JPH10505327A - 血管系の特異的凝固のための方法および組成物 - Google Patents

血管系の特異的凝固のための方法および組成物

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Abstract

(57)【要約】 特定の血液凝固の達成に使用される種々の組成物および方法が開示されている。これは、二重特異性抗体を用いたコアギュラントの部位特異的送達による、腫瘍の退行を引き起こす特定のインビボにおける腫瘍血管系の凝固によって例示される。

Description

【発明の詳細な説明】 血管系の特異的凝固のための方法および組成物 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、一般に、血管および凝固の分野に関する。より詳細には、本発明は 、特異的凝固を達成する使用のための、二重特異性抗体を含む種々の増殖因子ベ ースの試薬および免疫学的試薬を提供する。 ２．関連する技術の説明 過去３０年間の間に、新生物形成疾患の化学療法における進歩が実現されてき た。これは、新しい化学療法剤の開発、より詳細には、薬物の同時投与のための 処法の開発におけるいくつかの進歩を含む。細胞レベルおよび組織レベルにおけ る新生物形成のプロセス、および基礎となる抗新生物形成剤の作用のメカニズム に対する重要な理解もまた、絨毛膜ガン腫、ウイルムス腫瘍、急性白血病、横紋 筋腫、網膜芽腫、ホジキン病およびバーキットリンパ腫を含む、多くの新生物形 成疾患の化学療法の進歩を可能にしてきた。いくつかの腫瘍において進歩がなさ れてきたが、ヒトガンの最も普通の形態の多くはまだ、有効な化学療法の介入に 抵抗している。 いずれの処置処法でも言及しなければならない重要な根本的な問題は、「全細 胞殺傷」の概念である。この概念は、有効な処置処法を有するために、それが外 科的アプローチまたは化学療法的アプローチのいずれかまたはその両方であるか どうかかかわらず、全てのいわゆる「クローン原性」悪性細胞の全細胞殺傷が存 在しなければならないこと、すなわち、制御されずに増殖しそして任意の腫瘍塊 に入れ替える能力を有する細胞が除去され得ることを確保する。全細胞殺傷を実 現する治療剤および治療処法を開発する究極の要求のためには、特定のタイプの 腫瘍が他の腫瘍より治療しやすい。例えば、軟組織腫瘍(例えば、リンパ腫)、お よび血液および血液形成器官の腫瘍(例えば白血病)は、一般に、化学療法治療に 対してガン腫のような固形腫瘍よりも応答しやすい。 化学療法に対する軟組織腫瘍および血液ベースの腫瘍のこの感受性についての １つの理由は、化学療法的介入に対してリンパ球および白血球が物理的に接近し やすいからである。単純な投与では、大部分の化学療法剤は固形腫瘍塊の全ての 細胞に到達することが軟腫瘍および血液ベースの場合よりもはるかに難しく、そ してそれゆえ全細胞殺傷を達成することがはるかに難しい。化学療法剤の投与量 を増大することにより、しばしば、毒性副作用が生じる。これは、一般に従来の 抗腫瘍剤の有効性を制限する。 成功した抗腫瘍剤を開発する戦略は、腫瘍細胞を選択的に殺すが、正常な組織 に対しては、存在しても比較的小さな不都合な作用しか示さない薬剤の設計を含 む。新生物形成組織と正常組織との間には定性的相違がほとんどないため、この 目標の達成は困難である。このために、多年にわたって多くの研究は、化学療法 および診断の両方のための免疫学的標的として供し得る腫瘍特異的「マーカー抗 原」を同定することに集中してきた。多くの腫瘍特異的、または準腫瘍特異的( 「腫瘍関連の」)マーカーが、特異的抗体により認識され得る腫瘍細胞抗原とし て同定されてきた。不幸にも、一般に、腫瘍特異的抗体それ自体は、基本的にガ ン治療に有用であるように十分な抗腫瘍効果を発揮しない。 つい最近、イムノトキシンが、ガン細胞を選択的に標的とする試みに利用され た。イムノトキシンは、特異的な標的化剤、代表的には腫瘍特異的な抗体または フラグメント(fragment)と細胞毒性剤(例えば、トキシン部分)との接合体(conju gate)である。標的化剤は、標的にされた抗原を有する細胞にトキシンを向け、 そしてこれらの細胞を殺すように設計される。「第２世代」のイムノトキシン、 例えば、脱グリコシル化されたリシンＡ鎖を利用して肝臓によるイムノトキシン の取り込みを防ぎ、そして肝臓毒性を低減するような(Blakeyら、1987a;b)、お よびイムノトキシンにインビボでより高い安定性を与える新しい架橋剤を有する ような(Thorpeら、1988)イムノトキシンが、現在開発されている。 イムノトキシンは、マウス(Thorpeら、1988；Ghetieら、1991；Griffinら、19 88a;b)およびヒト(Vitettaら、1991)におけるリンパ腫および白血病を処置する 際に有効であった。しかし、リンパ系新形成は、腫瘍細胞が血液で運ばれるイム ノトキシンに比較的に接近しやすいため、特に、イムノトキシン療法を受けやす い。また、正常なリンパ球抗原を標的にすることも可能である。なぜなら、治療 の間に悪性細胞とともに殺される正常なリンパ球は、標的抗原を欠く始原細胞か ら迅速に再形成されるからである。 リンパ腫におけるこれらの効果とは対照的に、イムノトキシンは固形腫瘍の処 置において相対的に有効ではない(Weinerら、1989；Byersら、1989)。これに対 する主な理由は、固形腫瘍が一般に抗体サイズ分子に対して不透過性であること である：注入投与量／ｇ腫瘍の0.001％未満の比取込み値はヒトの研究にはまれ ではない(Sandsら、1988；Epenetosら、1986)。別の重要な問題は、抗原欠損変 異体がイムノトキシンによる殺傷からのがれ、そして再増殖し得ることである(T horpeら、1988)。 さらに、腫瘍塊に侵入する抗体は、いくつかの理由により均一に分布しない。 第１に、腫瘍細胞の密なパッキングおよび繊維状の腫瘍支質が、高分子輸送に対 して圧倒的な物理的バリアーを示し、そしてリンパ球による排出がないことと組 み合わされて、腫瘍コアで浸出および液体対流を低減する高い割り込み圧力を作 り出す(Baxterら、1991；Jain、1990)。第２に、大部分の腫瘍における血管の分 布は、組織化されておらずかつ不均一であり、これにより、いくつかの腫瘍細胞 は、大きな拡散距離により、浸出する抗体から分離される(Jain、1990)。第３に 、腫瘍に侵入する抗体の全てが、脈管周囲領域において、最初に遭遇する腫瘍細 胞により吸着され得、より遠い部位の腫瘍細胞に到着するものをなくする(Baxte rら、1991；Kennelら、1991)。 従って、固形腫瘍の処置のための新規戦略の開発に対する顕著な必要性が存在 することは明らかである。１つのアプローチは、腫瘍細胞よりもむしろ腫瘍の血 管系に薬剤を標的化することを含む。固形腫瘍の増殖は、腫瘍の血管形成に高度 に依存し、そして腫瘍細胞の増殖は、酸素、栄養素および他の増殖因子の供給、 および代謝産物の流出が満足される場合のみ維持され得る。実際、多くの現存す る療法は、それらの作用の一部として、血管媒介の作用メカニズムを有し得るこ とが既に観察されている(Denekamp、1990)。 本発明者らは、血管系を標的にすることは、腫瘍から生命維持事象を奪い、そ して腫瘍の増殖速度を低下させ、または腫瘍細胞の死をもたらすようであること を提案する。このアプローチは、腫瘍細胞を直接標的にすることに対していくつ かの利点を与えることが期待される。第１に、標的細胞は、静脈内投与された治 療剤に直接に接近し得、それにより、注入された投与量の高い割合を迅速に局在 化することを可能にする(Kennesら、1991)。第２に、毛細管のそれぞれが腫瘍を 取り込む「コード(cord)」中で数千の細胞に酸素および栄養素を提供するため、 腫瘍血管系に対する限られた損傷でさえ、腫瘍細胞死の雪崩を生じる(Denekamp 、1990；Denekamp、1984)。最後に、標的抗原を欠く変異体内皮細胞の外殖(outg rowth)は有りそうもない。これらは正常細胞だからである。 現時点では、腫瘍血管の標的化を成功させるため、正常組織中の内皮細胞では なく、腫瘍の内皮細胞を認識する抗体が必要であることが一般に受け入れられて いる。数種の抗体が開発されたが(Duijvestijnら、1987；Hagemeierら、1986；B rulandら、1986；Murrayら、1989；Schlingemannら、1985)、いずれも高度な特 異性を示さなかった。また、血管を標的にする抗体接合体中の第２の薬剤として 有望な任意の特定の薬剤は、上記トキシン以外には報告されていないようである 。従って、不幸にも、血管を標的にすることは一定の理論的利点を示すが、これ らの利点を取り込む有効な戦略はまだ開発されていない。 発明の要旨 本発明は、特異的凝固、例えば、腫瘍血管系中の凝固を達成する使用のための 、副作用が制限された新規な組成物および方法を提供することにより、先行技術 の制限を克服する。本発明は、一般的および全体的意味では、疾患に関連する血 管系中の凝固を刺激し得る種々の新規な免疫学的因子および増殖因子ベースの二 重特異性組成物、ならびにこれらの調製の方法および使用に関する。 本発明は、一般に「二重特異性結合リガンド」として記載され得る結合リガン ドを提供する。このようなリガンドは、代表的には、疾患と関連する標的細胞( 例えば、腫瘍細胞)、またはこのような細胞と関連する成分；疾患と関連する血 管系(例えば、腫瘍血管系)に関連する特定の成分；あるいは疾患と関連する支質 の成分またはそれと関連する成分に結合する「第１結合領域」を含む。第１結合 領域は、凝固因子それ自身であり得るか、または凝固因子に結合し得る第２結合 領域であり得る「凝固剤」と作動可能に会合するかまたは連結される。 本発明の結合リガンドは、「二重特異性」として記載される。なぜなら、これ らは「少なくとも」二重特異性であり、すなわち、これらは最小でも２つの機能 的に異なる領域を含むからである。他の構築物(例えば、三重特異性および多重 特異性の結合リガンド)を使用する組成物および方法もまた、本発明の範囲内に 含まれる。本明細書中に記載の二重特異性凝固リガンドを、他のエフェクター( 例えば、他の免疫学的因子および増殖因子ベースの組成物、抗原誘発剤、免疫刺 激剤、免疫抑制剤、化学療法薬物など)とともに使用する、組み合わせ組成物、 キットおよび方法もまた意図される。 第１結合領域および任意の第２結合領域は、抗体またはそのフラグメントであ り得る。本明細書中で使用される用語「抗体」とは、任意の免疫学的結合剤(例 えば、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE)を広く意味することが意図される。一般に 、IgGまたはIgMが好ましい。なぜなら、これらは、生理学的状態で最も一般な抗 体であり、そしてこれらは実験室設定中で最も容易に作製されるからである。モ ノクローナル抗体(MAb)は、一定の利点(例えば、再生産性および大規模生産)を 有し、そしてそれらの使用が一般に好ましいことが認識されている。操作された 抗体(例えば、組換え抗体およびヒト化された抗体)もまた、本発明の範囲内に入 る。 抗体の抗原結合領域が結合および標的化剤として利用される場合、完全な抗体 分子が利用され得る。あるいは、抗体のFv、scFv(一重鎖Fv)、Fab'、Fab、Dabま たはF(ab')2フラグメントにより例示されるように機能的な抗原結合領域が使用 され得る。種々の抗体ベースの構築物を調製および使用する技術は、該当分野で 周知であり、そして本明細書にさらに記載されている。 結合リガンドの凝固因子部分は、それが有意な機能的能力を維持するように形 成され、すなわち、結合リガンドの凝固因子部分は、標的領域に送達されるとき に、それがまだ血液凝固または血餅形成を促進するその能力を保持するような形 態である。しかし、特定の実施態様では、結合リガンドの凝固因子部分は、例え ば、コアギュラントの天然の相応物よりも活性が少なく、そしてこの因子は、標 的領域への送達に際してのみ所望のレベルの活性を達成する。このような例の１ つは、Gla改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子であるが、これは、膜環境への 二重特異性リガンドの第１結合領域の結合に際して有意な機能的活性を達成する 。 第２結合領域が凝固因子に結合するために使用される場合、これは、一般に、 凝固を誘導するその能力を有意に損害しない凝固因子上の部位を認識するように 選択される。同様に、凝固因子が第１結合剤に共有結合する場合、その機能的凝 固部位と異なる部位が、一般に、分子を連結するために使用される。 本発明の二重特異性リガンドの「第１結合領域」は、指定の標的部位、すなわ ち、凝固が必要とされる腫瘍領域または他の疾患部位と関連する部位に結合する 任意の成分であり得る。標的分子は、腫瘍を標的にする場合、一般に、腫瘍部位 中では非腫瘍部位中よりも高い濃度で存在する。特定の好ましい実施態様では、 標的分子は、腫瘍細胞、腫瘍血管細胞、腫瘍関連支質、または他の成分と関連す るかどうかにかかわらず、このような細胞または他の腫瘍関連の実体に制限され る。しかし、これは、本発明の要件ではない。 この点に関して、腫瘍血管系は、「プロトロンボチック(prothrombotic)」で あり、そして凝固する傾向にあることに注意されべきである。従って、標的コア ギュラントは、腫瘍血管系を優先的に凝固させるが、たとえ他の正常細胞または 体成分、特に、正常な内皮細胞または支質でさえもが標的分子の有意なレベルを 発現しても、正常組織の血管系を凝固させないことが意図される。従って、この アプローチは、例えば、ガンの処置手段として、ヒトでの使用が、腫瘍血管系に トキシンを標的づける使用よりも安全であると考えられる。 特定の実施態様では、本発明における使用のために意図される第１結合領域は 、腫瘍細胞成分または腫瘍細胞と関連する成分に関し得る。一般に、腫瘍細胞を 標的にする際、第１結合リガンドは、二重特異性結合リガンドの凝固因子成分を 、血管に最も近い血管周囲の腫瘍細胞上に濃縮し、それにより、腫瘍血管の凝固 の引金となり、二重特異性結合リガンドに有意な有用性を与えると考えられる。 従って、第１結合領域は、腫瘍細胞に結合する抗体または他の薬剤のような成 分であり得る。「腫瘍細胞に結合する」薬剤は、本明細書中で任意の接近可能な 成分または腫瘍細胞の成分に結合するリガンドとして、あるいは本明細書にさら に記載されるように、それ自身が腫瘍細胞に結合するかまたは腫瘍細胞と関連す る成分に結合するリガンドとして定義される。 このような腫瘍結合リガンドの大多数は、細胞表面腫瘍抗原またはマーカーに 結合する薬剤、特に抗体であることが意図される。このような抗原の多くは、抗 原結合および腫瘍標的化における使用のための種々の抗体が存在するように、公 知である。従って、本発明は、表Ｉに例示されるような同定された腫瘍細胞表面 抗原に結合する第１結合領域(例えば、抗体の抗原結合領域)、および表IIに例示 される腫瘍細胞への結合のようなインタクトの腫瘍細胞に優先的にまたは特異的 に結合する第１結合領域を含む。 現在、腫瘍細胞結合領域の好ましい例は、細胞表面腫瘍抗原p185HER2、乳汁ム チンコアタンパク質(milk mucin core protein)、TAG-72、ルイスaまたはガン胎 児性抗原(CEA)に結合する抗体の抗原結合領域を含む領域である。現在好ましい 腫瘍細胞結合領域の別のグループは、抗体9.2.27、OV-TL3、MOv18、B3、KS1/4、 260F9またはP612に結合する、腫瘍関連抗原に結合する抗体の抗原結合性領域を 包含する領域である。 抗体9.2.27は高分子量(Mr)のメラノーマ抗原に結合し、OV-TL3およびMOv18の 両方は卵巣関連の抗原に結合し、B3およびKS1/4はガン腫抗原に結合し、260F9は 乳房ガン腫に結合し、そしてD612は結腸直腸ガン腫に結合する。D612、B3または KS1/4と同じ抗原に結合する抗原結合部分が特に好ましい。D612は米国特許第5,1 83,756号に記載されており、ATCC受託番号HB9796を有し；B3は米国特許第5,242, 813号に記載されており、ATCC受託番号HB10573を有し；そして組換えおよびキメ ラKS1/4抗体は米国特許第4,975,369号に記載されており；それぞれは参考として 本明細書中に援用される。 腫瘍細胞標的化において、腫瘍マーカーが、生物学的リガンドが同定されてい る成分(例えば、レセプター)である場合、抗体よりもむしろこのリガンド自体が また標的化剤として利用され得る。このようなリガンドの活性フラグメントまた は結合領域もまた利用され得る。 本発明における使用のための第１結合領域はまた、腫瘍細胞マーカーと関連す るリガンドに結合する成分であり得る。例えば、目的の腫瘍抗原が細胞表面レセ プターである場合、インビボの腫瘍細胞は、それらの表面に結合しそして標的と して利用可能な、対応する生物学的リガンド(例えば、ホルモン、サイトカイン または増殖因子)を有する。これは、腫瘍細胞によって生成され、続いてこの細 胞の表面に結合され得る循環性リガンドおよび「パラ分泌型」リガンドの両方を 含む。 従って、本発明はさらに、同定された腫瘍細胞表面抗原(表Ｉに例示されるよ うな)に結合するリガンドに結合するか、あるいは１つまたはそれ以上のインタ クトの腫瘍細胞に優先的にまたは特異的に結合する第１結合領域(例えば、抗体 およびそのフラグメント)を包含する。さらに、レセプター自体、または好まし くはレセプターまたはレセプター結合ドメインの操作された形態または可溶性形 態もまた二重特異性凝固リガンドの結合領域として利用され得る。 さらなる実施態様では、第１結合領域は、腫瘍部位以外の疾患部位で特異的ま たは優先的に発現される標的分子に結合する成分であり得る。他の疾患細胞と関 連する代表的な標的分子は、例えば、良性前立腺肥大症(BPH)と関連するPSAおよ び増殖性糖尿病性網膜症と関連するFGFを含む。上記の疾患の１つを有する動物 または患者は、疾患部位における凝固の特異的誘発から恩恵を受け得ると考えら れる。 本明細書の文脈中では「疾患細胞」の意味は、疾患または障害と関連した細胞 である。この細胞は、非疾患の部位および細胞中のレベルに比べて、疾患の部位 および細胞中でより高い濃度で存在する標的可能な成分を発現するかまたはそれ と関連する。これは、疾患部位中の血管系と関連する標的可能な成分を含む。 他の疾患部位にコアギュラントを標的づけかつ送達する使用のための代表的な 第１結合領域は、抗体(例えば、抗-PSA(BPH)、およびFGFに結合するGF82、GF673 H3)を含む。対応するレセプター(この場合はFGFレセプター)に結合する生物学的 結合リガンド(例えば、FGF)もまた使用され得る。以下に記載されるように、血 管標的に対する抗体もまた使用され得る。支質または内皮細胞の標的化は、他の 疾患を処置する強力な手段を提供し、ここで「疾患細胞」自体は強力または独特 なマーカー抗原と関連しなくても良い。 さらなる実施態様では、本発明の第１結合領域は、疾患関連の血管系、すなわ ち、特異的凝固が動物または患者に有利であり得る血管系の領域の成分に結合し 得る成分である。腫瘍血管系と特異的または優先的に関連する成分に結合し得る 第１結合領域が、現時点では好ましい。「腫瘍血管系の成分」は、腫瘍血管系内 皮細胞表面分子および細胞表面レセプターまたは分子に結合し得る任意の成分( 例えば増殖因子)の両方を含む。 特定の好ましい結合リガンドは、細胞表面レセプターに結合する抗体およびそ のフラグメント、ならびにこれらのレセプターの対応する生物学的リガンドに結 合する抗体である。代表的な抗体は、MHCクラスIIタンパク質、VEGF/VPEレセプ ター、FGFレセプター、TGFβレセプター、TIE(TIE-1およびTIE-2を含む、チロシ ンキナーゼ-免疫グロブリン-上皮増殖因子様レセプター)、VCAM-1、P-セレクチ ン、E-セレクチン、αvβ3インテグリン、プレイオトロピン(pleiotropin)、エ ンドシアリン(endosialin)およびエンドグリン(endoglin)に結合する抗体である 。 エンドグリンに結合する抗体の抗原結合領域を含む第１結合領域は、好ましい 薬剤の１群である。これらは、モノクローナル抗体TEC-4またはモノクローナル 抗体TEC-11と同じエピトープに結合する抗体およびフラグメントにより代表され る。 VEGFレセプターに結合する抗体の抗原結合領域は、好ましい薬剤の別の群であ る。これらは、特に、モノクローナル抗体3E11、3E7、5G6、4D8、10B10またはTE C-110と同じエピトープに結合する抗体またはフラグメントにより代表される。 以下のように名付けた抗体の任意の１つと実質的に同じ結合特異性を有する抗-V EGF抗体もまた使用され得る：1B4、4B7、1B8、2C9、7D9、12D2、12D7、12E10、5 E5、8E5、5E11、7E11、3F5、10F3、1F4、2F8、2F9、2F10、1G6、1G11、3G9、9G1 1、10G9、GV97、GV39、GV97γ、GV39γ、GV59またはGV14。さらに適切な抗VEGF 抗体は、4.6.1.、A3.13.1、A4.3.1およびB2.6.2(Kimら、1992)；SBS94.1(Oncoge ne Science)；G143-264およびG143-856(Pharmingen)を含む。 さらに有用な抗体は、腫瘍血管系細胞表面レセプターに結合するリガンドに結 合する抗体である。従って、VEGF/VPF、FGF、TGFβに結合する抗体、TIEに結合 するリガンド、腫瘍関連のイソ型フィブロネクチン、スキャッター因子(scatter factor)、肝細胞増殖因子(HGF)、血小板因子４(PF4)、PDGF(PDGFaおよびPDGFb を含む)およびTIMP(メタロプロテイナーゼの組織インヒビター、TIMP-1、TIMP-2 およびTIMP-3を含む)は、これらの実施態様で有用であり、そのうち、VEGF/VPF 、FGF、TGFβに結合する抗体、TIEに結合するリガンドまたは腫瘍関連イソ型フ ィブロネクチンがしばしば好ましい。 さらに別の実施態様では、腫瘍血管系に特異的なマーカーは、最初に誘導され た、すなわち、それの発現が人間の手によって特異的に操作されたマーカーであ り得、それにより、結合リガンド(例えば、抗体)を用いる次の標的化を可能にす る。 代表的な誘導性抗原は、単核細胞、マクロファージ、肥満細胞、ヘルパーＴ細 胞、CD8-陽性Ｔ細胞、NK細胞または腫瘍細胞によってさえ放出され得るような、 サイトカイン(例えば、IL-1、IL-4、TNF-α、TNF-βまたはIFN-γ)により誘導性 抗原を含む。誘導された標的の例は、E-セレクチン、VCAM-1、ICAM-1、エンドグ リンおよびMHCクラスII抗原である。MHCクラスII誘導を使用する場合、正常組織 中のMHCクラスIIの抑制が、シクロスポリン(例えば、シクロスポリンＡ(CsA)、 または機能的に等価な薬剤)を用いて達成され得るように、一般に必要とされる 。 さらに誘導性抗原は、コアギュラント(例えば、トロンビン、第IX/IXa因子、 第X/Xa因子、プラスミンまたはメタロプロテイナーゼ(マトリックスメタロプロ テイナーゼ、MMP))によって誘導性抗原を含む。一般に、トロンビンによって誘 導性抗原が使用される。この群の抗原は、P-セレクチン、E-セレクチン、PDGFお よびICAM-1を含み、そのうち、P-セレクチンおよび／またはE-セレクチンの誘導 および標的化が一般に好ましい。 リガンド-レセプター複合体(complex)に存在するが、個々のリガンドおよびレ セプターの両方には存在しないエピトープに結合する抗体もまた使用され得る。 このような抗体は、細胞表面に存在するリガンド-レセプター複合体を認識し、 かつそれに結合するが、遊離のリガンドまたは複合体化されていないレセプター には結合しない。従って、本明細書中で使用される「リガンド-レセプター複合 体」は、リガンド(例えば、増殖因子)がそのレセプター(例えば、増殖因子レセ プター)に特異的に結合する場合に生成される結果としての複合体を意味する。 これは、VEGF/VEGFレセプター複合体により代表される。 このようなリガンド-レセプター複合体は、腫瘍に関連しない内皮細胞よりも 腫瘍関連の内皮細胞上で有意に多い数で存在するようであり、それゆえ、抗複合 体抗体により標的化され得ることが期待される。抗複合体抗体は、モノクローナ ル抗体2E5、3E5または4E5と同じエピトープに結合するような抗体およびそのフ ラグメントを含む。 さらなる実施態様では、本発明における使用のために意図される第１結合領域 は、疾患関連の支質の成分(例えば、腫瘍関連の支質の成分)に結合する。これは 、基底膜成分、活性された血小板および誘導性の腫瘍支質成分、特にコアギュラ ント(例えば、トロンビン)によって誘導性の成分に結合する抗体の抗原結合領域 を含む。「活性化された血小板」は、本明細書では腫瘍支質の成分として定義さ れ、その理由の１つは、それらが活性されるときに支質に結合することである。 腫瘍関連支質の好ましい標的可能な要素は、現在のところ、腫瘍関連イソ型フ ィブロネクチンである。イソ型フィブロネクチンは、インテグリンファミリーの レセプターに結合するリガンドである。腫瘍関連のイソ型フィブロネクチンは、 例えば、MAb BC-1によって認識されるように利用可能である。従って、このMab 、および類似の特異性を有する他のMabは、本発明における使用のために好まし い薬剤である。イソ型フィブロネクチンは、支質成分であるが、内皮細胞に結合 し、それゆえ、本発明の文脈では標的可能な血管内皮細胞結合リガンドとして考 慮され得る。 好ましい抗支質抗体の別の群は、フィブリノーゲン上のRIBS(レセプター誘導 結合部位)に結合する抗体である。RIBSは、標的可能な抗原であり、支質におけ るRIBSの発現は活性化された血小板によって指示される。活性化された血小板上 のリガンド誘導結合部位であるLIBSに結合する抗体もまた有用である。 有用な抗体のさらなる群の１つは、種々の良性および悪性の腫瘍の支質で発現 される高分子量の細胞外糖タンパク質であるテネイシンに結合する抗体である。 それゆえ、Shresthaら(1994)に記載されるような抗体およびTuominen ＆ Kallio inen(1994)により記載される143DB7C8は、コアギュリガンド(coaguligand)の結 合部分として使用され得る。 「疾患および腫瘍関連の支質の成分」は、種々の細胞型、マトリックス成分、 エフェクター、およびそのいくつかが「支質」の最も狭い定義から外れると考え られ得る他の分子成分を含むが、疾患領域(例えば、腫瘍)と優先的に関連する標 的可能な実体である。 従って、第１結合領域は、平滑筋細胞、周囲細胞(pericyte)、繊維芽細胞、マ クロファージ、浸潤性リンパ球または白血球に結合する抗体またはリガンドであ り得る。第１結合領域はまた、結合組織の成分に結合し得、そして例えば、フィ ブリン、プロテオグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、およびアニオン性ポリ サッカライド(例えば、ヘパリンおよびヘパリン様化合物)に結合する抗体および リガンドを含む。 他の好ましい実施態様では、本発明の血管系および支質結合リガンドは、それ ら自体が抗体であるよりもむしろ生物学的なリガンドまたはその一部分である結 合領域である。この意味では、「生物学的なリガンド」は、サイトカイン、ホル モン、増殖因子などにより代表されるように、細胞表面分子(例えば、レセプタ ー)に結合するかまたはこれと会合し、支質中または血管細胞上に接近可能な分 子である。任意のそのような増殖因子またはリガンドが、それが疾患関連の支質 または血管系、例えば、腫瘍血管系内皮細胞の表面上に存在する特異的生物学的 レセプターに結合する限り、使用され得る。 本発明のこれらの局面における使用のための適切な増殖因子は、例えば、VEGF /VPF(血管内皮増殖因子／血管透過性因子)、FGF(タンパク質の繊維芽細胞増殖因 子ファミリー)、TGFβ(形質転換増殖因子Ｂ)、TIEに結合するリガンド、腫瘍関 連のイソ型フィブロネクチン、スキャッター因子(scatter factor)、肝細胞増殖 因子(HGF)、血小板因子４(PF4)、PDGF(血小板由来の増殖因子)、TIMPまたはIL-8 、IL-6またはXIIIa因子さえを含む。VEGF/VPFおよびFGFがしばしば好ましい。 公知のレセプターに基づいた結合リガンド構築物を用いて内皮細胞結合成分( 例えば、サイトカインまたは増殖因子)を標的にすることもまた意図される。一 般に、レセプターが標的化成分として使用される場合、レセプターの短縮型また は可溶性形態が利用され得る。このような実施態様では、標的化された内皮細胞 結合成分が二量体リガンド(例えば、VEGF)であることが特に好ましい。これが好 ましい理由は、二量体の１つ成分が既に細胞表面レセプターにインサイチュで結 合され、二量体の他の成分を二重特異性の凝固リガンドの可溶性レセプター部分 に結合するために利用されるように残すからである。 疾患関連の血管系の成分に結合し得る少なくとも１つの標的化領域を含む二重 特異性、あるいは三重または多重特異性リガンドは、血管内皮細胞、および疾患 関連の薬剤(例えば、活性化された血小板)が、異なる疾患において(特に異なる 腫瘍において)類似しているという利点を有する。この現象は、個々の疾患また は特異的な腫瘍タイプのそれぞれに薬剤を合わせなければならないよりも、多く の疾患およびガンのタイプを１種の薬品で処置することを実行可能にする。 それゆえ、本発明の組成物および方法は、血管成分を有する良性および悪性疾 患を処置するための使用に適切である。このような血管系関連疾患は、良性増殖 (例えば、BPH)、糖尿病性網膜症、血管再狭窄、動静脈性奇形(AVM)、髄膜腫、血 管腫、血管新生緑内障および乾癬を含む。さらにこの群に含まれるのは、滑膜炎 、皮膚炎、子宮内膜炎、血管繊維腫、慢性関節リウマチ、アテロマ硬化斑、角膜 移植新血管化、血友病性関節、過形成性瘢痕、osler-weber症候群、化膿性肉芽 腫、水晶体後繊維増殖、硬皮症、トラコーマおよび血管癒着である。上記疾患の それぞれは、共通の血管依存性病理学を有することが知られ、それゆえ、これは 、疾患部位において凝固を達成することが有益であり得ることが意図される。 本発明の二重特異性結合リガンド-凝固因子接合体は、例えば、生化学的架橋 剤、および好ましくは、SMPTにより代表されるように、血中においてかなりの安 定性を有するものを使用することにより、２つまたはそれ以上成分が共有結合さ れる接合体であり得る。これらの成分はまた、周知のアビジン(またはストレプ トアビジン)およびビオチンの組み合わせを使用して連結され得る。種々の架橋 剤、アビジン：ビオチン組成物および組み合わせ、ならびに接合体を調製する技 術は、当該分野で周知であり、そして本明細書にさらに記載される。 あるいは、このような二重特異性凝固剤は、分子生物学的技術、即ち、結合リ ガンドまたは領域をコードする遺伝子(またはcDNA)を凝固因子をコードする遺伝 子(またはcDNA)に連結することにより調製される融合タンパク質であり得る。こ のことは当該技術分野で周知であり、そして本明細書でさらに記載される。代表 的には、凝固因子をコードするDNAセグメントに作動可能に連結された第１の結 合領域をコードするDNAセグメントを同じリーディングフレームで含む発現ベク ターが調製され、そして組換え宿主細胞がコードされた融合タンパク質を産生す るようにこのベクターを発現する。 本発明で使用するための凝固因子は、第II/IIa因子、第VII/VIIa因子、第IX/I Xa因子または第X/Xa因子のような、ビタミンＫ依存性凝固因子の１つを含み得る 。第V/Va因子、第VIII/VIIIa因子、第XI/XIa因子、第XII/XIIa因子および第XIII /XIIIa因子もまた用いられ得る。 特定の局面は、Gla改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子に関する。このよう な因子は、ビタミンＫ依存性凝固因子をコードする遺伝子を、原核生物宿主細胞 中(この細胞はGluからGlaへの改変を行うことができない)で発現することにより 調製され得る。この因子はまた、必要なまたは「対応する」グルタミン酸残基を 欠いているビタミンＫ依存性凝固因子をコードする遺伝子操作された凝固因子遺 伝子を作成し、次いで、この遺伝子操作された遺伝子を、実際に、任意の組換え 宿主細胞で発現することにより調製され得る。同様に、このような凝固因子はま た、ビタミンＫ依存性凝固因子タンパク質を処理して対応するグルタミン酸残基 を除去または改変することにより調製され得る。 本発明の結合リガンドに使用される好ましい凝固因子は、組織因子および組織 因子誘導体である。有用な組織因子の１つのグループは、第VII因子を活性化す る能力を欠く変異体である。組織因子は、一般にアミノ酸配列の約157位と約167 位との間の領域に由来する１つまたはそれ以上のアミノ酸を改変することにより 第VII因子を活性化する能力における欠損を与え得る。例示の変異体は、158位の TrpがArgに；162位のSerがAlaに；164位のGlyがAlaに変化した変異体；ならびに 158位のTrpがArgに、かつ162位のSerがAlaに変化した二重変異体である。 さらに好ましい組織因子誘導体は、短縮型組織因子、二量体またはなお多量体 の組織因子、および二量体またはなお多量体の短縮型組織因子である。 本発明は、少なくとも１つの他の組織因子または誘導体に作動可能に連結され た組織因子または誘導体を含む新規な組織因子構築物をさらに提供する。短縮型 組織因子が好ましく、短縮型の組織因子が改変されて疎水性膜挿入部分を含む場 合が特に好ましい。 本明細書で規定されるように「疎水性膜挿入部分」は、組織因子の膜への挿入 または膜との機能的接触を指向する１つまたはそれ以上のユニットである。本発 明の疎水性膜挿入部分は、約３と約20との間の疎水性アミノ酸のような実質的に 疎水性のアミノ酸の連続部分により；および脂肪酸によっても例示される。 疎水性アミノ酸は、短縮型組織因子のN末端もしくはC末端に配置され得るか、 または分子の別の点に付加され得るかのいずれかである。疎水性アミノ酸が用い られる場合、これらは、有利には、分子生物学的技術により分子中に組み込まれ 得る。同様に、疎水性アミノ酸または脂肪酸は、合成化学技術を用いて組織因子 に付加され得る。 本発明の組織因子二量体、三量体および多量体では、組織因子または誘導体の 各々は、例えば、ジスルフィド、チオエーテルまたはペプチド結合を介して作動 可能に連結され得る。ある実施態様では、組織因子ユニットは、その使用が意図 される血漿中、または生理学的環境中で実質的に安定である結合を介して連結さ れる。これは、組織因子の二量体形態が生物学的に最も活性であることが証明さ れ得るという本発明者らの思想に基づく。しかし、本発明の方法では、組織因子 単量体が活性であることが知られているように、安定な結合が必要な訳ではない 。 二量体および多量体中の１つまたはそれ以上の組織因子または短縮型組織因子 はまた、改変されて、結合領域のような第２の薬剤に組織因子構築物を連結する ために適切である末端システイン残基または別の部分を含み得る。 従って、選択的に切断可能なアミノ酸配列を含むペプチドを含む、組織因子単 量体、短縮型組織因子、および組織因子二量体ならびに多量体は、本発明の別の 局面を形成する。ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第IXa因子、第Xa因 子、または間質コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ(gelatinase)、またはストロメリシ ン(stromelysin)のようなメタロプロテイナーゼに対する切断部位を含むペプチ ドリンカーが特に好ましい。 従って、組織因子単量体、短縮型組織因子、組織因子二量体および多量体、な らびに実際任意のコアギュラントを、生物学的に放出可能な結合を介して、抗体 、抗体の抗原結合領域、リガンド、またはレセプターのような第２の薬剤に連結 し得る。上記の列挙したプロテイナーゼに対する切断部位を含むペプチドリンカ ーの選択は、例えば、腫瘍環境内のそのようなプロテイナーゼの存在に基づく。 腫 瘍部位に対する二重特異性薬剤またはリガンドの送達は、切断を生じると予想さ れ、凝固因子の相対的に特異的な放出を生じる。 本発明の特定の構築物は、その配列中に作動可能に連結した一連の以下のユニ ットを含む構築物である：システイン残基、選択的に切断可能なペプチドリンカ ー、疎水性アミノ酸の連続部分、第１の短縮型組織因子、および第２の短縮型組 織因子；または配列中に：第１のシステイン残基、選択的に切断可能なペプチド リンカー、疎水性アミノ酸の第１の連続部分、第１の短縮型組織因子、第２の短 縮型組織因子、および疎水性アミノ酸の第２の連続部分；ここで各構築物は、抗 体、リガンドまたはレセプターのような第２の薬剤に連結されてもよく、または 連結されなくてもよい。 他の適切な凝固因子は、ラッセルクサリヘビ蛇毒X因子アクチベーター；トロ ンボキサンＡ2およびトロンボキサンＡ2シンターゼのような血小板活性化化合物 ；およびα2-抗プラスミンのようなフィブリン溶解のインヒビターである。 凝固因子が複合体に共有結合しないが、構築物の標的化物に作動可能に連結し ている第２の結合領域への結合手段により非共有結合する結合リガンドもまた、 本発明に包含される。適切な「第２の結合領域」は、凝固因子に対して結合特異 性を有する抗体の抗原結合部位を含み、これには、ScFv、Fv、Fab'、FabおよびF (ab')2フラグメントのような、抗体の機能的部分が含まれる。 従って、ビタミンＫ依存性凝固第II/IIa因子、第VII/VIIa因子、第IX/IXa因子 、または第X/Xa因子；Gla改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子；組織因子、変 異体組織因子、短縮型組織因子、二量体組織因子、多量体組織因子、二量体短縮 型組織因子；プレカリクレイン；第V/Va因子、第VIII/VIIIa因子、第XI/XIa因子 、第XII/XIIa因子、および第XIII/XIIIa因子；ラッセルクサリヘビ蛇毒X因子ア クチベーター、トロンボキサンＡ2またはα2-抗プラスミンに対して指向された 抗体、またはそれらのフラグメントを含む結合リガンドが考慮される。 非共有結合した凝固剤は、凝固因子に結合され得るか、または凝固因子と「予 め複合体化」され得、それらを用いて、投与の際に、外因性凝固因子を動物の疾 患部位(例えば腫瘍血管系)に送達し得る。同様に、凝固因子に特異的な第２の結 合領域を含む結合リガンドもまた、「非複合体化」形態および特異的凝固をなお 達成する機能で動物に投与され得る；この例では、薬剤は、循環(内因性)凝固因 子を蓄積し得、そしてそれを疾患部位または腫瘍部位内に濃縮する。 用語「凝固因子」または凝固剤は、内因性凝固因子およびその誘導体、または 組換え型を含む外から添加された型のこのような因子であり得る。コアギュラン ト(本発明の「コアギュリガンド(coaguligand)」)は、トキシン(イムノトキシン )に対して明確な利点を有する。何故なら、これらは、100％疾患に限定されない ことがわかるマーカーを標的にする際、顕著な有害な副作用を生じないからであ る。さらに、用いられるコアギュラントは、ほとんどの場合ヒト起源であり、そ してそれ故、リシンＡ鎖のような外来トキシンより免疫原性の問題が少ないから である。 このような組成物に制限されないが、本発明に従った組成物の重要な例は、二 重特異性抗体であり、この抗体は、疾患細胞または疾患関連血管系マーカーの成 分に結合する第１の抗原結合領域、および凝固因子に結合する第２の抗原結合領 域を含む。本発明はまた、このような二重特異性抗体のscFv、Fv、Fab'、Fab、 およびF(ab')2断片を提供する。このような二重特異性抗体の１つの現在好まし い例は、MHCクラスII抗原に対して指向される１つの結合部位、および組織因子 に対して指向される別の結合部位を含む抗体である。 さらなる実施態様で、本発明は、上記の結合リガンドおよび二重特異性抗体の 任意または組み合わせを薬理学的に受容可能な形態で含む薬学的組成物、および 治療用キットを提供する。これは、結合リガンドが、凝固因子に共有結合してい る第１の結合領域を有し、そしてまた結合リガンドにおける第１の結合領域は、 次に凝固因子に結合する第２の結合領域に共有結合する−結合は動物への投与の 前、または投与後に起こる−薬学的組成物およびキットを含む。 本発明に従って、二重特異性、三重特異性、または多重特異性の結合リガンド の組み合わせを含む薬学的組成物および治療用キットがまた考慮される。これは 、１つの結合リガンドが疾患細胞または腫瘍細胞に指向し、そしてもう１つが血 管系内皮細胞マーカーまたは疾患関連支質の成分に対して指向する組み合わせを 含む。抗体、イムノトキシン、免疫エフェクター、化学療法剤などのような他の 別の成分もまた、本発明の組成物およびキットに含まれ得る。 キットはまた、正常組織の内皮細胞で抗原発現を抑制する際の使用については 、シクロスポリンのような抗原サプレッサー；および/または疾患関連血管内皮 細胞または支質を誘導して標的化可能な抗原を発現する際の使用については、E- セレクチン、P-セレクチン、またはMHC クラスII抗原のような「誘導剤」を含み 得る。例示の誘導剤は、疾患または腫瘍抗原を結合し、そしてIFN-γを生成する Ｔ細胞クローンを含むが、このようなクローンは、キットを用いて処置されるべ き動物から単離されることが現在好ましい。 好ましい誘導剤は、疾患または腫瘍細胞抗原、あるいは支質成分にさえも結合 し、そして所望の標的抗原の発現を誘導するサイトカイン、コアギュラント、ま たは他の因子を産生し得るエフェクター細胞に結合する二重特異性抗体である。 現在のところ、二重特異性抗体の１つの好ましい群は、腫瘍抗原に、および活性 化抗原CD14またはCD16に結合して、単球、マクロファージ、またはマスト細胞に よるIL-1産生を刺激するような群；ならびに腫瘍抗原に、および活性化抗原CD2 、CD3またはCD28に、そして好ましくはCD28に結合して、NK細胞によりまたは好 ましくはT細胞によりIFN-γ産生を刺激するような群である。 二重特異性抗体の第２番目の好ましい群は、腫瘍抗原にまたは腫瘍支質の成分 に、および組織因子、組織因子誘導体、プロトロンビン、第VII/VIIa因子、第IX /IXa因子、第X/Xa因子、第XI/XIa因子、またはラッセルクサリヘビ蛇毒X因子ア クチベーターに結合して、トロンビン産生を刺激するような群である。このよう な二重特異性抗体を第１の「誘導」組成物として含むキットは、一般に、P-セレ クチンまたはE-セレクチンに結合する第１の結合領域を含む結合リガンドを含む 第２の薬学的組成物を含む。 本発明の二重特異性リガンド、および所望による他の成分は、１つまたはそれ 以上の適切な容器手段を用いて、便利なように少量に分けおよびパッケージにさ れ、そして別々の容器は単一のパッケージで調剤され得る。薬学的組成物および キットは、本明細書にさらに記載されている。 本発明は、コアギュラントの送達および疾患処置において有意な臨床的有用性 を有しているが、それはまた多くのインビトロ用途を有する。これらは例えば、 二重特異性化合物である、特定の抗体、リガンド、またはレセプターの結合能力 に基づく種々のアッセイを含む。従って、本発明の二重特異性凝固リガンドは、 本明細書にさらに記載されるように、イムノブロット、ウェスタンブロット、ド ットブロット、RIA、ELISA、免疫組織化学、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS) 、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィーなどのような、標準的な結合アッ セイおよびプロトコールで用いられ得る。 なおさらなる実施態様では、本発明は、糖尿病性網膜症、血管再狭窄、AVM、 血管腫、血管新生緑内障、乾癬および慢性関節リウマチ、ならびに血管化腫瘍成 分を有する腫瘍のような疾患を処置するために用いられ得るように、疾患関連血 管系にコアギュラントを送達する方法に関する。このような方法は一般に、血管 成分を有する疾患を伴うヒト被験体を含む動物に、少なくとも１つの上記のよう な二重特異性結合リガンドを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。 組成物は、疾患部位（例えば固形腫瘍）の血管系で血液凝固を促進するに有効 な量および経路により投与される。有効用量は、好適な実施態様および詳細な実 施例中の情報のような、本発明の開示を考慮すれば、当業者に公知である。他の 方法のように、例えば、血管化腫瘍部位への注射のような非経口投与がしばしば 適切である。 本発明の方法は、共有結合した凝固因子を含む結合リガンドを投与する手段、 および二重特異性リガンドまたは抗体の第２の結合領域に複合体化されている非 共有結合した凝固因子を含む結合リガンドを投与する手段の両方により、外因性 凝固因子の送達を提供する。 本発明のさらなる方法は、疾患または腫瘍血管系への内因性凝固因子の送達を 生じる方法を含む。これは、動物または患者に、内因性凝固因子に結合しそして この因子を疾患関連または腫瘍血管系に濃縮する第２の結合領域を含む結合リガ ンドを投与することにより達成される。 なおさらなる方法論の実施態様では、腫瘍血管系または支質のマーカーが特異 的に誘導され、次いで抗体のような結合リガンドを用いて標的とされ得ることが 考慮される。例示の誘導性抗原は、E-セレクチン、P-セレクチン、MHCクラスII 抗原、VCAM-1、ICAM-I、エンドグリン、LAM-1と反応性のリガンド、血管アドレ シン(addressin)、および他の接着分子を含み、E-セレクチンおよびMHCクラスII 抗原が現在好適である。 誘導しそして次にMHCクラスIIタンパク質を標的にする場合、正常組織中のMHC クラスIIの抑制が一般に必要である。MHCクラスII抑制は、シクロスポリン、ま たは機能的に等価な薬剤を用いて達成され得る。次いでMHCクラスII分子は、疾 患関連血管系をエフェクター細胞(一般に誘導性サイトカインIFN-γを放出する 、動物のヘルパーT細胞またはNK細胞)に曝すことなどによる、シクロスポリンに 依存しない手段を用いて疾患関連血管内皮細胞中で誘導され得る。 活性化された単球、マクロファージ、およびさらにマスト細胞は、E-セレクチ ンを誘導するサイトカイン(IL-1; TNF-α; TNF-β)を生成し得るエフェクター細 胞である；その一方、ヘルパーT細胞、CD-8陽性Ｔ細胞およびNK細胞は、MHCクラ スIIを誘導するIFN-γを生成し得る。IL-1を生成するために疾患部位で単球/マ クロファージを活性化すること、またはIFN-γを生成するために疾患関連ヘルパ ーＴ細胞またはNK細胞を活性化することは、動物に、エフェクター細胞表面活性 化抗原に結合する活性化抗体を投与することにより達成され得る。例示の活性化 抗原は、単球/マクロファージについてはCD14およびCD16(IgEについてはFcR)； およびＴ細胞についてはCD2、CD3およびCD28；を含み、特定の実施態様で使用す るためには、CD14およびCD28がそれぞれ好適である。 特異的な活性化および誘導を達成するために、１つの現在好ましい方法は、CD 14またはCD28のようなエフェクター細胞活性化抗原、および疾患または腫瘍細胞 抗原の両方に結合する二重特異性抗体を用いることである。これらの二重特異性 抗体は、疾患または腫瘍部位に局在化し、そして単球/マクロファージおよびＴ 細胞をそれぞれ活性化する。標的疾患または腫瘍成分付近の活性化されたエフェ クター細胞は、誘導性サイトカイン、この場合、IL-1およびIFN-γをそれぞれ生 成する。 正常組織中のMHCクラスII抑制はまた、動物に抗CD-4抗体を投与することによ り達成され得る；動物のＴ細胞によるIFN-γ産生を抑制するこの機能は、MHCク ラスII発現の阻害を生じる。MHCクラスII分子は、再び、疾患部位をIFN-γのみ に曝すことにより疾患関連血管内皮細胞で特異的に誘導され得る。これを達成す るための１つの手段は、疾患部位にある抗原に結合するIFN-γ産生Ｔ細胞クロー ンを動物投与することによる。このIFN-γ産生Ｔ細胞は、好ましくは、インビト ロで増殖した腫瘍浸潤性白血球(TIL)のような、動物の疾患部位から得られる浸 潤性白血球である。 二重特異性抗体を用いて、トロンビンのようなコアギュラント産生を、腫瘍部 位のような局所環境でのみ誘導する方法がまた提供される。さらに、これは、一 般に、腫瘍細胞または腫瘍支質の成分、および組織因子、組織因子誘導体、プロ トロンビン、第VII/VIIa因子、第IX/IXa因子、第X/Xa因子、第XI/XIa因子、また はラッセルクサリヘビ蛇毒X因子アクチベーターに結合する二重特異性抗体を含 む薬学的組成物を動物に投与することにより達成され得る。次いで、E-セレクチ ンまたはP-セレクチンに結合する抗体が、凝固因子または凝固因子に結合する第 ２の結合領域に連結し、そして動物の血流中に導入される。 より一般的な組み合わせ処理療法もまた可能であり、ここでは、例えば、本発 明の腫瘍凝固エレメントを、放射線療法または化学療法のような現存する抗腫瘍 療法と組み合わせるか、または抗腫瘍イムノトキシンのような第２の免疫学的試 薬の使用と組み合わせる。良性疾患の新規の処置方法もまた、現在用いられてい る他の療法と組み合わされ得る。 図面の簡単な説明 以下の図面は本明細書の一部をなすものであり、本発明の特定の局面を更に説 明するために添付されている。本発明は、これら図面のうち一つ以上を本明細書 に記載した具体的な実施例の詳細な説明とともに参照することにより、よりよく 理解され得るであろう。 図１。B21-2/10H10二重特異性抗体を介した、tTFのA20細胞への繋ぎ止め(teth ering)。A20細胞を様々な濃度のB21-2/10H10（□）、SFR8/10H10（●）またはB2 1-2/OX7（○）および過剰量の125I-tTFと共に、アジ化ナトリウムの存在下４℃ にて１時間インキュベートした。細胞に結合した125I-tTFの数を、実施例IIに説 明するように決定した。 図２。A20細胞当たりの繋ぎ止められたtTF分子の数と、血漿の凝固を誘導する 能力との関係。A20細胞を、様々な濃度のB21-2/10H10および過剰量のtTFと共に アジ化ナトリウムの存在下４℃にて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、 37℃に加温し、カルシウムおよびマウス血漿を加え、最初のフィブリン鎖が形成 されるまでの時間を記録した（横座標）。A20細胞を、二重特異性抗体および125 I-tTFと共に４℃にて１時間インキュベートする同一の研究を行って、細胞に特 異的に結合したtTFの数を、実施例IIに説明するように決定した（縦座標）。未 処理のA20細胞に加えられた血漿(すなわちtTF分子０個／細胞)は、190秒で凝固 した。 図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄ。コアギュリガンド投与後の血管血栓形 成および腫瘍壊死の時間経過。直径0.8 cmのC1300（Muγ）腫瘍を有する３匹の マウスのグループに、14μgのB21-2/10H10および11μgのtTFからなるコアギュリ ガンドの静脈内注射をおこなった。図３Ａ；注射前：血管は完全(intact)であり 腫瘍細胞は健常である。図３Ｂ；0.5時間：腫瘍全体にわたる血管が血栓を有し ている；腫瘍細胞は健常である。図３Ｃ；４時間：全腫瘍血管中に稠密な血栓が 存在しており、腫瘍細胞は分離して核凝縮が発生している。腫瘍間隙内に赤血球 が見える。図３Ｄ；24時間：腫瘍全体にわたって進行した腫瘍壊死。矢印は血管 を示す。 図４。腫瘍血管系を照準とするコアギュリガンド治療によって誘導された固形 腫瘍の退行。直径約0.8 cmのC1300（Muγ）腫瘍を有するNu/nuマウスに、tTF（1 1μg）と混合したB21-2/10H10（14μg）の静脈内注射を、１週間間隔で２回おこ なった（矢印）（□）。コントロールグループのマウスには、tTFのみ（●）、B 21-2/10H10のみ（○）または希釈液（■）を同用量与えた。イソ型適合性(mache d)コントロール二重特異性抗体（SFR8/10H10、OX7/10H10またはB21-2/OX7）およ びtTFを同用量与えた他のコントロールグループのマウスは、tTFのみを与えられ た動物におけるものと同様な腫瘍応答を示した。グループ毎のマウスの数は７ま たは８であった。 図５。抗体−tTF構築物の例。この図は、化学的に誘導体化された抗体をジス ルフィド結合を介して化学的に誘導体化されたtTFに連結することによって合成 された接合体と、様々なTFまたはTF二量体の抗体およびそのフラグメントへの連 結によって合成された接合体との両方を示している。 図６。A20細胞に結合した際のtTF接合体の血餅形成活性。A20細胞を、様々な 濃度の二重特異性B21-2/10H10＋H6[tTF]を１：１のモル濃度比で１時間予備混合 したもの（□）、Ｂ21-2抗体−H6C[tTF］（●）、およびB21-2抗体−H6[tTF]（ ▲）と共にアジ化ナトリウムの存在下４℃にて１時間インキュベートした。細胞 を洗浄し、37℃に加温し、カルシウムおよびマウス血漿を加え、最初のフィブリ ン鎖が形成されるまでの時間を記録した。結果を、tTF不在下の血餅形成時間の ％血餅形成時間として表している。 図７。抗腫瘍細胞tTF接合体の血餅形成活性。TF9-6B4およびTF8-5G9抗体とプ レインキュベートしたLS174細胞（■）、Widr細胞（●）およびH460細胞（▲） を、様々な濃度の、D612抗体-H6C[tTF]（■）、KS1/4抗体−H6[tTF]（●）、お よびXMMCO791抗体−H6[tTF]（▲）と共にアジ化ナトリウムの存在下４℃にて１ 時間インキュベートした。細胞を洗浄し、37℃に加温し、カルシウムおよびマウ ス血漿を加え、最初のフィブリン鎖が形成されるまでの時間を記録した。結果を 、tTF不在下の血餅形成時間の％血餅形成時間として表している。 図８。第II/IIa因子、第VII/IIa因子、第IX/IXa因子、および第X/Xa因子、のG laドメイン(γ−カルボキシグルタミン酸)。矢印は、シグナルペプチド切断部位 およびペプチド切断部位ならびに活性化切断部位（斜めの矢印）を表している。 好適な実施態様の詳細な説明 モノクローナル抗体（MAb）およびイムノトキシン（IT）は、リンパ腫および 白血病の治療に大きな可能性を示している（Lowderら、1987。Vitettaら、1991 ）が、ヒトの全てのガンの90％以上を占める（Shockleyら、1991）ガン腫および その他の固形腫瘍に対しては、現在のところ臨床治験において比較的非効果的で あることがわかっている（ByersおよびBaldwin、1988。AbramsおよびOldham、19 85）。この主な理由は、高分子は容易には固形腫瘍中に浸出せず（Sands、1988 。Epenetosら、1986）、いったん腫瘍塊中に入ると、腫瘍細胞間の緊密な結合（ Dvorakら、1991）、繊維間質（Baxterら、1991）、間隙圧力勾配（Jain、1990） 、および結合部位バリア（Juweidら、1992）の存在のために均一に分布し得ない ためである。 従って、固形腫瘍を処置するための新しいストラテジーの開発において、腫瘍 細胞そのものよりも腫瘍の血管系を標的化する工程を包含する方法は、ある種の 利点を提供すると思われる。例えば腫瘍血管系特異的フィブリン形成による腫瘍 を通る血流の障害の誘導は、腫瘍部位における流入および流出プロセスを妨害し 、従って抗腫瘍効果が生じる。腫瘍への血液供給を停止させることは、腫瘍関連 血管における凝固促進−フィブリン溶解バランスを、凝固剤(coagulating agent )に特異的に曝すことによって凝固プロセス側にシフトすることを通じて達成さ れ得る。 本発明は、腫瘍特異的凝固に代表される特異的な血液凝固を得るための、様々 な手段を提供する。これは、少なくとも一つの成分が免疫的標的化成分または成 長因子ベースの標的化成分であり、凝固を直接的または間接的に刺激し得る少な くとも一つの他の成分が用いられる、二重特異性または多重特異性の結合リガン ドを用いることによって達成される。 Ａ．標的化可能疾患部位 本発明によって提供される組成物および方法は、血管部分を有する良性または 悪性腫瘍などのいずれの疾患の処置にも幅広く適用可能である。このような血管 系関連疾患は、BPH、糖尿病性網膜症、血管再狭窄、動静脈性奇形（AVM）、髄膜 腫、血管腫、血管新生緑内障および乾癬、ならびに血管線維腫、関節炎、アテロ ーム性動脈硬化プラーク、角膜移植血管新生、血友病関節、過形成性瘢痕、osle r-weber症候群（osler-weber syndrome）、化膿肉芽腫、後水晶体繊維増殖症、 鞏皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎および子宮内膜症さえも含む。 代表的な血管形成性腫瘍は、酸素および栄養素の供給のために血管部分を必要 とする固形腫瘍、特にガン腫である。本発明を用いて処置され得る固形腫瘍の例 は、肺、胸部、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸 、直腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、および甲状腺のガン 腫、扁平上皮細胞ガン腫、腺ガン腫、小細胞ガン腫、メラノーマ、神経膠腫、神 経芽腫などを含むがこれに限定されない。 本発明の二重特異性剤の一の結合領域は、凝固剤を腫瘍領域に送達し得る、す なわち上記に示すような腫瘍部位に局在化させることが可能な成分である。凝 固剤は、若干広く分布しても、トキシン部分の場合において発生が知られている ような激しい副作用を伴わないため、二重特異性リガンドの標的化成分に対する 必要条件は比較的厳密ではない。標的化剤は従って、腫瘍細胞成分、腫瘍血管系 成分、腫瘍細胞に結合するまたは一般的に関連する成分、腫瘍血管系に結合する または一般的に関連する成分、腫瘍細胞外マトリックスまたは間質の成分、およ び腫瘍血管系中に見られる細胞型さえも対象とし得る。 例えばイムノトキシンを用いる場合に必要となる非常に厳密な標的化という問 題は、腫瘍血管系は「プロトロンビン産生性(prothrombotic)」であり凝固傾向 にあるという事実によってもまた軽減される。従って、特異的標的化手段を達成 することにより、凝固は非腫瘍部位中の血管系よりも腫瘍血管系において促進さ れる。従って、特異的標的化は、標的化剤の生物分布特性に関連する純粋に物理 的な用語というよりもむしろ、機能的な用語であり、有用な標的が完全に腫瘍に 制限されず、腫瘍特異性凝固の促進に有効な標的化リガンドが投与後に身体の他 の部位で見出されることはあり得ないことではない。 １．腫瘍細胞標的 腫瘍を構成する悪性細胞は、腫瘍細胞の比較的特異的なマーカーに結合可能な 領域を有する二重特異性リガンドを用いて標的化され得る。腫瘍細胞への結合が 、結合した凝固剤を腫瘍へ局在化させることにより、特異的な凝固が達成される 。更に、血管周辺腫瘍細胞への物理的な接近可能性に起因して血管に最も近い腫 瘍細胞付近に二重特異性剤が集中する可能性が高いために、これは凝固を促進す るための特に効果的な手段であることが予想される。 多くのいわゆる「腫瘍抗原」が記載されているが、そのいずれも本発明におい て標的として用いることが可能である。固形腫瘍関連抗原の例を多数、本明細書 中の表Ｉ中に列挙した。このような抗原に対する抗体の調製および使用は、充分 に当該技術の範囲内であり、抗体例も同時に表Ｉに列挙しておく。 標的化可能腫瘍を規定するもう一つの手段は、腫瘍細胞によって発現された抗 原の生化学的特性を記載するのではなく、腫瘍細胞そのものの特性を考慮して説 明される。従って、（ATCCカタログから）公的に入手可能なヒト腫瘍細胞株を例 示する意味で表IIを提供する。 表IIに提供した情報は一例であり、年度または範囲による制限は意図していな い。任意の後年のATCCカタログを参照することによって、他の適切な細胞株を同 定することが可能である。また、特定の細胞型が所望であるならば、そのような 細胞を得るための手段および／またはその即時入手可能な供給源は、当該技術分 野の当業者に公知である。従って、科学文献の分析により、標的化することを所 望する任意の腫瘍細胞型の細胞について適切な選択を容易に行い得る。 （ａ）抗腫瘍細胞抗体 腫瘍抗原標的を認識するための容易な手段は、その特定の抗原に対する結合親 和性を有する抗体を使用することである。固形腫瘍抗原に対する幅広い数の抗体 が公知である。いくつかの有用な抗腫瘍抗体を上記表Ｉに示している。しかし当 業者には直ちに理解されるように、表Ｉに示す抗体のいくつかは、治療用途に対 して適切な生化学的特性を有さないか、十分な腫瘍特異性を有さない可能性があ る。その一例は、細胞質抗原を認識するMUC8-22である。一般に、これらのよう な抗体は、モデル系またはスクリーニングアッセイにおけるような研究的実施態 様においてのみ有用である。 一般に、本発明のこれらの局面において使用される抗体は、好ましくは、細胞 表面に接近可能な抗原および腫瘍細胞によって優先的にあるいは特異的に発現さ れる抗原を認識する。このような抗体はまた好ましくは、例えばKd＜200nM、好 ましくは＜100nMを示す高い親和特性を示し、生命を維持している(life-sustain ing)通常組織、例えば心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、胸部、前立腺、甲状 腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経繊維、膵臓、皮膚、またはその他のヒト身体中 の生命を維持している器官または組織から選ばれる一つ以上の組織に対しては、 有意な反応性を示さない。本発明の目的において最も重要な「生命を維持してい る」組織は、低反応性の観点から言えば、心臓、腎臓、中枢神経系および末梢神 経系組織および肝臓を含む。本明細書で使用する用語「有意な反応性」とは、免 疫組織化学分析に適した条件下において特定の組織に適用された際に、大部分ネ ガティブな細胞ばかりのフィールド中にほんの僅かのポジティブな細胞が散りば められた状態であって染色を引き起こさないあるいは無視可能な程度の染色しか 引き起こさないような、抗体または抗体フラグメントをいう。 本発明での使用が考えられる表Ｉ内の抗体中で可能性が特に高い抗体は、固形 腫瘍に高い選択性を有するものである。例えば、多くの乳ガン、肺ガン、および 結腸／直腸ガンの表面に選択的に見られるTAG72およびHER-2プロトオンコジーン タンパク質に結合する抗体（Thorら、1986。Colcherら、1987。Shepardら、1991 ）；MOv18およびOV-TL3ならびに乳ムチンコアタンパク質およびヒト乳脂肪小球 体に結合する抗体（Miottiら、1985。Burchellら、1983）；および高Mrメラノー マ抗原に結合する抗体9.2.27（Reisfeldら、1982）である。更に有用な抗体は、 ほぼ全ての卵巣ガン腫において均一に発現することが知られている、葉酸結合タ ンパク質に対する抗体；扁平上皮細胞ガン腫および大多数の神経膠腫において過 剰発現されるオンコジーンのerbファミリーに対する抗体；および現行の前臨床 評価および臨床評価の対象として知られるその他の抗体である。 抗体B3、KSI/4、CC49、260F9、XMMCO-791、D612およびSM3は、当該分野で通常 実施されている標準的な前臨床試験後の臨床実施態様における使用に特に適切で あると思われる。B3（米国特許第5,242,813号；Brinkmanら、1991）は、ATCC受 託番号HB 10573を有する；KS1/4は米国特許第4,975,369号に記載されるように作 製し得る；D612（米国特許第5,183,756号）は、ATCC受託番号HB 9796を有する。 腫瘍関連標的を規定するための別の手段は、腫瘍細胞によって発現された抗原 の生化学的特性を記載するのではなく、腫瘍細胞の特性を考慮して説明する。従 って、本発明者らは、表IIに挙げた腫瘍細胞に優先的に結合する任意の抗体を、 二重特異性リガンドの標的化成分として使用し得ると考える。優先的な腫瘍細胞 結合もまた、腫瘍細胞に高親和性を示し、かつ、上記に定義された生命維持して いる正常細胞または組織に対して有意な反応性を有さない抗体に基づく。 本発明は従って、本明細書に記載する標的化された凝固方法に使用される抗体 を生成するためのいくつかの手段を提供する。腫瘍細胞特異的抗体を生成するた めには、腫瘍細胞抗原を含有する組成物を用いて動物を免疫化し、本明細書中以 下において詳細に説明するように、得られた抗体のなかで適切な特異性を有する ものを選択することになるであろう。免疫化組成物は、表Ｉ中の任意の抗原の精 製されたあるいは部分的に精製された調製物；表Ｉ中の任意の抗原を富化した(e nriched)膜調製物(membrane preparation)等の組成物；表II中に挙げた任意の細 胞；または、表II中に挙げた任意の細胞タイプを含む細胞混合物または細胞集団 を含有していてもよい。 もちろん、抗体の供給源に関わらず、ヒト処置における本発明の実施の際には 、臨床的に標的化された腫瘍が最終的に選択された抗原を発現することを前もっ て確実にすることが好ましい。これは、例えば外科的生検のような腫瘍組織サン プルを抗原について試験することまたは恐らくは循環している放出抗原(shed an ti gen)を試験することを包含する、比較的容易なアッセイによって達成される。こ れは、腫瘍に対する反応性に関してハイブリドーマの「バンク」由来の抗体の結 合親和性を試験するELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）のような免疫学的スク リーニングアッセイにおいて容易に実施し得る。その後、適切な腫瘍選択性およ び親和性を示す抗体を選択して、本発明の二重特異性抗体の調製のために用いる ことができる。 周知の交差反応性現象のため、最初の抗原をヒト細胞から得る免疫化プロトコ ルに加えて、最初に使用される抗原がマウスや霊長類のような動物由来であるよ うな免疫化プロトコルから有用な抗体が得られ得ることが予想される。ヒト起源 の抗原を用いる場合、これらはヒト腫瘍細胞株から得てもよく、または、問題と なっている特定の患者からの生体サンプルを得ることによって調製してもよい。 実際、患者の腫瘍に対する「特別に誂えた(custom-tailored)」抗体の誘起のた めの方法は公知であり（Stevensonら、1990）、本発明においての使用が考えら れる。 （ｂ）更なる腫瘍細胞標的および結合リガンド 腫瘍細胞抗原への結合により凝固剤を腫瘍部位に向けるために、抗体の使用に 加えて他のリガンドも用いることが可能である。過剰発現されたレセプター（エ ストロゲンレセプター、EGFレセプター）または変異レセプターである腫瘍抗原 に関しては、対応するリガンドを標的化剤として用いることが可能である。 内皮細胞レセプターリガンドと同様に、特異的または優先的に腫瘍細胞に結合 する成分が存在し得る。例えば、腫瘍抗原が過剰発現されたレセプターである場 合は、腫瘍細胞をインビボで特異的なリガンドでコートし得る。その後にリガン ドに対する抗体またはレセプター自体の形態を用いてリガンドを標的化すること が可能と思われる。これらのタイプの標的化剤の具体例は、TIE-1またはTIE-2リ ガンドに対する抗体、第４血小板因子に対する抗体、および白血球接着結合タン パク質である。 ２．他の疾患標的 更なる実施態様において、第一の結合領域は、腫瘍部位以外の疾患部位におい て特異的または優先的に発現される標的分子に結合する成分であってもよい。 他の疾患細胞に関連する標的分子の例は、例えば、乾癬に関連する白血球接着 分子；増殖性糖尿病性網膜症に関連するFGF；様々な疾患における活性化内皮細 胞に関連する第４血小板因子；および血管増殖性疾患に関連するVEGFを含む。上 記疾患のいずれか一つを有する動物または患者は、疾患部位に凝固を特異的に誘 導することによって恩恵を受けると思われる。 KlagsburnおよびFolkman（1990）に記載される、通常の血管依存性病因を有す ることが知られている疾患もまた、本明細書に記載する二重特異性リガンドを用 いて処置し得る。特に、血管内皮細胞標的化リガンドまたは間質標的化リガンド を用いて疾患部位における凝固を達成できる。BPH、糖尿病性網膜症、血管再狭 窄、血管癒着、AVM、髄膜腫、血管腫、血管新生緑内障、リューマチ性関節炎お よび乾癬の処置が現在特に考えられる。 ３.疾患関連血管系細胞標的 血管系の細胞は、本発明における標的としての使用が意図される。これらの場 合、二重特異性リガンドの１つの結合領域が、疾患関連血管系内皮細胞によって 優先的に発現される接近可能マーカーに結合し得る。血管内皮細胞が、疾患領域 、および局所的な異常生理プロセスによる産物に近接しているため、血管マーカ ーの搾取作用が可能となる。例えば、腫瘍血管内皮細胞は、内皮細胞の表現型プ ロフィールを変化させる、腫瘍細胞および腫瘍由来産物にさらされる。 腫瘍細胞は、リンホカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、成長因子および 血管形成誘導因子のような腫瘍由来産物を合成する(elaborate)ことが知られて おり、これらの腫瘍由来産物は、近隣の血管内皮細胞(Kandelら、1991;Folkman 、1985a、b)およびサイトカイン(Burrowsら、1991; Rucoら、1990; Bordenら、1 990)に作用する。腫瘍産物は、内皮細胞に結合し、そして特定の分子の発現を選 択的に誘導する。これらの誘導された分子が、本発明の特定の局面によって提供 される腫瘍内皮特異性コアギュラント送達を用いて標的化され得る。腫瘍内の血 管内皮細胞は、多様な正常組織内の内皮細胞より30倍速い速度で増殖し(Denekam pら、1982)、このことは増殖関連決定基が、腫瘍血管内皮細胞のマーカーとして 作用し得ることを示唆している。 本発明の特定の実施態様において、二重特異性リガンドの標的化成分は、腫瘍 血管系に対して比較的高い特異性を有する成分である。これらの標的化成分は、 腫瘍内皮において発現される分子と結合するが、正常内皮細胞の表面においては 、ほとんどまたは全く発現のない成分として定義され得る。このような特異性は 、当業者にとっては慣例である、組織切片の免疫染色の標準的な手順によって評 価され得る。 しかし、上述したように、本発明の利得は、選択性の要求が、先行技術の方法 、特にイムノトキシンを用いる方法において以前必要とされていたほど厳密では ない点にある。これはなぜなら、凝固剤の誤った標的化に伴ういかなる副作用も 、トキシンの誤った標的化から生じる副作用と比較すると最小となるからである 。 従って、本発明の二重特異性リガンドまたは抗体を用いて標的化される分子は 、腫瘍血管系上において、正常内皮細胞よりも高いレベルにて発現される分子と 一般的に提唱される。 (ａ)疾患における血管内皮細胞マーカー 疾患部位または疾患環境内の血管内皮細胞の表面において優先的に発現するこ とが知られている分子は、本明細書中において、「自然疾患関連血管内皮細胞マ ーカー」と称される。この用語は、増加した、または不適切な脈管形成または内 皮細胞の増殖に関連した疾患において発現される内皮細胞成分を、簡潔にいうた めに用いられる。１つの特定の例として、腫瘍由来因子に応答してインサイチュ で発現される腫瘍内皮細胞成分が挙げられる。これらの成分はまた、「自然誘導 腫瘍内皮細胞マーカー」とも称される。 VEGF/VPF(血管内皮増殖因子/血管透過性因子)、およびFGF(線維芽細胞成長因 子)ファミリーの構成要素の両方が、腫瘍血管系内または腫瘍血管系上において 濃縮される。従って、対応するレセプターは、腫瘍血管系上に潜在的な攻撃の標 的を提供する。例えば、VEGFレセプターは、齧歯類およびヒトの両方において、 正常組織内の内皮細胞と対照的に、腫瘍内皮細胞上においてアップレギュレート されることが知られている(Thiemeら、1995)。おそらく、これは腫瘍微環境の特 徴である低酸素の結果である(Leithら、1992)。FGFレセプターはまた、低酸素に さらされた内皮細胞上において３倍アップレギュレートされ、それゆえ腫瘍にお いてアップレギュレートされると考えられている(BicknellおよびHarrisら、199 2)。 内皮細胞上のTGFβ(トランスフォーミング成長因子β)レセプター(エンドグリ ン)は、分裂細胞上でアップレギュレートされ、他の標的を提供する。本発明者 の一人は、エンドグリンが、培養中の、活性化されて分裂しているHUVECにおい てアップレギュレートされ、そして広範囲の固形腫瘍および胎盤胎児部を含む、 血管新生の部位における内皮細胞上でヒト組織において強く発現されることを見 いだした。対照的に、前新生物病巣を含む、多様な非悪性成人組織の大半におけ る内皮細胞は、ほとんどまたは全くエンドグリンを含有しない。重要なことに、 エンドグリン発現は、TEC-4およびTEC-11抗体が低いレベルで良性線維腺種およ び初期のガンに結合すること、ならびにこれらの抗体が高いレベルで後期腺管内 ガンおよび浸潤ガンに結合することにより示されるように、胸部における新生物 進行と相関すると考えられている。 他の自然疾患関連血管内皮細胞マーカーは、TIE、VCAM-1、P-セレクチン、E- セレクチン、αVβ3インテグリン、プレイオトロピンおよびエンドシアリンを含 み、それぞれが本発明を用いて標的化され得る。 (ｂ)サイトカイン誘導性血管内皮マーカー しばしば身体における局所的な機能不全を起こす疾患プロセスの性質により、 他の組織に比較的影響することなく、疾患部位を操作する方法が利用可能である 。これは、動物の身体内において別個の物として存在する悪性および良性腫瘍に 特に当てはまる。例えば、腫瘍血管内皮細胞に特異的なさらなるマーカーをつく るように、腫瘍環境を操作し得る。これらの方法は、概して固形腫瘍において自 然に生じる腫瘍環境を模倣し、また、近接する血管内皮細胞の表面において特定 の分子の特異的発現を誘導する、成長因子またはサイトカインのようなシグナル 因子の局所的な産生を伴う。 疾患または腫瘍環境における血管内皮細胞の表面において発現するように人工 的に誘導され得る分子群は、本明細書において「誘導性内皮細胞マーカー」、また は特定的には誘導性腫瘍内皮細胞マーカーと称される。この用語は、動物内の疾 患または腫瘍発達プロセスの一部として誘導されるマーカーではなく、人工的に 誘導される、つまり人の手による操作の結果誘導されるマーカーを指すのに用い られる。上記定義された用語「誘導性マーカー」を、「自然マーカー」も例えば腫瘍 由来因子によって誘導されるという事実にも関わらず、本出願における簡潔な表 記のために選択した。 従って、本発明を実施するためには必要ではないが、疾患関連血管系の表面上 の血管内皮抗原標的の選択的誘起のための技法が利用可能であり、これは、所望 であれば本発明と併用して用いられ得る。これらの技法は、抗原発現、すなわち 細胞表面提示を操作して、標的抗原が、疾患関連血管系の表面において発現また は利用可能にされるが、正常内皮の表面上では発現されない、あるいは接近可能 または結合のために利用可能にされない、または少なくともより少ない程度にさ れるようにする。 腫瘍内皮マーカーは、腫瘍由来サイトカイン(Burrowsら、1991; Rucoら、1990 )および血管形成誘導因子(Mignattiら、1991)によって誘導され得る。本発明に よって提供される、腫瘍内皮において特異的に誘導され得、次いで二重特異性凝 固リガンドを用いて標的化され得る細胞表面マーカーの例には、表IIIに示され るものが含まれる(Bevilacquaら、1987; Dustinら、1986; Osbornら、1989; Col linsら、1984)。 提案されるマーカーの誘導のメカニズム；IL-1およびIFN-γのような誘導、す なわち「中間サイトカイン」；ならびに、その標的化によってサイトカインの放出 が生じる白血球細胞タイプおよび関連するサイトカイン活性分子もまた、表III に示されている。特異的なマーカーの誘導の際には、二重特異性「サイトカイン 誘導」または、「抗原誘導」抗体が通常必要とされる。この抗体は、腫瘍の場所に おける適切なサイトカインの放出を選択的に誘導し、従って、血管内皮細胞によ る、所望の標的抗原の発現を選択的に誘導する。二重特異性抗体は、腫瘍塊およ びサイトカイン産生白血球の細胞を架橋し、その結果白血球を活性化し、サイト カインを放出する。 これらのような、二重特異性抗体の調製および使用は、CD3、CD14、CD16およ びCD28を認識する架橋抗体が、第２抗原と架橋して、サイトカイン産生を選択的 に誘起するという先に示された事実に部分的に基づいている(Qianら、1991)。本 発明においては、首尾良く腫瘍細胞架橋された白血球のみが活性化され、サイト カインを放出するので、サイトカイン放出は、腫瘍の場所に限定される。従って 、E-セレクチンのような所望のマーカーの発現も同様に、腫瘍血管系の内皮に限 定される。 表IIIに示される可能な誘導性マーカーの内、E-セレクチンおよびHLA-DR、HLA -DPおよびHLA-DQのようなMHCクラスII抗原(Collinsら、1984)が、臨床実施態様 と合わせて使用される断然最も好ましい標的であることに留意することが重要で ある。表IIIの他の接着分子は、正常組織、通常はリンパ器官内および内皮上に おいて、変化する程度に発現し、このことはこれらの標的化をおそらく、動物モ デルにおいて、または正常組織におけるそれらの発現が有意な副作用なしに阻害 され得る場合にのみに適切にしている。E-セレクチンまたはMHCクラスII抗原の 標的化が好ましい。なぜなら、これらの抗原の発現が、腫瘍結合内皮において選 択的に最も直接的に促進しそうであるからである。 E-セレクチン 正常内皮の表面において発現されない抗原の標的化は、誘導法の最も率直な形 態である。E-セレクチンは、正常内皮血管系、または他のヒト細胞タイプにおい て発現されない接着分子であるが(Cotranら、1986)、IL-1、TNF、リンホトキシ ンおよび細菌エンドトキシンのようなサイトカインの作用によって、内皮細胞の 表面上に誘導され得る(Bevilacquaら、1987)。これは、IFN-γによっては誘導さ れない(Wuら、1990)。従って、E-セレクチンの発現は、そのようなサイトカイン の選択的な送達を介して、または腫瘍環境においてそのようなサイトカインの選 択的な放出を生じる組成物の使用を介して、腫瘍内皮中に選択的に誘導され得る 。 二重特異性抗体は、腫瘍部位において、１つ以上の上記またはその他の適切な サイトカインの選択的な放出を生じ得るが、身体のその他の部分において放出を 生じ得ない組成物の一例である。そのような二重特異性抗体は、本明細書におい て、「抗原誘導抗体」と称され、当然、標的化および凝固成分を有する、本発明の 任意の二重特異性抗体とは異なる。抗原誘導抗体は、単球/マクロファージ系列 （lineage）、Ｔ細胞、および/またはNK細胞、あるいは肥満細胞のようなサイト カインエフェクター細胞と、標的化された固形腫瘍塊の腫瘍細胞とを架橋するよ うに設計される。次いで、この架橋は、架橋の部位、すなわち腫瘍に局在化され たサイトカインの放出をもたらす。 有効な抗原誘導抗体は、一方で選択された腫瘍細胞表面抗原(例えば、表Ｉに おける腫瘍細胞表面抗原)を認識し、他方で選択された白血球細胞タイプの表面 上の選択された「サイトカイン活性化」抗原を認識する。「サイトカイン活性化」抗 原という用語は、抗体またはそのフラグメント、もしくは自然に生じる因子また はその合成アナログのようなエフェクター分子によって結合されると、それが可 溶性因子であっても他の細胞上の膜結合カウンターレセプターであっても、白血 球細胞によってサイトカインの放出を促進する白血球の表面上の種々の既知の分 子のいずれをも指すために用いられる。サイトカイン活性化分子の例にはそれぞ れ、IL-1およびTNFαの放出を活性化するCD14(LPSレセプター)およびIgEに対す るFcR；ならびにIFNγおよびTNFβの放出を活性化するCD16、CD２、またはCD３ 、または、CD28が含まれる。 そのような抗原誘導二重特異性抗体は、いったん腫瘍を有する動物の血流に導 入されると、腫瘍内の腫瘍細胞に結合し、それらの腫瘍細胞を、腫瘍に浸潤した エフェクター細胞(例えば単球/マクロファージ)と架橋し、その後、腫瘍内のサ イトカインの選択的な放出をもたらす。しかし、重要なことに、腫瘍および白血 球の架橋なしに、抗原誘導抗体は、サイトカインの放出をもたらさない。従って 、腫瘍から離れた身体の部分において、サイトカイン放出は生じないため、サイ トカイン誘導分子(例えば、E-セレクチン)の発現は、腫瘍内皮内のみに生じる。 適切な二重特異性抗体と架橋されると、架橋された白血球によってサイトカイ ンの放出を生じる、多数の有用な「サイトカイン活性化」抗原が知られている。こ の目的のために通常好ましい標的は、単球およびマクロファージの表面において 見いだされるCD14である。CD14は架橋されると、単球/マクロファージを刺激し 、IL-1(Schuttら、1988; Chenら、1990)、およびおそらく他のサイトカインを放 出し、これらは次いで、近接する血管系上のE-セレクチンの出現を刺激する。E- セレクチン誘導および標的化に関連した他の可能な架橋の標的には、肥満細胞上 に見いだされるIgEに対するFcR；NK細胞上に見いだされるIgG(CD16)に対するFcR ；およびＴ細胞の表面上に見いだされるCD２、CD３またはCD28が含まれる。他の 白血球細胞タイプよりも、固形腫瘍の単球/マクロファージ浸潤が相対的に分布 するため、これらの内、CD14標的化が通常望ましい。 誘導実施態様の例において、固形腫瘍を有している動物に、二重特異性(Fab'- Fab')抗CD14/抗腫瘍抗体(例えば、高Mrメラノーマ抗原OV-TL3に対する抗-CEA、9 . 2.27抗体、または卵巣関連抗原に対するMOv 18抗体)を注射する。抗体は、その 腫瘍結合活性によって、腫瘍内に局在化し、次いで、腫瘍内の単球およびマクロ ファージを、それらのCD14抗原を架橋することによって活性化する(Schuttら、1 988; Chenら、1990)。活性化された単球/マクロファージは、抗腫瘍性活性を有 し(Palleroniら、1991)、そして腫瘍血管内皮細胞上のE-セレクチン抗原をすば やく誘導するIL-1およびTNFを放出する(Bevilacquaら、1987; Poberら、1991)。 MHCクラスII抗原 本発明における使用が考えられる誘導性マーカーの第２の好ましいグループは 、HLA-DA、HLA-DPおよびHLA-DQを含むMHCクラスII抗原（Collinsら、1984）であ る。クラスII抗原は、ヒトを含む数種類の種のほとんどの正常な組織内の血管内 皮細胞上で発現される。インビトロ（Collinsら、1984；Daarら、1984；O'Conne llら、1990）およびインビボ（Groenewegenら、1985）での研究により、血管内 皮細胞によるクラスII抗原の発現には、ＴH1細胞によって形成され、そしてNK細 胞およびCD8+T細胞によってもより低い程度に形成されるIFN-γの継続した存在 が要求されることが示されている。 MHCクラスII抗原は血管内皮細胞に特有のものでなく、マウス（Hammerling、1 976）およびヒト（Daarら、1984）の双方において、Ｂ細胞、活性化されたＴ細 胞、単球／マクロファージ系統の細胞、およびある種の上皮細胞上においても構 成的(constitutively)に発現する。「正常な」内皮上でのMHCクラスII抗原の発 現のため、それらの標的化はＥ−セレクチンほどには簡単ではない。しかし、正 常な組織内でのクラスII分子の発現を効果的に抑制する能力を有するシクロスポ リンＡ（Cyclosporin A; CsA)など（Groenewegenら、1985）の免疫抑制剤と関連 して使用することによって、MHCクラスII抗原の誘導および標的化が可能となる 。CsAは、Ｔ細胞およびNK細胞の活性化を防止することによって作用し（Groenew egenら、1985；DeFranco、1991）、それによってIFN-γの基底レベル(basal lev el)を内皮上におけるクラスIIの発現を維持するのに必要とされるレベル以下に 減少させる。 やはり免疫抑制効果を有し、クラスII発現を抑制する能力を示すと思われる、 シクロスポリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇなどを含む、CsAに関連するその他各種のシ クロスポリンが存在する。同様に有効であり得るその他の作用剤には、FK506お よびラパマイシン（rapamycin）が含まれる。 従って、MHCクラスII誘導および標的化の実施態様の実施では、腫瘍を有する 動物を、クラスII発現を抑制するために効果的な用量のCsAまたは他のクラスII 免疫抑制剤で事前に処置することが必要である。これはCsAの場合、代表的には 約10から約30 mg/kg体重のオーダーである。正常組織内で一旦抑制されると、ク ラスII抗原は、ここでも二重特異性抗体の使用を通じて、腫瘍の内皮内に選択的 に誘導され得る。 この場合、抗原を誘導する二重特異性抗体は、腫瘍細胞マーカーと、IFN-γの 生成を誘導することのできるエフェクター細胞の表面上に見られる活性化抗原と に対する特異性を有する。そのようなエフェクター細胞とは、一般的にはヘルパ ーＴ細胞（ＴH）またはナチュラルキラー（NK）細胞である。これらの実施態様 では、クラスII抗原の発現がIFN-γを用いて達成され、他のサイトカインでは達 成されないという点で、Ｔ細胞またはNK細胞（CD16が使用される場合）が腫瘍中 に存在し、サイトカイン中間体を生成する必要がある。従って、本発明のこの局 面の実施のためには、抗原を誘導する二重特異性抗体による標的化のためのサイ トカイン活性化抗原としてCD2、CD3、CD28、最も好ましくはCD28、を選択するこ とが望ましい。 腫瘍中で活性化されるべきＴ細胞は、血管系に隣接するものである。細胞にと って最もアクセスし得る領域であり、二重特異性抗体が最も集中するところでも あるからである。活性化されたＴ細胞は、その後、IFN-γを分泌し、これが隣接 する腫瘍血管系上にクラスII抗原を誘導する。 一方のアームが腫瘍抗原に対して向けられており、もう一方のアームがCD28に 対して向けられている二重特異性（Fab'-Fab'）抗体の使用が、現状では好まし い。この抗体は、腫瘍中でＴ細胞上のCD28抗原を架橋し、これは、（例えば、一 般に腫瘍細胞によって分泌されるIL-1によって提供される（Burrowsら、1991：R ucoら、1990））第２の信号と組合わさった場合、Ｔ細胞をCA2+−非依存性CsA− 非抑制性の経路を通じて活性化することが示されている（Hessら、1991；Juneら 、1987；Bjorndahlら、1989）。 種々のサイトカイン活性化分子に対する抗体の調製も、当該分野で周知である 。例えば、白血球による、サイトカイン生成を誘導する能力を有する抗−CD14お よび抗-CD28モノクローナル抗体の調製および使用は、今ではいくつかの研究室 によって記述されている（Schuttら、1988；Chenら、1990；およびJuneら、1990 で、それぞれ概説されている）。さらに、その他のメカニズムおよびその他の活 性化抗原を通じて白血球によるサイトカインの放出を刺激するモノクローナル抗 体の調製もまた、公知である（Clarkら、1986；Geppertら、1990）。 さらなる実施態様では、クラスII分子の発現を抑制し、そして腫瘍が存在する 部分でのクラスII分子の発現を選択的に引き出すための別のアプローチが、意図 される。CsAおよび二重特異性活性化抗体の双方の使用を回避するこのアプロー チは、Ｔ細胞によるIFN-γの生成を抑制すること（例えば抗−CD4抗体の使用を 通じて（Streetら、1989））によって、クラスII分子の発現が効果的に阻害され 得るという事実を利用する。この実施態様の使用において、IFN-γの生成は抗− CD4を投与することによって阻害され、結果的にクラスII発現の一般的な抑制と なる。クラスIIは、その後、例えば腫瘍内部においてのみ活性化可能である腫瘍 特異的Ｔ細胞の使用により、腫瘍サイトにおいてのみ誘導される。 この処置モードにおいては、一般的には動物またはヒトの患者をIFN-γの生成 を抑制するために効果的な用量の抗−CD4によって事前に処置し、それによって クラスII分子の発現を抑制する。効果的な用量は、例えば、約４〜約10 mg/kg体 重のオーダーである。クラスII発現が抑制された後は、腫瘍細胞の表面上に発現 される抗原に対して特異的な、INF-γを生成するＴ細胞クローン（例えば、Th１ または細胞毒性のＴリンパ球、CTL）が調製され、血流内へ導入される。これら のＴ細胞はそれらの抗原認識能力のため腫瘍塊に局在化され、そのような認識が 行われる際にIFN-γを放出する。このように、サイトカインの放出はここでも腫 瘍に対してのみ制限されて、従って、クラスII分子の発現を腫瘍血管系に限定す る。 IFN-γを生成するＴ細胞クローンは、末梢の血液から入手し得るが（Mazzocch iら、1990）、好ましいソースは腫瘍塊の中からである（Foxら、1990）。そのよ うなＴ細胞クローンの現行での好ましい調製手段では、患者から腫瘍塊の一部分 を取り除き；（必要に応じてコラゲナーゼ消化を用いて）細胞を分離し；密度勾 配遠心分離を用いて腫瘍に浸透する白血球を濃縮し、続いて、（例えば特異性抗 体と補体とによる処置によって）その他の白血球の部分集合を枯渇させ；その後 、腫瘍に浸透する白血球をインビトロで拡大(expand)させて、IFN-γを生成する クローンを供給する。このクローンは、必然的に、患者と免疫学的に適合し、従 って、患者によって十分に許容される。 各個別のクローンのサイトカイン分泌パターンを14日毎に決定することによっ て、高IFN-γ生成Ｔ細胞クローンを、拡大させた白血球からさらに選択し、その ことによって格別の利益を達成することができることが提案されている。この目 的のため、静止したクローンは有糸分裂的または抗原的に24時間刺激され、それ らの培養上澄液は、例えば、特異的サンドイッチELISA技術（Cherwinskiら、198 9）を使用して、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5およびIL-10の存在についてアッセイ される。ＴH1クローンの特徴的なサイトカイン分泌パターンである、高レベルの IL-2およびIFN-γを分泌するクローンが選択される。腫瘍特異性は、増殖アッセ イを用いて確認される。 さらに、抗−CD4抗体として、抗−CD4 Fabを採用することが好ましい。その理 由は、この抗体は注入後24時間以内に身体から除去され、従って後で投与される 腫瘍認識Ｔ細胞クローンの抑制を生じさせないからである。腫瘍特異性を有する Ｔ細胞クローンの調製は、一般に当該分野で周知であり、例えば固形の黒色腫に 浸透するリンパ球からのＴ細胞クローンの生成および特徴付けによって示される （Maedaら、1991）。 MHCクラスII抑制−誘導法のいずれを使用するにしても、静脈注射される抗− クラスII抗体が、外皮細胞または肝臓および脾臓以外の正常な臓器内の単球／マ クロファージに達するようには見えないという事実より、結果的に更なる利益が 得られそうである。これは、おそらく、ほとんどの正常な臓器内の血管内皮は、 肝臓および脾臓内でのように有窓性を有さずタイトであり、従って抗体はクラス II−陽性細胞に達するために基底膜を横切って拡散せねばならないからである。 また、例えば架橋に続いて、結果として生じ得るいかなるＢ細胞除去も、これら の細胞がクラスII陰性の先祖細胞から補充されるので、重要な問題を提示しそう にない（Loweら、1986）。Ｂリンパ腫の患者に起こるＢ細胞の殺傷さえも、明ら かな害を生じるものではない（Vitettaら、1991）。 要約すると、本発明の腫瘍凝固組成物および抗体はすっきりとシンプルであり 、それらの操作性に関して抗原の誘導を必要としないが、抗原を誘導する二重特 異性抗体の、本発明と組み合わせた使用も意図されている。そのような抗体は一 般的に、本発明の二重特異性凝固リガンドに先立って、投与される。 一般的に言って、「免疫原性」の腫瘍であるほど、例えば腫瘍内のＴ細胞の抗 −CD28／抗−腫瘍二重特異性抗体を通じての架橋を含む、MHCクラスIIアプロー チにより適している。その理由は、これらの腫瘍はＴ細胞によってより浸透され やすいからであり、このことはこの方法が有効であるための前提条件だからであ る。免疫原性固形腫瘍の例として、腎臓ガン腫、黒色腫、少数の乳ガンおよび結 腸ガンの他に、可能性のあるものとして膵臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、肺ガンお よび神経膠ガンが含まれる。これらの腫瘍は、「免疫原性」として言及される。 それは、これらが宿主中で免疫反応を引き起こす証拠が在り、細胞免疫療法を施 せることが判明しているからである（Yamaueら、1990）。黒色腫および大腸ガン の場合、これらの事例での使用が最も好ましい抗体は、B72.3(抗-TAG-72)および PRSC5/PR4C2(抗-Lewis a)または9.2.27(抗-高 Mr 黒色腫抗原)である。 全ての起源の固形腫瘍の多数について、マクロファージ／単球中間体を採用す る抗−CD14アプローチがより適切である。これは、ほとんどの腫瘍はマクロファ ージを豊富に含んでいるからである。マクロファージを豊富に含む腫瘍の例とし て、ほとんどの乳ガン腫、結腸ガン腫および肺ガン腫が含まれる。これらの事例 での使用が好ましい抗−腫瘍抗体の例として、抗-HER-2、B72.3、SM-3、HMFG-2 、およびSWA11がある（Smithら、1989）。 (c) コアギュラント誘導性マーカー トロンビン、第IX/IXa因子、第X/Xa因子、プラスミンおよび、間質性コラゲナ ーゼ、ストロメリシンおよびゼラチナーゼなどの金属結合タンパク分解酵素など のコアギュラントは、ある種のマーカーを誘導するようにも作用する。特に、Ｅ −セレクチン、Ｐ−セレクチン、PDGFおよびICAM-1は、トロンビンによって誘導 される（Sugamaら、1992；Shankarら、1994）。 従って、この誘導については、抗−コアギュラント／抗−腫瘍二重特異性抗体 が利用される。抗体は、その腫瘍結合活性によって腫瘍内に局在化される。その 後、二重特異性体はコアギュラント（例えばトロンビン）を腫瘍内に濃縮し、結 果的に腫瘍血管内皮細胞上でのＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチンの誘導が得 られる（Sugamaら、1991；Shankarら、1994）。 あるいは、短縮型組織因子の腫瘍細胞または内皮への標的化が、腫瘍内でのト ロンビンの堆積を誘導する。トロンビンが堆積されると、腫瘍血管内皮細胞上に Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンが誘導される。 (d) 血管内皮細胞マーカーに対する抗体 疾患関連血管系標的を認識するための直載的な手段は、自然環境においてまた は人工的な手段によって誘導されたものかに関係なく、特定の細胞表面レセプタ ー、分子または抗原に対して結合親和力を有する抗体を使用する。これらは、例 えば腫瘍血管内皮細胞上に存在することが知られているもの、腫瘍に由来する因 子に反応して誘導あるいは過剰発現されるもの、およびヒトの手による操作に従 って誘導されるものである、全ての細胞表面成分に対する抗体を含む。表IVおよ び表Ｖに、有用な抗体およびそれらの特性を要約する。 本発明で使用し得るさらなる２種類の抗体は、Rettigら(1992)およびWangら(1 993)によって記載された、ヒトの腫瘍の血管系内に発現されるがほとんどの正常 な組織内では発現されない、未知の機能を有する関連のない抗原に対する抗体で ある。 Kimら(1993)によって記載された抗体も、特にこの抗体がインビボで血管形成 を阻害し腫瘍の成長を抑制したので、本発明で使用し得る。 ヒトの腫瘍について特異的であることが以前に示されていない抗体も使用し得 る。例えば、Venkateswaranら(1992)は、抗−FGF MAbsの生成を記載した。Xuら( 1992)は、FGFレセプター(flg)イソ型に対する、16個のイソ型およびドメイン特 異的ポリクローナルおよびモノクローナル抗体のパネルの開発および特徴付けを 行った。Massogliaら(1987)も、FGFに対するMAbsを報告した。 (e) 疾患血管系に対する抗体の生成 上記の抗体および科学文献において公知で公表されているその他の抗体など、 既知の抗体を利用することに加えて、以下により詳細に説明されるように、通常 の免疫化手順を使用することによっても新規な抗体を生成し得る。周知の疾患関 連血管マーカー抗原に対する抗体を生成するために、抗原を含む免疫原性組成物 によって動物を免疫化する。これは、抗原を含む、あるいは抗原が濃縮された膜 調製物；細胞または膜から分離されたような抗原の比較的精製された形態；例え ば、天然の抗原抽出物または組換型宿主細胞から得られた抗原の組換型の形態を 用いる、種々の精製工程によって得られるような、抗原の高度に精製された形態 であり得る。 本発明は、疾患関連血管系内皮細胞上に存在する抗原に対する抗体を生成する ための更なる方法をも提供し、それらの方法は抗原の生化学的本質が未知である 場合であっても使用に適切である。これらの方法は、腫瘍血管系内皮細胞に対す る抗体の生成を通じて例示される。この様式により抗体の生成を達成する第１の 手段には、動物またはヒトの患者の腫瘍部位から得られる血管内皮細胞の調製物 が用いられる。そのような細胞の調製物で単に実験動物を免疫化することにより 、生成される抗体を回収する。この方法の最も有効な形態は、特異的抗体がつい で選択されるが、これは従来のハイブリドーマ技術および腫瘍血管系内皮細胞に 対 するスクリーニングを使用することにより達成され得る。 上記方法の発展は、インビトロで腫瘍血管系事象を模倣するものであり、細胞 の精製は必要ではない。この方法の使用では、内皮細胞を、動物中よりもむしろ 細胞培養中の腫瘍馴化培地から得られ得るような、腫瘍に由来する生成物にさら す。この方法は、一般的に内皮細胞を腫瘍馴化培地で刺激すること、および刺激 された内皮細胞を免疫原として適用し、抗体の収集物を調製することを包含する 。ここでも、特異的抗体が選択されるが、それは例えば従来のモノクローナル抗 体技術、または免疫化し動物の脾臓から単離されたRNAから調製された組み合わ せ的な免疫グロブリンファージミドライブラリなどのその他の技術を用いる。腫 瘍に刺激された血管内皮を優先的に認識し、正常なヒト成人の組織とよりも腫瘍 関連内皮細胞とより強く反応する特異的抗体が選択される。 この点に関して使用を意図される刺激された内皮細胞は、例えば、ヒト臍静脈 内皮細胞(human umbilical vein endothelial cells; HUVE)、ヒト皮膚細血管内 皮細胞(human dermal microvascular endothelial cells; HDEMC)、ヒト伏在静 脈内皮細胞(human saphenous vein endothelial cells)、ヒト大網脂肪内皮細胞 (human omental fat endothelial cells)、その他のヒト細血管内皮細胞、ヒト 脳の毛細管内皮細胞などである。本願明細書の記述に従い、他種からの内皮細胞 が、腫瘍馴化培地によって刺激され得、免疫抗原として用いられてハイブリドー マを生成し抗体を生産することも意図される。すなわち腫瘍で刺激されたヒトの 血管内皮細胞と交差反応する抗体、および／または前臨床モデルで使用する抗体 を生成することも、意図される。 本明細書において、「腫瘍馴化培地」は、ひとつまたはそれ以上の腫瘍に由来 するサイトカイン、リンフォカインまたはその他のエフェクター分子を含有する 培養培地のような組成物または培地として定義される。最も典型的には、腫瘍馴 化培地は、選択された腫瘍細胞が培養され、従ってそのような腫瘍に由来する生 成物が濃縮される培養培地から調製される。培地のタイプは、少なくとも初期の 時点で腫瘍細胞の増殖を維持するのに適切な養分と条件とを含有する限り、特に 重要とは考えられない。腫瘍馴化培地から物質を抽出しさらには分離し、ひとつ またはそれ以上の抽出物を内皮細胞に適用することも、もちろん可能である。 培地の調製のために使用される腫瘍のタイプに関しては、究極的に本発明を使 用する分析または処置を受ける腫瘍を模倣するまたはそれに類似する腫瘍を採用 することがもちろん好ましい。従って、例えば、乳ガンの治療のためのプロトコ ールの開発を予測する場合、ZR-75-1、T47D、SKBR3、MDA-MB-231などの乳ガン細 胞を採用することが好ましい。結直腸腫瘍の場合、HT29ガン腫と同様DLD-1、HCT 116若しくはSW48またはSW122が、例として言及され得る。肺腫瘍の場合、NCI-H6 9、SW2、NCI H23、NCI H460、NCI H69、またはNCI H82が、例として言及され得 る。黒色腫の場合の良い例は、DX.3、A375、SKMEL-23、HMB-2、MJM、T8または実 際にVUPである。上記のいかなる場合も、処置されるべき腫瘍から生成された細 胞、すなわち生検から得られた細胞も採用され得ることが更に考えられる。 一旦調製されると、腫瘍馴化培地は、ついで内皮細胞の細胞表面上の腫瘍内皮 細胞特異的マーカーの出現を刺激するために用いられる。例えば、選択された内 皮細胞を腫瘍馴化培地（またはそれに由来する生成物）の存在下で培養すること を含む。ここでも、採用される内皮細胞のタイプは、それが最終的に治療または 診断されるべき特定の腫瘍の血管系に関連する内皮細胞を一般的に代表する限り 、決定的に重要でないことが提案される。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVE)またはヒト 皮膚細血管内皮細胞(HDMEC、Karasek、1989)を適用することが好ましい。なぜな らヒトにその起源を有し、サイトカイン成長因子および血管形成因子に反応し、 容易に得られるからである。しかし、インビトロで培養し得るいかなる内皮細胞 も本発明の実施において採用され得、やはり有益な結果を達成し得ることが期待 されている。EA.hy9.26、ECV304、ヒトの伏在静脈内皮細胞などが、例として言 及され得る。 一旦、腫瘍に由来する生成物を用いて刺激されると、内皮細胞はその後、モノ クローナル抗体(MAb)の調製の免疫原として適用される。抗原細胞表面マーカー に対するMAbを調製する技術はまったく明確であり、当業者に周知の技術を使用 することにより容易に実施され得る。これは、KohlerおよびMilstein(1975)の手 順によって例示され、以下で更に説明される。 一般的に言って、刺激された内皮細胞を使用してMAbを調製する好ましい方法 は、以下の手順を包含する。ヒト腫瘍由来の細胞または細胞株が、組織培養で４ 日間またはそれ以上増殖される。組織培養上澄液（「腫瘍馴化培地」）を腫瘍細 胞培養液から取り出し、HUVECの培養液へ50％(v/v)の最終濃度となるように加え る。２日間の培養の後、HUVECは非酵素的に回収され、１〜２×106個の細胞がマ ウスの腹腔内に注入される。このプロセスを、２週間の間隔をおいて３回繰り返 し、最終の免疫化は静脈ルートによる。３日後、脾臓細胞を採取し、通常のプロ トコール（KohlerおよびMilstein、1975）に従ってSP2/0骨髄腫細胞と融合し、 適切な反応性を有する抗体を生成するハイブリドーマを限界希釈法によってクロ ーン化する。 結果として生じるハイブリドーマのコレクションから、活性化されていない血 管内皮を認識する以上に活性化された血管内皮を認識する抗体を生成する、ひと つまたはそれ以上のハイブリドーマを選択する。ひとつのゴールは、正常な内皮 に対する結合親和力を実質的に有しない抗体の同定である。しかし、先行技術と 比較した際、本発明においてはこの特性は決定的ではない。いずれにしても、腫 瘍により活性化された内皮細胞のひとつまたはそれ以上のタイプに対する適切な 抗体生成ハイブリドーマは、例えばELISA、RIA、IRMA、IIF、または同様の免疫 アッセイを用いるスクリーニングによって、一般的に同定される。一旦候補が同 定されると、活性化されていないまたは「正常な」内皮あるいはその他の正常な 組織または細胞のタイプに対する反応性の欠損についてのテストが望まれている 。この様に、特定の適用に際して予測される望ましくない高レベルの正常な交差 反応性を有する抗体を生成するハイブリドーマを排除し得る。 (f) 抗エンドグリン抗体 上記の技術を使用することにより、腫瘍血管内皮細胞に対する比較的特異性を 有する抗体が調製および分離された。ひとつの特定の例では、HT29ガン腫細胞を 用いて馴化培地を調製し、ついで、これを用いて培養中のHUVE細胞を刺激した。 結果として生じたHT29−活性化HUVE細胞は、ついで、ハイブリドーマバンクの調 製の免疫原として用いられ、ハイブリドーマバンクはHT29−活性化HUVE細胞を使 用するELISA−スクリーニング、さらにはヒトの腫瘍および正常組織の切片の免 疫組織学的分析によってスクリーニングされた。このバンクから、腫瘍血管内皮 細胞抗原を認識する抗体が選択された。 腫瘍内皮細胞抗体４および腫瘍内皮細胞抗体11(TEC4およびTEC11)と命名され たMAbは、上記方法を使用して得られた。TEC4およびTEC11によって認識される抗 原は、最終的には分子エンドグリンであると決定された。TEC4およびTEC11によ って認識されるエンドグリン上のエピトープは刺激されたHUVE細胞の細胞表面上 に存在し、刺激されていない細胞の表面上には最小限度でのみ（または免疫学的 に接近可能な程度）存在する。エンドグリンに対するMAbはすでに生成されてい る。しかし、HUVECまたはTCM−活性化HUVEC細胞表面決定基との反応性をFACSま たは間接免疫蛍光検査法によって分析することにより、TEC-4およびTEC-11によ って認識されるエピトープが44G4と命名された以前の抗体（GougosおよびLetart e、1988）のそれとは異なることが示される。 公知の任意の抗エンドグリン抗体（例えば、GougosおよびLetarte、1988；Gou され得るが、TEC-4およびTEC-11 mAbが特に適切であると考えられる。これは、 それらが広範囲の固形腫瘍の（および数種類の慢性炎症性状態および胎児胎盤に おける）毛細血管および細静脈内皮細胞を「中程度」から「強度」で標識するが 、正常で健康な成人の組織の大多数においては血管の比較的弱い染色を示すから である。TEC-11は実質的に非内皮細胞と反応性を示さないため、特に好ましい。 さらに、TEC-4とTEC-11の双方とも補体結合性であり、それにより腫瘍血管床内 の内皮細胞の選択的溶解をも誘導する能力が与えられる。 MAb TEC-4およびTEC-11と交差反応する抗体、すなわちTEC-4またはTEC-11と同 じエピトープでのエンドグリンに結合するものも、本発明で有効であると考えら れる。TEC-4またはTEC-11と同じエピトープでエンドグリンに結合する抗体の同 定は、まったく明白な事柄である。このことは、抗体の競合を評価することので きる種々の免疫学的スクリーニングアッセイの中の任意のものを用いて容易に決 定することができる。例えば、検査されるべきテスト抗体がTEC-4またはTEC-11 のそれとは異なるソース、例えばウサギから得られる場合、あるいは異なるイソ 型、例えばIgG1またはIgG3である場合でも、競合ELISAが使用され得る。競合ELI SAのそのような一実施態様では、TEC-4またはTEC-11を異なる量のテスト抗体と 共に事前に混合して、ついで抗原でコートしたELISAプレートのウェルに適用す る。抗−ネズミまたは抗−IgM２次抗体のいずれかを使用することによって、結 合したTEC-4またはTEC-11抗体のみを検出することができ、それらの結合は、TEC -4またはTEC-11のいずれかと同じエピトープを認識するテスト抗体の存在によっ て減少される。 TEC-4またはTEC-11とテスト抗体との間の抗体競合の研究を行うために、最初 にTEC-4またはTEC-11を検出可能な標識、例えばビオチンもしくは酵素または放 射性標識など標識し得、その後の同定を可能とする。これらの場合は、標識され た抗体を試験されるべきテスト抗体と共に種々の比率（例えば、1:1、1:10およ び1:100）でインキュベートし、適切な時間の後、標識されたTEC-4またはTEC-11 抗体の反応性をアッセイし、これを、インキュベーション中に競合する抗体（テ スト）が含まれなかった場合のコントロール値と比較する。 アッセイは、抗体結合に基づく免疫学的アッセイの範囲内のひとつであればい かなるものでも良く、TEC-4またはTEC-11抗体は、それらの標識を検出すること により、例えばビオチン化された抗体の場合はストレプトアビジンを使用し、ま たは酵素的標識に関する発色基質を使用することによって、または単に放射性標 識を検出することによって検出される。TEC-4またはTEC-11と同じエピトープに 結合する抗体は、結合について効果的に競合し得、TEC-4またはTEC-11結合を著 しく減少する。これは標識された抗体の結合の減少によって証明される。本ケー スでは、標識されたTEC-4またはTEC-11抗体をテスト抗体と混合した後、残りの 反応性を決定するのに適切なアッセイとして、例えば、ヒトのエンドグリンを用 いるELISA、RIAまたはウエスタンブロット；エンドグリンの免疫沈降反応；ヒト エンドグリンを発現する組換型細胞のELSA、RIAまたは免疫蛍光染色；腫瘍血管 系内皮細胞の間接免疫蛍光染色；HUVECまたはTCM−活性化HUVEC細胞表面決定基 との反応性の間接免疫蛍光検査；およびFACS分析が含まれる。この後者の方法が 最も好適であり、TEC-4およびTEC-11によって認識されるエピトープが44G4（Gou gosおよびLetarte、1988）のそれとは異なることを示すために採用された。 いかなるテスト抗体も存在しない状況下での標識されたTEC-4抗体またはTEC-1 1抗体の反応性は、高いコントロール値である。低いコントロール値は、標識さ れた抗体と同じタイプの標識されていない抗体と共にインキュベートすることに よって得られるが、それは競合が生じ、標識された抗体の結合が減少するときで ある。標識された抗体反応性のテスト抗体存在下における著しい減少は、同じエ ピトープを認識するテスト抗体、すなわち標識された抗体と「交差反応」するも のが存在することを示す。本願のこの局面における「著しい減少」とは、約1:1 の比率での少なくとも約10％〜50％、またはより好ましくは約1:100の比率での 約90％に等しいまたはそれ以上の結合の再生可能な（すなわち首尾一貫して観察 される）減少として定義され得る。 「交差反応性アッセイ」の使用は、TEC-4またはTEC-11という面における上記 の説明のように、本発明に使用し得るいかなる抗体に対しても適用され得る。従 って、腫瘍細胞の構成成分、腫瘍血管系の構成成分、腫瘍細胞関連成分、腫瘍血 管系関連成分、腫瘍細胞外のマトリクス成分、または本明細書にリストされてい る細胞タイプと本明細書にリストされている抗体のいかなるものとも同じエピト ープで結合し、抗体競合アッセイによって決定される抗体は、凝固剤と組み合わ され二重特異性リガンドを形成する場合、本発明の範囲に入る抗体となる。 (g) 血管内皮細胞結合リガンドの使用 成長因子レセプターのような、内皮細胞表面分子に結合、あるいはそれと相互 作用することが知られている生物学的リガンドは、標的化成分としても使用され 得る。 この意味において標的として有用であると考えられる成長因子またはリガンド として、VEGF/VPF、FGF、TGFβ、TIEに結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネ クチンイソ型、消散因子(scatter factor)、肝細胞増殖因子(HGF)、血小板因子 ４(PF4)、PDGFおよびTIMPが含まれる。 特に好ましい標的は、VEGF/VPF、FGFファミリーのタンパク質およびTGFβであ る。Abrahamら(1986)はFGFをクローン化し、従って組換えタンパク質として入手 可能である。Ferraraら(1991)によって報告されているように、121、165、189、 および206個のアミノ酸を有する４種のVEGFがクローン化されている。 (h) 結合リガンドの標的化 抗体または特異的標的化リガンドはまた、腫瘍のような疾患部位内の血管内皮 細胞の表面に結合するいかなる成分に対しても向けられ得る。このような成分は 、 腫瘍環境に応答する内皮細胞上で、内皮細胞上に既に存在する特異的細胞表面レ セプターに、あるいは誘導または過剰発現されたレセプターに結合する、腫瘍由 来のリガンドおよび抗原（例えば、増殖因子）によって例示される。腫瘍血管関 連標的はまた、腫瘍由来の内皮細胞結合因子とも命名され得る。 成功的な疾患標的化のために必要である特異性のレベルは達成される。なぜな ら、部分的には、局所内皮細胞が、正常内皮細胞上に存在しないか、または過小 発現もしくはマスクされるレセプターを発現または現すために誘導されるからで ある。腫瘍について、その他の組織のために用い得るリガンドの量が減少するこ とで、腫瘍中の内皮細胞が腫瘍由来の因子を捕獲し、そしてそれらを細胞表面に 結合させるという事実のために、さらなる特異性が得られる。血液および組織液 のプール中に分配することによる、因子またはリガンドのさらなる希釈と組み合 わされた場合、正常組織内の内皮細胞は、比較的少数のこのような因子を結合す ると予期される。従って、操作上は、細胞表面結合リガンドまたは因子は、腫瘍 内皮細胞マーカーとして使用することができる。 腫瘍細胞自身による生成に加え、腫瘍内皮細胞結合因子はまた、腫瘍に浸潤し たその他のタイプの細胞（例えば、マクロファージおよびマスト細胞）から生じ 得るか、あるいは腫瘍内部で活性化される血小板によって形成され得る。 腫瘍血管系関連標的として有用であると考えられるさらなる増殖因子またはリ ガンドとして、EGF、FGF、VEGF、TGFβ、HGF（NaKamura、1991）、アンジオトロ ピン(angiotropin)、TGF-α、TNF-α、PD-ECGFおよびTIE結合リガンド（Bicknel lおよびHarris、1992）が包含される。現在の好ましい標的として、VEGF/VPF、F GFファミリーのタンパク質形成転換増殖因子β（TGF−β）；TGF-α；腫瘍壊死 因子−α（TNF-α）；アンジオトロピン；血小板由来内皮細胞増殖因子（PD-ECG F）；TIE結合リガンド；プレイオトロピンが含まれる。 本発明の別の局面は、リガンド−レセプター複合体上のみに存在するエピトー プに特異的である標的化抗体またはそれ由来の結合領域の使用であり、そのエピ トープは、個々の（遊離の）リガンドおよび非結合形態レセプターの双方に存在 しない。これらの抗体は、リガンド（例えば、増殖因子）がそのレセプター（例 えば、増殖因子レセプター）に結合して、特異的に結合した複合体を形成する場 合に生じる独特のコンホメーションを認識し、そしてそれに結合する。このよう なエピトープは、リガンドまたはレセプターの非複合体上には存在しない。 発明者らは、これらの抗体が結合するリガンド−レセプター複合体が、非腫瘍 関連内皮細胞上よりも腫瘍関連内皮細胞上に著しく多数で存在することに注目す る。従って、このような抗体は標的化剤として有用であり、そして本発明の二重 特異性コアギュラントの特異性をさらに増加させるように作用する。 (i) レセプター構築物 内皮細胞表面レセプターの可溶性結合ドメインはまた、本発明の標的化リガン ドとしての使用も考えられる。この概念は、一般的に、種々のインビトロおよび インビボでの結合プロトコールで利用されている周知のサンドイッチ結合現象に 基づく。基本的には、内皮細胞が特異的なレセプターを発現すると、細胞は対応 するリガンドに結合し、そしてそれを吸着する。ついで、リガンドがシステム内 へ導入されると、さらなるレセプター構築物に結合するためにそれらが用いられ 得る。 有用な内皮細胞レセプターの範囲は、前述のセクションで同定されており、VE GF/VPF、FGF、TGFβ、TIE-1およびTIE-2が特に好ましい標的である。これらのレ セプターのそれぞれは、標的化リガンドとしての使用のための可溶性結合ドメイ ンを形成するために操作され得る。 ４．疾患関連支質細胞標的 (a) 細胞外マトリクス／支質標的 腫瘍病理における基底膜マーカーの有用性が、Birembautら(1985)によって記 載された。これらの研究により、基底膜(BM)マーカー、タイプIVコラーゲン、ラ ミニン(LM)、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSP)、およびフィブロネクチン(FN )の分布が、腫瘍病理において崩壊したことが示された。Burtinら(1983)はまた 、ヒトの転移リンパ節内の基底膜および結合組織抗原の変更を記載した。 本発明での使用のための好ましい標的はRIBSである。Ugarovaら(1993)は、コ ンホメーション的変化がフィブリノーゲン中に発生し、そして血小板膜糖タンパ ク質GPIIb-IIIaとの相互作用によって誘導されることを報告した。活性化された 血小板上でのフィブリノーゲンの膜糖タンパク質GPIIb-IIIaへの結合は、血小板 の凝集を導く。この相互作用の結果、遊離リガンドではなく結合リガンドによっ て発現される、レセプター誘導の結合部位、RIBS、エピトープの発現によって証 明されるように、フィブリノーゲン中におけるコンホメーション的変化が得られ る。 ２つのRIBSエピトープが、Ugarovaら(1993)によって局在化された。１つの配 列はγ112〜119に在り、MAb 9F9によって認識される；２つ目はAα95〜98のRGDF 配列であり、mAb 155B16によって認識される。これらのエピトープはまた、フィ ブリノーゲンのプラスチック表面上への吸着およびプラスミンによる分子の消化 によって露呈される。エピトープのタンパク質分解による曝露と同時に、Aα− 鎖のカルボキシル末端面の切断が生じ、フラグメントＸ2を形成する。フィブリ ノーゲン中でのAα 95〜98でのRGDF配列の非アクセス性は、この配列が分子のGP IIb-IIIaへの初期結合に参加しないことを示唆する。 フィブリノーゲンのそのレセプターへの結合は、Aα−鎖のカルボキシル末端 面のコンホメーションを変更し、分子のＤドメインとＥドメインとの間のコイル ドコイル(coiled-coil)の結合セグメント内に在る配列を露呈し、RIBSエピトー プを生成する。実際的には、RIBS配列は、凝固リガンド(coaguligand)を用いて 標的化の際に使用するためのエピトープとして提案される。従って、MAb 9F9お よびMAb155B16は、Zamarronら(1991)によって記載された抗体のように、都合良 く使用し得る。 (b) 付加的細胞標的 本発明は、疾患領域内に見られる細胞のタイプに対して標的化を行うことによ って、コアギュラントを疾患関連血管系に向けるために使用し得るという、さら なる長所を有する。 血小板は、傷ついた血管壁に付着し損傷部位に蓄積することによって、止血お よび血栓形成に関与する。生理学的条件下での初期の出血停止は、血管の損傷部 位における血小板の堆積がその原因であるが、それは、病理学的条件下では、そ の後の虚血性組織損傷および血栓による塞栓形成によって、血管閉塞を導き得る 。 血小板とその環境との相互作用、および血小板とそれ自身との相互作用は、細 胞表面で始められる複雑なプロセスを表す。従って、表面膜は、血管壁および血 漿成分を含む外部媒体と内部の血小板との間の反応性界面を提供する。 活性化された血小板上に発現される多量体の血小板タンパク質であるp-115（H aywardら、1991）は、本発明を使用して標的化され得る。血小板は、複雑な生化 学的および形態学的変化を経ることによって、多数の刺激剤に応答する。これら の変化は、付着、凝集、および凝固を含む生理学的プロセスに含まれる。血小板 の活性化は、モノクローナル抗体によって認識され得る膜の変更を生じる。モノ クローナル抗体であるJS-1（Haywardら、1991）は、凝固リガンドの一部分とし て使用されることが考えられる、このような抗体のひとつである。 リガンドに誘導される結合部位(LIBS)は、リガンド結合がレセプターの形状変 化を引き起こした後、細胞表面レセプター上に発現される部位であり、その後の 生物学的事象を仲介する。これらは、RIBSに対する対応物として見なされ、そし て本発明で使用するための好ましい標的でもある。 13個の抗−LIBS抗体がFrelingerら(1990; 1991)によって開発され、それらの 内のいずれもが、本明細書中の記載に従って、疾患または腫瘍の部位へコアギュ ラントを送達するために使用し得る。マウスのモノクローナル抗血小板抗体であ るMA-TSPI-1（ヒトのトロンボスポンジンに対する）ならびにDewerchinら(1991) のMA-PMI-2、MA-PMI-1、およびMA-LIBS-1（ヒトの血小板糖タンパク質IIb/IIIa 上のLIBSに対する）もまた、Heynenら(1994)のRUU2.41およびLIBS-1；Tomiyama ら(1992)のOP-G2；およびAb-15のように、使用され得る。 他の多くの標的（例えば、平滑筋細胞、周皮細胞、線維芽細胞、マクロファー ジならびに浸潤性リンパ球および白血球上の抗原）も使用し得る。 Ｂ．凝固剤 本発明の二重特異性薬剤の第２のアーム(arm)あるいは要素は、凝固を促進し 得る成分てある。「凝固促進薬剤」は、凝固因子、凝固を間接的に刺激する因子 てあり得、あるいは、凝固因子または凝固を間接的に刺激する因子を結合および 放出し得る第２結合領域の形態であり得る。 １．凝固因子 以下に示す薬剤によって例示されるように、様々な凝固因子が本発明に関連し て用いられ得る。凝固因子が第１結合薬剤と共有結合する場合、機能性凝固部位 とは異なる部位が分子の連結に用いられる。凝固因子の、活性部位あるいは機能 性領域とは異なる適切な結合領域もまた、以下のセクションのそれぞれに記載さ れる。 (a)組織因子 組織因子(TF)は、血液凝固を開始し得る１つの因子である。TFは血液凝固の外 因性経路の活性化因子であり、生理学的に正常な状態においては、血液と直接接 触しない(Osterudら、1986；Nemerson、1988、Broze、1992；Ruf & Edington、1 994)。しかし、血管の損傷時、あるいは特定のサイトカインまたはエンドトキシ ンにより活性化された場合、内皮(下)細胞(Weissら、1989)または特定の血液細 胞(Warrら、1990)のいずれかによってTFは血液に曝される。次いで、TFは、正常 な状態においては低濃度で血液中を循環するVIIa因子(Wildgooseら、1992)と複 合体を形成し、そして、このTF/VIIa因子複合体は、Ｘ因子のXa因子への活性化 によって、凝固カスケードを開始する。カスケードによって、最終的に、フィブ リンが形成される。 この連続する事象が起こるために、TF:VIIa複合体は、リン脂質表面と結合し なければならす、この表面にはIXまたはＸ因子を有する凝固開始複合体が会合し 得る(Rufら、1991；Paborskyら、1991；Bachら、1986)。この理由のために、遺 伝子を短縮することによって貫膜および細胞質領域を除去した短縮型TF(即ちtTF )は、天然TFのＸ因子の10万分の１の活性化活性を有する可溶性タンパク質であ る(Rufら、1991)。 (b)血餅形成因子(clotting Factors) トロンビン、第V/Va因子および誘導体、第VIII/VIIIa因子および誘導体、第IX /IXa因子および誘導体、第X/Xa因子および誘導体、第XI/XIa因子および誘導体、 第XII/XIIa因子および誘導体、第XIII/XIIIa因子および誘導体、第Ｘ因子活性化 因子および第Ｖ因子活性化因子もまた、本発明に使用され得る。 (c)ヘビ毒コアギュラント ラッセルクサリヘビ蛇毒が凝固タンパク質を含有することは、Williamsおよび Esnoufによって1962年に明らかにされた。Kisiel(1979)は、第Ｖ因子を活性化す るヘビ毒糖タンパク質を単離し、Di Scipioら(1977)は、その毒からのプロテア ーゼがヒト第Ｘ因子を活性化することを明らかにした。この第Ｘ因子活性化因子 は、本発明において使用することが意図された成分である。 ラッセルクサリヘビ蛇毒中に存在する第Ｘ因子活性化因子に特異的なモノクロ ーナル抗体(例えば、Pukrittayakameeら、1983、のMP1)もまた生成されており、 人体内の特異的標的部位に薬剤を送達するために用いられ得る。 (d)プロスタグランジンおよび合成酵素 トロンボキサンＡ2は、内因性の過酸化物(endoperoxides)から、血小板ミクロ ソーム内の酵素シクロオキシゲナーゼおよびトロンボキサンシンテターゼの連続 的作用によって形成される。トロンボキサンＡ2は、血小板によって容易に生成 され、そして、強力な血管収縮因子であり、血小板の凝集を起こし得る(Whittle ら、1981)。 トロンボキサンＡ2およびその活性類似体の両方は、本発明において使用する ことが意図されている。トロンボキサンＡ2生成のための合成プロトコルは、Bha gwatら(1985)に記載されている。Ohuchidaら(1981)によって記載されたトロンボ キサンＡ2類似体(特に化合物２)は、本発明に使用することが特に意図されてい る。 トロンボキサンシンターゼ、および血小板を活性化するプロスタグランジンを 合成する他の酵素もまた、本発明において「コアギュラント」として用いられ得 る。ShenおよびTai(1986a;b)は、トロンボキサンシンターゼのモノクローナル抗 体および免疫アフィニティー精製を記載し；また、Wangら(1991)は、ヒトトロン ボキサンシンターゼのためのcDNAを報告している。 (e)フィブリン溶解の阻害剤 α２抗プラスミン、すなわちα２プラスミン阻害剤は、ヒトの血漿に天然に存 在するプロテナーゼ阻害剤であり、プラスミノーゲン活性化因子によって誘導さ れるフィブリン塊(clots)の溶解を効果的に阻害する機能を果たす(Moroi & Aoki 、1976)。α２抗プラスミンは、特に強力な阻害剤であり、本発明において使用 することが意図されている。 α２抗プラスミンは精製され得るが、これは最初にMoroi & Aoki(1976)に記載 されている。他の精製スキームもまた用いられ得る。例えば、プラスミノーゲン セファロース上でのアフィニティークロマトグラフィー、DEAEセファデックス上 でのイオン交換クロマトグラフィー、およびコンカナバリンＡセファロース上で のクロマトグラフィーを行う；あるいは、プラスミンＡ鎖(LBSI)内の３つのＮ末 端三重ループ構造を含有するエラスターゼ消化(elastase-digested)プラスミノ ーゲン処方剤(formulation)を有するセファロースカラム上でのアフィニティー クロマトグラフィーを行い、次いでゲル濾過を行う(それぞれ、Wiman & Collen 、1977；Wiman、1980)、などである。 α２抗プラスミンのcDNA配列(Toneら、1977)が利用できるので、α２抗プラス ミン生成の好適な方法は、組換え発現による。 α２抗プラスミンに対するモノクローナル抗体もまた利用でき、本発明の二重 特異性結合リガンドの実施態様として使用され得る。例えば、Hatteyら(1987)は 、α２抗プラスミンに対する２つのMAb、MPW2APおよびMPW3APを記載した。これ らのMAbのそれぞれは、同等に良好に、天然のα２抗プラスミンと反応すること が報告されているので、それら両方が、外因性のα２抗プラスミンを標的部位に 送達するため、あるいは内因性のα２抗プラスミンを蓄積してそれを標的領域内 に濃縮するために使用され得る。Mimuroおよび共同研究者によって記載されたJT PI-2などの他の抗体もまた使用され得る。 ２．凝固因子を結合する薬剤 本発明の他の群の二重特異性凝固リガンドは、標的化領域が凝固因子に直接連 結されるのではなく、凝固因子に結合する第２結合領域に連結される。 第２結合領域を用いて凝固因子を結合および送達する場合、その結合領域は、 凝固誘導能力を大きく損なわないような凝固因子上の部位を認識するように選択 される。このような結合に適した凝固因子の領域は、前のセクションに記載した ように、標的化領域への共有結合に適した領域と、一般的に同じである。 しかし、このクラスの二重特異性リガンドは、腫瘍部位あるいは領域への送達 の後に、凝固因子を放出することが予想され得るため、第２結合薬剤あるいは抗 体への結合に適した凝固因子の領域には、より大きな柔軟性がある。また別の利 点は、二重特異性抗体が、tTF注入の前に予め局在化され得ることであり、これ は、必要なtTFの量、ひいては毒性を低減し得る。 この方法での使用に適切な第２結合領域は、一般的に、凝固因子に対する結合 特異性を有する抗体の抗原結合部位であり、scFv、Fv、Fab'、FabおよびF(ab')2 フラグメントなどの抗体の機能性部分を含む。 組織因子、トロンビン、プレカリクレイン(prekallikein)、第V/Va因子、第VI II/VIIIa因子、第IX/IXa因子、第X/Xa因子、第XI/XIa因子、第XII/XIIa因子、第 XIII/XIIIa因子、ラッセルクサリヘビ蛇毒、トロンボキサンＡ2またはα２抗プ ラスミンに対する抗体あるいはそのフラグメントを含有する二重特異性結合リガ ンドは、本発明のこの局面の実施態様の例示である。 Ｃ．連結手段 第１標的化領域および第２凝固領域は、作動可能に連結され、これにより、各 領域が、重大な障害を伴わずに、意図された機能を果たすことが可能になる。こ のように、標的化領域は、腫瘍環境標的の範囲から選択されるように、意図され た標的に結合することが可能であり、また、凝固領域は、直接的または間接的に 、例えば結合した因子の放出によって、血液凝固あるいは血餅形成を促進するこ とが可能である。 標的化領域結合機能を評価するために必要とされることは、二重特異性リガン ドが依然として、複合体を形成していない第１結合領域と実質的に同じ方法で、 標的化された成分に結合することを確かめるために、結合アッセイを行うことで ある。適切な結合アッセイは、通常用いられるタイプのアッセイであり、第１標 的化領域が抗体である免疫学的な結合アッセイ、および／または他の生化学的な 結合アッセイであり、例えば、125ヨウ素標識されたタンパク質または他の放射 標 識された成分を用いてリガンド−レセプター結合を評価し、スキャッチャードプ ロットを生成するようなアッセイである。 このようなアッセイにおける標的抗原あるいは標的成分は、天然または組み換 え体供給源から精製されるタンパク質、膜濃縮調製物、無傷の(intact)細胞およ び組織切片を含む数多くの形態で提供され得る。一般に、タンパク質組成物が使 用される場合、それらは、マイクロタイタープレート、膜、などの固体の支持体 に、あるいは、カラムマトリクスにさえ固定される。また、生理学的標的を反映 する標的組成物を使用するのが一般的に好ましく、標的が通常、細胞関連である ので、組織および細胞自体を含む無傷の細胞を含む組成物の使用もまた好ましい 。 二重特異性複合体の機能性結合の確認に用いられる種々の免疫学的アッセイは 、例えば、ウエスタンブロッティング、ELISA、固定細胞を用いたELISA、免疫組 織化学、および蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)を含む。このようなアッセイ の全ての実施は、一般に、当業者には公知であり、本明細書でさらに開示される 。 上記または他の結合アッセイのいずれにおいても、二重特異性化合物の標的化 領域結合機能の評価は容易なことであり、二重特異性リガンドと、複合化してい ない第１結合領域とは、通常、比較を容易にするために、同じ条件下で平行して アッセイに供される。効果的な二重特異性リガンドは、大きな障害を伴わずに、 つまり、複合化していない第１結合領域と実質的に同じ様に、標的に結合する。 複合化していない結合領域アッセイの結果を100%の基準値とすると、本明細書の 用語、二重特異性リガンドの「実質的な結合」とは、二重特異性リガンドが少な くとも約50%の結合、より好ましくは、約50%から約80%の間の結合、さらに、最 も好ましくは、約80%から約100%の間の結合を示すことを意味する。 二重特異性リガンドが、コアギュラントに結合する第２結合領域を含む場合、 例えば、二重特異性抗体である場合、さらに有用なアッセイは、二重特異性リガ ンドの両方のアームの結合機能が同時に評価できるタイプのものである。これは 、例えば、二重特異性リガンドまたは抗体との架橋を介する、放射標識されたコ アギュラントの標的細胞への結合を評価することによって達成される。このよう なアッセイは、B21-2/10H10二重特異性抗体を用いた、tTFの標的細胞への結合に よって例示され、実施例IIに記載されている。 二重特異性リガンドの凝固剤機能を決定することもまた、容易なことである。 ここで必要とされることは、二重特異性リガンドを用いた凝固アッセイを行い、 それが、複合化していない凝固剤と実質的に同じ方法で、凝固を促進する機能を 果たすことを確かめることである。このことは、それら自体が共に凝固因子であ る「凝固剤」、および凝固因子に結合する第２結合領域であるものについて当て はまる。当然、後者の場合、第２結合領域への結合を可能にするために、二重特 異性リガンドは、in vitroあるいはex vivoアッセイにおいて凝固因子と予め複 合化される。 １つの適切な凝固アッセイは、必要に応じて予めコアギュラントと複合化され る二重特異性リガンドが、血漿サンプルと混合される。このアッセイにおいては 、フィブリンストランドの出現が凝固を示す。したがって、効果的な二重特異性 リガンドは、フィブリンストランドが出現するまでの時間を短縮し、特に、コン トロールのレベルと比較して経過時間を有意に短縮することが期待される。 上記アッセイの改変例は、まず、適切な標的細胞を有効な条件下および十分な 時間、二重特異性リガンドにさらして結合させること、非特異的に結合した成分 を除去するために細胞を洗浄すること、次いで、洗浄された細胞を血漿内で再懸 濁することを包含する。このアッセイでは、二重特異性リガンドで効果的にコー ティングされた細胞のみが、フィブリンストランドが出現するまでの時間を短縮 すると期待される。このタイプのアッセイは、それ自体が二重特異性構築物の機 能の両方、即ち、細胞の初期標的化、およびその後の局在化された凝固を評価す るアッセイである点で好ましい。 二重特異性化合物の凝固機能を、複合化していない凝固剤のそれと比較するた めには、再び、平行したアッセイが行われる。効果的な二重特異性リガンドは、 大きな障害を伴わずに、凝固を促進する機能を果たす、つまり、複合化していな い凝固剤と実質的に同じ様に機能する。複合化していないコアギュラントアッセ イの結果を100%の基準値とすると、本明細書の用語「実質的な機能」とは、二重 特異性リガンドが少なくとも約50%の凝固、より好ましくは、約50%から約80%の 間の凝固、さらに、最も好ましくは、約80%から約100%の間の凝固を示すことを 意味する。 二重特異性リガンドの２つの機能性領域は合成化学技術あるいは組み換えDNA 技術を用いて連結され得る。これらの技術のそれぞれは、通常採用され、当業者 には周知であり、実施例Ｉにおいて、また、以下の詳細な説明によってさらに例 示される。 １．生化学的架橋剤(cross-linker) 一般に、抗体または他の標的化成分の凝固剤への結合には、イムノトキシンの 調製のために開発されたものと同じ技術が適用される。しかし、生理学的に用い られるようになる特定の量の複合化していない凝固剤が、特に厳密なものを意図 しないゆえに、本技術に相当な利点があることは明らかである。このように、い かなる架橋剤の安定性要件も、イムノトキシンなどの他の構築物に採用されるリ ンカー程厳密ではない。したがって、イムノトキシンにおける使用に適したあら ゆる架橋剤もまた本発明において使用できることが、一般的なガイドラインとし て考慮され得、そして、さらなるリンカーもまた考慮され得る。 トキシンに加えて、他の様々な化学療法および薬理学的な薬剤が抗体に連結さ れ、薬理学的に機能することが明らかになっている接合体が形成されている(例 えば、Vaickusら、1991、参照)。調査された抗腫瘍性薬剤の例は、ドキソルビシ ン、ダウノマイシン、メトトレキセート、およびビンブラスチンその他を含む(D illmanら、1988；Pieterszら、1988)。また、ネオカルチノスタチン(Kimuraら、 1983)、マクロマイシン(macromycin)(Manabeら、1984)、トレニモン(trenimon)( Ghose、1982)およびαアマニチン(α-amanitin)(Davis & Preston、1981)などの 他の薬剤の結合が記載されている。上記科学論文のそれぞれに記載される連結技 術もまた、本発明に関連して使用することが意図されている。 架橋試薬を用いて２つの異なる分子の官能基、例えば結合および凝固剤を互い に結びつける分子架橋が形成される。２つの異なるタンパク質を段階的に連結す るために、望ましくないホモポリマーの形成を排除するヘテロ２機能性架橋剤が 用いられ得る(表VI)。 例示的なヘテロ二官能性架橋剤は２つの反応基を含む：一方は一級アミン基（ 例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、他方はチオール基（例えば、 ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する。架橋剤は、一 級アミン反応基を介して、一方のタンパク質（例えば、選択された抗体またはフ ラグメント）のリジン残基（単数または複数）と反応し得、そして既に第１のタ ンパク質に結合した架橋剤は、チオール反応基を介して、他方のタンパク質（例 えば、コアギュラント）のシステイン残基（遊離メルカプト基）と反応する。 従って、好適なコアギュラントまたは凝固結合領域は、一般には、架橋のため に利用可能な官能基を有するか、または有するように誘導体化されることが理解 され得る。この要件により、広範囲な基をこの様式で用い得ることが制限される とは考えられない。例えば、一級または二級アミン基、ヒドラジド基またはヒド ラジン基、カルボキシルアルコール基、リン酸基、もしくはアルキル化基が、結 合または架橋のために用いられ得る。連結技術の概略については、Ghose & Blai r(1987)を参照のこと。 架橋剤の２つの反応基の間のスペーサーアーム(spacer arm)は様々な長さおよ び化学組成を有し得る。スペーサーアームが長いほど、接合成分の柔軟性(flexi bility)が良好になり、一方、ブリッジのいくつかの特定の成分（例えば、ベン ゼン基）により、反応基に安定性の増加がもたらされるか、または様々な局面の 作用に対する化学結合の耐性（例えば、還元剤に対するジスルフィド結合の耐性 ）の増加がもたらされ得る。L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Alaのようなペプチドスペー サーの使用もまた意図される。 血液中で適切な安定性を有する架橋剤を用いるのが好ましい。標的化剤および 凝固剤を接合するためにうまく用いられ得る数多くのタイプのジスルフィド結合 含有結合剤が知られている。立体的に障害をもつジスルフィド結合を含む結合剤 は、インビボにおいてより高い安定性を示し、これにより作用部位での結合前に コアギュラントが放出されるのを防止し得ることが分かる。従って、このような 結合剤は、結合剤１つの好適なグループである。 イムノトキシンで使用するのに最も好適な架橋剤の１つはSMPTである。SMPTは 、隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体障害をもつ」ジスルフィド 結 合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織およ び血液中に存在し得るグルタチオンのようなチオレートアニオンによる攻撃から 結合を保護する機能を有し、これにより、結合した薬剤が腫瘍部位に送達される 前に接合体が分離するのを防ぐのを補助すると考えられる。SMPT薬剤もまた、本 発明の二重特異性凝固リガンドと共に用いられ得ることが意図される。 多くの既知の他の架橋剤と同様に、SMPT架橋剤は、システインのSHまたは一級 アミンのような官能基（例えば、リジンのεアミノ基）を架橋する能力を有する 。別の可能なタイプの架橋剤としては、スルホスクシンイミジル-2-(p-アジドサ リチルアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネートのような切断可能なジスルフ ィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが挙げられる。N-ヒ ドロキシ-スクシンイミジル基は一級アミノ基と反応し、フェニルアジドは（光 分解の際に）非選択的に任意のアミノ酸残基と反応する。 立体障害をもつ架橋剤に加えて、立体障害をもたない結合剤もまた本発明にお いて使用され得る。保護されたジスルフィドを含有または生成するとは考えられ ない他の有用な架橋剤としては、SATA、SPDP、および2-イミノチオラン(Wawrzyn czak & Thorpe，1987)がある。このような架橋剤の使用は当該分野では充分理解 されている。 ひとたび接合体化されると、二重特異性薬剤は通常は精製され、未接合体化標 的化剤またはコアギュラントおよび他の混入物質から接合体が分離される。未接 合標的化剤を取り除いて、接合体化種と未接合体化種との間で抗原をめぐる競合 が起こる可能性を防ぐことが重要である。充分な純度を有する接合体を提供して これらを臨床的に有用にする際に、多くの精製技術が利用可能である。ゲル濾過 、ゲル透析または高速液体クロマトグラフィーのような、サイズ分離に基づく精 製方法が一般に最も有用である。Blue-Sepharose分離のような他のクロマトグラ フィー技術もまた用いられ得る。 ２．組換え融合タンパク質 本発明の二重特異性標的コアギュラントはまた、分子生物学技術によって調製 される融合タンパク質であり得る。このような目的を達成するために組換えDNA 技術を用いることは、現在では当業者にとって通常の作業である。このような方 法としては、例えば、インビトロにおける組換えDNA法、合成技術、およびイン ビボにおける組換え／遺伝子組換えがある。さらに、DNAおよびRNA合成は、自動 合成機を用いて行い得る（例えば、Sambrookら、1989；およびAusubelら、1989 に記載されている技術を参照）。 一般に、融合タンパク質を調製するためには、結合リガンドまたは他の標的化 領域をコードする遺伝子またはcDNAのようなDNAコード領域を、凝固因子または 凝固結合領域をコードするDNAコード領域（すなわち、遺伝子またはcDNA）に結 合させる。これは、代表的には、凝固因子をコードする第２DNAセグメントに作 動可能に連結した第１結合領域をコードする第１DNAセグメントを、同じリーデ ィングフレーム内に含む発現ベクターを調製する工程を包含する。配列は、核酸 全体を翻訳すると本発明の所望の二重特異性化合物が得られるような方法で結合 する。発現ベクターは、挿入されたDNA領域より上流側に、DNAの転写を促進し、 これによりコードされる組換えタンパク質の発現を促進するように作用する１つ またはそれ以上のプロモーターを含む。これが「組換え発現」の意味である。 特定の結合領域またはコアギュラントが好適であるが、コードDNAが直ちに利 用できない場合は、これは、所望のタンパク質をコードするDNA分子をDNAライブ ラリー（例えば、cDNAまたはゲノムライブラリー）から得る「分子クローニング 」の技術を用いて得られ得る。このような手順では、適切なDNAライブラリーが 、例えば、タンパク質に対する抗体を用いる発現スクリーニングプロトコル、ま たは活性アッセイを用いてスクリーニングされる。もしくは、スクリーニングは 、タンパク質のアミノ酸配列部分を考慮して、または関連タンパク質をコードす る遺伝子のDNA配列から設計されたオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイ ゼーションに基づいてもよい。このようなスクリーニングプロトコルの操作は当 業者には周知であり、科学文献、例えば、Sambrookら(1989)に詳細に記載されて いる。 組換えDNA技術により産生されるときは、本発明の標的化剤／凝固剤化合物は 「融合タンパク質」と呼ばれる。このような融合タンパク質は、少なくとも、本 発明で定義される標的化剤および凝固剤を含み、そしてこれらの薬剤は作動可能 に結合されることが理解される。融合タンパク質はまた、得られる融合タンパク 質の標的化または凝固活性にある程度の影響を与えない限り、標的化剤および凝 固剤化合物を作動可能に連結するペプチドスペーサーのようなさらなるペプチド 配列を含み得る。 組換え二重特異性タンパク質リガンドは、いわゆる天然に産生されたタンパク 質を化学的に架橋することによって生成される二重特異性構築物とは異なり得る 。特に、例えば、グリコシル化およびリン酸化のような翻訳後の修飾の程度は、 同じ２つのタンパク質の組換え融合体と化学的融合体との間で異なり得る。これ は重大な問題であるとはみなされないが、当業者であれば、臨床設定で使用する 前に、組換え融合タンパク質が、意図したように、そして他のデータから想定さ れるように機能するかどうかを確認し得る。 組換え発現の１つの利点は、結合領域を、例えばその長さおよび／またはアミ ノ酸組成が容易に変動し得るように容易に操作し得ることである。所望であれば 、本発明の２つの薬剤を作動可能に連結するために、切断不能なペプチドスペー サーが提供され得る。同様に、固有の切断部位を有するペプチドを２つの化合物 の間に挿入し得る。 特定の場合、所望であれば、ジスルフィド結合ループ構造に折り畳み得る、標 的化剤および凝固剤を作動可能に連結するペプチドスペーサーを提供することが 可能である。ループ内のタンパク質分解性切断により、標的化剤と凝固剤とが単 一のジスルフィド結合のみによって連結されているヘテロ二量体ポリペプチドが 生成される（例えば、Lordら、1992参照）。 様々な宿主発現系でタンパク質の発現を実現するために、適切な核酸および転 写／翻訳制御配列を含む発現ベクターを構築するための多くの標準的な技術が利 用可能である。発現に利用し得る細胞型としては、標的化剤／凝固剤コード化配 列を含有する、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDN A発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば、大腸菌、B．subtilis）；標 的化剤／凝固剤コード配列を含む組換え酵母発現ベクターにより形質転換された 酵母（例えば、Saccharomyces、Pichia）；標的化剤／凝固剤コード配列を含む 組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）を感染させた昆虫細 胞系；組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルスCa MV；タバコモザイクウィルスTMV）を感染させた、または標的化剤／凝固剤コー ド配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）により形 質転換された植物細胞系；および哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例え ば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳類ウィルス由来のプロモータ ー（例えば、アデノウィルス後期プロモーター；ワクシニアウィルス7.5Kプロモ ーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳類細胞系（例えば、COS、CHO、BH K、293、3T3）のような微生物があるが、これらに限定されない。 細菌系では、発現される標的化剤／凝固剤構築物について意図される用途に応 じて、多くの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、多量の二重特異性薬 剤を産生する場合は、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を 指向するベクターが望ましい。このようなベクターとしては、標的化剤／凝固剤 コード配列が、lac zコード領域を有するベクターのフレーム内に個別に連結さ れ得、これによりlac Z産物部分をさらに含む融合タンパク質が提供される、大 腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら、1983）；pINベクター（Inouyeら、1985；V an Heekeら、1989）などがあるが、これらに限定されない。pGEXベクターは、標 的化剤／凝固剤の組み合わせのような外来ポリペプチドを、グルタチオンS-トラ ンスフェラーゼ(GST)をさらに含む融合タンパク質として発現するためにも用い られ得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン- アガロースビーズへの吸着およびこの後の遊離グルタチオンの存在下での溶出に よって、溶解した細胞から容易に精製され得る。pGEXベクターはトロンビンまた は第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、これにより融合タンパ ク質全体の中の結合剤／凝固タンパク質がGST部分から放出され得る。 １つの有用な昆虫系では、Autograph californica核多角体病ウィルス(AcNPV) が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。このウィルスは、 Spodoptera frugiperda細胞内で増殖する。標的化剤／凝固剤コード配列は、ウ ィルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化され、AcNPV プロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。 二重特異性リガンドコード配列を首尾良く挿入することによって、ポリヘドリン 遺伝子が不活性となり、非閉塞(non-occluded)組換えウィルス（例えば、ポリヘ ドリン遺伝子によってコードされるタンパク質コートを欠いたウィルス）が産生 される。このような組換えウィルスは、次に、挿入した遺伝子を発現させるSpod optera frugiperda細胞を感染させるために用いられる（例えば、Smithら、1983 ；*Smithの米国特許第4,215,051号参照）。 哺乳類宿主細胞では、多数のウィルスベースの発現系が利用され得る。アデノ ウィルスを発現ベクターとして用いる場合は、標的化剤／凝固剤コード配列を、 アデノウィルス転写／翻訳制御接合体（例えば、後期プロモーターおよび三部分 (tripartite)リーダー配列）に連結し得る。このキメラ遺伝子は、次に、インビ トロにおけるまたはインビボにおける組換えによってアデノウィルスゲノムに挿 入され得る。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1またはE3）への挿入 により、生存能力があり、感染宿主内に二重特異性タンパク質を発現し得る組換 えウィルスが得られる（例えば、Loganら、1984参照）。 挿入された標的化剤／凝固剤コード配列を効率的に翻訳するためには、特異的 な開始シグナルもまた必要であり得る。このようなシグナルは、ATG開始コドン および隣接する配列を含む。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを さらに備える必要があり得る。当業者であれば容易にこれを決定し、必要なシグ ナルを備え得る。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望の コード配列のリーディングフレームと同調（すなわちインフレーム）していなけ ればならないことは周知である。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コ ドンは、天然および合成を問わず多様な起源から得られ得る。適切な転写エンハ ンサー要素、転写ターミネーターなどを加えることによって、発現効率が増強さ れ得る（Bittnerら、1987参照）。 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特異 的な様式で修飾およびプロセスする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物 のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切 断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。宿主細胞はそれぞれ、タン パク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有 する。発現された外来タンパク質の適切な修飾およびプロセッシングを確実にす るために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的のために、遺伝 子産物の一次転写、グリコシル化、およびリン酸化の適切な処理のための細胞機 構を有する真核生物宿主細胞が用いられ得る。このような哺乳類宿主細胞として は、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などがあるが、これら に限定されない。 組換えタンパク質を長期にわたり高収量で産生するためには、安定した発現が 好ましい。例えば、標的化剤／凝固リガンドをコードする構築物を安定して発現 する細胞株が設計され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよ りむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハン サー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御され る標的化剤／凝固剤DNAおよび選択マーカーにより形質転換され得る。外来DNAの 導入後、設計された細胞を富養培地で１〜２日増殖させ、次に選択培地に置き換 える。組換えプラスミド中の選択マーカーによりこの選択に対する耐性が付与さ れ、細胞がそれぞれの染色体にプラスミドを安定して組み込み、増殖してフォー カスを形成し、これが次にクローン化され、拡大されて細胞株となり得る。 ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977）、ヒポキサンチン -グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalskaら、1962）、およびア デニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowyら、1980）を含むがこれ らに限定されない多くの選択系が用いられ得、これらはそれぞれ、tk-、hgprt- 、またはaprt-細胞で用いられ得る。また、メトトレキセートに対する耐性を付 与するdhfr（Wiglerら、1980；O'Hareら、1981）；ミコフェノール酸に対する耐 性を付与するgpt（Mulliganら、1981）；アミノグリコシドG-418に対する耐性を 付与するneo（Colberre-Garapinら、1981）；およびヒグロマイシンに対する耐 性を付与するhygro（Santerreら、1984）の選択の基礎として、代謝拮抗物質耐 性が用いられ得る。 Ｄ．抗体 抗体が二重特異性リガンドの一方または両方の一部として用いられる場合、抗 体の選択は、一般に腫瘍のタイプおよび選択される凝固リガンドに依存する。し かし、ある有利点は、特定のタイプの抗体の適用により達成され得る。例えば、 IgGベースの抗体は、そのFab'対応物よりも良好な結合能力および遅い血中クリ アランスを示すことが予測され得るが、Fab'フラグメントベースの組成物は、一 般に、良好な組織浸透能力を示す。 １．モノクローナル抗体 抗体を調製し特徴付けする手段は当業者に周知である（例えば、*Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988）。 モノクローナル抗体（MAb）を生成する方法は、一般に、ポリクローナル抗体 を調製するための方針と同じ方針に沿って始める。簡単にいえば、ポリクローナ ル抗体は、動物を、用いられている抗原組成物およびプロトコル（例えば、正常 細胞集団に寛容になり、次いで腫瘍細胞集団で免疫すること）に依存して、免疫 寛容前または免疫寛容前でないいずれかに、本発明に従って免疫原性組成物で免 疫し、そして免疫された動物から抗血清を回収することにより、調製される。広 範な動物種が抗血清の生成に用いられ得る。代表的には、抗-抗血清の生成に用 いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤ ギである。ウサギの血液量が比較的大量であるため、ウサギはポリクローナル抗 体の生成のための好適な選択である。 当該分野で周知のように、所定の組成物はその免疫原性が変化し得る。従って 、宿主の免疫系をブーストすることがしばしば必要であり、これはペプチドまた はポリペプチド免疫原をキャリアに結合することにより達成され得る。代表的か つ好適なキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびウシ血清 アルブミン（BSA）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウ サギ血清アルブミンのような他のアルブミンもまた、キャリアとして用いられ得 る。ポリペプチドをキャリアタンパク質に結合する手段は当該分野において周知 であり、そしてグルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル(maleimidobencoy l)-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド(carbodiimyde)、お よびビス-ジアゾ化ベンジジン(bis-diazotized)を含む。 当該分野においてまた周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジ ュバントのような公知の免疫応答の非特異的刺激剤の使用により増強され得る。 代表的かつ好適なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅My cobacterium tuberculosisを含む免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロイン トアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。 ポリクローナル抗体の産生に用いられる免疫原組成物の量は、免疫原の性質な らびに免疫に用いられる動物によって変化する。種々の経路が免疫原の投与に用 いられ得る（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）。ポリクローナル抗 体の産生は、免疫後の種々の時点で免疫された動物の血液をサンプリングするこ とによりモニターされ得る。第二に、追加接種もまた与えられ得る。追加免疫お よび力価検定のプロセスは、適切な力価が達成されるまで繰り返され得る。所望 の力価レベルが得られると、免疫された動物を出血させ得、そして血清を単離し て保存し、および／または動物をMAbを生成するために用い得る。 MAbは、*米国特許第4,196,265号（本明細書中に参考として援用される）に例 示されるように、周知の技法の使用により容易に調製され得る。代表的には、こ の技法は、選択された免疫原組成物（例えば、精製または部分精製腫瘍細胞ある いは血管内皮細胞タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または完全な細胞組成 物）で適切な動物を免疫することを包含する。免疫する組成物は、抗体産生細胞 を刺激するために効果的な様式で投与される。マウスおよびラットのような齧歯 類は好適な動物であるが、ウサギ、ヒツジ蹄叉細胞の使用もまた可能である。ラ ットの使用はある有利点を提供し得る（*Goding、1986、60-61頁）が、マウスが 好適であり、BALB/cマウスが最も好適であり、これは最も日常的に用いられ、そ して一般に、より高い割合の安定な融合を生じる。 免疫後、抗体産生能力のある体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）が、MAb生成 プロトコルにおける使用について選択される。これらの細胞は、生検された脾臓 、扁桃腺、またはリンパ節から、あるいは末梢血サンプルから得られ得る。脾臓 細胞および末梢血細胞が好適であり、前者は、分裂形質芽球期における抗体産生 細胞の豊富な供給源であるためであり、そして後者は末梢血が容易に入手し可能 であるからである。時折、パネルの動物が免疫され、そして最高の抗体力価を有 する動物の脾臓が取り出され、そして脾臓リンパ球が脾臓をシリンジでホモジナ イズすることにより得られている。代表的には、免疫されたマウス由来の脾臓は 、約５×107〜２×108のリンパ球を含む。 免疫された動物由来の抗体産生Ｂリンパ球は、次いで、不死化ミエローマ細胞 の細胞、一般に免疫された動物と同種の細胞、と融合される。好適には、ハイブ リドーマ産生融合手順に使用するために適したミエローマ細胞株は非抗体産生で あり、高い融合効率、および次いで、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの 増殖を支持するある選択培地中での増殖を不可能にする酵素欠損を有する。 多くのミエローマ細胞の任意の１つが、当業者に知られているように用いられ 得る（*Goding，65-66頁、1986；*Campbell、75-83頁、1984）。例えば、免疫さ れた動物がマウスである場合、P3-X63-/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag４１、Sp21 0-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7、およびS194/5XX0 Bulを使用 し得；ラットについては、R210.RCY.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F、4B210、また は上記に挙げたマウス細胞株の１つを使用し得；そして、U-266、GM1500-GRG2、 LICR-LON-HMy2、およびUC729-6はヒト細胞融合と関連して全て有用である。 １つの好ましいマウスミエローマ細胞はA63-A68、653ミエローマ細胞株であり 、これはATCCから容易に入手可能である。用いられ得る別のマウスミエローマ細 胞株は、8-アザグアニン耐性マウスミエローマSP2/0非産生細胞株である。 抗体産生脾臓細胞またはリンパ節細胞とミエローマ細胞とのハイブリッドを生 成する方法は、通常、体細胞をミエローマ細胞と４：１の割合で混合する工程を 包含するが、この割合は、細胞膜の融合を促進する１つの薬剤または複数の薬剤 （化学物質または電気的物質）の存在下、それぞれ約20：１〜約１：１まで変化 し得る。Sendaiウイルスを用いる融合方法は、KohlerおよびMilstein（1975；19 76）に記載されており、そして37％(v/v)PEGのようなポリエチレングリコール（ PEG）を用いる方法がGefterら（1977）により記載されている。電気的に誘導さ れる融合方法の使用もまた適切である（*Goding，71-74頁、1986）。 融合手順は、通常、低い頻度、約１×10-6〜１×10-8で生存可能なハイブリッ ドを産生する。しかし、これは、選択培地中で培養することにより、生存可能な 融合されたハイブリッドが親の非融合細胞（特に正常には無限に分裂し続ける非 融合ミエローマ細胞）から分化されるような問題を提起しない。この選択培地は 、一般に、組織培養培地でヌクレオチドの新規合成をブロックする薬剤を含む培 地である。代表的かつ好適な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、およ びアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリンおよび ピ リミジンの両方の新規合成をブロックするが、アザセリンはプリン合成のみをブ ロックする。アミノプテリンまたはメトトレキセートが用いられる場合、培地に ヌクレオチド供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンが補充される（HAT培 地）。アザセリンが用いられる場合、培地にヒポキサンチンが補充される。 好適な選択培地はHATである。ヌクレオチドサルベージ経路の操作可能な細胞 のみが、HAT培地中で生存し得る。ミエローマ細胞はサルベージ経路の重要な酵 素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT））が欠 損しており、そしてそれらは生存し得ない。Ｂ細胞はこの経路を操作し得るが、 培養物中での生存期間が限定されており、一般に、約２週間以内に死滅する。従 って、選択培地中で生存し得る細胞のみがミエローマおよびＢ細胞から形成され るハイブリッドである。 この培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの群を提供す る。代表的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートで単一の クローンの希釈により細胞を培養すること、次いで所望の反応性について（約２ 〜３週後）個々のクローン上清を試験することにより行われる。このアッセイは 、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞障害性アッセイ、プ ラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどのように、感度が高く、簡単、か つ迅速であるべきである。 次いで、選択されたハイブリドーマは連続希釈され、そして個々の抗体産生細 胞株中にクローニングされ、次いで、このクローンは、MAbを提供するために無 限に増殖され得る。この細胞株は、MAb産生のために２つの基本的な方法で利用 され得る。ハイブリドーマのサンプルは、最初の融合用の体細胞およびミエロー マ細胞を提供するために用いられたタイプの組織適合性動物に（しばしば腹腔に ）注入され得る。注入された動物は、融合された細胞ハイブリッドにより産生さ れる特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。次いで、この動物の 体液（例えば、血清または腹水）は、高濃度でMAbを提供するために採取され得 る。個々の細胞株はまたインビトロで培養され得、ここではMAbが高濃度で容易 に得られ得る培養培地中に自然に分泌される。いずれかの手段により産生される MAbは、所望であれば、濾過、遠心分離、および種々のクロマトグラフ法（例 えば、HPLCまたはアフィニティークロマトグラフィー）を用いてさらに精製され 得る。 発明者らはまた、モノクローナル抗体を生成するために分子クローニングアプ ローチを使用することを意図する。このために、組み合わせ免疫グロブリンファ ージミドライブラリーは、免疫された動物の脾臓から単離されるRNAから調製さ れ、そして適切な抗体を発現するファージミドは、抗原を発現する細胞およびコ ントロール細胞（例えば、正常細胞対腫瘍細胞）を用いてパンニングすることに より選択される。このアプローチが従来のハイブリドーマ技術よりも有利な点は 、１ラウンドで約104倍多くの抗体が産生およびスクリーニングされ得ること、 および、ＨおよびＬ鎖の組み合わせにより新しい特異性が生じることであり、こ のことは適切な抗体を見出す機会をさらに増加させる。 本発明でMAbを用いる場合、これは、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスタ ー、ニワトリ、またはさらにウサギ起源であり得る。本発明は、ヒト抗体、ヒト 定常および／または可変領域ドメインを有するマウス、ラット、または他の種由 来の「ヒト化」またはキメラ抗体、および他の組換え抗体ならびにこれらのフラ グメントの使用を意図する。もちろん、調製の容易さおよび試薬の迅速な入手可 能性のため、代表的にはマウスモノクローナル抗体が好ましい。 ２．機能的抗体結合領域 標的化剤抗体または抗体フラグメント（例えば、Fab'、Fab、F(ab')2、Fvまた はscFv）の起源または由来は、二重特異性リガンドの調製に実際に用いられる抗 体またはフラグメントが所望の結合特性を示す限りは、本発明の実施に特に重要 であるとは考えられない。 Fc部分が除去されている抗体調製物を使用する必要があり得る。免疫グロブリ ン分子のフラグメント化は、制御されたタンパク質分解により達成され得るが、 その条件は、種および免疫グロブリンクラスまたはサブクラスによりかなり変化 する。２価F(ab')2フラグメントは、通常、１価FabまたはFab'フラグメントより も好適である。 Fab Fabフラグメントは、非特異的チオールプロテアーゼであるパパインによる全 免疫グロブリンのタンパク質分解より得られ得る。パパインは、まず、システイ ン、2-メルカプトエタノール、またはジチオトレイトールを用いて活性部位にお けるスルフヒドリル（sulphydryl）基を還元することにより活性化されなければ ならない。ストック酵素中の重金属は、最大酵素活性を確実にするためにEDTA（ 2mM）を用いるキレート形成により除去すべきである。酵素および基質は、正常 には１：100の重量比で一緒に混合される。インキュベーション後、反応は、ヨ ードアセトアミドを用いるチオール基の不可逆的アルキル化によってまたは単に 透析によって停止され得る。消化の完全性はSDS-PAGEによりモニターされるべき であり、そして種々の画分は、プロテインＡ−セファロースまたはイオン交換ク ロマトグラフィーにより分離されるべきである。 F(ab')2 ウサギおよびヒト起源のIgGからのF(ab')2フラグメントを調製するための通常 の手順は、酵素ペプシン（プロトコル7.3.2）によるタンパク質分解により制限 される。条件（酢酸緩衝液中100×抗体過剰w/w、pH4.5、37℃）は、抗体が重鎖 間ジスルフィド結合のＣ末端側で切断されることを示唆する。マウスIgGの消化 速度はサブクラスによって変化し得、そしていくつかの未消化または完全に分解 されたIgGを含まない高収率の活性F(ab')2フラグメントを得ることは困難であり 得る。特に、IgG2bは完全な分解を非常に受けやすい。他のサブクラスは、最適 な結果を生じるために異なるインキュベーション条件を必要とする。 ペプシンによるラットIgGの消化は、0.1M 酢酸緩衝液、pH 4.5中での透析、お よび次いで１％w/wペプシンとの４時間のインキュベーションを包含する条件を 必要とし；IgG1およびIgG2aの消化は、最初に0.1M ギ酸緩衝液、pH 2.8に対して ４℃で16時間透析し、次いで酢酸緩衝液に対して透析する場合は改良される。Ig G2bでは、0.1M リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.8中、37℃にて４時間、スタフィ ロコッカスのV8プロテアーゼ（３%w/w）とインキュベーションすることによって さらに一貫した結果が得られる。 ３．二重特異性抗体 一般に、二重特異性抗体の調製もまた、Glennieら（1987）により例示される ように、当業者に周知である。二重特異性抗体は、例えば、ガン患者を処置する ために（Bauerら、1991）臨床的に用いられている。二重特異性抗体の調製の１ つの方法は、一方は標的された腫瘍細胞抗原および他方は凝固剤（または活性化 抗原のような他の所望の標的）に特異性を有する抗体の別個の調製を包含する。 二重特異性抗体はまた、免疫療法剤としての使用のために特に開発されている 。抗原誘発とともに初期に述べられているように、これらの抗体のいくつかがリ ンパ球と腫瘍抗原とを架橋するために開発された（Nelson，1991；Segalら、199 2）。例としては、Ｔ細胞と、例えば、CD3において腫瘍抗原とを結合し、ならび に標的細胞に極めて接近してTCR/CD3複合体を物理的に架橋することによりリン パ球活性化を引き起こすキメラ分子を包含する（Staerzら、1985；Perezら、198 5；1986a；1986b；Tingら、1988）。 実際に、ガン腫、リンパ腫、白血病、およびメラノーマの腫瘍細胞は、Ｔ細胞 による二重特異性抗体媒介死滅を受けやすいことが報告されている（Nelson、19 91；Segalら、1992；deLeijら、1991）。これらのタイプの二重特異性抗体はま た、悪性の腫瘍標的に対していくつかの第Ｉ相臨床試験で用いられている。それ らは本発明によれば新規な組成物ではないが、二重特異性架橋抗体を本明細書に 記載される二重特異性凝固リガンドとともに組み合わせて使用することもまた意 図される。二重特異性架橋抗体は、参考文献（例えば、deLeijら（1991）；Clar kら（1991）；Rivoltiniら（1992）；Bolhuisら（1992）；およびNittaら（1990 ））に記載されるように投与され得る。 二重特異性抗体の調製について当該分野では多くの方法が公知であるが、Glen nieら（1987）の方法は、２つの選択された抗体からの消化性F(ab'γ)2フラグメ ントの調製、次いで別個のFab'γSHフラグメントを提供するためのそれぞれの還 元を包含する。結合されるべき２つのパートナーのうちの１つにおけるSH基は、 次いで、o-フェニレンジマレイミドのような架橋試薬でアルキル化されて、一方 のパートナーにおいて遊離のマレイミド基を提供する。次いで、このパートナー は、チオエーテル結合によって他方に結合されて、所望のF(ab'γ)2ヘテロ接合 体を得る。 調製、高収量、および再現性の容易さのため、Glennieら（1987）の方法は、 しばしば二重特異性抗体の調製に好適であるが、用いられ得るおよび発明者らに より意図される多くの他のアプローチがある。例えば、他の技術は公知であり、 SPDPまたはプロテインＡとの架橋が行われるか、あるいは三重特異性構築物が調 製される（Titusら、1987；Tuttら、1991）。 二重特異性抗体を産生する別の方法は、２つのハイブリドーマの融合によるク アドローマ(quadroma)の形成である（Flavellら、1991、1992；Pimmら、1992；F renchら、1991；Embletonら、1991）。本明細書中で用いられる用語「クアドロ ーマ」は、２つのＢ細胞ハイブリドーマの生産的融合を記載するために用いられ る。現在の標準的技術を用いて、２つの抗体産生ハイブリドーマが融合されて娘 細胞を得、そして次いで、両セットのクローン型の免疫グロブリン遺伝子の発現 を維持したこれらの細胞が選択される。 クアドローマを生成する好ましい方法は、親ハイブリドーマの少なくとも１つ の酵素欠損変異体の選択を包含する。次いで、この第１の変異体ハイブリドーマ 細胞株が、例えば、ヨードアセトアミドに致死的に曝された、その継続した生存 が妨げられる第２のハイブリドーマの細胞に融合される。細胞融合は、致死的に 処理されたハイブリドーマから酵素欠損に関する遺伝子を獲得することによる第 １のハイブリドーマのレスキュー、および第１のハイブリドーマへの融合による 第２のハイブリドーマのレスキューを可能にする。同じイソ型であるが異なるサ ブクラスの免疫グロブリンの融合が、好ましいが、必要とされるわけではない。 混合サブクラス抗体は、好ましいクアドローマの単離のための代替アッセイの使 用を可能にする。 より詳細には、クアドローマ開発およびスクリーニングの１つの方法は、第１ の選択MAbを分泌するハイブリドーマ株を得、そして必須代謝酵素であるヒポキ サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)を欠損している この株を作製することを包含する。ハイブリドーマの欠損変異体を得るために、 細胞を8-アザグアニンの漸増濃度（１×10-7Ｍ〜１×10-5Ｍ）の存在下で増殖さ せる。変異体を限界希釈によりサブクローン化し、そしてヒポキサンチン／アミ ノプテリン／チミジン（HAT）感受性について試験する。培養培地は、例えば、1 0％FCS、２mM L-グルタミン、および１mMペニシリン−ストレプトマイシンを補 充したDMEMからなり得る。 第２の所望のMAbを産生する相補ハイブリドーマ細胞株は、標準的な細胞融合 技術（Galfreら、1981）によるか、またはClarkら、（1988）により記載のプロ トコルを用いることにより、クアドローマを生成するために用いられる。簡単に いえば、4.5×107個のHAT-感受性第１細胞を、致死用量の不可逆性の生化学的イ ンヒビターであるヨードアセトアミド（リン酸緩衝化生理食塩水中５mM）で、融 合前に、30分間氷上で前処理した2.8×107個のHAT-耐性第２細胞と混合する。細 胞融合をポリエチレングリコール(PEG)を用いて誘導し、そして細胞を96ウェル マイクロ培養プレートに播種する。クアドローマをHAT含有培地を用いて選択す る。二重特異性抗体含有培養物を、例えば、固相イソ型特異的ELISAおよびイソ 型特異的免疫蛍光染色を用いて、同定する。 二重特異性抗体を同定するための１つの同定の実施態様では、マイクロタイタ ープレート（Falcon，Becton Dickinson Labware）のウェルが、親ハイブリドー マ抗体の１つと特異的に相互作用し、かつ両抗体と交差反応性を有さない試薬で コートされる。プレートは洗浄され、ブロックされ、そして試験されるべき上清 (SN)が各ウェルに添加される。プレートは室温で２時間インキュベートされ、上 清は捨てられ、プレートは洗浄され、そして希釈アルカリホスファターゼ−抗抗 体接合体が室温で２時間添加される。プレートは洗浄され、そしてホスファター ゼ基質（例えば、P-ニトロフェニルリン酸(Sigma，St．Louis)）が各ウェルに添 加される。プレートはインキュベートされ、３Ｎ NaOHが各ウェルに添加されて 反応を停止させ、そしてOD410値がELISAリーダーを用いて測定される。 別の同定実施態様では、ポリ-L-リジンで前処理したマイクロタイタープレー トが、標的細胞の１つを各ウェルに結合させるために用いられ、次いで細胞が、 例えば、１％グルタルアルデヒドを用いて固定化され、そして二重特異性抗体が 、それらの無傷細胞への結合能力について試験される。さらに、FACS、免疫蛍光 染色、イディオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイ、および抗体特徴付け の分野において一般的な他の方法が、本発明と共に、好ましいクアドローマを同 定するために用いられ得る。 クアドローマを単離した後、二重特異性抗体が他の細胞産物から精製される。 これは、免疫グロブリン精製の当業者に公知の種々のタンパク質単離手順により 達成され得る。抗体を調製および特徴付けする手段は、当該分野において周知で ある（例えば、★Antibodies：A Laboratory Manual，1988を参照のこと）。 例えば、選択されたクアドローマからの上清が、プロテインＡまたはプロテイ ンＧセファロースカラムに通され、IgGを結合する（イソ型に依存する）。次い で、結合された抗体が、例えば、pH5.0クエン酸緩衝液で溶出される。BsAbを含 有する溶出画分が、等張緩衝液に対して透析される。あるいは、溶出液はまた、 抗免疫グロブリンセファロースカラムに通される。次いで、BsAbが、3.5M塩化マ グネシウムで溶出される。次いで、このようにして精製されたBsAbは、例えば、 上記のように、イソ型特異的ELISAおよび標的細胞の免疫蛍光染色アッセイによ り、結合活性について試験される。 精製BsAbおよび親抗体はまた、SDS-PAGE電気泳動を行い、続いて銀またはクマ シーで染色することにより特徴づけおよび単離され得る。これは、親抗体の一方 が他方より高い分子量を有する場合に可能である。その場合、BsAbのバンドは、 ２つの親抗体のバンド間の中間部に移動する。サンプルの還元は、２つの異なる 見かけ分子量を有する重鎖の存在を確証する。 さらに、組換え技術が、一般に抗体の調製のために、現在利用可能である。こ のことにより、所望の二重特異性を有する抗体をコードする組換え抗体遺伝子の 調製が可能となる（Van Dukら、1989）。従って、最も好ましい結合特性を有す るモノクローナル抗体を選択した後、これらの抗体に関するそれぞれの遺伝子が 、例えば、ファージ発現ライブラリーの免疫スクリーニングにより、単離され得 る（OiおよびMorrison，1986；WinterおよびMilstein，1991）。次いで、Fabコ ードドメインの再配列により、適切なキメラ構築物が容易に得られ得る。 Ｅ．結合アッセイ 本発明は、動物およびヒト処置法(regimen)において重要な有用性を有するが 、これは、多くの他の実施用途もまた有する。これらの用途は、一般に、二重特 異性化合物の特異的結合能に関連する。本発明の全ての化合物は、少なくとも１ つの標的および結合成分（例えば、抗体、リガンド、レセプターなど）を含むの で、得られる二重特異性構築物は、本来の抗体、リガンド、またはレセプターな どが用いられ得る事実上全ての結合実施態様において用いられ得る。コアギュラ ント または他の結合領域の存在は、いずれの結合アッセイにおいても第１の結合領域 の有用性を打ち消さない。 このようにして、二重特異性凝固リガンドは、標準的な結合アッセイにおいて 用いられ得る。この結合アッセイとしては、例えば、免疫ブロット、ウェスタン ブロット、および抗原が固体支持体マトリックス（例えば、ニトロセルロース、 ナイロン、またはそれらの組合せ）上に固定化されている他のアッセイが挙げら れる。それらリガンドは、単に「抗体基質」として用いられ得るか、または標準 的な二次試薬が許容不能に高いバックグラウンドを生じさせる抗原の検出で用い られる、より特異的な検出手段を提供するために用いられ得る。これは、研究さ れる抗原がそれ自身免疫グロブリンであるか、または他の抗体がこの手順におい て用いられる（ELISAの場合において以下に例示する）場合、特に有用である。 二重特異性結合リガンドはまた、解凍したばかりの組織塊およびホルマリン固 定化パラフィン包埋組織塊の両組織塊と共に、免疫組織化学；蛍光活性化細胞選 別、フローサイトメトリー、またはフローマイクロフルオロメトリー；複合体混 合物から標的抗原を分離するための免疫沈降（この場合、それらが分子格子を形 成できるため、二次マトリックス結合試薬を用いなくても沈降を達成し得る）； 抗原または細胞精製実施態様（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、特 定の場合では、１つまたはそれ以上の細胞集団の同時一工程高速精製さえも包含 する）；および本明細書中に示される情報を与えられる当業者に公知の多くの他 の結合アッセイにおいて、用いられ得る。 一例として、本発明の二重特異性リガンドは、ELISAアッセイにおいて用いら れ得る。多くのタイプのELISAが知られており、そして当該分野において日常的 に実施されている。二重特異性リガンドは、実施される特定のELISAタイプおよ び検出されるべき「抗原」（成分）に依存して、いずれの結合工程においても用 いられ得る。従って、リガンドは、プレートをコートするように用いられ得、抗 原として結合部位に関して競合し得、一次結合リガンド、二次結合リガンド、ま たは三次または他の結合リガンドとしてさえ標準曲線を作成し得る。以下に記載 する代表的な様式をさらに考慮し、多くのELISA実施様式が当業者に公知である 。 ELISAの１つの形態では、結合標的（一般的に抗体自身である）が、ポリスチ レンマイクロタイタープレートのウェルのような選択された表面、好ましくはタ ンパク質親和性を示す表面上に固定化される。洗浄して不完全に吸着した物質を 除去した後、試験抗血清に関して抗原的に中性であると知られる非特異的タンパ ク質（例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、または粉乳溶液）でアッ セイプレートウェルを結合またはコートすることが望ましい。これは、固定化表 面上の非特異的吸着部位のブロックを可能にし、従って表面上の抗血清の非特異 的結合により引き起こされるバックグラウンドを低下させる。 これらのELISAタイプ（一般的にサンドイッチELISAと呼ばれる）において、プ レート結合抗体は、抗原を「捕捉」するために用いられる。第１の抗体をウェル に結合させ、非反応性物質でコートしてバックグラウンドを低下させ、そして洗 浄して非結合物質を除去した後、固定化表面は、本発明の代表的な実施態様にお いて、免疫複合体（抗原／抗体）形成が導かれる様式で、検出および／または力 価測定されるべき抗原性物質を含有する試験サンプルと接触される。これらの実 施態様は、臨床サンプルまたは生体抽出液においてリガンドを検出するために、 特に有用である。サンプルは、好ましくは、BSA、ウシγグロブリン（BGG）、お よびリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、ならびに界面活性剤（例えばTween）の溶液 で希釈される。 次いで、重層した抗血清が、２〜４時間、好ましくは25〜37℃の目安の温度で インキュベートされる。インキュベーション後、抗血清接触表面は、非免疫複合 物質を除去するように洗浄される。好ましい洗浄手順は、PBS/Tween、またはホ ウ酸緩衝液のような溶液を用いる洗浄を包含する。 結合抗原と試験サンプルとの間で特異的免疫複合体を形成し、続いて洗浄した 後、免疫複合体形成の発生および量は、同じ複合体を二次特異的結合成分（一般 に抗体ベースの成分である）に供することにより決定され得る。特定の実施態様 では、本発明の二重特異性リガンドは、この工程において用いられるように提案 されている。次いで、特異的結合工程および洗浄工程がさらに実施される。 本発明の代表的な実施態様において検出手段を提供するために、検出標識に結 合されている第３の抗体が用いられる。検出標識としては、適切な色素原基質と インキュベートさせた際に発色を生じさせる結合酵素が挙げられる。第３のまた は三次の標識抗体は、二重特異性リガンドの一成分に対して結合親和性を有する 。最終免疫複合体は、適切な結合工程および洗浄工程の後に、標識を検出するこ とにより決定される。この標識の検出は、例えば、色素原基質とインキュベート することにより行われる。色素原基質としては、例えば、尿素およびブロモクレ ゾールパープル、または2,2'-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホ ン酸[ABTS]およびH2O2が挙げられる。次いで、定量は、例えば、可視スペクトル 分光光度計を用いて、発色の程度を測定することにより達成される。 上記のELISAタイプと共に、二次検出試薬として二重特異性凝固リガンドを用 いることは、別個の利益を有する。例えば、そのことにより、通常標的される典 型的な抗体定常領域とは異なる二重特異性リガンドの部分に特異的な三次の標識 抗体の使用が可能になる。特に、二重特異性構築物の凝固部分（または凝固結合 領域）に特異的である三次結合リガンドが用いられ得る。免疫複合体形成を検出 するこの新規な手段は、サンドイッチELISAにおいて特に有用な改良特異性を与 える。このサンドイッチELISAでは、三次抗体が、意図された二次抗体にちょう ど結合するのではなく、プレートをコートするために用いられる本来の物質（す なわち、本来の抗体）と交差反応し、そして結合し得る。二重特異性リガンドの 非抗体部分に対して、または新規な抗原結合領域に対してさえも標識三次成分を 指向することにより、非特異的結合の問題および異例に高いバックグラウンドは 回避される。 二重特異性リガンドのさらなる実施用途は、それらの凝固能を利用することに より明らかである。提案された全ての化合物は凝固を誘導し得るので、それらは 、凝固を一成分として包含する任意のアッセイにおいて、例えば、コントロール として用いられ得る。標的成分の存在は、このようなアッセイにおいて、他とは 独立した各成分機能として、コアギュラントの有用性を打ち消さない。 Ｆ．組織因子結合二重特異性抗体の有効な用途 初めの方で述べたように、組織因子(TF)は、血液凝固を開始させ得る１つの因 子てある。TFは、血管損傷において、または特定のサイトカインによる活性化後 に、血液に曝される。次いで、利用可能なTFが、第VIIa因子と複合体を形成し、 最終的にフィブリン形成を生じる凝固カスケードを開始させる。 １つの代表的な実施態様において、本発明者らは、１つの抗原結合部位では腫 瘍血管系内皮細胞上の抗原に対する特異性を有し、そして他方の抗原結合部位で はヒトTFの細胞外ドメインに対する特異性を有する二重特異性抗体を合成した。 ヒトTFに対して特異性を有する抗体は、第VIIa因子複合体形成事象またはTF/VII a活性を妨害することなく、高い親和性でTFに結合することが既に示された（Mor risseyら、1988）。全長ヒトTFを用いる代わりに、本発明者らは、短縮型(tTF) を用いた。この短縮型は、細胞質ドメインならびに膜貫通ドメインを欠く。短縮 されたTFは、第VIIa因子と複合体を形成し得るが、凝固誘導活性を欠く。これは おそらく、凝固開始複合体（第Ｘ因子を含む）がアセンブルし得る膜表面と、複 合体を形成し得ないからである。 この腫瘍血管系内皮細胞表面特異的標的構築物の有効性を分析するために用い られるマウスモデルは、最近確立されたモデルであり、このモデルでは、MHCク ラスII抗原（正常組織の血管系には存在しない）が、腫瘍細胞により分泌される IFN-γによる誘導により、腫瘍血管系で発現される（Burrowsら、1992；Burrows およびThorpe、1993）。静脈内に投与された抗クラスII抗体は迅速かつ強く腫瘍 血管系に局在化することが実証されている（Burrowsら、1992）。 本発明者らは、C1300（Muγ）腫瘍生成マウスにおいて、抗MHCクラスII／抗TF 二重特異性抗体が、tTFと共に投与される場合、腫瘍の血管系において特異的に 凝固を誘導し得ることを、本明細書中において実証する。実際に、抗体：tTF複 合体の静脈内投与は、腫瘍血管系の迅速な血栓症を誘導し、70％の動物で腫瘍退 縮を完了した。二重特異性抗体単独、tTF抗体単独、tTF存在下または非存在下の 任意のイソ型適合性コントロール抗体のいずれもが、同一の効果を誘起し得なか った。このことは、Ｂ21-2/10H10二重特異性抗体が、標的細胞およびtTFを架橋 し得る「コアギュリガンド」として作用し、それによりtTFが第Ｘ因子を活性化 し得、そして凝固カスケードを開始させ得ることを示している。これはまた、固 形腫瘍の処置におけるコアギュリガンドの明らかな成功を示す。 Ｇ．薬学的組成物およびキット 本発明の薬学的化合物は、一般に薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体 に溶解または分散した有効量の二重特異性凝固リガンドを包含する。 用語「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」は、動物またはヒト に、適切に投与されるとき、有害な、アレルギー性のまたはその他の不都合な反 応を起こさない分子実体および組成物をいう。本明細書中で用いられるように、 「薬学的に受容可能なキャリア」としては、任意のおよびすべての溶媒、分散媒 、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤（isotonic agent）および 吸収遅延剤（absorption delaying agent）などが挙げられる。薬学的活性物質 に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従 来の媒体または薬剤は、活性成分と適合しないものではない限り、本治療組成物 中でのその使用が意図される。補助活性成分もまた、組成物に取り入られ得る。 １．非経口処方物 本発明の二重特異性リガンドは、しばしば非経口投与のために処方される。例 えば、静脈内、筋肉内、皮下または他のそのような経路を経る注射（腫瘍部位ま たは疾病部位に直接点滴することを含む）のために処方される。活性成分として 腫瘍標的化凝固剤を含有する水性組成物は、本発明の開示を考慮すれば当業者に 理解される。代表的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれ かのように注射可能なものとして調製され得る。注射前に液体を加えて溶液また は懸濁液を調製するために用いられるのに適する固体の形態もまた、調製され得 る。そして調製物はまた、乳化もされ得る。 遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩のような活性化合物の溶液は、ヒドロ キシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製され 得る。分散体はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれ らの混合物、ならびにオイル中で調製され得る。通常の保存および使用条件下で は、これらの調製物は、保存剤を含有し微生物の成育を防止する。 注射用途に適した薬学的形態としては、無菌水溶液または分散体；ゴマ油、ピ ーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含有する処方物；および無菌注 射溶液または分散体の用時調製のための無菌粉末が挙げられる。すべての場合で 、形態は、無菌でなければならず、容易にシリンジで使用できる程度まで流動的 でなければならない。それは、製造および保存条件下で安定でなければならず、 微生物（例えば、細菌類および真菌類）の混入作用に対して保護されなければな ら ない。 二重特異性リガンドまたは抗体は、中性または塩の形態で組成物の中に処方さ れ得る。薬学的に受容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により 形成される）を包含し、そしてこれは無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）また は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）により形成され る。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化 ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または 水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミ ン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。 キャリアはまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロー ル、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それら の適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動 性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合には要 求される粒子の大きさの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得 る。微生物の作用を防止することは、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、 パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）に より達成され得る。多くの場合、等張化剤（例えば、糖または塩化ナトリウム） を含有することが好ましい。注射可能な組成物の吸収を延長することは、吸収を 遅延する薬物（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）の組成 物中での使用で達成され得る。 無菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列 挙した種々の他の成分と組み合わせ、続いて滅菌濾過を行うことにより調製され る。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、塩基性分散媒および上に 列挙したもののうち必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルの中に組み入 れることにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製 の好ましい方法は真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、それらの技法は、活 性成分と付加的な所望の成分との粉末を、あらかじめ無菌濾過されたそれらの溶 液から生成する。 処方されると、溶液は、投薬処方物に適合した方法および治療に効果のあるよ うな量で、投与される。処方物は、種々の剤形（例えば、上記の注射溶液のタイ プ）で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた、用いられ得る。 本発明に従った適切な薬学的組成物は、一般に、予定される使用に応じて、受 容し得る薬学的希釈剤または賦形剤（例えば、無菌水溶液）と混合して最終濃度 の範囲にされた、ある量の二重特異性リガンドを含有する。調製技術は、Reming ton's Pharmaceutical Sciences、第16版、Mack Publishing Company、1980（本 明細書中で参考として援用される）により例示されるように当該分野で周知であ る。エンドトキシン混入は、安全レベル（例えば、0.5ng/mgタンパク質未満）で 最小限に維持されるべきことが理解される。さらに、ヒト投与については、調製 品は、FDA Office of Biological Standardsにより要求されるような無菌性、発 熱性、一般安全性および純度標準を満たすべきである。 治療効果量は、本明細書中（例えば、実施例III参照）に詳述する研究で示さ れるように、動物モデルを用いて容易に決定され得る。固形腫瘍を有する実験動 物は、臨床環境に移される前に適切な治療用量を最適化するのに、よく用いられ る。このようなモデルは、効果的な抗ガンストラテジーを予測するのに、非常に 信頼性のあることが知られている。例えば、実施例IIIで用いられるように、腫 瘍を有するマウスは、前臨床試験で広く用いられる。 本発明者は、C1300（Mo8）腫瘍を有するマウスを用い、毒性限界、および最小 限の毒性で至適な抗腫瘍効果を与える二重特異性の作用範囲を決定した。 ガンの処置においての使用のための有効量は、１週間あたり約１回の頻度でIV ルートを経て投与される場合、約0.1mg/kgと約２mg/kgとの間、および好ましく は約0.8mg/kgと約1.2mg/kgとの間であると、現在のところ提示されている。処置 される被験体の状態により、用量のいくらかの変化は必然的に生じる。投与に対 して責任のある人は、いずれにしても、個々の患者に対して適切な用量を決定す る。このような最適化および調整は、当該分野で日常的に行われ、そして決して 過度の実験量を表さない。 本発明の一つの局面は、循環から内因性凝固因子を蓄積し、腫瘍部位内にそれ を濃縮する、複合化していない二重特異性結合リガンドを投与することによる腫 瘍部位への凝固剤の送達に関することに留意すべきである。これらの場合、用い られる薬学的組成物は、標的化領域およびコアギュラント結合領域を有するリガ ンドを含有するが、他の点では一般に上記のものと同じである。 非経口投与（例えば、静脈内注射または筋肉内注射）用に処方された化合物に 加えて、他の薬学的に受容され得る形態（例えば、錠剤または他の経口投与のた めの固形物、時間放出(time release)カプセル、リポソーム形態など）もまた意 図される。処置される状態に応じて、他の薬学的処方物もまた用いられ得る。例 えば、皮膚炎および乾癬のような病的状態を処置するために適切な局所処方物； および糖尿病性網膜症のための眼用処方物。 ２．摂取可能な処方物 特定の実施態様では、活性化合物は、経口投与され得る。このことは、消化酵 素によるタンパク質分解に、一般に耐性の、または耐性となる薬剤について意図 される。このような化合物は、化学的に設計または修飾された薬剤；右旋性ペプ チジル薬剤；リポソーム処方物；およびペプチダーゼ分解およびリパーゼ分解を 避けるために時間放出カプセルに入った処方物を包含することが意図される。 経口投与のために、活性二重特異性化合物は、例えば不活性希釈剤または消化 され得る食用キャリアと共に投与され得る。あるいは、それらは、堅いまたは軟 らかいシェルのゼラチンカプセル内に封入されるか、あるいは錠剤として圧縮さ れるか、あるいは食餌内に直接組み入れられる。経口治療投与のために、活性化 合物は、賦形剤に組み入れられ、そして摂取し得る錠剤、舌下錠剤、トローチ、 カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤（wafer）などの形態で 用いられる。このような組成物および調製物は、少なくとも0.1％の活性二重特 異性コアギュラントを含有するべきである。組成物および調製物の割合は、当然 変化し得、好ましくはユニットの重量の約２％〜約60％の間であり得る。このよ うな治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が得られるような量 である。 錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、また：結合剤（例えば、ゴムトラガ カント、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、 リン酸ジカルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、ア ルギン酸など）；滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）を含有し得、そし て甘味料（例えば、スクロース、ラクトース、またはサッカリン）または香料（ 例えば、ペパーミント、冬緑油、またはチェリー香料）が添加され得る。用量単 位形態がカプセルの場合、上記のタイプの材料に加えて液体キャリアが含有され 得る。 種々の他の材料は、コーティングとして、またはそれ以外に用量単位の物理的 形態を改変するように存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、シ ェラック、糖またはその両方でコートされ得る。エリキシル剤のシロップは、活 性化合物、甘味料としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベンおよびプ ロピルパラベン、染料、および香料（例えば、チェリー香料またはオレンジ香料 ）を含有し得る。当然、任意の用量単位形態の調製に用いられる任意の材料は、 薬学的に純粋で、用いられる量で実質的に無毒であるべきである。さらに、活性 化合物は、持続放出調製物および処方物に組み入れられ得る。 ３．リポソーム処方物 本発明の二重特異性凝固リガンドはまた、所望であれば、リポソーム調製物と して処方され得る。以下の情報は、本発明のコアギュラントを組み入れたリポソ ーム処方物の製造において利用され得る。リン脂質は、水に分散された場合、脂 質と水のモル比に依存してリポソームを形成する。リポソームの物理的特性は、 pH、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性 物質および極性物質に対して低い浸透性を示すが、高温において相転移して、こ れによりその浸透性が著しく変わる。相転移は、ゲル状態として知られる密に充 填された秩序ある構造から、流体状態として知られるゆるく充填されたあまり秩 序のない構造への変化を意味する。この相転移は、特有の相転移温度で起こり、 イオン、糖および薬物に対する浸透性の増加を生じる。 温度に加えて、タンパク質に曝されることで、リポソームの浸透性は、変わり 得る。特定の可溶タンパク質（例えば、シトクロームｃ）は、二重層に結合し、 変形させ、そして貫入し、それにより浸透性の変化を引き起こす。コレステロー ルは、見かけ上リン脂質をさらに堅密に充填することにより、タンパク質のこの 貫入を阻害する。本発明での使用について最も有用なリポソーム形成は、コレス テロール、またはPEGさえ含有することは、意図される。 溶質をトラップする能力は、異なるタイプのリポソームの間で変化する。例え ば、多層ベシクル（MLV）は、溶質をトラップすることにおいて適度に効果があ り、小さな単層ベシクル（SUV）は、十分てはない。SUVは、サイズ分布において 均一性および再現性の点で有利であるが、サイズとトラップ効率との間の妥協(c ompromise)は、大きい単層ベシクル（LUV）により示される。これらは、エーテ ルエバポレーションにより調製され、そして溶質トラップにおいて、MLVより３ 〜４倍効果がある。 リポソーム特性に加えて、化合物のトラップにおける重要な決定因子は、化合 物自体の物理化学的性質である。極性化合物は、水性空間でトラップされ、そし て非極性化合物は、ベシクルの脂質二重層に結合する。極性化合物は、浸透によ りまたは二重層が破壊されたときに遊離されるが、非極性化合物は、二重層が温 度またはリポタンパク質への曝露により破壊されない限り、二重層と結びついた ままである。両方のタイプとも、相転移温度において最大外向き流出速度(efflu x rate)を示す。 リポソームは、以下の４つの異なるメカニズムを経て、細胞と相互作用する： 網内系の食細胞（例えば、マクロファージおよび好中球）によるエンドサイトー シス；非特異的な弱い疎水性の力または静電力、あるいは細胞表面成分との特異 的な相互作用のどちらかによる細胞表面への吸着；リポソームの脂質二重層の細 胞質膜への挿入による細胞質膜との融合（細胞質の中へのリポソーム内容物の同 時放出を伴う）；およびリポソーム内容物との任意の会合なしでのリポソーム脂 質の細胞膜または細胞下(subcellular)膜への転移、あるいはその逆による。ど のメカニズムが作用し、そして１つより多くのメカニズムが同時に作用するかど うかを決定することは、しばしば困難である。 静脈内に注射されたリポソームの成りゆき(fate)および性質は、それらの物理 的性質（例えば、大きさ、流動性、および表面電荷）に依存する。それらは、そ れらの組成に依存して、数時間から数日間、組織に残存し、そして血中での半減 期は、数分から数時間の範囲である。より大きいリポソーム（例えば、MLVおよ びLUV）は、網内系の食作用細胞により速やかに取り込まれるが、循環系の生理 学が、大部分の部位でこのような大きな種の排出(exit)を制限する。それらは、 毛細管内皮（例えば、肝臓または脾臓の洞様血管）に存在する大きな開口部また は孔においてのみ排出され得る。従って、これらの器官は、取り込みの主要部位 である。一方、SUVは、より広い組織分布を示すが、なお肝臓および脾臓中に高 度に隔離(sequester)される。一般に、このインビボでの性質は、リポソームの 大きいサイズを受け入れやすい器官および組織のみへのリポソームの集中を決定 する。これは、明らかに血液を含んでいるので、このことは、それらの本発明と 組み合わせた使用の限定とはならない。 他の実施態様では、本発明の二重特異性成分は、リポソーム表面と混合され得 、薬物内容物を、標的細胞表面上に位置する特異的抗原レセプターに導く。炭水 化物決定因子（細胞−細胞間の認識、相互作用、および付着において役割を有す る糖タンパク質または糖脂質細胞表面成分）もまた、認識部位として用いられ得 る。なぜならそれらは、リポソームを特定の細胞タイプに導く能力があるからで ある。主として、リポソーム調製物の静脈内注射が用いられるが、他の投与経路 もまた考え得ることは意図されている。 ４．局所処方物 局所使用のための二重特異性コアギュラントの処方物、例えば、クリーム、軟 膏およびゲルとしての処方物もまた意図される。油性または水溶性軟膏基剤の調 製物もまた、当業者に周知である。例えば、これらの組成物としては、植物油、 動物性脂肪、およびさらに好ましくは石油から得られた半固体炭水化物が挙げら れ得る。用いられる特定の成分としては、白色軟膏、黄色軟膏、セチルエステル ワックス、オレイン酸、オリーブ油、パラフィン、ワセリン、白色ワセリン、鯨 ロウ、スターチグリセリン剤、白色ワックス、黄色ワックス、ラノリン、無水ラ ノリン、およびグリセリルモノステアレートが挙げられ得る。 種々の水溶性軟膏基剤もまた用いられ得、例としては、グリコールエーテルお よびその誘導体、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシル40、およ びポリソルベートが挙げられる。所望であれば、皮膚を通しての送達すら、例え ば、経皮パッチ、イオン浸透療法、または電気移送（electrotransport）により 、用いられ得る。 ５．眼用処方物 本発明の二重特異性凝固リガンドはまた、眼用溶液としての使用に適した薬学 的組成物に処方され得る。このような眼用溶液は、例えば、糖尿病性網膜症の処 置において重要である。従って、糖尿病性網膜症の処置のために、本発明の二重 特異性接合体は、治療を必要とする被験者の目に、従来の薬学的な慣行（例えば 、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1488〜1501頁（Mack Publ ishing Co.、Easton、PA））に従って調製された眼用調製物の形態で投与される 。 眼用調製物は、新規の二重特異性コアギュラントまたはその薬学的に受容可能 な塩を、薬学的に受容可能な溶液、懸濁液、または軟膏中において、約0.01重量 ％〜約１重量％、好ましくは約0.05重量％〜約0.5重量％の濃度で含有する。い くらかの濃度の変化は、用いる特定の化合物、処置される被験体の状態などによ り、必然的に生じる。そして、処置の責任者は、個別の被験体について最も適し た濃度を決定する。眼用調製物は、好ましくは無菌水溶液の形態であり、所望で あれば、付加的な成分（例えば、保存剤、緩衝剤、張度調節剤、抗酸化剤および 安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤など）を含有する。 このような溶液中での使用に適した保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、 塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙げられる。適切 な緩衝剤としては、ホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナ トリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナト リウム、二リン酸ナトリウムなどが挙げられ、pHを約６〜８の間、好ましくは約 ７〜7.5の間に維持するに充分な量である。適切な張度調節剤は、デキストラン4 0、デキストラン70、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレン グリコール、塩化ナトリウムなどであり、眼用溶液の塩化ナトリウム当量は、0. 9±0.2％の範囲である。 適切な抗酸化剤および安定剤としては、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナ トリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤剤お よび清澄剤としては、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー282 、およびチロキサポールが挙げられる。適切な増粘剤としては、デキストラン40 、デキストラン70、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒド ロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポ リ エチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキ シメチルセルロースなどが挙げられる。眼用調製物は、従来の方法（例えば、点 眼液の形態でまたは眼用溶液中に目を浸すことにより）により治療が必要とされ る被験体の目に、局所的に投与される。 ６．治療キット 本発明はまた、本明細書中で記載された二重特異性凝固リガンドを含む治療キ ットを提供する。このようなキットは、一般に、本発明に従う少なくとも一つの 二重特異性リガンドの薬学的に受容可能な処方物を、適切な容器手段中に含有す る。キットはまた、以下のものを含有し得る：他の薬学的に受容可能な処方物（ 例えば、一般に異なる標的成分を有するさらなる二重特異性凝固リガンドを含有 する処方物）；複合化されていない余分の凝固因子；二重特異性抗体、Ｔ細胞、 または例えば抗原誘導で用いられる他の機能成分；抗原抑制で用いられる成分（ 例えば、シクロスポリン）；異なる抗腫瘍部位の抗体またはイムノトキシン；お よび１つ以上の一連の(a range of)化学療法薬剤。 組み合わせキットで用いられる好ましい薬剤としては、疾患関連血管内皮細胞 を誘導して、標的化可能な抗原（例えば、E-セレクチンまたはMHCクラスII抗原 ）を発現し得る薬剤が挙げられる。誘導剤としては、疾患抗原または腫瘍抗原に 結合し、そしてIFN-γを産生するＴ細胞クローンが挙げられ得る。好ましい誘導 剤としては、疾患細胞抗原または腫瘍細胞抗原、ならびにサイトカインの同化に より標的抗原発現を誘導し得るエフェクター細胞と結合する二重特異性抗体が挙 げられる。 このように、さらに本発明は、適切な容器手段中に以下を含有するキットを包 含する：エフェクター細胞表面（すなわち、単球／マクロファージ、マスト細胞 、Ｔ細胞、またはNK細胞）上の活性化抗原、および疾患細胞の細胞表面上の抗原 に結合する二重特異性抗体を含有する第１の薬学的組成物；および、二重特異性 リガンドを含む第２の薬学的組成物。この二重特異性リガンドは、活性化エフェ クター細胞またはそれからのサイトカインにより誘導される内皮細胞抗原に結合 する第１結合領域を含み、ここでのこの第１結合領域は、凝固因子または凝固因 子に結合する第２結合領域と作動可能に連結している。 活性化抗原CD14、CD16（IgEについてはFcR）、CD2、CD3、CD28またはＴ細胞レ セプター抗原に結合する二重特異性抗体を含有する第１の薬学的組成物を含むキ ットが好ましく、CD14結合二重特異性抗体またはCD28結合二重特異性抗体を含有 する第１の薬学的組成物を含むキットかさらに好ましい。CD14またはCD16の結合 を経た単球／マクロファージまたはマスト細胞の活性化は、E-セレクチンを誘導 するIL-1産生を生じ、他方、CD2、CD3、またはCD28の結合を経たＴ細胞の活性化 は、MHCクラスIIを誘導するIFN-γ産生を生じる。従って、E-セレクチンまたはM HCクラスII抗原に結合する第１結合領域を含む、二重特異性リガンドを含有する 、第２の薬学的組成物を含むキットもまた好ましい。 キットは、任意の追加の成分があってもなくても二重特異性凝固リガンドを含 有する単一の容器手段を有し得る。あるいは、キットは、それぞれの所望される 薬剤に対して異なる容器手段を有し得る。二重特異性凝固リガンドを生成するの に必要な別々の成分を含むキットもまた意図される。 キットの成分が１つ以上の液体溶液として供給されるとき、その液体溶液は水 溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。しかし、キットの成分は、乾燥粉末と して供給され得る。試薬または成分が乾燥粉末として供給されるとき、粉末は、 適切な溶媒の添加により再構成される。溶媒もまた、他の容器手段中で供給され 得ることは想像される。 キットの容器手段としては、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フ ラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段が挙げられ、その中に二重特異性凝固 リガンドおよび他の所望される薬剤が入れられ得、好ましくは適切に小分けされ る。追加の成分が含有される場合、キットはまた、一般に第２のバイアルまたは 他の容器を有し、追加の成分はその中に入れられ、別々に計画された用量の投与 を可能にする。キットは、無菌の薬学的に受容可能な緩衝剤または他の希釈剤を 含有するための第２／第３の容器手段もまた含有し得る。 キットはまた、二重特異性リガンドを動物または患者に投与する手段（例えば 、１つ以上の針またはシリンジ、あるいは点眼容器、ピペット、あるいは同様の 器具）を有し、それにより処方物が動物内に注入され得、または身体の疾患領域 に適用され得る。本発明のキットはまた、代表的には、バイアルなどおよび他の 成 分を市販のための密閉するための手段（例えば、所望のバイアルおよび他の器具 を入れて保存する、射出成型またはブロー成型プラスチック容器）を含み得る。 以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を説明するために包含される。以 下の実施例において開示された技術が、本発明者により発見され、本発明の実施 において良好に作用する技術を表し、従ってその実施についての好ましい様式を 構成すると考えられることは、当業者により理解されるべきである。しかし、当 業者は、本発明の真意および範囲から逸脱することなしに、多くの改変が開示さ れた特定の実施態様においてなされ得、同様の結果を得ることは、本発明の開示 を考慮して理解すべきである。 実施例Ｉ 二重特異性凝固抗体の合成 本実施例は、腫瘍部位にコアギュラントを特異的に導き得る二重特異性抗体（ すなわち、「コアギュリガンド」）の合成を記載する。 Ａ．材料および方法 １．試薬 ペプシン（Ａ；EC 3.4.23.1）、Ellman試薬(ER；5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ 安息香酸、DNTB)、2-メルカプトエタノール(2-ME)、亜砒酸ナトリウム(NaAsO2) 、およびウサギ脳トロンボプラスチン(アセトン粉末)を、Sigma Chemical Co.， St．Louis MO．から得た。Sephadex G-25およびG-100を、Pharmacia LKB(Piscat away，NJ)から得た。 ２．ヒト短縮型組織因子(tTF) 組換えヒト短縮型TF(tTF)を、２つの異なる方法の１つを用いて調製した。 方法Ｉ：E.coli発現ベクターの構築。tTF(残基１〜218）をコードするcDNAを、c DNAの上流のトロンビン切断部位に対するコード領域の添加を可能にするプライ マー5'-GAAGAAGGGATCCTGGTGCCTCGTGGTTCTGGCACTACAAATACT-3'（5'-プライマー； 配列番号28）および5‘-CTGGCCTCAAGCTTAACGGAATTCACCTTT-3'（3'-プライマー； 配列番号29）を用いるPCRにより増幅した。PCR産物を、BamHIおよびHindIIIを用 いて切断し、発現ベクターpTrcHisC(Invitrogen)のBamHIおよびHindIII部位の間 に連結した。 DH5α細胞を連結混合物で形質転換し、そしてアンピシリンの存在下での選択 の後に組換えプラスミドを単離した。E.coli株BL21を、組換えプラスミドpTrcHi sC-tTFを用いて形質転換し、そして得られた形質転換体をタンパク質発現に用い た。 方法Ｉ：E.coliからのtTFの発現、再折畳み、および精製。ポリ(his)-tTF融合タ ンパク質を、pTrc-HisC-tTFで形質転換したBL21細胞を用いて発現させた。接種 培養物（LB培地中10ml）を、37℃にて振盪しながら一晩増殖させた。 接種培養物を増殖培地に添加し、次いでこれを37℃にて振盪しながら増殖させ た。550nmの吸光度が約0.5に達した場合、10mlの100mMイソプロピル-β-D-チオ ガラクトピラノシドを添加した。振盪を、37℃にて約20時間（定常期まで）続け た。 細胞を、遠心分離（10,000×g、20分間）により回収し、そしてインクルージ ョンボディーを以下のように単離した（試薬の量は、細胞ペースト１グラムあた りである）。細胞ペーストを、４mlの10mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、１nM MgC l2、0.17mg/ml PMSF、2mg/ml ニワトリ卵白リゾチーム(Sigma)に懸濁した。ベン ゾナーゼ(250単位，EM Science)を添加した懸濁物を、室温にて1.5時間、緩やか に混合し、次いで12,000gにて15分間遠心分離した。 ペレットを、10mM Tris(pH7.5)、1mM EDTA、３％NP40（２ml）中に再懸濁し、 50％の力で１分間超音波処理し、そして12,000×gにて20分間遠心分離した。ペ レットを水中に再懸濁し、50％の力で20〜30秒間超音波処理し、そして12,000× gにて20分間遠心分離した。水洗を繰り返し、最終的なペレット（インクルージ ョンボディーが非常に多い）を６M 塩化グアニジウム、0.5M NaCl、20mMリン酸 、10mM β-メルカプトエタノール、pH8.0（１gインクルージョンボディーあたり ９mlの）中に、室温にて一晩、緩やかに混合することにより懸濁した。 懸濁物を、12,000×gにて20分間遠心分離し、そして上清をニッケルニトリロ 酢酸(Ni-NTA，Qiagen)カラムに載せた。カラムを、同じ６M 塩化グアニジウム緩 衝液pH８、次いでpH７を用いて連続的に洗浄し、次いでpHを４まで減少させるこ とによりタンパク質を溶出させた。 融合タンパク質を含有するNi-NTAカラム画分を合わせ、そしてジチオトレイト ールを50mMに添加した。溶液を、室温にて一晩保持し、次いで６M 尿素、50mM T ris、0.02％アジ化ナトリウム（pH8.0）中に約１mg/mlのタンパク質濃度に希釈 し、そして同じ緩衝液の10〜20容量に対して４℃にて透析した。緩衝液を、２M 尿素、50mM Tris、300mM NaCl、2.5mM 還元グルタチオン、0.5mM 酸化グルタチ オン、0.02％アジ化ナトリウム（pH8.0）（折畳み緩衝液）に変えた。透析をさ らに２日続け、緩衝液を新鮮な折畳み緩衝液に交換し、そして透析をさらに２日 続けた。 次いで、溶液を20mM TEAに対して十分に透析し、透析バッグから取り出し、ヒ トトロンビン（約500部組換えタンパク質あたり１部(w/w)）で室温にて一晩処理 し、そしてHR-10/10 mono-Q陰イオン交換カラムに載せた。tTFタンパク質を、30 分間にわたって、０〜150mMまで直線的に濃度が増加するNaClを含有する20mM TE A緩衝液（流速３ml/分）を用いて溶出した。 方法II：tTF相補DNA(cDNA)の調製。J-82細胞（ヒト膀胱ガン）由来のRNAを、t TFのクローン化に用いた。全RNAを、GlassMaxTMRNAマイクロ単離試薬（Gibco BR L）を用いて単離した。RNAを、GeneAmp RNA PCRキット(Perkin Elmer)を用いてc DNAに逆転写した。tTF cDNAを、同じキットで、以下の２つのプライマーで増幅 した： 下線を付した配列は、tTFのＮ末端およびＣ末端をコードする。５'プライマー の残りの配列は、発現ベクターへのtTFのクローン化を可能にするNcoIの制限部 位であり、そしてトロンビンに対する切断部位をコードする。３'プライマーの 配列は、発現ベクターにtTFをクローン化するためのHindIII部位である。PCR増 幅を、製造者により提案されるように行った。簡略には、75μM dNTP；0.6μMプ ライマー、1.5mM MgCl2を用いて、95℃にて30秒間、55℃にて30秒間、および72 ℃にて30秒間の30サイクルを行った。 方法II．ベクター構築。E.coli発現ベクターH6pQE-60を、tTF（Leeら，1994）発 現のために用いた。PCR増幅したtTF cDNAを、NcoI部位とHindIII部位との間に挿 入した。H6pQE-60は、発現されるタンパク質がＮ末端に(His)6配列を有するよう に組み込まれた(His)6コード配列を有し、このタンパク質はNi-NTAカラムで精製 し得る。 方法II．tTF精製。tTFを含有するH6pQE-60DNAを、E.coli TG-1細胞に形質転換し た。細胞を、OD600=0.5まで増殖させ、そしてIPTGを30μMまで添加し、tTF産生 を誘導した。細胞を、30℃にて18時間振盪した後に回収した。細胞ペレットを、 ６ M Gu-HClにおいて変成し、そして溶解物をNi-NTAカラム(Qiagen)に載せた。結合 したtTFを、６M尿素で洗浄し、そして６M〜１Mの尿素のグラジエントを用いて室 温にて16時間再折畳みさせた。カラムを、洗浄緩衝液（0.05M NaH2PO4、0.3M Na Cl、10％グリセロール）で洗浄し、そしてtTFを、洗浄緩衝液中の0.2M イミダゾ ールで溶出させた。 溶出したtTFを濃縮し、そしてG-75カラムに載せた。tTFモノマーを回収し、そ してトロンビンで処理してH6ペプチドを除去した。これは、500部のtTF(w/w)に 対して１部のトロンビン(Sigma)を添加することにより、室温にて18時間行った 。混合物をベンズアミジンSepharose 6Bトロンビンアフィニティーカラム(Pharm acia)に通過させることにより、トロンビンをtTFから除去した。 tTFは、第VIIa因子に結合し、および第VIIa因子の触媒活性(Rufetら、1991)を 増強する酵母またはチャイニーズハムスター卵巣細胞由来の組換えtTFと同一の 能力を有した。ドデシル硫酸ナトリウム中のポリアクリルアミドゲル電気泳動に より分析した場合、これは、約24kDの分子量を有する単一成分として移動した。 ３．モノクローナル抗体 B21-2(TIB-229)ハイブリドーマおよびSFR8-B6ハイブリドーマ（HB-152、以下S FR8と称する）を、ATCCから得た。両方のハイブリドーマは、ラットIgG2b抗体を 分泌し、これを培養上清からプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーに より精製した。B21-2抗体は、A-20細胞ならびにBALB/c/nu/nuマウス中に増殖し たC1300（Ｍuγ）トランスフェクタント腫瘍の血管系上に発現されるI-Ad抗原と 反応する。SFR8抗体は、HLA-Bw6エピトープに対して指向し、そしてB21-2抗体に 対するイソタイプのマッチしたネガティブコントロールとして供する。 TF9/10H10（10H10と称する）であるマウスIgG1は、TF/第VIIa因子活性を妨害 することなくヒトTFと反応性であり、そしてMorrisseyら(1988)に記載のように 産生した。 細胞株MRC OX7（OX7と称する）を、A.F.Williams博士(MRC Cellular Immunolo gy Unit,University of Oxford,Oxford,England)から得た。これは、Ｔリンパ球 上のThy 1.1抗原を認識する、マウスIgG1抗体OX7抗体を分泌した。これを、TF9/ 10H10に対するネガティブコントロールにマッチしたイソタイプとして用いた。 全ての抗体を、培養上清からプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー により精製した。 ４．二重特異性抗体の合成 F(ab')2フラグメントを、それぞれのIgGを２％(w/v)ペプシンで37℃にて５〜 ９時間消化し、そしてフラグメントをSephadex G100クロマトグラフィーにより 精製することにより得た。二重特異性抗体B21-2/10H10、SFR8/10H10、およびB21 -2/OX7の合成を、微小な改変を加えたBrennanら(1985)の方法に従って実行した 。 二重特異性抗体B21-2/10H10、SFR8/10H10、OX7/10H10、およびB21-2/OX7を、 微小な改変を加えたBrennanら(1985)の方法に従って合成した。簡略には、F(ab' )2フラグメントを、IgG抗体からペプシンでの消化により得、そしてクロマトグ ラフィーSephadex G100により均一に精製した。F(ab')2フラグメントを、１mM E DTA(PBSE緩衝液)および９mM NaAsO2を含有する0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.8）中の５mM 2-メルカプトエタノールを用いて20℃にて16時間還元した。Ellm an試薬(ER)を、25mMの最終濃度になるように添加し、20℃にて３時間後、Ellman 誘導Fab'フラグメント(Fab'-ER)を、PBSEにおいてSephadex G25のカラム条で未 反応ERから分離した。 二重特異性抗体を形成させるために、１つの抗体に由来するFab'-ERを、限外 濾過セル中に約2.5mg/mlまで濃縮し、そして10mM 2-メルカプトエタノールを用 いて20℃にて１時間還元した。得られたFab'-SHをPBSEにおいてSephadex G25の カラムを通して濾過し、そして第2の抗体から調製した等モル量のFab'-ERと混合 した。混合物を、限外濾過により約３mg/mlまで濃縮し、そして20℃にて16時間 撹拌した。反応産物をSephadex G100のカラムで分画し、そして二重特異性抗体( 110kDa)を含有する画分を１mg/mlに濃縮し、そして0.02％アジ化ナトリウム中で ４℃にて貯蔵した。 Ｂ．結果 １．二重特異性抗体の分析 F(ab')2フラグメントおよび二重特異性調製物の分子量を、Pharmacia LKB-Pha stsystem(Pharmacia LKB,Piscataway，NJ)を用いる４〜15％グラジエントゲルで のSDS-Page電気泳動により決定した。二重特異性ならびにホモダイマー対ヘテロ ダイマーの％を、FACS分析により決定した(実施例II)。 SDS-Page電気泳動による（およびFACS、実施例IIによる）二重特異性抗体の分 析は、B21-2/10H10 二重特異性が、いすれかの起源の４％未満のホモダイマーお よび140kDまたは55kDの分子量を有する、＜10％フラグメントを含有することを 示した。調製物の約10％は、おそらく(いずれかの起源の)超軽鎖と付着したF(ab ')2構築物である140kDフラグメントよりなった。 実施例II 凝固抗体結合およびインビトロでの機能 本実施例は、凝固抗体（コアギュリガンド）の二重特異性を示し、そして特異 的結合、細胞送達、および凝固がコアギュリガンドを用いてインビトロで達成さ れることを示す。 Ａ．材料および方法 １．細胞 A20細胞株（これは、I-AdポジティブBALB/c B細胞リンパ腫である）を、アメ リカンタイプカルチャーコレクション(ATCC; Rockville，MD; TIB-208)から購入 した。A20細胞を、10％(v/v)ウシ胎児血清(FCS)、0.2mM L-グルタミン、200単位 /mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン、18mM Hepes、0.1mM非必須 アミノ酸混合物、および１mMピルビン酸ナトリウムを補充したDMEM(この培地を 、以下完全DMEM培地と称する；全ての試薬をLife Technologies，Gaitherburg， MDから得た)中で増殖させた。2-MEを、A20細胞に対して0.064mMの最終濃度で完 全DMEMに添加する。培養物を、90％空気／10％CO2の加湿雰囲気中において37℃ にて維持した。 J82（TFを発現するヒト胆嚢ガン）を、ATCC(HTB-1)から得た。細胞は、完全DM EM中で付着して増殖した。 C1300神経膠腫細胞株を、自然発症腫瘍（これは、A/Jaxマウス（Dunham & Ste wart，1953）中で生じた）から樹立した。Ｃ1300(Muγ)12株（以下、C1300(Muγ )と称する）は、IFN-γ発現レトロウイルスpSVX(Muγ ΔAs)（Watanbeら，1989 ）を用いるマウスIFN--γ遺伝子を有するＣ1300神経膠腫細胞のトランスフェク ションに由来した。IFN-γ発現レトロウイルスを、Dr.Y.Watanabe(Department o f Molecular Microbiology，Kyoto University，Japan)から得た。 Ｃ1300(Muγ)12細胞を、10％(v/v)ウシ胎児血清(FCS)、2.4mM L-グルタミン、 200単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、100μM非必須アミノ酸 、１μMピルビン酸ナトリウム、18μM HEPES、および１mg/ml G418(Geneticin;S igma)を補充したDulbeccoの改変Eagle培地(DMEM)中で維持した。培養物を、90％ 空気／10％CO2の加湿雰囲気中で37℃にて維持した。 Thy 1.1-発現AKR-AマウスＴリンパ球細胞株を、Dr.I.MacLennan教授(Departme nt of Experimental Pathology，Birmingham University，Birmingham，England )から得て、そして完全DMEM中で増殖させた。 ２．間接的免疫蛍光 A20細胞を、PBS/0.2％ BSA/0.02％ Na-アジド（以下、FACS緩衝液と称する） 中に４×106細胞／mlで再懸濁した。J82細胞を、PBS/EDTA(0.2％ w/v)を用いて フラスコから穏やかな条件下で放出させ、そしてFACS緩衝液中に４×106細胞／m lで再懸濁した。50μlの細胞懸濁物を、丸底96ウェルプレートのウェル中の１次 抗体の50μlの適切な系列希釈物に添加した。室温にて15分間のインキュベーシ ョン後、細胞を、FACS緩衝液で３回洗浄した。最後の上清を除去した後、FACS緩 衝液中で１対20希釈でフルオレセインイソチオシアネート(FITC)に結合させた50 μlの２次抗体を細胞に添加した。細胞を、さらに15分間室温にてインキュベー トし、そしてFACS緩衝液で3回洗浄した。フルオレセインと会合した細胞を、FAC Scan(Becton Dickenson，Fullerton，CA)で測定した。データを、Lysis IIプロ グラムを用いて分析した。FITC-抗-ラットイムノグロブリンを2次抗体として用 いた場合、正常なマウス血清（10％ v/v）を、マウス細胞との非特異的交差反応 をブロックするために添加した。 ３．タンパク質の放射性標識 タンパク質を、MasonおよびWilliams(1980)、(プロトコル２)により記載され るクロラミンＴプロトコルに従って125ヨウ素を用いて標識した。ヨウ素化産物 をG25で精製し、そしてモノクローナルフラグメントの場合は５％ DMSOおよび５ mg/mlウシIgGの存在下で、そしてtTFの場合は５％ DMSOおよび５mg/ml BSAの存 在 下で-70℃にて貯蔵した。比活性は、2.5μCi/μgと4.8μCi/μgとの間の範囲で あった。 ４．結合研究 ヒトtTFを、MasonおよびWilliams(1980)により記載されるクロラミンＴ手順（ プロトコル２）を用いて2.5〜4.8μCi/μgの比活性まで125ヨウ素で標識した。 ２mg/ml BSAおよび0.02％アジ化ナトリウムを含有するPBS中のA20細胞の２×106 細胞／mlの懸濁液を、96ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに50μl の容量で分配した。ウェルに、同じ緩衝液中に８〜0.02μg/mlの濃度範囲にわた って調製した25μlの二重特異性抗体を添加した。 同じ緩衝液中の25μlの８μg/mlの125I-tTFを各ウェルに添加し、モル過剰のt TFを得た。プレートを振盪し、そして４℃にて１時間インキュベートした。次い で、細胞を、2mg/ml BSAを含有する0.9％(w/v)NaClを用いてプレート中で３回洗 浄した。ウェルの内容物を、微小遠心管中のジブチルフタレートおよびビス(2- エチルヘキシル)フタレート油の10：11(v/v)混合物上にピペットした。チューブ を7500gにて1.5分間遠心分離し、そして液体窒素中で瞬間凍結させた。細胞を含 有するチップを、切り離した。細胞ペレット中および上清中の放射活性を、γカ ウンター中で測定した。 ５．凝固アッセイ 上記結合アッセイに用いられたマイクロプレートと同一のマイクロプレートを 、125I-tTFの代わりに非標識tTFを添加したことを除いて同じ条件で設定した。4 ℃にて1時間インキュベーション後、細胞を前述のように3回洗浄し、そして２mg /ml BSAおよび12.5mM CaCl2を含有する75μlの0.9％ NaClに再懸濁した。ウェル の内容物を、５ml透明プラスチックチューブに移し、そして37℃に暖めた。各チ ューブに、30μlのクエン酸処理マウス血漿を37℃にて添加した。最初のフィブ リンストランドを形成した時間を記録した。 Ｂ．結果 １．抗体二重特異性 SFR８/10H10に関する二重特異性を、標的細胞としてのJ28細胞（TFポジティブ ）および10H10の存在を示すためのFITC-抗-マウス免疫グロブリンを用いてFAC Sにより示した。FITC-抗-ラットイムノグロブリンを用いてSFR８の存在を示した 。平均蛍光強度-対-濃度曲線は、両方の株の一致した。これは、マウスおよびラ ットの両方のアームが二重特異性調製物中に存在することを示す。 ２．抗体結合 125ヨウ素標識B21-2 Fab'およびSFR8 Fab'を用いる結合研究は、A20細胞に対 するB21-2 Fab'の結合の飽和に達するする濃度が21.5nMであることを示した。SF R8 Fab'は、21.5nMでは、B21-2 Fab'については細胞あたり530,000分子であるの に対して、細胞あたり50,000未満の分子数でA20細胞に非特異的に結合した。 ３．コアギュラント送達および拘束 コントロールの二重特異性抗体と比較した、tTFをB21-2/10H10 二重特異性抗 体を媒介してA20細胞に架橋させる能力を研究するために、A20細胞を、示すよう な濃度範囲の二重特異性抗体および125I-tTFとともにインキュベートした。飽和 は、10nM(１μg/ml)以上の二重特異性抗体の濃度で達成され、この時、平均310, 000分子のtTFが各A20細胞に結合した。結合は特異的であった。なぜなら、tTF結 合が、イソタイプにマッチするコントロールの二重特異性抗体（SFR8/10H10また はB21-2/OX7）のいすれにも媒介されなかったからである。これらの抗体は、tTF を拘束するために必要とされる２つの特性のうちの１つのみを有する(図１)。 ４．凝固 二重特異性抗体によりA20細胞に結合しているtTFが、凝固を誘導し得るか否か を調査するために、本発明者らは、まず第1に、A20細胞を21.5nM 二重特異性抗 体および69nM tTFとともにインキュベートした。得られた凝固時間に対する影響 を、表VIIに示す。これらの第1の研究は、B21-2/10H10およびtTFの複合体でコー トされたA20細胞が、フィブリン形成を誘導し得ることを示した：これは、凝固 時間を、140秒（用いられる特定の条件下で添加される抗体またはTFの非存在下 で凝固するCaCl2中のマウス血漿についての時間）から60秒に短縮した。対照的 に、コントロールの二重特異性抗体は、凝固の活性化を誘導しなかった：これら の場合では、凝固時間は、140秒であった。 後の研究は、最初の研究の結果を確認および拡張した。tTFがB21-2/10H10で拘 束されているA20細胞にマウス血漿を添加すると、迅速に凝集した。フィブリン ストランドは、非処理A20細胞へ添加される血漿中における164秒と比較して血漿 添加の36秒後に見られた（表VII）。tTFが細胞に拘束されている場合にのみ凝固 が誘導される：tTF単独、ホモダイマーF(ab')2、Fab'フラグメント、またはtTF の拘束に必要な２つの特性のうち１つしか有さない二重特異性抗体とともにイン キュベートした細胞については、凝固時間における影響は見られなかった。 各A20細胞に拘束されたtTF分子の平均数のlogとマウス血漿の凝固を誘導した 細胞についての速度との間には、直線関係が存在した（図２）。細胞あたり300, 000分子のtTFを有する細胞は40秒で凝固を誘導したが、細胞あたり20,000分子を 有する細胞でさえも凝固は非処理細胞（190秒）についてよりも有意に速かった （140秒）。 実施例III インビボでの特定腫瘍脈管系特異的凝固 本実施例は、ヒト組織因子に対する送達ビヒクルとしての二重特異性抗体コア ギュリガンドの投与後にもたらされる腫瘍脈管系のインビボでの特異的凝固を記 載する。 Ａ．材料および方法 １．試薬 マウス血液を心臓穿刺により得、そして3.8％緩衝化クエン酸の１/10容量に回 収した。血液を3000gにて10分間遠心分離し、そして血漿を少量で瞬間凍結し、 そして-70℃にて貯蔵した。 ２．動物 BALB/c nu/nuマウスを、Simonsen(Gilroy，CA)から得て、そしてSPF条件下で 維持した。 ３．C1300(Mu γ)マウスモデルおよび処理 腫瘍モデルは、３つの改良を加えた以外は、以前に記載された（Burrowsら、1 992;Burrows & Thorpe，1993）通りであった。第1に、異なる抗体であるB21-2を 用いた。この抗体は、両方の分子を認識する、以前に用いたM5/114抗体とは異な り、I-Adを認識するが、I-Edを認識しない。B21-2抗体は、M5/114よりも約10培 良好な親和性を有する。第２に、BALB/c nu/nuマウスにおいて連続的に増殖する 、以前に用いたC1300(Muγ)12株のサブ株を用いた。以前に用いたC1300(Muγ)12 細胞は、連続的に増殖する腫瘍を形成させるために非感染C1300細胞と混合しな けれはならなかった。C1300(Muγ)t1P3と称する新しいサブ株を、以下ではC1300 (Muγ)という。第３に、腸内細菌が胃腸内上皮においてI-Adを誘導することを防 止するために、マウスの飲料水中にテトラサイクリンを添加することは不必要で あった。イムノトキシンとは異なり、コアギュリガンドは、I-Ad発現胃腸上皮を 損傷しない。 固形腫瘍の確立のために、1.5×107C1300(Muγ)細胞を、BALB/c nu/nuマウス の右脇腹中に皮下的に注射した。腫瘍が直径0.8cmまで増殖したら、マウスをラ ンダムにそれぞれ７〜８匹のマウスを含む異なる処置グループに割り当てた。 コアギュリガンドを、総容量2.5mlの0.9% NaCl中に二重特異性抗体（140μg） およびtTF（110μg）を混合し、そしてこれらを４℃にて１時間放置することに より調製した。次いで、マウスにこの混合物（すなわち、14μgの二重特異性抗 体および11μgのtTF）0.25mlの静脈内注射を受けさせた。他のマウスは、14μg の二重特異性抗体単独、または11μgのtTF単独を受けた。この注射を、尾の静脈 の1つに約45秒間にわたってゆっくりと行い、そして同じ静脈に200μlの第２の 注射が続いた。この注射手順は、マウスに急速に注入される場合（１〜２秒間） に見られる尾の静脈の血栓を防ぐために適している。７日後、処置を繰り返した 。 垂直腫瘍直径を、規則的な間隔をおいて測定し、そして腫瘍容量を、以下の 式に従って評価した： 容量＝短径2×長径×π/6。 腫瘍容量の差を、統計的有意さについて２つの独立サンプルについてMann-Whi tney-Wilcoxon非パラメトリック試験を用いて試験した(Gibbons，1976)。 組織病理学的分析については、動物を、処置後にメトファンを種々の時間で用 いて麻酔し、そしてヘパリン処理生理食塩水を用いる潅流により放血した。500I Uのヘパリンをi.v.注射し、動物をメトファンで麻酔し、そして肝臓から血液が 一掃されるまで0.6ml/分の流速でPBSを用いて全身の循環を潅流した。腫瘍およ び正常な組織を取り出し、そしてホルマリン固定した（４％ v/v）。組織のパラ フィン切片を切断し、そしてフィブリンの検出のために標準的なMartius Scarle t Blue(MSB)トリクロム技術を用いて、ならびに細胞形態学のためにヘマトキシ リンおよびエオシンを用いて染色した。 Ｂ．結果 １．改良腫瘍モデル 前記のC1300（Muγ）腫瘍モデル（Burrowsら、1992）を改良するために、本発 明者らは、C1300（Muγ）細胞株を、その親細胞であるC1300と混合することなく 増殖し得るが、腫瘍の内皮細胞上でI-AdMHC IIクラス抗原をいまだ発現し得る細 胞株にサブクローン化した。本発明者らは、FACSにより測定されるように、この モデルに使用される初期の抗I-Ad抗体（M5/114.15.2）よりも、その抗原に対し て５倍〜10倍高い親和性を有する抗I-Ad抗体（B21-2）を使用した。この新規抗I -Ad抗体を用いるインビボ分布研究は、M5/114.15.2が示したのと同一の組織分布 パターンを示した。B21-2を用いる濃い染色は、腫瘍血管内皮において見られ、 薄い染色から中程度の染色は、肝臓中のクッパー細胞、脾臓中の周辺帯ならびに 小腸および大腸のいくつかの領域に見られた。他の正常組織中の血管は、染色さ れなかった。 ２．適切なインビボ用量の決定 マウスの尾静脈に静脈内注射された最大耐性用量は、16μgのB21-2/10H10プラ ス11μgのtTFであった。この用量で、マウスは体重が減少せず、正常な外観およ び活動レベルを有していた。20μgのB21-2/10H10プラス16μgのtTFのより高い用 量では、10匹のマウスのうち２匹が、最終的には消散する局所的皮膚出血を発生 した。より低い用量を、インビボ研究に採用した。静脈内で与えられた短縮型TF 自体は、50μgで無毒であった。 ３．腫瘍血管系における特異的凝固および梗塞形成 B21-2/10H10（20μg）およびtTF（16μg）からなる凝固リガンド（coaguligan d）の、固体C1300（Muγ）腫瘍を有するマウスへの静脈内投与により、30分以内 に腫瘍は黒化した挫傷外観を生じた。腫瘍内での現象の時間経過の組織学的研究 は、凝固リガンドの注射30分後、腫瘍の全ての領域中の全ての血管が、血栓形成 したことを示した（図3B）。血管は、血小板凝集、パックされた赤血球およびフ ィブリンを含んでいた。この時点で、腫瘍細胞は、健常であり、未処置マウスの 腫瘍細胞と形態学的に区別できなかった（図3A）。 ４時間までに、腫瘍細胞の窮迫の徴候が明らかになった。腫瘍細胞の大部分は 、互いに分離し始め、そしてピクノーゼ核を発生した（図3C）。赤血球は、通常 、腫瘍間隙中に観察された。24時間までに、腫瘍壊死の進行が腫瘍中で見られた （図3D）。72時間までに、腫瘍の中央領域全体が形態学的に不明瞭な壊死組織片 （debris）に凝集した。 試験した３つの腫瘍のうち１つにおいて、５〜10細胞層厚の腫瘍細胞の生存可 能縁が、腫瘍の周辺で見られた。その周辺部で、腫瘍が周辺の正常組織に浸潤し ていた。同一の腫瘍の連続切片の免疫組織学的検査は、腫瘍浸潤領域中の血管が IIクラス抗原を欠いていたことを示した。 30分または24時間前にB21-2/10H10二重特異性抗体（20μg）のみを受けたコン トロールマウス由来の腫瘍は、梗塞形成の徴候を示さなかった。tTF（16μg）の み、あるいはB21-2/OX7またはSFR8/10H10との組み合わせを受けたマウス由来の 腫瘍は、注射後30分では梗塞形成の徴候を示さなかったが、注射後24時間では腫 瘍中の偶発的な血管（全ての血管の約20％）が梗塞形成した。これらは、腫瘍の 核において最も一般的であるようであった。 血栓または形態学的異常が、凝固リガンドまたはtTFの投与の30分後、４時間 後および24時間後に腫瘍を有するマウスから取られた肝臓、腎臓、肺、腸、心臓 、脳、副腎、膵臓および脾臓のパラフィン切片において見られなかった。 ４．固形腫瘍の腫瘍退行 図４は、B21-2/10H10およびtTFからなる凝固リガンドを、直径0.8cmの腫瘍を 有するマウスに投与した、代表的な抗腫瘍研究の結果を示す。腫瘍は、それらの 処置前サイズの約半分に退行した。７日目で処置を繰り返すことにより、腫瘍は さらに、通常は完全に退行した。７匹の動物のうち５匹において、完全な退行が 得られた。２匹のマウスは、４か月後および６か月後に続いて再発した。これら の抗腫瘍効果は、全ての他の群と比較した場合、統計学的に高度に有意（P<0.00 1）である。 tTFのみ、またはイソ型が一致したコントロールの二重特異性抗体（SFR8/10H1 0またはB21-2/OX7）と混合したtTFで処置したマウスの腫瘍は、抗体または希釈 剤のみを受ける群の腫瘍よりも、よりゆっくり増殖した。これらの違いは、12日 〜14日で統計学的に有意（P<0.05）であった。従って、B21-2/10H10凝固リガン ドで見られた抗腫瘍効果の一部は、tTF自体のわずかな非特異的作用のためであ る。 研究の最後で、希釈剤のみで処置し、そして2.0cm3および2.7cm3の非常に大き な腫瘍（すなわち、体重の10％〜15％）を有した２匹のマウスに、凝固リガンド 治療を行った。両方とも、完全な緩解を有したが、それらの腫瘍はその後、腫瘍 増殖の元の部位で再増殖した。 Ｃ．議論 本研究は、凝固を誘導する能力を事実上有しない可溶性ヒトtTFが、腫瘍内皮 細胞に対して二重特異性抗体により標的化される場合、腫瘍血管系に対して強力 なトロンボゲンとなることを示す。インビトロ凝固の研究は、tTFの血栓活性の 修復が、細胞表面上の抗原への架橋を介して仲介されることを示した。 tTFは、高親和性を有する第VII因子および第VIIa因子を結合し、そしてVIIaの 触媒活性を高めるが、血漿の凝固を誘導しない。なぜなら、tTF：VIIa複合体は 、第IX因子および第X因子の効率的な活性化のために膜表面と会合しなければな らないからである（Rufら、1991；Krishnaswamyら、1992）。二重特異性抗体に よるtTF：VIIaの細胞表面への連結は、tTF：VIIaを膜の極近くに近接させること により凝固を誘導する能力を修復する：膜リン脂質は、第IX因子または第X因子 との凝固開始複合体が、凝固プロセスにおいて中間体を組立て、そして効率的に 生 成し得る表面を提供する。 IIクラスに対する凝固リガンドの、IIクラスを発現する血管系を有する腫瘍を 有するマウスへの投与は、腫瘍中の血管の急速な血栓症を引き起こした。これに 引き続き、大部分の動物における腫瘍の梗塞および完全な腫瘍退行があった。完 全な退行が得られなかった動物において、腫瘍は、腫瘍が周囲の正常組織に浸潤 した腫瘍周辺部の腫瘍細胞の生存縁から再増殖した。腫瘍の増殖端での血管は、 IIクラス抗原を欠いていた。従って、凝固リガンドによるこれらの血管の血栓症 がないことを説明する。これらの生存細胞は、既に見出されているように（Burr owsおよびThorpe、1993）、腫瘍細胞自体に作用する薬物を同時投与することに より死滅され得るようである。 凝固リガンドの抗腫瘍効果は、抗IIクラス抗体および脱グリコシル化リシンＡ 鎖からなるイムノトキシンを用いる同一の腫瘍モデルにおいて得られる効果（Bu rrowsおよびThorpe、1993）と類似の大きさであった。２つの薬剤間の１つの違 いは、作用の速度である。凝固リガンドは、30分未満で腫瘍血管の血栓症を誘導 する。一方、イムノトキシンは同様の効果を達成するのに６時間要した。イムノ トキシンはよりゆっくり作用する。なぜなら、血栓症は、タンパク質合成の閉鎖 により生じる内皮細胞損傷に対して二次的であるからである。 イムノトキシンと凝固リガンドとの間の第２の重要な違いは、それらが異なる 毒性の副作用を有することである。イムノトキシンは、抗生物質を与えて、腸内 細菌によるIIクラス誘導を抑制しない限り、IIクラス発現の胃腸上皮の致死破壊 を生じた。凝固リガンドは、血液を除いて凝固因子が存在しないことから予想さ れるように胃腸損傷を生じなかったが、高用量で投与された場合に、いくつかの マウスにおいて凝固障害を生じた。 本報告に記載される知見は、ヒト凝固誘導タンパク質を腫瘍血管系に対して標 的化する治療能力を示す。臨床適用のため、抗体または他のリガンドは、固形腫 瘍の血管内皮細胞の表面に存在するが、正常組織の内皮細胞に存在しない分子に 結合することが必要とされる。腫瘍内皮マーカーは、腫瘍由来血管形成因子（Fo lkman、1985）またはサイトカイン（Burrowsら、1991；Rucoら、1990）により直 接誘導され得るか、あるいは新血管形成中の内皮細胞の急速な増殖（Denekampお よびHobson、1982）および転移（Folkman、1985）に関し得る。 いくつかの候補抗体が記載されている。エンドグリンに対する抗体であるTEC- 11は、ヒト腫瘍内皮細胞に選択的に結合する特定の例である。 他の抗体として、エンドシアリンに対するFB5（Rettigら、1992）、エンドグ リン様分子に対するE-9（Wangら、1993）、フィブロネクチンのイソ型に対するB C-1（Carnemollaら、1989）ならびに骨肉腫関連抗原に対するTP-1およびTP-3（B rulandら、1988）が挙げられる。CD34は、転移性内皮細胞および腫瘍および胎児 組織における出芽性毛細管（budding capillaries）のアルブミン（abluminal） プロセスに対してアップレギュレートされることが報告されている（Schlingema nnら、1990）。血管内皮細胞増殖因子（VEGF）に対するレセプターは、おそらく 低酸素症に応答して（Thiemeら、1995）腫瘍血管においてアップレギュレートさ れ（Plateら、1993；Brownら、1993）、そして腫瘍血管においてVEGFを選択的に 濃縮する（Dvorakら、1991）。 凝固誘導タンパク質をこれらのおよび他の腫瘍内皮細胞マーカーに標的化する ことによる腫瘍梗塞形成の誘導は、固形腫瘍の処置への価値のある新規アプロー チとして提案される。専らヒト凝固リガンドを産生するために、ヒト（またはヒ ト化）抗体のヒト凝固タンパク質への結合は、特に意図される。従って、与えら れる処置過程を繰返すことにより、初期腫瘍およびその転移の両方と戦うことが 可能となる。 実施例IV 短縮型組織因子（tTF）構築物の合成 tTFは、本明細書では成熟組織因子タンパク質の細胞外ドメイン（成熟タンパ ク質のアミノ酸１〜219；配列番号23）として示される。配列番号23は、例えば 、配列番号22によりコードされる。 Ａ．H6[tTF] H6Ala Met Ala[tTF]。tTF相補的DNA（cDNA）を、以下のように調製した：J-82 細胞（ヒト膀胱ガン）由来のRNAを、tTFのクローニングのために使用した。全RN Aを、GlassMaxTMRNAマイクロ単離試薬（Gibco BRL）を用いて単離した。RNAを、 GeneAmp RNA PCRキット（Perkin Elmer）を用いてcDNAに逆転写した。tTF cDNA を、同一キットを用いて以下の２つのプライマーで増幅した： 下線を引いた配列は、tTFのN-末端をコードする。5'プライマー中の残りの配 列は、発現ベクターへのtTFのクローニングを可能にするNcoIの制限部位である 。3'プライマー中の配列は、発現ベクターへのtTFのクローニングのためのHindI II部位である。PCR増幅を、製造者により提案されるように実施した。簡潔に述 べると、75μM dNTP；0.6μMプライマー、1.5mM MgCl2を使用し、そして95℃で3 0秒、55℃で30秒および72℃で30秒の30サイクルを実施した。 E.coli発現ベクターH6pQE-60を、tTFを発現するために使用した（Leeら、1994 ）。PCR増幅tTF cDNAを、NcoIとHind3部位との間に挿入した。H6pQE-60は、組込 まれた(His)6コード配列を有し、その結果発現タンパク質は、N-末端で(His)6配 列を有し、これはNi-NTAカラムで精製し得る。 tTFを精製するため、tTF含有H6pQE-60 DNAを、E.coli TG-1細胞に形質転換し た。細胞をOD600=0.5まで増殖し、そしてIPTGを30μMまで添加し、tTF産生を誘 導した。30℃で18時間振盪後、細胞を採集した。細胞ペレットを6M Gu-HCl中で 変性し、そして溶解液をNi-NTAカラム（Qiagen）に載せた。結合tTFを6M尿素で 洗浄し、そしてtTFを、室温で16時間、6M〜1M尿素の勾配で再び折り畳んだ（ref old）。カラムを洗浄緩衝液（0.05 NaH2PO4、0.3M NaCl、10％グリセロール）で 洗浄し、そしてtTFを洗浄緩衝液中の0.2Mイミドゾール（Imidozole）で溶出した 。溶出したtTFを濃縮し、そしてG-75カラムに載せた。tTF単量体を採取した。 Ｂ．tTF Gly[tTF]。GlytTF相補的DNA（cDNA）を、PCRにおいて5'プライマーを以下のプ ライマーで置き換えたこと以外は前記セクションで記載したのと同一の方法で調 製した。 下線を引いた配列は、tTFのN-末端をコードする。残りの配列は、NcoIの制限 部位およびトロンビンの切断部位をコードする。 H6pQE-60発現ベクターおよびタンパク質精製の手法は、最終タンパク質生成物 をトロンビンで処理してH6ペプチドを除去したこと以外は上記と同一である。こ れを、１部のトロンビン（Sigma）を500部のtTF（w/w）に添加することにより行 い、そして切断を室温で18時間実施した。混合物をベンズアミジンセファロース 6Bトロンビンアフィニティーカラム（Pharmacia）に通すことにより、トロンビ ンをtTFから除去した。 Ｃ．システイン改変tTFS tTF構築物を、N末端またはC末端システインで改変して、ジスルフィド結合を 介する誘導体化抗体への結合を容易にした。 H6C[tTF]。(His)6Ala Met Ala Cys-[tTF]。PCRにおいて5'プライマーを以下の プライマーで置き換えたこと以外は前記セクションに記載のように、DNAを作製 した。 すべての手法は、N-末端cysを交換可能な酸化剤／還元剤で保護したこと以外 は、上記と同一であった。 C[tTF]。Gly Ser Cys[tTF2-219]。PCRにおいて5'プライマーを以下のプライマ ーで置き換えたこと以外は前記セクションに記載のように、DNAを作製した。 ベクター構築物およびタンパク質精製は、上記のようにトロンビン処理を使用 して(His)6を除去したこと以外は、(His)6Ala Met Ala Cys[tTF]構築物について 記載したのと同一である。 H6[tTF]C。(His)6Ala Met Ala［tTF］Cys。3'プライマーを以下のプライマー で置き換えたこと以外は(His)6AMA[tTF]セクションに記載と同一の方法で、DNA を作製した。 下線を引いた配列は、tTFのC末端をコードする。残りの配列は、tTFを発現ベ クターにクローニングするためのHindIII制限部位を含有する。 全ての手法は、10mM β-MEを６M Gu-HCl変性溶液中で使用し、C末端システイ ンを交換可能な酸化剤／還元剤で保護したこと以外はtTFセクションに記載と同 一であった。 他の[tTF]Cys単量体（例えば、[tTF 1-220]Cys、[tTF 1-221]Cysおよび[tTF 1 -222]Cys）もまた、同一の方法論を用いて作製（および結合）する。 Ｄ．Ｃリンカー[tTF] Ｃリンカー[tTF]であるGly-Ser-Cys-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-[tTF ]もまた構築した。cDNAを、以下の２工程のPCR手法を用いて作製した： PCR１：リンカーDNAの増幅 NcoI部位、トロンビン切断部位、システイン、リンカーおよびtTFのN末端をコ ードするcDNAを、以下のプライマーを用いて増幅した： 下線を引いた配列は、リンカーペプチドをコードする。PCRにおいて使用したD NAテンプレートは、以下のリンカーをコードする二重鎖DNAであった。 tTFセクションに記載と同一のPCR条件を用いた。95b.p.増幅生成物を、PCR2に おいてtTF DNAに結合した。 PCR2：CysリンカーDNAのtTF DNAへの結合。PCRに使用したDNAテンプレートは 、２つの重複DNAであった：上記のPCR1由来の95b.p.DNAおよびtTF DNA。使用し たプライマーは以下であった： 740b.p.の最終PCR生成物を、NcoIおよびHindIIIで消化し、そしてtTFセクショ ンに記載のようにH6pQE 60に挿入した。 ベクター構築物およびタンパク質精製手法は、C[tTF]セクションに記載と全て 同一である。 実施例Ｖ 二量体組織因子の合成 組織因子二量体が、凝固開始時に単量体よりも強力であり得ることを、本発明 者らは推論した。J82膀胱ガン細胞の表面上の天然の組織因子が、二量体として 存在し得ることが可能である（Fairら、1987）。１つの第VII因子または第VIIa 因子分子の１つの組織因子分子への結合はまた、別の第VII因子または第VIIa因 子の別の組織因子への結合を促進し得る（Fairら、1987；Bachら、1986）。さら に、組織因子は、サイトカインレセプターファミリーのメンバーに対して構造的 相同性を示し（Edgingtonら、1991）、これらのいくつかは二量体化して活性レ セプターを形成する（DaviesおよびWlodawer、1995）。従って、本発明者らは以 下のようにTF二量体を合成した。 Ａ．[tTF] リンカー[tTF] 構造Gly[tTF](Gly)4Ser(Gly)4Ser(Gly)4Ser[tTF]を有するGly[tTF]リンカー[t TF]を作製した。２つのDNA断片を、以下のように、別々にPCR増幅し、結合し、 そしてベクターに挿入した： PCR1：tTFおよびリンカーDNAの5'半分の調製。PCRにおけるプライマー配列は 以下の通りである： Gly[tTF]DNAをDNAテンプレートとして使用した。さらにPCR条件はtTFセクショ ンに記載の通りであった。 PCR2：リンカーDNAの3'半分およびtTF DNAの調製。PCRにおけるプライマー配 列は以下の通りであった： tTF DNAをPCRにおいてテンプレートとして使用した。PCR1由来の生成物を、Nc oIおよびBamHで消化した。PCR2由来の生成物を、HindIIIおよびBamH1で消化した 。消化したPCR1 DNAおよびPCR2 DNAを、NcoIおよびHindIII消化のH6pQE 60 DNA と結合した。 ベクター構築物およびタンパク質精製のための手法は、Gly[tTF]セクションに 記載と同一であった。 Ｂ．Cys[tTF] リンカー[tTF] 構造Ser Gly Cys［tTF 2-219］(Gly)4Ser(Gly)4Ser(Gly)4Ser[tTF]を有するCy s[tTF]リンカー[tTF]もまた構築した。DNAを、以下のプライマーを用いてPCRに より作製した： [tTF]リンカー[tTF]DNAをテンプレートとして使用した。残りのPCR条件は、tT Fセクションに記載と同一であった。ベクター構築物およびタンパク質精製は、 全て、H6C[tTF]の精製に記載の通りであった。 Ｃ．[tTF] リンカー[tTF]cys タンパク質構造[tTF](Gly)4Ser(Gly)4Ser(Gly)4Ser［tTF］Cysを有する[tTF] リンカー[tTF]cys二量体もまた作製した。DNAを、以下のプライマーを用いてPCR により作製した： [tTF]リンカー[tTF]DNAをテンプレートとして使用した。残りのPCR条件は、tT Fセクションに記載と同一であった。ベクター構築物およびタンパク質精製は、[ tTF]cysセクションの精製に記載のように再度実施した。 Ｄ．化学的結合二量体 [tTF]Cys単量体を化学的に結合して、[tTF]Cys-Cys[tTF]二量体を形成する。 これを、室温で１時間、等モル量のDTTを保護した[tTF]Cysに添加して脱保護し 、そして[tTF]CysのC末端でシステインを曝すことにより行う。等モル量の保護 した[tTF]Cysを、DTT/[tTF]Cys混合物に添加し、そして室温で18時間インキュベ ーションを続ける。二量体をG-75ゲル濾過カラムで精製する。 Cys[tTF]単量体を、同一の方法を用いて化学的に結合して、二量体を形成する 。 実施例VI 組織因子変異体の合成 tTF結合第VII因子を第VIIa因子に変換する能力を欠く２つのtTF変異体を記載 する。第VII因子と比較して、血漿中に第VIIa因子は300倍少なく存在する（Morr isseyら、1993）。従って、循環性の変異体tTFは、凝固をほとんど開始し得ず、 それゆえ非常に低い毒性を示す。凝固リガンドにおいて、一旦変異体tTFが結合 抗体を介して腫瘍部位に局所化すると、第VIIa因子が注入されてtTF結合第VII因 子と交換する。変異体は、第VIIa因子の存在下で活性である。 Ａ．[tTF]G164A 「[tTF]G164A」は、Alaにより置換されたtTFのアミノ酸164（Gly）を有する変 異体タンパク質構造を有する。Chameleon二重鎖部位特異的変異誘発キット（Str atagene）を、変異体の生成に使用する。DNAテンプレートはGly[tTF]DNAであり 、そして変異誘発プライマーの配列は以下である： 上記のベクター構築物およびタンパク質精製手法を、Gly[tTF]の精製に使用す る。 Ｂ．[tTF]W158R S162A [tTF]W158R S162Aは、tTFのアミノ酸158（Trp）がArgで置換され、そしてアミ ノ酸162（Ser）がAlaで置換されている二重変異体である。[tTF]G164Aについて の記載と同一の変異誘発方法を使用する。変異誘発プライマーは以下である： 前記ベクター構築物およびタンパク質精製手法を、Gly[tTF]の精製に使用する 。 実施例VII 組織因子接合体の合成 Ａ．化学的誘導体化および抗体結合 抗体tTF接合体を、ジスルフィド結合を介して、化学的に誘導体化した抗体を 化学的に誘導体化したtTFに結合することにより合成した（図５に例示するよう に）。 抗体を５倍モル過剰のスクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル α-（2- ピリジルジチオ）トルエン（SMPT）と室温で１時間反応させて、抗体１分子あた り平均２個のピリジルジスルフィド基を有する誘導体化抗体を得た。誘導体化抗 体を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより精製した。 抗体に対して2.5倍モル過剰のtTFを、45倍モル過剰の2-イミノチオラン（21T ）と室温で１時間反応させて、tTF１分子あたり平均1.5個のスルフヒドリル基を 有するtTFを得た。誘導体化tTFもまた、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ ーにより精製し、そして直ちに誘導体化抗体と混合した。 混合物を放置して室温で72時間反応させ、次いでSephacryl S-300カラムに添 加して抗体-tTF接合体を遊離tTFおよび遊離したピリジン-2-チオンから分離した 。接合体を、抗tTFカラムのアフィニティークロマトグラフィーにより遊離抗体 から分離した。最終接合体生成物の優勢な分子種は、SDS-PAGEにより評価される ように、より少量の多置換接合体（Mr 約202,000以下）を有する単置換抗体-tTF 接合体（Mr 約176,000）であった。 Ｂ．システイン改変tTFの誘導体化抗体への結合 抗体-C[TF]および[tTF]C接合体を、ジスルフィド結合を介して、システイン改 変tTFを化学的に誘導体化した抗体に直接結合することにより合成した（図５に 例示するように）。 抗体を、12倍モル過剰の2ITと室温で１時間反応させて、抗体１分子あたり平 均1.5個のスルフヒドリル基を有する誘導体化抗体を得た。誘導体化抗体をゲル パーミエーションクロマトグラフィーにより精製し、そして直ちに２倍モル過剰 のシステイン改変tTFと混合した。混合物を放置して室温で24時間反応させ、次 いで接合体を、上記のようにゲルパーミエーションクロマトグラフィーおよびア フィニティークロマトグラフィーにより精製した。 最終接合体の優勢な分子種は、SDS-PAGEにより評価されるように、より少量の 多置換接合体（Mr 約202,000以下）を有する単置換接合体（Mr 約176,000）であ った。 Ｃ．システイン改変tTFのFab'フラグメントへの結合 抗体 Fab'-C[tTF]および[tTF]C接合体を調製する。このような接合体は、イン ビボにおいてより強力であり得る。なぜなら、このような接合体は、制限された 内在化（internalization）能により、２価接合体よりも長く細胞表面上に残存 するからである。Fab'フラグメントを、２倍モル過剰のシステイン改変tTFと24 時間混合し、次いで接合体を、上記のようにゲルパーミエーションクロマトグラ フィーおよびアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。 Ｄ．tTF 接合体の凝固活性 tTF接合体を、A20細胞に対する表面上で発現されるIIクラス抗原に結合するB2 1-2モノクローナル抗体を用いて調製した。接合体を、化学的に誘導体化したtTF およびシステイン改変tTFを用いて調製し、そしてCaCl2中のマウス血漿を凝固す る接合体の能力を、A20細胞の表面への結合後測定した。 両方のB21-2接合体は、用量依存様式で、CaCl2中のマウス血漿（コントロール ）の凝固時間を短縮した。tTF接合体は、二重特異性抗体B21-2/10H10を用いて、 A20細胞の表面にtTFを連結した場合に生じるのと同様の凝固促進を示した（図６ ）。 Ｅ．抗腫瘍細胞tTF接合体 tTFが腫瘍血管内皮細胞に標的化される場合、tTFが腫瘍血管内で凝固を誘導す ることが既に確立されている（実施例Ｉ〜III）。本発明者らは、tTFが腫瘍細胞 の表面に標的化される場合、凝固が腫瘍血管内で誘導されることを意図した。 ３つの抗腫瘍細胞抗体（KS1/4、D612、およびXMMCO-791）を、上記の「tTF接 合体の調製」セクションに記載のようにtTFに結合した。KS1/4を、Scripps Rese arch Institute、Department of Immunology、La Jolla、CaliforniaのDr．R．R eisfeldから得た。そしてこれは米国特許第4,975,369号にも記載されている；D6 12は、NCI、Laboratory of Tumor Immunology and Biology Bethesda、Maryland のDr．J．Schlomから得、米国特許第5,183,756号に記載されており、そしてATCC ハイブリドーマ細胞株アクセション番号HB 9796由来の培養上澄みから得られ得 る；XMMCO-791は、ATCCから購入したハイブリドーマ細胞株由来の組織培養上澄 みから精製した。 ヒト結腸ガン細胞株Widrを、KS1/4に対する標的細胞として使用した。Widr細 胞をATCCから購入し、そして10％(v/v)ウシ胎児血清、L-グルタミンおよび抗生 物質を補充したDMEM中、空気において10％(v/v)CO2雰囲気中で維持した。ヒト結 腸ガン細胞株LS147Tを、D612に対する標的細胞として使用した。LS147T細胞をAT CCから購入し、そして10％(v/v)ウシ胎児血清、L-グルタミンおよび抗生物質を 補充したRPMI中、空気において５％(v/v)CO2雰囲気中で維持した。ヒトの非小細 胞肺ガン細胞株H460を、XMMCO-791に対する標的細胞として使用した。H460細胞 を、Dr．Adi Gazdar、Simmons Cancer Center、University of Texas Southwest ern Medical Center、Dallas、Texasから得、そして10％(v/v)ウシ胎児血清、L- グルタミンおよび抗生物質を補充したDMEM中、空気において10％(v/v)CO2雰囲気 中で維持した。３つの細胞株は全て、付着性単層として増殖した。 接合体を、関連の標的抗原を発現する腫瘍細胞に結合した場合、CaCl2中のマ ウス血漿の凝固時間を増大する能力について試験した。腫瘍細胞を、PBS中の0.0 5％(w/v)EDTAを用いて組織培養フラスコから取り出した。細胞を、TF9-6B4およ びTF8-5G9抗体でプレインキュベートして任意の天然の組織因子活性を中和し（M orriseyら、1988）、次いで凝固アッセイをA20細胞について記載の通りに実施し た。 全ての３つの接合体は、標的細胞株に結合した場合、用量依存様式で、CaCl2 中のマウス血漿（コントロール）の凝固時間を短縮した（図７）。これは、tTF が細胞表面に標的化された場合、凝固が腫瘍細胞の表面で加速されたことを示す 。 実施例VIII 組織因子プロドラッグの合成 例示的なtTFプロドラッグは以下の構造を有する：tTF1-219（X）n1（Y）n2Ｚ リガンド、ここでtTF1-219は、サイトゾルドメインおよび膜貫通ドメインを除い たTFを表し；Xは、長さn1のアミノ酸（AA）の疎水性膜貫通ドメイン（1-20 AA） を表し；Yは、長さn2のAAの親水性プロテアーゼ認識配列（適切なプロテアーゼ 認識を確実にするに十分なAA）を表し；Zは、ジスルフィドチオエステルまたは 他の結合基（例えば、(Cys)1-2）を表し；リガンドは、腫瘍細胞、腫瘍EC、結合 組織（支質）または基底膜マーカーを認識する抗体または他の標的化部分を表す 。 tTFプロドラッグは、疾患組織（すなわち、腫瘍）への局所化を可能にする静 脈内注射を意図する。一旦疾患組織に局所化されると、内因性プロテアーゼ（す なわち、メタロプロテイナーゼ、トロンビン、第Xa因子、第VIIa因子、第IXa因 子、プラスミン）は、プロドラッグ由来の親水性プロテアーゼ認識配列を切断す る。これは、疎水性膜貫通配列を局所細胞膜に挿入することを可能にする。一旦 その尾部（tail）が膜内に挿入すると、tTFは凝固誘導特性を回復し、その結果 疾患組織の血管において凝固を形成する。 実施例IX Gla 修飾を欠く凝固因子の合成 Gla（γ-カルボキシグルタミン酸）修飾を欠くビタミンＫ依存性凝固因子（第 II/IIa因子、第VII/VIIa因子、第IX/IXa因子および第X/Xa因子）は、凝固リガン ドの形成に有用であることを意図する。Gla修飾を欠く凝固因子は、貧弱な凝固 剤である。なぜなら、非修飾因子は脂質膜と効率的に会合しないからである：リ ガンドを介した因子の腫瘍の血管または他の部位への標的化により、因子は細胞 表面近傍に戻されるはずであり、そしてその部位での凝固の進行を可能にするは ずである。 「Gla」は、存在するGlu（グルタミン酸）残基の翻訳後修飾により作製される 。 Gla修飾を欠くビタミンＫ依存性凝固因子（第II/IIa因子、第VII/VIIa因子、第I X/IXa因子および第X/Xa因子）は、GluをGlaに改変しない宿主（例えば、細菌） 中でビタミンＫ依存性凝固因子をコードする遺伝子を発現することにより作製さ れ得る。第II/IIa因子、第VII/VIIa因子、第IX/IXa因子および第X/Xa因子のそれ ぞれをコードするDNA配列は、それぞれ配列番号24、配列番号25、配列番号26お よび配列番号27として本明細書に包含される。従って、原核生物の発現は簡単で ある。 このようなGla欠失因子はまた、この遺伝子を発現する前に、この場合は実質 的に任意の宿主細胞において、相当するGlu残基を他のアミノ酸に変化させるよ うに上記の配列のいずれか（配列番号24、配列番号25、配列番号26、および配列 番号27）を変異させることにより作製され得る。変化されるべきコドンは、GAG コドンである（GAAもまたGluをコードし、これは避けられるべきである）。例示 として第VII因子を用いて、Gla「ドメイン」は、一般に216〜325領域に位置する 。第一のGlaコードトリプレットは、配列番号25の231に存在し、そして最後は、 配列番号25の318から伸長する。GAGコドンは、分子生物学的技術を用いて容易に 変化され得る。 図８は、上記のビタミンK依存性凝固因子の各々のGlaドメインが、類似した領 域に位置することを示す。それ故、配列番号24、配列番号26、および配列番号27 のいずれか１つにおける、いわゆる「相当する」Glu残基の変異はまた、容易に 理解される。 以下のコドンの表は、所定のGlaコードコドンまたは配列を改変することにお いて作製される変異の容易な選択を可能にするために提供される。 部位特異的変異誘発は、基礎を成すDNAの特定の変異誘発およびこのDNAへの１ つ以上のヌクレオチド配列の変化の導入による、Gla改変されていない個々のビ タミンＫ依存性凝固因子の調製における使用が意図される技術である。 部位特異的変異誘発は、横断される欠失連結部の両側に安定な２重鎖を形成す るための十分なサイズおよび配列の複雑さのプライマー配列を提供するために、 所望の変異のDNA配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、ならびに十 分な数の隣接したヌクレオチドの使用により変異体を生成させる。代表的には、 改変される配列の結合部の両側に約５〜10残基を有する、約17〜25ヌクレオチド の長さのプライマーが好ましい。 一般には、部位特異的変異誘発の技術は、Adelmanら、（1983）のような刊行 物および上記のTF変異体研究により例示されるように、当該分野において周知で ある。この技術は、代表的には１本鎖および２本鎖形態の両方で存在するファー ジベクターを使用する。部位特異的変異誘発において有用な代表的なベクターは 、M13ファージ（Messingら、1981）のようなベクターを包含する。これらのファ ージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてこれらの使用は、一般に当業者 に周知である。２本鎖プラスミドはまた、目的の遺伝子をプラスミドからファー ジに移す工程を削除する部位特異的変異誘発において日常的に用いられる。 一般に、本明細書による部位特異的変異誘発は、最初に１本鎖ベクターを得る こと、または２本鎖ベクターの２本鎖を融解して分離することにより実施される 。このベクターは、ビタミンＫ依存性凝固因子をコードするDNA配列をその配列 内に含む。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーが（一般的 には、例えばCreaら、（1978）の方法により合成的に）調製される。次いで、こ のプライマーは、１本鎖ベクターとアニールされ、そして変異保有鎖（mutation -bearing strand）の合成を完了するために、E.coliポリメラーゼI Klenowフラ グメントのようなDNA重合酵素に供される。従って、ヘテロ２重鎖が形成され、 ここで１つの鎖は、本来の非変異配列をコードし、そして第２の鎖は所望の変異 を保有する。次いで、このヘテロ２重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、E.co li細胞）を形質転換するために使用され、そして変異配列アレンジメントを保有 する組換えベクターを含有するクローンが選択される。 実施例Ｘ さらなる抗腫瘍血管系抗体 本実施例は、腫瘍血管系と正常な組織の血管系とを区別することにおける使用 のための腫瘍由来内皮細胞「結合因子」に対する抗体の生成を記載する。特に、 血管透過因子（VPF）（血管内皮細胞増殖因子（VEGF）とも呼ばれる）に対する 抗体およびbFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）に対する抗体の生成を記載する。 FGFに関してさらに詳細には、Gomez-PinillaおよびCotman（1992）；Nishikaw aら、(1992)(塩基性線維芽細胞増殖因子の局在化を記載している)；Xuら、(1992 )(FGFの発現および免疫化学的分析に関する)；Reillyら、(1989)(モノクローナ ル抗体に関する)；Dixonら、(1989)(FGF検出および特徴付けに関する)；Matsuza kiら、(1989)(ヘパリン結合成長因子に対するモノクローナル抗体に関する)；な らびにHerblinおよびGross(1992)(血管系に関連した固形腫瘍におけるbFGFにつ いての結合部位を議論している)を引用し得る。 本研究において、ウサギを、ツベルクリン（精製されたタンパク質誘導体、PP D）またはチログロブリンキャリアーとカップリングした、ヒトVEGF、マウスVEG F、モルモットVEGF、ヒトbFGF、マウスbFGF、またはモルモットbFGFのN末端ペプ チドで過免疫した。これらのペプチドは、25〜26アミノ酸の長さであり、そして C末端残基としてシステインを用いてペプチド合成機で合成した。抗血清を、Sep haroseマトリックスにカップリングしたペプチドのカラムにおいてアフィニティ ー精製した。 VEGFに対する抗体を、ELISAならびにモルモットの腫瘍および正常組織の凍結 切片におけるそれらの染色パターンにより同定した。モルモットVEGFおよびヒト VEGFに対するポリクローナル抗体は、それぞれ、モルモットL10腫瘍および種々 のヒト腫瘍（耳下腺ガン、卵巣ガン、乳ガン）の凍結切片上の大多数の血管内皮 細胞と反応した。抗ヒトVEGF抗体は、正常なヒト腎臓糸球体における内皮細胞を 取り囲む糸球体間質細胞および肝臓における内皮細胞を染色したが、しかし正常 なヒトの胃、脚の筋肉、および脾臓における血管を染色しなかった。抗モルモッ トVEGF抗体は、腎臓、脳、脾臓、心臓、精嚢、肺、大腸、胸腺、前立腺（prostr ate）、肝臓、精巣、および骨格筋を含む正常な組織のいずれにおいても内皮細 胞を染色しなかった。 ヒトFGFに対するポリクローナル抗体は、耳下腺ガンおよび卵巣ガンにおける 内皮細胞を染色したが、しかし乳ガンにおける内皮細胞を染色しなかった。抗ヒ トFGF抗体は、ヒト腎臓における糸球体内皮細胞を染色したが、しかし正常な胃 、脚の筋肉、および脾臓における内皮細胞を染色しなかった。 モルモットVEGF、ヒトVEGFおよびモルモットbFGFに対するモノクローナル抗体 を、PPDまたはチログロブリンにカップリングしたN末端配列ペプチド（ペプチド のC末端にシステインを有する）でBALB/cマウスを免疫することにより調製した 。規定された配列の合成ペプチド免疫原は、以下に示され、そしてそれぞれ配列 番号30、配列番号31、および配列番号32で表される： ペプチドを、スクシミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボ キシレート（SMCC）でチログロブリンを誘導体化し、そして誘導体とペプチドを 反応させることにより、チログロブリンまたはPPDに接合させた。これは、チロ グロブリンへのチオエーテル結合により連結される１つ以上のペプチド配列を有 する接合体を与える。 特に、上記配列に対するモノクローナル抗体の生成を、以下の手順を用いて達 成した：BALB/cマウスを、いくつかの部位へのペプチド-PPDまたはペプチド-チ ログロブリンでの連続した注射により免疫した。最後の注射の４または５日後に 、脾臓を取り出し、そして脾細胞を、Morrowら、（1991）に刊行された手順に従 ってポリエチレングリコールを用いて、P3xG3Ag8.653骨髄腫細胞と融合した。 個々のハイブリドーマ上清を以下のようにスクリーニングした： 第１のスクリーニング：ペプチド-チログロブリン被覆したプレートにおけるELI SA。 第２のスクリーニング：チログロブリンへのSMCCにより連結されたシステインに おけるELISA。 第３のスクリーニング：モルモット株10腫瘍またはヒト耳下腺ガンの凍結切片の 間接的免疫ペルオキシダーゼ染色。 第４のスクリーニング：種々の悪性および正常なモルモットおよびヒトの組織の 凍結切片の間接的免疫ペルオキシダーゼ染色。 ペプチド-チログロブリンに結合するが、しかしシステイン-チログロブリンに 結合しない抗体を選択した。これらの抗体は、正常な組織における内皮細胞に結 合するよりも強力に悪性腫瘍における内皮細胞に結合した（表VIII）。 Ａ．ヒトおよびモルモット組織切片のGV97染色 モルモットVEGF N末端に対するGV97抗体は、種々のヒト悪性組織（表IX）およ び正常組織（表X）における内皮細胞に結合した。 悪性腫瘍における内皮細胞への結合は、正常組織における内皮細胞への結合を 超過する傾向があった。 モルモット腫瘍（株10肝細胞性ガン）および正常組織における内皮細胞の染色 は、分布および強度においてヒト組織に観察された染色と類似した（表XI）。 表において、＋は、ネガティブな結果に対立するものとしてのポジティブな結 果を示す。数値2+、3+、および4+は、当該研究分野で日常的に理解されるように 、増大する強度のポジティブシグナルをいう。 Ｂ．GV97 の可溶性ヒトVEGFとの反応性の欠失 VEGF、VEGFレセプター（Flk-1）またはレセプターに結合（または複合体化） したVEGFに特異的である抗体を同定するために、ELISAスクリーニングプロトコ ルを開発した。手順は以下の通りである： 最初に、96ウェルELISAプレート（丸底）を、感作緩衝液中の10μg/mlの100μ l/ウェルのFLK/seapで被覆した（外側のウェルはブランクのままにした）。一晩 のインキュベーション後、このプレートを、一晩の間４℃にて、PBSで２回洗浄 した。次に、FLK/Seap被覆したプレートを、250μl/ウェルのPBS＋CAH（５％） 溶液で１時間37℃にてブロックした。ブロッキング溶液を除去し、プレートを、 ペーパータオル上で勢いよく叩いた。 次いでブロックしたプレートを、結合において２μg/mlで100μl/ウェルのVEG F-165（Dr．Ramakrishnan，University of Minnesotaから入手した酵母において 生成されたVEGF 165 aa形態）＋0.1μg/mlヘパリンとともに室温で４時間または ４℃で一晩インキュベートした。VEGF溶液を回収し、そしてプレートをPBS-twee n（0.10％）で２回洗浄した。次に、100μl/ウェルのハイブリドーマ融合上清を ウェルに添加し、そして１時間32℃にてインキュベートした。この上清のインキ ュベーションの後、プレートをPBS tweenで３回洗浄し、次いでPBS tween＋CAH （５％）中に1:1000で、100μlウェルの二次抗体（KPL，Gt抗マウスIgG）ととも に１時間37℃にてインキュベートした。 二次抗体とのインキュベーションの後、プレートを、PBS tweenで４回洗浄し 、100μl/ウェルの基質（クエン酸緩衝液＋H2O2に溶解したSubstrate Sigma OPD ）とともに20分間インキュベートし、そしてCambridge Technology Microplate Reader（Model 7520）において490nmで読み取った。適切なコントローウェルよ り高い吸光度を有するウェルを、ポジティブとして選択し、そしてさらに特徴付 けた。 GV97は、組換えVEGF被覆ELISAプレートに結合せず、しかも組換えヒトVEGFは 、GV97被覆したELISAプレートに結合しないことを見出した。可溶性組換えヒトV EGFは、50μg/mlで添加された場合でさえ、組織学的な切片における腫瘍内皮へ の５μg/ml GV97の結合をブロックしなかった。 これらのデータは、組換えヒトVEGFにおいて隠されるが、VEGFが内皮細胞上の そのレセプターに結合すると接近可能になるVEGFのエピトープを、GV97が認識す ることを示唆している。 Ｃ．株10保有モルモットにおけるGV97局在化 組織学的切片から得られた染色データとは対照的に、GV97抗体は、株10腫瘍保 有モルモットへの注射の後、腫瘍内皮細胞に選択的に局在化した（表XII）。こ の腫瘍における内皮細胞の染色は、中程度の強さであったが、一方、種々の器官 における正常な内皮の染色は、検出不能であった。 Ｄ．抗-bFGFは、腫瘍内皮細胞に選択的に結合する GV97およびGF82（これらは、モルモットbFGFのＮ末端に対して惹起された）は 、モルモット株10腫瘍の凍結反応における内皮細胞および２つの型のヒト悪性腫 瘍における内皮細胞に強く結合した（表XIII）。対照的に、種々のモルモット正 常組織における内皮細胞の比較的弱い染色が観察された。 実施例XI ヒト処置プロトコル 本実施例は、本発明の二重特異性結合および凝固リガンドを用いるヒト処置プ ロトコルに関する。これらのリガンドは、種々のヒトのガンおよびさらに他の疾 患（例えば、中期またはより長期の血流の停止が有利である、良性前立腺肥大症 および慢性関節リウマチ）の臨床的処置における使用が意図される。 二重特異性リガンドは、抗腫瘍治療において特に有用な道具であると考えられ ている。動物研究を含む本明細書に示されるデータ、ならびにリンパ腫の処置（ Glennieら、1988）、Ｔ細胞標的化（NolanおよびKennedy，1990）および薬物標 的化（Paulus，1985）に関する当該分野における知識から、適切な用量および処 置法は、容易に開発され得る。 当然、広範な使用の前に、さらなる動物研究および臨床治験が行われる。患者 の処置およびモニタリングを含む、臨床治験を行うための種々の要素は、本開示 の見解から当業者に公知である。以下の情報は、このような治験を確立すること における使用のための一般的な指針として示されている。 研究のために選択される患者は、従来の治療の少なくとも１つの課程に応答し 得ず、そして身体検査、研究室技術、またはＸ線撮影手順により決定される客観 的に測定され得る疾患を有しなければならないことが意図される。マウスモノク ローナル抗体部分が用いられる場合、患者は、マウス免疫グロブリンに対するア レルギーの病歴を有していないべきである。いかなる化学療法も、研究に入る少 なくとも２週間前に止められるべきである。 二重特異性リガンド投与に関して、３つの管腔ポートを備える留置中心静脈カ テーテル（indwelling central venous catheter with a triple lumen port） の使用において特定の利点が見出されると考えられる。二重特異性リガンドは、 例えば、0.22μmフィルターを用いて濾過され、そして例えば、生理食塩水で、1 00mlの最終用量まで適切に希釈されるべきである。使用前に、試験試料もまた、 同様の方法で濾過され、そしてその濃度は、A280を測定することにより濾過の前 および後に評価されるべきである。予測される回収率は、87〜99％の範囲内であ るべきであり、次いでタンパク質損失のための調整が説明され得る。 二重特異性リガンドは、各患者に2〜7日間隔に2〜4回の注入で、約４〜24時間 の期間にわたって投与され得る。投与はまた、７日間にわたる定常速度の注入に より実施され得る。任意の用量レベルで与えられる注入は、観察される任意の毒 性に依存するべきである。従って、グレードII毒性が、任意の単回の注入後、ま たは定常速度の注入の特定の期間に達成された場合、毒性が改善されない限り、 さらなる用量は差し控えられるか、または定常速度の注入は停止されるべきであ る。増加した用量の二重特異性凝固リガンドは、任意のカテゴリーにおいて、患 者の約60％が受容し得ないグレードIIIまたはグレードIV毒性を示すまで患者の 群に投与されるべきである。この値の2/3である用量は、安全な用量として定義 され得る。 身体検査、腫瘍測定、および臨床検査は、勿論、処置の前にそして一ヶ月後ま での間隔で実施されるべきである。臨床試験は、全血球数、血清クレアチニン、 クレアチンキナーゼ、電解質、尿素、窒素、SGOT、ビリルビン、アルブミン、お よび総血清タンパク質を含むべきである。処置後60日までに採取される血清試料 は、完全な二重特異性リガンドまたはその成分およびリガンドのいずれかまたは 両方の部分に対する抗体の存在についてラジオイムノアッセイにより評価される べきである。任意の標準的なアッセイ（例えば、ELISAまたはRIA）を用いる、血 清の免疫学的分析は、治療薬剤の薬物動態学およびクリアランスの評価を可能に する。 抗腫瘍応答を評価するために、患者は、最後の注入から48時間〜１週間に検査 され、そして30日後に再び検査されるべきであることが意図される。触知可能な 疾患が存在する場合、全ての塊の２つの垂直直径は、処置の間毎日、治療の完了 後１週間以内、および30日目に測定されるべきである。触知不可能な疾患を測定 するために、一連のCTスキャンが、48時間〜１週間目に、そして30日目に再び、 胸部、腹部、および骨盤を通して1-cm間隔で実施され得る。組織試料はまた、疾 患部位からの生検、あるいは適切である場合は、血液または液体試料までも用い て、組織学的に、および/またはフローサイトメトリーにより評価されるべきで ある。 臨床的な応答は、条件にあった尺度により定義され得る。例えば、完全な応答 は、処置１ヶ月後の全ての測定可能な腫瘍の消失により定義され得る。一方、部 分的な応答は、全ての腫瘍部位が拡大を示さない、処置１ヶ月後の全ての評価し 得る腫瘍結節の直角をなす直径の積の合計の50％以上の減少により定義され得る 。同様に、混合応答は、１つ以上の部位における進行を伴って、処置１ヶ月後の 全ての測定可能な病巣の直角をなす直径の積の50％以上の減少により定義され得 る。 ＊ ＊ ＊ 本明細書中で開示および請求される全ての組成物および方法は、本開示の見解 から、過度の実験を要することなく作製および遂行され得る。本発明の組成物お よび方法は、好ましい実施態様に関して記載されているが、改変が、本発明の概 念、精神、および範囲を逸脱することなく、本明細書中に開示される組成物、方 法、および方法の工程または一連の工程に適用され得ることは当業者に明らかで ある。さらに詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤が、 同一または類似した結果が達成されながら本明細書中に記載される薬剤に代用さ れ得ることは明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似した置換お よび改変は、添付の請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概 念内にあると考えられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 トルペ， フィリップ イー. アメリカ合衆国 テキサス 75214， ダ ラス， ウエストレイク アベニュー 6918 (72)発明者 エドギントン， トーマス エス. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037, ラ ホヤ，アベニダ デ ラ プラヤ 2362

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．以下の(a)および(b)を含む結合リガンド： (a)疾患細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関連支質の成分に結合する 第１結合領域；該第１結合領域が作動可能に連結した (b)凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。 ２．前記第１結合領域がIgG抗体、IgM抗体、または抗体の抗原結合性領域を含 む、請求項１に記載の結合リガンド。 ３．前記第１結合領域が、抗体のscFv、Fv、Fab'、FabまたはF(ab')2フラグメ ントを含む、請求項２に記載の結合リガンド。 ４．前記第１結合領域が、腫瘍細胞、腫瘍血管系の成分、または腫瘍支質の成 分に結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項２に記載の結合リガンド。 ５．前記第１結合領域が、腫瘍細胞の細胞表面抗原に結合する抗体の抗原結合 性領域を含む、請求項４に記載の結合リガンド。 ６．前記第１結合領域が、細胞表面腫瘍抗原p185HER2、乳汁ムチンコアタンパ ク質、TAG-72、ルイスa、ガン胎児性抗原(CEA)、または腫瘍関連抗原に結合する 抗体の抗原結合性領域を含み、該腫瘍関連抗原が9.2.27、OV-TL3、MOv18、B3、K S1/4、260F9およびD612からなる群から選択される抗体に結合する、請求項５に 記載の結合リガンド。 ７．前記第１結合領域が、腫瘍血管系の成分に結合する抗体の抗原結合性領域 を含む、請求項４に記載の結合リガンド。 ８．前記第１結合領域が、腫瘍血管系細胞表面レセプターに結合する抗体の抗 原結合性領域を含む、請求項７に記載の結合リガンド。 ９．前記第１結合領域が、MHCクラスIIタンパク質、VEGF/VPFレセプター、FGF レセプター、TGFβレセプター、TIE、VCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、αv β3インテグリン、プレイオトロピン、エンドシアリンまたはエンドグリンに結 合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項８に記載の結合リガンド。 １０．前記第１結合領域が、エンドグリンに結合する抗体の抗原結合性領域を 含む、請求項９に記載の結合リガンド。 １１．前記第１結合領域が、モノクローナル抗体TEC-4またはモノクローナル 抗体TEC-11と同じエピトープに結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項１ ０に記載の結合リガンド。 １２．前記第１結合領域が、VEGFレセプターに結合する抗体の抗原結合性領域 を含む、請求項９に記載の結合リガンド。 １３．前記第１結合領域が、モノクローナル抗体3E11、3E7、5G6、4D8または1 0B10と同じエピトープに結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項１２に記 載の結合リガンド。 １４．前記第１結合領域が、モノクローナル抗体TEC-110と同じエピトープに 結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項１２に記載の結合リガンド。 １５．前記第１結合領域が、腫瘍血管系細胞表面レセプターに結合するリガン ドに結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項７に記載の結合リガンド。 １６．前記第１結合領域が、VEGF/VPF、FGF、TGFβ、TIEに結合するリガンド 、腫瘍関連フィブロネクチンイソ型、スキャッターファクター、肝細胞増殖因子 (HGF)、血小板第４因子(PF4)、PDGFまたはTIMPに結合する抗体の抗原結合性領域 を含む、請求項１５に記載の結合リガンド。 １７．前記第１結合領域が、VEGF/VPF、FGF、TGFβ、TIEに結合するリガンド または腫瘍関連フィブロネクチンイソ型に結合する抗体の抗原結合性領域を含む 、請求項１６に記載の結合リガンド。 １８．前記第１結合領域が、誘導性の腫瘍血管系成分に結合する抗体の抗原結 合性領域を含む、請求項７に記載の結合リガンド。 １９．前記第１結合領域が、コアギュラントにより誘導性の腫瘍血管系成分に 結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項１８に記載の結合リガンド。 ２０．前記第１結合領域が、トロンビンにより誘導性の腫瘍血管系成分に結合 する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項１９に記載の結合リガンド。 ２１．前記第１結合領域が、P-セレクチンまたはE-セレクチンに結合する抗体 の抗原結合性領域を含む、請求項２０に記載の結合リガンド。 ２２．前記第１結合領域が、サイトカインによって誘導性の腫瘍血管系成分に 結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項１８に記載の結合リガンド。 ２３．前記第１結合領域が、単球、マクロファージ、マスト細胞、ヘルパーＴ 細胞、CD8-陽性Ｔ細胞またはNK細胞が放出するサイトカインによって誘導性の腫 瘍血管系成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項２２に記載の結合 リガンド。 ２４．前記第１結合領域が、サイトカインIL-1、LI-4、TNF-α、TNF-βまたは IFN-γによって誘導性の腫瘍血管系成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含む 、請求項２２に記載の結合リガンド。 ２５．前記第１結合領域が、E-セレクチン、VCAM-1、ICAM-1、エンドグリンま たはMHCクラスII抗原に結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項２２に記 載の結合リガンド。 ２６．前記第１結合領域が、E-セレクチンに結合する抗体の抗原結合性領域を 含む、請求項２５に記載の結合リガンド。 ２７．前記第１結合領域が、MHCクラスII抗原に結合する抗体の抗原結合性領 域を含む、請求項２５に記載の結合リガンド。 ２８．前記第１結合領域が、リガンド:レセプター複合体に結合する抗体であ るが、該リガンドまたはレセプターがリガンド:レセプター複合体になっていな い場合には該リガンドまたは該因子レセプターに結合しない抗体の抗原結合性領 域を含む、請求項７に記載の結合リガンド。 ２９．前記第１結合領域が、モノクローナル抗体2E5、3E5または4E5と同じエ ピトープに結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項２８に記載の結合リガ ンド。 ３０．前記第１結合領域が、腫瘍支質の成分に結合する抗体の抗原結合性領域 を含む、請求項４に記載の結合リガンド。 ３１．前記第１結合領域が、テネイシンに結合する抗体の抗原結合性領域を含 む、請求項３０に記載の結合リガンド。 ３２．前記第１結合領域が、基底膜成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含 む、請求項３０に記載の結合リガンド。 ３３．前記第１結合領域が、活性化血小板に結合する抗体の抗原結合性領域を 含む、請求項３０に記載の結合リガンド。 ３４．前記第１結合領域が、誘導性の腫瘍支質成分に結合する抗体の抗原結合 性領域を含む、請求項３０に記載の結合リガンド。 ３５．前記第１結合領域が、コアギュラントによって誘導性の腫瘍支質成分に 結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項３４に記載の結合リガンド。 ３６．前記第１結合領域が、トロンビンによって誘導性の腫瘍支質成分に結合 する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項３５に記載の結合リガンド。 ３７．前記第１結合領域が、RIBSに結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請 求項３６に記載の結合リガンド。 ３８．前記第１結合領域が、疾患細胞または疾患関連血管系の成分に結合する リガンドまたはレセプターを含む、請求項１に記載の結合リガンド。 ３９．前記第１結合領域が、腫瘍細胞表面レセプターに結合するリガンド、ま たは腫瘍細胞表面分子に結合するリガンドに結合するレセプターの可溶性結合ド メインを含む、請求項３８に記載の結合リガンド。 ４０．前記第１結合領域が、腫瘍血管系の成分に結合するリガンドまたはレセ プターを含む、請求項３８に記載の結合リガンド。 ４１．前記第１結合領域が、腫瘍血管系内皮細胞表面レセプターに結合するリ ガンドを含む、請求項４０に記載の結合リガンド。 ４２．前記第１結合領域が、VEGF/VPF、FGF、TGFβ、TIEに結合するリガンド 、腫瘍関連フィブロネクチンイソ型、スキャッターファクター、肝細胞増殖因子 (HGF)、血小板第４因子(PF4)、PDGFまたはTIMPを含む、請求項４１に記載の結合 リガンド。 ４３．前記第１結合領域がVEGF/VPFを含む、請求項４２に記載の結合リガンド 。 ４４．前記第１結合領域がFGFを含む、請求項４２に記載の結合リガンド。 ４５．前記第１結合領域が、腫瘍血管系内皮細胞表面レセプターに結合するリ ガンドに結合するレセプターの可溶性結合ドメインを含む、請求項４０に記載の 結合リガンド。 ４６．前記第１結合領域が、VEGF/VPFレセプターの可溶性結合ドメインを含む 、請求項４５に記載の結合リガンド。 ４７．前記第１結合領域が凝固因子に作動可能に連結している、請求項１に記 載の結合リガンド。 ４８．前記凝固因子が、ビタミンＫ依存性II/IIa凝固因子、VII/VIIa因子、IX /IXa因子またはX/Xa因子を含む、請求項４７に記載の結合リガンド。 ４９．前記凝固因子が、Gla改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子を含む、請 求項４８に記載の結合リガンド。 ５０．前記凝固因子が、ビタミンＫ依存性凝固因子をコードする遺伝子を原核 宿主中で発現させることによって調製される、請求項４９に記載の結合リガンド 。 ５１．前記凝固因子が、ビタミンＫ依存性凝固因子タンパク質を処理して、そ の対応のグルタミン酸残基を除去または変更することによって調製される、請求 項４９に記載の結合リガンド。 ５２．前記凝固因子が、その対応のグルタミン酸残基を欠くビタミンＫ依存性 凝固因子をコードする操作された凝固因子遺伝子を調製すること、および該操作 された遺伝子を組換え宿主細胞中で発現させることによって調製される、請求項 ４９に記載の結合リガンド。 ５３．前記凝固因子が、組織因子または組織因子誘導体を含む、請求項４７に 記載の結合リガンド。 ５４．前記凝固因子が、VII因子を活性化する能力が欠損した変異組織因子を 含む、請求項５３に記載の結合リガンド。 ５５．前記凝固因子が、約157位と約167位との間のアミノ酸領域における変異 を伴う組織因子を含む、請求項５４に記載の結合リガンド。 ５６．前記凝固因子が変異組織因子を含み、158位のTrpがArgに変化し；162位 のSerがAlaに変化し；164位のGlyがAlaに変化し；または158位のTrpがArgに変化 し、かつ162位のSerがAlaに変化している、請求項５５に記載の結合リガンド。 ５７．前記凝固因子が短縮型組織因子を含む、請求項５３に記載の結合リガン ド。 ５８．前記凝固因子が二量体の短縮型組織因子を含む、請求項５７に記載の結 合リガンド。 ５９．前記凝固因子がラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーターを含む、 請求項４７に記載の結合リガンド。 ６０．前記凝固因子が血小板活性化化合物を含む、請求項４７に記載の結合リ ガンド。 ６１．前記凝固因子がトロンボキサンA2またはトロンボキサンA2シンターゼを 含む、請求項６０に記載の結合リガンド。 ６２．前記凝固因子がフィブリン溶解のインヒビターを含む、請求項４７に記 載の結合リガンド。 ６３．前記凝固因子がα2-抗プラスミンを含む、請求項６２に記載の結合リガ ンド。 ６４．前記第１結合領域が、凝固因子に結合する第２結合領域に作動可能に連 結している、請求項１に記載の結合リガンド。 ６５．前記第２結合領域に結合した凝固因子をさらに含む、請求項６４に記載 の結合リガンド。 ６６．前記第２結合領域が、凝固因子に結合する抗体の抗原結合性領域を含む 、請求項６４に記載の結合リガンド。 ６７．前記第２結合領域が、IgG抗体、IgM抗体、あるいは抗体のscFv、Fv、Fa b'、FabまたはF(ab')2フラグメントを含む、請求項６６に記載の結合リガンド。 ６８．前記第２結合領域が、ビタミンＫ依存性II/IIa凝固因子、VII/VIIa因子 、IX/IXa因子またはX/Xa因子に結合する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項６ ６に記載の結合リガンド。 ６９．前記第２結合領域が、Gla改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子に結合 する抗体の抗原結合性領域を含む、請求項６８に記載の結合リガンド。 ７０．前記第２結合領域が、組織因子に結合する抗体の抗原結合性領域を含む 、請求項６６に記載の結合リガンド。 ７１．前記第２結合領域が、変異組織因子に結合する抗体の抗原結合性領域を 含む、請求項７０に記載の結合リガンド。 ７２．前記第２結合領域が、短縮型組織因子に結合する抗体の抗原結合性領域 を含む、請求項７０に記載の結合リガンド。 ７３．前記第２結合領域が、二量体の短縮型組織因子に結合する抗体の抗原結 合性領域を含む、請求項７２に記載の結合リガンド。 ７４．前記第２結合領域が、ラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベータ、ト ロンボキサンA2またはα2-抗プラスミンに結合する抗体の抗原結合性領域を含む 、請求項６６に記載の結合リガンド。 ７５．前記第１結合領域が、共有結合を介して前記凝固因子または前記第２結 合領域に作動可能に連結している、請求項１に記載の結合リガンド。 ７６．前記第１結合領域が、化学的架橋リンカーを介して前記凝固因子または 前記第２結合領域に作動可能に連結している、請求項７５に記載の結合リガンド 。 ７７．前記結合リガンドが、宿主細胞中で組換えベクターを発現させることに よって調製される融合タンパク質であり、該ベクターが、同じリーディングフレ ーム中に、前記凝固因子または第２結合領域をコードするDNAセグメントに作動 可能に連結した前記第１結合領域をコードするDNAセグメントを含む、請求項７ ５に記載の結合リガンド。 ７８．前記第１結合領域が、アビジン：ビオチンの組み合わせを用いて、前記 凝固因子または前記第２結合領域に作動可能に連結している、請求項１に記載の 結合リガンド。 ７９．二重特異性抗体としてさらに規定される請求項１に記載の結合リガンド であって、該二重特異性抗体が、腫瘍細胞、腫瘍関連血管系の成分、または腫瘍 関連支質の成分に結合する第１抗原結合性領域を含み、該第１抗原結合性領域が 、凝固因子に結合する第２抗原結合性領域に作動可能に連結している、結合リガ ンド。 ８０．IgG抗体、IgM抗体、あるいは二重特異性抗体のscFv、Fv、Fab'、Fabま たはF(ab')2フラグメントとしてさらに規定される、請求項７９に記載の結合リ ガンド。 ８１．短縮型組織因子に結合する第２抗原結合性領域に作動可能に連結してい る、MHCクラスIIタンパク質に結合する第１抗原結合性領域を含む二重特異性抗 体としてさらに規定される、請求項７９に記載の結合リガンド。 ８２．以下の(a)および(b)を含む結合リガンド： (a)腫瘍細胞、腫瘍関連血管系の成分、または腫瘍関連支質の成分に結合する 第１結合領域；該第１結合領域が作動可能に連結した (b)操作された凝固因子、または操作された凝固因子に結合する第２結合領域 。 ８３．前記操作された凝固因子が、Gla改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子 である、請求項８２に記載の結合リガンド。 ８４．前記操作された凝固因子が、Gla改変を欠く、II/IIa凝固因子、VII/VII a因子、IX/IXa因子またはX/Xa因子である、請求項８３に記載の結合リガンド。 ８５．前記操作された凝固因子が、ビタミンＫ依存性凝固因子遺伝子を原核宿 主中で発現させることによって調製される、請求項８３に記載の結合リガンド。 ８６．前記操作された凝固因子が、ビタミンＫ依存性凝固因子タンパク質を処 理して、その対応のグルタミン酸残基を除去または変更することによって調製さ れる、請求項８３に記載の結合リガンド。 ８７．前記操作された凝固因子が、対応するグルタミン酸残基を欠くビタミン Ｋ依存性凝固因子をコードする操作された凝固因子遺伝子を調製すること、およ び該操作された遺伝子を組換え宿主細胞中で発現させることによって調製される 、請求項８３に記載の結合リガンド。 ８８．前記操作された凝固因子が、第２の組織因子または誘導体に作動可能に 結合した第１の組織因子または誘導体を含む組織因子構築物である、請求項８２ に記載の結合リガンド。 ８９．前記組織因子構築物が短縮型組織因子を含む、請求項８８に記載の結合 リガンド。 ９０．前記組織因子構築物が、疎水性膜挿入部分を含む、請求項８９に記載の 結合リガンド。 ９１．前記組織因子構築物が、約３と約20との間の疎水性アミノ酸の連続部分 を含む短縮型組織因子を含む、請求項９０に記載の結合リガンド。 ９２．前記組織因子構築物が短縮型組織因子を含み、該短縮型組織因子が該短 縮型組織因子のＮ末端またはＣ末端に位置する疎水性アミノ酸の連続部分を含む 、請求項９１に記載の結合リガンド。 ９３．前記組織因子構築物が、脂肪酸を含む短縮型組織因子を含む、請求項９ ０に記載の結合リガンド。 ９４．前記組織因子構築物が２つの短縮型組織因子を含み、これらの各々が膜 挿入部分を含む、請求項９０に記載の結合リガンド。 ９５．前記組織因子構築物が、ジスルフィド、チオエーテルまたはペプチド結 合で作動可能に連結した第１および第２の組織因子または誘導体を含む、請求項 ８８に記載の結合リガンド。 ９６．前記第１結合領域が、操作された凝固因子に結合する第２結合領域に作 動可能に連結している、請求項８２に記載の結合リガンド。 ９７．前記第１結合領域が操作された凝固因子に作動可能に連結している、請 求項８２に記載の結合リガンド。 ９８．前記第１結合領域が、生物学的に除去可能な結合を介して前記操作され た凝固因子に結合している、請求項９７に記載の結合リガンド。 ９９．前記第１結合領域が、選択的に切断可能なペプチド結合を介して前記操 作された凝固因子に結合している、請求項９８に記載の結合リガンド。 １００．前記第１結合領域が、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、IXa 因子、Xa因子またはメタロプロテイナーゼに対する切断部位を含むペプチドリン カーを介して前記操作された凝固因子に結合している、請求項９９に記載の結合 リガンド。 １０１．第２の組織因子または誘導体に作動可能に連結した第１の組織因子ま たは誘導体を含む、組織因子構築物。 １０２．作動可能に連結された第１、第２および第３の組織因子または組織因 子誘導体を含む、請求項１０１に記載の組織因子構築物。 １０３．作動可能に連結された約５個の組織因子または組織因子誘導体を含む 、請求項１０２に記載の組織因子構築物。 １０４．作動可能に連結された約１０個の組織因子または組織因子誘導体を含 む、請求項１０３に記載の組織因子構築物。 １０５．作動可能に連結された約２０個の組織因子または組織因子誘導体を含 む、請求項１０４に記載の組織因子構築物。 １０６．短縮型組織因子を含む、請求項１０１に記載の組織因子構築物。 １０７．疎水性膜挿入部分を含む短縮型組織因子を含む、請求項１０６に記載 の組織因子構築物。 １０８．約３と約20との間の疎水性アミノ酸の連続部分を含む短縮型組織因子 を含む、請求項１０７に記載の組織因子構築物。 １０９．短縮型組織因子を含み、該短縮型組織因子が該短縮型組織因子のＮ末 端またはＣ末端に位置する疎水性アミノ酸の連続部分を含む、請求項１０８に記 載の組織因子構築物。 １１０．脂肪酸を含む短縮型組織因子を含む、請求項１０７に記載の組織因子 構築物。 １１１．２つの短縮型組織因子を含み、これらの各々が疎水性膜挿入部分を含 む、請求項１０７に記載の組織因子構築物。 １１２．末端システイン残基を含むように改変された短縮型組織因子を含む、 請求項１０１に記載の組織因子構築物。 １１３．２つの短縮型組織因子を含み、これらの各々が末端システイン残基を 含むように改変されている、請求項１１２に記載の組織因子構築物。 １１４．前記システイン残基に作動可能に連結した抗体または抗体の抗原結合 性領域をさらに含む、請求項１１２に記載の組織因子構築物。 １１５．選択的に切断可能なペプチドリンカーを含むように改変された短縮型 組織因子を含む、請求項１０６に記載の組織因子構築物。 １１６．前記選択的に切断可能なペプチドリンカーが、ウロキナーゼ、プラス ミン、トロンビン、IXa因子、Xa因子またはメタロプロテイナーゼについての切 断部位を含む、請求項１１５に記載の組織因子構築物。 １１７．前記選択的に切断可能なペプチドリンカーが、間質コラゲナーゼ、ゼ ラチナーゼまたはストロメリシンについての切断部位を含む、請求項１１６に記 載の組織因子構築物。 １１８．前記選択的に切断可能なペプチドリンカーに作動可能に連結した抗体 または抗体の抗原結合性領域をさらに含む、請求項１１５に記載の組織因子構築 物。 １１９．その配列中に作動可能に連結した一連のユニット：システイン残基、 選択的に切断可能なペプチドリンカー、疎水性アミノ酸の連続部分、第１の短縮 型組織因子および第２の短縮型組織因子を含む、請求項１０１に記載の組織因子 構築物。 １２０．その配列中に作動可能に連結した一連のユニット：第１のシステイン 残基、選択的に切断可能なペプチドリンカー、第１の疎水性アミノ酸の連続部分 、第１の短縮型組織因子、第２の短縮型組織因子および第２の疎水性アミノ酸の 連続部分を含む、請求項１１９に記載の組織因子構築物。 １２１．前記システイン残基に作動可能に連結した抗体または抗体の抗原結合 性領域をさらに含む、請求項１１９に記載の組織因子構築物。 １２２．以下の(a)および(b)を含む結合リガンドを、薬理学的に受容可能な形 態で含む、薬学的組成物： (a)疾患細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関連支質の成分に結合する 第１結合領域；該第１結合領域が作動可能に連結した (b)凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。 １２３．前記結合リガンドが、凝固因子に共有結合した第１結合領域を含む、 請求項１２２に記載の薬学的組成物。 １２４．前記結合リガンドが、凝固因子に結合する第２結合領域に共有結合し た第１結合領域を含む、請求項１２２に記載の薬学的組成物。 １２５．前記結合リガンドが、前記第２結合領域に非共有結合的に結合した凝 固因子をさらに含む、請求項１２４に記載の薬学的組成物。 １２６．前記結合リガンドが二重特異性抗体である、請求項１２４に記載の薬 学的組成物。 １２７．前記第１結合領域が、組織因子、組織因子誘導体、あるいは抗体の抗 原結合性領域に作動可能に連結し、該抗体が組織因子または組織因子誘導体に結 合する、請求項１２２に記載の薬学的組成物。 １２８．適切な容器手段中に以下の(a)および(b)を含むキット： (a)第１の薬学的組成物であって、疾患関連血管系または疾患関連支質におけ る標的抗原の発現を誘導し得る生物学的薬剤を含む、第１の薬学的組成物；およ び (b)第２の薬学的組成物であって、以下の(i)および(ii)を含む結合リガンドを 含む、第２の薬学的組成物： (i)疾患関連血管系または疾患関連支質の誘導性標的抗原に結合する第１結 合領域；該第１結合領域が作動可能に連結した (ii)凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。 １２９．前記第１の薬学的組成物が、疾患関連血管内皮細胞上の標的抗原の発 現を誘導し得る生物学的薬剤を含む、請求項１２８に記載のキット。 １３０．前記第１の薬学的組成物が、白血球細胞の細胞表面上の活性化抗原お よび血管化腫瘍の腫瘍細胞の細胞表面上の腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体を 含む、請求項１２８に記載のキット。 １３１．前記第１の薬学的組成物が、活性化抗原CD2、CD3、CD14、CD16(IgEに ついてはFcR)、CD28またはＴ細胞レセプター抗原に結合する二重特異性抗体を含 む、請求項１３０に記載のキット。 １３２．前記第１の薬学的組成物が、CD14に結合し、そして単球／マクロファ ージ細胞によるIL-1の発現を誘導する二重特異性抗体を含む、請求項１３１に記 載のキット。 １３３．前記第２の薬学的組成物が、E-セレクチンに結合する第１結合領域を 含む結合リガンドを含む、請求項１３２に記載のキット。 １３４．前記第１の薬学的組成物が、CD28に結合し、そしてＴ細胞によるIFN- γの発現を誘導する二重特異性抗体を含む、請求項１３１に記載のキット。 １３５．前記第２の薬学的組成物が、MHCクラスII抗原に結合する第１結合領 域を含む結合リガンドを含む、請求項１３４に記載のキット。 １３６．正常組織の血管内皮細胞におけるMHCクラスII抗原の発現を抑制し得 る抗原を含む、第３の薬学的組成物をさらに含む、請求項１３４に記載のキット 。 １３７．シクロスポリンを含む第３の薬学的組成物をさらに含む、請求項１３ ６に記載のキット。 １３８．前記第１の薬学的組成物が、腫瘍抗原p185HER2、乳汁ムチンコアタン パク質、TAG-72、ルイスa、ガン胎児性抗原(CEA)、または腫瘍関連抗原に結合す る二重特異性抗体を含み、該腫瘍関連抗原が9.2.27、OV-TL3、MOv18、B3、KS1/4 、260F9およびD612からなる群から選択される抗体に結合する、請求項１３０に 記載のキット。 １３９．前記第１の薬学的組成物が、疾患関連支質成分における標的抗原の発 現を誘導し得る生物学的薬剤を含む、請求項１２８に記載のキット。 １４０．前記第１の薬学的組成物が、腫瘍細胞または腫瘍支質の成分；および 組織因子、組織因子誘導体、プロトロンビン、VII/VIIa因子、IX/IXa因子、X/Xa 因子、XI/XIa因子またはラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーターに結合す る二重特異性抗体を含む、請求項１３９に記載のキット。 １４１．前記第２の薬学的組成物が、P-セレクチンに結合する第１結合領域を 含む結合リガンドを含む、請求項１４０に記載のキット。 １４２．前記第２の薬学的組成物が、E-セレクチンに結合する第１結合領域を 含む結合リガンドを含む、請求項１４０に記載のキット。 １４３．疾患関連血管系に凝固因子を送達するための医薬の調製における結合 リガンドの使用であって、該結合リガンドが以下の(a)および(b)を含む、使用： (a)疾患細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関連支質の成分に結合する 第１結合領域；該第１結合領域が作動可能に連結した (b)凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。 １４４．前記結合リガンドが、外因性凝固因子を疾患関連血管系に送達するた めの医薬の調製において使用され、該結合リガンドが凝固因子に共有結合した第 １結合領域を含む、請求項１４３に記載の使用。 １４５．前記結合リガンドが、外因性凝固因子を疾患関連血管系に送達するた めの医薬の調製において使用され、該結合リガンドが凝固因子に非共有結合的に 結合する第２結合領域に共有結合した第１結合領域を含む、請求項１４３に記載 の使用。 １４６．前記結合リガンドが、外因性凝固因子を疾患関連血管系に送達するた めの医薬の調製において使用され、該結合リガンドが外因性凝固因子に結合する 第２結合領域に共有結合した第１結合領域を含み、そして該医薬を動物に投与す ると該因子を該疾患関連血管系に集中させる、請求項１４３に記載の使用。 １４７．前記医薬が、良性前立腺肥大症(BPH)、糖尿病性網膜症、血管再狭窄 、動静脈性奇形(AVM)、血管腫、血管新生緑内障、慢性関節リウマチまたは乾癬 の処置において使用されることが意図されている、請求項１４３に記載の使用。 １４８．前記医薬が、血管化腫瘍を有する動物の処置において使用されること が意図されている、請求項１４３に記載の使用。 １４９．前記医薬が、動物の腫瘍関連血管系または腫瘍関連支質における標的 化可能な成分の発現の誘導の後に使用されることが意図されており、該医薬が、 誘導された標的化可能な成分に結合する第１結合領域を含む結合リガンドを含む 、請求項１４８に記載の使用。 １５０．腫瘍関連血管系における前記標的化可能な成分の発現がサイトカイン によって誘導される、請求項１４９に記載の使用。 １５１．腫瘍関連血管系における前記標的化可能な成分の発現が、前記動物の 白血球細胞から放出されるサイトカインによって誘導される、請求項１５０に記 載の使用。 １５２．腫瘍関連血管系における前記標的化可能な成分の発現が、前記動物の 単球、マクロファージ、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、CD8-陽性Ｔ細胞またはNK 細胞から放出されるサイトカインによって誘導される、請求項１５１に記載の使 用。 １５３．腫瘍関連血管系における前記標的化可能な成分の発現が、サイトカイ ンIL-1、LI-4、TNF-α、TNF-βまたはIFN-γによって誘導される、請求項１５１ に記載の使用。 １５４．前記動物の前記白血球細胞が、白血球細胞表面活性化抗原に結合する 活性化抗体を含む薬学的組成物を該動物に投与することによって活性化されて、 サイトカインを放出する、請求項１５１に記載の使用。 １５５．前記活性化抗体が、白血球細胞表面活性化抗原CD2、CD3、CD14、CD16 、IgEについてのFcR、CD28またはＴ細胞レセプター抗原に結合する、請求項１５ ４に記載の使用。 １５６．前記活性化抗体が、動物腫瘍内で、活性化された白血球および腫瘍細 胞に結合および架橋する二重特異性抗体である、請求項１５４に記載の使用。 １５７．前記活性化抗体が、CD14またはCD28、および腫瘍細胞の細胞表面抗原 に結合する二重特異性抗体である、請求項１５６に記載の使用。 １５８．前記E-セレクチン、VCAM-1、ICAM-1、エンドグリンまたはMHCクラスI I抗原の発現が、腫瘍関連血管系において誘導される、請求項１５０に記載の使 用。 １５９．前記E-セレクチンの発現が、腫瘍関連血管系において誘導される、請 求項１５８に記載の使用。 １６０．前記MHCクラスII抗原の発現が、腫瘍関連血管系において誘導される 、請求項１５８に記載の使用。 １６１．動物の正常組織における内皮細胞による前記MHCクラスII抗原の発現 が、該動物へのシクロスポリンの投与によって抑制され；そして、次いで腫瘍関 連血管系におけるMHCクラスII抗原の発現が、CD28および腫瘍細胞の細胞表面抗 原に結合する二重特異性抗体の該動物への投与によって誘導される、請求項１６ ０に記載の使用。 １６２．動物の正常組織における内皮細胞による前記MHCクラスII抗原の発現 が、該動物のＴ細胞におけるIFN-γ産生を抑制する抗CD4抗体の該動物への投与 によって抑制され；そして、次いで腫瘍関連血管系におけるMHCクラスII抗原の 発現が、前記疾患部位中の抗原に結合するIFN-γ-産生Ｔ細胞クローンの該動物 への投与によって誘導される、請求項１６０に記載の使用。 １６３．前記IFN-γ-産生Ｔ細胞クローンが： (a)該動物の疾患部位から組織断片を取り出す工程； (b)該疾患部位から、浸潤した白血球を抽出する工程；および (c)該浸潤した白血球をインビトロで拡大させてIFN-γ産生クローンを提供す る工程を包含する方法によって調製される、請求項１６２に記載の使用。 １６４．腫瘍関連血管系における前記標的化可能な成分の発現が、トロンビン によって誘導される、請求項１４９に記載の使用。 １６５．腫瘍細胞または腫瘍支質の成分、および組織因子、組織因子誘導体、 プロトロンビン、VII/VIIa因子、IX/IXa因子、X/Xa因子、XI/XIa因子またはラッ セルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーターに結合する二重特異性抗体を含む薬学 的組成物を動物に投与することによって、前記トロンビンの産生が誘導される、 請求項１６４に記載の使用。 １６６．前記P-セレクチンの発現が、腫瘍関連血管系において誘導される、請 求項１６４に記載の使用。 １６７．前記E-セレクチンの発現が、腫瘍関連血管系において誘導される、請 求項１６４に記載の使用。 １６８．ガンを処置するための医薬の調製における凝固性結合リガンドの使用 であって、該結合リガンドが以下の(a)および(b)を含む、使用： (a)腫瘍細胞、腫瘍関連血管系の成分、または腫瘍関連支質の成分に結合する 第１結合領域；該第１結合領域が作動可能に連結した (b)凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。 １６９．前記医薬が、非経口投与のための処方物である、請求項１６８に記載 の使用。 １７０．前記医薬が、血管化腫瘍部位中に注入されるための処方物である、請 求項１６８に記載の使用。 １７１．前記医薬が、ヒト患者における使用に適している、請求項１６８に記 載の使用。 １７２．前記凝固性結合リガンドが、組織因子、短縮型組織因子、二量体組織 因子、あるいは組織因子または組織因子誘導体に結合する抗体の抗原性結合領域 に作動可能に連結した第１結合領域を含む、請求項１６８に記載の使用。
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