KR101935058B1 - 조직 인자에 대한 인간 항체 약물 접합체 - Google Patents

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Abstract

조직 인자에 대한 항체 약물 접합체가 개시된다. 항체 및 항체 약물 접합체를 포함하는 제약 조성물, 및 항체 및 항체 약물 접합체를 사용하는 치료 및 진단 방법이 또한 개시된다.

Description

조직 인자에 대한 인간 항체 약물 접합체 {HUMAN ANTIBODY DRUG CONJUGATES AGAINST TISSUE FACTOR}
본 발명은 항체 약물 접합체 (ADC)에 관한 것이며, 여기서 항체는 조직 인자 상에서 에피토프에 결합한다. 이러한 ADC는 특히 암, 염증 및 혈관 질환의 치료에 유용하다.
조직 인자 (TF) (또한 트롬보플라스틴, 인자 III 또는 CD142로 지칭됨)는 지모겐 프로트롬빈으로부터 트롬빈 형성의 개시에 필요한 내피하 조직, 혈소판 및 백혈구에 존재하는 단백질이다. 트롬빈 형성은 궁극적으로 혈액의 응고를 일으킨다. 조직 인자는 세포가 혈액 응고 캐스케이드를 개시할 수 있도록 하고, 응고 인자 VII (FVII)에 대한 고친화도 수용체인 세린 프로테아제로서 기능을 한다. 생성된 복합체는 특이적 제한 단백질분해에 의한 응고 프로테아제 캐스케이드의 개시를 담당하는 촉매 사건을 제공한다. 비기능적 전구체로서 순환하는 이들 프로테아제 캐스케이드의 다른 보조인자와는 달리, 상기 인자는 세포 표면 상에서 발현될 때 완전히 기능적인 강력한 개시제이다.
조직 인자는 세린 프로테아제 인자 VIIa (FVIIa)에 대한 세포 표면 수용체이다. 조직 인자에의 FVIIa의 결합은 세포 내의 신호전달 과정이 시작되도록 하고, 상기 신호전달 기능은 혈관신생에서 소정의 역할을 한다. 혈관신생이 성장 및 발생뿐만 아니라 상처 치유에서 정상적인 과정인 반면, 이는 또한 휴지 상태로부터의 악성 상태로의 종양의 전이에서 근본적인 단계이며: 암 세포가 혈관신생에 참여하는 단백질 (혈관신생 성장 인자로도 지칭됨)을 생산하는 능력을 얻었을 때, 이들 단백질은 종양에 의해 근접한 조직으로 방출되고, 새로운 혈관이 기존의 건강한 혈관으로부터 종양을 향해 및 종양으로 발아하도록 자극한다. 일단 새로운 혈관이 종양으로 들어가면 이는 급속하게 그의 크기를 확장시키고 국부 조직 및 장기에 침습할 수 있다. 새로운 혈관을 통해, 암 세포는 추가로 순환계 내로 탈출하고 다른 장기에 정박하여 새로운 종양을 형성할 수 있다 (전이).
또한, TF는 염증에서 소정의 역할을 한다. TF의 역할은 혈액 응고에 의해 매개되는 것으로 추정된다 (문헌 [A. J. Chu: "Tissue factor mediates inflammation" in Archives of biochemistry and biophysics, 2005, vol. 440, No. 2, pp. 123-132]). 따라서, 예를 들어 모노클로날 항-TF 항체에 의한 TF의 억제는 항-염증뿐만 아니라 혈관 질환에 기여하는 응고-염증 사이클을 차단하는데 중요하다.
TF 발현은 많은 종류의 암에서 관찰되고, 보다 공격적인 질환과 연관된다. 또한, 인간 TF는 가용성의 대안적으로-스플라이싱된 형태인 asHTF로 존재한다. 최근에 asHTF는 종양 성장을 촉진하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Hobbs et al., 2007 Thrombosis Res. 120(2) S13-S21]).
많은 진전이 이루어졌지만, 치료 항체에 기초하여 중증 질환을 치료하는 개선된 방법, 예를 들어 암, 염증 및 혈관 질환의 개선된 치료가 여전히 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은, 특히 암의 치료에 사용하기 위한, 고도로 특이적이고 효과적인 항-TF 항체 약물 접합체를 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 암, 염증 및 혈관 질환의 치료에 유용한 신규 항-TF 항체 약물 접합체에 관한 것이다. 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 조직 인자 (TF)를 발현하는 세포를 사멸시키는데 매우 효과적이다. 또한, 항-TF 항체 약물 접합체는 응고를 제한적으로 억제하거나 또는 억제하지 않음으로써 유리해진다.
도 1: 본 발명의 항체의 서열의 정렬.
서열 번호는 서열의 오른쪽 괄호에 열거된다.
카바트에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3은 다음과 같이 나타낸다: 이탤릭체 및 볼드체의 서열은 CDR1 영역을 나타내고, 밑줄 표시한 서열은 CDR2 영역을 나타내고, 볼드체 서열은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 2: IgG4 서열 (서열 81-82)
서열 81: 인간 IgG4의 야생형 CH 영역의 아미노산 서열. 이탤릭체 서열은 CH1 영역을 나타내고, 강조 서열은 힌지 영역을 나타내고, 보통 서열은 CH2 영역을 나타내고, 밑줄 표시한 서열은 CH3 영역을 나타낸다.
서열 82: 인간 IgG4의 힌지가 없는 CH 영역의 아미노산 서열
도 3: TF의 세포외 도메인에의 항-TF HuMab의 결합. 결합을 ELISA에 의해 결정하였다. EC50 값은 3개의 실험의 평균이다.
도 4: MDA-MD-231 세포 상의 막-결합된 TF에의 항-TF HuMab의 결합. 결합을 FACS 분석에 의해 결정하였고, 항체는 a), b) 및 c)에 제시된 3개의 군으로 분류되었고 (또한 WO 10/066803 참조), 여기서 항체는 교차-차단 군으로 분류되었다.
도 5: 항-TF HuMab에 의한 FVIIa 결합의 억제를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 증가하는 농도의 항-TF HuMab의 존재 하의 FVIIa 결합에 대한 평균 형광 강도 (MFI)이다. 항-TF HuMab의 부재 하의 100 nM FVIIa에 대한 MFI는 149,942였다. 하나의 대표적인 실험이 제시된다.
도 6: 항-카파-ETA'-접합 항-TF HuMab에 의한 세포 사멸의 용량-의존성 유도.
도 7: ELISA에 의해 결정된, TF 세포외 도메인의 재조합 단백질에의 항-TF HuMab 및 ADC의 결합. 하나의 대표적인 실험이 제시된다.
도 8: 항-TF ADC에 의한 세포 사멸의 시험관내 용량-의존성 유도. 하나의 대표적인 실험이 각 세포주에 대해 제시된다: A431 (a), HPAF-II (b) 및 NCI-H441 (c). 제시된 데이터는 항-TF ADC로 처리된 세포의 중복 웰의 생존 백분율 ± S.E.M.이다.
도 9: SCID 마우스에서 A431 및 HPAF-II 이종이식편의 치유적 치료에 있어 항-TF ADC의 생체내 효능. 확립된 A431 (A) 또는 HPAF-II (B) 종양을 갖는 마우스를 항-TF ADC로 처리하였다. 제시된 데이터는 군당 평균 종양 부피 ± S.E.M.이다 (군당 n = 7마리 마우스).
도 10: 안정성을 시험하기 위한 ADC 및 비접합 IgG1의 SDS-PAGE 분석. 샘플을 연구 시작 시점 (t=0) (a-d) 또는 5℃ 및 < -65℃에서 3개월 동안 저장 후에 (e-h) SDS-PAGE에 의해 분석하였다. (a, c) 레인 1, 9: 분자량 (MW) 마커, 레인 2: IgG1 내부 대조군, 레인 3: HuMab-TF-098, 레인 4: HuMab-TF-098-vcMMAE, 레인 5: HuMab-TF-098-mcMMAF, 레인 6: HuMab-TF-011, 레인 7: HuMab-TF-011-vcMMAE, 레인 8: HuMab-TF-mcMMAF. (b, d) 레인 1, 9, 10: MW 마커, 레인 2: IgG1 내부 대조군, 레인 3: HuMab-TF-111, 레인 4: HuMab-TF-111-vcMMAE, 레인 5: HuMab-TF-111-mcMMAF, 레인 6: IgG1-b12, 레인 7: IgG1-b12-vcMMAE, 레인 8: IgG1-b12-mcMMAF.
(e, g) 레인 1, 11: MW 마커, 레인 2: IgG1 내부 대조군, 레인 3: < -65℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-098-vcMMAE, 레인 4: 5℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-098-vcMMAE, 레인 5: < -65℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-098-mcMMAF, 레인 6: 5℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-098-mcMMAF, 레인 7: < -65℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-011-vcMMAE, 레인 8: 5℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-011-vcMMAE, 레인 9: < -65℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-011-mcMMAF, 레인 10: 5℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-011-mcMMAF. (f, h) 레인 1, 11, 12: MW 마커, 레인 2: IgG1 내부 대조군, 레인 3: < -65℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-111-vcMMAE, 레인 4: 5℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-111-vcMMAE, 레인 5: < -65℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-111-mcMMAF, 레인 6: 5℃에서 3개월 후의 HuMab-TF-111-mcMMAF, 레인 7: < -65℃에서 3개월 후의 IgG1-b12-vcMMAE, 레인 8: 5℃에서 3개월 후의 IgG1-b12-vcMMAE, 레인 9: < -65℃에서 3개월 후의 IgG1-b12-mcMMAF, 레인 10: 5℃에서 3개월 후의 IgG1-b12-mcMMAF.
비-환원 조건의 경우, 상이한 중쇄 (H) - 경쇄 (L) 조합의 크기를 나타낸다: 148 kDa (HHLL), 125 kDa (HHL), 99 kDa (HH), 67 kDa (HL), 51 kDa (H) 및 25 kDa (L).
도 11: 연구 시작 시점 및 < -65℃ 또는 5℃에서 3개월 동안 저장 후의 HuMab-TF-098-vcMMAE (a), HuMab-TF-098-mcMMAF (b), HuMab-TF-011-vcMMAE (c), HuMab-TF-011-mcMMAF (d), HuMab-TF-111-vcMMAE (e), HuMab-TF-111-mcMMAF (f), IgG1-b12-vcMMAE (g) 및 IgG1-b12-mcMMAF (h)의 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC) 프로파일.
도 12: 안정성을 시험하기 위한 TF-ECDHis에의 ADC 및 비접합 IgG1의 결합 검정. 샘플을 연구 시작 시점 (t=0) 또는 5℃ 및 < -65℃에서 3개월 동안 저장 후에 분석하였다.
도 13: SCID 마우스에서의 HPAF-II 이종이식편의 치유적 치료에 있어 항-TF ADC의 생체내 용량-반응. 확립된 HPAF-II 종양을 갖는 마우스를 항-TF vcMMAE ADC로 처리하였다. 제시된 데이터는 군당 평균 종양 부피 ± S.E.M.이다 (군당 n = 8마리 마우스).
본 발명의 상세한 설명
정의
용어 "조직 인자", "TF", "CD142", "조직 인자 항원", "TF 항원" 및 "CD142 항원"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 달리 명시되지 않는 한, 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 조직 인자 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 인간 조직 인자의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 포함한다. 조직 인자는 실시예 1에 사용된 서열 진뱅크 등록 번호 NP_001984일 수 있다.
용어 "이뮤노글로불린"은 한 쌍은 저분자량 경쇄 (L)이고 한 쌍은 중쇄 (H)인 2쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어지며, 4개 모두 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 것인, 구조적으로 관련된 당단백질의 클래스를 지칭한다. 이뮤노글로불린의 구조는 널리 특성화되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다. 간략하게, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역 (CH 또는 CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL 또는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역 (CL 또는 CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 지칭되는 초가변 영역 (또는 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성할 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있고, 이들 영역에는 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한, 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)] 참조). 전형적으로, 이 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 방법에 따라 수행된다 (본원에서 카바트에서와 같은 또는 카바트에 따른 어구, 예컨대 가변 도메인 잔기 넘버링은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이 넘버링 시스템을 지칭함). 이 넘버링 시스템을 사용하여, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 그 내부로의 삽입에 상응하는 보다 적은 아미노산 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 VH CDR2의 잔기 52 다음의 단일 아미노산 삽입체 (카바트에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 다음의 삽입 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대해, 항체 서열을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동성 영역에서 정렬하여 결정할 수 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "항체" (Ab)는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 그의 유도체를 지칭하고, 이는 전형적인 생리적 조건 하에 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 약 24시간 또는 그 초과, 약 48시간 또는 그 초과, 약 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과 등과 같은 충분한 기간의 시간, 또는 임의의 다른 관련된 기능적으로-정의된 기간 (예컨대, 항원에 대한 항체 결합과 연관된 생리적 반응을 유도하고/하거나, 촉진하고/하거나, 증진시키고/시키거나 조정하는데 충분한 시간 및/또는 항체가 이펙터 활성을 동원하는데 충분한 시간)의 반감기로 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체 (Ab)의 불변 영역은 이뮤노글로불린이 면역계의 다양한 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 보체계의 성분, 예컨대 고전적인 보체 활성화 경로의 제1 성분 (C1q)이 포함되는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 본원에서 용어 항체는 달리 언급되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 항원에 특이적으로 결합하는 능력이 유지된 항체의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 "항체"에 포함되는 결합 단편의 예는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab' 또는 Fab 단편, 또는 WO2007059782 (젠맙 A/S(Genmab A/S))에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 본질적으로 VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 본질적으로 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) 본질적으로 VH 도메인으로 이루어지고, 또한 도메인 항체 (문헌 [Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90])로 지칭되는, dAb 단편 (문헌 [Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)]); (vi) 낙타류 또는 나노바디 (문헌 [Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24]) 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되더라도, 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨)를 형성하는 단일 단백질 쇄로 만들어지도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 2개의 도메인을 연결할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) 및 Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 참조). 이와 같은 단일 쇄 항체는 달리 언급되거나 문맥상 명백하게 지시되지 않는 한, 용어 항체 내에 포함된다. 상기 단편이 항체의 의미 내에 일반적으로 포함되지만, 이는 총괄적으로, 및 각각 독립적으로, 상이한 생물학적 특성 및 용도를 나타내는 본 발명의 독특한 특징이다. 본 발명과 관련하여 상기 및 기타 유용한 항체 단편들이 본원에서 추가로 논의된다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 임의의 공지의 기술, 예를 들어 효소적 절단, 펩티드 합성, 및 재조합 기술에 의해 제공되는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력이 유지된 항체 단편 (항원-결합 단편)을 또한 일반적으로 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 생성된 항체는 임의의 이소형을 지닐 수 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "ADC"는 항체 약물 접합체를 지칭하고, 이는 본 발명과 관련하여 본원에 기재된 바와 같이 또 다른 모이어티에 커플링되는 항-TF 항체를 지칭한다.
"항-TF 항체"는 항원 조직 인자 또는 조직 인자 항원에 특이적으로 결합하는, 상기 기재된 바와 같은 항체이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하는 의도는 아니다.
바람직한 실시양태, 항체 약물 접합체의 항체, 또는 본 발명의 항체 약물 접합체는 단리된다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "단리된 항체" 또는 "단리된 항체 약물 접합체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체 또는 항체 약물 접합체를 지칭하도록 의도된다 (예를 들어, 조직 인자에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 조직 인자 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 본원에 사용된 바와 같이 단리된 항체 약물 접합체는 또한 "유리 독소"가 실질적으로 없는 항체 약물 접합체를 지칭하도록 의도되고, 여기서 "유리 독소"는 항체에 접합되지 않는 독소를 의미하도록 의도된다. 독소와 관련하여 사용된 바와 같이 용어 "실질적으로 없는"은 특히 실시예 16에 기재된 바와 같이 결정시에 5% 미만, 예컨대 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1.5% 미만, 또는 1% 미만, 또는 0.5% 미만의 비접합 약물이 존재한다는 것을 의미할 수 있다. 그러나, 인간 조직 인자의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 단리된 항체 약물 접합체는 다른 관련 항원, 예를 들어 다른 종으로부터의 항원 (예컨대, 조직 인자 종 상동체)에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체 또는 단리된 항체 약물 접합체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 2종 이상의 "단리된" 모노클로날 항체 또는 항체 약물 접합체는 널리-정의된 조성으로 조합된다.
2개 이상의 항체와 관련하여 본원에 사용되는 경우, 용어 "와 경쟁하다" 또는 "와 교차-경쟁하다"는 2개 이상의 항체가 TF에의 결합에 대해 경쟁하는 것, 예를 들어 WO 10/066803의 실시예 12에 기재된 바와 같은 검정에서 TF 결합에 대해 경쟁하는 것을 나타낸다. 일부 쌍의 항체에서, WO 10/066803의 실시예 12의 검정에서의 경쟁은 하나의 항체가 플레이트에 코팅되고 다른 항체는 경쟁을 위해 사용되거나 그 반대일 경우에만 관찰된다. 본원에 사용되는 경우에 용어 "와 경쟁하다"는 또한 항체의 이러한 조합을 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물인 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 또는 그의 조성물은 본 발명에 따른 약물 접합 항체일 수 있다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 미리 결정된 항원에의 항체의 결합과 관련하여 용어 "결합" 또는 "특이적으로 결합하다"는 전형적으로 예를 들어 항원을 리간드로, 항체를 분석물로 사용하여 비아코어(BIAcore) 3000 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정시에 약 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 또는 약 10-11 M 이하의 KD에 상응하는 친화도로의 결합이고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게-관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에의 그의 결합 친화도보다 적어도 10배 낮은, 예컨대 적어도 100배 낮은, 예를 들어 적어도 1,000배 낮은, 예컨대 적어도 10,000배 낮은, 예를 들어 적어도 100,000배 낮은 KD에 상응하는 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 친화도가 더 낮은 양은 항체의 KD에 의존성이기 때문에, 항체의 KD가 매우 낮으면 (즉, 항체가 고도로 특이적이면), 항원에 대한 친화도가 비-특이적 항원에 대한 친화도보다 더 낮은 양은 적어도 10,000배일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "kd" (sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 또한 koff 값으로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "ka" (M-1 x sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "KD" (M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "KA" (M-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합 평형 상수를 지칭하고, ka를 kd로 나누어 얻는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "내재화"는 TF 항체와 관련하여 사용되는 경우에 항체가 세포-표면으로부터 TF-발현 세포로 내재화된 임의의 메카니즘을 포함한다. 항체의 내재화는 내화된 항체-독소 접합체 또는 복합체의 효과가 측정된 간접 또는 직접 검정에서 평가될 수 있다 (예컨대, 예를 들어 실시예 15의 항-카파-ETA' 검정 또는 실시예 18의 내재화 및 세포 사멸 검정). 일반적으로, 직접 검정, 예컨대 본원에서 실시예 18에 기재된 검정은 항체 약물 접합체의 내재화를 측정하기 위해 이용되는 한편, 간접 검정, 예컨대 본원에서 실시예 15에 기재된 검정은 이후에 2차 접합 항체와 예비-인큐베이션되는 항체의 내재화를 측정하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 한 실시양태에서 예시된 항체의 VL 영역, VH 영역, 또는 하나 이상의 CDR의 기능적 변이체를 포함하는 항체를 제공한다. 항-TF 항체와 관련하여 사용되는 VL, VH 또는 CDR의 기능적 변이체는 항체가 모 항체의 친화도/결합력 및/또는 특이성/선택성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과)을 여전히 보유할 수 있도록 하고, 일부 경우에 이러한 항-TF 항체는 모 항체보다 더 큰 친화도, 선택성 및/또는 특이성과 연관될 수 있다.
이러한 기능적 변이체는 전형적으로 모 항체에 대한 유의한 서열 동일성을 보유한다. 2개의 서열 간의 동일성 퍼센트는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = [동일한 위치의 #/위치의 총 #] x 100). 서열의 비교 및 2개의 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비-제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적인 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 퍼센트는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램으로 결정할 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이에 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 문헌 [E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988))]의 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램 내에 통합된 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)]의 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다.
CDR 변이체의 서열은 대부분 보존적 치환을 통해 모 항체 서열의 CDR 서열과 상이할 수 있고; 예를 들어 변이체 내의 적어도 약 35%, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 (예를 들어, 약 65-99%, 예를 들어 약 96%, 97% 또는 98%)의 치환이 보존적 아미노산 잔기 대체이다.
CDR 변이체의 서열은 대부분 보존적 치환을 통해 모 항체 서열의 CDR 서열과 상이할 수 있고; 예를 들어 변이체 내의 적어도 10개, 예컨대 적어도 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 치환이 보존적 아미노산 잔기 대체이다.
본 발명과 관련하여, 보존적 치환은 하기 3개의 표 중의 하나 이상에서 반영되는 아미노산의 클래스 내에서의 치환에 의해 정의될 수 있다:
보존적 치환을 위한 아미노산 잔기 클래스
Figure 112013003426946-pct00001
대안적인 보존적 아미노산 잔기 치환 클래스
Figure 112013003426946-pct00002
아미노산 잔기의 대안적인 물리적 및 기능적 분류
Figure 112013003426946-pct00003
보다 보존적인 치환 분류는 하기를 포함한다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민.
아미노산의 추가의 군은 또한 예를 들어 문헌 [Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed. 1993), W.H. Freeman and Company]에 기재된 원리를 이용하여 만들 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 소수친수성/친수성 특성 및 잔기 중량/크기의 측면에서의 보존은 예시된 항체의 CDR과 비교하여 변이체 CDR에서 또한 실질적으로 보유된다 (예를 들어, 서열의 중량 클래스, 소수친수성 스코어, 또는 둘 다는 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 (예를 들어, 약 65-99%)로 유지됨). 예를 들어, 보존적 잔기 치환은 또한 또는 대안적으로 당업계에 공지된 강 또는 약 중량에 기초한 보존 기의 대체를 기초로 할 수 있다.
유사한 잔기의 보유는 또한 또는 대안적으로 BLAST 프로그램 (예를 들어, 표준 설정 BLOSUM62, 개방 갭 = 11 및 연장된 갭 = 1을 사용하여 NCBI를 통해 이용가능한 BLAST 2.2.8)의 사용에 의해 결정되는 유사성 스코어에 의해 측정될 수 있다. 적합한 변이체는 전형적으로 모 펩티드에 대해 적어도 약 45%, 예컨대 적어도 약 55%, 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 (예를 들어, 약 70-99%)의 유사성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM)를 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 대체로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 기로 구성되고, 통상적으로 특정한 3차원 구조 특성 및 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는, 입체형태적 에피토프에 대한 결합은 변성 용매의 존재하에 상실되지만 비입체형태적 에피토프에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관련되는 아미노산 잔기 (에피토프의 면역우성 성분으로도 지칭됨) 및 결합에 직접 관련되지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 특이적인 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기 (즉, 아미노산 잔기가 특이적인 항원 결합 펩티드의 풋프린트 내에 존재함)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 인간 항체는 상기 항체가 인간 이뮤노글로불린 서열을 이용하는 시스템으로부터 수득되는 경우, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스의 면역화에 의해 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리의 스크리닝에 의해 특정한 배선 서열로부터 "유래"되며, 여기서 선택된 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 적어도 90％, 예컨대 적어도 95％, 예를 들어 적어도 96％, 예컨대 적어도 97％, 예를 들어 적어도 98％, 또는 예컨대 적어도 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 전형적으로, 중쇄 CDR3 외부에서, 특정한 인간 배선 서열로부터 유래된 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 20개 이하의 아미노산 차이, 예컨대 10개 이하의 아미노산 차이, 예컨대 9, 8, 7, 6 또는 5개 이하, 예를 들어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "성장을 억제하다" (예를 들어, 세포, 예컨대 종양 세포를 지칭하는 경우)는 항-TF 항체 약물 접합체와 접촉되지 않은 동일한 세포의 성장과 비교하여 항-TF 항체 약물 접합체와 접촉되었을 때 세포 성장의 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100%의 세포 배양물의 성장 억제를 포함하도록 의도된다. 이러한 세포 성장의 감소는 항-TF 항체 및 약물에 의해 행해지는 다양한 메카니즘에 의해 개별적으로, 또는 예를 들어 항체-의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP), 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-매개 세포독성 (CDC) 및/또는 아폽토시스, 또는 아우리스타틴의 튜불린과의 상호작용에 의해 유도될 수 있는 것과 같은 G2/M 세포 주기 정지 및 아폽토시스와 조합하여 일어날 수 있다.
용어 "안정화 IgG4 항체"는 절반-분자 교환을 감소시키도록 변형된 IgG4 항체를 지칭한다 (WO 2008/145142 (젠맙 A/S) 또는 문헌 [van der Neut Kolfschoten M et al., (2007) Science 14;317(5844)] 및 그의 참고문헌 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 인식 및 활성화 단계와 대조적으로, 면역 반응의 이펙터 단계에 수반되는 면역 세포를 지칭한다. 예시적인 면역 세포는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예컨대, 세포용해 T 세포 (CTL)가 포함되는 B 세포 및 T 세포), 킬러 세포, 자연 킬러 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 다형핵 세포, 예를 들어 호중구, 과립구, 비만 세포 및 호염기구를 포함한다. 일부 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체 (FcR)를 발현하고, 특정 면역 기능을 수행한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 ADCC를 유도할 수 있고, 예컨대 자연 킬러 세포가 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현하는 단핵구, 대식세포는 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 성분에 대한 항원의 제시 또는 항원을 제시하는 세포에의 결합에 관여한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 포식할 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정한 FcR의 발현은 시토카인과 같은 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 γ (IFN-γ) 및/또는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)에 의해 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 증진된 발현은 표적 세포에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 서열을 포식하거나 용해시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "벡터"는 그에 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 가지 유형은 추가의 DNA 절편이 그 내부에 라이게이션될 수 있는 원형 이중-가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예컨대, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 따라서 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게 "발현 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 교환가능하게 사용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 형태의 벡터이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예컨대, 복제-결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단하게 "숙주 세포")는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하도록 의도된다. 상기 용어는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 그 세포의 자손도 지칭하도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경 상의 영향으로 인해 다음 세대에서 특정의 변형이 일어날 수도 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 바와 같이 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 재조합 숙주 세포는, 예를 들어 트랜스펙토마, 예컨대 CHO 세포, HEK293 세포, NS/0 세포, 및 림프구성 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "트랜스펙토마"는 항체를 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함한 진균을 포함한다.
용어 "트랜스제닉 비-인간 동물"은 하나 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스진 또는 트랜스크로모솜 (동물의 천연 게놈 DNA에 통합되거나 통합되지 않은 것)을 포함하는 게놈을 가지며, 완전 인간 항체를 발현할 수 있는 비-인간 동물을 지칭한다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는, TF 항원 및/또는 TF를 발현하는 세포로 면역화되는 경우에 마우스가 인간 항-TF 항체를 생산하도록, 인간 경쇄 트랜스진 및 인간 중쇄 트랜스진 또는 인간 중쇄 트랜스크로모솜을 가질 수 있다. 인간 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉 마우스, 예를 들어 HuMAb 마우스, 예컨대 HCo7, HCo17, HCo20 또는 HCo12 마우스에서와 같이 마우스의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있거나, 또는 인간 중쇄 트랜스진은 WO02/43478에 기재된 바와 같은 트랜스크로모소말 KM 마우스에서와 같이 염색체 외부에 유지될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스크로모소말 마우스 (본원에서 "트랜스제닉 마우스"로 총칭함)는 V-D-J 재조합 및 이소형 스위칭을 거침으로써 소정의 항원에 대해 다수의 이소형의 인간 모노클로날 항체 (예컨대, IgG, IgA, IgM, IgD 및/또는 IgE)를 생산할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 비-인간 동물은 특정 항체를 코딩하는 유전자를 도입함으로써, 예를 들어 이러한 유전자를 동물의 유액에서 발현되는 유전자에 작동가능하게 연결시킴으로써, 특정 항원에 대한 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
"치료"는 증상 또는 질환 상태의 진정, 개선, 정지 또는 근절 (치유)을 목적으로 유효량의 본 발명의 치료 활성 화합물을 투여하는 것을 지칭한다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"은 바람직한 치료 결과의 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 항-TF 항체 약물 접합체의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 바람직한 반응을 유도하는 항-TF 항체 약물 접합체의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료 유효량은 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료학상 유익한 효과가 더 큰 양이다.
"항-이디오타입" (Id) 항체는 일반적으로 항체의 항원-결합 부위와 연관된 특징적인 결정자를 인식하는 항체이다.
본 발명의 추가 측면 및 실시양태
본 발명은 항-TF 항체 약물 접합체를 제공한다.
한 측면에서 본 발명은
(i) 서열 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 46에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 47에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 48에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역, 또는
(ii) 서열 34에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 35에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 36에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 74에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 75에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역, 또는
(iii) 서열 38에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 39에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 40에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 78에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 80에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역, 또는
(iv) 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 42에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역
을 포함하며 조직 인자에 결합하는 항체, 또는
(v) 상기 서열에서 바람직하게는 최대 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는, 임의의 상기 항체의 변이체
를 포함하며, 여기서 항체는 링커를 통해 아우리스타틴 또는 그의 기능적 펩티드 유사체 또는 그의 유도체에 접합된 것인 항체 약물 접합체를 제공한다.
한 실시양태에서 항체는
(i) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(ii) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(iii) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(iv) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함한다.
한 실시양태에서 항체는 전장 항체이다.
한 실시양태에서 항체는 완전 인간 모노클로날 IgG1 항체, 예컨대 IgG1,κ이다. 또 다른 실시양태에서 항체는 완전 인간 모노클로날 안정화 IgG4 항체이다.
한 실시양태에서 아우리스타틴은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이다:
Figure 112013003426946-pct00004
상기 식에서, 파상선은 링커에 대한 부착 부위를 나타낸다.
한 실시양태에서 아우리스타틴은 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)이다:
Figure 112013003426946-pct00005
상기 식에서, 파상선은 링커에 대한 부착 부위를 나타낸다.
한 실시양태에서 링커는 항-TF 항체의 (부분적) 환원에 의해 수득된 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기에 부착된다.
한 실시양태에서 링커-아우리스타틴은 MC-vc-PAB-MMAF (또한 vcMMAF로 지칭됨) 또는 MC-vc-PAB-MMAE (또한 vcMMAE로 지칭됨)이다:
Figure 112013003426946-pct00006
상기 식에서, p는 1 내지 8의 수를 나타내고, 예를 들어 p는 3-5일 수 있고, S는 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기를 나타내고, Ab는 항-TF 항체를 나타낸다. 한 실시양태에서 링커-아우리스타틴은 vcMMAE이다.
한 실시양태에서 링커-접합체는 mcMMAF이다 (여기서 mc/MC는 말레이미도 카프로일의 약어임):
Figure 112013003426946-pct00007
상기 식에서, p는 1 내지 8의 수를 나타내고, 예를 들어 p는 3-5일 수 있고, S는 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기를 나타내고, Ab는 항-TF 항체를 나타낸다.
한 실시양태에서 항체는 예를 들어 실시예 14에 기재된 바와 같이 결정된 조직 인자에의 FVIIa의 결합을 차단한다.
한 실시양태에서 항체는 조직 인자에의 FVIIa 결합을, 실시예 14에 기재된 바와 같이 결정시에 바람직하게는 0.01-3.0 μg/mL, 예컨대 0.1-2.0 μg/mL, 또는 0.2-1.2 μg/mL의 억제 IC50의 최대 값으로 억제한다.
한 실시양태에서 항체는 조직 인자 결합에 대해
서열 33의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 73의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체,
또는
서열 1의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 41의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체,
또는
서열 5의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 45의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체,
또는
서열 9의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 49의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체,
또는
서열 13의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 53의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체,
또는
서열 17의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 57의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체,
또는
서열 21의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 61의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체,
또는
서열 25의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 65의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체,
또는
서열 29의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 69의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체,
또는
서열 37의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 77의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체
와 경쟁한다.
한 실시양태에서 항체는
a) 서열 34, 35 및 36의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 74, 75 및 76의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
b) 서열 2, 3 및 4의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 42, 43 및 44의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
c) 서열 6, 7 및 8의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 46, 47 및 48의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
d) 서열 10, 11 및 12의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 50, 51 및 52의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
e) 서열 14, 15 및 16의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 54, 55 및 56의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
f) 서열 18, 19 및 20의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 58, 59 및 60의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
g) 서열 22, 23 및 24의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 62, 63 및 64의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
h) 서열 26, 27 및 28의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 66, 67 및 68의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
i) 서열 30, 31 및 32의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 70, 71 및 72의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
j) 서열 38, 39 및 40의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 78, 79 및 80의 CDR1, 2 및 3 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함하거나, 또는
k) 상기 서열에서 최대 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는, 임의의 상기 항체의 변이체
를 포함한다.
한 실시양태에서 항체는
a) 서열 33, 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 37 및 29로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 영역 서열에 대해 적어도 80%의 동일성, 예컨대 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 100%의 동일성, 또는
b) 서열 33, 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 37 및 29로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 영역 서열과 비교하여, 최대 20개, 예컨대 15, 또는 10, 또는 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환
을 갖는 VH를 포함한다.
한 실시양태에서 항체는
a) 서열 73, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 77 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 영역 서열에 대해 적어도 80%의 동일성, 예컨대 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 또는 100%의 동일성, 또는
b) 서열 73, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 77 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 영역 서열과 비교하여, 최대 20개, 예컨대 15, 또는 10, 또는 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환
을 갖는 VL을 포함한다.
한 실시양태에서 항체는
a) 서열 33의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 73의 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
b) 서열 1의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 41의 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
c) 서열 5의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 45의 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
d) 서열 9의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 49의 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
e) 서열 13의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 53의 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
f) 서열 17의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 57의 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
g) 서열 21의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 61의 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
h) 서열 25의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 65의 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
i) 서열 29의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 69의 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
j) 서열 37의 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 77의 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함한다.
한 실시양태에서 항체는 실시예 12의 검정에 기재된 바와 같이 결정시에 3.0 nM 이하, 예컨대 0.50 nM 이하, 예를 들어 0.35 nM 이하, 예컨대 0.20 nM 이하, 예를 들어 0.1 nM 이하의 겉보기 친화도 (EC50)로 조직 인자의 세포외 도메인에 결합한다.
한 실시양태에서 항체는 실시예 13의 검정에 기재된 바와 같이 결정시에 바람직하게는 10 nM 이하, 예를 들어 8 nM 이하, 예컨대 5 nM 이하, 예를 들어 2 nM 이하, 예컨대 1 nM 이하, 예를 들어 0.5 nM 이하, 예컨대 0.3 nM 이하의 겉보기 친화도 (EC50)로, 조직 인자를 발현하는 포유동물 세포, 예컨대 조직 인자를 코딩하는 구축물로 형질감염된 A431 세포에 결합한다.
또 다른 또는 대안적 측면에서 항체는 탁솔; 시토칼라신 B; 그라미시딘 D; 브로민화에티듐; 에메틴; 미토마이신; 에토포시드; 테노포시드; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 콜히친; 독소루비신; 다우노루비신; 디히드록시 안트라신 디온; 튜불린-억제제, 예컨대 메이탄신 또는 그의 유사체 또는 유도체; 미톡산트론; 미트라마이신; 악티노마이신 D; 1-데히드로테스토스테론; 글루코코르티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀롤; 퓨로마이신; 칼리케아미신 또는 그의 유사체 또는 유도체, 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 6 메르캅토퓨린, 6 티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5 플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 겜시타빈, 또는 클라드리빈; 알킬화제, 예컨대 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴, 카르보플라틴, 두오카르마이신 A, 두오카르마이신 SA, 라켈마이신 (CC-1065), 또는 그의 유사체 또는 유도체; 피롤로[2,1-c][1,4] 벤조디아제핀 (PDB) 또는 그의 유사체; 항생제, 예컨대 닥티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신 (AMC); 디프테리아 독소 및 관련 분자, 예컨대 디프테리아 A 쇄 및 그의 활성 단편 및 하이브리드 분자, 리신 독소, 예컨대 리신 A 또는 탈글리코실화 리신 A 쇄 독소, 콜레라 독소, 시가(Shiga)-유사 독소, 예컨대 SLT I, SLT II, SLT IIV, LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 바우만-버크 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 젤라닌, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질, 예컨대 PAPI, PAPII, 및 PAP S, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제 (RNase); DNase I, 스타필로코쿠스 장독소 A; 미국자리공 항바이러스 단백질; 디프테린 독소; 및 슈도모나스 내독소로 이루어진 군으로부터 선택된 치료 모이어티에 접합된다. 추가의 대안적 실시양태에서 항체는 돌라스타틴, 메이탄신, 칼리케아미신, 두오카르마이신, 라켈마이신 (CC-1065) 또는 그의 임의의 유사체, 유도체 또는 전구약물로 이루어진 군으로부터 선택된 세포독성 모이어티에 접합된다.
추가의 대안적 실시양태에서 항체는 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα, IFNβ, IFNγ, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스팀 및 TNFα로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인에 접합된다.
추가의 대안적 실시양태에서 항체는 방사성동위원소에 접합된다.
한 실시양태에서 항체는 실시예 15에 기재된 바와 같이 A431, BxPC3 또는 MDA-MB-23에서 독소에 커플링된 항체의 내재화에 의해 세포독성을 유도할 수 있다.
한 실시양태에서 항체는 A431 세포에서 9 x 10-5 내지 4 x 10-4 μg/mL의 EC50 값으로, 실시예 15에 기재된 바와 같이 내재화에 의해 세포독성을 유도한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체의 제조는 실시예 16에 기재된 바와 같이 결정시에 2% 미만, 예컨대 1.5% 미만, 또는 1% 미만, 또는 0.5% 미만의 비접합 약물을 생성한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체의 제조는 실시예 16에 기재된 바와 같이 결정시에 10% 미만, 예컨대 8% 미만, 또는 7% 미만 또는 6% 미만 또는 5.5% 미만의 응집물을 생성한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체의 제조는 실시예 16에 기재된 바와 같이 결정시에 1% 미만, 예컨대 0.5% 미만, 또는 0.25% 미만, 또는 0.2% 미만의 내독소를 생성한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체의 제조는 실시예 16에 기재된 바와 같이 결정시에 1-100 mg/mL 범위, 예컨대 2-50 mg/mL 범위, 또는 5-25 mg/mL 범위, 또는 5-15 mg/mL 범위, 또는 7.5-15 mg/mL 범위, 또는 8-12 mg/mL 범위, 또는 9-11 mg/ml 범위의 항체 약물 접합체의 농도를 생성한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 실시예 17에 기재된 바와 같이 결정시에 600 ng/mL 이하, 예컨대 550 ng/mL 이하, 또는 500 ng/mL 이하의 겉보기 친화도 (EC50), 예컨대 200-600 ng/mL 범위의 EC50 값, 예를 들어 300-600 ng/mL 범위의 EC50 값, 또는 350-550 ng/mL 범위의 EC50 값, 또는 400-500 ng/mL 범위의 EC50 값으로 조직 인자의 세포외 도메인에 결합한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 A431 세포에서 1 내지 100 ng/mL의 EC50 값으로, 실시예 18에 기재된 바와 같이 내재화에 의해 세포독성을 유도한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 HPAF-II 세포에서 0.5 내지 20 ng/mL의 EC50 값으로, 실시예 18에 기재된 바와 같이 내재화에 의해 세포독성을 유도한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 NCI-H441 세포에서 0.5 내지 500 ng/mL, 예컨대 0.5 내지 20 ng/mL의 EC50 값으로, 실시예 18에 기재된 바와 같이 내재화에 의해 세포 세포독성을 유도한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 세포당 200,000개 초과의 조직 인자 분자, 예컨대 세포당 200,000-1,000,000개의 조직 인자 분자, 예를 들어 세포당 200,000 내지 500,000개의 조직 인자 분자를 발현하는, 예를 들어 종양 세포에서 실시예 18에 기재되 바와 같이 내재화에 의해 세포독성을 유도한다. EC50 값은 한 실시양태에서 0.1 내지 100 ng/mL일 수 있다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 세포당 20,000개 초과의 조직 인자 분자, 예컨대 세포당 20,000-200,000개의 조직 인자 분자를 발현하는, 예를 들어 종양 세포에서 실시예 18에 기재되 바와 같이 내재화에 의해 세포독성을 유도한다. EC50 값은 한 실시양태에서 0.5 내지 500 ng/mL, 예컨대 0.5 내지 20 ng/mL일 수 있다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 실시예 19에 기재된 바와 같이 종양 성장을 억제한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는, 종양 성장을 실시예 19에 기재된 바와 같이 결정시에, 세포당 1000개 초과의 조직 인자 분자, 예컨대 세포당 10,000개 초과의 조직 인자 분자, 예를 들어 세포당 100,000개 초과의 조직 인자 분자, 또는 예컨대 세포당 1000-20,000개의 조직 인자 분자, 또는 세포당 20,000-200,000개의 조직 인자 분자, 또는 세포당 200,000-500,000개의 조직 인자 분자, 또는 세포당 200,000-1,000,000개의 조직 인자 분자를 발현하는 세포주의 종양 성장을 억제한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 적어도 3개월 동안 -65℃에서 안정하고, 여기서 안정한 것은 실시예 20에 기재된 바와 같이 결정시에 항체 약물 접합체의 적어도 95%가 단량체 분자로 존재하는 것을 지칭한다.
한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 적어도 3개월 동안 5℃에서 안정하고, 여기서 안정한 것은 실시예 20에 기재된 바와 같이 결정시에 항체 약물 접합체의 적어도 95%가 단량체 분자로 존재하는 것을 지칭한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 임의의 상기 실시양태에 정의된 바와 같은 항체 약물 접합체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 임의의 상기 실시양태에 정의된 바와 같은 항체 약물 접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 장애의 치료에 사용하기 위한 임의의 상기 실시양태에 정의된 바와 같은 항체 약물 접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 염증의 치료에 사용하기 위한 임의의 상기 실시양태에 정의된 바와 같은 항체 약물 접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 임의의 상기 실시양태에 정의된 바와 같은 항체 약물 접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 암은 중추 신경계의 종양, 두경부암, 폐암, 예컨대 NSCLC, 유방암, 구체적으로 삼중-음성 유방암, 식도암, 위암 또는 위장암, 간암 및 담도암, 췌장암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁내막암, 난소암, 악성 흑색종, 육종, 원인불명 원발성 기원의 종양, 골수암, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병 및 비-호지킨 림프종, 피부암, 신경교종, 뇌암, 자궁암, 급성 골수성 백혈병 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서 암은 췌장암이다.
한 실시양태에서 암은 결장직장암이다.
한 실시양태에서 암은 난소암이다.
한 실시양태에서 암은 유방암이다.
한 실시양태에서 암은 전립선암이다.
한 실시양태에서 암은 방광암이다.
한 실시양태에서, 암은 튜불린 억제제로의 치료에 감수성인 암이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 상기 실시양태 중 임의의 것의 항체 약물 접합체를 제공하며, 여기서 의약은 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학요법제와 조합하여 암을 치료하기 위한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 암 치료용 의약의 제조를 위한 상기 실시양태 중 임의의 것의 항체 약물 접합체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 암은 상기 기재된 암 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 세포 사멸의 유도, 또는 종양 세포 발현 조직 인자의 성장 및/또는 증식의 억제를 필요로 하는 개체에게 유효량의 임의의 상기 실시양태의 항체 약물 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 세포 사멸을 유도하거나, 또는 종양 세포 발현 조직 인자의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 임의의 상기 암 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 유효량의 임의의 상기 실시양태의 항체 약물 접합체를 투여함으로써 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서 항체 약물 접합체는 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학요법제와 조합하여 투여된다.
항체
본 발명은, 특히 링커를 통해 서로 접합될 수 있는, 항체 및 약물 둘 다를 포함하는 항-TF 항체 약물 접합체에 관한 것이다.
항체는 널리 공지된 발현 벡터 시스템 및 숙주 세포를 이용하여 널리 공지된 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 한 실시양태에서 항체는 문헌 [De la Cruz Edmunds et al., 2006, Molecular Biotechnology 34: 179-190], EP216846, US5981216, WO 87/04462, EP323997, US5591639, US5658759, EP338841, US5879936, 및 US5891693에 개시된 바와 같이 GS 발현 벡터 시스템을 사용하여 CHO 세포에서 제조된다.
널리 공지된 기술을 이용하여 세포 배지로부터 항체를 단리 및 정제한 후에, 이들을 하기 추가로 기재된 바와 같이 링커를 통해 아우리스타틴과 접합시킨다.
본 발명의 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌 [Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)]에서 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 생산될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 모노클로날 항체는 임의의 적합한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 따라서, 예를 들어 모노클로날 항체는 예를 들어 표면에 항원을 발현하는 세포 또는 관심 항원을 코딩하는 핵산 형태의 관심 항원으로 면역화시킨 마우스로부터 얻은 뮤린 비장 B 세포로부터 제조한 하이브리도마로부터 수득할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 면역화시킨 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 래트, 개, 영장류 등의 항체-발현 세포로부터 유래된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 조직 인자에 대해 지시된 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서 "트랜스제닉 마우스"로 총칭한다.
HuMAb 마우스는 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니로커스를 내인성 μ 및 κ 쇄 로커스를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께 (문헌 [Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)]). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 인간 IgG,κ 모노클로날 항체를 생성한다 (문헌 [Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌]; 문헌 [Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) 및 Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)]에서 검토됨). HuMAb 마우스의 제조는 문헌 [Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 상세하게 기재되어 있다. 또한, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187을 참조한다.
HCo7 마우스는 그의 내인성 경쇄 (카파) 유전자 내의 JKD 파괴 (문헌 [Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)]에 기재된 바와 같음), 그의 내인성 중쇄 유전자 내의 CMD 파괴 (WO 01/14424의 실시예 1에 기재된 바와 같음), KCo5 인간 카파 경쇄 트랜스진 (문헌 [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재된 바와 같음), 및 HCo7 인간 중쇄 트랜스진 (US 5,770,429에 기재된 바와 같음)을 갖는다.
HCo12 마우스는 그의 내인성 경쇄 (카파) 유전자 내의 JKD 파괴 (문헌 [Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)]에 기재된 바와 같음), 그의 내인성 중쇄 유전자 내의 CMD 파괴 (WO 01/14424의 실시예 1에 기재된 바와 같음), KCo5 인간 카파 경쇄 트랜스진 (문헌 [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재된 바와 같음), 및 HCo12 인간 중쇄 트랜스진 (WO 01/14424의 실시예 2에 기재된 바와 같음)를 갖는다.
HCo17 트랜스제닉 마우스 균주 (또한 US 2010/0077497 참조)는 pHC2의 80 kb 삽입체 (문헌 [Taylor et al. (1994) Int. Immunol., 6: 579-591]), pVX6의 25 Kb 삽입체, 및 yIgH24 염색체의 -460 kb 효모 인공 염색체 단편의 공동주입에 의해 생성되었다. 이 균주는 (HCo17) 25950으로 지정되었다. 이어서, (HCo17) 25950 균주를 CMD 돌연변이 (PCT 공보 WO 01109187의 실시예 1에서 기재됨), JKD 돌연변이 (문헌 [Chen et al. (1993) EMBO J 12: 811-820]) 및 (KC05) 9272 트랜스진 (문헌 [Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851])을 포함하는 마우스와 번식시켰다. 생성된 마우스는 내인성 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 로커스의 파괴를 위해 동질접합성인 백그라운드에서 인간 이뮤노글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스진을 발현한다.
HCo20 트랜스제닉 마우스 균주는 미니로커스 30 중쇄 트랜스진 pHC2, 배선 가변 영역 (Vh)-함유 YAC yIgH10, 및 미니로커스 구축물 pVx6의 공동-주사의 결과이다 (WO09097006에 기재되어 있음). 이어서 (HCo20) 균주는 CMD 돌연변이 (PCT 공보 WO 01/09187의 실시예 1에 기재됨), JKD 돌연변이 (문헌 [Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 811-820]), 및 (KC05) 9272 트랜스진 (문헌 [Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851])을 포함하는 마우스와 번식시켰다. 생성된 마우스는 내인성 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 로커스의 파괴를 위해 동질접합성인 백그라운드에서 인간 10개 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스진을 발현한다.
Balb/c 균주의 유익한 표과를 갖는 HuMab를 생성하기 위해, HuMab 마우스를 야생형 Balb/c 마우스에 KC05 균주 (문헌 [Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기재된 바와 같음)를 역교배시켜 생성된 KC05 [MlK] (Balb) 마우스와 교배시켜 WO09097006에 기재된 바와 같은 마우스를 생성하였다. 이러한 교배를 이용하여 Balb/c 하이브리드를 HCo12, HCo17 및 HCo20 균주에 대해 생성하였다.
KM 마우스 균주에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌 [Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)]에 기재된 바와 같이 동종접합 방식으로 파괴되고, 내인성 마우스 중쇄 유전자는 WO 01/09187의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동종접합 방식으로 파괴되었다. 이러한 마우스 균주는 문헌 [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재된 바와 같이 인간 카파 경쇄 트랜스진 KCo5를 보유한다. 또한, 이러한 마우스 균주는 WO 02/43478에 기재된 바와 같이 염색체 14 단편 hCF (SC20)으로 구성된 인간 중쇄 트랜스크로모솜을 보유한다.
널리 공지된 기술에 따라 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하기 위해서 이러한 트랜스제닉 마우스로부터의 비장 세포가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 인간 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 다른 종으로부터 기원하는 본 발명의 항체가, 관심 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대해 트랜스제닉인 또 다른 비-인간 포유동물 또는 식물의 생성 및 그로부터 회수가능한 형태의 항체의 생산을 통해 트랜스제닉 방식으로 생성될 수 있다. 포유동물에서의 트랜스제닉 생산과 관련하여, 항체는 염소, 소, 또는 다른 포유동물에서 생산되어 유액으로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 및 US 5,741,957을 참조한다.
또한, 본 발명의 인간 항체 또는 다른 종으로부터의 본 발명의 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여, 비제한적으로 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 다른 기술을 포함하는 디스플레이-유형 기술을 통해 생성될 수 있고, 생성된 분자에 대해 친화도 성숙과 같은 추가적 성숙을 수행할 수 있으며, 이러한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (파지 디스플레이), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (파지 디스플레이), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (리보솜 디스플레이), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (파지 디스플레이), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992)], 및 US 5,733,743 참조). 디스플레이 기술이 인간이 아닌 항체를 생산하기 위해 이용되는 경우, 이러한 항체는 인간화될 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 이소형의 것일 수 있다. 이소형의 선택은 전형적으로 바람직한 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 유도에 의해 결정될 것이다. 예시적인 이소형은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 영역, 카파 또는 람다가 사용될 수 있다. 원하는 경우에, 본 발명의 항-TF 항체의 클래스는 공지된 방법에 의해 스위칭될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM인 본 발명의 항체는 본 발명의 IgG 항체로 클래스 스위칭될 수 있다. 또한, 한 IgG 서브클래스를 또 다른 서브클래스로, 예를 들어 IgG1을 IgG2로 전환하기 위해 클래스 스위칭 기술이 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 이펙터 기능은 다양한 치료 용도를 위해, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로 이소형 스위칭에 의해 변경될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1 항체, 예를 들어 IgG1,κ이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전장 항체, 바람직하게는 IgG1 항체, 특히 IgG1,κ 항체이다. 용어 전장 항체는 일반적으로 천연 전체 항체로 공지된 것, 즉 단편이 아니거나, 또는 항체의 상이한 쇄가 인간에 의해 재배열되어 새로운 유형의 항체를 생성하는 다른 유형의 항체가 아닌 것을 지칭하는 것으로 이해된다 (예를 들어, 디스플레이 상의 전장 항체를 개시한 문헌 [Sidhu SS, Nature Biotechnology, 25, 5, 537-538, (2007)] 참조). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체 단편 또는 단일-쇄 항체이다.
항체 단편은 예를 들어 통상의 기술을 사용한 단편화에 의해 얻을 수 있고, 단편은 전체 항체에 대해 본원에 기재된 바와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')2 단편은 Fab' 단편을 생산하기 위해 디술피드 브릿지가 환원되도록 처리될 수 있다. Fab 단편은 IgG 항체를 파파인으로 처리함으로써 수득할 수 있고; Fab' 단편은 IgG 항체의 펩신 소화로 수득할 수 있다. 또한, F(ab') 단편은 하기 기재된 Fab'를 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 통해 결합시킴으로써 생산될 수 있다. Fab' 단편은 F(ab')2의 힌지 영역의 디술피드 결합의 절단에 의해 수득한 항체 단편이다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편을 환원제, 예컨대 디티오트레이톨로 처리함으로써 수득할 수 있다. 또한, 항체 단편은 재조합 세포에서 이러한 단편을 코딩하는 핵산의 발현에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)] 참조). 예를 들어, F(ab')2 단편의 일부를 코딩하는 키메라 유전자는 CH1 도메인을 코딩하는 DNA 서열 및 H 쇄의 힌지 영역, 이어서 이러한 말단절단된 항체 단편 분자를 생성하기 위한 번역 정지 코돈을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 WO 2010/066803 (젠맙 A/S)에서 추가로 개시 및 특성화되었다.
한 실시양태에서 항-TF 항체는 안정화 IgG4 항체이다. 적합한 안정화 IgG4 항체의 예는 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역의 위치 409의 아르기닌 (문헌 [Kabat et al.]에서와 같이 EU 인덱스에 나타냄)이 리신, 트레오닌, 메티오닌 또는 류신, 바람직하게는 리신으로 치환 (WO2006033386 (기린(Kirin))에 기재됨)되고/거나 힌지 영역이 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함하는 항체이다.
추가 실시양태에서, 안정화 IgG4 항-TF 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 IgG4 항체이며, 여기서 상기 중쇄는 409에 상응하는 위치에서 Lys, Ala, Thr, Met 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기 및/또는 405에 상응하는 위치에서 Ala, Val, Gly, Ile 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기를 갖는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하며, 상기 항체는 임의로 하나 이상의 추가의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하지만, 힌지 영역에서 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 상기 항체는 409에 상응하는 위치에 Lys 또는 Ala 잔기를 포함하거나 또는 항체의 CH3 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG3의 CH3 영역에 의해 대체된 것이다.
추가 실시양태에서, 안정화 IgG4 항-TF 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 IgG4 항체이며, 여기서 상기 중쇄는 잔기를 409에 상응하는 위치에서 Lys, Ala, Thr, Met 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기 및/또는 405에 상응하는 위치에서 Ala, Val, Gly, Ile 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기를 갖는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하고, 상기 항체는 임의로 하나 이상의 추가의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하고, 상기 항체는 힌지 영역에서 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체는 409에 상응하는 위치에 Lys 또는 Ala 잔기를 포함하거나 또는 항체의 CH3 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG3의 CH3 영역에 의해 대체된 것이다.
추가 실시양태에서, 항-TF 항체는 ADCC와 같은 이펙터 기능을 조정하는 능력이 감소되거나 또는 심지어 제거되도록 돌연변이된 비-IgG4 유형, 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG3의 항체이다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 문헌 [Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177(2):1129-1138 (2006) 및 Hezareh M, J Virol. ;75(24):12161-12168 (2001)]에 기재되어 있다.
접합체
본 발명은 항-TF 항체 약물 접합체를 제공한다.
한 측면에서 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 아우리스타틴 또는 아우리스타틴 펩티드 유사체 및 유도체 (US5635483; US5780588)에 접합된, 본원에 개시된 바와 같은 항-TF 항체를 포함한다. 아우리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해 및 핵 및 세포 분열을 방해하는 것으로 밝혀졌고 (문헌 [Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584]) 및 항암 (US5663149) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965])을 갖는다. 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (말단)을 통하여, 링커를 통해 항체에 부착될 수 있다.
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 N-말단-연결된 모노메틸 아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다 (문헌 [Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research. Volume 45, abstract number 623, presented March 28, 2004]에 개시되고, US 2005/0238649에 기재되어 있음).
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 MMAE (모노메틸 아우리스타틴 E)이고, 여기서 파상선은 항체 약물 접합체의 링커 (L)에의 공유 부착을 나타낸다:
Figure 112013003426946-pct00008
또 다른 예시적인 아우리스타틴 실시양태는 MMAF (모노메틸 아우리스타틴 F)이고, 여기서 파상선은 항체 약물 접합체의 링커 (L)에의 공유 부착을 나타낸다 (US2005/0238649):
Figure 112013003426946-pct00009
본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체는 세포증식억제 또는 세포독성 약물 단위와 항체 단위 사이에 링커 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 세포내 조건 하에 절단가능하여, 링커의 절단이 항체로부터 세포내 환경에 약물 단위를 방출한다. 또 다른 실시양태에서, 링커 단위는 절단가능하지 않고, 약물은 예를 들어 항체 분해에 의해 방출된다. 일부 실시양태에서, 링커는 세포내 환경에 (예를 들어, 리소솜 또는 엔도솜 또는 소포 내에) 존재하는 절단가능한 작용에 의해 절단될 수 있다. 링커는 예를 들어 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소 (리소솜 또는 엔도솜 프로테아제를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있고, 이들은 모두 디펩티드 약물 유도체를 가수분해하여 표적 세포 내로 활성 약물을 방출시키는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123] 참조). 구체적 실시양태에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit (발린-시트룰린) 링커 또는 Phe-Lys (페닐알라닌-리신) 링커이다 (예를 들어, US6214345 (Val-Cit 링커를 갖는 독소루비신의 합성 및 Phe-Lys 링커의 상이한 예를 기재함) 참조). Val-Cit 및 Phe-Lys 링커의 구조의 예는 하기 기재된 MC-vc-PAB, MC-vc-GABA, MC-Phe-Lys-PAB 또는 MC-Phe-Lys-GABA를 포함하나 이에 제한되지 않고, 여기서 MC는 말레이미도 카프로일의 약어이고, vc는 Val-Cit의 약어이고, PAB는 p-아미노벤질카르바메이트의 약어이고, GABA는 γ-아미노부티르산의 약어이다. 치료제의 세포내 단백질분해 방출을 이용하는 이점은 작용제가 전형적으로 접합되는 경우에 감쇄되고, 접합체의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 링커 단위는 절단가능하지 않고, 약물은 항체 분해에 의해 방출된다 (US 2005/0238649 참조). 전형적으로, 이러한 링커는 세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않다. 본원에 사용된 바와 같이 링커와 관련하여 "세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않다"는 항체 약물 접합체 화합물이 세포외 환경 (예를 들어, 혈장)에 존재할 때 20% 이하, 전형적으로 약 15% 이하, 보다 전형적으로 약 10% 이하, 및 보다 더 전형적으로 약 5% 이하, 약 3% 이하, 또는 약 1% 이하의 링커가 항체 약물 접합체 화합물의 샘플에서 절단되는 것을 의미한다. 링커가 세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않은지 여부는 예를 들어 미리 결정된 기간 (예를 들어, 2, 4, 8, 16 또는 24시간) 동안 항체 약물 접합체 화합물을 혈장과 인큐베이션한 후에 혈장에 존재하는 유리 약물의 양을 정량화함으로써 결정될 수 있다.
MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 추가의 예시적 실시양태는 하기 구조를 갖는다 (여기서, Ab는 항체를 의미하고 약물-로딩 (또는 항체 분자당 세포증식억제 또는 세포독성 약물의 평균 수)을 나타내는 p는 1 내지 약 8이고, 예를 들어 p는 4-6, 예컨대 3-5일 수 있거나, 또는 p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 수 있음).
절단가능한 링커가 아우리스타틴과 조합되는 예는 MC-vc-PAB-MMAF (또한 vcMMAF로 지칭됨) 및 MC-vc-PAB-MMAF (또한 vcMMAE로 지칭됨)를 포함하며, 여기서 MC는 말레이미도 카프로일의 약어이고, vc는 Val-Cit (발린-시트루린) 기반 링커의 약어이고, PAB는 p-아미노벤질카르바메이트의 약어이다:
Figure 112013003426946-pct00010
다른 예는 비-절단가능한 링커, 예컨대 mcMMAF (mc (MC는 이와 관련하여 mc와 동일함)는 말레이미도 카프로일의 약어임)와 조합된 아우리스타틴을 포함한다:
Figure 112013003426946-pct00011
세포증식억제 또는 세포독성 약물 로딩은 p에 의해 표시되고, 분자에서 항체당 세포증식억제 약물 모이어티의 평균 수 (또한 약물 대 항체 비, DAR로 지칭됨)이다. 세포증식억제 또는 세포독성 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개 약물 모이어티의 범위일 수 있고, 유용한 관능기, 예컨대 비제한적으로 리신 또는 시스테인에서와 같은 아미노 또는 술프히드릴 기를 갖는 아미노산 상에서 일어날 수 있다.
접합 방식에 따라, p는 예를 들어 본 발명에서와 같이 부착이 술프히드릴 기인 경우에 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 일반적으로, 항체는 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기가 디술피드 브릿지로 존재하므로 약물 모이어티에 연결될 수 있는 다수의 술프히드릴 기 (유리 및 반응성 시스테인 티올 기)를 함유하지 않는다. 따라서, 특정 실시양태에서, 항체를 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)과 같은 환원제로 부분적 또는 완전한 환원 조건 하에 환원시켜, 반응성 술프히드릴 잔기를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ADC에 대한 약물 로딩은 1 내지 약 8의 범위이고, 예를 들어 p는 4-6, 예컨대 3-5일 수 있거나, 또는 p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8일 수 있으며, 이는 최대 8개의 술프히드릴 잔기가 항체의 (부분적) 환원 후에 이용가능하게 되기 때문이다 (쇄내 디술피드 결합에 관여하는 8개의 시스테인이 존재함).
한 실시양태에서, 약물 링커 모이어티는 vcMMAE이다. vcMMAE 약물 링커 모이어티 및 접합 방법은 WO2004010957, US7659241, US7829531, US7851437 및 US 11/833,028 (시애틀 제네틱스, 인크.(Seattle Genetics, Inc.)) (본원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있고, vcMMAE 약물 링커 모이어티는 여기에 개시된 것과 유사한 방법을 이용하여 시스테인에서 항-TF 항체에 결합된다.
한 실시양태에서, 약물 링커 모이어티는 mcMMAF이다. mcMMAF 약물 링커 모이어티 및 접합 방법은 US7498298, US 11/833,954 및 WO2005081711 (시애틀 제네틱스, 인크.) (본원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있고, mcMMAF 약물 링커 모이어티는 여기에 개시된 것과 유사한 방법을 이용하여 시스테인에서 항-TF 항체에 결합된다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-011-vcMMAE이다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-098-vcMMAE이다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-111-vcMMAE이다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-114-vcMMAE이다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-011-mcMMAF이다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-098-mcMMAF이다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-111-mcMMAF이다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-114-mcMMAF이다.
대안적 실시양태에서 항-TF 항체는 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 화학요법 약물, 시토카인, 면역억제제 또는 방사성동위원소에 접합된다. 이러한 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다.
세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 (예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함한다. 본 발명의 면역접합체를 형성하는데 적합한 치료제는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 메이탄신 또는 그의 유사체 또는 유도체, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신; 칼리케아미신 또는 그의 유사체 또는 유도체; 항대사물 (예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 겜시타빈, 클라드리빈), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 다른 백금 유도체, 예컨대 카르보플라틴; 뿐만 아니라 두오카르마이신 A, 두오카르마이신 SA, CC-1065 (또한 라켈마이신으로 공지됨), 또는 CC-1065의 유사체 또는 유도체), 돌라스타틴, 피롤로[2,1-c][1,4] 벤조디아제핀 (PDB) 또는 그의 유사체, 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 다우노루비신 (이전의 다우노마이신), 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신 (AMC)), 항-유사분열 작용제 (예를 들어, 튜불린-억제제), 예컨대 디프테리아 독소 및 관련 분자 (예컨대, 디프테리아 A 쇄 및 그의 활성 단편 및 하이브리드 분자); 리신 독소 (예컨대, 리신 A 또는 탈글리코실화 리신 A 쇄 독소), 콜레라 독소, 시가-유사 독소 (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 바우만-버크 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 젤라닌, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신 독소를 포함한다. 다른 적합한 접합 분자는 항미생물성/용해성 펩티드, 예컨대 CLIP, 마가이닌 2, 멜리틴, 세크로핀 및 P18; 리보뉴클레아제 (RNase), DNase I, 스타필로코쿠스 장독소-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 디프테린 독소 및 슈도모나스 내독소를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) 및 Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994)]을 참조한다. 본원 전반에 기재된 바와 같이 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 투여될 수 있는 치료제, 예컨대 예를 들어 항암 시토카인 또는 케모카인은 또한 본 발명에 개시된 항체에의 접합에 유용한 치료 모이어티에 대한 후보이다.
또 다른 대안적 실시양태에서, 본 발명에 개시된 항-TF 항체 약물 접합체는 접합 핵산 또는 핵산-관련 분자를 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, 접합 핵산은 세포독성 리보뉴클레아제, 안티센스 핵산, 억제 RNA 분자 (예를 들어, siRNA 분자) 또는 면역자극 핵산 (예를 들어, 면역자극 CpG 모티프-함유 DNA 분자)이다. 또 다른 대안적 실시양태에서, 본 발명의 항-TF 항체는 아우리스타틴 또는 그의 기능적 펩티드 유사체 또는 유도체 대신에 압타머 또는 리보자임에 접합된다.
또 다른 대안적 실시양태에서, 하나 이상의 방사성표지된 아미노산을 포함하는 항-TF 항체 약물 접합체가 제공된다. 방사성표지된 항-TF 항체는 진단 및 치료 목적 둘 다에 사용될 수 있다 (방사성표지된 분자에의 접합이 또 다른 가능한 특징임). 폴리펩티드를 위한 표지의 비제한적 예는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 및 125I, 131I, 및 186Re를 포함한다. 방사성표지된 아미노산 및 관련 펩티드 유도체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))] 및 US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 및 US 5,697,902 참조). 예를 들어, 방사성동위원소는 클로르아민 T 방법에 의해 접합될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 방사성동위원소 또는 방사성동위원소-함유 킬레이트에 접합된다. 예를 들어, 항체는 킬레이터 링커, 예를 들어 DOTA, DTPA 또는 티욱세탄에 접합될 수 있으며, 이는 항체와 방사성동위원소와의 복합체 형성을 허용한다. 항체는 또한 또는 대안적으로 하나 이상의 방사성표지된 아미노산 또는 다른 방사성표지된 분자를 포함하거나 또는 이에 접합될 수 있다. 방사성표지된 항-TF 항체는 진단 및 치료 목적 둘 다에 사용될 수 있다. 방사성동위원소의 비제한적 예는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 111In, 131I, 186Re, 213Bs, 225Ac 및 227Th를 포함한다.
항-TF 항체는 또한 예를 들어 그의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 접합에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예시적인 중합체 및 이들을 펩티드에 부착시키는 방법은 예를 들어 US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 및 US 4,609,546에 예시되어 있다. 추가의 중합체는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (예를 들어, 분자량이 약 1,000 내지 약 40,000, 예컨대 약 2,000 내지 약 20,000인 PEG)을 포함한다. 이는 예를 들어 항-TF 항체가 단편인 경우에 사용될 수 있다.
상기 기재된 것과 같은 접합 분자(들)에 본 발명에 개시된 항-TF 항체를 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법 (문헌 [Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982)]에 기재된 방법 포함)이 이용될 수 있다. 이러한 항체는 다른 모이어티를 항-TF 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, 항-TF 항체 H 또는 L 쇄)의 N-말단 측면 또는 C-말단 측면에 화학적으로 접합시킴으로써 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)] 참조). 또한, 이러한 접합 항체 유도체는 적절한 경우에 내부 잔기 또는 당에 접함시킴으로써 생성될 수 있다.
작용제는 본 발명에 개시된 항-TF 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 제2 작용제의 간접 커플링의 한 예는 항체에서 시스테인 또는 리신 잔기에의 스페이서 모이어티를 통한 커플링이다. 한 실시양태에서, 항-TF 항체는 생체내에서 치료 약물로 활성화될 수 있는 전구약물 분자에 스페이서 또는 링커를 통해 접합된다. 투여 후에, 스페이서 또는 링커는 종양 세포-연관 효소 또는 다른 종양-특이적 조건에 의해 절단되어, 활성 약물이 형성된다. 이러한 전구약물 기술 및 링커의 예는 WO02083180, WO2004043493, WO2007018431, WO2007089149, WO2009017394 및 WO201062171 (Syntarga BV, et al.) (모두 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 적합한 항체-전구약물 기술 및 두오카르마이신 유사체는 또한 미국 특허 번호 6,989,452 (메다렉스(Medarex)) (본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-TF 항체는 방사성 동위원소에의 항체의 접합을 허용하는 킬레이터 링커, 예를 들어 티욱세탄에 부착된다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 발현 벡터에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항-TF 항체는 아우리스타틴 또는 그의 기능적 펩티드 유사체 또는 유도체와 상이한 치료 모이어티에 접합된다. 이러한 발현 벡터는 한 실시양태에서 이후에 후속적으로 본원에 기재된 바와 같은 모이어티에 접합될 수 있는 본 발명의 항-TF 항체를 발현하는데 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 1-4, 5-8, 33-36, 37-40, 41-44, 45-48, 73-76 및 77-80.
또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 VH 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 1, 5, 37 및 33.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 VH CDR3 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 4, 8, 40 및 36.
또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 VL 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 41, 45, 77 및 73.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 VL CDR3 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 44, 48, 80 및 76.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 하나 이상의 상기 아미노산 서열의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 최대 25개의 아미노산 변형, 예컨대 20개, 예컨대 최대 15, 14, 13, 12 또는 11개의 아미노산 변형, 예컨대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 변형, 예컨대 결실 또는 삽입, 바람직하게는 치환, 예컨대 보존적 치환을 갖거나, 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 80%의 동일성, 예컨대 임의의 상기 언급된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%의 동일성 또는 90%의 동일성 또는 95%의 동일성, 예컨대 96%의 동일성 또는 97%의 동일성 또는 98%의 동일성 또는 99%의 동일성을 갖는다.
추가 실시양태에서, 발현 벡터는 항체, 예를 들어 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
이러한 발현 벡터는 본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해 사용될 수 있다.
본 발명과 관련하여 발현 벡터는 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터 (적합한 세트의 발현 제어 요소를 포함하는 핵산 서열)일 수 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합물로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-TF 항체-코딩 핵산은 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터, 예를 들어 선형 발현 요소 (예를 들어, 문헌 [Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)]에 기재된 바와 같음), 압축형 핵산 벡터 (예를 들어, US 6,077,835 및/또는 WO 00/70087에 기재된 바와 같음), 플라스미드 벡터, 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "미지 (midge)" 최소 크기의 핵산 벡터 내에 (예를 들어, 문헌 [Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)]에 기재된 바와 같음), 또는 침전된 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaP04-침전된 구축물로서 (예를 들어, WO 00/46147, 문헌 [Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), 및 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)]에 기재된 바와 같음) 포함된다. 이러한 핵산 벡터 및 그의 용법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972 참조).
한 실시양태에서, 벡터는 박테리아 세포에서 항-TF 항체의 발현에 적합하다. 이러한 벡터의 예는 발현 벡터, 예컨대 블루스크립트(BlueScript) (스트라타진(Stratagene)), pIN 벡터 (문헌 [Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989)]), pET 벡터 (노바젠(Novagen), 위스콘신주 매디슨) 등을 포함한다.
발현 벡터는 또한 또는 대안적으로 효모 시스템에서 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서 발현에 적합한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 예를 들어, 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터를 포함한다 (문헌 [F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), 및 Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)]에서 검토됨).
핵산 및/또는 벡터는 또한 폴리펩티드, 예를 들어 신생 폴리펩티드 쇄를 주변세포질 공간에 또는 세포 배양 배지 내로 표적화할 수 있는 분비/국재화 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 당업계에 공지되어 있고, 분비 리더 또는 신호 펩티드, 소기관 표적화 서열 (예를 들어, 핵 국재화 서열, ER 체류 신호, 미토콘드리아 수송 서열, 엽록체 수송 서열), 막 국재화/앵커 서열 (예를 들어, 이동 중지 서열, GPI 앵커 서열) 등을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터에서, 항-TF 항체-코딩 핵산은 임의의 적합한 프로모터, 인핸서 및 다른 발현-촉진 요소를 포함하거나 그와 회합될 수 있다. 이러한 요소의 예는 강한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서뿐만 아니라 RSV, SV40, SL3-3, MMTV 및 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리(A) 종결 서열, 이. 콜라이(E. coli) 내에서 플라스미드 생성물에 대한 복제 기점, 선택 마커로서 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커)를 포함한다. 핵산은 또한 CMV IE와 같은 구성적 프로모터에 반대되는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다 (당업자는 이러한 용어가 특정 조건 하에 유전자 발현 정도의 실제 서술어임을 인식할 것임).
한 실시양태에서, 항-TF-항체-코딩 발현 벡터는 바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 또는 숙주 동물 내에 배치되고/되거나 전달될 수 있다.
또한 추가 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항-TF 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 이중특이적 분자를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마에 관한 것이다. 숙주 세포의 예는 효모, 박테리아 및 포유동물 세포, 예컨대 CHO 또는 HEK 세포를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-TF 항체의 발현을 위한 코딩 서열을 포함하는 세포 게놈 내로 안정하게 통합된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-TF 항체의 발현을 위한 코딩 서열을 포함하는, 비-통합된 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드 또는 선형 발현 요소를 포함하는 세포를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다. 또한 추가 측면에서, 본 발명은 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물에 관한 것이고, 여기서 동물 또는 식물은 본 발명의 항체를 생산한다. 이러한 하이브리도마 및 트랜스제닉 동물의 생성은 상기 기재되어 있다.
추가 측면에서, 본 발명은
a) 상기 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 하이브리도마 또는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
b) 배양 배지로부터 본 발명의 항체를 정제하는 단계, 및 임의로
c) 항-TF 항체를 ADC로 형질전환시키는 단계
를 포함하는, 본 발명의 항-TF 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
제약 조성물
항-TF 항체 약물 접합체의 정제시에 이들은 널리 공지된 제약 담체 또는 부형제를 이용하여 제약 조성물로 제제화될 수 있다.
제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제와 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 개시된 것과 같은 통상의 기술에 따라 제제화될 수 있다.
제약상 허용되는 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지의 아주반트 및 부형제는 본 발명의 항체 약물 접합체 및 선택된 투여 방식에 적합해야 한다. 제약 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적합성은 항원 결합에 대한 본 발명의 선택된 화합물 또는 제약 조성물의 바람직한 생물학적 특성에 대한 유의한 부정적인 영향의 결여 (예를 들어, 실질적이지 않은 영향 (10% 이하의 상대적 억제, 5% 이하의 상대적 억제 등))에 기초하여 결정된다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 희석제, 충전제, 염, 완충제, 세제 (예를 들어, 비이온성 세제, 예컨대 트윈-20 또는 트윈-80), 안정화제 (예를 들어, 당 또는 단백질-무함유 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제 및/또는 제약 조성물에 포함시키기 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다.
TF를 과다발현하는 암 세포는 세포당 보다 많은 항체가 결합할 수 있으므로 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체에 대해 특히 우수한 표적일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체로 치료할 암 환자는 그의 종양 세포 내에 K-ras에서 하나 이상의 돌연변이 및/또는 p53에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 것으로 진단된 환자, 예를 들어 췌장암, 폐암 또는 결장직장암 환자이다. TF 발현은 MEK/미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK) 및 포스파티딜이노시톨 3'-키나제 (PI3K)에 의존성인 방식으로 질환 진행을 유도하는 2가지 주요 형질전환 사건 (K-ras 종양유전자의 활성화 및 p53 종양 억제인자의 불활성화)의 제어 하에 있다 (문헌 [Yu et al. (2005) Blood 105:1734]).
본 발명의 제약 조성물 내의 항체 약물 접합체의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 바람직한 치료 반응을 달성하기 위해 효과적인 항체 약물 접합체의 양을 얻을 수 있기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물 또는 그의 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에 널리 공지된 다른 요인과 같은 다양한 약동학 요인에 따라 결정될 것이다.
제약 조성물은 임의의 적합한 경로 및 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 약물 접합체를 투여하는 적합한 경로는 당업계에 널리 공지되어 있고, 당업자가 선택할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비경구 투여된다.
본원에 사용된 바와 같이 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로 주사에 의한 것을 의미하고, 표피, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 건내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 두개내, 흉곽내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
제약상 허용되는 담체는 본 발명의 항체 약물 접합체와 생리학상 상용성인 임의의 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제, 항산화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 목화씨 오일 및 참깨 오일, 카르복시메틸 셀룰로스 콜로이드성 용액, 트라가칸트 검 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 및/또는 다양한 완충제를 포함한다. 다른 담체는 제약 업계에 널리 공지되어 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체와 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물 내에서 그의 사용이 고려된다.
예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제, 예를 들어 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 조성물 내에 등장화제, 예컨대 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 염화나트륨을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 제약 조성물의 보관 수명 또는 유효성을 증진시킬 수 있는, 선택된 투여 경로에 적합한 하나 이상의 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보존제 또는 완충제를 또한 함유할 수 있다. 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제와 같은, 신속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 담체는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생분해성의 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 단독으로 또는 왁스와 함께, 또는 당업계에 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 생체내에서 적합한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물 내에서 그의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
주사용 제약 조성물은 전형적으로 멸균성이고 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙적 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 함유하는 수성 또는 비수성 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 글리세롤, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속적인 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 일어날 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 항-TF 항체 약물 접합체를 적절한 용매 내에, 요구되는 경우에 예를 들어 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합물과 함께 혼입한 후 멸균 마이크로여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 항-TF 항체 약물 접합체를 기본 분산 매질 및 예를 들어 상기 열거된 것 중의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법의 예는 미리 멸균-여과시킨 그의 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 항-TF 항체 약물 접합체를 적절한 용매 내에, 요구되는 경우에 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합물과 함께 혼입한 후 멸균 마이크로여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 항-TF 항체 약물 접합체를 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것 중의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법의 예는 미리 멸균-여과시킨 그의 용액으로부터 항-TF 항체 약물 접합체 플러스 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
본 발명의 제약 조성물은 하나의 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체 또는 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체의 조합물을 함유할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 수많은 목적에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 다양한 형태의 암의 치료에 사용될 수 있다. 한 측면에서 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 다음과 같은 다양한 고형 암 유형의 치료에 사용된다: 중추 신경계의 종양, 두경부암, 폐암 (예컨대, 비소세포 폐암), 유방암 (예컨대, 삼중-음성 유방암), 식도암, 위암, 간암 및 담도암, 췌장암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁내막암, 난소암, 악성 흑색종, 육종 (연부 조직, 예를 들어 골 및 근육), 원인불명 원발성 기원 (즉, 원인불명 원발성) 종양, 백혈병, 골수암 (예컨대, 다발성 골수종), 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병 및 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 피부암, 신경교종, 뇌암, 자궁암 및 직장암.
추가의 자가면역 염증, 예컨대 근병증 또는 다발성 경화증은 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체로 표적화될 수 있다.
암 관련 지혈 장애가 또한 본 발명으로 표적화될 수 있다.
염증이 있는 추가의 질환, 예컨대 근병증, 류마티스 관절염, 골관절염, 강직성 척추염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장병증성 척추염, 소아 관절병증, 반응성 관절병증, 감염성 또는 감염후 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균 관절염, 매독성 관절염, 사구체신염, 말기 신질환, 전신 홍반성 루푸스, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 낭성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식, 알레르기성 천식, 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 특발성 폐 섬유증, 또는 다발성 경화증이 본 발명의 항-TF 항체로 표적화될 수 있다.
또한 혈관 질환, 예컨대 혈관 재협착, 심근 혈관 질환, 뇌 혈관 질환, 망막증 및 황반 변성 (비제한적으로 습식 AMD 포함)이 항-TF 항체 약물 접합체로 치료될 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 심혈관 위험, 예컨대 아테롬성동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 이상지혈증 및 급성 관상동맥 증후군 (비제한적으로 급성 심근 경색, 졸중 포함)을 갖는 환자의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 혈전증, 예컨대 DVT, 신장 색전증, 폐 색전증, 동맥 혈전증의 억제를 위해, 또는 동맥 수술, 말초 혈관 우회로 이식 또는 관상 동맥 우회로 이식, 설치물, 예컨대 동맥-정맥 션트; 스텐트 또는 카테터의 제거 후에 발생하는 혈전증의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 신장 허혈성 재관류 손상의 억제에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 고지단백혈증 또는 부갑상선기능항진증의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 혈관염, ANCA-양성 혈관염 또는 베체트병의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 외상-유도된 호흡 부전, 예컨대 급성 호흡 곤란 증후군 또는 급성 폐 손상의 차단에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 감염-유도된 기관 기능장애, 예컨대 신부전, 급성 호흡 곤란 증후군 또는 급성 폐 손상의 차단에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 다양한 혈전색전성 장애, 예컨대혈관성형술, 심근경색, 불안정형 협심증 및 관상 동맥 협착으로부터 발생하는 것의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 전신 감염에 대한 TF-매개 합병증, 예컨대 패혈증 또는 폐렴을 치료하기 위한 예방적 셋팅에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 혈전증 위험이 있는 아테롬성동맥경화성 혈관을 갖는 환자의 예방적 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 이식편-대-숙주 질환의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 또한 심장 동종이식편 혈관병증 (CAV)을 예방하고, 급성 이식편 거부를 예방하기 위해, 췌도 이식에서 베타 세포 생착을 증가시키는데 유용할 수 있다.
유사하게, 본 발명은 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체를 TF를 발현하는 종양 세포의 성장 및/또는 증식의 억제를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, TF를 발현하는 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 종양 세포는 암, 예컨대 전립선암, 폐암 (예컨대, 비소세포 폐암), 유방암 (예컨대, 삼중-음성 유방암), 결장직장암 (예컨대, 전이성 결장직장암), 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 피부 흑색종, 백혈병 골수암 (예컨대, 다발성 골수종), 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병 및 비-호지킨 림프종, 피부암, 전립선암, 신경교종, 뇌암, 신장암, 자궁암, 방광암, 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 직장암에 연관된다.
또한, 본 발명은 상기 언급된 특정 암 적응증 중 어느 것과 같은 암 치료용 의약의 제조를 위한 인간 TF에 결합하는 항-TF 항체 약물 접합체의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체로 치료할 환자의 선택은 그의 소변 및/또는 혈액 내의 TF의 수준에 기초한다. 특정한 실시양태에서, 치료할 환자는 소변 및/또는 혈액 내에 비교적 높은 수준의 TF를 갖는다. 예를 들어, 치료할 환자는 소변 내의 TF 수준이 20 ng/mL 초과, 예컨대 40 ng/mL 초과, 예를 들어 100 ng/mL 초과, 예컨대 200 ng/mL 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 환자의 혈청 내의 TF 수준은 100 pg/mL 초과, 예컨대 200 pg/mL 초과일 수 있다. 이는 예를 들어 ELISA를 이용하여 결정할 수 있다. 이를 수행하는 방법은 진단 용도와 관련하여 하기 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
그러나, 소변 및/또는 혈액에서 TF 수준이 보다 낮은 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체로 환자를 치료하는 것이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
한 실시양태에서 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체로 치료할 환자의 선택은 TF 발현의 수준에 기초할 수 있다. TF 발현의 수준은 환자를 방사성표지된 항-TF 항체에 노출시킨 후에 환자에서 방사능의 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다. 방사성표지된 항-TF 항체는 본 발명에 기재된 항-TF 항체 약물 접합체, 즉 본원에 기재된 항-TF 항체 약물 접합체의 항체일 수 있거나, 또는 또 다른 항-TF 항체일 수 있다. 방사성표지의 예는 항체의 방사성표지와 관련하여 상기 기재된 임의의 것일 수 있다. 이를 수행하는 방법은 진단 용도에 관련하여 하기 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 치료 방법의 추가 실시양태에서, 치료 효능을 치료 동안, 예를 들어 미리정의된 시점에 모니터링한다. 한 실시양태에서, 효능을 예를 들어 ELISA에 의해 소변 또는 혈액 내의 TF 수준을 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 이를 수행하는 방법은 진단 용도에 관련하여 하기 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 효능을 질환 영역의 시각화에 의해, 예를 들어 표지된 항-TF 항체, 예컨대 본 발명에 기재된 표지된 항-TF 항체를 사용하여 예를 들어 하나 이상의 PET-CT 스캔을 수행함으로써 결정할 수 있다. 또한, 표지된 항-TF 항체, 예컨대 본원에 개시된 표지된 항-TF 항체 011, 098, 114 및 111은 예를 들어 PET-CT 스캔을 이용하여 TF-생산 종양을 검출하는데 사용될 수 있다.
상기 치료 및 사용 방법에서 투여 요법은 최적의 바람직한 반응을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 용량을 투여할 수 있거나, 여러 회분으로 나뉘어진 용량을 시간 경과에 따라 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 지시된 바에 비례하여 용량을 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제제화할 수 있다. 본원에 사용된, 투여량 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 상세한 내용은 (a) 활성 화합물의 특징적인 특징 및 달성할 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서 감수성의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 특징적인 한계에 의해 지시되고 그에 직접 의존한다.
항-TF 항체 약물 접합체에 대한 효율적인 투여량 및 투여 요법은 치료할 질환 또는 상태에 의존적이고 당업자가 결정할 수 있다. 본 발명의 화합물의 치료 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 약 0.1-100 mg/kg, 예컨대 약 0.1-50 mg/kg, 예를 들어 약 0.1-20 mg/kg, 예컨대 약 0.1-10 mg/kg, 예컨대 약 0.5-5 mg/kg, 예를 들어 약 5 mg/kg, 예컨대 약 4 mg/kg, 또는 약 3 mg/kg, 또는 약 2 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg, 또는 약 0.3 mg/kg이다. 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체의 치료 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는, 특히 본원에 개시된 항체 011, 098, 114 또는 111의 약 0.02-30 mg/kg, 예컨대 약 0.1-20 mg/kg, 또는 약 0.5-10 mg/kg, 또는 약 0.5-5 mg/kg, 예를 들어 약 1-2 mg/kg이다.
당업계의 통상의 기술을 갖는 의사는 요구되는 제약 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사는 제약 조성물에서 사용되는 항-TF 항체 약물 복합체의 용량을 바람직한 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 더 낮은 수준에서 시작하여 바람직한 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생산하기 위해 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 상기 기재된 인자에 따라 좌우될 것이다. 투여는 예를 들어 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여일 수 있고, 예를 들어 표적의 부위에 근접하게 투여된다. 원하는 경우에, 제약 조성물의 효과적인 1일 용량은 따로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 초과의 하위-용량으로서 하루에 걸쳐 적절한 간격으로 임의로 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체를 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, 항-TF 항체 약물 접합체를 상기 기재된 바와 같은 제약 조성물로서 투여하는 것이 바람직하다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 10 내지 1500 mg/m2, 예컨대 30 내지 1500 mg/m2, 또는 예컨대 50 내지 1000 mg/m2, 또는 예컨대 10 내지 500 mg/m2, 또는 예컨대 100 내지 300 mg/m2의 매주 투여량으로 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여는 예를 들어, 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회 반복될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 30 내지 1500 mg/m2, 예컨대 50 내지 1000 mg/m2 또는 100 내지 300 mg/m2의 투여량으로 3주마다 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여는 예를 들어, 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회 반복될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 독성 부작용을 감소시키기 위해 장기간, 예컨대 24시간 초과에 걸쳐 느린 연속 주입에 의해 투여될 수 있다.
한 실시양태에서 항-TF 항체 약물 접합체는 50 mg 내지 2000 mg, 예컨대 예를 들어 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg 또는 2000 mg의 매주 투여량으로, 16회까지, 예컨대 4 내지 10회, 예컨대 4 내지 6회 투여될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 이러한 투약법은 필요한 경우에 예를 들어, 6개월 또는 12개월 후에 1회 이상 반복될 수 있다. 투여량은 예를 들어, 생물학적 샘플을 채취하고 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체의 항원 결합 영역을 표적화하는 항-이디오타입 항체를 사용함으로써, 투여 시에 혈액 내의 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체의 양을 측정함으로써 결정되거나 조정될 수 있다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 예를 들어 6개월 이상의 기간 동안 매주 1회와 같은 유지 요법에 의해 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체의 1회 주입에 이어 방사성동위원소를 함유하는 본 발명의 항-TF 항체 (예컨대, 본원에 개시된 항체 011, 098, 114 또는 111)의 주입을 포함하는 요법에 의해 투여될 수 있다. 요법은 예를 들어 7 내지 9일 후에 반복될 수 있다.
비-제한적 예로서, 본 발명에 따른 치료는 24, 12, 8, 6, 4, 또는 2시간마다의 단일 또는 분할 용량, 또는 그의 임의의 조합을 이용하여 치료 개시후 제1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40일 중 적어도 하나, 또는 대안적으로 제1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 중 적어도 하나, 또는 일부 경우에 제11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주, 또는 그의 임의의 조합에서 1일당 약 0.1-100 mg/kg, 예컨대 0.3-3 mg/kg, 예를 들어 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg의 양으로 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체의 매주, 2주마다, 3주마다 또는 매월 투여량으로 제공될 수 있다.
종양 요법을 위한 "유효량"은 또한 질환의 진행을 안정화시키는 그의 능력에 의해 측정할 수 있다. 암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 대안적으로, 조성물의 상기 특성은 숙련된 진료의에게 공지된 시험관내 검정에 의해 세포 성장을 억제하거나 아폽토시스를 유도하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가할 수 있다. 치료 화합물의 치료 유효량은 종양 크기를 감소시키거나 그렇지 않으면 대상체에서 증상을 개선할 수 있다. 당업자는 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정한 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
항-TF 항체 약물 접합체는 또한 암 발병 위험을 감소시키고/시키거나, 암 진행에서 사건 발현의 발생을 지연시키고/시키거나 암이 완화 상태일 때 재발 위험을 감소시키기 위해 예방을 위해 투여될 수 있다. 이것은 다른 생물학적 요인으로 인해 존재하는 것으로 공지된 종양의 위치 결정이 어려운 환자에서 특히 유용할 수 있다.
항-TF 항체 약물 접합체는 또한 조합 요법으로, 즉 치료할 질환 또는 상태에 관련된 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체 의약은 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 세포독성제, 화학요법제 또는 항혈관신생제와 조합하기 위한 것이다.
이러한 조합 투여는 동시, 개별 또는 순차적일 수 있다. 동시 투여의 경우, 작용제는 적절하게 하나의 조성물 또는 개별 조성물로서 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제와 조합된 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체 및 적어도 하나의 화학요법제를 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체 및 적어도 하나의 화학요법제를 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 적어도 하나의 화학요법제와 함께 투여할 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 이러한 화학요법제는 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 겜시타빈, 클라드리빈 및 유사 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 다른 백금 유도체, 예컨대 카르보플라틴 및 유사 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 화학요법제는 항-유사분열 작용제, 예컨대 탁산, 예를 들어 도세탁셀 및 파클리탁셀, 및 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 비노렐빈으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 화학요법제는 토포이소머라제 억제제, 예컨대 토포테칸 또는 이리노테칸으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 화학요법제는 세포증식억제 약물, 예컨대 에토포시드 및 테니포시드로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 화학요법제는 성장 인자 억제제, 예컨대 ErbB1 (EGFR)의 억제제 (예컨대, 이레사 (Iressa), 에르비툭스 (세툭시맙), 타르세바 및 유사 작용제), ErbB2 (Her2/neu)의 억제제 (예컨대, 헤르셉틴 및 유사 작용제) 및 유사 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 화학요법제는 티로신 키나제 억제제, 예컨대 이마티닙 (글리벡 (Glivec), 글리벡 (Gleevec) STI571), 라파티닙, PTK787/ZK222584 및 유사 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체, 및 혈관신생, 신생혈관형성 및/또는 다른 혈관형성의 적어도 하나의 억제제를 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
이러한 혈관신생 억제제의 예는 우로키나제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제 (예컨대, 마리마스타트, 네오바스타트, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 및 유사 작용제), 내피 세포 이동 및 증식의 억제제 (예컨대, TNP-470, 스쿠알라민, 2-메톡시에스트라디올, 콤브레타스타틴, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 페니실라민, SCH66336 (쉐링-플라우 코포레이션(Schering-Plough Corp), 뉴저지주 매디슨), R115777 (얀센 파마슈티카, 인크(Janssen Pharmaceutica, Inc), 뉴저지주 티츄빌) 및 유사 작용제), 혈관신생 성장 인자의 길항제 (예컨대, ZD6474, SU6668, 혈관신생제 및/또는 그의 수용체 (예컨대, VEGF, bFGF 및 안지오포이에틴-1)에 대한 항체, 탈리도미드, 탈리도미드 유사체 (예컨대, CC-5013), 수젠 5416, SU5402, 항혈관신생 리보자임 (예컨대, 안지오자임), 인터페론 α (예컨대, 인터페론 α2a), 수라민 및 유사 작용제), VEGF-R 키나제 억제제 및 다른 항-혈관신생 티로신 키나제 억제제 (예컨대, SU011248), 내피-특이적 인테그린/생존 신호전달의 억제제 (예컨대, 비탁신 및 유사 작용제), 구리 길항제/킬레이터 (예컨대, 테트라티오몰리브데이트, 캅토프릴 및 유사 작용제), 카르복시아미도-트리아졸 (CAI), ABT-627, CM101, 인터류킨-12 (IL-12), IM862, PNU145156E뿐만 아니라 혈관신생을 억제하는 뉴클레오티드 분자 (예컨대, 안티센스-VEGF-cDNA, 안지오스타틴을 코딩하는 cDNA, p53을 코딩하는 cDNA 및 결핍 VEGF 수용체-2를 코딩하는 cDNA) 및 유사 작용제이다.
혈관신생, 신생혈관형성 및/또는 다른 혈관형성의 이러한 억제제의 다른 예는 항-혈관신생 헤파린 유도체 및 관련 분자 (예를 들어, 헤파리나제 III), 테모졸로미드, NK4, 대식세포 이동 억제 인자 (MIF), 시클로옥시게나제-2 억제제, 저산소증-유도가능 인자 1의 억제제, 항-혈관신생 대두 이소플라본, 올티프라즈, 푸마길린 및 그의 유사체, 소마토스타틴 유사체, 펜토산 폴리술페이트, 테코갈란 나트륨, 달테파린, 툼스타틴, 트롬보스폰딘, NM-3, 콤브레스타틴, 칸스타틴, 아바스타틴, 다른 관련 표적에 대한 항체 (예컨대, 항-알파-v/베타-3 인테그린 및 항-키니노스타틴 mAb) 및 유사 작용제이다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 항암 면역원, 예컨대 암 항원/종양-연관 항원 (예를 들어, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM/TACSTD1), 뮤신 1 (MUC1), 암배아성 항원 (CEA), 종양-연관 당단백질 72 (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, 암-연관 바이러스 백신 (예를 들어, 인간 유두종바이러스 백신), 종양-유래 열 충격 단백질, 및 유사 작용제일 수 있다. 본원에서 다른 곳에서 기재되는 많은 다른 적합한 암 항원/종양-연관 항원 및 당업계에 공지된 유사한 분자가 또한 또는 대안적으로 이러한 실시양태에서 사용될 수 있다. 항암 면역원성 펩티드는 또한 항-이디오타입 "백신", 예컨대 BEC2 항-이디오타입 항체, 미투모맙, 세아박 및 관련 항-이디오타입 항체, MG7 항체에 대한 항-이디오타입 항체, 및 다른 항암 항-이디오타입 항체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Birebent et al., Vaccine. 21(15), 1601-12 (2003), Li et al., Chin Med J (Engl). 114(9), 962-6 (2001), Schmitt et al., Hybridoma. 13(5), 389-96 (1994), Maloney et al., Hybridoma. 4(3), 191-209 (1985), Raychardhuri et al., J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986), Pohl et al., Int J Cancer. 50(6), 958-67 (1992), Bohlen et al., Cytokines Mol Ther. 2(4), 231-8 (1996) 및 Maruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33 (2002)] 참조). 이러한 항-이디오타입 Ab는 임의로 담체에 접합될 수 있고, 상기 담체는 합성 (전형적으로 불활성) 분자 담체, 단백질 (예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) (예를 들어, [Ochi et al., Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)] 참조), 또는 세포 (예를 들어, 적혈구, 예를 들어 문헌 [Wi et al., J Immunol Methods. 122(2), 227-34 (1989)] 참조)일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 잠재적으로 암에 대한 T 세포 면역을 유도함으로써 작용하는 예르보이(Yervoy) (이필리무맙)와 같은 면역-종양학 약물과 조합된다. 면역자극 약물과 조합된 항-TF 항체 약물 접합체로의 세포감소는 유의한 임상적 이익을 환자에게 제공할 것이다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 항암 시토카인, 케모카인 또는 그의 조합일 수 있다. 적합한 시토카인 및 성장 인자의 예는 IFNγ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα (예를 들어, INFα2b), IFNβ, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스팀 및 TNFα를 포함한다. 적합한 케모카인은 Glu-Leu-Arg (ELR)-음성 케모카인, 예컨대 IP-10, MCP-3, MIG, 및 SDF-1α (인간 CXC 및 C-C 케모카인 패밀리로부터의)를 포함할 수 있다. 적합한 시토카인은 시토카인 유도체, 시토카인 변이체, 시토카인 단편 및 시토카인 융합 단백질을 포함한다. 본원에서 자연 발생 펩티드-코딩 핵산을 포함하는 이들 및 다른 방법 또는 용도는 대안적으로 또는 추가로 US 5,968,502, US 6,063,630 및 US 6,187,305 및 EP 0505500에 기재된 바와 같은 "유전자 활성화" 및 상동성 재조합 유전자 상향조절 기술에 의해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 세포 주기 제어/아폽토시스 조절제 (또는 "조절 작용제")일 수 있다. 세포 주기 제어/아폽토시스 조절제는 세포 주기 제어/아폽토시스 조절제, 예컨대 (i) cdc-25 (예컨대, NSC 663284), (ii) 세포 주기를 과다자극하는 시클린-의존성 키나제 (예컨대, 플라보피리돌 (L868275, HMR1275), 7-히드록시스타우로스포린 (UCN-01, KW-2401), 및 로스코비틴 (R-로스코비틴, CYC202)), 및 (iii) 텔로머라제 조정제 (예컨대, BIBR1532, SOT-095, GRN163, 및 예를 들어 US 6,440,735 및 US 6,713,055에 기재된 조성물)을 표적화 및 조정하는 분자를 포함할 수 있다. 아폽토시스 경로를 방해하는 분자의 비-제한적 예는 TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL)/아폽토시스-2 리간드 (Apo-2L), TRAIL 수용체를 활성화하는 항체, IFN 및 안티센스 Bcl-2를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 호르몬 조절제, 예컨대 항-안드로겐 및 항-에스트로겐 요법에 유용한 작용제일 수 있다. 이러한 호르몬 조절제의 예는 타목시펜, 이독시펜, 풀베스트란트, 드롤록시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 디에틸스틸베스트롤, 에티닐 에스트라디올/에스티닐, 항안드로겐 (예컨대, 플루타디드/유렉신), 프로게스틴 (예컨대, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론/프로베라, 메게스트롤 아세페이트/메게이스), 아드레노코르티코스테로이드 (예컨대, 히드로코르티손, 프레드니손), 황체화 호르몬-방출 호르몬 (및 그의 유사체 및 다른 LHRH 효능제, 예컨대 부세렐린 및 고세렐린), 아로마타제 억제제 (예컨대, 아나스트라졸/아리미덱스, 아미노글루테티미드/시타드렌, 엑세메스탄), 호르몬 억제제 (예컨대, 옥트레오티드/산도스타틴) 및 유사 작용제이다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 항-무력화 작용제 (예를 들어, 종양 및 암 항원에 대한 허용성을 파괴하는 소분자 화합물, 단백질, 당단백질, 또는 항체)일 수 있다. 이러한 화합물의 예는 CTLA-4의 활성을 차단하는 분자, 예컨대 MDX-010/예르보이 (이필리무맙)이며 (문헌 [Phan et al., PNAS USA 100, 8372 (2003)]), 이는 잠재적으로 암에 대한 T 세포 면역을 유도함으로써 작용한다. 면역자극 약물과 조합된 항-TF 항체 약물 접합체로의 세포감소는 유의한 임상적 이익을 환자에게 제공할 것이다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위한 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 종양 억제인자 유전자-함유 핵산 또는 벡터, 예컨대 인간 재조합 야생형 p53/SCH58500을 코딩하는 복제-결여 아데노바이러스 등; 종양유전자, 돌연변이된, 또는 탈조절된 유전자에 표적화된 안티센스 핵산; 또는 돌연변이된 또는 탈조절된 유전자에 표적화된 siRNA일 수 있다. 종양 억제인자 표적의 예는, 예를 들어 BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1 및 DCC를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위한 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 항암 핵산, 예컨대 게나센스 (오그메로센/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (리포솜 캡슐화된 c-raf 안티센스 올리고뉴클레오티드/ISIS-5132), MG98, 및 PKCα, 클러스테린, IGFBP, 단백질 키나제 A, 시클린 D1 또는 Bcl-2h를 표적화하는 다른 안티센스 핵산일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위한 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 항암 억제 RNA 분자일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lin et al., Curr Cancer Drug Targets. 1(3), 241-7 (2001), Erratum in: Curr Cancer Drug Targets. 3(3), 237 (2003), Lima et al., Cancer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004), Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004), Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl), S144 (2003), Yang et al., Oncogene. 22(36), 5694-701 (2003) 및 Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)] 참조).
본 발명의 조성물 및 조합 투여 방법은 또한 핵산 백신, 예를 들어 이러한 암 항원/종양-연관 항원을 코딩하는 네이키드 DNA 백신의 투여를 포함한다 (예를 들어, US 5,589,466, US 5,593,972, US 5,703,057, US 5,879,687, US 6,235,523, 및 US 6,387,888 참조). 한 실시양태에서, 조합 투여 방법 및/또는 조합 조성물은 자가 백신 조성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 조합 조성물 및/또는 조합 투여 방법은 전체 세포 백신 또는 시토카인-발현 세포 (예를 들어, 재조합 IL-2 발현 섬유모세포, 재조합 시토카인-발현 수지상 세포 등)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003), Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) 및 Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002)] 참조). 본 발명의 조합 방법에서 유용할 수 있는 이러한 자가 세포 접근법의 또 다른 예는 마이박스 (MyVax)® 맞춤형 면역요법 방법 (이전에 GTOP-99로 언급됨) (제니토프 코포레이션(Genitope Corporation), 미국 캘리포니아주 레드우드 시티)이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체가 바이러스, 바이러스 단백질 등과 조합되거나 공동-투여되는 조합 조성물 및 조합 투여 방법을 제공한다. 일반적으로 생체내에서 1회 또는 단지 수 라운드의 복제만 할 수 있고 종양 세포에 표적화되는 복제-결여 바이러스가 예를 들어 이러한 조성물 및 방법의 유용한 성분일 수 있다. 이러한 바이러스 작용제는 면역자극제, 예컨대 GM-CSF 및/또는 IL-2를 코딩하는 핵산을 포함하거나 그와 회합될 수 있다. 천연 종양세포용해성 및 이러한 재조합 종양세포용해성 바이러스 (예를 들어, HSV-1 바이러스, 레오바이러스, 복제-결여 및 복제-감수성 아데노바이러스 등)가 이러한 방법 및 조성물의 유용한 성분일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 항-TF 항체 약물 접합체가 종양세포용해성 바이러스와 조합되거나 공동-투여되는 조합 조성물 및 조합 투여 방법을 제공한다. 이러한 바이러스의 예는 종양세포용해성 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함하고, 변형 바이러스일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Shah et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003), Stiles et al., Surgery. 134(2), 357-64 (2003), Sunarmura et al., Pancreas. 28(3), 326-9 (2004), Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004), Varghese et al., Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), Wildner et al., Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004) 및 Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001)] 참조).
본 발명의 조합 조성물 및 조합 투여 방법은 또한 "전세포" 및 "채택" 면역요법 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 면역계 세포 (예를 들어, 종양-침윤 림프구 (TIL), 예컨대 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 (예를 들어, 종양-특이적 항원 및/또는 유전자 증진으로 확장시킨 T 세포), 항체-발현 B 세포 또는 다른 항체 생산/제시 세포, 수지상 세포 (DC) (예를 들어, 항-시토카인 발현 재조합 수지상 세포, DC-확장제, 예컨대 GM-CSF 및/또는 Flt3-L과 함께 배양된 수지상 세포, 및/또는 종양-연관 항원-로딩된 수지상 세포), 항-종양 NK 세포, 소위 하이브리드 세포, 또는 그의 조합물의 주입 또는 재-주입을 포함할 수 있다. 세포 용해물이 또한 이러한 방법 및 조성물에서 유용할 수 있다. 이러한 측면에서 유용할 수 있는 임상 시험에서 세포성 "백신"은 캔백신(Canvaxin)TM, APC-8015 (덴드레온(Dendreon)), HSPPC-96(안티제닉스 (Antigenics)), 및 멜라신(Melacine)® 세포 용해물을 포함한다. 임의로 명반과 같은 아주반트와 혼합된, 암세포로부터 흘러나온 항원 및 그의 혼합물 (예를 들어, 문헌 [Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, July 2001] 참조)이 또한 이러한 방법 및 조합 조성물 내의 성분일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체는 내부 백신접종 방법의 적용과 조합되어 환자에게 전달될 수 있다. 내부 백신접종은 전형적으로 (i) 전체로서 종양 세포 또는 (ii) (a) 분비된 단백질, 당단백질 또는 다른 생성물, (b) 막-연관 단백질 또는 당단백질 또는 막과 회합되거나 막 내에 삽입된 다른 성분, 및/또는 (c) 세포내 단백질 또는 다른 세포내 성분을 포함하는 종양 세포의 일부를 향해 작용하는 면역 반응을 유발시키는, 환자에서 유도된 종양 또는 암 세포 사멸, 예를 들어 종양 세포의 약물-유도된 또는 방사선-유도된 세포 사멸을 나타낸다. 내부 백신접종-유도된 면역 반응은 체액성 (즉, 항체-보체 매개성) 또는 세포-매개성 (예를 들어, 내부에서 치사시킨 종양 세포 또는 그의 일부를 인식하는 내인성 세포독성 T 림프구의 발달 및/또는 증가)일 수 있다. 방사선요법뿐만 아니라, 상기 종양 세포-사멸 및 내부 백신접종을 유도하기 위해 사용될 수 있는 약물 및 작용제의 비제한적인 예는 통상적인 화학요법제, 세포-주기 억제제, 항-혈관신생 약물, 모노클로날 항체, 아폽토시스-유도제 및 신호 전달 억제제이다.
상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 다른 항암제의 예는 분화 유도 작용제, 레티노산 유사체 (예컨대, 모든 트랜스 레티노산, 13-시스 레티노산 및 유사 작용제), 비타민 D 유사체 (예컨대, 세오칼시톨 및 유사 작용제); ErbB3, ErbB4, IGF-IR, 인슐린 수용체, PDGFRa, PDGFR베타, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7의 억제제 및 유사 작용제이다.
상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 다른 항암제의 예는 카텝신 B, 카텝신 D 데히드로게나제 활성의 조절제, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (예컨대, 글루타실시스테인 신테타제 및 락테이트 데히드로게나제), 및 유사 작용제이다.
상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 다른 항암제의 예는 에스트라무스틴 및 에피루비신이다.
상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 다른 항암제의 예는 HSP90 억제제 유사 17-알릴 아미노 겔다나마이신, 종양 항원, 예컨대 PSA, CA125, KSA 등에 대해 지시된 항체, 인테그린 유사 인테그린 β1, VCAM의 억제제 및 유사 작용제이다.
상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 다른 항암제의 예는 칼시뉴린-억제제 (예컨대, 발스포다르, PSC 833 및 다른 MDR-1 또는 p-당단백질 억제제), TOR-억제제 (예컨대, 시롤리무스, 에베롤리무스 및 라파마이신) 및 "림프구 귀소" 메카니즘의 억제제 (예컨대, FTY720), 및 세포 신호전달에 대해 효과가 있는 작용제, 예컨대 부착 분자 억제제 (예를 들어, 항-LFA 등)이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 하나 이상의 다른 치료 항체, 예컨대 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)®), 잘루투무맙, 세툭시맙 (에르비툭스(Erbitux)®), 파니투무맙 (벡티빅스(Vectibix)TM), 오파투무맙 (아르제라(Arzerra)®), 자놀리무맙, 다라투무맙 (HuMax-CD38), 라니비주맙 (루센티스(Lucentis)®), 다클리주맙 (제나팍스(Zenapax)®), 바실릭시맙 (시뮬렉트(Simulect)®), 인플릭시맙 (레미케이드(Remicade)®), 아달리무맙 (휴미라(Humira)®), 나탈리주맙 (티사브리(Tysabri)®), 오말리주맙 (졸레어(Xolair)®), 에팔리주맙 (렙티바(Raptiva)®), 니모투주맙, 리툭시맙 (리툭산 (Rituxan)®/마브테라(MabThera)®) 및/또는 트라스투주맙 (헤르셉틴®)과의 조합에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용될 수 있는 다른 치료 항체는 WO98/40408 (천연 인간 TF에 결합할 수 있는 항체), WO04/094475 (정상 혈장 대조군과 비교하여 인자 매개 혈액 응고를 억제하지 않는, 인간 조직 인자에 결합하는 있는 항체), WO03/093422 (TF 단독보다 큰 친화도로 TF:VIIa 복합체에 결합하는 항체), WO03/037361 (아폽토시스와 관련된 치료를 위한 TF 효능제 또는 길항제) 또는 WO 2010/066803 (조직 인자에 대한 인간 모노클로날 항체)에 개시된 것이다.
한 실시양태에서, 항-TF 항체 약물 접합체는 종양의 내부에 항-TF 항체 약물 접합체 또는 조합 조성물의 접근을 촉진하는 하나 이상의 작용제의 전달과 함께 투여될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 종양을 이완시킬 수 있는 (예를 들어, US 6,719,977 참조) 렐락신의 전달과 연관하여 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체는 세포 투과 펩티드 (CPP)에 결합될 수 있다. 세포 투과 펩티드 및 관련 펩티드 (예컨대, 조작되 세포 투과 항체)는 예를 들어 문헌 [Zhao et al., J Immunol Methods. 254(1-2), 137-45 (2001), Hong et al., Cancer Res. 60(23), 6551-6 (2000), Lindgren et al., Biochem J. 377(Pt 1), 69-76 (2004), Buerger et al., J Cancer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75 (2003), Pooga et al., FASEB J. 12(1), 67-77 (1998) 및 Tseng et al., Mol Pharmacol. 62(4), 864-72 (2002)]에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체 및 적어도 하나의 화학요법제를 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 이러한 항-염증성 작용제는 아스피린 및 다른 살리실레이트, Cox-2 억제제 (예컨대, 로페콕시브 및 세레콕시브), NSAID (예컨대, 이부프로펜, 페노프로펜, 나프록센, 술린닥, 디클로페낙, 피록시캄, 케토프로펜, 디플루니살, 나부메톤, 에토돌락, 옥사프로진 및 인도메타신), 항-IL6R 항체, 항-IL8 항체 (예를 들어, WO2004058797에 기재된 항체, 예를 들어 10F8), 항-IL15 항체 (예를 들어, WO03017935 및 WO2004076620에 기재된 항체), 항-IL15R 항체, 항-CD4 항체 (예를 들어, 자놀리무맙), 항-CD11a 항체 (예를 들어, 에팔리주맙), 항-알파-4/베타-1 인테그린 (VLA4) 항체 (예를 들어, 나탈리주맙), 염증성 질환의 치료를 위한 CTLA4-Ig, 프레드니솔론, 프레드니손, 질환 변형 항류마티스 약물 (DMARD), 예컨대 메토트렉세이트, 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 피리미딘 합성 억제제 (예컨대, 레플루노미드), IL-1 수용체 차단제 (예컨대, 아나킨라), TNF-α 차단제 (예컨대, 에타네르셉트, 인플릭시맙 및 아달리무맙) 및 유사 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체 및 적어도 하나의 면역억제제 및/또는 면역조절제를 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 이러한 면역억제제 및/또는 면역조절제는 시클로스포린, 아자티오프린, 미코페놀산, 미코페놀레이트 모페틸, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 메토트렉세이트, 금 염, 술파살라진, 항말라리아제, 브레퀴나르, 레플루노미드, 미조리빈, 15-데옥시스페르구알린, 6-메르캅토퓨린, 시클로포스파미드, 라파마이신, 타크롤리무스 (FK-506), OKT3, 항-흉선세포 글로불린, 티모펜틴, 티모신-α 및 유사 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 면역억제제 및/또는 면역조절제는 면역억제 항체, 예컨대 IL-2 수용체의 p75에 결합하는 항체, CD25에 대한 항체 (예를 들어, WO2004045512에 기재된 것, 예컨대 AB1, AB7, AB11 및 AB12), 또는 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNγR, TNFαR 또는 TNFR (2개의 서브유닛: CD120a 및 CD120b로 이루어짐), IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-10R, CD11a, 또는 CD58에 결합하는 항체, 또는 그의 리간드에 결합하는 항체로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 면역억제제 및/또는 면역조절제는 가용성 IL-15R, IL-10R, B7 분자 (B7-1, B7-2, 그의 변이체 및 그의 단편), ICOS, 및 OX40, 음성 T 세포 조절제의 억제제 (예컨대, CTLA4에 대한 항체) 및 유사 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체 및 항-C3b(i) 항체를 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 항-TF 항체 약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 히스톤 데아세틸라제 억제제 (예를 들어, 페닐부티레이트) 및/또는 DNA 복구 작용제 (예를 들어, DNA 복구 효소 및 관련 조성물, 예컨대 디메리신)로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 작용제 중 임의의 것과의 조합 요법에 사용하기 위한 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-011-vcMMAE이다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 작용제 중 임의의 것과의 조합 요법에 사용하기 위한 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-098-vcMMAE이다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 작용제 중 임의의 것과의 조합 요법에 사용하기 위한 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-111-vcMMAE이다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 작용제 중 임의의 것과의 조합 요법에 사용하기 위한 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-114-vcMMAE이다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 작용제 중 임의의 것과의 조합 요법에 사용하기 위한 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-011-mcMMAF이다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 작용제 중 임의의 것과의 조합 요법에 사용하기 위한 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-098-mcMMAF이다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 작용제 중 임의의 것과의 조합 요법에 사용하기 위한 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-111-mcMMAF이다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 작용제 중 임의의 것과의 조합 요법에 사용하기 위한 항-TF 항체 약물 접합체는 HuMab-TF-114-mcMMAF이다.
치료 유효량의 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체의 투여를 포함하는 상기 기재된 바와 같은 장애의 치료를 위한 본 발명의 방법은 또한 항암 지향 광역학 요법 (예를 들어, 항암 레이저 요법 (이는 임의로 광증감제의 사용과 함께 실시될 수 있음), 예를 들어 문헌 [Zhang et al., J Control Release. 93(2), 141-50 (2003)] 참조), 항암 음파 및 충격파 요법 (예를 들어, 문헌 [Kambe et al., Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997)] 참조), 및/또는 항암 영양 요법 (예를 들어, 문헌 [Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34(1), 249-69, viii (2004) 및 Rafi, Nutrition. 20(1), 78-82 (2004)] 참조)을 포함할 수 있다. 유사하게, 항-TF 항체 약물 접합체는 항암 지향 광역학 요법 (예를 들어, 항암 레이저 요법 (이는 임의로 광증감제의 사용과 함께 실시될 수 있음), 항암 음파 및 충격파 요법, 및/또는 항암 영양 요법과 함께 투여될, 상기 기재된 바와 같은 장애 치료용 제약 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 항-TF 항체 약물 접합체, 예컨대 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체, 및 방사선요법을 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 TF를 발현하는 세포에 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체 및 방사선요법을 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 방사선요법과 조합하여 투여할, 암 치료용 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체의 용도를 제공한다.
방사선요법은 방사선 조사 또는 환자에의 방사선제약의 투여를 포함한다. 방사선 공급원은 치료받는 환자의 외부 또는 내부에 존재할 수 있다 (방사선 치료는, 예를 들어 체외 빔 방사선 요법 (EBRT) 또는 근접요법 (BT) 형태일 수 있음). 이러한 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 방사성 원소는, 예를 들어 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 아이오다이드-123, 아이오다이드-131 및 인듐-111을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체를 수술과 조합하여 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 제약 조성물은 조합 요법으로, 즉, 치료할 질환 또는 상태와 관련된 하나 이상의 작용제와 조합하여, 개별 제약 조성물로서 또는 본 발명의 화합물을 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-제제화하여 투여될 수 있다. 이러한 조합 요법은 본 발명의 화합물 및/또는 공동-투여된 작용제의 보다 적은 투여량을 요구할 수 있고, 따라서 다양한 단독요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
상기한 것뿐만 아니라, 다른 적절한 조합 요법은 다음을 포함한다:
ㆍ 췌장암의 치료를 위해, 항대사물, 예컨대 5-플루오로우라실 및/또는 겜시타빈과 조합된, 가능하게는 90Y-hPAM4, ARC-100, ARQ-197, AZD-6244, 바르독솔론 메틸, 식수투무맙, (IMC-A12), 폴리틱소린 칼슘, GVAX, 이필리무맙, KRX-0601, 메르바론, MGCD-0103, MORAb-009, PX-12, Rh-Apo2L, TLN-4601, 트라베데르센, 볼로식시맙 (M200), WX-671, 페메트렉세드, 루비테칸, 익사베필론, OCX-0191Vion, 216586-46-8, 라파티닙, 마투주맙, 이마티닙, 소라페닙, 트라스투주맙, 익사베필론, 에를로티닙, 아바스틴 및 세툭시맙으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 조합된 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체
ㆍ 결장직장암의 치료를 위해, 겜시타빈, 베바시주맙, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, IFL, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 5-FU/LV, 카페시타빈, UFT, EGFR-표적화제, 예컨대 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙, 잘루투무맙; VEGF 억제제, 또는 티로신 키나제 억제제, 예컨대 수니티닙으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 조합된 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체.
ㆍ 유방암의 치료를 위해, 항대사물, 안트라시클린, 탁산, 알킬화제, 에포틸론 항호르몬제 (페마르, 타목시펜 등), ErbB2 (Her2/neu)의 억제제 (예컨대, 헤르셉틴 및 유사 작용제), CAF/FAC (시클로포스파미드, 독소루비신, 5FU) AC (시클로, 독소), CMF (시클로, 메토트렉세이트, 5FU), 도세탁셀 + 카페시타빈, GT (파클리탁셀, 겜시타빈) FEC (시클로, 에피, 5FU) (헤르셉틴과 조합됨): 파클리탁셀 +/- 카르보플라틴, 비노렐빈, 도세탁셀, 라파티닙과 조합된 CT; 카페시타빈으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 조합된 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체.
ㆍ 방광의 치료를 위해, 항대사물 (겜시타빈, 알림타, 메토트렉세이트), 백금 유사체 (시스플라틴, 카르보플라틴), EGFr 억제제 (예컨대, 세툭시맙 또는 잘루투무맙), VEGF 억제제 (예컨대, 아바스틴) 독소루비신, 티로신 키나제 억제제, 예컨대 게피티닙, 트라스투주맙, 항-유사분열 작용제, 예컨대 탁산, 예를 들어 파클리탁셀, 및 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈블라스틴으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 조합된 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체.
ㆍ 전립선암의 치료를 위해, 호르몬/항호르몬 요법; 예컨대 항안드로겐, 황체화 호르몬 방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 및 화학요법제, 예컨대 탁산, 미톡산트론, 에스트라무스틴, 5FU, 빈블라스틴, 익사베필론으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 조합된 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체.
ㆍ 난소암의 치료를 위해, 항-유사분열 작용제, 예컨대 탁산, 및 빈카 알칼로이드, 케릭스, 토포테칸으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 조합된 본 발명에 따른 항-TF 항체 약물 접합체.
진단 용도
본 발명의 항-TF 항체는 또한 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항-TF 항체는 한 실시양태에서 약물 대신 검출제 또는 표지에 접합되어 진단 용도에 적합하게 될 수 있다. 한 실시양태에서 항-TF 항체 또는 검출제에 접합된 항-TF 항체의 진단 용도는, 본 발명의 다른 방법 중 하나, 특히 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체의 제약 용도와 조합되어 사용될 수 있다. 검출제에 접합된 항-TF 항체는 일부 경우에 TF에의 항-TF 항체의 결합의 직접적인 검출을 허용할 수 있고, "검출제" 또는 "표지"의 예는 하기에 주어져 있으며, 하기에서 "항-TF 항체"에 대한 언급은 적절한 경우에 또한 "검출제 또는 표지에 접합된 항-TF 항체"에 대한 언급을 포함할 수 있다. 용어 "진단 용도"는 또한 치료를 위한 환자를 선택하는 것과 관련하여 예를 들어 혈장, 소변에서의 TF의 수준 또는 생검에서 TF의 발현 수준을 측정하는 것 또는 상기 기재된 바와 같은 치료의 효능을 측정하는 것을 포함하며, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 치료를 위한 환자를 선택하기 위한, 예를 들어 방사성표지된 항-TF 항체의 용도를 포함한다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 항-TF 항체를 포함하는 진단 조성물에 관한 것이고, 여기서 진단 조성물은 특정한 실시양태에서 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체와 조합되어 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-TF 항체는 TF의 수준, 또는 그의 막 표면 상에 TF를 함유하는 세포의 수준을 검출함으로써, TF를 발현하는 세포가 발병기전에서 능동적인 역할을 하는 질환을 진단하기 위해 생체내에서 또는 시험관내에서 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 시험할 샘플을 임의로 대조군 샘플과 함께 항-TF 항체와, 항-TF 항체와 TF 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 이어서, 복합체 형성을 (예를 들어, ELISA를 이용하여) 검출한다. 대조 샘플을 시험 샘플과 함께 사용할 때, 복합체는 샘플 둘 다에서 검출되고, 샘플 사이에서 복합체 형성의 임의의 통계상 유의한 차이는 시험 샘플 내의 TF의 존재를 표시한다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명의 항-TF 항체는 또한
- 본 발명의 항-TF 항체 또는 본 발명의 이중특이적 분자를 항체와 TF 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 샘플과 접촉시키는 것; 및
- 복합체가 형성되었는지 여부를 분석하는 것
을 포함하는, 샘플에서 TF 항원 또는 TF를 발현하는 세포의 존재를 검출하는 방법에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 방법은 시험관내에서 수행된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 항-TF 항체는 또한 침습성 세포 및 조직, 및 본 발명의 항-TF 항체에 의해 표적화된 다른 세포의 확인 및 진단을 위한, 및 치유적 치료의 진행, 치료 후의 상태, 암의 발병 위험, 암 진행 등의 모니터링을 위한 방법에 사용될 수 있다.
이러한 진단 검정의 한 예에서, 본 발명의 항-TF 항체는 조직에서 침습성 세포의 수준을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 항-TF 항체와 잠재적인 TF-함유 조직 사이에 면역복합체를 형성하는 것, 및 면역복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 면역복합체의 형성은 조직에서 침습성 세포의 존재와 관련이 있다. 접촉은 표지된 단리된 항체 및 표준 영상화 기술을 이용하여 생체내에서 수행할 수 있거나, 조직 샘플 상에서 시험관내에서 수행할 수 있다.
본 발명의 항-TF 항체는 또한 임의의 적합한 기술에 의해 임의의 적합한 생물학적 샘플 내에서 TF-함유 펩티드 및 펩티드 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 통상적인 면역검정의 예는 비제한적으로 항-TF 항체를 사용하는 ELISA, RIA, FACS 검정, 플라즈몬 공명 검정, 크로마토그래피 검정, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 및/또는 면역침전을 포함한다. 본 발명의 항-TF 항체는 인간으로부터 TF 및 TF-단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술에서 사용되는 항-TF 항체 및/또는 2차 항체에 대한 적합한 표지는 비제한적으로 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 및 3H를 포함한다.
항-TF 항체는 또한 검출가능한 물질로 표지된 TF 펩티드 표준물 및 비표지된 항-TF 항체를 사용하는 경쟁 면역검정에 의해 생물학적 샘플 내에서 검정될 수 있다. 이러한 검정에서, 생물학적 샘플, 표지된 TF 펩티드 표준물(들) 및 항-TF 항체는 조합되고, 비표지된 항-TF 항체에 결합된 표지된 TF 표준물의 양이 결정된다. 생물학적 샘플 내의 TF 펩티드의 양은 항-TF 항체에 결합된 표지된 TF 표준물의 양에 반비례한다.
항-TF 항체는 종양의 생체내 영상화에서 특히 유용하다. TF와 연관된 종양의 생체내 영상화는 임의의 적합한 기술에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 종양 내의 항-TF 항체 또는 종양으로부터 2차 표지된 (예를 들어, FITC 표지된) 항-TF 항체:TF 복합체를 표지하기 위해 99Tc-표지화 또는 또 다른 감마선 방출 동위원소를 사용한 표지화가 이용되고, 전형적으로 저-에너지 고해상도 시준기 또는 저-에너지 다목적 시준기를 사용하여 감마 섬광 카메라 (예를 들어, 엘신트 아펙스(Elscint Apex) 409ECT 장치)로 영상화할 수 있다. 이어서, 염색된 조직을 종양 내의 TF-연관 펩티드의 양의 표시자로서 방사능 계수에 대해 평가할 수 있다. 이러한 기술을 사용하여 얻어진 영상은 예를 들어 침습성 암 세포의 존재에 대한 바이오마커로서 TF 또는 TF-단편의 사용과 관련하여 환자, 포유동물, 또는 조직 내에서 TF의 생체분포를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 상기 기술에 대한 변동은 감마 카메라 기술과 비교하여 영상화를 개선하기 위해 자기 공명 영상화 (MRI)의 사용을 포함할 수 있다. 유사한 면역섬광조영술 방법 및 원리는 예를 들어 문헌 [Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al., (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), 및 Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (eds.) (Chapman & Hall 1993)]에 기재되어 있다. 이러한 영상은 또한 다른 항암제의 표적화 전달을 위해 사용될 수 있고, 그 예는 본원에 기재된다 (예를 들어, 아폽토시스성 작용제, 독소, 또는 CHOP 화학요법 조성물). 또한, 이러한 영상은 또한 또는 대안적으로 종양을 제거하기 위한 수술 기술에 대한 기초로서 역할을 할 수 있다. 또한, 이러한 생체내 영상화 기술은 환자가 종양이 있는 것으로 확인되지만 (다른 바이오마커, 전이 등의 존재로 인한), 종래의 분석 기술에 의해 종양이 확인될 수 없는 상황에서 종양의 확인 및 위치 결정을 허용할 수 있다. 모든 이러한 방법은 본 발명의 특징이고, 이러한 방법은 특히 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체로의 환자의 치료와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 생체내 영상화 및 다른 진단 방법은 인간 환자 (예를 들어, 이전에 암으로 진단되지 않은 환자 또는 암으로부터 회복/완화 기간의 환자)에서 미세전이의 검출에서 특히 유용하다. 예를 들어, 모든 암 세포의 90%까지 구성할 수 있는 암종 암 세포는 항-TF 항체 조성물로 매우 잘 염색되는 것으로 입증되었다. 본원에 기재된 모노클로날 항-TF 항체를 사용한 검출은 공격성/침습성인 암종의 존재를 표시할 수 있고, 또한 또는 대안적으로 이러한 미세전이에 대한 관련 모노클로날 항-TF 항체 사용의 실행성에 대한 지표를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-TF 항체는 생체내 영상화 방법에 사용될 수 있고, 여기서 본 발명의 항-TF 항체는 검출-촉진 방사선-비투과 작용제에 접합되고, 접합 항체는 예컨대 혈류 내로의 주사에 의해 숙주에 투여되고, 숙주 내의 표지된 항체의 존재 및 위치가 검정된다. 이러한 기술 및 본원에 제공되는 임의의 다른 진단 방법을 통해, 본 발명의 항-TF 항체는 인간 환자 또는 인간 환자로부터 채취한 생물학적 샘플에서 질환-관련 세포의 존재를 스크리닝하는 방법에 사용될 수 있다.
진단 영상화를 위해, 방사성동위원소는 직접적으로 또는 중간 관능기를 사용함으로써 간접적으로 항-TF 항체에 결합될 수 있다. 유용한 중간 관능기는 킬레이터, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산을 포함한다 (예를 들어, US 5,057,313 참조).
방사성동위원소 및 방사선-비투과 작용제뿐만 아니라, 진단 방법은 염료 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘 복합체 사용), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 자기 공명 영상화 (MRI)를 위한 증진제 (예를 들어, 상자성 이온)에 접합된 항-TF 항체를 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,331,175 참조, MRI 기술 및 MRI 증진제에 접합된 항체의 제조를 기재함). 상기 진단/검출제는 자기 공명 영상화에 사용하기 위한 작용제, 및 형광 화합물 중에서 선택될 수 있다. 항-TF 항체를 방사성 금속 또는 상자성 이온으로 로딩하기 위해, 이를 이온에 결합하기 위한 다수의 킬레이트화 기가 부착되는 긴 꼬리를 갖는 시약과 반응시키는 것이 필요할 수 있다. 이러한 꼬리는 중합체, 예컨대 폴리리신, 폴리사카라이드, 또는 펜던트 기 (여기에 킬레이트화 기, 예컨대 예를 들어, 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스티오세미카르바존, 폴리옥심 및 상기 목적에 유용한 것으로 공지된 유사한 기가 결합할 수 있음)를 갖는 다른 유도체화된 또는 유도체화가능한 쇄일 수 있다. 킬레이트는 표준 화학을 이용하여 항-TF 항체에 커플링될 수 있다.
따라서, 본 발명은 진단적 항-TF 항체 접합체를 제공하고, 여기서 항-TF 항체는 조영제 (예컨대, 자기 공명 영상화, 전산화 단층촬영을 위한, 또는 초음파 조영 증강제) 또는 방사성 핵종 (예를 들어, 감마-, 베타-, 알파-, 오거(Auger) 전자-, 또는 양전자-방출 동위원소일 수 있음)에 접합된다.
추가 측면에서, 본 발명은
- 본 발명의 항-TF 항체 또는 본 발명의 이중특이적 분자; 및
- 키트의 사용 지침서 (여기서, 키트는 특히 또한 본 발명의 검출제 또는 조영제에 접합된 항-TF 항체를 함유함)
를 포함하는 샘플에서, TF 항원 또는 TF를 발현하는 세포의 존재를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-TF 항체는 또한 항-TF 항체 및 TF 펩티드에의 항-TF 항체의 결합을 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 용기를 포함하는, 암의 진단을 위한 키트에 사용될 수 있다. 이러한 키트는 특히 본 발명의 항-TF 항체 약물 접합체를 추가로 포함할 수 있다. 시약은 예를 들어, 형광 태그, 효소적 태그, 또는 다른 검출가능한 태그를 포함할 수 있다. 시약은 효소적 반응을 위한 2차 또는 3차 항체 또는 시약을 또한 포함할 수 있고, 여기서 효소적 반응은 시각화될 수 있는 생성물을 생산한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 적합한 용기(들) 내에 표지된 또는 비표지된 형태의 본 발명의 하나 이상의 항-TF 항체, 간접적 검정을 위한 인큐베이션을 위한 시약, 및 표지의 특성에 따라 이러한 검정에서 검출을 위한 기질 또는 유도체화제를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 대조 시약(들) 및 사용 지침서가 또한 포함될 수 있다.
진단 키트는 또한 세포 활성의 검출을 위해 또는 조직 샘플 또는 숙주 내에서 TF 펩티드의 존재를 검출하기 위해 항-TF 항체, 예를 들어 접합된/표지된 항-TF 항체와 함께 사용하기 위해 공급될 수 있다. 이러한 진단 키트에서뿐만 아니라 본원에서 다른 곳에서 기재되는 치료 용도를 위한 키트에서, 항-TF 항체는 전형적으로 단독으로 또는 표적 세포 또는 펩티드에 특이적인 추가의 항체와 조합되어 용기 내에 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 제약상 허용되는 담체 (예를 들어, 불활성 희석제) 및/또는 그의 성분, 예를 들어 트리스, 포스페이트 또는 카르보네이트 완충제, 안정화제, 보존제, 살생물제, 살생물제, 불활성 단백질, 예를 들어 혈청 알부민 등 (전형적으로 혼합을 위해 개별 용기 내에) 및 추가의 시약 (또한 전형적으로 개별 용기(들) 내에)이 또한 포함된다. 특정 키트에서, 항-TF 항체 (전형적으로 개별 용기 내에 존재)에 결합할 수 있는 2차 항체가 또한 포함된다. 제2 항체는 전형적으로 표지에 접합되고 본 발명의 항-TF 항체와 유사한 방식으로 제제화된다. 상기 및 본원의 다른 곳에 기재된 방법을 이용하여, 항-TF 항체는 암/종양 세포의 하위세트를 정의하고 이러한 세포 및 관련 조직/성장을 특성화하기 위해 사용될 수 있다.
계내 검출은 환자로부터 조직학적 시편을 제거하고, 본 발명의 표지된 항-TF 항체의 조합물 (검출제에 접합된 항-TF 항체)을 이러한 시편에 제공함으로써 달성할 수 있다. 본 발명의 항-TF 항체는 본 발명의 표지된 항-TF 항체를 생물학적 샘플에 적용함으로써 또는 도포함으로써 제공될 수 있다. 이러한 절차를 사용함으로써, TF 또는 TF-단편의 존재뿐만 아니라 검사된 조직 내에 이러한 펩티드의 분포를 결정하는 것 (예를 들어, 암세포의 확산의 평가와 관련하여)이 가능하다. 본 발명을 이용하여, 당업자는 임의의 매우 다양한 조직학적 방법 (예컨대, 염색 절차)이 이러한 계내 검출을 달성하기 위해 변형될 수 있음을 용이하게 알 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 추가의 제한으로 간주되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1
조직 인자 (TF)에 대한 발현 구축물
HEK, NS0 또는 CHO 세포에서 TF 또는 그의 세포외 도메인의 발현을 위한 완전히 코돈-최적화된 구축물을 생성하였다. 이들 구축물에 의해 코딩되는 단백질은 TF에 대한 진뱅크 등록 번호 NP_001984와 동일하다. 구축물은 클로닝을 위한 적합한 제한 부위 및 최적 코작(Kozak) 서열 (문헌 [Kozak, 1987])를 함유하였다. 구축물을 포유동물 발현 벡터 pEE13.4 (론자 바이올로직스(Lonza Biologics))에 클로닝시켜 (문헌 [Bebbington, Renner et al. 1992]), pEE13.4TF를 얻었다. PCR을 이용하여, 6개의 His 잔기를 함유하는 C-말단 His 태그 (TFECDHis)를 첨가한 TF의 세포외 도메인 (ECD) (아미노산 1-251)을 코딩하는 부분을 합성 구축물로부터 증폭시켰다. 구축물을 pEE13.4에 클로닝하고, 완전히 서열 결정하여 구축물의 정확성을 확인하였다.
실시예 2
HEK-293F 세포에서의 일시적인 발현
프리스타일 (Freestyle)TM 293-F (현탁 성장 및 화학적으로 정의된 프리스타일 배지에 적합한 HEK-293 서브클론 (HEK-293F)) 세포를 인비트로젠으로부터 수득하고, 제업체의 지침에 따라 293펙틴 (인비트로젠)을 이용하여 적절한 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 항체 발현의 경우에, 실시예 10에 기재된 바와 같은 적절한 중쇄 및 경쇄 벡터를 공발현시켰다.
실시예 3
NS0 세포에서의 반-안정한 발현
pEE13.4TF를 NS0 세포 내에 안정하게 형질감염시키고, 안정한 클론을 글루타민의 부재 하에 및 7.5 μM의 메틸술폭시민 (MSX)의 존재 하에 성장에 대해 선택하였다. 클론의 풀을 선택 압력을 유지하면서 현탁 배양에서 성장시켰다. 풀을 FACS 분석에 의해 TF 발현에 대해 시험하고, 추가의 사용을 위해 확보하였다.
실시예 4
CHO 세포에서의 안정한 발현
pEE13.4TF를 CHO-K1SV (론자 바이올로직스) 세포에서 안정하게 형질감염시키고, 안정한 클론을 글루타민의 부재 하에 및 50 μM MSX의 존재 하에 성장에 대해 선택하였다. 단일 클론을 집어 확장시키고, 하기 기재된 바와 같이 FACS 분석에 의해 TF 발현에 대해 시험하였다. 고발현 클론을 선택하고 추가의 사용을 위해 확보하였다.
실시예 5
His-태그 부착된 TF의 정제
TFECDhis를 HEK-293F 세포에서 발현시켰다. TFECDHis 내의 his-태그로 인해 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제가 가능하다. 이 과정에서, 크로마토그래피 수지 상에 고정된 킬레이터를 Co2+ 양이온으로 채운다. TFECDHis-함유 상청액을 수지와 함께 배치 방식 (즉, 용액)으로 인큐베이션한다. His-태그 부착된 단백질은 수지 비드에 강하게 결합하는 반면, 배양 상청액 내에 존재하는 다른 단백질은 강하게 결합하지 않는다. 인큐베이션 후에, 비드를 상청액으로부터 회수하고, 칼럼에 채웠다. 약하게 결합된 단백질을 제거하기 위해 칼럼을 세척한다. 이어서, 강하게 결합된 TFECDHis 단백질을 Co2+에의 His의 결합과 경쟁하는 이미다졸을 함유하는 완충제를 사용하여 용리시킨다. 용리액을 탈염 칼럼 상에서 완충제 교환에 의해 단백질로부터 제거한다.
실시예 6
트랜스제닉 마우스의 면역화 절차
항체 042, 092-A09, 098 및 101은 하기 면역화로부터 유래되었다: 3마리 HCo20 마우스 (2마리 수컷 및 1마리 암컷, 균주 GG2713), 3마리 HCo17 마우스 (2마리 수컷 및 1마리 암컷, 균주 GG2714), 3마리 HCo12-BALB/c 마우스 (3마리 수컷, 균주 GG2811), 3마리 HCo7 (3마리 수컷, 균주 GG2201) 및 3마리 HCo12 마우스 (3마리 수컷, 균주 GG2198) (메다렉스, 미국 캘리포니아주 산 호세); 참고로 상기 HuMab 마우스에 대한 단락 참조)를 5x106개 반-안정한 형질감염된 NS0-TF 세포 또는 20 μg의 TFECDHis 단백질로 격주로 교대로 면역화시켰다. 4회의 복강내 (IP) 및 꼬리 기부에서 4회의 피하 (SC) 면역화를 비롯한 총 8회의 면역화를 수행하였다. 세포를 사용한 제1 면역화는 완전 프로인트 아주반트 (CFA; 디프코 래보러토리즈(Difco Laboratories), 미국 미시건주 디트로이트)에서 이루어졌다. 다른 모든 면역화를 위해, 세포를 PBS에서 IP 주사하고, TFECDHis를 불완전 프로인트 아주반트 (IFA; 디프코 래보러토리즈, 미국 미시건주 디트로이트)를 사용하여 SC 주사하였다. 혈청 역가가 충분한 것으로 밝혀졌을 때 (1/50 또는 그보다 낮은 혈청의 희석액은 적어도 2회의 순차적인, 격주 스크리닝 사건에서 실시예 7에 설명된 바와 같은 항원 특이적 스크리닝 검정에서 양성으로 밝혀짐), 마우스에게 추가로 100 μL PBS 중의 10 μg TFECDHis 단백질을 융합 4 및 3일 전에 2회 정맥내 (IV) 부스팅하였다.
항체 109, 111 및 114는 하기 면역화로부터 유래되었다: 3마리 HCo20 마우스 (3마리 수컷), 3마리 HCo17 마우스 (3마리 암컷), 3마리 HCo12-BALB/c 마우스 (3마리 암컷), 3마리 HCo7 (3마리 수컷) 및 3마리 HCo12 마우스 (3마리 암컷)를 5x106개 반-안정한 형질감염된 NS0-TF 세포로 격주로 면역화시켰다. 세포를 사용한 제1 면역화는 CFA에서 이루어졌고, 다른 모든 (7) 면역화를 위해 세포를 PBS에서 IP 주사하였다. 혈청 역가가 충분한 것으로 밝혀졌을 때 (상기 정의된 바와 같음), 마우스에게 추가로 100 μL PBS 중의 1x106개의 일시적으로 반-안정하게 형질감염된 NS0-TF 세포를 융합 4 및 3일 전에 2회 IV 부스팅하였다.
항체 011, 017-D12 및 025는 하기 면역화로부터 유래되었다: 3마리 HCo20 마우스 (3마리 수컷), 3마리 HCo17 마우스 (2마리 수컷 및 1마리 암컷), 3마리 HCo12-BALB/c 마우스 (3마리 수컷), 3마리 HCo7 (3마리 수컷) 및 3마리 HCo12 마우스 (2마리 수컷 및 1마리 암컷)를 20 μg의 TFECDHis 단백질로 격주로 면역화시켰다. 단백질을 사용한 제1 면역화는 CFA에서 이루어졌고, 다른 모든 (7) 면역화를 위해 단백질을 IFA에서 피하 및 복강내로 교대로 주사하였다. 혈청 역가가 충분한 것으로 밝혀졌을 때 (상기 정의됨), 마우스에게 추가로 100 μL PBS 중의 10 μg TFECDHis 단백질을 융합 4 및 3일 전에 2회 정맥내 (IV) 부스팅하였다.
실시예 7
균질한 항원 특이적 스크리닝 검정
면역화시킨 마우스의 혈청 또는 HuMab (인간 모노클로날 항체) 하이브리도마 또는 트랜스펙토마 배양 상청액 내의 항-TF 항체의 존재를 형광측정 미세부피 검정 기술 (FMAT; 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)을 이용하는 균질한 항원 특이적 스크리닝 검정 (4개의 4분원)에 의해 결정하였다.
이를 위해, 3개의 세포 기반 검정 및 1개의 비드 기반 검정의 조합을 이용하였다. 세포 기반 검정에서, TH1015-TF (TF를 일시적으로 발현하는 HEK-293F 세포; 상기 기재된 바와 같이 생산됨) 및 A431 (세포 표면에서 TF를 발현함)뿐만 아니라 HEK293 야생형 세포 (TF를 발현하지 않음, 음성 대조군)에의 결합을 결정하였다. 비드 기반 검정에서, 스트렙타비딘 비드에 커플링된 비오티닐화 TF (SB1015-TF)에의 결합을 결정하였다.
샘플을 세포/비드에 첨가하여 TF에 결합시켰다. 이후에, HuMab의 결합을 형광 접합체 (염소 항-인간 IgG-Cy5; 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 사용하여 검출하였다. 마우스 항-인간 TF 항체 (ERL; 젠맙에서 알렉사(Alexa)-647에 커플링시킴)를 양성 대조군으로 사용하고, HuMAb-마우스에서 풀링된 혈청 및 마우스-크로뮴퓨어-알렉사647 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 샘플을 어플라이드 바이오시스템즈 8200 세포 검출 시스템 (8200 CDS)을 이용하여 스캐닝하고, '계수 x 형광'을 판독치로 사용하였다.
실시예 8
HuMab 하이브리도마 생성
충분한 항원-특이적 역가 발달 (상기 정의됨)을 갖는 HuMab 마우스를 안락사시키고, 복부 대동맥 및 대정맥에 측면이 접하는 비장 및 림프절을 수집하였다. 마우스 골수종 세포주에 대한 비장세포 및 림프절 세포의 융합은 본질적으로 제조업체의 지침에 따라 CEEF 50 전기융합 시스템 (사이토 펄스 사이언시스(Cyto Pulse Sciences), 미국 메릴랜드주 글렌 버니)를 이용하는 전기융합에 의해 수행하였다. 생성된 HuMab 하이브리도마의 선택 및 배양은 표준 프로토콜에 기초하여 이루어졌다 (예를 들어, 문헌 [Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006]에 기재된 바와 같음).
실시예 9
정제된 항체의 질량 분광측정법
6-웰 또는 하이퍼플라스크(Hyperflask) 단계로부터 0.8 ml 항체 함유 상청액의 작은 분취액을 사이클론(Sciclone) ALH 3000 워크스테이션 (캘리퍼 라이프사이언시스(Caliper Lifesciences), 미국 홉킨톤) 상에서 단백질 G 수지를 함유하는 PhyTip 칼럼 (파이넥서스 인크.(PhyNexus Inc.), 미국 산 호세)을 사용하여 정제하였다. PhyTtip 칼럼은 제조업체의 지침에 따라 사용하였으나, 완충제는 다음에 의해 대체되었다: 결합 완충제 PBS (비.브라운(B.Braun), 메디컬 B.V.(Medical B.V.), 네덜란드 오스) 및 용리 완충제 0.1M 글리신-HCl pH 2.7 (플루카 리에델-드 하엔(Fluka Riedel-de Haen), 독일 부흐스). 정제 후에, 샘플을 2M 트리스-HCl (pH 9.0) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 네덜란드 츠빈드레흐트)로 중화시켰다. 대안적으로, 일부 경우에, 보다 큰 부피의 배양 상청액을 단백질 A 친화성 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
정제 후에, 샘플을 384-웰 플레이트 (워터스(Waters), 100 ul 사각웰 플레이트, 파트# 186002631)에 넣었다. 샘플을 N-글리코시다제 F (로슈(Roche) cat no 11365177001)로 37℃에서 밤새 탈글리코실화하였다. DTT (15 mg/ml)를 첨가하고 (1 μl/웰), 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플 (5 또는 6 ul)을 BEH300 C18, 1.7μm, 2.1x 50 mm 칼럼을 갖는 액퀴티(Acquity) UPLCTM (워터스, 미국 밀포드) 상에서 60℃에서 탈염시켰다. 둘 다 0.1% 포름산 (플루카, cat no 56302, 독일 부흐스)을 갖는 MQ 물 및 LC-MS 등급 아세토니트릴 (바이오솔브(Biosolve), cat no 01204101, 네덜란드 발켄스바르트)을 각각 용리액 A 및 B로 사용하였다. 비행 시간 전자분무 이온화 질량 스펙트럼을 양이온 방식으로 작동하는 micrOTOFTM 질량 분광측정계 (브루커(Bruker), 독일 브레맨) 상에서 온-라인으로 기록하였다. 분석에 앞서, 900-3000 m/z 스케일을 ES 튜닝 믹스 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 산타 클라라)를 사용하여 보정하였다. 질량 스펙트럼을 5 내지 80 kDa의 분자량을 탐색하는 최대 엔트로피 알고리즘을 이용한 데이터어날리시스(DataAnalysis)TM 소프트웨어 v. 3.4 (브루커)로 디컨볼루션하였다.
디컨볼루션 후에, 중복 항체를 발견하기 위해 모든 샘플에 대해 생성되는 중쇄 및 경쇄 질량을 비교하였다. 중쇄의 비교에서, C-말단 리신 변이체의 가능한 존재를 고려하였다. 이것은 특징적인 항체의 목록을 생성하고, 여기서 특징적인 것은 중쇄 및 경쇄의 특징적인 조합으로 정의된다. 중복 항체가 발견된 경우에, 다른 시험으로부터의 결과를 사용하여 어떠한 물질이 실험을 계속하기 위해 사용되는 최상의 물질인지 결정하였다.
118개의 TF-특이적 하이브리도마의 중쇄 및 경쇄의 분자량의 MS 분석으로 70개의 특징적인 항체 (특징적인 중쇄/경쇄 조합)를 수득하였다. 이들을 많은 기능적 검정에서 특성화하여, 본 발명의 리드 후보, TF 특이적 항체를 확인하였다.
실시예 10
항-TF HuMab 가변 도메인의 서열 분석 및 발현 벡터에서의 클로닝
5x106개 하이브리도마 세포로부터 항-TF HuMab의 전체 RNA를 제조하고, 제조업체의 지침에 따라 스마트 RACE cDNA 증폭 키트 (클론테크(Clontech))를 사용하여 100 ng의 전체 RNA로부터 5'-RACE-상보성 DNA (cDNA)를 제조하였다. VH (중쇄의 가변 영역) 및 VL (경쇄의 가변 영역) 코딩 영역을 PCR에 의해 증폭시키고, 제로 블런트(Zero Blunt) PCR 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 pCR-블런트 II-TOPO 벡터 (인비트로젠)에 클로닝하였다. 각각의 HuMab에 대해, 16개의 VL 클론 및 8개의 VH 클론을 서열 분석하였다. 서열은 본원에서 서열 목록 및 도 1에 주어진다.
표 1A 및 표 1B (하기)는 항체 서열 정보 및 가장 상동성인 배선 서열의 개관을 제공한다.
[표 1A]
Figure 112013003426946-pct00012
[표 1B]
Figure 112013003426946-pct00013
서열 목록에 대한 참조: (도 1에서의 서열)
도 1에서, 017-D12 클론은 "017"로 지칭되고, 유사하게 092-A09 클론은 "092"로 지칭된다.
Figure 112013003426946-pct00014
Figure 112013003426946-pct00015
Figure 112013003426946-pct00016
항-TF HuMab 092-A09는 서열 17의 VH 서열 및 서열 57의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
항-TF HuMab 101은 서열 21의 VH 서열 및 서열 61의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
항-TF HuMab 025는 서열 25의 VH 서열 및 서열 65의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
항-TF HuMab 109는 서열 29의 VH 서열 및 서열 69의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
항-TF HuMab 017-D12는 서열 9의 VH 서열 및 서열 49의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
항-TF HuMab 114는 서열 1의 VH 서열 및 서열 41의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
항-TF HuMab 042는 서열 13의 VH 서열 및 서열 53의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
항-TF HuMab 011은 서열 5의 VH 서열 및 서열 45의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
항-TF HuMab 098은 서열 33의 VH 서열 및 서열 73의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
항-TF HuMab 111은 서열 37의 VH 서열 및 서열 77의 VL 서열을 포함하는 전장 완전 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체이다.
실시예 11
항체의 정제
배양 상청액을 0.2 μm 전량 필터 위에서 여과하고, 5 ml 단백질 A 칼럼 (r단백질 A FF, 아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience)) 상에 로딩하고, 0.1 M 시트르산-NaOH (pH 3)로 용리하였다. 용리액을 2M 트리스-HCl (pH 9)로 즉시 중화시키고, 12.6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl (pH 7.4) (비.브라운)로 밤새 투석하였다. 투석 후에, 샘플을 0.2 μm 전량 필터 위에서 멸균 여과시켰다. 순도는 SDS-PAGE에 의해 결정하고, 농도는 비탁법 및 280 nm에서 흡광도에 의해 측정하였다. 정제된 항체를 분취하고 -80℃에서 저장하였다. 일단 해동되면, 정제된 항체 분취액을 4℃에서 유지하였다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 하이브리도마에 의해 발현된 항체 중쇄 및 경쇄의 분자 질량을 확인하기 위해 질량 분광측정법을 수행하였다.
실시예 12
ELISA에서 TF의 세포외 도메인에의 항-TF HuMab의 결합
수득된 항-TF HuMab의 특이성을 ELISA에 의해 평가하였다. ELISA 플레이트 (마이크로론(Microlon); 그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One))를 +4℃에서 PBS (pH 7.4) 중의 0.5 μg/mL TFECDHis로 밤새 코팅하였다. 코팅된 ELISA 플레이트를 비우고 1시간 동안 실온에서 PBS 중의 2% (v/v) 닭 혈청 (깁코(Gibco), 스코틀랜드 페이즐리)으로 차단하고, 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS (PBST)로 세척하였다. 이후에, HuMab (PBSTC (2% (v/v) 닭 혈청 및 0.05% (v/v) 트윈-20이 보충된 PBS)에서 연속 희석시킴)을 1시간 동안 RT에서 진탕 조건 (300 rpm) 하에 인큐베이션하였다. 결합된 HuMab를 PBSTC에서 1:5,000으로 희석시킨 HRP-접합 염소-항-인간 IgG 항체 (잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 검출하고, 이를 1시간 동안 RT에서 진탕 조건 (300 rpm) 하에 인큐베이션하였다. 반응액을 어두운 곳에서 RT에서 ABTS (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))로 더욱 발색시키고, 2% (w/v) 옥살산을 첨가하여 15-30분 후에 중지시킨 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. HuMab-KLH (KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)에 대한 인간 모노클로날 항체)를 음성 대조군으로 사용하였다. 마우스 항-인간 TF (ERL)를 양성 대조군 (접합체로서 HRP 표지된 항-마우스 IgG)으로 사용하였다. 결합 곡선을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) V4.03 소프트웨어를 이용하여 비-선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)를 이용하여 검정하였다.
도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 항-TF 항체는 TFECDHis에 결합하였다. HuMab에 대한 EC50 값은 3개의 실험의 평균이고, 0.13 내지 0.17 nM으로 변하였다 (하기 표 2).
Figure 112013003426946-pct00017
실시예 13
막-결합된 TF에의 항-TF HuMab의 결합
막-결합된 TF에의 항-TF HuMab의 결합을 TF 형질감염된 CHO 세포, 또는 TF 발현 종양 세포주 MDA-MB-231, (루시퍼라제 형질감염된) A431 및 Bx-PC3을 사용하여 FACS 분석에 의해 결정하였다.
세포를 PBS (2 x 106개 세포/mL)에 재현탁시키고, 96-웰 V-바닥 플레이트 (50 μL/웰)에 넣었다. FACS 완충제 (0.1% BSA 및 0.02% Na-아지드가 보충된 PBS)에서 연속적으로 희석된 HuMab의 50 μL를 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충제로 3회 세척한 후, 50 μL의 피코에리트린 (PE)-접합 염소 항-인간 IgGFc (잭슨 이뮤노리서치) (FACS 완충제에서 1:100으로 희석시킴)을 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 후에 (어두운 곳에서), 세포를 3회 세척하고, HuMab의 특이적 결합을 FACSCalibur (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 상에서 유동 세포측정법에 의해 검출하였다. HuMab-KLH를 음성 대조군으로 사용하였다. 마우스 항-TF에 이어 PE-접합 항-마우스 IgGFc를 양성 대조군으로 사용하였다. 결합 곡선을 그래프패드 프리즘 V4.03 소프트웨어 (그래패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 이용하여 비-선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)를 이용하여 검정하였다.
도 4는 MDA-MB-231 세포에의 TF-특이적 HuMab의 결합 곡선의 예를 보여준다. 표 3은 TF 형질감염된 CHO 세포 (S1015-TF), MDA-MB-231, A431 및 Bx-PC3 세포에의 TF-특이적 HuMab의 결합의 EC50 값의 개관을 제공한다.
Figure 112013003426946-pct00018
실시예 14
TF에의 FVIIa 결합의 억제
MDA-MB-231 세포 상에서 항-TF HuMab에 의한 TF에의 FVIIa의 결합의 억제를 FACS 분석에 의해 측정하였다. MDA-MB-231 세포를 PBS에서 세척하여 혈청을 제거하고, 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다 (웰당 100,000개 세포). 세포를 DMEM/0.1% BSA에서 15분 동안 항-TF HuMab와 인큐베이션한 후에, DMEM/0.1% BSA에서 30분 동안 4℃에서 100 nM FVIIa와 인큐베이션하였다. 세포를 PBS/0.1% BSA/0.02% 나트륨 아지드 (FACS 완충제)로 세척하고, 10 μg/mL 토끼 항-FVIIa (아브캄(Abcam) [ab7053])와 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제로 세척하고, 1:50 희석된 PE-표지된 염소 항-토끼 IgG (잭슨 [111-116-144])와 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제로 세척하고, 평균 형광 강도 (MFI)를 FACSCanto II (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 상에서 측정하였다.
50% 억제를 얻는데 필요한 항체의 농도 (IC50)를 그래프패드 프리즘 (비-선형 회귀 분석)을 이용하여 계산하였다.
도 5 및 표 4는 HuMab-TF-098 (IC50: 1.2 μg/mL), -114 (IC50이 결정될 수 없음) 및 -011 (IC50: 0.6 μg/mL)이 MDA-MB-231 세포에의 FVIIa 결합을 효율적으로 억제하는 반면, HuMab-TF-013, -044 및 -111은 FVIIa 결합을 억제하지 않는다는 것 (또는 훨씬 적은 정도로 억제한다는 것)을 보여준다.
Figure 112013003426946-pct00019
제시된 데이터는 하나의 대표적인 실험에서 측정된, MDA-MB-231 세포 상에서 TF에의 100 nM FVIIa의 결합을 억제하는 항-TF HuMab의 IC50 값 (μg/mL)이다.
실시예 15
항-카파-ETA' 검정에서 항-TF HuMab에 의한 항체-매개 내재화 및 세포 사멸
항-TF HuMab가 항체-약물 접합체 접근법에 적합한지 결정하기 위해, 카파-유도 슈도모나스-외독소 A (항-카파-ETA')를 이용하는 일반적인 시험관내 세포-기반 사멸 검정을 이용하였다. 본 검정에서 슈도모나스-외독소 A의 말단절단 형태에 접합된 고친화도 항-인간 카파 경쇄 도메인이 사용되었다. 내재화시에, 항-카파-ETA' 도메인-항체 접합체는 단백질분해 및 디술피드-결합 환원을 거쳐 촉매 및 결합 도메인을 분리한다. 촉매 도메인은 골지 시스템으로부터 KDEL 잔류 모티프를 통해 소포체로 운반되고, 이후에 시토졸로 전위되어, 이곳에서 단백질 합성을 억제하고 아폽토시스를 유도한다 (문헌 [Kreitman RJ. BioDrugs. 2009; 23(1): 1-13. Recombinant Immunotoxins Containing Truncated Bacterial Toxins for the Treatment of Hematologic Malignancies]).
독소에 의한 항체-매개 내재화 및 세포 사멸을 상이한 항-TF HuMab에 대해 시험하였다. 대등한 수준의 TF 발현을 갖는 3개의 상이한 세포주를 시험하였다. 이들 세포는 또한 EGFR을 (상이한 수준에서) 발현하였으며, 이는 EGFR에 결합하고, EGFR 내재화를 유도하는 것으로 알려진 양성 대조군 항체 (2F8)의 사용을 허용한다. 세포주 상에서 발현된 TF 및 EGFR 분자의 수를 Qifi 키트 (다코(Dako), 덴마크 글로스트럽)에 의해 결정하였다; A431 세포: 세포당 평균 TF 분자 대략 500,000개, 세포당 평균 EGFR 분자 대략 500,000개; BxPC3: 세포당 평균 TF 분자 대략 500,000개, 세포당 평균 EGFR 분자 대략 200,000개; MDA-MB-231: 세포당 평균 TF 분자 대략 500,000개, 세포당 평균 EGFR 분자 대략 100,000개. 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트 (그라이너 바이오-원)에서 세포 배양 배지 중에 최적 농도 (A431: 2,500개 세포/웰; BxPC3: 3,000개 세포/웰; MDA-MB-231: 5,000개 세포/웰)로 시딩하고, 부착을 허용하였다. 독소에 의한 내재화 및 사멸을 가능하게 하는 항-TF HuMab를 확인하기 위해, 항체의 부재 하에 비-특이적 세포 사멸을 유도하지 않는, 고정된 농도 (0.5 μg/mL [A431 및 BxPC3]; 0.25 μg/mL [MDA-MB-231])의 항-카파-ETA'를 적정된 양의 항-TF HuMab와 30분 동안 인큐베이션한 후에 세포에 첨가하였다. 3일 후에, 생존 세포의 양을 제조업체의 지침에 따라 알라마르블루(AlamarBlue) (바이오소스 인터내셔널(BioSource International), 미국 샌프란시스코)로 정량화하였다. 형광은 표준 알라마르블루 셋팅을 갖는 엔비전(EnVision) 2101 다중표지 판독기 (퍼킨엘머(PerkinElmer), 핀란드 투르쿠)를 이용하여 모니터링하였다. 항-카파-ETA'를 갖는 2F8를 양성 대조군으로 포함시켰다. 이소형 대조군 항체 (IgG1-b12)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 6 및 표 5는 항-카파-ETA'-예비-인큐베이션된 항-TF HuMab 중 하나 (HuMab-TF-087)를 제외한 모두가 용량-의존성 방식으로서 A431, BxPC3 및 MDA-MB-231 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 보여준다. 항-카파-ETA'-예비-인큐베이션된 HuMab-TF-098, -114 및 -011은 항-카파-ETA'-예비-인큐베이션된 HuMab-TF-013, -111 및 -044 (EC50: A431 세포에 대해 2.0 x 10-2 내지 9.8 x 10-2 μg/mL)보다 더 효율적인 사멸 (EC50: A431 세포에 대해 9 x 10-5 내지 4 x 10-4 μg/mL)을 유도하였다. 항-카파-ETA'-예비-인큐베이션된 HuMab-TF-087은 세포 사멸을 유도하지 않았다.
하나의 대표적인 실험은 각 세포주에 대해 제시된다: A431 (a), BxPC3 (b) 및 MDA-MB-231 (c). 제시된 데이터는 항-카파-ETA'-예비-인큐베이션된 항-TF HuMab로 처리된 세포의 3중 웰의 평균 형광 강도 (MFI) ± S.E.M.이다. 상부 파상선은 항-카파-ETA'-예비-인큐베이션된 항-TF HuMab의 부재 하에 수득한 최대 신호를 나타내고; 하부 파상선은 스타우로스포린으로 수득한 최대 사멸을 나타낸다.
Figure 112013003426946-pct00020
제시된 데이터는 하나의 대표적인 실험에서 측정된, 항-카파-ETA'-예비-인큐베이션된 항-TF HuMab로 처리된 지정된 세포주의 EC50 값 (μg/mL) 및 최대 사멸 백분율이다. 세포 사멸 백분율 (사멸%)은 다음과 같이 계산하였다:
(MFI비처리 - MFI접합 HuMab-처리) / (MFI비처리 - MFI스타우로포린-처리).
실시예 16
항-TF ADC의 제조
HuMab-011, HuMab-098 및 HuMab-111 및 음성 대조군 IgG1-b12를 HEK-293F 세포 (HuMab-011, HuMab-111 및 IgG1-b12)에서 일시적으로 또는 안정한 CHO 세포주 (HuMab-098)를 사용하여 생산하였다. 항체를 표준 절차에 따라 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하여, 최종적으로 대략 400 mg의 정제된 항체를 수득하였다. 다음에, 항체를 각각 vcMMAE 및 mcMMAF에 접합시켰다. 대략 200 mg의 HuMab-011, HuMab-098 또는 HuMab-111을 vcMMAE 또는 mcMMAF에 접합시켰다. 약물-링커 vcMMAE 또는 mcMMAF를 문헌에 기재된 절차에 따라 환원된 항체의 시스테인으로 알킬화시켰다 (문헌 [Sun et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16: 1282-1290; McDonagh et al., (2006) Protein Eng. Design Sel. 19: 299-307; Alley et al., (2008) Bioconjugate Chem. 19: 759-765]). 과량의 N-아세틸시스테인을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 임의의 잔류 비접합 약물을 정제에 의해 제거하고, 최종 항-TF 항체 약물 접합체를 PBS에서 제제화하였다. 항-TF 항체 약물 접합체를 이후에 농도 (280 nm에서의 흡광도에 의함), 약물 대 항체 비 ('DAR') (역상 크로마토그래피 (RP-HPLC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의함), 비접합 약물의 양 (역상 크로마토그래피에 의함), 응집 백분율 (크기-배제 크로마토그래피, SEC-HPLC에 의함) 및 내독소 수준 (LAL에 의함)에 대해 분석하였다. 결과를 하기 표 6에 제시하였다.
Figure 112013003426946-pct00021
실시예 17
ELISA에 의해 결정된, TF의 재조합 세포외 도메인에의 항-TF ADC의 결합
TF에의 항-TF ADC의 결합을 ELISA (TF의 코팅된 재조합 세포외 도메인)에 의해 측정하고, 비접합 항-TF HuMab의 결합과 비교하였다. ELISA 플레이트 (그라이너 바이오원)를 PBS 중의 1.25 μg/mL, 100 μL/웰, 재조합 TFECDHis (비.브라운 멜순젠 아게(Melsungen AG))로 4℃에서 O/N 코팅하였다. ELISA 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS (PBST)로 3회 세척하고, 200 μL/웰 PBST로 RT에서 1시간 동안 진탕 (300 rpm)하면서 차단시키고, PBST로 3회 세척하고, 비웠다. 이후에, 100 μL 항-TF ADC 또는 비접합 항-TF HuMab를 PBST 중 연속 희석액에 첨가하고, RT에서 90분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 비웠다. 결합된 항-TF ADC 및 비접합 HuMab는 검정 완충제에 HRP-접합 마우스-항 인간 IgG1 (100 μL; 0.015 μg/mL; 산퀸(Sanquin); # M1328)을 첨가하고, RT에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하여 검출하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 비우고, 100 μL ABTS 용액 (50 ml ABTS 완충제 [로슈] 및 하나의 ABTS 정제 [50 mg; 로슈])와 인큐베이션하였다. 어두운 곳에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한 후에, 어두운 곳에서 10분 동안 웰당 100 μL 옥살산 (2% [w/v]; 리에델 드 하엔(Riedel de Haen))과 인큐베이션하여 반응을 중단시켰다. 플레이트를 ELISA 판독기 (바이오텍 인스트루먼츠(Biotek Instruments), EL808 흡광도 마이크로플레이트 판독기)에서 OD 405 nm에서 측정하였다.
IgG1-b12 (비-관련 항원에 결합하는 항체)를 음성 대조군으로 사용하였다 (둘 다 비접합되었을 뿐만 아니라 ADC 포맷임).
결합 곡선은 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 이용하여 비-선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)에 의해 분석하였다.
도 7은 모든 항-TF HuMab 및 ADC가 ELISA에서 TF 세포외 도메인에 유사한 범위 내에서 결합된다는 것을 입증하는 (EC50 값: 370 내지 470 ng/mL), 결합 곡선을 보여준다.
표 7은 TF의 세포외 도메인에의 결합에 대한 항-TF HuMab 및 ADC의 EC50 값을 보여준다. EC50 값은 ng/mL 단위이다.
Figure 112013003426946-pct00022
실시예 18
시험관내 사멸 검정에서 항-TF ADC에 의한 항체-매개 내재화 및 세포 사멸
항-TF ADC가 세포독성을 유도하는 능력을 결정하기 위해, 시험관내 세포-기반 사멸 검정을 수행하였다.
3개의 세포주의 세포 사멸을 상이한 항-TF ADC에 대해 시험하였다. A431 세포를 도이체 잠룽 폰 미크로오가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (DSMZ: ACC 91)로부터 수득하였고, HPAF-II 및 NCI-H441 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC: CRL-1997 및 HTB-174)으로부터 수득하였다. 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트 (그라이너 바이오-원)에서 세포 배양 배지 중에 최적 농도 (A431: 2.5 x 103개/웰; HPAF-II 및 NCI-H441: 5 x 103개/웰)로 시딩하고, 부착을 허용하였다. 항-TF ADC의 연속 희석액을 첨가하고, 72시간 (A431 및 HPAF-II) 또는 96시간 (NCI-H441) 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 생존 세포의 양을 제조업체의 지침에 따라 알라마르블루 (바이오소스 인터내셔널, 미국 샌프란시스코)로 정량화하였다. 형광은 표준 알라마르블루 셋팅을 갖는 엔비전 2101 다중표지 판독기 (퍼킨엘머, 핀란드 투르쿠)를 이용하여 모니터링하였다. IgG1-b12 (비-관련 항원에 결합하는 항체) ADC를 음성 대조군으로 사용하였다. 스타우로스포린 (시그마, # S6942)을 사용하여 최대 세포 사멸을 유도하였다.
A431 및 HPAF-II 세포주는 둘 다 세포당 200,000개 초과의 조직 인자 분자를 발현하고, 따라서 높은 수준의 조직 인자를 발현하는 것으로 간주할 수 있다.
NCI-H441 세포는 세포당 대략 80,000개 조직 인자 분자를 발현하고, 이에 따라 중간 수준의 조직 인자를 발현하는 것으로 간주할 수 있다.
도 8 및 표 8은 모든 항-TF ADC가 용량-의존성 방식으로 A431, HPAF-II 및 NCI-H441 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 보여준다. HuMab-TF-098 및 -011은 HuMab-TF-111 (IC50: A431 세포에 대해 46 내지 83 ng/mL, HPAF-II 세포에 대해 4 내지 15 ng/mL 및 NCI-H441 세포에 대해 416 ng/mL)보다 약간 더 효율적인 사멸 (IC50: A431 세포에 대해 9 내지 22 ng/mL, HPAF-II 세포에 대해 1 내지 5 ng/mL 및 NCI-H441 세포에 대해 1 내지 10 ng/mL)을 유도하였다. 하나의 대표적인 실험을 각 세포주에 대해 제시하였다: A431 (a) 및 HPAF-II (b). 제시된 데이터는 항-TF ADC로 처리된 세포의 중복 웰의 생존 백분율 ± S.E.M.이다.
Figure 112013003426946-pct00023
제시된 데이터는 하나의 대표적인 실험에서 측정된, 항-TF ADC로 처리된 지정된 세포주의 IC50 값 (ng/mL) 및 (10 μg/mL의 농도에서의) 최대 사멸 백분율이다. 세포 사멸 백분율 (사멸%)을 다음과 같이 계산하였다:
(MFI비처리 - MFI항-TF ADC-처리) / (MFI비처리 - MFI스타우로포린-처리) x 100%.
실시예 19
항-TF ADC를 사용한 SCID 마우스에서의 A431 및 HPAF-II 종양 이종이식편의 치유적 치료
항-TF ADC의 생체내 효능은 SCID 마우스에서 확립된 피하 (SC) A431 및 HPAF-II 이종이식 종양에서 결정하였다. 200 μL PBS 중 5 x 106개 A431 (DSMZ로부터 수득함) 또는 2 x 106개 HPAF-II (ATCC로부터 수득함) 종양 세포를 암컷 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 SC 주사한 후에, 종양 크기가 A431 이종이식편의 경우 대략 200-250 mm3일 때: 제11, 14, 18 및 21일 또는 HPAF-II 이종이식편의 경우 대략 100-150 mm3일 때: 제13, 16, 20 및 23일에 항-TF ADC 또는 대조군 (IgG1-b12; ADC 및 비접합 둘 다)을 4회 주사하였다 (100 μL 중 60 μg/마우스, 복강내 (IP)). 종양 부피를 1주일에 적어도 2회 결정하였다. 종양 부피 (mm3)를 다음과 같이 캘리퍼 (PLEXX) 측정으로부터 계산하였다: 0.52 x (길이) x (폭)2.
도 9는 모든 항-TF ADC가 확립된 s.c. A431 (a) 및 HPAF-II (b) 종양의 종양 성장을 억제하는데 효과적이었다는 것을 보여준다. 제시된 데이터는 군당 평균 종양 부피 ± S.E.M.이다 (군당 n = 7마리 마우스). HPAF-II 모델에서, vcMMAE 접합체는 종양 성장을 억제하는데 mcMMAF 접합체보다 현저하게 더 효율적이었다.
실시예 20
항-TF 리드 클론 ADC 및 IgG1-b12 ADC의 안정성
MMAE- 및 MMAF-접합 물질의 안정성은 < -65℃ 및 5℃에서 10일, 1, 2 및 3개월 동안 저장시에 시험하였다. 유사한 결과가 모든 중간 시점에서 수득되었기 때문에 본 실시예에서는 3개월 데이터만을 제시하였다. 또한, 물질의 안정성을 동결-해동의 반복된 주기에서 시험하였다.
제조된 ADC 배치 (각각 2개의 상이한 링커와 접합된 4개의 IgG 배치, 표 6)를 급속 냉동시켰다. 안정성 시험을 위해, 배치를 해동시키고, PBS에서 1 mg/mL로 희석하였다. 희석된 물질을 냉동바이알에 300 μL 부분으로 분취하고, 바이알을 온도 저장 동안 < -65℃ 또는 5℃에 두었다. 동결-해동을 위해, 각 배치의 3개의 바이알을 < -65℃에서 O/N 냉동킨 후에, RT에서 도움없이 해동시켰다. 동결-해동 주기를 2회 더 반복하였다 (샘플을 총 3회 동결-해동시킴). 모든 물질을 연구 출발 시점 (t=0)에 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC) 및 결합 ELISA에서 조직 인자 (TFECDHis)에의 결합에 의해 분석하였다. 동일한 분석을 < -65℃ 및 5℃에서 3개월 동안 저장된 (t=3개월) 샘플 및 동결-해동 샘플에 대해 수행하였다.
SDS-PAGE를 변형된 라에믈리(Laemli) 방법 (문헌 [Laemli 1970 Nature 227(5259): 680-5])을 이용하여 4-12% NuPAGE 비스-트리스 겔 (인비트로젠, 네덜란드 브레다) 상에서 환원 및 비-환원 조건 하에 수행하였으며, 여기서 샘플은 중성 pH에서 러닝시켰다. SDS-PAGE 겔을 쿠마시로 염색하고, 옵티고(Optigo) 영상화 시스템 (이소젠 라이프 사이언스(Isogen Life Science))을 이용하여 디지털 영상화시켰다.
HP-SEC를 TSK HP-SEC 칼럼 (G3000SWxl; 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 옴니라보(Omnilabo)를 통함, 네덜란드 브레다)에 연결된 워터스 얼라이언스(Waters Alliance) 2695 또는 2795 분리 장치 (워터스, 네덜란드 이튼-루어) 및 워터스 2487 이중 λ 흡광도 검출기 (워터스)를 이용하여 수행하였다. 샘플을 1 mL/분에서 러닝시켰다. 결과를 엠파워(Empower) 소프트웨어 버전 2를 이용하여 처리하고, 피크당 총 피크 높이의 백분율로 표현하였다.
TF 세포외 도메인의 재조합 단백질에의 결합은 실시예 17에서 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다.
도 10 a-d는 안정성 연구 출발 시점 (t=0)에서 비접합 및 접합 항-TF 리드 클론 및 IgG1-b12의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 비-환원 SDS-PAGE (a,b) 상에서, 비접합 IgG1은 약 150 kDa의 무손상 IgG 밴드로 이동하였다. 예상한 바와 같이, ADC는 변성 SDS-PAGE 조건 및 ADC 분자의 비-공유 특성 (분쇄된 디술피드 결합)으로 인해 주로 작은 크기의 IgG 단편 (125 kDa=HHL, 99 kDa=HH, 67 kDa=HL, 51 kDa=H 및 25 kDa=L)으로 해리되었다 (도 10 a,b). 환원된 SDS-PAGE 분석 (도 10 c,d)은 비접합 경쇄 (L0) 및 하나의 약물 (MMAE 또는 MMAF)이 부착된 경쇄 (L1)의 밴드를 보여주었다. 부분적 분할이 비접합 중쇄 (H0) 및 MMAE-접합 형태 (H1, H2 및 H3)에서 관찰되었다. MMAF-접합 및 비접합 중쇄 형태는 잘 분할될 수 없었으나 50 kDa에서 확산 밴드로 나타났다.
양쪽 온도 (< -65℃ 및 5℃)에서 3개월 저장 후에 샘플에 대한 SDS-PAGE 결과는 도 10 e-f에 나타난 바와 같이 t=0 데이터와 대등하였다. 또한, 동결-해동 샘플의 경우, SDS-PAGE 분석에 의해 출발 물질과 비교하여 차이가 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
도 11은 양쪽 온도에서 t=0 및 t=3개월에서의 ADC 배치에 대한 HP-SEC 프로파일 오버레이를 보여준다. 본래 HP-SEC 조건 하에, ADC 물질 (t=0)은 소량의 이량체 IgG 분자와 함께 단량체 IgG 분자의 하나의 피크로 용리되었다. 3개월 저장시에 MMAE- 및 MMAF-접합 HuMab-TF-098 (a, b) 및 HuMab-TF-011 (c, d)에 대한 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, HuMab-TF-111 (e, f) 및 IgG1-b12 (g, h)의 ADC 물질은 t=3개월에서 회수율 (피크 높이) 감소를 나타내었다. 이러한 보다 ?은 회수율은 이미 t=10일 샘플에서 관찰되었고, 3개월까지의 장기 저장 후에 일정하게 유지되었다.
단량체 IgG 분자의 백분율 (단량체 %)을 HP-SEC 피크 프로파일로부터 계산하고, 데이터를 표 9에 요약하였다. 비교를 위해, 비접합 물질의 단량체 %를 나타낸다. 데이터는 ADC 물질의 > 95%가 무손상 단량체 IgG 분자로 이루어졌다는 것을 보여준다. 단량체 %는 < -65℃ 및 5℃에서 3개월 저장 후에 변하지 않고 유지되었으며, 이는 제시간에 응집물이 형성되지 않았다는 것을 나타낸다.
동결/해동 샘플의 HP-SEC 분석은 모든 샘플의 IgG 피크 회수율이 t=0에서의 회수율과 유사하였다는 것을 보여주었다 (데이터는 제시되지 않음). 그러나, HuMab-TF-ADC 물질의 동결-해동은 표 9에 나타난 바와 같이 약간 더 낮은 단량체 % (1.5-3.6%)를 나타내었다. 이는 소량의 응집물 (HP-SEC에 의해 판단된 바와 같은 이량체 IgG 분자, 데이터는 제시되지 않음)의 형성 때문이었다.
TF 세포외 도메인 (TFECDHis)의 재조합 단백질에의 비접합 및 접합 HuMab-TF-098, -011 및 -111의 결합을 ELISA에 의해 시험하였다. < -65℃ 및 5℃에서 3개월 저장 후에, 도 12에 나타난 바와 같이 결합 능력은 t=0에서와 비교하여 변화하지 않았다. 유사한 결과를 동결-해동 샘플에서 수득하였다 (데이터는 제시되지 않음).
안정성 실험은 ADC 물질 (1 mg/mL)이 SDS-PAGE, HP-SEC 및 TFECDHis에의 결합에 의해 결정된 바와 같이 적어도 3개월 동안 < -65℃ 및 5℃에서 안정하다는 것을 보여준다. 부수적인 응집물 형성은 물질의 반복된 동결 해동에 의해 유도되었다.
Figure 112013003426946-pct00024
실시예 21
SCID 마우스에서의 HPAF-II 종양 이종이식편의 치유적 치료에 있어 항-TF ADC의 용량-반응
항-TF ADC의 생체내 효능은 SCID 마우스에서 확립된 SC HPAF-II 이종이식 종양을 상이한 용량의 항-TF ADC로 처리함으로써 추가로 분석하였다. HPAF-II 종양 이종이식편을 상기 기재된 바와 같이 확립한 후에, 종양 크기가 대략 100-150 mm3일 때: 제10, 13, 17 및 21일에 출발하여 2가지 상이한 용량 (100 μL 중 6 및 20 μg/마우스 [IgG1-b12를 마우스당 60 μg IgG1의 최종 용량으로 첨가함], IP)의 항-TF vcMMAE ADC 또는 대조군 비접합 mAb (IgG1-b12; 100 μL 중 60 μg/마우스, IP)로 4회 주사하였다. 종양 부피는 1주일에 적어도 2회 결정하였다. 종양 부피 (mm3)는 다음과 같이 캘리퍼 (PLEXX) 측정으로부터 계산하였다: 0.52 x (길이) x (폭)2.
도 13은 모든 3개의 vcMMAE 접합체의 20 μg 용량이 확립된 s.c. HPAF-II 종양의 종양 성장을 억제하는데 효과적이었다는 것을 보여준다. 모든 3개의 vcMMAE 접합체의 6 μg 용량은 종양 성장을 다소 지연시킬 수 있었으나 종양 성장을 억제하지는 않았다.
등가물
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 다수의 등가물을 인식할 것이거나 또는 더 이상의 통상적인 실험을 이용하지 않고 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 하기 특허청구범위에 포함되도록 의도된다. 종속항에 개시된 실시양태의 임의의 조합이 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다.
[발명의 실시양태]
[실시양태 1]
(i) 서열 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 46에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 47에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 48에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역, 또는
(ii) 서열 34에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 35에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 36에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 74에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 75에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역, 또는
(iii) 서열 38에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 39에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 40에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 78에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 80에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역, 또는
(iv) 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 42에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역
을 포함하며 조직 인자에 결합하는 항체, 또는
(v) 상기 서열에서 바람직하게는 최대 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는, 상기 항체 중 어느 것의 변이체
를 포함하며, 여기서 상기 항체는 링커를 통해 아우리스타틴 또는 그의 기능적 펩티드 유사체 또는 유도체에 접합된 것인 항체 약물 접합체.
[실시양태 2]
제1 실시양태에 있어서, 항체가
(i) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(ii) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(iii) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(iv) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함하는 것인 항체 약물 접합체.
[실시양태 3]
제1 실시양태 또는 제2 실시양태에 있어서, 항체가 전장 항체인 항체 약물 접합체.
[실시양태 4]
제1 실시양태 내지 제3 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 완전 인간 모노클로날 IgG1 항체, 예컨대 IgG1,κ인 항체 약물 접합체.
[실시양태 5]
제1 실시양태 내지 제4 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 아우리스타틴이 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)인 항체 약물 접합체.
Figure 112016055334652-pct00053

상기 식에서, 파상선은 링커에 대한 부착 부위를 나타낸다.
[실시양태 6]
제1 실시양태 내지 제4 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 아우리스타틴이 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)인 항체 약물 접합체.
Figure 112016055334652-pct00054

상기 식에서, 파상선은 링커에 대한 부착 부위를 나타낸다.
[실시양태 7]
제1 실시양태 내지 제6 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 링커가 항-TF 항체의 (부분적) 환원에 의해 수득한 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기에 부착되는 것인 항체 약물 접합체.
[실시양태 8]
제1 실시양태 내지 제5 실시양태 및 제7 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 링커-아우리스타틴이 vcMMAF 또는 vcMMAE인 항체 약물 접합체.
Figure 112016055334652-pct00055

상기 식에서, p는 1 내지 8의 수를 나타내고, S는 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기를 나타내고, Ab는 항-TF 항체를 나타낸다.
[실시양태 9]
제8 실시양태에 있어서, 링커-아우리스타틴이 제8항에 정의된 바와 같은 vcMMAE인 항체 약물 접합체.
[실시양태 10]
제1 실시양태 내지 제4 실시양태, 제6 실시양태 및 제7 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 링커-접합체가 mcMMAF인 항체 약물 접합체.
Figure 112016055334652-pct00056

상기 식에서, p는 1 내지 8의 수를 나타내고, S는 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기를 나타내고, Ab는 항-TF 항체를 나타낸다.
[실시양태 11]
제1 실시양태 내지 제10 실시양태 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 항체 약물 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
[실시양태 12]
제1 실시양태 내지 제10 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체 약물 접합체.
[실시양태 13]
제1 실시양태 내지 제10 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체.
[실시양태 14]
제13 실시양태에 있어서, 암이 중추 신경계의 종양, 두경부암, 폐암, 예컨대 NSCLC, 유방암, 구체적으로 삼중 음성 유방암, 식도암, 위암 또는 위장암, 간암 및 담도암, 췌장암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁내막암, 난소암, 악성 흑색종, 육종, 원인불명 원발성 기원의 종양, 골수암, 급성 림프모구성 백혈병, AML, 만성 림프모구성 백혈병 및 비-호지킨 림프종, 피부암, 신경교종, 뇌암, 자궁암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 약물 접합체.
[실시양태 15]
제13 실시양태에 있어서, 췌장암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체.
[실시양태 16]
제13 실시양태에 있어서, 결장직장암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체.
[실시양태 17]
제13 실시양태에 있어서, 난소암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체.
[실시양태 18]
제13 실시양태에 있어서, 유방암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체.
[실시양태 19]
제13 실시양태에 있어서, 전립선암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체.
[실시양태 20]
제13 실시양태에 있어서, 방광암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체.
[실시양태 21]
제12 실시양태에 있어서, 의약이 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학요법제와 조합하여 암의 치료에 사용하기 위한 것인 항체 약물 접합체.
[실시양태 22]
암 치료용 의약의 제조를 위한 제1 실시양태 내지 제10 실시양태 중 어느 하나의 항체 약물 접합체의 용도.
[실시양태 23]
제21 실시양태에 있어서, 제14 실시양태 내지 제20 실시양태 중 어느 하나의 추가의 특징을 포함하는 용도.
[실시양태 24]
세포 사멸의 유도, 또는 종양 세포 발현 조직 인자의 성장 및/또는 증식의 억제를 필요로 하는 개체에게 유효량의 제1 실시양태 내지 제10 실시양태 중 어느 하나의 항체 약물 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 세포 사멸을 유도하거나, 또는 종양 세포 발현 조직 인자의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법.
[실시양태 25]
제14 실시양태 내지 제20 실시양태 중 어느 하나의 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 유효량의 제1 실시양태 내지 제10 실시양태 중 어느 하나의 항체 약물 접합체를 투여함으로써 상기 질환을 치료하는 방법.
[실시양태 26]
제25 실시양태에 있어서, 항체 약물 접합체를 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학요법제와 조합하여 투여하는 방법.
<110> Genmab A/S <120> Human antibody drug conjugates against tissue factor <130> P/65.WO <160> 82 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Asp 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Val Asn Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Pro Gly Thr Phe Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Gly Phe Thr Val Ser Asn Asp Gly 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Ile Trp Tyr Asp Gly Val Asn Lys 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Ala Arg Arg Pro Gly Thr Phe Tyr Gly 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<213> homo sapiens <400> 79 Asp Ala Ser 1 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 80 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 81 <211> 327 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 81 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 82 <211> 315 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 82 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 100 105 110 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 115 120 125 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 130 135 140 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 145 150 155 160 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 165 170 175 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 180 185 190 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 195 200 205 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 210 215 220 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 225 230 235 240 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 245 250 255 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 260 265 270 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 275 280 285 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 290 295 300 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 305 310 315

Claims (26)

  1. (i) 서열 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 46에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 47에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 48에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역, 또는
    (ii) 서열 34에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 35에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 36에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 74에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 75에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역, 또는
    (iii) 서열 38에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 39에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 40에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 78에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 80에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역, 또는
    (iv) 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 영역, 및 서열 42에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 영역
    을 포함하며 조직 인자에 결합하는 항체
    를 포함하며, 여기서 상기 항체는 링커를 통해 아우리스타틴에 접합된 것인 항체 약물 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 항체가
    (i) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
    (ii) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
    (iii) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
    (iv) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
    을 포함하는 것인 항체 약물 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것인 항체 약물 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 전장 항체인 항체 약물 접합체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 완전 인간 모노클로날 IgG1 항체인 항체 약물 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 완전 인간 모노클로날 IgG1 항체가 IgG1,κ인 항체 약물 접합체.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아우리스타틴이 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)인 항체 약물 접합체.
    Figure 112018008605901-pct00025

    상기 식에서, 파상선은 링커에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아우리스타틴이 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)인 항체 약물 접합체.
    Figure 112018008605901-pct00026

    상기 식에서, 파상선은 링커에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 항-TF 항체의 (부분적) 환원에 의해 수득한 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기에 부착되는 것인 항체 약물 접합체.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커-아우리스타틴이 vcMMAF 또는 vcMMAE인 항체 약물 접합체.
    Figure 112018008605901-pct00027

    상기 식에서, p는 1 내지 8의 수를 나타내고, S는 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기를 나타내고, Ab는 항-TF 항체를 나타낸다.
  11. 제10항에 있어서, p가 3 내지 5의 수를 나타내는 것인 항체 약물 접합체.
  12. 제10항에 있어서, 링커-아우리스타틴이 제10항에 정의된 바와 같은 vcMMAE인 항체 약물 접합체.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커-접합체가 mcMMAF인 항체 약물 접합체.
    Figure 112018008605901-pct00028

    상기 식에서, p는 1 내지 8의 수를 나타내고, S는 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기를 나타내고, Ab는 항-TF 항체를 나타낸다.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 약물 접합체를 포함하는, 암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 암이 중추 신경계의 종양, 두경부암, 폐암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 삼중 음성 유방암, 식도암, 위암 또는 위장암, 간암 및 담도암, 췌장암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁내막암, 난소암, 악성 흑색종, 육종, 원인불명 원발성 기원의 종양, 골수암, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프모구성 백혈병 및 비-호지킨 림프종, 피부암, 신경교종, 뇌암, 자궁암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 췌장암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 결장직장암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 난소암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 유방암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  20. 제14항에 있어서, 전립선암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  21. 제14항에 있어서, 방광암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  22. 제14항에 있어서, 하나 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 제약 조성물.
  23. 제14항에 있어서, 화학요법제와 조합하여 사용되는 제약 조성물.
  24. 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 약물 접합체를 포함하는, 세포 사멸을 유도하거나, 또는 조직 인자를 발현하는 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하기 위한 제약 조성물.
  25. 제11항에 있어서, 링커-아우리스타틴이 vcMMAE인 항체 약물 접합체.
    Figure 112018008605901-pct00057

    상기 식에서, p는 3 내지 5의 수를 나타내고, S는 항-TF 항체의 술프히드릴 잔기를 나타내고, Ab는 항-TF 항체를 나타낸다.

  26. 삭제
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