区的抗原结合位点或在功能上与其等同的抗原结合位点：(c1)包含SEQ ID NO：56的L链可变区氨基酸序列(L2的L链可变区)的抗原结合位点；(c2)包含SEQ ID NO：57的L链可变区氨基酸序列(L45的L链可变区)的抗原结合位点；(c3)包含SEQID NO：58的L链可变区氨基酸序列(L248的L链可变区)的抗原结合位点；(c4)包含SEQ IDNO：59的L链可变区氨基酸序列(L324的L链可变区)的抗原结合位点；(c5)包含SEQ ID NO：60的L链可变区氨基酸序列(L334的L链可变区)的抗原结合位点；(c6)包含SEQ ID NO：61的L链可变区氨基酸序列(L377的L链可变区)的抗原结合位点；(c7)包含SEQ ID NO：62的L链可变区氨基酸序列(L404的L链可变区)的抗原结合位点；(c8)包含SEQ ID NO：63的L链可变区氨基酸序列(L406的L链可变区)的抗原结合位点；(c9)包含SEQ ID NO：64的L链可变区氨基酸序列(L408的L链可变区)的抗原结合位点；和(c10)包含SEQ ID NO：173的L链可变区氨基酸序列(L180的L链可变区)的抗原结合位点。
27.根据实施方案21-26中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中所述所述第一和第二多肽还抗体H链恒定区，且所述第三和第四多肽包含抗体L链恒定区。
28.根据实施方案21-26中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中所述第一和第二多肽包含抗体H链恒定区，且所述第三和第四多肽包含抗体L链恒定区，且其中所述第三多肽和所述第四多肽是共享L链。
29.根据实施方案21-28中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中所述第一多肽包含选自以下(a1)至(a14)的任一种抗体H链，所述第二多肽包含选自以下(b1)至(b12)的任一种抗体H链，且所述第三多肽和所述第四多肽包含选自以下(c1)至(c10)的任一种抗体L链：(a1)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的抗体H链(Q1-G4k)；(a2)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的抗体H链(Q31-z7)；(a3)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的抗体H链(Q64-z55)；(a4)由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的抗体H链(Q64-z7)；(a5)由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的抗体H链(Q85-G4k)；(a6)由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的抗体H链(Q153-G4k)；(a7)由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的抗体H链(Q354-z106)；(a8)由SEQID NO：14的氨基酸序列组成的抗体H链(Q360-G4k)；(a9)由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的抗体H链(Q360-z118)；(a10)由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的抗体H链(Q405-G4k)；(a11)由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的抗体H链(Q458-z106)；(a12)由SEQ IDNO：18的氨基酸序列组成的抗体H链(Q460-z121)；(a13)由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的抗体H链(Q499-z118)；(a14)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的抗体H链(Q499-z121)；(b1)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的抗体H链(J268-G4h)；(b2)由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的抗体H链(J321-G4h)；(b3)由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的抗体H链(J326-z107)；(b4)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的抗体H链(J344-z107)；(b5)由SEQID NO：21的氨基酸序列组成的抗体H链(J232-G4h)；(b6)由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成的抗体H链(J259-z107)；(b7)由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的抗体H链(J300-z107)；(b8)由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的抗体H链(J327-z107)；(b9)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的抗体H链(J327-z119)；(b10)由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的抗体H链(J339-z119)；(b11)由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成的抗体H链(J346-z107)；(b12)由SEQ ID NO：170的氨基酸序列组成的抗体H链(J142-G4h)；(c1)由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的抗体L链(L2-k)；(c2)由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的抗体L链(L45-k)；(c3)由SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成的抗体L链(L248-k)；(c4)由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成的抗体L链(L324-k)；(c5)由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成的抗体L链(L334-k)；(c6)由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成的抗体L链(L377-k)；(c7)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的抗体L链(L404-k)；(c8)由SEQ ID NO：33的氨基酸序列组成的抗体L链(L406-k)；(c9)由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成的抗体L链(L408-k)；和(c10)由SEQID NO：171的氨基酸序列组成的抗体L链(L180-k)。
30.根据实施方案28所述的组合、抗体或用途，其中所述抗体是以下(a)至(u)中的任一个的双特异性抗体：
(a)双特异性抗体(Q1-G4k/J268-G4h/L45-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：9的共享L链；(b)双特异性抗体(Q1-G4k/J321-G4h/L45-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：9的共享L链；(c)双特异性抗体(Q31-z7/J326-z107/L2-k)，其中所述第一多肽是由SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：8的共享L链；(d)双特异性抗体(Q64-z55/J344-z107/L45-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQID NO：9的共享L链；(e)双特异性抗体(Q64-z7/J326-z107/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(f)双特异性抗体(Q64-z7/J344-z107/L406-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：33的共享L链；(g)双特异性抗体(Q85-G4k/J268-G4h/L406-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：33的共享L链；(h)双特异性抗体(Q85-G4k/J321-G4h/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(i)双特异性抗体(Q153-G4k/J232-G4h/L406-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQID NO：21的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：33的共享L链；(j)双特异性抗体(Q354-z106/J259-z107/L324-k)，其中所述第一多肽是由SEQ IDNO：13的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：29的共享L链；(k)双特异性抗体(Q360-G4k/J232-G4h/L406-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQID NO：33的共享L链；(1)双特异性抗体(Q360-z118/J300-z107/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(m)双特异性抗体(Q405-G4k/J232-G4h/L248-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：28的共享L链；(n)双特异性抗体(Q458-z106/J346-z107/L408-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQID NO：27的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：34的共享L链；(o)双特异性抗体(Q460-z121/J327-z119/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ IDNO：18的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(p)双特异性抗体(Q499-z118/J327-z107/L334-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：30的共享L链；(q)双特异性抗体(Q499-z118/J327-z107/L377-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：31的共享L链；(r)双特异性抗体(Q499-z118/J346-z107/L248-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：28的共享L链；(s)双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ IDNO：32的共享L链；(t)双特异性抗体(Q499-z121/J339-z119/L377-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：31的共享L链；和(u)双特异性抗体(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：170的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：171的共享L链。
31.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中在用多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)治疗的血友病A患者中以10U-200U FIX/kg体重的量施用所述FIX，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
32.根据实施方案31所述的组合、抗体或用途，其中另外以10U-200U FX/kg体重的量施用FX。
33.根据实施方案31所述的组合、抗体或用途，其中另外以10U-200U FII/kg体重的量施用FII。
34.根据实施方案31所述的组合、抗体或用途，其中另外以10U-200U FII/kg体重和10U-200U FX/kg体重的量施用FII和FX。
35.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中在用多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)治疗的血友病A患者中以10U-200U PCC/kg体重的量施用凝血酶原复合物(PCC)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
36.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中同时共同施用所述多特异性抗体和FIX。
37.根据上述实施方案中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中依次共同施用所述多特异性抗体和FIX。
38.一种治疗遭受血友病A的患者的方法，所述方法包括给需要这种治疗的患者施用有效量的a)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，b)凝固因子IX。
39.一种治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的方法，所述方法包括给需要这种治疗的患者施用有效量的a)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和b)凝固因子IX。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述患者遭受凝固因子VIII的先天性或获得性缺乏。
41.根据实施方案40所述的方法，其中所述缺乏通过抗体、其它抑制剂、消耗或稀释而获得。
42.在遭受出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等(例如遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症，例如遭受血友病A)的患者中实现以下目的的方法：
a)增加凝血酶产生；
b)增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)加速凝血酶产生/形成；
d)增加和加速凝血酶产生/形成；
e)加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)增强血液凝固；
g)增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等，
所述方法包括给所述患者施用有效量的a)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和b)(非活化的)凝固因子IX。
43.根据上述实施方案中的任一个所述的方法
a)其中存在增加的出血风险，
b)在外科手术或其它侵袭性手术中，和/或
c)血管损伤以后。
44.根据上述实施方案中的任一个所述的方法，其中另外联合使用a)凝固因子II或b)凝固因子X、c)凝固因子II和X；或d)凝固因子II、X和VII。
45.根据上述实施方案中的任一个所述的方法，其中凝固因子IX被包含在凝血酶原复合物浓缩物(PCC)中。
46.根据实施方案45所述的方法，其中所述凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII和FX。
47.根据实施方案45所述的方法，其中所述凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII、FX和FVII。
48.根据上述实施方案中的任一个所述的方法，其中所述抗体是双特异性的，且所述结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：105、106和107各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q499的H链CDR)和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)，且所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：126、127和128各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J327的H链CDR)和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)。
49.根据上述实施方案中的任一个所述的方法，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
50.根据上述实施方案中的任一个所述的方法，其中同时共同施用所述多特异性抗体和FIX。
51.根据上述实施方案中的任一个所述的方法，其中依次共同施用所述多特异性抗体和FIX。
在下面列出了本发明的一些优选实施方案：
1.用于治疗血友病A的多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链，其中所述抗体与(非活化的)凝固因子IX联合使用。
2.用于治疗血友病A的(非活化的)凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
3.用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链，其中所述抗体与(非活化的)凝固因子IX联合使用。
4.用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的(非活化的)凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
5.用于治疗血友病A的以下组分的组合：
i)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链，和
ii)(非活化的)凝固因子IX。
6.用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的以下组分的组合：
i)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链，和
ii)(非活化的)凝固因子IX。
7.多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链，
其中所述治疗是与凝固因子IX组合。
8.(非活化的)凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
9.多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)用于制备药物的用途，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链，
其中所述治疗与(非活化的)凝固因子IX组合。
10.(非活化的)凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
11.多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链，所述抗体
a)用于增加凝血酶产生；
b)用于增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)用于加速凝血酶产生/形成；
d)用于增加或加速凝血酶产生/形成；
e)用于加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)用于增强血液凝固；
g)用于增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)用于预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等；
其中所述抗体与(非活化的)凝固因子IX联合使用。
12.(非活化的)凝固因子IX，其
a)用于增加凝血酶产生；
b)用于增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)用于加速凝血酶产生/形成；
d)用于增加或加速凝血酶产生/形成；
e)用于加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)用于增强血液凝固；
g)用于增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)用于预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等；
其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
13.以下组分的组合：
i)多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链，和
ii)(非活化的)凝固因子IX，所述组合
a)用于增加凝血酶产生；
b)用于增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)用于加速凝血酶产生/形成；
d)用于增加或加速凝血酶产生/形成；
e)用于加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)用于增强血液凝固；
g)用于增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)用于预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等。
14.多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)用于制备药物的用途，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链，所述药物
a)用于增加凝血酶产生；
b)用于增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)用于加速凝血酶产生/形成；
d)用于增加或加速凝血酶产生/形成；
e)用于加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)用于增强血液凝固；
g)用于增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)用于预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等；
其中所述药物与(非活化的)凝固因子IX联合使用。
15.(非活化的)凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物
a)用于增加凝血酶产生；
b)用于增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)用于加速凝血酶产生/形成；
d)用于增加或加速凝血酶产生/形成；
e)用于加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)用于增强血液凝固；
g)用于增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)用于预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等；
其中所述凝固因子IX与多特异性抗体(其在功能上替换血液凝固因子VIII)联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
16.用于增加凝血酶产生的根据实施方案11-15中的任一个所述的组合、抗体或用途；
17.用于加速凝血酶产生的根据实施方案11-15中的任一个所述的组合、抗体或用途。
18.根据实施方案1-17中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中同时共同施用所述多特异性抗体和FIX。
19.根据实施方案1-17中的任一个所述的组合、抗体或用途，其中依次共同施用所述多特异性抗体和FIX。
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。应当理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下对所述操作进行修改。
实验程序：
实施例1
缺乏FVIII的血浆中的凝血酶产生
将缺乏FVIII的血浆样品(缺乏FVIII的血浆，Siemens)(但是含有正常水平的未活化的FIX、FX和FII)用作凝固因子VIII的缺乏或机能病症的模型(特别是作为血友病A患者样品的模型)。
将在US 2013/0330345中描述并在下文中缩写为Bsab FIX/FX的结合因子IX且结合因子X的双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)(其包含序列SEQ ID NO：20、SEQID NO：25和SEQ ID NO：32的氨基酸序列)以25、50、75或100μg/ml的浓度掺入血浆样品中，所述浓度类似于临床上应用的Bsab FIX/FX浓度。Bsab FIX/FX(Q499-z121/J327-z119/L404-k)详细描述在US 2013/0330345中，且包含：第一多肽，其包含结合血液凝固因子IX和/或活化的血液凝固因子IX的第一抗原结合位点；和第三多肽，其包含结合血液凝固因子IX和/或活化的血液凝固因子IX的第三抗原结合位点；以及第二多肽，其包含结合血液凝固因子X的第二抗原结合位点；和第四多肽，其包含结合血液凝固因子X的第四抗原结合位点其中所述第一多肽是包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的H链，所述第二多肽是包含SEQ IDNO：25的氨基酸序列的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的共享L链。
另外，在所述实验的部分中在体外加入重组FIX(Benefix(R))((非活化的)FIX)。可替代地，以1U/ml(Octaplex(R))的浓度在体外加入包含FIX(非活化形式)的商购可得的凝血酶原复合物浓缩物(PCC)。Octaplex是含有凝固因子II(220-760IU)、VII(180-480IU)、IX(500IU)和X(360-600IU)的一种合并的血浆凝固因子浓缩物。它也含有蛋白C、蛋白S、白蛋白、肝素和柠檬酸钠。由于PCC含有少量的肝素，它可能干扰它们的活性的体外评价，将PCC在肝素酶溶液(Hepzyme，Siemens)中温育15分钟，所述肝素酶是在体外降解肝素的酶。
作为对照，以100％的浓度将重组FVIII(Advate，Baxter)加入缺乏FVIII的血浆中。
在4％明胶溶液(Gelafusal)中制备Bsab因子IX/因子X的稀释物。
表1：试验的物质组合.
FVIII dp
FVIII dp +100％FVIII
FVIII dp +100μg/ml Bsab FIX/FX
FVIII dp +75μg/ml Bsab FIX/FX
FVIII dp +50μg/ml Bsab FIX/FX
FVIII dp +25μg/ml Bsab FIX/FX
FVIII dp +100％FVIII +100％FIX
FVIII dp +100μg/ml Bsab FIX/FX +100％FIX
FVIII dp +75μg/ml Bsab FIX/FX +100％FIX
FVIII dp +50μg/ml Bsab FIX/FX +100％FIX
FVIII dp +25μg/ml Bsab FIX/FX +100％FIX
FVIII dp +100％FVIII +1U PCC/ml
FVIII dp +100μg/mlBsab FIX/FX +1U PCC/ml
FVIII dp +75μg/ml Bsab FIX/FX +1U PCC/ml
FVIII dp +25μg/ml Bsab FIX/FX +1U PCC/ml
FVIII dp＝缺乏FVIII的血浆
在用少量组织因子(“PPP低试剂”、仪器和所有试剂得自Thrombinoscope，荷兰)活化凝固以后，借助于发荧光底物连续地确定凝血酶产生。
凝血酶产生方法的描述：
使用经校准的自动化凝血图(Calibrated Automated Thrombogram，CAT)方法，可以在Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands测量生物血浆中的凝血酶产生。简而言之，通过添加1pM组织因子(TF)、磷脂和钙离子(Ca2+)，通过非固有凝固途径触发凝血酶产生。加入低亲和力发荧光底物用于凝血酶产生的实时分析。针对已知的凝血酶校准物校准血浆样品，以便校正底物消耗、样品颜色和内滤光片效应。用Thermo Fluoroskan读出荧光。从测量的荧光信号计算凝血酶活性。表达的曲线表明游离的凝血酶活性(y-轴，nM凝血酶)与时间(x-轴，秒)的关系。
对照测量：缺乏FVIII的血浆和缺乏FVIII的血浆+100％FVIII：
如预期的，单独的缺乏FVIII的血浆的分析揭示了非常弱的凝血酶产生。这显示了血友病A患者中的出血病症的生理学原因。
在图3a中，FVIII的添加导致快速的凝血酶产生，和与缺乏FVIII的样品相比共7倍凝血酶产生。
Bsab FIX/FX的添加：
Bsab FIX/FX的添加也导致凝血酶产生显著增加至缺乏FVIII的样品的凝血酶产生的3.4倍-4.4倍。结果显示在图3b中。
在缺乏FVIII的血浆样品的凝血酶产生方面对比Bsab FIX/FX的活性与FVIII的活性：
对比补充了FVIII或Bsab FIX/FX的样品的凝血酶产生，使用FVIII形成了显著更多的凝血酶，并且用FVIII时达到凝血酶产生峰值的时间也比Bsab FIX/FX更短((参见图3c)。
FIX向用Bsab FIX/FX处理过的缺乏FVIII的血浆中的添加：
FIX(100％)向用Bsab FIX/FX处理过的缺乏FVIII的血浆中的添加导致凝血酶产生的显著增加(参见图4a和表2)。
在含有75μg Bsab FIX/FX/ml的样品中，这导致凝血酶产生的倍增。在含有50μgBsab FIX/FX/ml的样品中，确定了凝血酶产生的75％增加。在含有25μg Bsab FIX/FX/ml的样品中，发现了凝血酶产生的50％增加(参见图....和。
另外，FIX的添加使达到峰值的时间显著缩短，即不仅使凝血酶产生增加，而且使凝血酶产生加速。
如在图4a和表2中所见，用Bsab FIX/FX处理过的样品的凝血酶产生峰值以及达到峰值的时间与含有100％FVIII的样品匹配。
凝血酶原复合物浓缩物(PCC)向用Bsab FIX/FX处理过的缺乏FVIII的血浆的添 加：
PCC(1U/ml)向用Bsab FIX/FX处理过的缺乏FVIII的血浆的添加导致凝血酶产生的显著增加。
在含有75μg Bsab FIX/FX/ml的样品中，这导致凝血酶产生的94％增加。在含有25μg RO5534262/ml的样品中，发现了凝血酶产生的90％增加。在两种情况下，添加PCC的用Bsab FIX/FX处理过的样品相对于补充FVIII的样品而言凝血酶产生峰值是类似的(参见图4b和表2)。
表2：结果：试验的物质组合在缺乏FVIII的血浆中诱导的/增加的凝血酶产生.
使用100μg Bsab FIX/FX/ml和100％FIX或1U PCC/ml，甚至可以达到超过用100％FVIII/ml发现的凝血酶产生的凝血酶产生。在大出血并发症的情况下，例如在创伤或较大外科手术以后，这可能是合乎需要的。
实验数据的总结：
实验数据表明，FIX或PCC向用Bsab FIX/FX(Q499-z121/J327-z119/L404-k)处理过的血浆样品的添加会导致样品中凝血酶产生的显著增加。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 使用凝固因子和多特异性抗体的联合治疗
<130> P32729-WO
<150> EP15164045.5
<151> 2015-04-17
<160> 179
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1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 165
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Gln Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 166
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 166
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Gln Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Asn
20 25 30
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35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Ile Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 167
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 167
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 168
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 168
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 169
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 169
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr His Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr His Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Gln Gln Tyr Tyr Ser Pro Pro Leu Thr
1 5

Claims (22)

1.用于治疗血友病A的多特异性抗体，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体与(非活化的)凝固因子IX联合使用。
2.用于治疗血友病A的(非活化的)凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
3.用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的多特异性抗体，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，其中所述抗体与(非活化的)凝固因子IX联合使用。
4.用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的(非活化的)凝固因子IX，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
5.用于治疗血友病A的以下组合：
i)多特异性抗体，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和
ii)(非活化的)凝固因子IX。
6.用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者的以下组合：
i)多特异性抗体，其包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，和
ii)(非活化的)凝固因子IX。
7.多特异性抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，
其中所述治疗与(非活化的)凝固因子IX组合。
8.(非活化的)凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗血友病A，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
9.多特异性抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点，
其中所述治疗与(非活化的)凝固因子IX组合。
10.(非活化的)凝固因子IX用于制备药物的用途，所述药物用于治疗遭受凝固因子VIII的a)缺乏或b)机能病症的患者，其中所述凝固因子IX与多特异性抗体联合使用，所述多特异性抗体包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点和结合凝固因子X的第二抗原结合位点。
11.根据权利要求3、4、6、9或10所述的组合、抗体或用途，其中所述患者遭受凝固因子VIII的先天性或获得性缺乏。
12.根据权利要求11所述的组合、抗体或用途，其中所述缺乏通过抗体、其它抑制剂、消耗或稀释而获得。
13.根据前述权利要求中的任一项所述的组合、抗体或用途，其
a)用于增加凝血酶产生；
b)用于增加在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生；
c)用于加速凝血酶产生/形成；
d)用于增加和加速凝血酶产生/形成；
e)用于加速在血管损伤部位处/在组织因子释放部位处的凝血酶产生/形成；
f)用于增强血液凝固；
g)用于增强纤维蛋白凝块形成；和/或
h)用于预防和/或治疗出血、伴有出血的疾病、由出血造成的疾病等。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的组合、抗体或用途，
a)其中存在增加的出血风险，
b)在外科手术或其它侵袭性操作过程中，和/或
c)血管损伤以后。
15.根据前述权利要求中的任一项所述的组合、抗体或用途，其中另外联合使用a)凝固因子II或b)凝固因子X、c)凝固因子II和X；或d)凝固因子II、X和VII。
16.根据前述权利要求中的任一项所述的组合、抗体或用途，其中(非活化的)凝固因子IX被包含在凝血酶原复合物浓缩物(PCC)中。
17.根据权利要求16所述的组合、抗体或用途，其中所述凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII和FX。
18.根据权利要求16所述的组合、抗体或用途，其中所述凝血酶原复合物浓缩物包含FIX、FII、FX和FVII。
19.根据前述权利要求中的任一项所述的组合、抗体或用途，其中所述抗体是双特异性的，且所述结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：105、106和107各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(Q499的H链CDR))和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)，且所述第二抗原结合位点包含SEQID NO：126、127和128各自的H链CDR 1、2和3氨基酸序列(J327的H链CDR)和SEQ ID NO：156、157和158各自的L链CDR 1、2和3氨基酸序列(L404的L链CDR)。
20.根据前述权利要求中的任一项所述的组合、抗体或用途，其中所述抗体是双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其包含a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的H链，b)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的H链，和c)由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的(共享)L链。
21.根据权利要求1-20中的任一项所述的组合、抗体或用途，其中同时共同施用所述多特异性抗体和FIX。
22.根据权利要求1-20中的任一项所述的组合、抗体或用途，其中依次共同施用所述多特异性抗体和FIX。
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