JP2011500843A - 活性化プロテインcおよび不活性化プロテインcに対するモノクロナール抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2007年10月26日に出願された米国特許仮出願第60/983,092号の優先権の恩典を主張する。
本発明は一般に抗体の分野に関する。より具体的には、本発明は、活性化プロテインC(APC)に対して選択的に向けられるモノクロナール抗体および抗体フラグメントの同定および使用を記載する。
血液凝固とは、最終的にはフィブリン血餅を生じさせる、様々な血液成分または因子の複雑な相互作用からなるプロセスである。一般に、凝固「カスケード」に関与する血液成分は、プロ酵素または酵素原(活性化因子の作用によって活性形態に転換される酵素的に不活性なタンパク質)である。血液凝固の制御は、大きくは、活性化プロテインC(APC)によって達成される第VaおよびVIIIaプロ凝固因子のタンパク分解不活性化によって酵素的に達成される(Esmon, 1989)。
本発明は、活性化プロテインCに選択的に結合し、不活性化プロテインCには結合せず、活性化プロテインCの抗凝血活性を特異的に阻害するモノクロナール抗体の発見に関する。本発明のこれらおよび他の局面を以下さらに詳細に説明する。
抗体は、共通の構造的特徴を有する糖タンパク質の大きなファミリーを含む。抗体は、Yの文字に似た三次元構造を形成する四つのポリペプチドで構成されている。通常、抗体は二つの異なるポリペプチド、すなわち重鎖および軽鎖で構成されている。抗体分子は一つまたは複数のY単位で構成され、各Yが二つの重鎖および二つの軽鎖を含む。
本発明は、互いに「特異的に結合する」ことができる分子の製造および使用に関する。そのような結合が分子のそれぞれの構造に依存するならば、本明細書で使用される分子は、別の分子に「特異的に結合する」ことができるとされる。免疫原に結合する抗体の公知の能力が「特異的結合」の一例である。そのような相互作用は、化学構造にかかわらず化合物のクラスを含む非特異的結合(たとえば、ニトロセルロースへのタンパク質の結合など)とは対照的である。もっとも好ましくは、本発明の抗体は、近縁種の異種分子には結合することができない、または実質的に結合することができないような「高度に特異的な結合」を示す。実際、本発明の好ましいモノクロナール抗体は、活性化プロテインCに結合する能力を示すが、不活性化プロテインCには実質的に結合することができない。さらなる態様において、モノクロナール抗体は、APCのタンパク分解活性部位に結合し、それをブロックすることにより、APCの抗凝血活性のみを特異的に阻害する。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散した一つまたは複数の抗体、治療剤またはさらなる薬剤の有効量を含む。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散した抗体の有効量を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」とは、適切に動物またはヒトに投与された場合、有害、アレルギーまたは他の不都合な反応を生じさせない分子体および組成物をいう。
本明細書に記載される組成物はキットに含められることができる。したがって、キットは、適当な容器手段中に、本発明の抗体および/またはさらなる薬剤を含む。本発明者らは、キットに含めることができる他の成分を想定している。本発明の治療キットは、適当な容器手段中、薬学的に許容される製剤中の抗体の薬学的に許容される製剤を含む。キットは、一つの容器手段を有してもよいし、化合物ごとに別々の容器手段を有してもよい。
本発明の好ましい態様を実証するために以下の実施例を含める。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施において良好に働くことが本発明者らによって見いだされた技術を代表し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成すると考えられるということが当業者によって理解されよう。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示される特定の態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお、本発明の真意および範囲を逸することなく同様な結果を得ることができることを理解するはずである。
本発明のヒトmAbのスクリーニング、同定および使用の方法
材料
ヒトプロテインC、ウシトロンビンを前記のようにして調製した(Esmon et al., 1993。全体として参照により本明細書に組み入れられる)。組み換えAPC(Xigris)はEli Lillyからのものであった。Spectroxyme PCaはAmerican Diagnosticaからのものであった。1-パルミトイル-2-オレオイル−ホスファチジルコリン(PC)、1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルセリン(PS)および1-パルミトイル-2-オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(PE)はAvanti Polar Lipids, Inc.からのものであった。ヒト内皮由来EA.hy926細胞を、10%ウシ胎児血清、L-グルタミンおよびHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)で補足したDMEM(ダルベッコ修飾イーグル培地)中に維持した。Molecular Probes社のフルオレセインEXタンパク質標識キットを用いて、製造者の取り扱い説明にしたがってフルオレセイン標識APC(FL-APC)を調製した。これらの実施例において、修飾語「活性化」なしの「プロテインC」は不活性化プロテインCを指す。
ヒトプロテインCまたはAPCに対するマウスモノクロナール抗体(mAb)を標準技術(Rezaie and Esmon, 1992)によって産生した。
EA.hy926細胞へのFL-APCの結合に対するmAbのブロッキング能力をFACSによってスクリーニングすることにより、ヒトプロテインC mAb1575および1580(HPC1575およびHPC1580)を得た。簡潔にいうと、EA.hy926細胞を、0.5%BSA、3mM CaCl2および0.6mM MgCl2を含有するHBSS(ハンクス液)緩衝液中、50nM FL-プロテインCおよび100nM様々な抗プロテインCモノクロナール抗体とともに、氷上で30分間インキュベートし、FACS分析に付した。プロテインCではなくAPCへのmAbの結合能力をELISAアッセイによってスクリーニングすることにより、ヒトAPC mAb1573(HAPC1573)を得た。簡潔にいうと、96穴MaxiSorpプレート(NUNC)を、15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、pH9.6緩衝液中、5μg/ml様々なmAbで、4℃で夜通しコートした。プレートを、1mM CaCl2を含有するTTBS(0.05% Tween-20を含有するTBS)(TTBSカルシウム緩衝液)で洗浄し、TBS(20mMトリスHCl、150mM NaCl、pH7.5)中0.1%ゼラチンで1時間ブロックし、TTBSカルシウム緩衝液で再び洗浄し、TTBSカルシウム緩衝液中、100ng/mlプロテインCまたはAPCとともに1時間インキュベートした。TTBSカルシウム緩衝液で洗浄したのち、プレートを2μg/mlビオチン化HPC1580とともに1時間インキュベートし、TTBSカルシウム緩衝液で再び洗浄し、TTBSカルシウム緩衝液中、1μg/mlストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートとともにさらに1時間インキュベートした。TTBSカルシウム緩衝液で最後に洗浄し、リン酸p-ニトロフェニル液体基質(Sigma)を加えたのち、405nmでの終点吸光度をVmaxマイクロプレートリーダ上で読み取った。
このアッセイは、APCに対するmAbをスクリーニングするための前記ELISAアッセイを改変したものである。簡潔にいうと、プレートを5μg/ml HAPC1573でコートし、1×カゼインを含有するTBS(Vector Lab)でブロックし、TTBSカルシウム緩衝液で再び洗浄した。10mMベンズアミジン、1mM EDATおよび0.25×カゼイン緩衝液(希釈緩衝液)または1:4希釈ヒト血漿を含有するTTBS中、組み換えAPCを0〜8ng/mlでスパイクし、試料をプレート中で1時間インキュベートした。TTBSカルシウム緩衝液で洗浄したのち、プレートを、10mMベンズアミジン、5mM CaCl2および0.25×カゼイン緩衝液を含有するTTBS中、1ug/mlビオチン化HPC1575とともに1時間インキュベートした。TTBSカルシウム緩衝液で洗浄したのち、プレートを、10mMベンズアミジン、5mM CaCl2および0.25×カゼイン緩衝液を含有するTTBS中、0.5μg/mlストレプトアビジン−HRPとともにさらに1時間インキュベートし、TTBSカルシウム緩衝液で再び洗浄し、Ultra-TMB基質(Pierce)で発色させた。0.5M H2SO4を加えてHRP酵素反応を停止させたのち、OD405を読み取った。
EA.hy926細胞を、0.5% BSA、3mM CaCl2および0.6mM MgCl2を含有するHBSS緩衝液中、様々な濃度のHAPC1573またはHPC1575の非存在または存在において、50nM FL-APCとともに氷上で30分間インキュベートし、FACS分析に付した。
ST4凝固計(Diagnostica Stago)を使用する修飾第Xa因子1ステージ凝固アッセイにおいて、血漿中のAPC抗凝血活性に対するmAbの影響を決定した。標準アッセイにおいて、ラッセルクサリヘビ蛇毒からの第X因子活性化酵素X-CPの調節量をヒト正常プール血漿に加えて、0.1% BSAを含有するTBS中、ホスホリド小胞(最終的に10μg/mlの40% PE、20% PSおよび40% PC、w/v)とCaCl2(6.25mM)との混合物中の30s凝固時間を得た。CaCl2添加によって凝血を開始させた。CaCl2添加の前にAPC(最終200ng/ml)またはHAPC1573(最終20μg/ml)を加えた。
HBSS緩衝液(0.1%ウシ血清アルブミン、3mM CaCl2、0.6mM MgCl2を含有するHBSS)中10nM APC50μlのアミド溶解活性を、66.7nM HPC1555またはHAPC1573の非存在または存在において、50mM HEPES、100mM NaCl、pH7.5緩衝液中0〜2mM連続希釈Spectrozyme PCa50μlを加えることによって測定した。
EA.hy926細胞を、Opti-MEM培地(Invitrogen)中、100nM APCおよび200nM HAPC1573の非存在または存在において、子ウシ胸腺ヒストンH3またはH4(Roche)とともに37℃で1時間インキュベートし、そして室温で5分後、10μg/mlヨウ化プロピジウム(PI)を加えた。細胞を洗浄し、EDTA/PBSで解離させ、PI陽性染色のためにフローサイトメトリーに付した。
本発明のヒトmAbのスクリーニング、同定および使用の結果
HAPC1573は内皮におけるAPC結合を増強する
HAPC1575が内皮におけるAPC結合に影響を有するかどうかを試験するため、本発明者らは、EA.hy926細胞をFL-APCとともにHAPC1573またはHAPC1575の非存在または存在においてインキュベートし、細胞におけるFL-APCの結合をフローサイトメトリーによって計測した。フローサイトメトリーのヒストグラムは、HAPC1573は内皮細胞におけるFL-APC結合を増強するが、HPC1575は細胞におけるFL-APCの結合を阻害するということを示した(図2)。HAPC1573は内皮におけるAPC内在化を促進する。FL-APCは、APCのGlaドメインと細胞上のEPCRとの相互作用を介してEA.hy926細胞中に内在化され、この内在化は、EPCRブロック性Ab(JRK1494)またはGlaドメインブロック性Ab(HPC1575)のいずれかによってブロックされた(図3)。HAPC1573は細胞へのFL-APC内在化を促進し、この効果は、EPCRブロック性Abによって完全にブロックされた(図3)。
HAPC1573はELISAプレート上および内皮細胞上でAPCを認識したため、本発明者らは、HAPC1573が色素産生性基質に対するAPCのアミド溶解活性に影響することができるかどうかを調べた。合成ペプチド基質は通常、分子量およそ数百ダルトンの小さな分子であり、血漿中のセリンプロテアーゼに対する大部分の抗体はこれらの小さな基質に対する酵素活性に対してほとんど影響を有しない。しかし、HAPC1573は、APCの、その色素産生性基質Spectrozyme PCaに対する運動パラメータを劇的に変化させた(図4)。Spectrozyme PCaに対するAPCのkmは、Abの非存在またはHPC1555の存在における270nMと比較して、HAPC1573の存在においては15nMであった。Spectrozyme PCaに対するAPCのkcatは、Abの非存在またはHPC1555の存在における67と比較して、HAPC1573の存在においては18であった。HAPC1573の存在における小さなペプチド基質に対するAPCの甚大な変化は、このmAbがAPCの活性部位の近くのエピトープを認識し、Abと抗原との相互作用が、小さなペプチド基質に対するAPCの親和力を劇的に増大させるが、APC触媒部位からの産物のオフレートを低下させるということを示した。
図5は、HAPC1573が、第Xa因子開始1ステージ血漿凝固アッセイにおけるAPCの延長効果をほぼ完全に消滅させたことを示して、HAPC1573とAPCとの相互作用が、APCが第Va因子を開裂することを阻止したことを示唆する。
最近、本発明者らは、APCが細胞外ヒストンを開裂し、内皮をヒストンの細胞毒性から保護することができることを見いだした(原稿作成中)。HAPC1573は、色素産生性基質に対するAPCアミド溶解活性を変化させ、血漿中のAPC抗凝血活性をブロックするため、本発明者らは、このmAbが、細胞外ヒストンH3およびH4を開裂するAPCに影響し、かつ内皮におけるヒストンH3およびH4細胞毒性に対するAPC細胞保護に影響することができるかどうかを調べた。
本発明のヒトmAbのスクリーニング、同定および使用の説明
プロテインCは、内皮上のトロンボモジュリンと複合化したトロンビンによって活性化される。活性トロンビンのインビボで数秒の一過性寿命とは異なり、ヒトAPCは、その生成後、循環中で約20分の半減期を有する(Berg et al., 2003)。したがって、血漿中のAPCのレベルをうまく計測して、様々な病態生理学的条件下でのその制御を研究することができる。
本発明のマウスモノクロナール抗体のスクリーニングおよび使用の方法
材料および方法
組み換えマウスプロテインC、APC、ラットmAb MPC1609およびMAPC1591を、標準的手法にしたがって当研究室で製造した。Molecular Probes社のフルオレセインEXタンパク質標識キットを用いて、製造者の取り扱い説明にしたがってフルオレセイン標識APC(FL-APC)を調製した。
この実験では、Oklahoma Medical Research FoundationのInstitutional Aminal Care and Use Committeesによって承認された実験動物プロトコルにしたがって、6〜12週齢オスBL6マウスを使用した。
bEnd3細胞(マウス脳由来内皮細胞系)を、10%ウシ胎児血清およびL-グルタミンで補足したDMEM(ダルベッコ修飾イーグル培地)中で培養した。EA.hy926細胞(ヒト内皮細胞系)を、10%ウシ胎児血清、L-グルタミンおよびHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)で補足したDMEM中で培養した。
bEnd3細胞を、0.5%BSA、3mM CaCl2および0.6mM MgCl2を含有するHBSS緩衝液中、125nM MPC1609またはMAPC1591の非存在または存在において、100nM FL-APCとともに氷上で15分間インキュベートし、FACS分析に付した。
24穴プレート中のbEnd3細胞をHBSS緩衝液(0.1%ウシ血清アルブミン、3mM CaCl2、0.6mM MgCl2を含有するHBSS)で一度洗浄し、0.1μMプロテインCを含有するHBSS緩衝液中、0.1μM MPC1609またはMAPC1591とともに5分間プレインキュベートした。0.2mlの合計量の5nMウシトロンビンの添加によって活性化反応を開始させた。37℃で15分後、ウシ抗トロンビンIII 50μl(1.67mg/ml)を反応物に添加することによって反応を停止させた。50μl上澄みを96穴マイクロプレートに移し、プロテインCの活性化速度を、100mM NaCl、50mM HEPES-NaOH、pH7.5緩衝液中、0.4mM Spectrozyme PCa基質50μlに対して405nmのVmaxで測定した。
ST4凝固計(Diagnostica Stago)を使用する修飾第Xa因子1ステージ凝固アッセイにおいて、血漿中のAPC抗凝血活性に対するmAbの影響を決定した。このアッセイにおいては、ラッセルクサリヘビ蛇毒からの第X因子活性化酵素X-CPの調節量を、血漿(50%マウス血漿および50%ヒト正常プール血漿)に加えて、0.1%BSAを含有する20mMトリスHCl、150mM NaCl緩衝液(pH7.5)中、リン脂質小胞(最終的に10μg/mlの40%ホスファチジルエタノールアミン、20%ホスファチジルセリンおよび40%ホスファチジルコリン、w/v)とCaCl2(6.35nM)との混合物中の30s凝固時間を得た。CaCl2添加によって凝固を開始させた。CaCl2添加の前にAPC(最終200ng/ml)およびMPC1609(最終5μg/ml)またはMAPC1591(最終5μg/ml)を加えた。
EA.hy926細胞を、Opti-MEM培地(Invitrogen)中、100nM APCおよび200nM MAPC1591の非存在または存在において、50μg/ml子ウシ胸腺ヒストン(Sigma)とともに37℃で1時間インキュベートし、そして室温で5分後、10μg/mlヨウ化プロピジウム(PI)を加えた。細胞を洗浄し、PBS中0.526mM EDTAで解離させ、PI陽性染色のためにフローサイトメトリーに付した。
BUNおよびクレアチニンに関して、マウス血清をVitros 250 Chemistry Analyzer(Ortho-Clinical Diagnostics)上で分析した。Quantikine Colorimetric Sandwich ELISA(R&D Sytems)によって血清IL-6を計測した。
本発明のマウスモノクロナール抗体のスクリーニングおよび使用の結果
MPC1609は、プロテインCおよびAPCの両方に抗するものであり、内皮におけるプロテインCおよびAPC結合を阻害した(図8A。データ示さず)。MAPC1591は、APCには抗したが、プロテインCには抗せず、内皮におけるAPC結合を増強した(図8A。データ示さず)。内皮におけるプロテインC活性化は、MPC1609の存在において劇的に低下した(図8B)。MAPC1591はまた、おそらくは細胞におけるAPC結合の増強のせいで、プロテインC活性化をいくらか低下させた(図8B)。MPC1609およびMAPC1591は、いずれも、血漿凝固アッセイにおいてAPC抗凝血活性を完全に阻害した(図8C)。これらのインビトロ実験に基づいて、本発明者らは、MPC1609が、内皮またはリン脂質におけるプロテインCまたはAPCの結合の原因であるプロテインCまたはAPCのGlaドメインを隠蔽することにより、内皮またはリン脂質におけるプロテインCおよびAPC結合を阻害すると結論づけた。MAPC1591は、APCの活性部位の周囲のエピトープとの相互作用を介してAPCを認識したが、プロテインCを認識せず、この相互作用が、おそらくはAPCが第Va因子を開裂することを防ぐことによってAPC抗凝血活性を阻害した。
本発明のマウスモノクロナール抗体のスクリーニングおよび使用の説明
プロテインC経路は凝血および炎症の制御において重要な役割を演じる(Esmon, 2006)。ヒトAPCが、重篤な敗血症における死亡率を有意に減らすことが実証され、重篤な敗血症の治療のための最初の薬として認められた(Bernard et al., 2001)。しかし、敗血症におけるAPC保護効果の分子機構は未だ理解が不十分である。突然変異誘発研究は、APCの抗凝血活性が、内皮細胞に対するAPC抗アポトーシス効果にとって重要でないことは明かであり(Mosnier et al., 2004)、APCシグナル伝達の抗炎症および抗アポトーシス効果が内皮細胞中でプロテアーゼ活性化受容体1(PAR-1)媒介的である(Reiwald et al., 2002)ことを示した。しかし、PAR-1欠乏マウスは、LPS抗原投与下、その野生型対照マウスに類似した表現型を有し、APCがインビボで炎症および細胞保護を制御するためにPAR-1が重要な役割を演じないことを示唆した(Pawlinski et al., 2004, Camerer 2006)。インビボで病態生理学的機能を制御するAPCの中心的役割を与えられて、本発明者らは、マウスプロテインCおよびマウスAPCに対する二つのmAbを生成し、それら二つのmAbを使用して、マウスにおけるLPS誘発敗血症性ショックにおける、十分に理解されていないAPC保護効果の機構を探った。
Claims (39)
- 活性化プロテインCに結合し、抗凝血活性を阻害するが、不活性化プロテインCには結合しない、または不活性化プロテインCの活性化を阻害しない、モノクロナール抗体。
- 活性化プロテインCへの結合が、活性化プロテインCの活性部位で起こり、かつ活性化プロテインCの細胞保護効果を阻害しない、請求項1記載のモノクロナール抗体。
- HAPC1573としてさらに定められる、請求項1記載のモノクロナール抗体。
- 活性化または不活性化プロテインCの阻害がインビボにおいてである、請求項1記載のモノクロナール抗体。
- 活性化または不活性化プロテインCの阻害がインビトロにおいてである、請求項1記載のモノクロナール抗体。
- マウス抗体である、請求項1記載のモノクロナール抗体。
- ヒト抗体である、請求項1記載のモノクロナール抗体。
- ヒト化抗体である、請求項1記載のモノクロナール抗体。
- 抗体フラグメントである、請求項1記載のモノクロナール抗体。
- 抗体フラグメントが、Fab'、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体、FvまたはscFvとしてさらに定められる、請求項9記載のモノクロナール抗体。
- 内皮細胞プロテインC受容体(EPCR)またはリン脂質と、活性化プロテインCまたは不活性化プロテインCとの結合を阻害し、かつ不活性化プロテインCの活性化を阻害する、モノクロナール抗体。
- マウス不活性化プロテインCのGlaドメインに結合する、請求項11記載のモノクロナール抗体。
- 活性化または不活性化プロテインCの阻害がインビボにおいてである、請求項11記載のモノクロナール抗体。
- 活性化または不活性化プロテインCの阻害がインビトロにおいてである、請求項11記載のモノクロナール抗体。
- マウス抗体である、請求項11記載のモノクロナール抗体。
- ヒト抗体である、請求項11記載の抗体。
- ヒト化抗体である、請求項11記載の抗体。
- 抗体フラグメントである、請求項11記載の抗体。
- 抗体フラグメントが、Fab'、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体、FvまたはscFvとしてさらに定められる、請求項18記載の抗体。
- 請求項1記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項11記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 対象における活性化プロテインC抗凝血活性を阻害する方法であって、請求項1記載のモノクローナル抗体の有効量を該対象に投与することを含む、方法。
- 活性化プロテインCの細胞保護効果がモノクロナール抗体によって低下しない、請求項22記載の方法。
- 対象における活性化プロテインCアミド分解活性を阻害する方法であって、請求項1記載の抗体の有効量を該対象に投与することを含む、方法。
- 血液凝固を必要とする対象を治療する方法であって、請求項1記載の抗体の有効量を該対象に投与することを含む、方法。
- 血液凝固を必要とする対象を治療する方法であって、請求項11記載の抗体の有効量を該対象に投与することを含む、方法。
- 敗血症を病む対象を治療する方法であって、請求項1記載の抗体の有効量を投与することを含む、方法。
- 活性化プロテインCの投与をさらに含む、請求項27記載の方法。
- 敗血症を病む対象を治療する方法であって、請求項11記載の抗体の有効量を投与することを含む、方法。
- 活性化プロテインCの投与をさらに含む、請求項29記載の方法。
- 血友病を病む対象を治療する方法であって、請求項1記載の抗体の有効量を投与することを含む、方法。
- 血友病を病む対象を治療する方法であって、請求項11記載の抗体の有効量を投与することを含む、方法。
- 対象における止血を調節する方法であって、請求項1記載の抗体の有効量を投与することを含む、方法。
- 対象が外傷患者である、請求項33記載の方法。
- 対象における止血を調節する方法であって、請求項11記載の抗体の有効量を投与することを含む、方法。
- 対象が外傷患者である、請求項35記載の方法。
- 対象における血栓症を調節する方法であって、請求項1記載の抗体の有効量を投与することを含む、方法。
- 対象における血栓症を調節する方法であって、請求項11記載の抗体の有効量を投与することを含む、方法。
- 不活性化プロテインCの活性化を阻害する方法であって、請求項11記載のモノクロナール抗体の有効量を対象に投与することを含む、方法。
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