CN104487457B - 靶组织特异性抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明人等发现，通过发明包含抗原结合活性依赖于靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子，可以解决上述课题。通过使用本申请发明的抗原结合分子，可以靶组织特异性地治疗起因于靶组织的各种疾病。

Description

靶组织特异性抗原结合分子
技术领域
本发明提供：包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子、该抗原结合分子的制造方法和筛选方法、以及包含该抗原结合分子的药物组合物。
背景技术
抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因此作为药品而受到关注。其中，有多种IgG型的抗体药物已上市，目前还有多种抗体药物正在开发中（非专利文献1、和非专利文献2）。
作为使用了抗体药物的癌治疗药，迄今为止针对CD20抗原的利妥昔单抗（Rituxan）、针对EGFR抗原的西妥昔单抗（cetuximab）、针对HER2抗原的赫赛汀（herceptin）等已得到认可（非专利文献3）。这些抗体分子与表达于癌细胞的抗原结合，通过ADCC等发挥对癌细胞的伤害活性。已知这种基于ADCC等的细胞毒性依赖于表达于治疗用抗体的靶细胞的抗原的数目（非专利文献4），因此从治疗用抗体的效果的观点出发，优选作为靶的抗原的表达量高。但是，即使抗原的表达量高，若抗原表达于正常组织，则会对正常细胞发挥ADCC等的伤害活性，因而造成副作用大的问题。因此，作为癌治疗药的治疗用抗体的靶抗原优选特异性地表达于癌细胞。例如，针对已知作为癌抗原的EpCAM抗原的抗体分子被认为有望作为癌治疗药，但已知EpCAM抗原在胰腺也有表达，实际上据报道，在临床试验中，通过给予抗EpCAM抗体，由于对胰腺的细胞毒性，观察到了胰腺炎的副作用（非专利文献5）。
获得发挥基于ADCC活性的细胞毒性的抗体药物的成功后，报道了通过下述等而发挥强效的细胞毒性的第二代的改良抗体分子：通过除去天然型人IgG1的Fc区的N型糖链的岩藻糖而实现的ADCC活性的增强（非专利文献6）、通过天然型人IgG1的Fc区的氨基酸替换而增强对FcγRIIIa的结合所实现的ADCC活性的增强（非专利文献7）等。作为通过上述的NK细胞介导的ADCC活性以外的机制而对癌细胞发挥伤害活性的抗体药物，还报道了通过下述等而发挥强效的细胞毒性的改良分子抗体：将具有强效的细胞毒性的药物与抗体形成缀合物的Antibody Drug Conjugate（ADC）（非专利文献8）、和通过将T细胞补充至癌细胞而发挥对癌细胞的伤害活性的低分子抗体（非专利文献9）等。
如此发挥强效细胞毒性的抗体分子即使对抗原的表达不多的癌细胞也可发挥细胞毒性，另一方面，对抗原的表达少的正常组织却也同样地发挥细胞毒性。实际上，与针对EGFR抗原的天然型人IgG1即西妥昔单抗相比，针对CD3和EGFR的双特异性抗体即EGFR-BiTE通过将T细胞补充至癌细胞而对癌细胞发挥强效的细胞毒性，从而可发挥抗肿瘤效果。另一方面，EGFR在正常组织中也有表达，因此在将EGFR-BiTE给予食蟹猴时也确认到出现了严重的副作用（非专利文献10）。另外，使针对癌细胞中大量表达的CD44v6的抗体与mertansine结合而成的ADC即bivatuzumab mertansine，由于CD44v6在正常组织中也有表达，因而在临床上观察到严重的皮肤毒性和肝毒性（非专利文献11）。
如此，在使用对抗原的表达少的癌细胞也可以发挥强效的细胞毒性的抗体时，需要靶抗原高度癌特异性地表达，但如赫赛汀的靶抗原即HER2或西妥昔单抗的靶抗原即EGFR在正常组织中也有表达那样，认为高度癌特异性地表达的癌抗原的数目是有限的。因此，虽然能够强化对癌的细胞毒性，但对正常组织的细胞毒性作用导致的副作用也成为问题。
另外，最近，通过抑制有助于癌中的免疫抑制的CTLA4而增强肿瘤免疫的易普利姆玛（ipilimumab）对转移性黑素瘤显示出总存活期的延长（非专利文献12）。然而由于易普利姆玛全身性地抑制CTLA4，因而虽然肿瘤免疫得到增强，但显示全身性地免疫受到活化所致的自身免疫疾病样的严重副作用却成为问题（非专利文献13）。
另一方面，作为针对癌以外的疾病的抗体药物，已知在炎性・自身免疫疾病中通过抑制炎性细胞因子来发挥治疗效果的抗体药物（非专利文献14）。还已知，例如以TNF作为靶的Remicade或Humira、以及以IL-6R为靶的Actemra虽然对风湿性关节炎发挥高的治疗效果，但另一方面，由于全身性地中和这些细胞因子而观察到感染疾病的副作用（非专利文献15）。
作为可适用于第二代抗体药物的技术，开发有各种技术，报道了使效应功能、抗原结合能力、药物动力学、稳定性提高，或者使免疫原性风险降低的技术等（非专利文献16），但基本没有报道用于解决如上所述的副作用的、能够靶组织特异性地使抗体药物作用的技术。例如，对于癌组织或炎性组织之类的病变部位，报道有利用了这些靶组织中的pH为酸性条件的pH依赖性抗体（专利文献1、和2）。然而，癌组织或炎性组织中的相比于正常组织的pH的降低（即氢离子浓度的上升）很小，检测分子量极小的氢离子的浓度的微小上升而作用的抗体的制作困难，同时破骨细胞骨吸收区等正常组织或对象病变以外的组织中也有pH为酸性条件的情形，将pH的条件作为对病变部位特异性的环境因子来利用被认为还具有许多问题。另一方面，报道有通过被在癌组织或炎性组织之类的病变部位表达的蛋白酶切断从而开始发挥抗原结合活性的抗体的制作方法（专利文献3）。但是，利用蛋白酶的抗体的切断是不可逆的，因此在该病变部位被切断的抗体随着血流返回到正常组织，在正常组织中也可以与抗原结合，这被认为是问题。另外，认为这样的蛋白酶的癌特异性方面也存在问题。因此，还不知道为了在避免副作用的同时发挥药效而在正常组织或血液中不全身性地作用，在作为病变部位的癌或炎性部位中可逆性地作用那样的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 : 国际公开第WO2003/105757号
专利文献2 : 国际公开第WO2012/033953号
专利文献3 : 国际公开第WO2010/081173号
非专利文献
。
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明是鉴于上述情况而完成的发明，其目的在于提供对起因于靶组织的疾病的治疗有用的药物组合物、及其有效成分。另外，还在于提供该药物组合物和该有效成分的筛选方法以及制造方法。
用于解决技术问题的方法
本发明人等为了实现上述目的而进行了深入研究，结果创造了包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子。此外，本发明人等发现该抗原结合分子或含有该抗原结合分子的药物组合物对起因于靶组织的疾病的治疗有用，同时还发现对包括给予该抗原结合分子的起因于靶组织的疾病的治疗有用,和在用于起因于靶组织的疾病的治疗的药物的制造中该抗原结合分子有用。此外，本发明人等创造了该抗原结合分子的筛选方法和制造方法，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述：
（1）抗原结合分子，其包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域；
（2）（1）所述的抗原结合分子，其中，靶组织是癌组织；
（3）（2）所述的抗原结合分子，其中，前述癌组织特异性化合物是癌细胞特异性代谢产物、浸润于癌组织的免疫细胞特异性代谢产物、癌组织的基质细胞特异性代谢产物；
（4）（1）所述的抗原结合分子，其中，靶组织是炎性组织；
（5）（4）所述的抗原结合分子，其中，前述炎性组织特异性化合物是浸润于炎性组织的免疫细胞特异性代谢产物、在炎性组织中受到伤害的正常细胞特异性代谢产物；
（6）（1）所述的抗原结合分子，其中，前述靶组织特异性代谢产物是选自下述中的至少一种化合物：具有嘌呤环结构的核苷、氨基酸及其代谢产物、脂质及其代谢产物、糖代谢的一次代谢产物、烟酰胺及其代谢产物；
（7）（6）所述的抗原结合分子，其中，前述靶组织特异性代谢产物是选自下述中的至少一种化合物：腺苷、三磷酸腺苷、肌苷、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、犬尿氨酸、前列腺素E2、琥珀酸、柠檬酸、或1-甲基烟酰胺；
（8）（1）至（7）中任一项所述的抗原结合分子，其中，抗原是膜型分子；
（9）（1）至（8）中任一项所述的抗原结合分子，其是具有中和活性的抗原结合分子；
（10）（1）至（9）中任一项所述的抗原结合分子，其是具有细胞毒性的抗原结合分子；
（11）（1）至（10）中任一项所述的抗原结合分子，其包含Fc区；
（12）（11）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区是SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区；
（13）（11）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区包括FcγR结合改变Fc区，该FcγR结合改变Fc区的Fcγ受体结合活性比天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高；
（14）（13）所述的抗原结合分子，其中，前述FcγR结合改变Fc区的氨基酸序列中，选自以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位或440位中的至少一个以上的氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸；
（15）（14）所述的抗原结合分子，其中，前述FcγR结合改变Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸：
222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一者，
223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一者，
224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一者，
225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一者，
227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者，
228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者，
230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一者，
231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一者，
232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者，
233位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
234位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
235位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
236位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
237位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
238位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
239位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一者，
241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一者，
243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一者，
244位的氨基酸为His，
245位的氨基酸为Ala，
246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一者，
247位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中的任一者，
249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一者，
250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一者，
251位的氨基酸为Phe，
254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一者，
255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一者，
256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一者，
258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一者，
260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一者，
262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一者，
263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一者，
264位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
265位的氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一者，
267位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
268位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中的任一者，
269位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
270位的氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
271位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
272位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一者，
274位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一者，
276位的氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
278位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一者，
279位的氨基酸为Ala，
280位的氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中的任一者，
281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一者，
282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一者，
283位的氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中的任一者，
284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一者，
285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一者，
286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一者，
288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一者，
290位的氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一者，
292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一者，
293位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
294位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
295位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
296位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一者，
297位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
298位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
299位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一者，
300位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一者，
301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一者，
302位的氨基酸为Ile，
303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一者，
304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一者，
305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一者，
313位的氨基酸为Phe，
315位的氨基酸为Leu，
317位的氨基酸为Glu或Gln，
318位的氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中的任一者，
320位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
322位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
323位的氨基酸为Ile，
324位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
325位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
326位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
327位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
328位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
329位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
330位的氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
331位的氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
332位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
333位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中的任一者，
334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一者，
335位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一者，
336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一者，
337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一者，
339位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中的任一者，
376位的氨基酸为Ala或Val中的任一者，
377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一者，
378位的氨基酸为Asp，
379位的氨基酸为Asn，
380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一者，
382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一者，
385位的氨基酸为Glu，
392位的氨基酸为Thr，
396位的氨基酸为Leu，
421位的氨基酸为Lys，
427位的氨基酸为Asn，
428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一者，
429位的氨基酸为Met，
434位的氨基酸为Trp，
436位的氨基酸为Ile、或者
440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一者；
（16）（11）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区是以结合于Fc区的EU编号297位的糖链的组成中结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例变高的方式、或添加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区的比例变高的方式进行了修饰的Fc区；
（17）（11）、（13）至（16）中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区的在pH酸性范围条件下的FcRn结合活性与SEQ ID NO:5、6、7或8中任一者所示的Fc区的FcRn结合活性相比增强；
（18）（17）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区是在SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位中的至少一个以上的氨基酸被替换的Fc区；
（19）（18）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区在SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸：
238位的氨基酸为Leu，
244位的氨基酸为Leu，
245位的氨基酸为Arg，
249位的氨基酸为Pro，
250位的氨基酸为Gln或Glu中的任一者，或者
251位的氨基酸为Arg、Asp、Glu、或Leu中的任一者，
252位的氨基酸为Phe、Ser、Thr、或Tyr中的任一者，
254位的氨基酸为Ser或Thr中的任一者，
255位的氨基酸为Arg、Gly、Ile、或Leu中的任一者，
256位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、或Thr中的任一者，
257位的氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中的任一者，
258位的氨基酸为Asp，
260位的氨基酸为Ser，
262位的氨基酸为Leu，
270位的氨基酸为Lys，
272位的氨基酸为Leu、或Arg中的任一者，
279位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中的任一者，
283位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中的任一者，
285位的氨基酸为Asn，
286位的氨基酸为Phe，
288位的氨基酸为Asn、或Pro中的任一者，
293位的氨基酸为Val，
307位的氨基酸为Ala、Glu、Gln、或Met中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser 、Val、或Trp中的任一者，
309位的氨基酸为Pro，
312位的氨基酸为Ala、Asp、或Pro中的任一者，
314位的氨基酸为Ala或Leu中的任一者，
316位的氨基酸为Lys，
317位的氨基酸为Pro，
318位的氨基酸为Asn、或Thr中的任一者，
332位的氨基酸为Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中的任一者，
339位的氨基酸为Asn、Thr、或Trp中的任一者，
341位的氨基酸为Pro，
343位的氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中的任一者，
375位的氨基酸为Arg，
376位的氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中的任一者，
377位的氨基酸为Lys，
378位的氨基酸为Asp、Asn、或Val中的任一者，
380位的氨基酸为Ala、Asn、Ser、或Thr中的任一者
382位的氨基酸为Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
385位的氨基酸为Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中的任一者，
386位的氨基酸为Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中的任一者，
387位的氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中的任一者，
389位的氨基酸为Asn、Pro、或Ser中的任一者，
423位的氨基酸为Asn，
427位的氨基酸为Asn，
428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中的任一者
430位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
431位的氨基酸为His、或Asn中的任一者，
433位的氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中的任一者，
434位的氨基酸为Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中的任一者，
436位的氨基酸为Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、或Thr中的任一者，
438位的氨基酸为Lys、Leu、Thr、或Trp中的任一者，
440位的氨基酸为Lys、或者，
442位的氨基酸为Lys、308位的氨基酸为Ile、Pro、或Thr中的任一者；
（20）（1）至（19）中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域为多特异性或多互补位的抗原结合结构域；
（21）（20）所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域中，至少一个抗原结合结构域所结合的抗原是表达于癌细胞的细胞膜的膜型分子，和至少一个抗原结合结构域所结合的抗原是表达于效应细胞的细胞膜的膜型分子；
（22）（21）所述的抗原结合分子，其中，前述效应细胞是NK细胞、巨噬细胞、或T细胞；
（23）（21）或（22）所述的抗原结合分子，其中，表达于前述效应细胞的细胞膜的膜型分子是构成TCR的多肽、CD2、CD3、CD28、CD44、CD16、CD32、CD64、或NKG2D；
（24）（20）所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域中，至少一个抗原结合结构域所结合的抗原是表达于癌细胞的细胞膜的膜型分子、和至少一个抗原结合结构域所结合的抗原是细胞毒性物质；
（25）（20）至（24）中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合分子是抗体片段；
（26）（1）至（24）中的任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合分子是抗体；
（27）（1）至（7）中任一项所述的抗原结合分子，其中，抗原是可溶型分子；
（28）（27）所述的抗原结合分子，其是具有中和活性的抗原结合分子；
（29）（27）或（28）所述的抗原结合分子，其包含Fc区；
（30）（29）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区是SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区；
（31）（29）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区的在pH酸性范围条件下的FcRn结合活性与SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区的FcRn结合活性相比增强；
（32）（31）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区是在SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区的氨基酸序列中，选自以EU编号表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位中的至少一个以上的氨基酸被替换的Fc区；
（33）（32）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区在SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上氨基酸：
238位的氨基酸为Leu，
244位的氨基酸为Leu，
245位的氨基酸为Arg，
249位的氨基酸为Pro，
250位的氨基酸为Gln或Glu中的任一者，或者
251位的氨基酸为Arg、Asp、Glu、或Leu中的任一者，
252位的氨基酸为Phe、Ser、Thr、或Tyr中的任一者，
254位的氨基酸为Ser或Thr中的任一者，
255位的氨基酸为Arg、Gly、Ile、或Leu中的任一者，
256位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、或Thr中的任一者，
257位的氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中的任一者，
258位的氨基酸为Asp，
260位的氨基酸为Ser，
262位的氨基酸为Leu，
270位的氨基酸为Lys，
272位的氨基酸为Leu、或Arg中的任一者，
279位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中的任一者，
283位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中的任一者，
285位的氨基酸为Asn，
286位的氨基酸为Phe，
288位的氨基酸为Asn、或Pro中的任一者，
293位的氨基酸为Val，
307位的氨基酸为Ala、Glu、Gln、或Met中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser 、Val、或Trp中的任一者，
309位的氨基酸为Pro，
312位的氨基酸为Ala、Asp、或Pro中的任一者，
314位的氨基酸为Ala或Leu中的任一者，
316位的氨基酸为Lys，
317位的氨基酸为Pro，
318位的氨基酸为Asn、或Thr中的任一者，
332位的氨基酸为Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中的任一者，
339位的氨基酸为Asn、Thr、或Trp中的任一者，
341位的氨基酸为Pro，
343位的氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中的任一者，
375位的氨基酸为Arg，
376位的氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中的任一者，
377位的氨基酸为Lys，
378位的氨基酸为Asp、Asn、或Val中的任一者，
380位的氨基酸为Ala、Asn、Ser、或Thr中的任一者
382位的氨基酸为Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
385位的氨基酸为Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中的任一者，
386位的氨基酸为Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中的任一者，
387位的氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中的任一者，
389位的氨基酸为Asn、Pro、或Ser中的任一者，
423位的氨基酸为Asn，
427位的氨基酸为Asn，
428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中的任一者
430位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
431位的氨基酸为His、或Asn中的任一者，
433位的氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中的任一者，
434位的氨基酸为Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中的任一者，
436位的氨基酸为Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、或Thr中的任一者，
438位的氨基酸为Lys、Leu、Thr、或Trp中的任一者，
440位的氨基酸为Lys、或者，
442位的氨基酸为Lys、308位的氨基酸为Ile、Pro、或Thr中的任一者；
（34）（29）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区的在pH中性范围条件下的FcRn结合活性与SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区的FcRn结合活性相比增强；
（35）（34）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区是在SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位或436位中的至少一个以上的氨基酸被替换的Fc区；
（36）（35）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区在SEQ ID NO:5、6、7或8中记载的恒定区所含的Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上氨基酸：
237位的氨基酸为Met，
248位的氨基酸为Ile，
250位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
252位的氨基酸为Phe、Trp、或Tyr中的任一者，
254位的氨基酸为Thr，
255位的氨基酸为Glu，
256位的氨基酸为Asp、Asn、Glu、或Gln中的任一者，
257位的氨基酸为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val中的任一者，
258位的氨基酸为His，
265位的氨基酸为Ala，
286位的氨基酸为Ala或Glu中的任一者，
289位的氨基酸为His，
297位的氨基酸为Ala，
303位的氨基酸为Ala，
305位的氨基酸为Ala，
307位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
308位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr中的任一者，
309位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、His、或Ile中的任一者，
312位的氨基酸为Ala或His中的任一者，
314位的氨基酸为Lys或Arg中的任一者，
315位的氨基酸为Ala、Asp或His中的任一者，
317位的氨基酸为Ala，
332位的氨基酸为Val，
334位的氨基酸为Leu，
360位的氨基酸为His，
376位的氨基酸为Ala，
380位的氨基酸为Ala，
382位的氨基酸为Ala，
384位的氨基酸为Ala，
385位的氨基酸为Asp或His中的任一者，
386位的氨基酸为Pro，
387位的氨基酸为Glu，
389位的氨基酸为Ala或Ser中的任一者，
424位的氨基酸为Ala，
428位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
433位的氨基酸为Lys，
434位的氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中的任一者，或者
436位的氨基酸为His 、Ile、Leu、Phe、Thr、或Val；
（37）（29）或（31）至（36）中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区是抑制型Fcγ受体结合活性比活性型Fcγ受体结合活性高的Fc区；
（38）（37）所述的抗原结合分子，其中，前述抑制型Fcγ受体是人FcγRIIb；
（39）（37）或（38）所述的抗原结合分子，其中，前述活性型Fcγ受体是人FcγRIa、人FcγRIIa（R）、人FcγRIIa（H）、人FcγRIIIa（V）或人FcγRIIIa（F）；
（40）（37）至（39）中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区的以EU编号表示的238位或328位的氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸；
（41）（40）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区的以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、或328位的氨基酸为Glu；
（42）（40）或（41）所述的抗原结合分子，其中，前述Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上氨基酸：
233位的氨基酸为Asp，
234位的氨基酸为Trp、或Tyr中的任一者，
237位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp或Tyr中的任一者，
239位的氨基酸为Asp，
267位的氨基酸为Ala、Gln或Val中的任一者，
268位的氨基酸为Asn、Asp、或Glu中的任一者，
271位的氨基酸为Gly，
326位的氨基酸为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Leu、Met、Ser或Thr中的任一者，
330位的氨基酸为Arg、Lys、或Met中的任一者，
323位的氨基酸为Ile、Leu、或Met中的任一者，或者
296位的氨基酸为Asp；
（43）（27）至（42）中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合分子是抗体；
（44）（1）至（43）中任一项所述的抗原结合分子的制造方法，其包括选择抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域；
（45）（1）至（43）中任一项所述的抗原结合分子的筛选方法，其包括选择抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域；
（46）药物组合物，其包含（1）至（43）中任一项所述的抗原结合分子。
附图说明
[图1] 是示出在低分子不存在的正常环境中低分子开关抗体（Small moleculeswitch antibody）不与抗原结合，而在低分子以高浓度存在的靶组织中与抗原结合的图。
[图2] 是示出通过夹在低分子抗体与抗原的复合体中，低分子发挥开关功能的图。低分子若不存在则抗体与抗原的相互作用变得不充分，抗体无法与抗原结合，但若低分子存在则通过夹在抗体与抗原之间，抗体变得可以与抗原结合。
[图3] 是示出抗体对人IL-6的结合ELISA的结果的图。纵轴是通过各低分子的有无来评价各抗体对人IL-6的结合活性的吸光度的值。
[图4] 是100μmol/L 犬尿氨酸存在下、非存在下的A11与4μmol/L人IL-6的相互作用的传感图。
[图5] 是评价将1μmol/L的IL-6作为分析物而进行60秒钟相互作用时的、对固定化于传感器芯片CM5上的A11的结合的应答的变化的图。纵轴表示IL-6相互作用前后的应答的变化（RU）、横轴表示此时的溶液中所含的犬尿氨酸浓度（μmol/L）。
[图6] 是评价将1μmol/L的IL-6作为分析物而进行60秒钟相互作用时的、对固定化于传感器芯片CM5上的H01的应答的图。纵轴表示IL-6相互作用前后的应答的变化（RU）、横轴表示此时的溶液中所含的犬尿氨酸浓度（μmol/L）。
[图7] 是评价将0.1μmol/L的A11作为分析物而进行60秒钟相互作用时的、对固定化于传感器芯片CM5上的IL-6的应答的图。纵轴表示A11相互作用前后的应答的变化（RU）、横轴表示溶液中所含的犬尿氨酸浓度（μmol/L）。
[图8] 是在100μmol/L 犬尿氨酸存在下使A11与固定化于传感器芯片CM5的IL-6相互作用，然后在含有100μmol/L 犬尿氨酸的缓冲液或不含犬尿氨酸的缓冲液的条件下观察A11从IL6解离的图。图的纵轴表示将100μmol/L 犬尿氨酸存在下的A11的结合量设为100而进行标准化得到的值，横轴表示相互作用开始后的经过时间（秒）。
[图9] 是使800, 400, 200, 100, 50, 25 nmol/L的犬尿氨酸与固定化于传感器芯片上的IL-6相互作用时所得的传感图。纵轴表示犬尿氨酸相对于IL-6的结合量的变化（RU）（将相互作用实验开始时的应答设为0），横轴表示相互作用实验开始时起的经过时间。
[图10] 是示出对兔的免疫中使用的腺苷类似物2'-腺苷-PEG- 肽的结构的图。
[图11] 是示出对兔的免疫中使用的腺苷类似物5'-腺苷-PEG- 肽的结构的图。
[图12] 是示出将对兔的免疫中使用的腺苷类似物的肽部分替换为生物素得到的2'-腺苷-PEG-生物素的结构的图。
[图13] 是示出将对兔的免疫中使用的腺苷类似物的肽部分替换为生物素得到的5'-腺苷-PEG-生物素的结构的图。
[图14] 是将使各抗体与2'-腺苷-PEG-生物素相互作用时的结合量除以各抗体的捕获量（RU）得到的值（N_结合_100）表示为纵轴，将在2'-腺苷-PEG-生物素的相互作用后2'-腺苷-PEG-生物素从各抗体解离60秒后的值除以各抗体的捕获量（RU）得到的值（N_稳定性_100）表示为横轴的图。
[图15A] 是示出克隆SMB0002与腺苷结合（相互作用）的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从下方起依次表示7.81、31.3、125、500 nM的抗原与SMB0002的相互作用。
[图15B] 是示出克隆SMB0002与ATP结合（相互作用）的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从下方起依次表示78.1、313、1250、5000 nM的抗原与SMB0002的相互作用。
[图15C] 是示出克隆SMB0089与腺苷结合（相互作用）的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从下方起依次表示7.81、31.3、125、500 nM的抗原与SMB0089的相互作用。
[图15D] 是示出克隆SMB0089与ATP结合（相互作用）的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从下方起依次表示78.1、313、1250、5000 nM的抗原与SMB0089的相互作用。
[图15E] 是示出克隆SMB0104与腺苷结合（相互作用）的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从下方起依次表示7.81、31.3、500 nM的抗原与SMB0104的相互作用。
[图15F] 是示出克隆SMB0104与ATP结合（相互作用）的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从下方起依次表示78.1、313、1250、5000 nM的抗原与SMB0104的相互作用。
[图16] 是示出克隆SMB0171与ATP结合（相互作用）的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从下方起依次表示5、50 μM的抗原与SMB0171的相互作用。
[图17] 是示出克隆SMB0002与腺苷和ATP结合的竞争ELISA的结果的图。
[图18] 是评价ATP对ATNLSA1-4_D12的生物素标记抗原（5'-腺苷-PEG-生物素,ATP-PEG-生物素的混合）结合的抑制能力的图。
[图19] 是示出腺苷或ATP夹在抗体与抗原之间，使与抗原接触的抗体可变区部分形成文库，从而相对于任意抗原均能获得腺苷/ATP开关抗体的合理设计抗体文库的概念的图。
[图20] 是示出腺苷或ATP夹在抗体与抗原之间，相对于任意抗原均能获得腺苷/ATP开关抗体的腺苷免疫兔抗体文库的概念的图。
[图21] 是示出抗体对人IL-6的结合ELISA的结果的图。纵轴表示用450nm波长的吸光度的值表示的、基于氨基酸和氨基酸代谢物（犬尿氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、邻氨基苯甲酸、和3-羟基犬尿氨酸、犬尿酸）的有无的各抗体对人IL-6的结合活性。
[图22] 是示出抗体对人IL-6的结合ELISA的结果的图。纵轴表示用由450nm波长的吸光度算出的比活性的值表示的、基于各低分子（ATP、腺苷、肌苷、PGE2、琥珀酸、乳酸、犬尿氨酸、低分子cocktail）的有无的I6NMSC1-3_#03抗体对人IL-6的结合活性。
[图23] 是示出抗体对人IL-6的结合ELISA的结果的图。纵轴表示用由450nm波长的吸光度算出的比活性的值表示的、基于各低分子（ATP、腺苷、肌苷、PGE2、琥珀酸、乳酸、犬尿氨酸、低分子cocktail）的有无的I6NMSC1-3_#17抗体对人IL-6的结合活性。
[图24] 是示出抗体对HSA的结合ELISA的结果的图。纵轴表示用450nm波长的吸光度的值表示的、基于各低分子（ATP、腺苷、肌苷、PGE2、琥珀酸、乳酸、犬尿氨酸、低分子cocktail）的有无的HSNMSC1-4_#22抗体对HSA的结合活性。
[图25] 是示出由合理设计抗体文库所得的克隆I6DL2C5-4_076对人IL-6的ATP和/或腺苷 1 mM的存在/非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体对人IL-6的结合活性的吸光度的值。阴性对照（Negative Control）表示使用M13KO7 辅助噬菌体时的结果。
[图26] 是示出由合理设计抗体文库所得的克隆HSDL3C5-4_015对人血清白蛋白的ATP和/或腺苷 1 mM的存在/非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体对人血清白蛋白的结合活性的吸光度的值。阴性对照（Negative Control）表示使用M13KO7 辅助噬菌体时的结果。
[图27] 是示出由合理设计抗体文库所得的克隆6RAD2C1-4_011、和6RAD2C1-4_076对人IL-6 受体的ATP和/或腺苷（记载为ADO） 1 mM的存在或非存在下、以及低分子cocktail（SC）的存在或非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体对人IL-6 受体的结合活性的吸光度的值。阴性对照（Negative Control）表示使用M13KO7 辅助噬菌体时的结果。
[图28] 是示出克隆6RNMSC1-2_F02对人IL-6R的结合ELISA的结果的图。纵轴是通过各低分子的有无来评价抗体对人IL-6R的结合活性的吸光度的值。
[图29] 是示出克隆6RNMSC1-3_G02对人IL-6R的结合ELISA的结果的图。纵轴是通过各低分子的有无来评价抗体对人IL-6R的结合活性的吸光度的值。
[图30] 是示出抗体对人IL-6R的结合ELISA的结果的图。纵轴是通过各氨基酸或者氨基酸代谢物的有无来评价抗体对人IL-6R的结合活性的吸光度的值。
[图31] 是100μmol/L 犬尿氨酸存在下、10 mmol/L ATP存在下、犬尿氨酸、ATP非存在下的6RNMSC1-2_F02与1μmol/L IL-6R的相互作用的传感图。实线表示犬尿氨酸存在下的相互作用，虚线表示ATP存在下的相互作用，和点线表示它们非存在下的相互作用。
[图32] 是在100μmol/L 犬尿氨酸存在下使6RNMSC1-2_F02与固定化于传感器芯片CM5的IL-6R相互作用，然后在含有100μmol/L 犬尿氨酸的缓冲液或不含犬尿氨酸的缓冲液条件下观察6RNMSC1-2_F02从IL-6R解离的图。图的纵轴表示将100 μmol/L 犬尿氨酸存在下的6RNMSC1-2_F02的结合量设为100而进行标准化得到的值，横轴表示相互作用开始后的经过时间（秒）。实线表示犬尿氨酸存在下的6RNMSC1-2_F02从IL-6R解离，虚线表示犬尿氨酸非存在下的6RNMSC1-2_F02从IL-6R解离。
[图33] 是评价将5μg/L的6RNMSC1-2_F02作为分析物而进行180秒钟相互作用时的、对固定化于传感器芯片CM5上的IL-6R的应答的图。纵轴表示6RNMSC1-2_F02相互作用前后的应答的变化（RU），横轴表示溶液中所含的犬尿氨酸浓度（μmol/L）。
[图34] 是示出用FCM评价抗体对膜型人IL-6R的结合的图。上段是犬尿氨酸存在下的结果，下段是犬尿氨酸非存在下的结果。横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞数。
[图35A] 是示出在低分子存在下与抗原结合的抗体对表达抗原的细胞的ADCC活性的图。是示出在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合的克隆6RNMSC1-2_F02在犬尿氨酸存在下（三角）或非存在下（圆形）的对表达hIL-6R的BaF细胞的ADCC活性的图。白色表示各自的测定值，黑色表示平均值。
[图35B] 是示出在低分子存在下与抗原结合的抗体对表达抗原的细胞的ADCC活性的图。是示出无论有无犬尿氨酸均与hIL-6R结合的MRA在犬尿氨酸存在下（三角）或非存在下（圆形）的对表达hIL-6R的BaF细胞的ADCC活性的图。白色表示各自的测定值，黑色表示平均值。
[图36] 是示出在低分子存在下与抗原结合的抗体对表达抗原的细胞的ADCC活性的图。是示出在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合的克隆6RNMSC1-2_F02的存在下（三角）或非存在下（圆形）的克隆6RNMSC1-2_F02对表达hIL-6R的BaF细胞的ADCC活性的图。横轴表示犬尿氨酸浓度，纵轴表示ADCC活性（%）。ADCC活性表示平均值与标准偏差。
[图37] 是示出克隆6RNMSC1-2_F02在小鼠血清中对人IL-6R的结合ELISA的结果的图。纵轴是通过犬尿氨酸的有无来评价抗体与人IL-6R的结合活性的吸光度的值。
[图38] 是示出由合理设计抗体文库所得的克隆I6RLSA1-6_011对人IL-6的ATP和腺苷 10 mM的存在或非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体对人IL-6的结合活性的吸光度的值。阳性对照（Positive Control）表示使用由合理设计抗体文库所得的、示出不管有无低分子的对人IL-6的结合活性的克隆时的结果。阴性对照（Negative Control）表示使用M13KO7 辅助噬菌体时的结果。
[图39] 是示出由合理设计抗体文库所得的克隆6RRLSA1-6_037、6RRLSA1-6_045对人IL-6受体的ATP和腺苷 10 mM的存在或非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体对人IL-6 受体的结合活性的吸光度的值。阴性对照（Negative Control）表示使用M13KO7辅助噬菌体时的结果。
[图40] 是示出对于合理设计抗体文库利用抗体多价展示噬菌体展示针对人IgA-Fc实施4次淘选而得的96克隆的ELISA的结果的图。纵轴是评价在ATP和腺苷非存在下的抗体对人IgA-Fc的结合活性的吸光度的值，横轴是评价在ATP和腺苷存在下的抗体对人IgA-Fc的结合活性的吸光度的值。
[图41] 是示出对于合理设计抗体文库利用抗体单价展示噬菌体展示针对人IgA-Fc实施4次淘选而得的96克隆的ELISA的结果的图。纵轴是评价在ATP和腺苷非存在下的抗体对人IgA-Fc的结合活性的吸光度的值，横轴是评价在ATP和腺苷存在下的抗体对人IgA-Fc的结合活性的吸光度的值。
[图42] 是示出由合理设计抗体文库所得的克隆IADL3C5-4_048对人IgA-Fc的ATP和腺苷 1 mM的存在或非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体对人IgA-Fc的结合活性的吸光度的值。阳性对照（Positive Control）表示使用由合理设计抗体文库所得的、示出不管有无低分子的对人IgA-Fc的结合活性的克隆时的结果。阴性对照（NegativeControl）表示使用M13KO7 辅助噬菌体时的结果。
[图43] 是示出在各低分子1 mM存在下・非存在下使各克隆1 μM与固定化于传感器芯片CM5上的IL-6R相互作用120秒钟时的结合量(结合应答(Binding response)(RU))的图。
[图44A] 是示出在低分子存在下与抗原结合的抗体对表达抗原的细胞的ADCC活性的图。是示出在ATP存在下与hIL-6R结合的克隆6RAD2C1-4_030在ATP存在下（三角）或非存在下（圆形）的对表达hIL-6R的CHO细胞的ADCC活性的图。白色表示各自的测定值，黑色表示平均值。
[图44B] 是示出在低分子存在下与抗原结合的抗体对表达抗原的细胞的ADCC活性的图。是示出在ATP存在下与hIL-6R的克隆6RAD2C1-4_011在ATP存在下（三角）或非存在下（圆形）的对表达hIL-6R的CHO细胞的ADCC活性的图。白色表示各自的测定值，黑色表示平均值。
[图44C] 是示出在低分子存在下与抗原结合的抗体对表达抗原的细胞的ADCC活性的图。是示出无论有无ATP均与hIL-6R结合的MRA在ATP存在下（三角）或非存在下（圆形）的对表达hIL-6R的CHO细胞的ADCC活性的图。白色表示各自的测定值，黑色表示平均值。
[图45] 是示出由合理设计抗体文库所得的克隆HSADSA1-6_020对HSA的ATP和腺苷 10 mM的存在或非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体对HSA的结合活性的吸光度的值。阳性对照（Positive Control）表示使用由合理设计抗体文库所得的、示出不管有无低分子的对HSA的结合活性的克隆时的结果。阴性对照（Negative Control）表示使用M13KO7 辅助噬菌体时的结果。
具体实施方式
以下的定义和详细说明被提供用于容易地理解本说明书中说明的本发明。
氨基酸
本说明书中，例如，如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所示，氨基酸用单字母密码或三字母密码、或其两者来标记。
氨基酸的改变
为了改变抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可以适宜采用位点特异性突变诱变法（Kunkel等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））或重叠延伸 PCR等公知的方法。此外，作为替换为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸的改变方法，还可采用多种公知的方法（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例如，还适宜使用无细胞翻译系统（Clover Direct（Protein Express））等，该系统在作为终止密码子之一的UAG密码子（琥珀密码子）的互补性琥珀抑制基因tRNA中包含结合有非天然氨基酸的tRNA。
本说明书中，表示氨基酸的改变位点时所用的“和/或”一词的含义包括“和”和“或”适宜组合的所有组合。具体地，例如“33位、55位、和/或96位的氨基酸被替换”包含以下的氨基酸改变的突变；
(a) 33位、(b)55位、(c)96位、(d)33位和55位、(e)33位和96位、(f)55位和96位、(g)33位和55位和96位。
此外，本说明书中，作为表示氨基酸的改变的表述，也可以适宜使用在表示特定位置的数字的前后同时记有改变前与改变后的氨基酸的单字母密码或三字母密码的表述。例如，在加入抗体可变区所含的氨基酸的替换时所使用的N100bL或Asn100bLeu这一改变表示将以Kabat编号表示的100b位的Asn替换成Leu。即，数字表示以Kabat编号表示的氨基酸的位置，记载于其之前的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示替换前的氨基酸，记载于其之后的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示替换后的氨基酸。相同地，在抗体恒定区所含的Fc区加入氨基酸的替换时所使用的P238D或Pro238Asp这一改变表示将以EU编号表示的238位的Pro替换成Asp。即，数字表示以EU编号表示的氨基酸的位置，记载于其之前的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示替换前的氨基酸，记载于其之后的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示替换后的氨基酸。
抗原
本说明书中，“抗原”只要含有抗原结合结构域所结合的表位，则其结构并不限于特定的结构。就另外的意义而言，抗原可以是无机物也可以是有机物。作为抗原，可例示如下述的分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1 腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子（BlyS）、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3 成骨素（Osteogenin）、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a、OP-2）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、BRK-2、RPK-1、BMPR-II（BRK-3）、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3（C3）、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原（CEA）、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33（p67蛋白）、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80（B7-1）、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、半乳凝素-9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子（衰变促进因子）、脱（1-3）-IGF-I（脑IGF-1）、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR（ErbB-1）、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxin 1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白（FAP）、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵胞激素、断裂因子、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3（Vgr-2）、GDF-5（BMP-14、CDMP-1）、GDF-6（BMP-13、CDMP-2）、GDF-7（BMP-12、CDMP-3）、GDF-8（肌肉生长抑制素）、GDF-9、GDF-15（MIC-1）、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原（NP-cap或NIP-cap）、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子（HGF）、Hep B gp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu（ErbB-2）、Her3（ErbB-3）、Her4（ErbB-4）、单纯疱疹病毒（HSV） gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原（HMW-MAA）、HIV gp120、HIV IIIBgp 120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒（HCMV）、人生长激素（HGH）、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干扰素（INF）-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5（αV）、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子（KGF）、层连蛋白5、LAMP、LAP、LAP（TGF-1）、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC（HLA-DR）、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白（Muc1）、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C粘附因子、NCA 90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素-3、神经营养素-4、或神经营养素-6、Neurturin、神经生长因子（NGF）、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶（PLAP）、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原（PSMA）、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒（RSV）F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72（肿瘤相关糖蛋白-72）、TARC、TCA-3、T细胞受体（例如，T细胞受体α/β）、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β 泛特异性（泛特异性的TGF-β）、TGF-βRI（ALK-5）、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（TRAIL R1 Apo-2、DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B）、TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2、TRUNDD）、TNFRSF11A（RANK ODF R、TRANCE R）、TNFRSF11B（OPG OCIF、TR1）、TNFRSF12（TWEAK R FN14）、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFFR）、TNFRSF14（HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR AITR）、TNFRSF19（TROY TAJ、TRADE）、TNFRSF19L（RELT）、TNFRSF1A（TNF RICD120a、p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b、p75-80）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（LTbRTNF RIII、TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35、TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50）、TNFRSF6（FasApo-1、APT1、CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68、TR6）、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF8（CD30）、TNFRSF9（4-1BB CD137、ILA）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（DcTRAIL R2 TNFRH2）、TNFRST23（DcTRAILR1 TNFRH1）、TNFRSF25（DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1）、TNFSF10（TRAIL Apo-2配体、TL2）、TNFSF11（TRANCE/RANK配体 ODF、OPG配体）、TNFSF12（TWEAK Apo-3配体、DR3配体）、TNFSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20）、TNFSF14（LIGHTHVEM配体、LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITR配体 AITR配体、TL6）、TNFSF1A（TNF-a黏附素（Conectin）、DIF、TNFSF2）、TNFSF1B（TNF-b LTa、TNFSF1）、TNFSF3（LTb TNFC、p33）、TNFSF4（OX40配体 gp34、TXGP1）、TNFSF5（CD40配体 CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP）、TNFSF6（Fas配体 Apo-1配体、APT1配体）、TNFSF7（CD27配体 CD70）、TNFSF8（CD30配体CD153）、TNFSF9（4-1BB配体 CD137配体）、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TLR(Toll-like receptor)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达Lewis-Y相关碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1（flt-1）、VEGF、VEGFR、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、冯维勒布兰德因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG、Hsp90, IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL, PCSK9, 激肽释放酶原, RON, TMEM16F、SOD1, 嗜铬粒蛋白 A, 嗜铬粒蛋白B、tau, VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a,C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, 因子 B, 因子 D, 因子 H, 备解素、硬骨素（sclerostin）、纤维蛋白原, 纤维蛋白, 凝血酶原, 凝血酶, 组织因子, 因子V, 因子 Va, 因子 VII, 因子 VIIa, 因子 VIII, 因子 VIIIa, 因子 IX, 因子 IXa, 因子 X, 因子 Xa, 因子 XI, 因子 XIa, 因子 XII, 因子 XIIa, 因子 XIII, 因子 XIIIa,TFPI, 抗凝血酶 III, EPCR, 血栓调节蛋白、TAPI, tPA, 纤溶酶原, 纤溶酶, PAI-1,PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、LPA、S1P以及用于激素和生长因子的受体。作为抗原，优选为癌组织或炎性组织中的癌细胞・免疫细胞・基质细胞等中表达的抗原。
在上述抗原的例示中还记载有受体，但在这些受体以可溶型存在于生物体液中的情形中，也可以作为本发明的包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子所结合的抗原而使用。作为这样的可溶型受体的非限定的一个方案，例如可例示，由Mullberg等（J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968）记载的作为可溶型IL-6R的、由SEQ ID NO:1所示的IL-6R多肽序列中第1至第357位氨基酸构成的蛋白。
上述抗原的例示中还包含表达于细胞膜的膜型分子、和由细胞分泌到细胞外的可溶型分子。本发明的包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子结合于由细胞分泌的可溶型分子时，作为该抗原结合分子，优选如后所述具有中和活性。
对于可溶型分子所存在的溶液没有限定，该可溶型分子可以存在于生物体液、即充满生物体内的脉管或组织・细胞空间的所有的液体。在非限定的一个方案中，本发明的抗原结合分子所结合的可溶型分子可以存在于细胞外液。就脊椎动物而言，细胞外液是指血浆、组织间液、淋巴液、致密的结缔组织、脑脊髓液、髓液、穿刺液、或关节液等骨和软骨中的成分、肺泡液(支气管肺泡清洗液)、腹水、胸水、心包液、囊内液、或眼房水(房水)等细胞透过液(细胞的主动输送・分泌活动的结果产生的各种腺腔内的液体、和消化道管腔等其他体腔内液)的总称。
本发明的包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子与表达于细胞膜的膜型分子结合时，作为该抗原结合分子的优选实例，可举出如后所述具有细胞毒性的抗原结合分子、或者结合细胞毒性物质的抗原结合分子或具有结合细胞毒性物质的能力的抗原结合分子。此外，替代具有细胞毒性、或者结合细胞毒性物质或具有结合细胞毒性物质的能力的性质，或除了该性质之外，还具有中和活性的抗原结合分子也可优选举出作为非限定的一个方案。
表位
表示存在于抗原中的抗原决定簇的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。因此，例如，表位能够通过其结构来定义。此外，也可以通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原的结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来规定表位。另外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来规定表位。
线性表位是下述表位，其包含氨基酸一级序列得到识别的表位。线性表位在固有序列中典型地含有至少3个、和最普通含有至少5个、例如约8至约10个、6至20个氨基酸。
与线性表位相对地，立体结构表位是下述表位，含有表位的氨基酸的一级序列并不是被识别的表位的单一规定成分（例如，氨基酸的一级序列不需被规定表位的抗体所识别的表位）。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白的三维结构。例如，蛋白分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链变得并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法包括例如：X射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology (1996)、第66卷、Morris（编）。
与表位结合的抗原结合结构域的结构被称为互补位。表位和互补位通过在表位和互补位之间发生作用的氢键、静电力、范德华力、疏水键等稳定地结合。该表位与互补位之间的结合力被称为亲和力（affinity）。多个抗原与多个抗原结合分子结合时的结合力的总和被称为亲合力（avidity）。包含多个抗原结合结构域的（即多价的）抗体等与多个表位结合时，结合力（affinity）协同地发挥作用，因此亲合力比亲和力高。
结合活性
下述例示了通过含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法，但通过含有针对IL-6R以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法也可基于下述例示而适宜实施。
例如，含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别存在于IL-6R分子中的线性表位，可通过例如如下所述的操作来确认。为了上述目的，合成了包含构成IL-6R的细胞外结构域的氨基酸序列的线性的肽。该肽可以化学合成。或者，可以利用IL-6R的cDNA中的编码与细胞外结构域相当的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。接着，对包含构成细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽、和含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化的线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该该抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合中的、线性肽所致的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。
此外，含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别立体结构表位可以如下所述来确认。为了上述目的，制备了表达IL-6R的细胞。可举出：含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子在与IL-6R表达细胞接触时与该细胞强结合，但该抗原结合分子与经固定化的包含构成IL-6R细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽实质上不结合的情形等。这里，实质上不结合是指对人IL-6R表达细胞的结合活性的80%以下、通常50%以下、优选30%以下、特别优选15%以下的结合活性。
作为测定包含针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性的方法，可举出例如，Antibodies A Laboratory Manual中记载的方法（EdHarlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420）。即，可通过以IL-6R表达细胞作为抗原的ELISA或FACS（fluorescence activated cell sorting）的原理来进行评价。
在ELISA形式中，对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达细胞的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测多肽复合体添加至固定有IL-6R表达细胞的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体，检出与细胞结合的被测抗原结合分子。或者在FACS中，制作被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于IL-6R表达细胞的抗体结合效价（titer），由此可以比较被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性。
被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测出。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM （均为BD Biosciences公司的商品名）
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC（均为Beckman Coulter公司的商品名）。
例如，作为包含针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的优选测定方法的一例，可举出下述方法。首先，将表达IL-6R的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二抗染色。将被测抗原结合分子用适宜的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10 ng/ml之间的任意浓度使用。接着，通过FACSCalibur（BD公司）测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST Software（BD公司）进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。
含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否与某抗原结合分子共有表位，可通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优先的交叉阻断试验。
具体地，在交叉阻断试验中，涂布于微量滴定板的孔上的IL-6R蛋白质在候选竞争抗原结合分子的存在下、或非存在下经孵育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IL-6R蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对涂布有IL-6R蛋白质的孔的结合活性越降低。
经由IL-6R蛋白质而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶结合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标记物质进行标记。具体地，公知的是放射标记或荧光标记等。
与在候选竞争抗原结合分子复合体的非存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20%、优选至少20-50%、进一步优选至少50%的含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位、或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。
在鉴定含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位，能够通过比较两抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。
作为这种测定结合活性的方法，例如，在前述ELISA形式中，可通过比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
另外，鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位可通过以下方法来评价。首先，制备表达IL-6R的细胞、和表达在表位中导入了突变的IL-6R的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，用合适的缓冲液洗涤，向所得细胞悬浮液添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur（BD公司）来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备为所期望的浓度来使用。例如，以10μg/ml至10 ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELLQUEST Software（BD公司）进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即、通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。
本方法中，例如“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变IL-6R的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的FACSCalibur时，所得的荧光强度可以使用CELL QUEST Software进行分析。由多肽复合体存在下和非存在下的几何平均值，通过下述式1计算该比较值（ΔGeo-Mean），由此可以求出抗原结合分子的结合造成的荧光强度的增加比例。
（式1）
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean（多肽复合体存在下）/Geo-Mean（多肽复合体非存在下）。
将通过解析得到的反映被测抗原结合分子对突变IL-6R表达细胞的结合量的算术平均比较值（突变IL-6R分子ΔGeo-Mean值）、与反映被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变IL-6R表达细胞和IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备为相互相同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别IL-6R中的表位的抗原结合分子被用作对照抗原结合分子。
被测抗原结合分子相对于突变IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值只要小于被测抗原结合分子相对于IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值的至少80%、优选50%、进一步优选30%、特别优选15%，则认为“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”。计算Geo-Mean值（算术平均）的计算式记载于CELL QUEST Software User's Guide（BD biosciences公司）。通过对比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。
靶组织
本说明书中所用的术语“靶组织”是指包含存在有本发明的抗原结合分子以化合物依赖性的方式结合的抗原的细胞的组织，是指该抗原结合分子与表达于该细胞的膜型分子的结合、或与存在于该组织的可溶型分子的结合对包含该组织的机体带来正的药理作用的组织。此时，“正的药理作用”是指包含靶组织的病理部位对包含该组织的机体造成的症状的减轻、缓和、改善、或治愈的作用。作为带来这种药理作用的非限定性机制的一个方案，例如，在癌等恶性肿瘤所造成的症状的情形中，可例示针对癌细胞的细胞毒性和增殖抑制以及癌组织中免疫活化等。作为这种非限定性机制的一个方案，例如，在炎性疾病的情形中，可例示炎性组织中的炎性细胞因子的作用的阻断活性和免疫抑制等。
癌组织特异性化合物
本说明书中所用的术语“癌组织特异性化合物（癌组织特异性化合物）”是指与非癌组织相比在癌组织中差异地存在的化合物。本说明书中，术语“癌”通常用于表示恶性新生物，其可以是转移性或非转移性。例如，作为由消化道、皮肤等上皮组织产生的癌症的非限定性实例，可例示：脑肿瘤、皮肤癌、头颈部癌、食道癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、乳腺癌、前立腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肝癌、大肠癌、结肠癌、膀胱癌、和卵巢癌等。此外，作为由肌肉等非上皮性组织（间质）产生的肉瘤的非限定性实例，可例示：骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、和血管肉瘤等。进而，作为来源于造血器官的血液肿瘤的非限定性实例，可例示：包括霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma）和非霍奇金淋巴瘤（non Hodgkin's lymphoma）的恶性淋巴瘤、包括急性髓细胞性白血病（acutemyelocytic leukemia）或慢性髓细胞性白血病（chronic myelocytic leukemia）、和急性淋巴性白血病（acute lymphatic leukemia）或慢性淋巴性白血病（chronic lymphaticleukemia）的白血病、以及多发性骨髓瘤（multiple myeloma）。本说明书中广泛使用的术语“新生物”还意指新产生任何病理组织肿瘤。本发明中，新生物引起肿瘤的形成，其部分地以血管形成为特征。新生物可以是良性，例如血管瘤、神经胶质瘤、畸胎瘤等，或者是恶性，例如癌肿瘤、肉瘤、胶质细胞瘤、星状胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤等。
术语“癌组织”意指含有至少一种癌细胞的组织。因此，例如癌组织含有癌细胞和血管那样，其是指有助于含有癌细胞和内皮细胞的肿瘤（tumor mass）的形成的所有的细胞型。本说明书中，肿瘤是指肿瘤组织病灶（a foci of tumor tissue）。术语“肿瘤”通常用于意指良性新生物或恶性新生物。
例如，在数个实施方式中，癌组织特异性化合物可以是由存在于癌组织但不存在于非癌组织中、或者不存在于癌组织但存在于非癌组织中等定性的癌组织特异性所规定的化合物。在其它实施方式中，癌组织特异性化合物可以是由以与非癌组织相比为不同浓度（例如，高浓度或低浓度）存在于癌组织中等定量的癌组织特异性所规定的化合物。例如，癌组织特异性化合物以任意的浓度差异地存在。但通常，癌组织特异性化合物可以以增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍、或其以上、直至无限大（即不存在于非癌组织中的情形）的浓度存在；或者通常可以以减少至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或直至至少100%（即，表示不存在）的浓度存在。优选癌组织特异性化合物以统计学上显著的浓度（即，以使用Welch's t检验或Wilcoxon秩和检验中的任一者来确定的方式，p值为小于0.05和/或q值为小于0.10）差异地存在。作为癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，可例示下述化合物，其是如下所述的癌组织所含的癌细胞、免疫细胞、基质细胞中通过特有的代谢活性所产生的癌组织特异性的代谢产物（癌组织特异性代谢产物；癌细胞特异性代谢产物、浸润于癌组织的免疫细胞特异性的代谢产物、癌基质细胞特异性代谢产物）。
癌组织特异性代谢产物
术语“代谢”是指在生物的组织内产生的化学变化，包括“同化”和“异化”。同化是指分子的生物合成或蓄积，异化是指分子的分解。“代谢产物”是起因于物质代谢的中间体或产物。“一次代谢产物”是指与细胞或生物的成长或者繁殖的过程直接相关的代谢产物；“二次代谢产物”是指与它们的成长或者繁殖的过程不直接相关，而是生物合成与细胞或生物中共同的生命现象不直接相关的物质的代谢结果所产生的抗生素或色素等产物。代谢产物可以是“生物高分子”的代谢产物，也可以是“低分子”的代谢产物。“生物高分子”是包含一种以上的重复单元的高分子。生物高分子通常见于生物系统，可举出：形成生物的细胞和粘附于其的细胞间基质、组织间基质等形成结构物的分子量为大约5000以上的分子，特别是多糖类（碳水化物等）和肽（该术语以包括多肽和蛋白的方式使用）和多核苷酸、同样地它们的类似物、例如由氨基酸类似物或者非氨基酸基团构成的化合物或者含有氨基酸类似物或者非氨基酸基团的化合物。“低分子”是指存在于机体的“生物高分子”以外的天然的化学物质。作为本说明书中记载的非限定的一个方案的癌组织特异性代谢产物，可优选举出癌细胞特异性的低分子代谢产物（Eva Gottfried, Katrin Peter and Marina P. Kreutz,From Molecular to Modular Tumor Therapy (2010) 3 (2), 111-132）。进而，也包括浸润于癌组织的免疫细胞所大量产生的代谢产物或支持癌细胞的生存和/或成长的基质细胞（癌基质细胞或癌间质成纤维细胞（CAF））所大量产生的代谢产物。作为浸润的免疫细胞，可例示树突细胞、抑制性树突细胞、抑制性T细胞、耗竭性T细胞（exhausted T cell）、骨髄系来源的抑制细胞（myeloma derived suppressor cell、MDSC）等。此外，本发明的代谢产物中还包括存在于癌组织的细胞（癌细胞、免疫细胞、基质细胞）由于凋亡、坏死等而发生细胞死亡时从细胞内释放至细胞外的化合物。
为了鉴定癌细胞特异性代谢产物，除了转录组水平上的分析（例如，例示有Dhanasekaran等（Nature (2001) 412, 822-826）、Lapointe等（Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. (2004) 101, 811-816）或Perou等（Nature (2000) 406, 747-752等）或者蛋白质组水平上的分析（例如，Ahram等（Mol. Carcinog. (2002) 33, 9-15、Hood等（Mol. Cell.Proteomics (2005) 4, 1741-1753）之外，还适宜使用以代谢学分析为中心的代谢学（Metabolomics）分析。即，为了鉴定被测试样中的代谢产物，可以使用将高压液相色谱（HPLC）、核磁共振（NMR）（Brindle等（J. Mol. Recognit. (1997) 10, 182-187）、质谱法（Gates和Sweeley（Clin. Chem. (1978) 24, 1663-1673）（GC/MS和 LC/MS））和ELISA等单独和/或组合使用的代谢学分析。
通过这些研究阐明了，因改变使癌细胞能够在低的氧压条件下生长的代谢产物（例如葡萄糖或氧）和生长因子的浓度梯度而构成的肿瘤内的异质性（Dang和Semenza（Trends Biochem. Sci. (1999) 24, 68-72））。这些研究中，为了理解肿瘤的恶性度的不同程度所致的能量利用通路的变化，而使用了细胞株模型（Vizan等（Cancer Res. (2005)65, 5512-5515）。作为代谢学平台技术的构成要素的非限定的一个方案，例示有Lawton等（Pharmacogenomics (2008) 9, 383）中记载的试样提取、分离、检出、分光分析、数据标准化、类特异性代谢产物的描述、通路测绘、确认、和候补代谢产物的功能性表征。通过这些方法可以鉴定所期望的癌组织中的癌细胞特异性代谢产物。
作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、或癌组织特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出选自以下化合物中的至少一种化合物。至少一种化合物意指后述相同的抗原结合结构域的抗原结合活性除了依赖于一种癌组织特异性化合物、或癌组织特异性代谢产物的情形，还包括依赖于多种癌组织特异性化合物、或癌组织特异性代谢产物的情形。
（1）乳酸、琥珀酸、柠檬酸等糖酵解系统、或克雷伯氏循环的一次代谢产物
作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出在乳酸、琥珀酸、柠檬酸等与存在于周围的非癌部组织相比在癌组织中以高浓度存在的葡萄糖代谢的结果生成的一次代谢产物。一直以来，已知表征为丙酮酸激酶、己糖激酶、和乳酸脱氢酶（LDH）等糖酵解系统（Embden-Myerhof通路）酶的向上调节（上调）的糖酵解系统表现型作为瓦伯格效应是实体瘤的特征。
即，在肿瘤细胞中，认为并非M1同种型而是在厌氧条件下的糖酵解（erobicglycolysis）所需的M2同种型的丙酮酸激酶的高表达对于机体内的肿瘤细胞的生长起有利作用（Christofk等（Nature (2008) 452, 230-233）。由丙酮酸激酶生成的丙酮酸受到乳酸的反馈抑制，该乳酸是厌氧条件下的乳酸脱氢酶（LDH）的平衡反应的结果生成的。据称通过该反馈抑制引起线粒体中的呼吸（克雷伯氏循环）的促进、和细胞增殖抑制，因此LDH、己糖激酶、和葡萄糖转运体（GLUT）的向上调节对于肿瘤细胞的增殖起到重要的作用（Fantin等（Cancer Cell (2006) 9, 425-434））。葡萄糖通过糖酵解系统而代谢，其最终代谢产物乳酸与质子一起被共同输送至肿瘤的周围，结果据说肿瘤周边组织的pH变化为酸性条件。已知糖酵解系统的最终产物乳酸、因线粒体中的呼吸的促进而生成的琥珀酸和柠檬酸在癌组织中蓄积（Teresa等（Mol. Cancer (2009) 8, 41-59））。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出通过这样的糖酵解系统的代谢而生成的一次代谢产物即乳酸、琥珀酸、柠檬酸等。此外，还已知由于细胞死亡，在细胞内以高浓度存在的琥珀酸漏出至细胞外（Nature Immunology, (2008) 9,1261-1269）。因此认为在细胞死亡频繁发生的癌组织中，琥珀酸的浓度会上升。
（2）丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸
已知除了上述的葡萄糖代谢以外，在需要连续供给厌氧条件下的生物高分子的生物合成所需的必需氨基酸和非必需氨基酸的肿瘤细胞中，氨基酸代谢也变化。谷氨酰胺是在其侧链含有二个氮的作为氮转运体作用的在机体中最广泛地分布的氨基酸。谷氨酰胺向细胞内摄入的速度上升的肿瘤细胞据称作为谷氨酰胺陷阱（glutamine trap）发挥作用。这种谷氨酰胺的摄入和向谷氨酸和乳酸转换的活性的上升被称作“谷氨酰胺分解（glutaminolysis）”，被认为是经转化的（肿瘤）细胞的特征（Mazurek和Eigenbrodt（Anticancer Res. (2003) 23, 1149-1154、以及Mazurek等（J. Cell. Physiol. (1999)181, 136-146））。其结果，癌患者表现出血浆中谷氨酰胺的水平的减少，同时表现出谷氨酸浓度的增大（Droge等（Immunobiology (1987) 174, 473-479）。继而，通过肺癌组织的经13C放射标记的葡萄糖的代谢研究，在13C标记琥珀酸、13C标记丙氨酸、13C标记谷氨酸、和13C标记柠檬酸的浓度间观察到相关。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，优选可举出通过这种谷氨酰胺分解等而在癌组织中以高浓度蓄积的丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等。
（3）犬尿氨酸（kynurenine）等氨基酸的代谢产物
吲哚胺2, 3-双加氧酶（IDO）是在黑素瘤、结肠癌、和肾癌等许多的癌中高表达的色氨酸代谢酶（Uyttenhove等（Nat. Med. (2003) 9, 1269-127），已知存在二个同种型（Lob等（CancerImmunol. Immunother. (2009) 58, 153-157））。IDO催化色氨酸向犬尿氨酸（化1所示）转换，是烟酰胺核苷酸（NAD）的从头合成通路的最初的酶。此外，在不表达IDO的神经胶质瘤中，通过肝脏的色氨酸2, 3-双加氧酶（TDO）而由色氨酸生成犬尿氨酸（Opitz等（Nature (2011) 478, 7368, 197-203））。另外IDO在浸润于癌组织的树突细胞中也有表达，树突细胞也会产生犬尿氨酸（J. Immunol. (2008) 181, 5396-5404）。另外，IDO在癌组织的骨髄系来源的抑制细胞（MDSC）中也有表达，MDSC也会产生犬尿氨酸（Yu等（J.Immunol. (2013) 190, 3783-3797））。
[化1]
。
已知犬尿氨酸抑制同种T细胞应答（Frumento等（J. Exp. Med. (2002) 196,459-468），并且提倡下述机制，其中，肿瘤细胞通过上述抑制避开抗肿瘤免疫应答，同时通过犬尿氨酸作为表达于神经胶质瘤的芳烃受体的内源性配体发挥作用的自分泌增殖机制，神经胶质瘤细胞的增殖得到促进（Opitz等（上述））。犬尿氨酸通过犬尿氨酸酶转变为邻氨基苯甲酸（[化2]所示），并通过犬尿氨酸3-羟化酶转变为3-羟基犬尿氨酸（[化3]所示）。邻氨基苯甲酸、和3-羟基犬尿氨酸均转变为形成NAD的前体的3-羟基邻氨基苯甲酸。
[化2]
。
[化3]
。
犬尿氨酸通过犬尿氨酸氨基转移酶转变为犬尿酸（[化4]所示）。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出这种犬尿氨酸、及其代谢产物，即邻氨基苯甲酸、3-羟基犬尿氨酸、和犬尿酸等氨基酸的代谢产物。
[化4]
。
（4）前列腺素E2（Prostaglandin E2）等花生四烯酸的代谢产物
前列腺素E2（PGE2）（[化5]）是被称作包含由环氧合酶（COX）-1/2合成的前列腺素和血栓烷的前列腺素类的花生四烯酸的代谢物（Warner和Mitchell（FASEB J. (2004) 18,790-804））。促进PGE2结肠癌细胞的增殖，并抑制其凋亡（Sheng等（Cancer Res. (1998)58, 362-366））。 已知在许多癌细胞中，环氧合酶的表达是变化的。即，主要发现COX-1几乎在所有的组织中构成性地表达，与之相对，COX-2在肿瘤中通过某种炎性细胞因子和癌基因诱导（Warner和Mitchell（前述））。还报道了COX-2的过表达与乳腺癌的预后不良（Denkert等（Clin. Breast Cancer (2004) 4, 428-433）、和卵巢癌的急速疾病进行（Denker等（Mod. Pathol. (2006) 19, 1261-1269）有关联性。另外，浸润于癌组织的抑制性T细胞也产生前列腺素E2（Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223）。已知花生四烯酸的代谢物的前列腺素、白细胞三烯等低分子作为控制癌的自分泌和/或旁分泌性增殖的刺激因子起作用（Nat. Rev. Cancer (2012) 12 (11) 782-792）。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物或浸润于癌组织的免疫细胞特异性代谢物的非限定的一个方案，优选可举出这种前列腺素E2等花生四烯酸的代谢产物。除了前列腺素E2以外，血栓烷A2 (TXA2)在大肠癌等癌组织中的产生亢进（J. Lab. Clin. Med. (1993) 122,518-523），可作为本发明的花生四烯酸的代谢产物的非限定的一个方案而优选举出。
[化5]
。
（5）腺苷、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）等具有嘌呤环结 构的核苷
已知若癌细胞发生细胞死亡则细胞内的大量ATP会漏出至细胞外。因此，癌组织中的ATP浓度与正常组织相比显著地高（PLoS One. (2008) 3, e2599）。多种类型的细胞会释放ATP、ADP和AMP类型的腺嘌呤核苷酸。经由细胞外-5'-核苷酸酶（eco-5'-nucleotidase）（CD73）之类的细胞表面的细胞外酶代谢（Resta和Thompson（Immunol. Rev. (1998) 161,95-109）以及Sadej等（Melanoma Res. (2006) 16, 213-222）。腺苷是以低浓度在细胞外环境构成性地存在的嘌呤核苷，在发现于实体癌的低氧组织中，报道了细胞外腺苷浓度的显著增加（Blay和Hoskin（Cancer Res. (1997) 57, 2602-2605）。CD73表达于肿瘤和免疫细胞的表面（Kobie等（J. Immunol. (2006) 177, 6780-6786），在乳腺癌（Canbolat等（Breast Cancer Res. Treat. (1996) 37, 189-193）、胃癌（Durak等（Cancer Lett.(1994) 84, 199-202）、胰腺癌（Flocke和Mannherz（Biochim. Biophys. Acta (1991)1076, 273-281）和成胶质细胞瘤（Bardot等（Br. J. Cancer (1994) 70, 212-218））中观察到活性的上升。癌组织中的腺苷的蓄积被提出可能起因于细胞质的5'-核苷酸酶所致的AMP的脱磷酸引起的细胞内腺苷生成的增加（Headrick和Willis（Biochem. J. (1989)261, 541-550）。进而，浸润于癌组织的抑制性T细胞等也表达ATP分解酶，从而产生腺苷（Proc. Natl. Acad. Sci. (2006) 103 (35), 13132-13137、Curr. Med. Chem. (2011)18, 5217-5223）。认为产生的腺苷通过A2A受体等腺苷受体而使癌组织成为免疫抑制性环境（Curr. Med. Chem. (2011),18,5217-23）。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢在癌组织中以高浓度蓄积的ATP、ADP、AMP、或腺苷等。进而，腺苷通过腺苷脱氨酶分解为肌苷，因而肌苷以高浓度蓄积。
（6）尿酸
尿酸是机体内的嘌呤核苷的代谢通路的产物，且被释放至血液或间质腔等细胞外。此外，近年来明确了其由存在于癌组织等病变部位的死细胞所释放（Nat. Med. (2007)13, 851-856）。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，还优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢而在癌组织中以高浓度蓄积的尿酸。
（7）1-甲基烟酰胺
已知在多个人癌组织中，酶烟酰胺N-甲基转移酶有高表达。本酶由烟酰胺产生稳定代谢物1-甲基烟酰胺时，会消耗作为甲基供体的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基，因此提出通过伴随癌细胞中SAM浓度的减少的损害DNA的甲基化能力的机制，烟酰胺N-甲基转移酶的高表达有助于肿瘤化（tumorigenesis）（Ulanovskaya等（Nat. Chem. Biol. (2013) 9 (5)300-306））。已知本酶的稳定代谢产物1-甲基烟酰胺分泌至癌细胞的细胞外（Yamada等（J.Nutr. Sci. Vitaminol. (2010) 56, 83-86）），作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，还优选可举出通过这种烟酰胺的代谢而在癌组织以高浓度蓄积的1-甲基烟酰胺等。
炎性组织特异性化合物
本说明书中所用的术语“炎性组织特异性化合物（炎性组织特异性化合物）”是指与非炎性组织相比在炎性组织中差异地存在的化合物。本说明书中，“炎性组织”优选可例示：
类风湿性关节炎或骨关节炎中的关节
支气管哮喘或COPD中的肺（肺泡）
炎性肠疾病、克罗恩氏病或溃疡性大肠炎中的消化器官
肝脏、肾脏、肺的纤维化病中的纤维化组织
发生了脏器移植中的排斥反应的组织
动脉硬化或心力衰竭中的血管、心脏（心肌）
代谢综合征中的内脏脂肪
脂溢性皮炎等皮炎中的皮肤组织
椎间盘突出或慢性腰痛中的脊髄神经
等。
炎性组织特异性代谢产物
炎性组织特异性代谢产物是指浸润于炎性组织的免疫细胞所大量产生的代谢产物、以及在炎性组织中受到伤害的正常细胞所特异性地大量产生的代谢产物。作为浸润的免疫细胞，例示有效应T细胞、成熟树突细胞、嗜中性粒细胞、颗粒细胞（肥大细胞）、嗜碱性粒细胞等。此外，本发明的代谢产物中还包括存在于炎性组织的细胞（免疫细胞、正常细胞）由于凋亡、坏死等而发生细胞死亡时从细胞内释放至细胞外的化合物。
作为本发明中所使用的炎性组织特异性化合物、或炎性组织特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出选自以下化合物中的至少一种化合物。至少一种化合物意指后述相同的抗原结合结构域的抗原结合活性除了依赖于一种炎性组织特异性化合物、或炎性组织特异性代谢产物的情形，还包括依赖于多种炎性组织特异性化合物、或炎性组织特异性代谢产物的情形。
（1）前列腺素E2（Prostaglandin E2）等花生四烯酸的代谢产物
已知PGE2浓度在类风湿性关节炎或变形性关节症中高（Eur. J. Clin.Pharmacol. (1994) 46, 3-7.、Clin. Exp. Rheumatol. (1999) 17, 151-160、Am. J.Vet. Res. (2004) 65, 1269-1275.）。作为本发明中所使用的炎性组织特异性化合物、特别是炎性细胞特异性代谢产物或浸润于炎性组织的免疫细胞特异性代谢物的非限定的一个方案，优选可举出这种前列腺素E2等花生四烯酸的代谢产物。
（2）腺苷、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）等具有嘌呤环结 构的核苷
已知ATP浓度在发生了起因于支气管哮喘的炎症的肺泡中高（Nat. Med. (2007)13, 913-919）。此外，还已知ATP浓度在发生了起因于COPD的炎症的肺泡中高（Am. J.Respir. Crit. Care Med. (2010) 181, 928-934）。此外，还观察到腺苷浓度在类风湿性关节炎患者的关节液中高（Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2004) 36 877-882）。进而还已知ATP浓度在由GVHD引起了排斥反应的组织中高（Nat.Med. (2010) 16, 1434-1438）。此外还已知腺苷浓度在肺、肝脏、肾脏的纤维化组织中增大（FASEB J. (2008) 22, 2263-2272、J. Immunol. (2006) 176, 4449-4458、J. Am. Soc.Nephrol. (2011) 22 (5), 890-901、PLoS ONE J. (2010) 5 (2), e9242）。另外还观察到ATP浓度在肺纤维症患者的纤维化组织中上升（Am. J. Respir. Crit. Care Med. (2010)182, 774-783）。作为本发明中所使用的炎性组织特异性化合物的非限定的一个方案，优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢在炎性组织中以高浓度蓄积的ATP、ADP、AMP或腺苷等。进而，腺苷通过腺苷脱氨酶分解为肌苷，因而肌苷以高浓度蓄积。
（3）尿酸
尿酸是机体内的嘌呤核苷的代谢通路的产物，且被释放至血液或间质腔等细胞外。此外，近年来明确了由进行坏死（necrosis）的细胞所释放的尿酸会促进炎性应答（J.Clin. Invest. (2010) 120 (6), 1939-1949）。作为本发明中所使用的炎性组织特异性化合物的非限定的一个方案，还优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢而在炎性组织中以高浓度蓄积的尿酸。
抗原结合结构域
本说明书中，“抗原结合结构域”只要可与目标抗原结合，则可使用任意结构的结构域。作为这类结构域的实例，优选可举出例如：抗体的重链和轻链的可变区、生物体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸左右的被称作A结构域的组件（国际公开WO2004/044011、WO2005/040229）、含有与在细胞膜表达的糖蛋白即纤连蛋白中的蛋白结合的结构域即10Fn3结构域的Adnectin（国际公开WO2002/032925）、以构成ProteinA的包含58个氨基酸的3个螺旋束（bundle）的IgG结合结构域为构架的Affibody（国际公开WO1995/001937）、具有含33个氨基酸残基的转角和2个反向平行螺旋以及环的亚基反复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列（ankyrin repeat：AR）的分子表面露出的区域即DARPins（DesignedAnkyrin Repeat proteins）（国际公开WO2002/020565）、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL））等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向扭曲的桶结构的单侧的4个环区域即Anticalin等（国际公开WO2003/029462）、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得性免疫系统且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体（variable lymphocyte receptor（VLR））的富亮氨酸残基重复（leucine-rich-repeat（LRR））组件反复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片层结构的凹陷区域（国际公开WO2008/016854）。作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scFv（单链 Fv）”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2（单链 Fv 2）”、“Fab”或“F(ab')2”等。
本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同的表位可以存在于例如包含SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列的蛋白中。或者，本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相互不同的表位结合。这里，不同的表位可以存在于例如包含SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列的蛋白中。
特异性
特异性是指特异性结合的分子中的一个分子与它的一个或多个结合对象分子以外的分子实质上不结合的状态。此外，也可用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位是特异性的情形。此外，在多个不同的抗原中含有抗原结合结构域所结合的表位时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。这里，实质上不结合是指，根据上述结合活性的项目中所记载的方法所确定的，特异性结合分子对前述对象以外的分子的结合活性显示出对前述对象分子的结合活性的80%以下、通常50%以下、优选30%以下、特别优选15%以下的结合活性。
细胞毒性
本发明的非限定的一个方案中，提供含有抗原结合活性根据癌组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域、并对在其细胞膜上表达膜型分子的细胞具有细胞毒性的抗原结合分子、和含有该抗原结合分子作为有效成分的药物组合物。本发明中，细胞毒性可举出例如：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity：ADCC）、补体依赖性细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity：CDC）和T细胞所致的细胞毒性等。本发明中，CDC活性意指补体系统所致的细胞毒性。另一方面，ADCC活性意指免疫细胞等经由表达于该免疫细胞的Fcγ受体而结合至含有与表达于靶细胞的细胞膜的膜型分子结合的抗原结合结构域的抗原结合分子的Fc区，从而该免疫细胞对靶细胞赋予伤害的活性。目标抗原结合分子是否具有ADCC活性、或是否具有CDC活性可通过公知方法测定（例如，Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologicstudies in humans、Coligan等人编(1993)等）。
具体地，首先实施效应细胞、补体溶液、靶细胞的制备。
（1）效应细胞的制备
由摘取自CBA/N小鼠等的脾脏，在RPMI1640培养基（Invitrogen）中分离脾脏细胞。将经含有10%胎牛血清（FBS、HyClone）的相同培养基清洗的该脾脏细胞的浓度调整为5×106/mL，由此可制备效应细胞。
（2）补体溶液的制备
利用含10% FBS的培养基（Invitrogen）将Baby Rabbit Complement（CEDARLANE）稀释10倍，由此可制备补体溶液。
（3）靶细胞的制备
将表达抗原的细胞与0.2 mCi的51Cr-铬酸钠（GE Healthcare Bio-Sciences）一起在含10% FBS的DMEM培养基中于37℃培养1小时，由此可将该靶细胞放射性标记。放射性标记后，用含10% FBS的RPMI1640培养基清洗3次，将细胞的浓度调整为2×105/mL，由此可得到该靶细胞。
ADCC活性或CDC活性可通过以下所述的方法测定。ADCC活性的测定时，使加入至96孔U底培养板（Becton Dickinson）的各50μl的靶细胞与抗原结合分子在室温反应15分钟。然后，将加入有效应细胞100μl的该培养板在二氧化碳培养箱内静置4小时。抗原结合分子的终浓度可以设定为例如0或10μg/ml等的浓度。静置后，使用伽马计数器（COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company）测定由各孔回收的100μl上清的放射活性。使用测定值，基于(A-C)/(B-C) x 100的计算式可计算细胞毒性（%）。A表示各试样的放射活性（cpm）、B表示加入了1% NP-40（nacalai tesque)的试样的放射活性（cpm）、C表示仅含靶细胞的试样的放射活性（cpm）。
另一方面，CDC活性的测定时，使加入至96孔平底培养板（Becton Dickinson）的各50μl的靶细胞与抗原结合分子在冰上反应15分钟。然后，将加入有补体溶液100μl的该培养板在二氧化碳培养箱内静置4小时。抗原结合分子的终浓度可设定为例如0或3μg/mL等的浓度。静置后，使用伽马计数器测定由各孔回收的100μl上清的放射活性。细胞毒性可与ADCC活性测定相同地计算。
此外，结合有后述的化学治疗药、毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质的修饰抗原结合分子修饰物也可适宜地用作本发明的具有细胞毒性的抗原结合分子。这种修饰抗原结合分子（以下，称为抗原结合分子药物缀合物）可通过对所得抗原结合分子进行化学修饰而获得。另外，作为抗原结合分子的修饰方法，可适宜使用在抗体药物缀合物等领域中已经确立的方法。此外，结合有毒性肽的修饰抗原结合分子可通过将编码该毒性肽的基因与编码本发明的抗原结合分子的基因框内连接得到的融合基因在适当的宿主细胞中表达后，从该细胞的培养液中分离而获得。
中和活性
在本发明的非限定的一个方案中，提供诱导免疫应答的药物组合物，该组合物含有抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合分子含有抗原结合活性根据癌组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域，且对该膜型分子具有中和活性。在本发明的非限定的另一方案中，提供诱导免疫应答的药物组合物，该组合物含有抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合分子含有抗原结合活性根据癌组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域，并且除了对在其细胞膜上表达膜型分子的细胞具有细胞毒性之外，还对该膜型分子具有中和活性。通常，中和活性是指抑制病毒或毒素等对细胞具有生物学活性的配体的该生物学活性的活性。即，具有中和活性的物质是指与该配体或该配体所结合的受体结合，而抑制该配体与受体的结合的物质。与配体的结合被中和活性阻断的受体变得不能通过该受体发挥生物学活性。抗原结合分子为抗体时，具有这种中和活性的抗体通常被称作中和抗体。某被测物质的中和活性可通过在该被测物质的存在或非存在下的条件之间比较配体存在下的生物学活性来测定。
例如，作为IL-6受体的主要配体，优选可举出SEQ ID NO:27所示的IL-6。其氨基末端形成细胞外结构域的I型膜蛋白即IL-6受体会与由IL-6诱导了二聚体化的gp130受体一起形成异源四聚体（Heinrich等（Biochem. J. (1998) 334, 297-314））。由于该异源四聚体的形成，与gp130受体缀合的Jak被活化。Jak进行自身磷酸化与受体的磷酸化。受体和Jak的磷酸化位点对、Stat3之类的属于具有SH2的Stat家族的分子、MAP激酶、PI3/Akt、其它的具有SH2的蛋白或接头发挥结合位点的功能。接着，结合于gp130受体的Stat被Jak磷酸化。经磷酸化的Stat形成二聚体而移动至核内，调节靶基因的转录。Jak或Stat还可经由其它种类的受体而参与信号级联。解除控制的IL-6的信号级联在自身免疫疾病的病态或炎症、多发性骨髓瘤或前立腺癌等癌中被观察到。可作为癌基因起作用的Stat3在许多癌中恒定地活化。在前立腺癌与多发性骨髓瘤中，来自IL-6受体的信号级联与来自上皮生长因子受体(EGFR) 家族成员的信号级联之间存在串扰（Ishikawa等（J. Clin. Exp. Hematopathol.(2006) 46 (2), 55-66））。
这种细胞内的信号级联根据细胞种类而不同，因此可以根据目标靶细胞适宜设定靶分子，并不限定于上述因子。通过测定生物体内信号的活化，可以评价中和活性。此外，还可以将对存在于生物体内信号级联的下游的靶基因的转录诱导作用作为指标来检测生物体内信号的活化。靶基因的转录活性的变化可通过报告测定（reporter assay）的原理来检测。具体地，在靶基因的转录因子或启动子区域的下游配置GFP（Green FluorescenceProtein，绿色荧光蛋白）或荧光素酶等报告基因，并测定其报告活性，由此可以以报告活性的方式测定转录活性的变化。生物体内信号的活化的测定试剂盒可适宜使用市售品（例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System（Clontech）等）。
进而，作为测定作用于通常在促进细胞增殖的方向上工作的信号级联的EGF受体家族等受体配体的中和活性的方法，可通过测定目标细胞的增殖活性来评价抗原结合分子的中和活性。例如，作为评价或测定相对于例如HB-EGF等其增殖被EGF家族的生长因子所促进的细胞的增殖的、基于抗HB-EGF抗体的中和活性的抑制效果的方法，可适宜使用以下的方法。作为在试管内评价或测定该细胞增殖抑制活性的方法，可以采用以活细胞对添加于培养基中的[3H]标记胸苷的摄入作为DNA复制能力的指标来进行测定的方法。作为更简便的方法，还可采用在显微镜下测量将台盼蓝等色素排除至细胞外的能力的色素排除法或MTT法。后者利用了活细胞具有将作为四唑盐的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物)转变为蓝色的甲䐶产物的能力。更具体地，将被测抗体与配体一起添加至被测细胞的培养液中，经过一定时间后，将MTT溶液加入培养液中，静置一定时间，由此使MTT进行细胞。结果，黄色化合物MTT被细胞内线粒体内的琥珀酸脱氢酶转变为蓝色的化合物。使该蓝色产物溶解并显色后测定其吸光度，从而作为活细胞数的指标。除了MTT以外，MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂也有市售（nacalai tesque等）而可适宜使用。在活性测定时，可以与抗HB-EGF抗体相同地使用与抗HB-EGF抗体具有相同的同种型但不具有该细胞增殖抑制活性的结合抗体作为对照抗体，通过抗HB-EGF抗体较对照抗体显示出更强的细胞增殖抑制活性来判定活性。
作为用于评价活性的细胞，还可适宜使用例如：其增殖被HB-EGF促进的细胞即卵巢癌细胞RMG-1细胞株、利用以表达的方式结合了编码将人EGFR的细胞外结构域与小鼠G-CSF受体的细胞内结构域框内融合得到的融合蛋白hEGFR/mG-CSFR的基因的载体转化的小鼠Ba/F3细胞等。这样，本领域技术人员通过适宜选择用于评价活性的细胞，可以用于测定前述的细胞增殖活性。
抗体
本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制造的免疫球蛋白。抗体可从其天然存在的血浆或血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全地合成。作为抗体的实例，优选列举免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚型。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型（同种型）。本发明的抗体中可包含这些同种型中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242中，但在本发明中可以是其中的任一种。特别是，作为人IgG1的序列，以EU编号表示的356-358位氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。此外，作为人Igκ(Kappa)恒定区和人Igλ (Lambda)恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242中，但在本发明可以是其中的任一种。
制作具有所期望的结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示与IL-6R结合的抗体（抗IL-6R抗体）的制作方法。与IL-6R以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示而适宜制作。
抗IL-6R抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗IL-6R抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包含：由杂交瘤产生的单克隆抗体、和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体进行了转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。需要说明的是，本申请发明的单克隆抗体包含“人源化抗体”或“嵌合抗体”。
产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下所述制作。即，使用IL-6R蛋白作为致敏抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。接着，通过通常的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，由此可以选择出产生抗IgA抗体的杂交瘤。
具体地，单克隆抗体的制作例如如下所示进行。首先，表达其核苷酸序列公开在SEQ ID NO:2中的IL-6R基因，由此可得到由SEQ ID NO:1所示的IL-6R蛋白，其用作致敏抗原用于抗体制备。即，将编码IL-6R的基因序列插入公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所期望的人IL-6R蛋白。为了从培养上清中获得可溶型的IL-6R，例如，替代SEQ ID NO:1所示的IL-6R蛋白，而表达由Mullberg等（J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968）记载的作为可溶型IL-6R的、由SEQ IDNO:1所示的IL-6R多肽序列中第1至第357位的氨基酸构成的蛋白。此外，纯化的天然IL-6R蛋白也可同样地用作致敏抗原。
作为用于免疫哺乳动物的致敏抗原，可使用该纯化IL-6R蛋白。另外，IL-6R的部分肽也可以用作致敏抗原。此时，该部分肽也可以根据人IL-6R的氨基酸序列通过化学合成获得。此外，也可以通过将一部分IL-6R基因插入到表达载体中并使其表达来获得。进而，还可以使用蛋白分解酶分解IL-6R蛋白来获得，用作部分肽的IL-6R肽的区域和大小并不特别限于特定的方案。对于优选的区域，可以从SEQ ID NO:1的氨基酸序列中相当于第20-357位的氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为致敏抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体地，可以将8～50、优选10～30个残基的肽用作致敏抗原。
此外，也可以将IL-6R蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽融合而成的融合蛋白用作致敏抗原。为了制造用作致敏抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：将编码所期望的两种或更多的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如上所述地插入表达载体中。融合蛋白的制作方法记载于Molecular Cloning 第2版. （Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58（1989）Cold Spring Harbor Lab. press）。用作致敏抗原的IL-6R的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于国际公开WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等中。
作为用该致敏抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性来选择。通常优选使用啮齿类的动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、或兔、猴等。
按照公知的方法将上述动物用致敏抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过注射将致敏抗原给予至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体而言，将用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的致敏抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该致敏抗原对哺乳动物每4至21天给予数次。此外，致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作致敏抗原时，有时希望将与白蛋白、匙孔䗩血蓝蛋白等载体蛋白结合的该致敏抗原肽进行免疫。
此外，产生所期望抗体的杂交瘤可通过使用DNA免疫，如下所示来制作。DNA免疫是指下述免疫方法：被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，致敏抗原在该免疫动物的生物体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白质抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下优越性。
-能够维持IL-6R之类的膜蛋白的结构而赋予免疫刺激
-无需纯化免疫抗原
为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达IL-6R蛋白的DNA。编码IL-6R的DNA可通过PCR等公知的方法合成。将所得DNA插入适当的表达载体中，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予生物体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金颗粒用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别IL-6R的抗体的制作也可以采用国际公开WO2003/104453中记载的方法来制作。
如此地将哺乳动物免疫，确认到血清中与IL-6R结合的抗体效价的上升后，从哺乳动物采集免疫细胞，供于细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标志物。选选择标志物是指能够(或者不能)在特定培养条件下存活的形态。选择标志物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称为HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称为TK缺陷)等。具有HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会增殖。
HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞各自可通过含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5’-溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称为G418抗性的选择标志物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
作为这类骨髓瘤细胞，可适宜地使用例如：P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123 (4), 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology andImmunology（1978）81, 1-7）、NS-1（C. Eur. J. Immunol.（1976）6 (7), 511-519）、MPC-11（Cell（1976）8 (3), 405-415）、SP2/0（Nature（1978）276 (5685), 269-270）、FO（J.Immunol. Methods（1980）35 (1-2), 1-21）、S194/5.XX0.BU.1（J. Exp. Med.（1978）148(1), 313-323）、R210（Nature（1979）277 (5692), 131-133）等。
基本上，根据公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法（Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等，进行前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体地，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施上述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，为了进一步提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂后使用。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞达到1至10倍。作为用于上述细胞融合的培养液，使用例如适于上述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(FCS)等血清补液。
关于细胞融合，将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中以规定量充分混合，将预先加热至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量为1000至6000左右)以通常30至60%(w/v)的浓度添加。通过缓缓地混合混合液，形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
如此操作得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
如此操作得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标志物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT或TK缺陷的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地增殖。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体地，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。接着，可通过通常的有限稀释法实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，与IL-6R结合的单克隆抗体可以与表达于细胞表面的IL-6R结合。这种单克隆抗体可通过例如，FACS（fluorescence activated cell sorting,荧光激活细胞分选）来进行筛选。FACS是用激光分析接触了荧光抗体的细胞，测定各细胞发出的荧光，由此可以测定抗体对细胞表面的结合的系统。
为了通过FACS筛选产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤，首先制备表达IL-6R的细胞。用于筛选的优选细胞是强制表达IL-6R的哺乳动物细胞。通过将用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞作为对照使用，可以选择性地检测抗体对细胞表面的IL-6R的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合而与强制表达IL-6R的细胞结合的抗体的杂交瘤，可以获得产生IL-6R单克隆抗体的杂交瘤。
或者还可基于ELISA的原理来评价抗体对固定化的IL-6R表达细胞的结合活性。例如，将IL-6R表达细胞固定化于ELISA培养板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内固定化细胞接触，检出与固定化细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，结合于细胞的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体来检测。通过这些筛选选择出的、产生对抗原具有结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释法等进行克隆。
如此操作而制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。此外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。
按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有相容性的哺乳动物并使其增殖，从其腹水中获得单克隆抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体。
也可以优选使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因所编码的抗体。将克隆的抗体基因插入适当的载体中，再导入宿主中，由此表达由该基因编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等确立（Eur. J. Biochem.（1990）192 (3), 767-775）。另外，如下所述重组抗体的制造方法也是公知的。
例如，由产生抗IL-6R抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IL-6R抗体的可变区（V区）的cDNA。为此，通常首先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞中提取mRNA的方法，例如可使用如下所述的方法。
- 胍超离心法（Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299）
- AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159）。
所提取的mRNA可使用mRNA 纯化试剂盒（GE Healthcare Bio-Sciences制）等进行纯化。或者，还市售有如QuickPrep mRNA 纯化试剂盒（GE Healthcare Bio-Sciences制）等那样用于从细胞中直接提取总mRNA的试剂盒。使用这种试剂盒，可由杂交瘤获得mRNA。使用逆转录酶，可由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV逆转录酶第一链 cDNA合成试剂盒（生化学工业公司制）等合成。此外，为了cDNA的合成和扩增，可以适当采用利用了SMART RACE cDNA 扩增试剂盒（Clontech制）和PCR的5'-RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. (1988) 85 (23), 8998-9002、Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932）。进而，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。
由所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择集落后，可以由形成该集落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，关于该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列，可以通过公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5’-RACE法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先，以从杂交瘤细胞中提取的RNA为模板合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。在5'-RACE cDNA文库的合成中可适当地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。
以所得的5’-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。根据公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的碱基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(RocheDiagnostics)等市售试剂盒来预先确定亚类。
具体地，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用下述引物，其能够扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因。为了扩增IgG的可变区基因，通常3’侧的引物使用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5’侧的引物则使用5’ RACE cDNA文库制作试剂盒所附带的引物。
使用如此扩增而得到的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白针对IL-6R的结合活性作为指标，可以筛选所期望的抗体。例如为了获得针对IL-6R的抗体时，进一步优选抗体对IL-6R的结合是特异性的。与IL-6R结合的抗体例如可如下所述进行筛选：
步骤（1），使包含由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与表达IL-6R的细胞接触；
步骤（2），检测表达IL-6R的细胞与抗体的结合；和
步骤（3），选择与表达IL-6R的细胞结合的抗体。
检测抗体与表达IL-6R的细胞的结合的方法是公知的。具体地，通过之前所述的FACS等方法，可检测出抗体与表达IL-6R的细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适宜使用表达IL-6R的细胞的固定标本。
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还优选采用淘选法，其利用了噬菌体载体。由多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体中，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原结合的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。根据需要重复该操作，从而可以浓缩具有所期望的结合活性的scFv。
得到目标的编码抗IL-6R抗体的V区的cDNA后，该cDNA被识别插入该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现的频率低的碱基序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体中，优选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上消化的编码抗IL-6R抗体的V区的cDNA插入适当的表达载体中，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区)的基因和编码上述V区的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入上述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，可在保持有编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧适当地配置消化上述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。
为了制造抗IL-6R单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因插入表达载体中。用于表达抗体的表达调控区包含例如增强子或启动子。另外，可以在氨基酸末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS（SEQ ID NO:3）的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗IL-6R抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别整合于不同的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体共转化（co-transfect）相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，将编码H链和L链的DNA插入单一表达载体中，从而可以转化宿主细胞（参照国际公开WO 1994/011523）。
用于将分离的抗体基因导入适当的宿主中来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体地，动物细胞可例示下述细胞。
（1）哺乳类细胞：CHO（中国仓鼠卵巢细胞株）、COS（猴肾细胞株）、骨髓瘤（Sp2/0、NS0等）、BHK （幼仓鼠肾细胞株）、Hela、Vero、HEK293（携带已剪切腺病毒(Ad)5 DNA的人胚肾细胞株）、PER.C6细胞(用5型腺病毒(Ad5) E1A和E1B基因转化的人胚视网膜细胞株)等（Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)）
（2）两栖动物细胞：非洲爪蟾卵母细胞等
（3）昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。
或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达系统。植物细胞的转化中，可以适宜使用进行了愈伤组织培养的细胞。
进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞。
- 酵母：酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属；
- 丝状真菌：黑曲霉菌(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属。
此外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适宜利用大肠杆菌（E. coli）、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。
除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以从导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内插入编码乳汁中固有产生的蛋白的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白质，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎，再将该进行了注入的胚胎导入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊（或其后代）产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素（Bio/Technology(1994), 12 (7), 699-702）。
对人给予本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该抗原结合分子中的抗原结合结构域，可以适当采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，所述基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工修饰。基因重组型抗体包含例如人源化（Humanized）抗体等。这些修饰抗体可使用公知方法适宜制造。
为了制作本说明书中记载的抗原结合分子的抗原结合结构域所使用的抗体的可变区通常由被4个框架区（FR）夹持的3个互补决定区（complementarity-determiningregion; CDR）构成。CDR是实质上决定抗体结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便是在具有不同结合特异性的抗体之间也多显示高度的同一性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体。
人源化抗体也被称为重构（reshaped）人抗体。具体地，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体地，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重叠延伸PCR。重叠延伸PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的碱基序列。针对4个FR分别准备引物。通常，对于将小鼠CDR移植到人FR时，选择与小鼠FR同一性高的人FR，但在维持CDR功能方面被认为有利。即，通常优选使用下述人FR，其包含与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。
另外，连接的碱基序列被设计为相互框内连接。通过各引物单独地合成人FR。结果得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列被设计为相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR通过小鼠CDR序列而连接。
最终3个CDR和4个FR连接得到的V区基因，通过会与其5'末端和3'末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上所述得到的DNA和编码人抗体C区的DNA以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主中建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体（参照欧州专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576）。
通过定性或者定量地测定并评价如上制作的人源化抗体对抗原的结合活性，可以优选选择人抗体FR，以便经由CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适抗原结合位点的方式来替换FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR导入氨基酸序列的突变。具体地，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分碱基序列的突变。通过这类引物合成的FR中导入了碱基序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸替换的突变型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望性质的突变FR序列（Cancer Res., (1993) 53, 851-856）。
另外，将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物（参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735参照）作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所期望的人抗体。
进而，使用人抗体文库通过淘选法获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的V区以单链抗体（scFv）的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区序列与所期望的人抗体C区序列框内融合后，插入适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适宜表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗体。这些方法已经公知（参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388）。
另外，作为获得抗体基因的方法，除了上述之外，还可适宜地使用如Bernasconi等（Science (2002) 298, 2199-2202）或国际公开WO2008/081008中记载的B细胞克隆（各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体（特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）的表达载体构建用的用途等）的方法。
EU编号和Kabat编号
根据本发明中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute ofHealth, Bethesda, Md., 1987年和1991年）。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表示。
靶组织特异性化合物依赖性的抗原结合结构域
为了获得抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子），即，靶组织特异性化合物依赖性的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子），可以适宜应用上述结合活性一项中所示的方法。作为非限定的一个方案，以下例示数个其具体例。例如，为了确认与靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）对抗原的结合活性相比，该化合物的存在下的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）对抗原的结合活性变高，将靶组织特异性化合物的非存在下和存在下的、或低浓度存在下和高浓度存在下的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）对抗原的结合活性进行比较。作为不同的非限定的一个方案，例如，为了确认与靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）对抗原的结合活性相比，该化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）对抗原的结合活性变高，将靶组织特异性化合物的低浓度存在下和高浓度存在下的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）对抗原的结合活性进行比较。
进而，在本发明中，“靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高”的表述也可以表述为“抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低”。另外，本发明中，有时也将“抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低”记载为“抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性弱”。
进而，在本发明中，“靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的低浓度存在下的抗原结合活性高”的表述也可以表述为“抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低”。另外，本发明中，有时也将“抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低”记载为“抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性弱”。
测定抗原结合活性时的靶组织特异性化合物的浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜选择，并无特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore（GE Healthcare）等进行测定。对于抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）与抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型分子时，通过对固定有抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的芯片加载抗原作为分析物，由此可以评价对可溶型分子的结合活性；在抗原为膜型分子时，通过对固定有抗原的芯片加载抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）作为分析物，由此可以评价对膜型分子的结合活性。
只要本发明的抗原结合分子中所含的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性弱，则该化合物的非存在下的抗原结合活性与该化合物存在下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的靶组织特异性化合物的非存在下的KD（Dissociation constant：解离常数）与存在下的KD之比即KD（化合物非存在下）/KD（化合物存在下）的值为2以上，进一步优选KD（化合物非存在下）/KD（化合物存在下）的值为10以上，进一步优选KD（化合物非存在下）/KD（化合物存在下）的值为40以上。KD（化合物非存在下）/KD（化合物存在下）的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以为400、1000、10000等任意的值。在靶组织特异性化合物的非存在下未观察到抗原结合活性时，该上限为无限大的数值。
只要本发明的抗原结合分子中所含的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合活性弱，则该化合物的低浓度存在下的抗原结合活性与该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的KD（Dissociation constant：解离常数）与高浓度存在下的KD之比即KD（化合物低浓度存在下）/KD（化合物高浓度存在下）的值为2以上，进一步优选KD（化合物低浓度存在下）/KD（化合物高浓度存在下）的值为10以上，进一步优选KD（化合物低浓度存在下）/KD（化合物高浓度存在下）的值为40以上。KD（化合物低浓度存在下）/KD（化合物高浓度存在下）的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以为400、1000、10000等任意的值。在靶组织特异性化合物的低浓度存在下未观察到抗原结合活性时，该上限为无限大的数值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型分子时可以使用KD（解离常数），而在抗原为膜型分子时则可以使用表观KD（Apparent dissociation constant：表观解离常数）。KD（解离常数）、和表观KD（表观解离常数）可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore（GE healthcare）、斯卡查德图（Scatchard plot）、流式细胞仪等。
此外，作为表示本发明的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性与存在下的抗原结合活性之比的其它指标，例如也可以适宜使用解离速度常数kd（Dissociation rate constant：解离速度常数）。使用kd（解离速度常数）替代KD（解离常数）来作为表示结合活性之比的指标时，靶组织特异性化合物的非存在下的相对于抗原的kd（解离速度常数）与该化合物存在下的kd（解离速度常数）之比即kd（化合物非存在下）/kd（化合物存在下）的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。Kd（化合物非存在下）/kd（化合物存在下）的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。在靶组织特异性化合物的非存在下未观察到抗原结合活性时，由于解离也不发生，故该上限为无限大的数值。
此外，作为表示本发明的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性与高浓度存在下的抗原结合活性之比的其它指标，例如也可以适宜使用解离速度常数kd（Dissociation rate constant：解离速度常数）。使用kd（解离速度常数）替代KD（解离常数）来作为表示结合活性之比的指标时，靶组织特异性化合物的低浓度存在下的相对于抗原的kd（解离速度常数）与该化合物高浓度存在下的kd（解离速度常数）之比即kd（化合物低浓度存在下）/kd（化合物高浓度存在下）的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。Kd（化合物低浓度存在下）/Kd（化合物高浓度存在下）的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。在靶组织特异性化合物的低浓度存在下未观察到抗原结合活性时，由于解离也不发生，故该上限为无限大的数值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型分子时可以使用kd（解离速度常数），在抗原为膜型分子时可以使用表观kd（Apparent dissociation rate constant：表观解离速度常数）。kd（解离速度常数）、和表观kd（表观解离速度常数）可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore（GE healthcare）、流式细胞仪等。另外，本发明中，在测定靶组织特异性化合物的某浓度下的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）的抗原结合活性时，该化合物的浓度以外的条件优选设为相同。
例如，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域（或抗原结合分子）的筛选来获得。
步骤(a)：获得靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合结构域（或抗原结合分子）的抗原结合活性；
步骤(b)：获得靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合结构域（或抗原结合分子）的抗原结合活性；
步骤(c)：选择靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性比该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
例如，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域（或抗原结合分子）的筛选来获得。
步骤(a)：获得靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合结构域（或抗原结合分子）的抗原结合活性；
步骤(b)：获得靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域（或抗原结合分子）的抗原结合活性；
步骤(c)：选择靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性比该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域（或抗原结合分子）或者它们的文库的筛选来获得。
步骤(a)：使靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合结构域（或抗原结合分子）或者它们的文库与抗原接触；
步骤(b)：将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）置于该化合物的非存在下；
步骤(c)：分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域（或抗原结合分子）或者它们的文库的筛选来获得。
步骤(a)：使靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域（或抗原结合分子）或者它们的文库与抗原接触；
步骤(b)：将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）置于该化合物的低浓度存在下；
步骤(c)：分离在前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
此外，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域（或抗原结合分子）或它们的文库的筛选来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的非存在下使抗原结合结构域（或抗原结合分子）的文库与抗原接触；
步骤(b)：选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域（或抗原结合分子）；
步骤(c)：使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域（或抗原结合分子）在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
此外，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域（或抗原结合分子）或它们的文库的筛选来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域（或抗原结合分子）的文库与抗原接触；
步骤(b)：选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域（或抗原结合分子）；
步骤(c)：使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域（或抗原结合分子）在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得。
步骤(a)：使抗原结合结构域（或抗原结合分子）的文库在靶组织特异性化合物的存在下与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)：在该化合物的非存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）；
步骤(c)：分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得。
步骤(a)：使抗原结合结构域（或抗原结合分子）的文库在靶组织特异性化合物的高浓度存在下与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)：在该化合物的低浓度存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）；
步骤(c)：分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的非存在下使抗原结合结构域（或抗原结合分子）的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)：回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域（或抗原结合分子）；
步骤(c)：使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域（或抗原结合分子）在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域（或抗原结合分子）的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)：回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域（或抗原结合分子）；
步骤(c)：使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域（或抗原结合分子）在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的存在下使抗原结合结构域（或抗原结合分子）的文库与抗原接触；
步骤(b)：获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）；
步骤(c)：将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域（或抗原结合分子）置于化合物的非存在下；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于在前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域（或抗原结合分子）的文库与抗原接触；
步骤(b)：获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域（或抗原结合分子）；
步骤(c)：将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域（或抗原结合分子）置于化合物的低浓度存在下；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于在前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
应予说明，上述步骤可以被重复2次以上。因此根据本发明，提供通过在上述筛选方法中进一步包括将步骤(a)～(c)或(a)～(d)重复2次以上的步骤的筛选方法而获得的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）或靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）。步骤(a)～(c)或(a)～(d)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
本发明的筛选方法中，靶组织特异性化合物可以是由以与非靶组织相比为不同的浓度（例如，高浓度或低浓度）存在于靶组织中等定量的靶组织特异性所规定的化合物。例如，靶组织特异性化合物以任意的浓度差异地存在。但是，通常靶组织特异性化合物可以以增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍、或其以上、直至无限大（即不存在于非靶组织中时）的浓度存在。
区别低浓度和高浓度的阈值可以对应于化合物而适宜设定。例如，ATP或腺苷的阈值的非限定的一个方案中，作为阈值，低浓度条件可以由10 nM、1 nM、100 pM、10 pM、1 pM或0 M的值中适宜设定。对应于所设定的阈值，高浓度条件可以由各阈值的至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍的值中适宜设定。此外，在PGE2的非限定的一个方案中，作为阈值，低浓度条件可以由10 pM、1 pM、100 fM、10 fM、1 fM或0 M的值中适宜设定。对应于所设定的阈值，高浓度条件可以由各阈值的至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍的值中适宜设定。进而，在犬尿氨酸的非限定的一个方案中，作为阈值，低浓度条件可以由10μM、1μM、100 nM、10 nM、1 nM或0 M的值中适宜设定。对应于所设定的阈值，高浓度条件可以由各阈值的至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍的值中适宜设定。
抗原结合结构域（或抗原结合分子）的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于靶组织特异性化合物的浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜决定。抗原结合结构域（或抗原结合分子）的抗原结合活性可以作为KD（Dissociation constant：解离常数）、表观KD（Apparent dissociation constant：表观解离常数）、解离速度kd（Dissociation rate：解离速度常数）、或表观kd（Apparent dissociation：表观解离速度常数）等来进行评价。它们可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可以采用Biacore（GE healthcare）、斯卡查德图、FACS等。
本发明中，选择靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的步骤，与选择靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。
此外，本发明中，选择靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的低浓度存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的步骤，与选择靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。
只要靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低，则对该化合物的存在下的抗原结合活性与非存在下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选该化合物的存在下的抗原结合活性是非存在下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。该抗原结合活性之差的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400倍、1000倍、10000倍等任意的值。在靶组织特异性化合物的非存在下未观察到抗原结合活性时，该上限为无限大的数值。
通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以是任意的抗原结合结构域（或抗原结合分子），例如，可以筛选上述的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域（或抗原结合分子），也可以筛选氨基酸序列被替换的抗原结合结构域（或抗原结合分子）。
文库
根据某一个方案，本发明的抗原结合结构域（或包含该结构域的抗原结合分子）可以由文库获得，该文库主要由多个抗原结合分子形成，所述多个抗原结合分子的序列彼此不同，并且其抗原结合结构域中含有至少一个使抗原结合分子对靶组织特异性化合物依赖性的抗原的结合活性变化的氨基酸残基。作为该化合物的实例，可例示：（1）乳酸、琥珀酸、柠檬酸等糖酵解系统、或克雷伯氏循环的一次代谢产物；（2）丙氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸等氨基酸；（3）犬尿氨酸、以及作为其代谢产物的邻氨基苯甲酸、3-羟基犬尿氨酸和犬尿酸等氨基酸的代谢产物；（4）前列腺素E2等花生四烯酸的代谢产物；以及（5）腺苷、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）等具有嘌呤环结构的核苷等。以下例示一种文库，该文库主要由多个抗原结合分子形成，所述抗原结合分子的序列彼此不同，并且其抗原结合结构域中含有至少一个使抗原结合分子对作为这种靶组织特异性化合物的腺苷和/或ATP依赖性的抗原的结合活性变化的氨基酸残基。
本说明书中，“文库”是指多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽、或编码它们的序列的核酸、多核苷酸。文库中所含的多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽的序列并非单一的序列，而是序列彼此不同的抗原结合分子或含有抗原结合分子的融合多肽。
本说明书中，序列彼此不同的多个抗原结合分子的记载中的“序列彼此不同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列彼此不同。即，文库中的彼此不同的序列的数量反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被视为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库为106至1012，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小扩大至1014。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体颗粒的实际数目通常比文库大小大10至10,000倍。该过量倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至10,000个。所以，本发明中的“序列彼此不同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列彼此不同，更具体意指序列彼此不同的抗原结合分子存在106至1014个分子、优选107至1012个分子、进一步优选108至1011个分子、特别优选108至1010个分子。
此外，本发明中的主要由多个抗原结合分子形成的文库这一记载中的术语“多个”，对于例如本发明的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒而言，通常是指这些物质的两种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面彼此不同，则表示该物质存在两种以上。作为实例，可举出在氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的突变体氨基酸。例如，当存在除了柔性残基以外或除了露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸以外序列实质上相同、且优选序列相同的本发明的2个以上的抗原结合分子时，则存在多个本发明的抗原结合分子。在其它例子中，当存在除了编码柔性残基的碱基以外或除了编码露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸的碱基以外实质上相同、且优选序列相同的本发明的2个以上的多核苷酸分子时，则存在多个本发明中的多核苷酸分子。
进而，本发明中的主要由多个抗原结合分子形成的文库的记载中的“主要由...形成”的表述反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合分子对抗原的结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度条件而不同的抗原结合分子的数量。具体地，优选显示出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在104个分子。此外，更优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在105个分子的文库获得。进一步优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在106个分子的文库中获得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在107个分子的文库中获得。还优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在108个分子的文库中获得。在其它表述中，也可适宜地表述为在文库中的序列不同的独立克隆的数量中抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而不同的抗原结合分子的比例。具体地，本发明的抗原结合结构域可以由显示出这种结合活性的抗原结合分子占文库中序列不同的独立克隆的数量的0.1%至80%、优选0.5%至60%、更优选1%至40%、进一步优选2%至20%、特别优选4%至10%的文库中获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也和上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表述。此外，病毒的情形也和上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表述。
使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化 的氨基酸
通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可以任意制备，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库（噬菌体文库等）、由对动物进行免疫而得的杂交瘤或由来自免疫动物的B细胞制作的抗体或文库、由通过适当连接了腺苷或ATP的免疫原性高的T细胞表位肽等与佐剂的缀合物（conjugate）免疫的动物的B细胞等免疫细胞制作的抗体或文库等。作为该T细胞表位肽的非限定的一例，可优选举出来源于破伤风毒素的p30辅助肽（由SEQ ID NO:4所示，也称为Fragment C（FrC））等。
作为如上所述使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸，可例示形成腺苷和/或ATP结合模体的氨基酸。包含前述氨基酸的抗原结合结构域中的氨基酸的位置并不限于特定位置，只要使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可变区或轻链可变区中的任意位置。即，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在非限定的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链的CDR1、CDR2和/或CDR3中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在非限定的另一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链的FR1、FR2、FR3和/或FR4中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。
此外，在本发明的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链和/或轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在非限定的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链和/或轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在非限定的另一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链和/或轻链的FR1、FR2、FR3和/或FR4中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。
作为这种氨基酸的非限定的一个方案，可以例示含有在重链可变区中的52位、52a位、53位、96位、100a位、或100c位的氨基酸中的任一者以上的氨基酸等。另外，作为这种氨基酸的非限定的一个方案，可以例示含有在重链可变区中的52位的Ser、52a位的Ser、53位的Arg、96位的Gly、100a位的Leu、100c位的Trp等氨基酸中的任一者以上的氨基酸。
对于抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列，只要重链和/或轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸，则可以使用任意框架序列。框架序列的起源没有限定，可以由非人动物的任意生物或人获得。作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、和非人灵长类中的生物。在特别优选的实施方案中，理想的是抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列具有人的种系框架序列。因此，在本发明的一个方案中，若框架序列完全为人的序列，则认为在给予人(例如疾病的治疗)时，本发明的抗原结合分子基本或完全不会引起免疫原性反应。根据上述含义，本发明中的“含有种系序列”意指本发明的框架序列的一部分与任意的人的种系框架序列的一部分相同。例如，在本发明的抗原结合分子的重链FR2序列为多个不同的人的种系框架序列的重链FR2序列组合得到的序列时，该抗原结合分子也是本发明的“含有种系序列”的抗原结合分子。此外，本发明的抗原结合分子的框架序列是经替换的序列时，该抗原结合分子也是本发明的“含有种系序列”的抗原结合分子。作为这种经替换的序列的实例，特别可举出：人的种系框架序列的一部分氨基酸被替换成使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸的序列。
作为框架的实例，例如优选列举现在已知的完全人型框架区的序列，其包含在V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中。这些框架区的序列能够适当用作本发明的抗原结合分子中所含的种系序列。种系序列可根据其相似性来分类（Tomlinson等（J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798）Williams和Winter（Eur. J. Immunol. (1993)23, 1456-1461）和Cox等（Nat. Genetics (1994) 7, 162-168））。可以从分类为7个亚类的Vκ、分类为10个亚类的Vλ、分类为7个亚类的VH中适宜选择优选的种系序列。
完全人型VH序列并不仅限于下述序列，优选可举出例如：VH1亚类（例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69）、VH2亚类（例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70）、VH3亚类（VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74）、VH4亚类（VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61）、VH5亚类（VH5-51）、VH6亚类（VH6-1）、VH7亚类（VH7-4、VH7-81）的VH序列等。它们也记载于公知文献（Matsuda等（J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975））等中，本领域技术人员可以根据它们的序列信息适当设计本发明的抗原结合分子。也可优选使用它们以外的完全人型框架或框架的亚区域(sub-region)。
完全人型Vκ序列并不仅限于下述序列，优选可举出例如：分类为Vk1亚类的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18；分类为Vk2亚类的A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11；分类为Vk3亚类的A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25；分类为Vk4亚类的B3；分类为Vk5亚类的B2（本说明书中也称为Vk5-2））；分类为Vk6亚类的A10、A14、A26等（Kawasaki等（Eur. J. Immunol. (2001) 31,1017-1028）、Schable和Zachau（Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022）和Brensing-Kuppers等（Gene (1997) 191, 173-181））。
完全人型的Vλ序列并不仅限于下述序列，优选可举出例如：分类为VL1亚类的V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22；分类为VL1亚类的V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19；分类为VL3亚类的V3-2、V3-3、V3-4；分类为VL4亚类的V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6；分类为VL5亚类的V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等（Kawasaki等（Genome Res. (1997) 7, 250-261））。
通常，这些框架序列根据一个或更多的氨基酸残基的区别而彼此不同。这些框架序列可以与本发明中的“使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用。作为与本发明的“使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用的完全人型框架的实例，并不仅限于此，另外还可举出KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等（例如，前述的Kabat等 (1991)和Wu等（J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250））。
本发明并不受特定理论的束缚，认为种系序列的使用有望排除大多数个体中的有害免疫反应的一个理由如下。通常的免疫反应中产生的亲和性成熟步骤的结果造成免疫球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的CDR的附近，对框架区的残基也造成影响。这些框架的突变在种系基因中不存在，而成为患者的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人群暴露于种系基因所表达的框架序列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些种系框架在患者中的免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性达到最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性种系基因的集合中选择。
为了制作本发明的、前述可变区序列的序列、重链可变区或轻链可变区的序列、或者CDR序列或框架序列中含有使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸的抗原结合分子，可以适宜采用位点特异性诱变法（Kunkel等（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1985) 82, 488-492））或重叠延伸 PCR等公知方法。
例如，通过将被选择作为预先含有使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基的CDR序列和/或框架序列的轻链可变区、与被制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，可以制作含有本发明的多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。
此外，也可以设计成前述被选择作为预先含有使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基的CDR序列和/或框架序列的重链和/或轻链可变区的序列中含有作为该氨基酸残基以外的残基的各种氨基酸。本发明中，这样的残基也被称为柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要根据组织特异性化合物的浓度条件而变化，则该柔性残基的数量和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。可以通过腺苷和/或ATP与抗体的复合体的结晶结构解析或导入突变来鉴定柔性残基以及能否将该残基替换为其它的何种氨基酸来制作文库。例如，根据腺苷和/或ATP与抗体的复合体的结晶结构解析，可以鉴定未参与腺苷和/或ATP的结合的抗体的残基。可以选择即使将被鉴定为不参与腺苷和/或ATP的结合的残基替换为其它氨基酸，也能将与化合物的结合维持于适当程度的氨基酸。藉此，可以设计选定氨基酸出现于选定残基的文库。该情形中，能够以形成将被鉴定为不参与腺苷和/或ATP的结合的残基替换为彼此不同的氨基酸而得的抗原结合分子的集合的方式，设计主要由多个抗原结合分子形成的文库。即，通过组合被替换为彼此不同的氨基酸的各柔性残基，可以带来含有该柔性残基的抗原结合分子的序列多样性。
此外，还能够以被鉴定为参与腺苷和/或ATP的结合的残基的至少一个是选自该残基和不同于该残基的残基中的任意残基的方式，设计包含这些残基的抗原结合分子。作为被鉴定为参与腺苷和/或ATP的结合的氨基酸的非限定的一个方案，可例示重链可变区中所含的52位、52a位、53位、96位、100a位、或100c位的氨基酸中的任一者以上的氨基酸等。另外，作为这种氨基酸的非限定的一个方案，可以例示含有在重链可变区中的52位的Ser、52a位的Ser、53位的Arg、96位的Gly、100a位的Leu、100c位的Trp等氨基酸中的任一者以上的氨基酸。例如，在前述100a位的Leu被鉴定为参与腺苷和/或ATP的结合时，文库中所含的抗原结合分子的100a位的氨基酸残基除了Leu之外，还可以是选自His、Met、Leu、Arg、Trp、或Tyr的任一柔性残基中的氨基酸残基。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示重链可变区中所含的31位、32位、33位、35位、50位、55位、56位、57位、58位、59位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、100a位、和100b位的氨基酸。作为这种氨基酸的其它的非限定的一个方案，可例示轻链可变区中所含的26位、27位、27a位、27b位、27c位、28位、29位、31位、32位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95a位、96位、和97位的氨基酸。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为重链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
31位的氨基酸为Asp、Gly、Asn、Ser、Arg、或Thr中的任一者，
32位的氨基酸为Ala、Phe、His、Asn、Ser、或Tyr中的任一者，
33位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Trp、Val、Tyr、或Thr中的任一者，
35位的氨基酸为His、Ser、Thr、Tyr、或Asn中的任一者，
50位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Ser中的任一者，
55位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Leu、Thr、Ser、Arg、或Asn中的任一者，
56位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Thr、Trp、Val、或Tyr中的任一者，
57位的氨基酸为Ala、Lys、Arg、Thr、或Ile中的任一者，
58位的氨基酸为Asp、Gly、Phe、His、Ser、Thr、Tyr、或Asn中的任一者，
59位的氨基酸为Leu、或Tyr中的任一者，
95位的氨基酸为Ala、Ile、Lys、Met、Leu、Arg、Trp、Val、Tyr、或Phe中的任一者，
96位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、或Ser中的任一者，
97位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Ser、Val、Tyr、或Arg中的任一者，
98位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Lys中的任一者，
99位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Phe、His、Lys、Asn、Gln、Ser、Arg、Trp、Val、Tyr、或Gly中的任一者，
100位的氨基酸为Ala、Glu、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asp中的任一者，
100a位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、His、Lys、Met、Arg、Trp、Val、或Tyr中的任一者，或者
100b位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asn中的任一者。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为轻链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
26位的氨基酸为Ala、Ser、或Thr中的任一者，
27位的氨基酸为Thr、或Ser中的任一者，
27a位的氨基酸为Gly、Asn、Thr、或Ser中的任一者，
27b位的氨基酸为Asn、或Asp中的任一者，
27c位的氨基酸为Ile、或Val中的任一者，
28位的氨基酸为Asp、或Gly中的任一者，
29位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Ser、Arg、Thr、Tyr、或Gly中的任一者，
31位的氨基酸为Glu、Asp、Lys、或Asn中的任一者，
32位的氨基酸为Ala、Asp、Ser、Thr、或Tyr中的任一者，
50位的氨基酸为Asp、Gly、Lys、Asn、Gln、Ser、Arg、Tyr、或Glu中的任一者，
51位的氨基酸为Asp、Gly、Lys、Asn、Thr、或Val中的任一者，
52位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、或Ser中的任一者，
53位的氨基酸为Glu、Asp、His、Asn、Gln、Ser、Tyr、或Lys中的任一者，
54位的氨基酸为Lys、或Arg中的任一者，
55位的氨基酸为Leu、或Pro中的任一者，
89位的氨基酸为Ala、Gly、Phe、Leu、Asn、Gln、Thr、Val、Tyr、或Ser中的任一者，
90位的氨基酸为Ala、Leu、Thr、Val、或Ser中的任一者，
91位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、His、Lys、Asn、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、或Tyr中的任一者，
92位的氨基酸为Glu、Asp、Ser、Arg、Thr、Val、Tyr、或Ala中的任一者，
93位的氨基酸为Ala、Asp、Ile、Asn、Ser、Arg、Thr、Val、Tyr、或Gly中的任一者，
94位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、Ile、Asn、Arg、Thr、或Ser中的任一者，
95位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asn中的任一者，
95a位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Ile、His、Lys、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Tyr、或Asn中的任一者，
96位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val中的任一者，或者
97位的氨基酸为Ala、Gly、Ile、Met、Leu、Ser、或Val中的任一者。
本说明书中，柔性残基是指在与公知和/或天然抗体或抗原结合结构域的氨基酸序列进行比较时，具有在该位置上出现的数个不同氨基酸的轻链和重链可变区上的氨基酸超变位置上存在的氨基酸残基的改变。超变位置通常存在于CDR区。一个方案中，在确定公知和/或天然抗体的超变位置时，Kabat, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (National Institute of Health Bethesda Md.) （1987年和1991年）所提供的数据是有效的。此外，因特网上的多个数据库（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html）中提供有收集的大量人轻链和重链的序列以及其配置，这些序列及其配置的信息对确定本发明中的超变位置有用。根据本发明，当氨基酸在某位置具有优选约2至约20、优选约3至约19、优选约4至约18、优选5至17、优选6至16、优选7至15、优选8至14、优选9至13、优选10至12个可能的不同氨基酸残基的多样性时，可以说该位置是超变的。在数个实施方案中，某氨基酸位置可以具有优选至少约2、优选至少约4、优选至少约6、优选至少约8、优选约10、优选约12个可能的不同氨基酸残基的多样性。
此外，通过将导入有前述使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和作为随机可变区序列文库而制作的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。同样地，通过将导入有前述使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基、并且使其以外的氨基酸残基设计为柔性残基的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。
将导入有前述使抗原结合分子对抗原的结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和作为随机可变区序列文库而制作的重链可变区组合的情形中，也可以与前述相同地，以柔性残基包含在该轻链可变区序列中的形式来设计。只要本发明的抗原结合分子的抗原结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化，则该柔性残基的数量和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。
作为要组合的重链可变区的实例，优选可举出随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适宜组合公知方法。本发明的非限定的一个方案中，根据用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因而构建的免疫文库可以优选用作随机可变区文库。
此外，在本发明的非限定的一个方案中，将基因组DNA中的V基因或重构功能性V基因的CDR序列用包含适当程度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组替换而得的合成文库也可以优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的CDR3的基因序列的多样性，因而也可仅替换CDR3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子的露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，根据抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出于表面和/或可与抗原接触的位置，通常为其CDR。露出于表面的位置优选使用InsightII程序(Accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法（例如，Lee和Richards（J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400）、Connolly（J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558））来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选列举SYBYL生物体高分子模量软件(Tripos Associates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于Pacios（Comput. Chem.(1994) 18 (4), 377-386和J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53）中。
此外，在本发明的非限定的一个方案中，为了提高抗体的稳定性，也可以适宜改变含有CDR区和/或框架区的可变区的氨基酸。作为这种氨基酸的非限定的一个方案，可以例示1位、5位、10位、30位、48位、58位的氨基酸。更具体地，可例示1位的Gln、5位的Gln、10位的Asp、30位的Asn、48位的Leu、58位的Asn。为了提高抗体的稳定性，可以将这些氨基酸替换为种系序列中所含的对应的氨基酸。作为这样的种系的非限定的一个方案的序列，可例示VH3-21的序列。该情形中，可以将1位的Gln替换为Glu、5位的Gln替换为Val、10位的Asp替换为Gly、30位的Asn替换为Ser、48位的Leu替换为Val、58位的Asn替换为Tyr。
进而，在本发明的非限定的一个方案中，由来源于正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且由其组成成分不含偏差的抗体序列即天然(naive)序列构成的天然文库也可特别优选用作随机可变区文库（Gejima等（Human Antibodies (2002) 11,121-129）和Cardoso等（Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344））。本发明中记载的包含天然序列的氨基酸序列是指由上述天然文库获得的氨基酸序列。
Fc区
Fc区包含来源于抗体重链恒定区的氨基酸序列。Fc区是从以EU编号表示的大约216位氨基酸的木瓜蛋白酶切割位点的铰链区N末端开始，包含该铰链、CH2和CH3结构域的抗体重链恒定区的一部分。Fc区可由人IgG1获得，但并不限于IgG的特定的亚类。作为该Fc区的优选实例，可举出如下所述在pH酸性范围内具有对FcRn的结合活性的Fc区。另外，该Fc区的优选实例还可举出如下所述具有Fcγ受体结合活性的Fc区。作为这种Fc区的非限定的一个方案，例示人IgG1（SEQ ID NO:5）、IgG2（SEQ ID NO:6）、IgG3（SEQ ID NO:7）、或IgG4（SEQ ID NO:8）所示的Fc区。
Fcγ受体（FcγR）
Fcγ受体（也记为FcγR）是指可与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体Fc区结合的受体，实质上指Fcγ受体基因所编码的蛋白家族的任意成员。就人而言，该家族包含：包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI（CD64）；包括同种型FcγRIIa（包括同种异型H131和R131。即，FcγRIIa (H)和FcγRIIa (R)）、FcγRIIb（包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2）和FcγRIIc的FcγRII（CD32）；以及包括同种型FcγRIIIa（包括同种异型V158和F158。即，FcγRIIIa (V)和FcγRIIIa (F)）和FcγRIIIb（包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2）的FcγRIII（CD16）、以及任何未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限定于此。FcγR可来源于任意的生物，包括人、小鼠、大鼠、兔和猴，但并不限定于此。小鼠FcγR类中包括：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）和FcγRIII-2（FcγRIV、CD16-2）、以及任意的未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或异型，但并不限定于此。作为这种Fcγ受体的优选例子，可举出：人FcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32）、FcγRIIb（CD32）、FcγRIIIa（CD16）和/或FcγRIIIb（CD16）。人FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：9（NM_000566.3）和10（NP_000557.1）中；人FcγRIIa（同种异型H131）的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：11（BC020823.1）和12（AAH20823.1）（同种异型R131是SEQ ID NO：12的166位的氨基酸被替换为Arg的序列）中；FcγRIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：13（BC146678.1）和14（AAI46679.1）中；FcγRIIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：15（BC033678.1）和16（AAH33678.1）中；和FcγRIIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：17（BC128562.1）和18（AAI28563.1）中（括号内示出RefSeq等数据库登录编号）。Fcγ受体对IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区是否具有结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选（Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay）或利用表面等离子共振（SPR）现象的BIACORE法等来确认（Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010）。
包括FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI（CD64）以及包括同种型FcγRIIIa（含有异型V158和F158）和FcγRIIIb（含有异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2）的FcγRIII（CD16）中，与IgG的Fc区结合的α链和具有在细胞内传导活化信号的ITAM的共有γ链缀合。另一方面，包括同种型FcγRIIa（包括同种异型H131和R131）和FcγRIIc的FcγRII（CD32）自身的细胞质结构域中含有ITAM。这些受体表达于巨噬细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞等众多免疫细胞。通过这些受体与IgG的Fc区结合而传递的活化信号使得巨噬细胞吞噬能力、炎性细胞因子的产生、肥大细胞的脱粒、抗原呈递细胞的功能亢进受到促进。如上所述，具有传导活化信号能力的Fcγ受体在本说明书中也称为活性型Fcγ受体。
另一方面，FcγRIIb（包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2）自身的细胞质内结构域中含有传递抑制型信号的ITIM。B细胞中，FcγRIIb和B细胞受体（BCR）的交联使得来自BCR的活化信号受到抑制，结果BCR的抗体产生受到抑制。巨噬细胞中，FcγRIII与FcγRIIb的交联使得吞噬能力和炎性细胞因子的产生能力受到抑制。如上所述，具有传导抑制信号能力的Fcγ受体在本说明书中也称为抑制型Fcγ受体。
Fc区对FcγR的结合活性
如上所述，作为本发明的抗原结合分子所含的Fc区，可举出具有Fcγ受体结合活性的Fc区。作为这种Fc区的非限定的一个方案，例示人IgG1（SEQ ID NO:5）、IgG2（SEQ IDNO:6）、IgG3（SEQ ID NO:7）、或IgG4（SEQ ID NO:8）所示的Fc区。Fcγ受体对IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区是否具有结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）或利用表面等离子共振（SPR）现象的BIACORE法等来确认（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006)103 (11), 4005-4010）。
ALPHA筛选是通过使用供体和受体这2种珠的ALPHA技术基于下述原理来实施。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子发生生物学相互作用，仅在2种珠接近的状态时检测出发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周围的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散至供体珠周围，到达接近的受体珠时，引起珠内的化学发光反应，最终发出光。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不会到达受体珠，因而不会引起化学发光反应。
例如，将含有经生物素标记的Fc区的抗原结合分子与供体珠结合，将经谷胱甘肽S转移酶（GST）标签化的Fcγ受体与受体珠结合。在包含竞争Fc区改变体的抗原结合分子的非存在下，具有天然型Fc区的抗原结合分子与Fcγ受体发生相互作用，产生520-620 nm的信号。含有没有标签的Fc区改变体的抗原结合分子与具有天然型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体间的相互作用。通过对反映竞争结果的荧光的减少进行定量，可以确定相对结合亲和性。使用Sulfo-NHS-生物素等来将抗体等抗原结合分子生物素化是公知的。作为用GST将Fcγ受体标签化的方法，可适宜地采用下述方法：将编码Fcγ受体的多核苷酸和编码GST的多核苷酸进行框内融合而成的融合基因可操作地与载体连接，在保持有该载体的细胞等中进行表达，使用谷胱甘肽柱来进行纯化。所得的信号可以通过使用例如GRAPHPADPRISM（GraphPad社、San Diego）等软件，与利用非线性回归分析的单位点竞争（one-sitecompetition）模型拟合而适宜地分析。
将观察相互作用的物质的一方（配体）固定在传感器芯片的金薄膜上，若从传感器芯片的背侧接受光以使在金薄膜和玻璃的界面发生全反射，则反射光的一部分会形成反射强度降低的部分（SPR信号）。将观察相互作用的物质的另一方（分析物）加载于传感器芯片的表面，配体和分析物若结合，则固定的配体分子的质量会增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率会发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生偏移（相反，若结合发生解离则信号的位置会返回）。Biacore系统将上述偏移的量、即传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据表示（传感图）。由传感图的曲线可求出动力学参数：结合速度常数（ka）和解离速度常数(kd），由此该常数之比可求出亲和性（KD）。BIACORE法中还优选使用抑制测定法。抑制测定法的实例记载在Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(2006) 103 (11), 4005-4010中。
Fcγ受体（FcγR）结合改变Fc区
作为本发明所含的Fc区，除了人IgG1（SEQ ID NO:5）、IgG2（SEQ ID NO:6）、IgG3（SEQ ID NO:7）、或IgG4（SEQ ID NO:8）所示的Fc区之外，还可适宜使用Fcγ受体结合活性较天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高的FcγR结合改变Fc区。本说明书中，“天然型人IgG的Fc区”意指与SEQ ID NO:5、6、7或8所示的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的Fc区。这种FcγR结合改变Fc区可通过改变天然型人IgG的Fc区的氨基酸来制作。FcγR结合改变Fc区的FcγR结合活性是否比天然型人IgG的Fc区的FcγR结合活性高，这可以采用上述结合活性一项中记载的方法来适当实施。
本发明中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。只要起始Fc区的修饰改变体可以在pH中性范围与人Fcγ受体结合，则可使用任何Fc区作为起始Fc区。此外，将已进行了改变的Fc区作为起始Fc区并进一步进行了改变而得到的Fc区也可优选用作本发明的Fc区。起始Fc区可指多肽自身、含有起始Fc区的组合物或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可包括抗体一项中概述的通过重组产生的公知的Fc区。对起始Fc区的来源没有限定，可由非人动物的任意生物或人获得。作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、和非人灵长类中的生物。在其他方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩或人获得。优选起始Fc区可由人IgG1获得，但不限于IgG的特定类别。这意味着可适宜使用人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc区作为起始Fc区。同样地，本说明书中也意指可以将来源于前述任意生物的IgG的任意种类或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG的变体或修饰型的实例记载于公知文献（Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91、Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470、Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23(4), 195-202、国际公开WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、和WO2006/105338）中，但并不受其限定。
作为改变的实例，包括一个以上的变异，例如替换成与起始Fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的变异、或者向起始Fc区的氨基酸中插入一个以上的氨基酸残基或从起始Fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选改变后的Fc区氨基酸序列包含含有非天然产生的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变体与起始Fc区必然具有不足100%的序列同一性或相似性。在优选的实施方案中，变体具有与起始Fc区的氨基酸序列为约75%～小于100%的氨基酸序列同一性或类似性、更优选为约80%～小于100%、更优选为约85%～小于100%、更优选为约90%～小于100%、最优选为约95%～小于100%的同一性或类似性的氨基酸序列。在本发明的非限定的一个方案中，起始Fc区和本发明的FcγR结合改变Fc区之间具有至少1个氨基酸的差异。起始Fc区与本发明的FcγR结合改变Fc区的氨基酸的不同可优选通过特别是上述的以EU编号特定的氨基酸残基位置的特定氨基酸的不同来规定。这种变体的制作方法例示于“氨基酸对改变”一项。
本发明的抗原结合分子所含的、Fcγ受体结合活性高于天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性的FcγR结合改变Fc区（FcγR结合改变Fc区）可通过任意方法获得，具体地，可通过被用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸的改变来获得该FcγR结合改变Fc区。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如，SEQ ID NO:5、6、7或8所示的人IgG（IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、和它们的改变体）的Fc区。
对于向其它氨基酸的改变，只要Fcγ受体结合活性较天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高，则任何位置的氨基酸均可改变。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情况下，优选包含带来Fcγ受体结合活性较与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高的效果的改变。作为这种氨基酸的改变，例如在国际公开WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260和WO2006/023403等中有报道。
作为可进行这种改变的氨基酸，例如，可举出选自以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位中的至少一个以上的氨基酸。通过这些氨基酸的改变，可以获得Fcγ受体结合活性较天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高的Fc区（FcγR结合改变Fc区）。
为了在本发明中使用，作为特别优选的改变，例如，可举出Fc区的以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸的改变：
221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一者，
222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一者，
223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一者，
224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一者，
225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一者，
227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者，
228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者，
230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一者，
231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一者，
232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者，
233位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
234位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
235位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
236位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
237位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
238位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
239位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一者，
241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一者，
243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一者，
244位的氨基酸为His，
245位的氨基酸为Ala，
246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一者，
247位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中的任一者，
249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一者，
250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一者，
251位的氨基酸为Phe，
254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一者，
255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一者，
256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一者，
258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一者，
260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一者，
262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一者，
263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一者，
264位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
265位的氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一者，
267位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
268位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中的任一者，
269位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
270位的氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
271位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
272位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一者，
274位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一者，
276位的氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
278位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一者，
279位的氨基酸为Ala，
280位的氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中的任一者，
281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一者，
282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一者，
283位的氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中的任一者，
284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一者，
285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一者，
286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一者，
288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一者，
290位的氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一者，
292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一者，
293位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
294位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
295位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
296位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一者，
297位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
298位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
299位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一者，
300位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一者，
301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一者，
302位的氨基酸为Ile，
303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一者，
304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一者，
305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一者，
313位的氨基酸为Phe，
315位的氨基酸为Leu，
317位的氨基酸为Glu或Gln，
318位的氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中的任一者，
320位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
322位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
323位的氨基酸为Ile，
324位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
325位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
326位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
327位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
328位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
329位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
330位的氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
331位的氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
332位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
333位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中的任一者，
334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一者，
335位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一者，
336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一者，
337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一者，
339位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中的任一者，
376位的氨基酸为Ala或Val中的任一者，
377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一者，
378位的氨基酸为Asp，
379位的氨基酸为Asn，
380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一者，
382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一者，
385位的氨基酸为Glu，
392位的氨基酸为Thr，
396位的氨基酸为Leu，
421位的氨基酸为Lys，
427位的氨基酸为Asn，
428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一者，
429位的氨基酸为Met，
434位的氨基酸为Trp，
436位的氨基酸为Ile、或者
440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一者。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为两处以上的氨基酸改变的组合，例如可举出如表1（表1-1～表1-3）中记载的组合。
表1-2是表1-1的续表。
表1-3是表1-2的续表。
测定本发明的抗原结合分子所含的Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合活性的pH条件可以适宜使用pH酸性范围至pH中性范围的条件。作为测定本发明的抗原结合分子所含的Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合活性的条件的pH酸性范围至pH中性范围，通常意指pH5.8～pH8.0。优选为由pH6.0 ～pH7.4的任意pH值表示的范围，优选从pH6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3和7.4中选择，特别优选为与癌组织的pH接近的pH6.15～7.4（Vaupel等（Cancer Res. (1989) 49, 6449-6665））。作为在测定条件中使用的温度，Fcγ受体结合结构域与人Fcγ受体的结合亲和性可在10℃～50℃的任意温度下进行评价。为了确定人Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合亲和性，优选使用15℃～40℃的温度。更优选诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35℃中的任一者的20℃至35℃的任意温度也同样用于确定Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合亲和性。25℃的温度是本发明的方案的非限定的一例。
本说明书中，FcγR结合改变Fc区的Fcγ受体结合活性较天然型Fc区的Fcγ受体结合活性高是指，FcγR结合改变Fc区的FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一者的人Fcγ受体结合活性比天然型Fc区对这些人Fcγ受体的结合活性高。例如，基于上述分析方法，与作为对照的包含人IgG的天然型Fc区的抗原结合分子的结合活性进行比较，包含FcγR结合改变Fc区的抗原结合分子的结合活性显示出105%以上、优选110%以上、115%以上、120%以上、125%以上、特别优选130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上的结合活性。作为天然型Fc区，既可以使用起始Fc区，也可以使用相同亚类的抗体的天然型Fc区。
本发明中，作为对照的人IgG的天然型Fc区，优选使用与以EU编号表示的297位的氨基酸结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区。与以EU编号表示的297位的氨基酸结合的糖链是否为含岩藻糖的糖链，可以采用非专利文献6中记载的方法。例如，通过下述的方法，可以判定与天然型人IgG的Fc区结合的糖链是否为含岩藻糖的糖链。通过使N-糖苷酶F(Roche diagnostics)与被测天然型人IgG反应，糖链从被测天然型人IgG中游离出来（Weitzhandler等（J. Pharma. Sciences (1994) 83, 12, 1670-1675）。接着，将与乙醇反应而除去了蛋白的反应液（Schenk等（J. Clin. Investigation (2001) 108 (11)1687-1695）的浓缩干固物用2-氨基吡啶进行荧光标记（Bigge等（Anal. Biochem. (1995)230 (2) 229-238)。将经过使用纤维素过滤筒的固相提取进行了脱试剂的、经荧光标记的2-AB化糖链通过正相层析进行分析。通过观察所检测的色谱图的峰，可以判定与人IgG的天然型Fc区结合的糖链是否是含岩藻糖的糖链。
作为对照的包含相同亚类的抗体的天然型Fc区的抗原结合分子，可以适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于SEQ ID NO:5（数据库注册号AAC82527.1的N末端添加有A）、6（数据库注册号AAB59393.1的N末端添加有A）、7（数据库注册号CAA27268.1）、和8（数据库注册号AAB59394.1的N末端添加有A）。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，来验证包含被测Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
具有选择性Fcγ受体结合活性的Fc区
此外，作为本发明中优选使用的Fcγ受体结合结构域的实例，还优选举出：具有对特定Fcγ受体的结合活性较其他Fcγ受体结合活性高的性质的Fcγ受体结合结构域（具有选择性Fcγ受体结合活性的Fcγ受体结合结构域）。使用抗体作为抗原结合分子（使用Fc区作为Fcγ受体结合结构域）时，由于一分子的抗体只能与一分子的Fcγ受体结合，因此一分子的抗原结合分子在与抑制型Fcγ受体结合的状态下无法与其它活性型FcγR结合，在与活性型Fcγ受体结合的状态下也无法与其它活性型Fcγ受体或抑制型Fcγ受体结合。
活性型Fcγ受体结合活性较抑制型Fcγ受体结合活性高的Fc区
如上所述，作为活性型Fcγ受体，优选可举出：包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI（CD64）、包含FcγRIIa以及FcγRIIIa（包括同种异型V158和F158）和FcγRIIIb（包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2）的FcγRIII（CD16）。此外，作为抑制型Fcγ受体的优选实例，可举出FcγRIIb（包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2）。
本说明书中，作为对特定的Fcγ受体的结合活性较其以外的Fcγ受体结合活性高的实例，可举出例如，活性型Fcγ受体结合活性高于抑制型Fcγ受体结合活性的情形。此时是指Fc区对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性高于对FcγRIIb的结合活性。例如，是指基于上述分析方法，含有Fc区的抗原结合分子对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性表现出对FcγRIIb的结合活性的105%以上、优选110%以上、120%以上、130%以上、140%以上、特别优选150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上的结合活性。活性型Fcγ受体结合活性较抑制型Fcγ受体结合活性高的Fc区可优选包含在抗原结合结构域与膜型分子结合的本发明的抗原结合分子中。已知含有这种Fc区的IgG1抗体会增强后述的ADCC活性，因此含有该Fc区的抗原结合分子可用作本发明的药物组合物中所含的抗原结合分子。
在本发明的非限定的一个方案中，作为活性型Fcγ受体结合活性较抑制型Fcγ受体结合活性高（对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性）的Fc区的实例，优选可举出：选自前述以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位中的至少一个以上的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。
在本发明的非限定的一个方案中，作为活性型Fcγ受体结合活性较抑制型Fcγ受体结合活性高（对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性）的Fc区的实例，优选可举出表1-1至1-3中记载的多个氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。
抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高的Fc区
本说明书中，作为对特定Fcγ受体的结合活性较对其以外的Fcγ受体的结合活性高的实例，可举出例如，抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高的情形。此时是指Fc区对FcγRIIb的结合活性较对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性高。例如，是指基于上述分析方法，含有Fc区的抗原结合分子对FcγRIIb的结合活性表现出对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性的105%以上、优选110%以上、120%以上、130%以上、140%以上、特别优选150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上的结合活性。抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高的Fc区可优选包含在抗原结合结构域与可溶型分子结合的本发明的抗原结合分子中。
在本发明的非限定的一个方案中，作为抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高（对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性）的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的238或328的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。
另外，在本发明的非限定的一个方案中，作为抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高（对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性）的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。此外，作为对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性的Fc区，还可以适宜选择US2009/0136485中记载的Fc区或改变。
另外，在本发明的非限定的一个方案中，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。
进而，在本发明的非限定的一个方案中，可优选举出PCT/JP2012/054624中所例示的改变为下述任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238位的Pro替换为Asp、以及以EU编号表示的237位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Phe、以EU编号表示的267位的氨基酸为Val、以EU编号表示的267位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly、以EU编号表示的326位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的326位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Met、以EU编号表示的239位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的267位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的234位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的234位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的237位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的237位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Met、以EU编号表示的237位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的330位的氨基酸为Lys、以EU编号表示的330位的氨基酸为Arg、以EU编号表示的233位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ser、以EU编号表示的326位的氨基酸为Thr、以EU编号表示的323位的氨基酸为Ile、以EU编号表示的323位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的323位的氨基酸为Met、以EU编号表示的296位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的330位的氨基酸为Met。
糖链经修饰的Fc区
作为本发明所提供的抗原结合分子所含的Fc区，还可包含下述Fc区：其是以与Fc区结合的糖链的组成中结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例变高的方式、或添加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区的比例变高的方式进行了修饰的Fc区。已知若从与抗体Fc区结合的N-糖苷结合复合型糖链还原末端的N -乙酰葡萄糖胺除去岩藻糖残基，则对FcγRIIIa的亲和性增强（非专利文献6）。已知含有这种Fc区的IgG1抗体会增强后述的ADCC活性，因此含有该Fc区的抗原结合分子可用作本发明的药物组合物中所含的抗原结合分子。作为从与抗体Fc区结合的N -糖苷结合复合型糖链还原末端的N -乙酰葡萄糖胺除去了岩藻糖残基的抗体，例如是如下所述的抗体：
经糖基化修饰的抗体（国际公开WO1999/054342等），
添加于糖链的岩藻糖缺陷的抗体（国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等）。
更具体地，作为从与抗体Fc区结合的N -糖苷结合复合型糖链还原末端的N -乙酰葡萄糖胺除去了岩藻糖残基的抗体的不同的非限定的一个方案，为了制作添加于糖链的岩藻糖缺陷的抗体（国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等），改变要受糖链修饰的多肽的形成糖链结构的活性，结果制作对糖链添加岩藻糖的能力低的宿主细胞。通过在该宿主细胞中表达所期望的抗体基因，可以从该宿主细胞的培养液中回收该糖链中的岩藻糖缺陷的该抗体。作为形成多肽的糖链结构的活性，可举出选自下述中的酶或转运体的活性作为非限定的优选实例：岩藻糖基转移酶（EC 2.4.1.152）、岩藻糖转运体（SLC35C1）、GMD（GDP-甘露糖-4,6-脱水酶）（EC 4.2.1.47）、Fx（GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3，5-表异构酶，4-还原酶）（EC 1.1.1.271）、和GFPP（GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶）（EC2.7.7.30）。这些酶或转运体只要可以发挥其活性，则不必规定其结构。本说明书中，将可以发挥这些活性的蛋白称为功能性蛋白。作为改变这些活性的方法的非限定的一个方案，可举出这些活性的缺失。为了制作这些活性缺失的宿主细胞，可以适宜采用破坏这些功能性蛋白的基因使之不能发挥功能的方法等公知的方法（国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等）。这种活性缺失的宿主细胞可通过破坏对CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、HEK293细胞、或杂交瘤细胞等为内源性的这些功能性蛋白的基因使之不能发挥功能的方法等来制作。
包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体（国际公开WO2002/079255等）是公知的。在非限定的一个方案中，为了制作包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体，制备表达下述基因的宿主细胞，该基因编码具有GnTIII（β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶）（EC 2.4.1.144）活性或GalT（β-1,4-半乳糖基转移酶）（EC 2.4.1.38）活性的功能性蛋白。在其它非限定的优选的一个方案中，制作除了前述功能性蛋白之外，还共表达编码具有人ManII（甘露糖苷酶II）（3.2.1.114）活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTI（β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶I）（EC 2.4.1.94）活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTII（β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶II）（EC 2.4.1.143）活性的功能性蛋白的基因、编码具有ManI（甘露糖苷酶）（EC 3.2.1.113）活性的功能性蛋白的基因、和α-1,6-岩藻糖基转移酶（EC 2.4.1.68）的宿主细胞（国际公开WO2004/065540）。
通过对如上所述的对糖链添加岩藻糖的能力低的宿主细胞、和具有形成含有平分型GlcNAc结构的糖链的活性的宿主细胞转染含有抗体基因的表达载体，分别可制作从与抗体Fc区结合的N -糖苷结合复合型糖链还原末端的N -乙酰葡萄糖胺除去了岩藻糖残基的抗体、和包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体。这些抗体的制造方法也可以适用于含有改变Fc区的抗原结合分子的制造方法，所述改变Fc区是以与本发明的Fc区结合的糖链的组成中结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例变高的方式、或添加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区的比例变高的方式经修饰的改变Fc区。通过这种制造方法制作的与本发明的抗原结合分子所含的Fc区结合的糖链的组成可通过前述“Fcγ受体（FcγR）结合改变Fc区”中记载的方法来确认。
多特异性抗原结合分子或多互补位的抗原结合分子
从其反应特异性的观点考虑，将具有如下特征且包含至少两个抗原结合结构域的抗原结合分子称作多特异性抗原结合分子：其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合，其至少一个其他的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合。抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的两种抗原结合结构域与两个不同的表位结合时，该抗原结合分子被称作双特异性抗原结合分子。此外，抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的三种抗原结合结构域与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作三特异性抗原结合分子。
与抗原分子中的第一表位结合的抗原结合结构域中的互补位和与结构不同于第一表位的第二表位结合的抗原结合结构域中的互补位的结构彼此不同。所以，从其结构特异性的观点考虑，具有如下特征且包含至少两个抗原结合结构域的抗原结合分子被称作多互补位的抗原结合分子：其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合，其至少一个其他的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合。抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的两种抗原结合结构域与两个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作双互补位的抗原结合分子。此外，抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的三种抗原结合结构域与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作三互补位的抗原结合分子。
包含一个或多个抗原结合结构域的多价多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法还记载在Conrath等（J.Biol.Chem. (2001) 276 (10) 7346-7350）、Muyldermans（Rev. Mol. Biotech. (2001) 74, 277-302）和Kontermann R.E. (2011)Bispecific Antibodies（Springer-Verlag）等非专利文献、以及国际公开WO1996/034103或WO1999/023221等专利文献等中。通过利用其中记载的多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法，可以制作本发明的抗原结合分子。
双特异性抗体及其制作方法
作为如上所述的多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法的一个方案，以下例示双特异性抗体及其制作方法。双特异性抗体是指包含与不同表位进行特异性结合的两种可变区的抗体。IgG型双特异性抗体可由通过融合两种产生IgG抗体的杂交瘤而产生的杂交的杂交瘤(quadroma)来分泌（Milstein等（Nature (1983) 305, 537-540）。
利用上述抗体一项中记载的重组方法制造双特异性抗体时，可以采用将编码包含两种目标可变区的重链的基因导入细胞中使其共表达的方法。但是，仅考虑这种共表达方法中的重链的组合，也会形成下述的(i)、(ii)、(iii)的组合以2：1：1的分子数的比例存在的混合物：(i)包含与第一表位结合的可变区的重链和包含与第二表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合、(ii)只是包含与第一表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合、(iii)只是包含与第二表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合。难以从这三种重链组合的混合物中纯化包含目标重链组合的抗原结合分子。
利用这种重组方法制造双特异性抗体时，通过对构成重链的CH3结构域进行适当的氨基酸替换的改变，可以优先分泌包含异源组合的重链的双特异性抗体。具体地，有下述方法：将存在于一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链替换成更大的侧链(knob(意为“突起”))、将存在于另一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链替换成更小的侧链(hole(意为“空隙”))，从而使突起能够配置在间隙内，以促进异种的重链形成和抑制同种的重链形成（国际公开WO1996027011、Ridgway等（Protein Engineering (1996) 9, 617-621）、Merchant等（Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681））。
此外，还已知通过将控制多肽的缔合或由多肽构成的异源多聚体的缔合的方法用于重链的缔合来制作双特异性抗体的技术。即，在双特异性抗体的制作中可以采用下述方法：通过改变形成重链内的界面的氨基酸残基，而控制成抑制具有相同序列的重链的缔合且形成序列不同的两个重链（国际公开WO2006/106905）。在制造双特异性抗体时也可以采用这样的方法。
作为本发明的非限定的一个方案中的抗原结合分子所含的Fc区，可适当使用形成以上述的双特异性抗体为来源的Fc区的两个多肽。更具体地，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的349位氨基酸为Cys、366位氨基酸为Trp，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Cys、366位氨基酸为Ser、368氨基酸为Ala、407位氨基酸为Val。
作为另外的本发明的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp，在另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys。在上述方案中，409位氨基酸可以是Glu以代替Asp，399位氨基酸可以是Arg以代替Lys。此外，除399位氨基酸Lys以外，还可以适当追加作为360位氨基酸的Asp或作为392位氨基酸的Asp。
作为本发明的另外的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的357位氨基酸为Lys。
作为本发明的另外的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys。
作为本发明的其它的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用上述组合得到的以下方案中的任一者：
(i) 形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、370位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys (本方案中，以EU编号表示的370位氨基酸可以是Asp以代替Glu，可以是以EU编号表示的392位氨基酸的Asp以代替370位氨基酸的Glu)；
(ii) 形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys (在本方案中，可以是以EU编号表示的360位氨基酸的Asp以代替439位氨基酸的Glu、可以是以EU编号表示的392位氨基酸的Asp或439位氨基酸的Asp)；
(iii) 形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的357位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys；或者
形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、370位氨基酸为Glu、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys (本方案中，以EU编号表示的370位氨基酸可以替换成Glu，而且370位氨基酸不替换成Glu，并且439位氨基酸Glu可以替换成Asp、或者392位氨基酸Asp可以替换成439位氨基酸Glu)。
进而，在本发明的其它的非限定的一个方案中，还优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的435位氨基酸为Arg、439位氨基酸为Glu。
进而，在本发明的其它的非限定的一个方案中，还优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu、435位氨基酸为Arg、439位氨基酸为Glu。
此外，除上述的异种重链的缔合技术外，为了制作本发明提供的多特异性或多互补位的抗原结合分子，还可以使用以下的作为异种轻链的缔合技术而已知的CrossMab技术：使形成与第一表位结合的可变区的轻链和形成与第二表位结合的可变区的轻链分别与形成与第一表位结合的可变区的重链和形成与第二表位结合的可变区的重链缔合（Scaefer等（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (2011) 108, 11187-11192））。此外，为了制作本发明所提供的多特异性或多互补位抗原结合分子，还可使用以下的作为异种重链的缔合技术而已知的Fab-Arm Exchange：利用不同的IgG4重链彼此发生交换，使形成与第一表位结合的可变区的重链和形成与第二表位结合的可变区的重链缔合(Labrijn等(Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013) 110, 5145-5150)、WO2008119353)。
效应细胞
本发明中，“效应细胞”可以以包括T细胞（CD4+（辅助淋巴细胞）T细胞和/或CD8+（细胞毒性）T细胞）、多核白细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞）、单核细胞、巨噬细胞、组织细胞或自然杀伤细胞（NK细胞）、NK样T细胞、库普弗细胞、朗格汉斯细胞、或淋巴因子活化杀伤细胞（LAK细胞）等白细胞、B淋巴细胞、或者树突细胞或巨噬细胞等抗原提呈细胞的最广义的含义来使用，作为优选的效应细胞的实例，可举出CD8+（细胞毒性）T细胞、NK细胞、或巨噬细胞。只要是表达于效应细胞的细胞膜的膜型分子，则可以用作本发明的抗原结合分子所含的至少1个抗原结合结构域所结合的抗原，作为优选的膜型分子，可例示作为非限定性实例的构成TCR的多肽、CD3、CD2、CD28、CD44、CD16、CD32、CD64、或NKG2D或者NK细胞活化配体。
细胞毒性物质
为了本发明的抗原结合分子与癌细胞结合而发挥细胞毒性，细胞毒性物质可以结合于抗原结合分子。作为细胞毒性物质，可以是以下例示的化学治疗药，也可以是CurrOpin Chem Biol (2010) 14, 529-37或国际公开2009/140242中公开的化合物，这些化合物通过适当的接头等与抗原结合分子结合。将本发明的抗原结合分子用作药物组合物时，可以在将该抗原结合分子给予对象（被测者、患者等）前，使这些细胞毒性物质与该抗原结合分子结合，也可以在给予前后或同时给予这些细胞毒性物质。
此外，结合有后述的化学治疗药、毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质的修饰抗原结合分子修饰物也可适宜地用作本发明的具有细胞毒性的抗原结合分子。这种修饰抗原结合分子（以下，称为抗原结合分子药物缀合物）可通过对所得抗原结合分子进行化学修饰而获得。另外，作为抗原结合分子的修饰方法，可适宜使用在抗体药物缀合物等领域中已经确立的方法。此外，结合有毒性肽的修饰抗原结合分子可通过将编码该毒性肽的基因与编码本发明的抗原结合分子的基因框内连接得到的融合基因在适当的宿主细胞中表达后，从该细胞的培养液中分离而获得。
与本发明的抗原结合分子结合的化学治疗药可以例示：阿扎立平（azaribine）、阿那曲唑（anastrozole）、阿扎胞苷（azacytidine）、博莱霉素（bleomycin）、波替单抗（bortezomib）、苔藓抑素-1（bryostatin-1）、白消安（busulfan）、喜树碱（camptothecin）、10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin）、卡莫司汀（carmustine）、塞来昔布（celebrex）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）、顺铂（cisplatin）、伊立替康（irinotecan）、卡铂（carboplatin）、克拉曲滨（cladribine）、环磷酰胺（cyclophosphamide）、阿糖胞苷（cytarabine）、达卡巴嗪（dacarbazine）、多西他赛（docetaxel）、放射菌素（dactinomycin）、柔红霉素葡萄糖醛酸化物（daunomycin glucuronide）、柔红霉素（daunorubicin）、地塞米松（dexamethasone）、二乙基己烯雌酚（diethylstilbestrol）、阿霉素（doxorubicin）、阿霉素葡萄糖醛酸化物（doxorubicin glucuronide）、表阿霉素（epirubicin）、乙炔基雌二醇（ethinyl estradiol）、雌莫司汀（estramustine）、依托泊苷（etoposide）、依托泊苷葡萄糖醛酸化物（etoposide glucuronide）、氟苷（floxuridine）、氟达拉滨（fludarabine）、氟他胺（flutamide）、氟尿嘧啶（fluorouracil）、氟羟甲睾酮（fluoxymesterone）、吉西他滨（gemcitabine）、己酸羟孕酮（hydroxyprogesteronecaproate）、羟基脲（hydroxyurea）、去甲氧基柔红霉素（idarubicin）、异环磷酰胺（ifosfamide）、甲酰四氢叶酸（leucovorin）、洛莫司汀（lomustine）、美登醇（maytansinoid）、氮芥（mechlorethamine）、醋酸甲羟孕酮（medroxyprogesteroneacetate）、醋酸甲地孕酮（megestrol acetate）、美法仑（melphalan）、巯基嘌呤（mercaptopurine）、甲氨蝶呤（methotrexate）、米托蒽醌（mitoxantrone）、光神霉素（mithramycin）、丝裂霉素（mitomycin）、米托坦（mitotane）、丁酸苯酯（phenylbutyrate）、强的松（prednisone）、甲苄肼（procarbazine）、紫杉醇（paclitaxel）、喷司他丁（pentostatin）、司莫司丁（semustine）、链脲菌素（streptozocin）、它莫西芬（tamoxifen）、紫杉醇类 （taxanes）、紫杉醇（taxol）、丙酸睾酮（testosterone propionate）、沙利度胺（thalidomide）、硫鸟嘌呤（thioguanine）、三胺硫磷（thiotepa）、替尼泊苷（teniposide）、拓扑替康（topotecan）、脲嘧啶氮芥（uracil mustard）、长春碱（vinblastine）、长春瑞滨（vinorelbine）、长春新碱（vincristine）。
本发明中，优选的化学治疗药为低分子的化学治疗药。低分子的化学治疗药在与本发明的抗原结合分子结合后，干涉抗原结合分子的功能的可能性也低。本发明中，低分子的化学治疗药通常具有100～2000、优选200～1000的分子量。这里例示的化学治疗药均为低分子的化学治疗药。这些本发明中的化学治疗药包括在生物体内转化为活性化学治疗药的前药。前药的活化可以是酶转化，也可以是非酶转化。
此外，作为与本发明的抗原结合分子结合的细胞毒性物质，还可例示假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)、肥皂草素-s6(Saporin-s6)、白喉毒素(Diphtheriatoxin)、海葵毒素(Cnidarian toxin)等毒性肽（毒素）或放射碘(Radioiodine)、光敏剂(Photosensitizer)。作为毒性肽的实例，例如，优选可举出下述毒性肽。
白喉毒素A链（Diphtheria toxin A Chain）（Langone等（Methods in Enzymology(1983) 93, 307-308））；
假单胞菌外毒素（Pseudomonas Exotoxin）（Nature Medicine (1996) 2, 350-353）；
蓖麻毒素链（Ricin A Chain）（Fulton等（J. Biol. Chem. (1986) 261, 5314-5319）、Sivam等（Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173）、Cumber等、（J. Immunol. Methods(1990) 135,15-24、Wawrzynczak等（Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562）、和Gheeite 等（J. Immunol.Methods (1991) 142,223-230））；
无糖链蓖麻毒素A链（Deglicosylated Ricin A Chain）（Thorpe等（Cancer Res.(1987) 47, 5924-5931））；
相思豆毒素A链（Abrin A Chain）（Wawrzynczak等（Br. J. Cancer (1992) 66,361-366）、Wawrzynczak等（Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562）、Sivam等（Cancer Res.(1987) 47, 3169-3173）、和Thorpe等（Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931））；
白树毒素（Gelonin）（Sivam等（Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173）、Cumber等（J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24）、Wawrzynczak等（Cancer Res., (1990) 50,7519-7562）、和Bolognesi等（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
美洲商陆抗病毒蛋白（PAP-s; 来源于种子的美洲商陆抗病毒蛋白）（Bolognesi等（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
ブリオジン（Briodin）（Bolognesi等（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
皂草素（Saporin）（Bolognesi等（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
木鳖子苷（Momordin）（Cumber等（J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24）；Wawrzynczak等（Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562）、和Bolognesi等（Clin. exp.Immunol. (1992) 89, 341-346））；
木鳖糖蛋白（Momorcochin）（Bolognesi等（Clin. exp. Immunol. (1992) 89,341-346））；
石竹素32（Dianthin 32）（Bolognesi等（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
石竹素30（Dianthin 30）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195,1-8））；
莫迪素（Modeccin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；
槲寄生凝集素（Viscumin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195,1-8））；
蒴莲素（Volkesin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；
商陆毒蛋白（Dodecandrin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986)195, 1-8））；
小麦毒蛋白（Tritin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；
丝瓜素（Luffin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；和
栝楼子毒蛋白（Trichokirin）（Casellas等（Eur. J. Biochem. (1988) 176,581-588）、和Bolognesi等（Clin. exp. Immunol., (1992) 89, 341-346)）。
抗原结合分子
本发明中，包含靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域的抗原结合分子以最广义的含义的形式使用，具体地，只要它们显示出抗原结合活性，则包括各种分子类型。例如，作为抗原结合结构域与Fc区结合的分子的实例，可举出抗体。抗体可包括单一的单克隆抗体(包括激动抗体和拮抗抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。另外，作为以抗体片段的形式使用的情形，可优选举出：抗原结合结构域和抗原结合片段(例如，Fab、F(ab’)2、scFv和Fv)。现有的稳定的α/β桶蛋白结构等立体结构作为构架(scaffold，基础)使用、仅其一部分结构为了构建抗原结合结构域而文库化的构架分子也包括在本发明的抗原结合分子中 。
本发明的抗原结合分子可包含介导Fcγ受体结合和/或FcRn结合的Fc区的至少一部分。例如，在非限定的一个方案中，抗原结合分子可以是抗体或Fc融合蛋白。融合蛋白是指包含含有第一氨基酸序列的多肽的嵌合多肽，该含有第一氨基酸序列的多肽与在天然情况下不会自然连接的具有第二氨基酸序列的多肽连接。例如，融合蛋白可以包括多肽，该多肽包含编码Fc区的至少一部分（例如，赋予Fcγ受体结合的Fc区部分和/或赋予FcRn结合的Fc区部分）的氨基酸序列。氨基酸序列可存在于一起转移到融合蛋白中的各蛋白中、或者它们通常可存在于同一蛋白中，但会进入融合多肽中的新的重组中。融合蛋白例如可通过化学合成来制作，或通过制作以所期望的关系编码肽区的多核苷酸、并将其表达的基因重组方法来制作。
本发明的各结构域可以通过多肽键直接连接，也可经由接头连接。作为接头，可以使用能通过基因工程导入的任意肽接头、或合成化合物接头（例如，Holliger等（ProteinEngineering (1996) 9 (3), 299-305））中公开的接头等，本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可根据目的适当选择，优选长度为5个氨基酸以上(上限没有特别限定，通常为30个氨基酸以下，优选20个氨基酸以下)，特别优选为15个氨基酸。
例如，在肽接头的情形中，优选可举出：
[n为1以上的整数]等。其中，本领域技术人员根据目的可以适当选择肽接头的长度或序列。
合成化学物接头（化学交联剂）是通常用于肽的交联的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂有市售。
使用多个连接各结构域的接头时，可全部使用同种的接头，也可使用不同种的接头。此外，除了上述记载中例示的接头之外，也可适当使用例如具有His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等肽标签的接头。此外，也可优选利用通过氢键、二硫键、共价键、离子性相互作用或这些键的组合来相互结合的性质。例如，利用抗体的CH1与CL间的亲和性，或者在异源Fc区缔合时利用以上述双特异性抗体为来源的Fc区。此外，还可优选利用在结构域间形成的二硫键。
为了通过肽键连接各结构域，将编码该结构域的多核苷酸进行框内连接。作为将多核苷酸进行框内连接的方法，限制性片段的连接或融合PCR、重叠PCR等方法是公知的，在本发明的抗原结合分子的制作中也可适宜单独或组合使用这些方法。本发明中，术语“被连接”、“被融合”、“连接”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过包括上述化学结合方法或重组方法在内的所有方法来连接两个以上的多肽等组分或成分以形成一个结构。框内连接，在两个以上的组分(element)或成分为多肽时，是指以维持该多肽的正确阅读框的方式连接的、用于形成更长的阅读框的两个以上的阅读框单位的连接。将二分子的Fab用作抗原结合结构域时，该抗原结合结构域与包含Fc区的恒定区不经由接头而通过肽键进行框内连接得到的作为本发明的抗原结合分子的抗体可以作为本发明的优选抗原结合分子来使用。
低分子化抗体
本发明中所使用的抗体并不限于抗体的全长分子，也可以是低分子化抗体或其修饰物。低分子化抗体包括全长抗体（例如，完整IgG等完整抗体）的一部分缺失的抗体片段，只要具有抗原结合活性则没有特别限定。本发明的低分子化抗体只要是全长抗体的一部分则没有特别限定，但优选含有重链可变区（VH）或/和轻链可变区（VL）。VH或VL的氨基酸序列可以有替换、缺失、添加和/或插入。进而，只要具有抗原结合活性，则可以使VH或/和VL的一部分缺失。另外，可变区可以被嵌合化或人源化。作为抗体片段的具体例，可举出例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等。此外，作为低分子化抗体的具体例，可举出例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（单链Fv）、双抗体、sc(Fv)2（单链(Fv)2）等。这些抗体的多聚体（例如，二聚体、三聚体、四聚体、多聚体）也包含在本发明的低分子化抗体中。
抗体片段可以通过将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶进行处理而产生，或者可以构建编码这些抗体片段的基因，并将其导入表达载体，然后通过适当的宿主细胞来表达（参照例如，Co等（J. Immunol.（1994）152, 2968-2976）、Better和Horwitz（Methods inEnzymology（1989）178, 476-496）、Plueckthun和Skerra等（Methods in Enzymology（1989）178, 476-496）、Lamoyi（Methods in Enzymology（1989）121, 652-663）、Rousseaux等（Methods in Enzymology（1989）121, 663-669）和Bird等（TIBTECH（1991）9, 132-137））。
双抗体是指通过基因融合构建的二价（bivalent）的低分子化抗体（Holliger等（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448 (1993)、欧州公开公报EP404097、和PCT公开公报WO1993/011161等）。双抗体是由2条多肽链构成的二聚体，通常，对于各多肽链，VL和VH在同一链中通过短至彼此不能结合程度的例如5个残基左右的接头结合。对于编码于同一多肽链上的VL与VH，由于它们之间的接头短，因而无法形成单链可变区片段，从而形成二聚体，所以双抗体具有2个抗原结合位点。
scFv可通过连接抗体的H链V区与L链V区来获得。该scFv中，H链V区与L链V区通过接头、优选肽接头而连接（Huston等（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。scFv中的H链V区和L链V区可以来自本说明书中作为抗体记载的任一抗体。作为连接V区的肽接头，没有特别限制，但可使用例如由3至25个残基左右组成的任意的单链肽，此外，还可使用后述的肽接头等。作为V区的连接方法，可利用如上所述的PCR法。可以通过PCR法扩增编码scFv的DNA，该PCR法中，以编码前述抗体的H链或H链V区的DNA序列、以及编码L链或L链V区的DNA序列中的编码全部或所期望的氨基酸序列的DNA部分为模板，并使用具有与其两端的序列对应的序列的一对引物。接着，组合编码肽接头部分的DNA、以及具有以使其两端分别与H链、L链连接的方式设计的序列的一对引物，进行PCR反应，由此可获得具有所期望序列的DNA。此外，一旦制作编码scFv的DNA，则可根据常法获得含有其的表达载体、和由该表达载体转化的重组细胞，此外，可通过培养结果得到的重组细胞并使编码该scFv的DNA表达来获得该scFv。
sc(Fv)2是通过接头等将2个VH和2个VL结合成为单链的低分子化抗体（Hudson等（J. Immunol. Methods (1999) 231, 177-189）。sc(Fv)2例如可通过将scFv用接头连接来制作。
另外，优选下述抗体，其特征在于，2个VH和2个VL以单链多肽的N末端侧为起点，并按照VH、VL、VH、VL（[VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL]）的顺序排列。2个VH和2个VL的顺序并不特别限于上述配置，可以按照任意顺序排列。例如还可举出如下所述的配置。
作为将抗体可变区结合的接头，可以使用与前述抗原结合分子一项中记载的接头相同的接头。例如，作为本发明中特别优选的sc(Fv)2的方案，可举出例如，以下的sc(Fv)2。
在将4个抗体可变区结合时，通常需要3个接头，全部可以使用相同的接头，也可以使用不同的接头。本发明中，作为非限定性低分子化抗体的一个方案，可例示下述双抗体或sc(Fv)2，其中，互补位彼此不同，一个互补位与结合至癌细胞细胞膜的膜型分子上存在的表位结合，另一互补位与表达于效应细胞细胞膜的膜型分子中存在的表位结合。上述双抗体或sc(Fv)2中，一互补位对结合至癌细胞细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性可以依赖于癌组织特异性化合物，一互补位对结合至效应细胞细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性可以依赖于癌组织特异性化合物，此外，两互补位的结合活性可以依赖于癌组织特异性化合物。
本发明中，作为非限定性低分子化抗体的一个方案，可例示下述双抗体或sc(Fv)2，其中，互补位彼此不同，一互补位与结合至癌细胞细胞膜的膜型分子上存在的表位结合，另一互补位与细胞毒性物质上存在的表位结合。上述双抗体或sc(Fv)2中，一互补位对结合至癌细胞细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性可以依赖于癌组织特异性化合物，一互补位对细胞毒性物质上存在的表位的结合活性可以依赖于癌组织特异性化合物，此外，两互补位的结合活性可以依赖于癌组织特异性化合物。
为了获得这种低分子化抗体，可以将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等进行处理而产生抗体片段；或者构建编码这些抗体片段或低分子化抗体的DNA，并将其导入表达载体，然后通过适当的宿主细胞来表达（参照例如，Co, M. S. et al., J. Immunol.(1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol.(1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989)178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux,J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B.W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137）。
FcRn
与属于免疫球蛋白超家族的Fcγ受体不同，人FcRn在结构上与主要组织不相容性复合体(MHC) I类的多肽结构类似，与I类的MHC分子具有22至29%的序列同一性（Ghetie等，Immunol. Today (1997) 18 (12), 592-598）。FcRn表达为异源二聚体，其由与可溶性β或轻链（β2微球蛋白）复合而成的跨膜α或重链构成。如MHC那样，FcRn的α链包含3个细胞外结构域(α1、α2、α3)，短的细胞质结构域将蛋白锚定于细胞表面。α1和α2结构域与抗体的Fc区中的FcRn结合结构域相互作用（Raghavan等（Immunity (1994) 1, 303-315）。
FcRn在哺乳动物的母体胎盘或卵黄囊中表达，其参与IgG从母体向胎儿的转移。此外，表达有FcRn的啮齿类新生儿的小肠中，FcRn参与母体IgG从所摄取的初乳或乳中穿过刷状边缘上皮的移动。FcRn在大量种类的大量的其它组织以及各种内皮细胞系中表达。其也在人成年血管内皮、肌肉血管系和肝窦毛细血管中有表达。FcRn被认为与IgG结合，将其再循环至血清中，由此起到维持血浆中的IgG浓度的作用。通常，FcRn对IgG分子的结合严格地为pH依赖性，最佳结合在小于7.0的pH酸性范围内可观察到。
以含有SEQ ID NO:28所示信号序列的多肽为前体的人FcRn在生物体内（SEQ IDNO:29中记载了含有信号序列的该多肽）与人β2-微球蛋白形成复合体。与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn可利用通常的重组表达方法来制造。可以评价本发明的Fc区对这种与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn的结合活性。本发明中，若无特别记载，则人FcRn是指能够与本发明的Fc区结合的形态，作为实例，可举出人FcRn与人β2-微球蛋白的复合体。
Fc区与FcRn、特别是与人FcRn的结合活性
由本发明提供的Fc区与FcRn、特别是与人FcRn的结合活性，如上述结合活性一项中所述，可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，pH以外的条件可由本领域技术人员适当确定。抗原结合分子的抗原结合活性和人FcRn结合活性可作为KD（Dissociationconstant：解离常数）、表观KD（Apparent dissociation constant：表观解离常数）、解离速度kd（Dissociation rate：解离速度）、或表观kd（Apparent dissociation：表观解离速度）等进行评价。它们可通过本领域技术人员公知的方法进行测定。例如可使用Biacore（GEhealthcare）、斯卡查德图、流式细胞仪等。
测定本发明的Fc区对人FcRn的结合活性时的pH以外的条件可由本领域技术人员适当选择，并无特别限定。例如，可如国际公开WO2009/125825中所记载那样，在MES缓冲液、37℃的条件下测定。此外，本发明的Fc区对人FcRn的结合活性的测定可通过本领域技术人员公知的方法进行，例如，可使用Biacore（GE Healthcare）等进行测定。对于本发明的Fc区与人FcRn的结合活性的测定，可通过向固定有Fc区或包含Fc区的本发明的抗原结合分子或人FcRn的芯片分别流过人FcRn或者Fc区或包含Fc区的本发明抗原结合分子作为分析物进行评价。
作为本发明的抗原结合分子所含的Fc区与FcRn具有结合活性的条件的pH中性范围，通常意指pH6.7～pH10.0。pH中性范围优选为由pH7.0～pH8.0的任意pH值表示的范围，优选从pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、和8.0中选择，特别优选为与生物体内的血浆中（血中）的pH接近的pH7.4。在pH7.4下人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性低而使得难以评价该结合亲和性时，可使用pH7.0以替代pH7.4。本发明中，作为本发明的抗原结合分子所含的Fc区与FcRn具有结合活性的条件的pH酸性范围，通常意指pH4.0～pH6.5。优选意指pH5.5～pH6.5，特别优选意指与生物体内的早期核内体内的pH接近的pH5.8～pH6.0。作为测定条件中使用的温度，人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性可以在10℃～50℃的任意温度下进行评价。为了确定人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性，优选使用15℃～40℃的温度。更优选地，诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35℃中的任一者的20℃至35℃的任意温度也同样用于确定人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性。25℃的温度是本发明的方案的非限定的一例。
根据The Journal of Immunology (2009) 182, 7663-7671，天然型人IgG1的人FcRn结合活性在pH酸性范围（pH6.0）为KD 1.7μM，但在pH中性范围则基本无法检测到活性。因此，在优选的方案中，可筛选包含pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD 20μM或更强的Fc区的抗原结合分子。在更优选的方案中，可筛选包含pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD 2.0μM或更强的Fc区的抗原结合分子。在进一步更优选的方案中，可筛选包含pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD 0.5μM或更强的Fc区的抗原结合分子。上述KD值可通过The Journal ofImmunology (2009) 182: 7663-7671中记载的方法（将抗原结合分子固定于芯片上，作为分析物流过人FcRn）来确定。
在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区
作为本发明所提供的抗原结合分子所含的Fc区，还可优选使用在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区。已知通常IgG抗体通过与FcRn结合而具有较长的血浆中滞留性。IgG与FcRn的结合仅在酸性条件下（pH6.0）被观察到，而在中性条件下（pH7.4）基本观察不到结合。IgG抗体被非特异性地摄入细胞，但通过在核内体内的酸性条件下与核内体内的FcRn结合而返回到细胞表面上，在血浆中的中性条件下从FcRn解离。向IgG的Fc区导入突变而使pH酸性范围条件下的FcRn结合丧失时，变得无法从核内体内再循环至血浆中，因而抗体的血浆中滞留性显著受损。作为改善IgG抗体的血浆中滞留性的方法，报道有提高pH酸性范围条件下的FcRn结合的方法。通过向IgG抗体的Fc区导入氨基酸替换，使pH酸性范围条件下的FcRn结合提高，从核内体内再循环至血浆中的效率上升，结果血浆中滞留性改善。
本发明并不受特定理论束缚，但例如，在本发明提供的抗原结合分子与癌组织所含癌细胞上表达的膜型抗原结合的情形等中，认为可以如下所述持续性地抑制癌细胞的增殖。在癌组织特异性化合物的高浓度存在下结合了本发明的抗原结合分子的膜型分子所表达的癌细胞在因该抗原结合分子所介导的细胞毒性而受到伤害后，认为该抗原仍旧是结合于该抗原结合分子中所含的抗原结合结构域的状态。从非特异性地摄入细胞中的该抗原结合分子中，在癌组织特异性化合物的低浓度存在下游离出抗原的该抗原结合分子通过在核内体内的酸性条件下与核内体内的FcRn结合，从而返回至细胞表面上，并在血浆中的中性条件下从FcRn解离。这样，认为经再循环的本发明的抗原结合分子在癌组织特异性化合物的高浓度存在下可与作为其抗原的表达于癌细胞上的膜型分子再次结合。
本发明并不受特定理论的束缚，例如，在本发明提供的抗原结合分子所结合的可溶型抗原是正向调节靶组织所含的靶细胞的增殖或炎性细胞的活化的配体的情形等中，认为可以如下所述抑制靶细胞的增殖或炎性细胞的活化。在这些靶组织特异性化合物的高浓度存在下，与作为其抗原的可溶型分子结合的本发明的抗原结合分子在被非特异性地摄入细胞后，在靶组织特异性化合物的低浓度存在下游离出抗原的该抗原结合分子通过在核内体内的酸性条件下与核内体内的FcRn结合，从而返回至细胞表面上，并在血浆中的中性条件下从FcRn解离。这样，认为经再循环的本发明的抗原结合分子在靶组织特异性化合物的高浓度存在下可与作为其抗原的可溶型分子再次结合。另一方面，在靶组织特异性化合物的低浓度存在下从抗原结合分子游离出的抗原在溶酶体中被分解。结果，可溶型抗原的浓度随着经历上述再循环阶段而减少，因此认为可以抑制癌细胞的增殖或炎性细胞的活化。
本发明中，优选pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区。只要是预先在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区，则可直接使用该结构域。该结构域在pH酸性范围条件下的FcRn结合活性不存在或弱时，可通过改变抗原结合分子中的氨基酸来获得具有所期望的FcRn结合活性的Fc区，通过改变Fc区中的氨基酸，也可适宜获得在pH酸性范围条件下具有所期望的FcRn结合活性或该活性增强的Fc区。这样的带来所期望的结合活性的Fc区的氨基酸改变可通过比较氨基酸改变前与改变后在pH酸性范围条件下的FcRn结合活性来发现。利用与上述用于改变Fcγ受体结合活性的方法相同的公知方法，本领域技术人员可实施适当的氨基酸改变。
本发明的抗原结合分子中所含的在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体而言，可通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸来获得在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性或该活性增强的FcRn结合结构域。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白Fc区，可举出例如人IgG（IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、和它们的改变体）的Fc区。对于向其它氨基酸的改变，只要可以在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性、或者在酸性范围条件下提高人FcRn结合活性，则可以改变任意位置的氨基酸。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，优选包含带来pH酸性范围条件下的FcRn结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。作为可实现这样的改变的氨基酸，可举出例如：如国际公开WO1997/034631中所记载的那样，以EU编号表示的252位、254位、256位、309位、311位、315位、433位和/或434位以及与这些氨基酸组合的253位、310位、435位和/或426位的氨基酸。优选可举出如国际公开WO2000/042072中记载的那样以EU编号表示的238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位和/或447位的氨基酸。同样地，作为可实现这种改变的氨基酸，还可优选举出例如：如国际公开WO2002/060919中记载的那样以EU编号表示的251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位和/或436位的氨基酸。进而，作为可实现这种改变的氨基酸，还可举出如国际公开WO2004/092219中记载的那样以EU编号表示的250位、314位和428位的氨基酸。此外，作为可实现这种改变的氨基酸，还优选举出例如国际公开WO2006/020114中记载的238位、244位、245位、249位、252位、256位、257位、258位、260位、262位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、307位、311位、312位、316位、317位、318位、332位、339位、341位、343位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、423位、427位、430位、431位、434位、436位、438位、440位和/或442位的氨基酸。此外，作为可实现这种改变的氨基酸，还优选举出例如国际公开WO2010/045193中所记载的以EU编号表示的251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位和/或436位的氨基酸。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH酸性范围条件下的FcRn结合得到增强。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，在带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案中，可举出以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸的改变：
251位的氨基酸为Arg或Leu中的任一者，
252位的氨基酸为Phe、Ser、Thr、或Tyr中的任一者，
254位的氨基酸为Ser或Thr中的任一者，
255位的氨基酸为Arg、Gly、Ile、或Leu中的任一者，
256位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、或Thr中的任一者，
308位的氨基酸为Ile或Thr中的任一者，
309位的氨基酸为Pro，
311位的氨基酸为Glu、Leu、或Ser中的任一者，
312位的氨基酸为Ala或Asp中的任一者，
314位的氨基酸为Ala或Leu中的任一者，
385位的氨基酸为Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中的任一者，
386位的氨基酸为Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中的任一者，
387位的氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中的任一者，
389位的氨基酸为Asn、Pro、或Ser中的任一者，
428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中的任一者
433位的氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中的任一者，
434位的氨基酸为His、Phe、或Tyr中的任一者，或者
436位的氨基酸为Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中的任一者。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：以EU编号表示的308位的氨基酸为Ile、309位的氨基酸为Pro、和/或311位的氨基酸为Glu。此外，该改变的另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：308位的氨基酸为Thr、309位的氨基酸为Pro、311位的氨基酸为Leu、312位的氨基酸为Ala、和/或314位的氨基酸为Ala。此外，该改变的又一另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：308位的氨基酸为Ile或Thr、309位的氨基酸为Pro、311位的氨基酸为Glu、Leu或Ser、312位的氨基酸为Ala、和/或314位的氨基酸为Ala或Leu。该改变的不同的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：308位的氨基酸为Thr、309位的氨基酸为Pro、311位的氨基酸为Ser、312位的氨基酸为Asp、和/或314位的氨基酸为Leu。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：以EU编号表示的251位的氨基酸为Leu、252位的氨基酸为Tyr、254位的氨基酸为Ser或Thr、255位的氨基酸为Arg、和/或256位的氨基酸为Glu。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：以EU编号表示的428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一者，433位的氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中的任一者，434位的氨基酸为His、Phe、或Tyr中的任一者，和/或436位的氨基酸为Arg、Asn、His、Lys、Met或Thr中的任一者。此外，该改变的另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：428位的氨基酸为His或Met、和/或434位的氨基酸为His或Met。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：以EU编号表示的385位的氨基酸为Arg、386位的氨基酸为Thr、387位的氨基酸为Arg、和/或389位的氨基酸为Pro。此外，该改变的另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：385位的氨基酸为Asp、386位的氨基酸为Pro和/或389位的氨基酸为Ser。
进而，在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案中，可举出以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸的改变：
250位的氨基酸为Gln或Glu中的任一者，或者
428位的氨基酸为Leu或Phe中的任一者。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处氨基酸。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：以EU编号表示的250位的氨基酸为Gln、和/或428位的氨基酸为Leu或Phe中的任一者。此外，该改变的另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：250位的氨基酸为Glu、和/或428位的氨基酸为Leu或Phe中的任一者。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案中，可举出以EU编号表示的选自下述中的至少两个以上的氨基酸的改变：
251位的氨基酸为Asp或Glu中的任一者，
252位的氨基酸为Tyr，
307位的氨基酸为Gln，
308位的氨基酸为Pro，
378位的氨基酸为Val，
380位的氨基酸为Ala，
428位的氨基酸为Leu，
430位的氨基酸为Ala、或Lys中的任一者，
434位的氨基酸为Ala、His、Ser、或Tyr中的任一者，或者
436位的氨基酸为Ile。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变两处的氨基酸，也可以改变三处以上的氨基酸。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：以EU编号表示的307位的氨基酸为Gln、和434位的氨基酸为Ala或Ser中的任一者。此外，该改变的另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：308位的氨基酸为Pro、和434位的氨基酸为Ala。此外，该改变的又一另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：252位的氨基酸为Tyr、和434位的氨基酸为Ala。该改变的不同的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：378位的氨基酸为Val、和434位的氨基酸为Ala。该改变的另外不同的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：428位的氨基酸为Leu、和434位的氨基酸为Ala。此外，该改变的又一另外不同的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：434位的氨基酸为Ala、和436位的氨基酸为Ile。进而，该改变的又一非限定的一个方案可以是包含以下的改变：308位的氨基酸为Pro、和434位的氨基酸为Tyr。进而，该改变的其它又一非限定的一个方案可以是包含以下的改变：307位的氨基酸为Gln、和436位的氨基酸为Ile。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案可以是包含以下任一者的改变：以EU编号表示的307位的氨基酸为Gln、380位的氨基酸为Ala、和434位的氨基酸为Ser。此外，该改变的另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：307位的氨基酸为Gln、380位的氨基酸为Ala、和434位的氨基酸为Ala。此外，该改变的又一另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：252位的氨基酸为Tyr、308位的氨基酸为Pro、和434位的氨基酸为Tyr。该改变的不同的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：251位的氨基酸为Asp、307位的氨基酸为Gln、和434位的氨基酸为His。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案中，可举出以EU编号表示的选自下述中的至少两个以上的氨基酸的改变：
238位的氨基酸为Leu，
244位的氨基酸为Leu，
245位的氨基酸为Arg，
249位的氨基酸为Pro，
252位的氨基酸为Tyr，
256位的氨基酸为Pro，
257位的氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中的任一者，
258位的氨基酸为Asp，
260位的氨基酸为Ser，
262位的氨基酸为Leu，
270位的氨基酸为Lys，
272位的氨基酸为Leu、或Arg中的任一者，
279位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中的任一者，
283位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中的任一者，
285位的氨基酸为Asn，
286位的氨基酸为Phe，
288位的氨基酸为Asn、或Pro中的任一者，
293位的氨基酸为Val，
307位的氨基酸为Ala、Glu、或Met中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、Ile、Lys、Leu、Met、Val、或Trp中的任一者，
312位的氨基酸为Pro，
316位的氨基酸为Lys，
317位的氨基酸为Pro，
318位的氨基酸为Asn、或Thr中的任一者，
332位的氨基酸为Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中的任一者，
339位的氨基酸为Asn、Thr、或Trp中的任一者，
341位的氨基酸为Pro，
343位的氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中的任一者，
375位的氨基酸为Arg，
376位的氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中的任一者，
377位的氨基酸为Lys，
378位的氨基酸为Asp、或Asn中的任一者，
380位的氨基酸为Asn、Ser、或Thr中的任一者，
382位的氨基酸为Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
423位的氨基酸为Asn，
427位的氨基酸为Asn，
430位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
431位的氨基酸为His、或Asn中的任一者，
434位的氨基酸为Phe、Gly、His、Trp、或Tyr中的任一者，
436位的氨基酸为Ile、Leu、或Thr中的任一者，
438位的氨基酸为Lys、Leu、Thr、或Trp中的任一者，
440位的氨基酸为Lys、或者，
442位的氨基酸为Lys。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变两处的氨基酸，也可以改变三处以上的氨基酸。
在包含人IgG1的Fc区来作为Fc区的情形中，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：以EU编号表示的257位的氨基酸为Ile、和311位的氨基酸为Ile。此外，该改变的另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：257位的氨基酸为Ile、和434位的氨基酸为His。此外，该改变的又一另外的非限定的一个方案可以是包含以下的改变：376位的氨基酸为Val、和434位的氨基酸为His。
在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区
此外，在另外的非限定的一个方案中，还可以筛选包含Fc区的抗原结合分子，所述Fc区具有pH中性范围的人FcRn结合活性的特征，以代替上述记载的pH酸性范围的人FcRn结合活性的特征。在更优选的方案中，可以筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD 40μM或更强的Fc区的抗原结合分子。在进一步更优选的方案中，可筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD 15μM或更强的Fc区的抗原结合分子。
此外，在另外的非限定的一个方案中，还可以筛选包含Fc区的抗原结合分子，所述Fc区除了具有上述记载的pH酸性范围的人FcRn结合活性的特征之外，还具有pH中性范围的人FcRn结合活性的特征。在更优选的方案中，可以筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD 40μM或更强的Fc区的抗原结合分子。在进一步更优选的方案中，可筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD 15μM或更强的Fc区的抗原结合分子。
本发明中，优选在pH酸性范围和/或pH中性范围具有人FcRn结合活性的Fc区。只要是预先在pH酸性范围和/或pH中性范围下具有人FcRn结合活性的Fc区，则可以直接使用该Fc区。当该Fc区在pH酸性范围和/或pH中性范围下的FcRn结合活性不存在或弱时，通过改变抗原结合分子所含的Fc区中的氨基酸，可以获得包含具有所期望的人FcRn结合活性的Fc区的抗原结合分子，但通过改变人Fc区中的氨基酸，也可适宜地获得在pH酸性范围和/或pH中性范围具有所期望的人FcRn结合活性的Fc区。此外，通过改变预先在pH酸性范围和/或pH中性范围下就具有人FcRn结合活性的Fc区中的氨基酸，也可以获得包含具有所期望的人FcRn结合活性的Fc区的抗原结合分子。这种带来所期望的结合活性的人Fc区的氨基酸改变，可通过比较氨基酸改变前与改变后在pH酸性范围和/或pH中性范围的人FcRn结合活性来发现。本领域技术人员可以利用公知的方法适宜实施氨基酸的改变。
本发明中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。只要起始Fc区的修饰改变体在pH酸性范围可以与人FcRn结合(所以，起始Fc区未必需要具有pH中性范围条件下的人FcRn结合活性)，则所有的Fc区均可用作起始结构域。作为起始Fc区的实例，优选可举出IgG抗体的Fc区、即天然型的Fc区。此外，将已进行了改变的Fc区作为起始Fc区并进一步进行了改变而得的改变Fc区也可优选用作本发明的改变Fc区。起始Fc区可指多肽自身、含有起始Fc区的组合物或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可包括抗体一项中概述的通过重组产生的公知的IgG抗体的Fc区。对起始Fc区的来源没有限定，可由非人动物的任意生物或人获得。作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、和非人灵长类中的生物。在其他方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩或人获得。优选地，起始Fc区可由人IgG1获得，但不限于IgG的特定亚类。这意指可适当使用人IgG1（SEQ ID NO:5）、IgG2（SEQ ID NO:6）、IgG3（SEQ ID NO:7）、或IgG4（SEQ ID NO:8）所示的Fc区作为起始Fc区。同样地，本说明书中也意指可以将来源于前述任意生物的IgG的任意种类或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG的变体或修饰型的实例记载于公知文献（Curr. Opin.Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91、Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470、Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202、国际公开WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、和WO2006/105338）中，但并不受其限定。
作为改变的实例，包括一个以上的变异，例如替换成与起始Fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的变异、或者向起始Fc区的氨基酸中插入一个以上的氨基酸残基或从起始Fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选改变后的Fc区氨基酸序列包含含有非天然产生的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变体与起始Fc区必然具有不足100%的序列同一性或相似性。在优选的实施方案中，变体具有与起始Fc区的氨基酸序列为约75%～小于100%的氨基酸序列同一性或类似性、更优选为约80%～小于100%、更优选为约85%～小于100%、更优选为约90%～小于100%、最优选为约95%～小于100%的同一性或类似性的氨基酸序列。在本发明的非限定的一个方案中，起始Fc区与本发明的改变Fc区之间存在至少一个氨基酸的差异。起始Fc区与改变Fc区的氨基酸的不同还可通过特别是上述的以EU编号表示的氨基酸残基位置的特定氨基酸的不同而适宜规定。这种变体的制作方法例示于“氨基酸对改变”一项。
本发明的抗原结合分子所含的具有pH中性范围的人FcRn结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体地，通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸，可以筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD 20μM或更强的Fc区的抗原结合分子，在更优选的方案中，可以筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD 2.0μM或更强的Fc区的抗原结合分子，在更进一步优选的方案中，可以筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD 0.5μM或更强的Fc区的抗原结合分子。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如，分别由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8所示的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等人IgG和它们的改变体的Fc区。
在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情形中，作为可以进行在pH酸性范围条件下对FcRn的结合通过用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸的改变而带来上述所期望的效果的改变的氨基酸，优选可举出例如，如国际公开WO2000/042072中记载的那样以EU编号表示的238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位和/或447位的氨基酸。同样地，作为可实现这种改变的氨基酸，还可优选举出例如：如国际公开WO2002/060919中记载的那样以EU编号表示的251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位和/或436位的氨基酸。进而，作为可实现这种改变的氨基酸，还可举出如国际公开WO2004/092219中记载的那样以EU编号表示的250位、314位和428位的氨基酸。此外，作为可实现这种改变的氨基酸，还优选举出例如国际公开WO2010/045193中所记载的以EU编号表示的251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位和/或436位的氨基酸。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH中性范围条件下的FcRn结合得到增强。
通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸，还可获得在pH中性范围具有人FcRn结合活性的Fc区。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如，分别由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8所示的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等人IgG和它们的改变体的Fc区。对于向其它氨基酸的改变，只要可具有pH中性范围的人FcRn结合活性、或者提高中性范围的人FcRn结合活性，则可以改变任何位置的氨基酸。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情形中，优选包含带来pH中性范围的人FcRn结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。作为可进行这种改变的氨基酸，例如可举出，EU编号221位～225位、227位、228位、230位、232位、233位～241位、243位～252位、254位～260位、262位～272位、274位、276位、278位～289位、291位～312位、315位～320位、324位、325位、327位～339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375位～378位、380位、382位、385位～387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426位～438位、440位和442位的位置的氨基酸。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH中性范围下对人FcRn的结合被增强。
为了用于本发明，在这些改变中，适宜选择在pH中性范围也增强人FcRn结合的改变。作为特别优选的Fc区改变体的氨基酸，可举出例如以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位和436位的氨基酸。通过将选自这些氨基酸的至少1个氨基酸替换为其它氨基酸，可以增强抗原结合分子所含的Fc区在pH中性范围的人FcRn结合活性。
作为特别优选的改变，可举出例如，Fc区的以EU编号表示的：
237位的氨基酸为Met，
248位的氨基酸为Ile，
250位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
252位的氨基酸为Phe、Trp、或Tyr中的任一者，
254位的氨基酸为Thr，
255位的氨基酸为Glu，
256位的氨基酸为Asp、Asn、Glu、或Gln中的任一者，
257位的氨基酸为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val中的任一者，
258位的氨基酸为His，
265位的氨基酸为Ala，
286位的氨基酸为Ala或Glu中的任一者，
289位的氨基酸为His，
297位的氨基酸为Ala，
303位的氨基酸为Ala，
305位的氨基酸为Ala，
307位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
308位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr中的任一者，
309位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、His、或Ile中的任一者，
312位的氨基酸为Ala或His中的任一者，
314位的氨基酸为Lys或Arg中的任一者，
315位的氨基酸为Ala、Asp或His中的任一者，
317位的氨基酸为Ala，
332位的氨基酸为Val，
334位的氨基酸为Leu，
360位的氨基酸为His，
376位的氨基酸为Ala，
380位的氨基酸为Ala，
382位的氨基酸为Ala，
384位的氨基酸为Ala，
385位的氨基酸为Asp或His中的任一者，
386位的氨基酸为Pro，
387位的氨基酸为Glu，
389位的氨基酸为Ala或Ser中的任一者，
424位的氨基酸为Ala，
428位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
433位的氨基酸为Lys，
434位的氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中的任一者，或者
436位的氨基酸为His 、Ile、Leu、Phe、Thr、或Val。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为这些氨基酸的改变的组合，可举出例如表2-1～2-33所示的氨基酸的改变。
表2-2是表2-1的续表。
表2-3是表2-2的续表。
表2-4是表2-3的续表。
表2-5是表2-4的续表。
表2-6是表2-5的续表。
表2-7是表2-6的续表。
表2-8是表2-7的续表。
表2-9是表2-8的续表。
表2-10是表2-9的续表。
表2-11是表2-10的续表。
表2-12是表2-11的续表。
表2-13是表2-12的续表。
表2-14是表2-13的续表。
表2-15是表2-14的续表。
表2-16是表2-15的续表。
表2-17是表2-16的续表。
表2-18是表2-17的续表。
表2-19是表2-18的续表。
表2-20是表2-19的续表。
表2-21是表2-20的续表。
表2-22是表2-21的续表。
表2-23是表2-22的续表。
表2-24是表2-23的续表。
表2-25是表2-24的续表。
表2-26是表2-25的续表。
表2-27是表2-26的续表。
表2-28是表2-27的续表。
表2-29是表2-28的续表。
表2-30是表2-29的续表。
表2-31是表2-30的续表。
表2-32是表2-31的续表。
表2-33是表2-32的续表。
包含二分子的FcRn和一分子的活性型Fcγ受体这四者的异源复合体
通过FcRn和IgG抗体的结晶学研究，认为FcRn-IgG复合体是由一分子的IgG对两分子的FcRn而构成，在位于IgG的Fc区两侧的CH2和CH3结构域的接触面附近，发生二分子的结合（Burmeister等（Nature (1994) 372, 336-343）。另一方面，如PCT/JP2012/058603的实施例3中所确认，明确了抗体的Fc区可以形成包含二分子的FcRn和一分子的活性型Fcγ受体这四者的复合体（PCT/JP2012/058603）。该异源复合体的形成是对包含在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区的抗原结合分子的性质进行分析并由所得结果明确的现象。
本发明并不受特定理论的束缚，但认为通过包含抗原结合分子所含的Fc区与两分子的FcRn以及一分子的活性型Fcγ受体这四者的异源复合体的形成，会对将抗原结合分子给予至生物体内时的抗原结合分子在该生物体内的药代动力学（血浆中滞留性）、以及针对被给予抗原结合分子的免疫应答（免疫原性）带来如下所述的影响。免疫细胞上除了各种活性型Fcγ受体之外还表达有FcRn，这暗示抗原结合分子在免疫细胞上形成这种四者复合体会提高对免疫细胞的亲和性，进而使细胞内结构域缔合而增强内化信号，促进摄入至免疫细胞中。对于抗原呈递细胞也同样，暗示通过在抗原呈递细胞的细胞膜上形成四者复合体，可将抗原结合分子容易地摄入抗原呈递细胞中。通常，被摄入抗原呈递细胞中的抗原结合分子在抗原呈递细胞内的溶酶体中被分解并被呈递至T细胞。结果，通过在抗原呈递细胞的细胞膜上形成上述四者复合体，抗原呈递细胞对抗原结合分子的摄入得到促进，因此有可能使抗原结合分子的血浆中滞留性变差。此外同样还可能诱发免疫应答（变差）。
因此，认为在将形成这种四者复合体的能力降低的抗原结合分子给予生物体时，该抗原结合分子的血浆中滞留性将提高，该机体的免疫应答的诱发会被抑制。作为这种抑制包含抗原呈递细胞的免疫细胞上的该复合体的形成的抗原结合分子的优选方案，可举出以下三种。
抑制异源复合体的形成的抗原结合分子
（方案1） 包含下述Fc区的抗原结合分子，该Fc区具有pH中性范围条件下的FcRn结 合活性、且对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低
方案1的抗原结合分子通过与二分子FcRn结合而形成三者复合体，但不形成包含活性型FcγR的复合体。对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低的Fc区可通过如上所述改变天然型Fc区的氨基酸来制作。改变Fc区对活性型FcγR的结合活性是否较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低，可使用前述结合活性一项中记载的方法适宜实施。
作为活性型Fcγ受体，优选可举出：包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI（CD64）、包含FcγRIIa（包括同种异型R131和H131）以及同种型FcγRIIIa（包括同种异型V158和F158）和FcγRIIIb（包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2）的FcγRIII（CD16）。
本说明书中，Fc区改变体对活性型Fcγ受体的结合活性较天然型Fc区对活性型Fcγ受体的结合活性低是指，Fc区改变体对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性较天然型Fc区对这些人Fcγ受体的结合活性低。例如是指，基于上述分析方法，与作为对照的包含天然型Fc区的抗原结合分子的结合活性进行比较，包含Fc区改变体的抗原结合分子的结合活性显示出95%以下、优选90%以下、85%以下、80%以下、75%以下、特别优选70%以下、65%以下、60%以下、55%以下、50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下的结合活性。作为天然型Fc区，既可以使用起始Fc区，也可以使用野生型抗体的不同同种型的Fc区。
此外，天然型对活性型FcγR的结合活性优选是指人IgG1对Fcγ受体的结合活性，为了降低对Fcγ受体的结合活性，除了上述改变以外，还可通过对人IgG2、人IgG3、人IgG4改变同种型来实现。此外，除了上述改变以外，通过用大肠杆菌等不添加糖链的宿主来表达包含具有Fcγ受体结合活性的Fc区的抗原结合分子，也可以降低对Fcγ受体的结合活性。
作为包含作为对照的Fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于：SEQ ID NO:5（RefSeq注册号AAC82527.1的N末端添加有A）、6（RefSeq注册号AAB59393.1的N末端添加有A）、7（RefSeq注册号CAA27268.1）、8（RefSeq注册号AAB59394.1的N末端添加有A）。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，来验证包含该Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
在本发明的非限定的一个方案中，作为对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低的Fc区的实例，
优选可举出前述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的234、235、236、237、238、239、270、297、298、325、328、和329中的任意一个以上的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区，但Fc区的改变并不限于上述改变，也可以是例如Cur. Opin. in Biotech.(2009) 20 (6), 685-691中记载的脱糖链（N297A, N297Q）、IgG1-L234A/L235A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E等改变、和国际公开WO2008/092117中记载的G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、N325L/L328R等改变、以及EU编号233位、234位、235位、237位的氨基酸的插入、国际公开WO2000/042072中记载的位置的改变。
此外，在本发明的非限定的一个方案中，优选可举出下述Fc区，其包括前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸的下述任一者以上的改变：
将234位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp中的任一者，
将235位的氨基酸改变为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Arg中的任一者，
将236位的氨基酸改变为Arg、Asn、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Tyr中的任一者，
将237位的氨基酸改变为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val、Tyr或Arg中的任一者，
将238位的氨基酸改变为Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Thr、Trp或Arg中的任一者，
将239位的氨基酸改变为Gln、His、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr或Arg中的任一者，
将265位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
将266位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
将267位的氨基酸改变为Arg、His、Lys、Phe、Pro、Trp或Tyr中的任一者，
将269位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
将270位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
将271位的氨基酸改变为Arg、His、Phe、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
将295位的氨基酸改变为Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一者，
将296位的氨基酸改变为Arg、Gly、Lys或Pro中的任一者，
将297位的氨基酸改变为Ala，
将298位的氨基酸改变为Arg、Gly、Lys、Pro、Trp或Tyr中的任一者，
将300位的氨基酸改变为Arg、Lys或Pro中的任一者，
将324位的氨基酸改变为Lys或Pro中的任一者，
将325位的氨基酸改变为Ala、Arg、Gly、His、Ile、Lys、Phe、Pro、Thr、TrpTyr、或Val中的任一者，
将327位的氨基酸改变为Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
将328位的氨基酸改变为Arg、Asn、Gly、His、Lys或Pro中的任一者，
将329位的氨基酸改变为Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val或Arg中的任一者，
将330位的氨基酸改变为Pro或Ser中的任一者，
将331位的氨基酸改变为Arg、Gly或Lys中的任一者，或
将332位的氨基酸改变为Arg、Lys或Pro中的任一者。
（方案2） 包含下述Fc区的抗原结合分子，该Fc区具有pH中性范围条件下的FcRn结 合活性、且对抑制型FcγR的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高
方案2的抗原结合分子可通过与二分子的FcRn和一分子的抑制型FcγR结合而形成含有它们四者的复合体。然而，由于一分子的抗原结合分子只能与一分子的FcγR结合，因而一分子的抗原结合分子在与抑制型FcγR结合的状态下无法与其它活性型FcγR结合。进而，据报道，在与抑制型FcγR结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子会被再循环至细胞膜上、从而避免细胞内的分解（Immunity (2005) 23, 503-514）。即，认为对抑制型FcγR具有选择结合活性的抗原结合分子无法形成引起免疫应答的包含活性型FcγR和两分子的FcRn的异源复合体。
作为活性型Fcγ受体，优选可举出：包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI（CD64）、包含FcγRIIa（包括同种异型R131和H131）以及同种型FcγRIIIa（包括同种异型V158和F158）和FcγRIIIb（包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2）的FcγRIII（CD16）。此外，作为抑制型Fcγ受体的优选实例，可举出FcγRIIb（包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2）。
本说明书中，对抑制型FcγR的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高是指，Fc区改变体对FcγRIIb的结合活性较对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性高。例如，是指基于上述分析方法，含有Fc区改变体的抗原结合分子对FcγRIIb的结合活性表现出对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性的105%以上、优选110%以上、120%以上、130%以上、140%以上、特别优选150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上的结合活性。
最优选的是对FcγRIIb的结合活性较对FcγRIa、FcγRIIa（包括同种异型R131和H131）和FcγRIIIa（包括同种异型V158和F158）的均高。FcγRIa对天然型IgG1的亲和性极高，因而认为在生物体内大量的内源性IgG1使得结合达到饱和，所以认为即使对FcγRIIb的结合活性比对FcγRIIa和FcγRIIIa的高、比对FcγRIa的低，也可能抑制该复合体的形成。
作为包含作为对照的Fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于：SEQ ID NO:5（RefSeq注册号AAC82527.1的N末端添加有A）、6（RefSeq注册号AAB59393.1的N末端添加有A）、7（RefSeq注册号CAA27268.1）、8（RefSeq注册号AAB59394.1的N末端添加有A）。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，来验证包含该Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
在本发明的非限定的一个方案中，作为对抑制型FcγR具有选择性结合活性的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的238或328的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。此外，作为对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性的Fc区，还可以适宜选择US2009/0136485中记载的Fc区或改变。
另外，在本发明的非限定的一个方案中，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。
进而，在本发明的非限定的一个方案中，可优选举出改变为下述任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238位的Pro替换为Asp、以及以EU编号表示的237位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Phe、以EU编号表示的267位的氨基酸为Val、以EU编号表示的267位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly、以EU编号表示的326位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的326位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Met、以EU编号表示的239位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的267位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的234位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的234位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的237位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的237位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Met、以EU编号表示的237位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的330位的氨基酸为Lys、以EU编号表示的330位的氨基酸为Arg、以EU编号表示的233位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ser、以EU编号表示的326位的氨基酸为Thr、以EU编号表示的323位的氨基酸为Ile、以EU编号表示的323位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的323位的氨基酸为Met、以EU编号表示的296位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的330位的氨基酸为Met。
（方案3） 包含下述Fc区的抗原结合分子，其中，构成Fc区的二个多肽的一方具有 pH中性范围条件下的FcRn结合活性、另一方不具有pH中性范围条件下的FcRn结合能力活性
方案3的抗原结合分子可通过与一分子的FcRn和一分子的FcγR结合而形成三者复合体，但不形成包含二分子的FcRn和一分子的FcγR的四者的异源复合体。作为本方案3的抗原结合分子所含的、构成Fc区的二个多肽的一方具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性、另一多肽不具有pH中性范围条件下的FcRn结合能力活性的Fc区，还可适宜使用来源于双特异性抗体（bispecific抗体）的Fc区。双特异性抗体是指对不同抗原具有特异性的二种抗体。IgG型双特异性抗体可由通过融合两种产生IgG抗体的杂交瘤而产生的杂交的杂交瘤(quadroma)来分泌（Milstein等（Nature (1983) 305, 537-540）。
通过使用前述抗体一项中记载的重组方法来制造上述方案3的抗原结合分子时，可采用将编码构成目标的二种Fc区的多肽的基因导入细胞并使它们共表达的方法。然而，制造的Fc区会形成下述Fc区以2：1：1的分子数的比例存在的混合物：构成Fc区的二个多肽的一方具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性、另一多肽不具有pH中性范围条件下的FcRn结合能力活性的Fc区；构成Fc区的二个多肽的双方均具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性的Fc区；构成Fc区的二个多肽的双方均不具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性的Fc区。难以由3种IgG纯化包含目标组合的Fc区的抗原结合分子。
使用这种重组手法制造方案3的抗原结合分子时，通过对构成Fc区的CH3结构域施加适当的氨基酸替换的改变，可以优先分泌出包含异源组合Fc区的抗原结合分子。具体地，有下述方法：将存在于一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链替换成更大的侧链(knob(意为“突起”))、将存在于另一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链替换成更小的侧链(hole(意为“空隙”))，从而使突起能够配置在间隙内，以促进异种的H链形成和抑制同种的H链形成（国际公开WO1996027011、Ridgway等（Protein Engineering (1996) 9, 617-621）、Merchant等（Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681））。
此外，还已知通过将控制多肽的缔合、或由多肽构成的异种多聚体的缔合的方法用于构成Fc区的二个多肽的缔合来制作双特异性抗体的技术。即，通过改变构成Fc区的二个多肽内的形成界面的氨基酸残基，而控制成抑制构成具有相同序列的Fc区的多肽的缔合、且形成构成序列不同的二个Fc区的多肽复合体的方法可用于双特异性抗体的制作（国际公开WO2006/106905）。具体地，在制造本发明的方案3的抗原结合分子时，作为非限定的一个方案，可采用前述双特异性抗体及其制作方法一项中记载的方法。
期待上述方案1～3的抗原结合分子与能够形成四者复合体的抗原结合分子相比均可使免疫原性降低、并使血浆中滞留性提高。
抗原结合结构域的制造方法
本发明提供靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域的制造方法。
即，本发明提供包含以下步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)获得靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(b)获得靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(c)选择靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
此外，本发明还提供包含以下步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)获得靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(b)获得靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(c)选择靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)使靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合结构域或者它们的文库与抗原接触；
步骤(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域置于该化合物的非存在下；
步骤(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)使靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域或者它们的文库与抗原接触；
步骤(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域置于该化合物的低浓度存在下；
步骤(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
此外，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的非存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
此外，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的存在下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)在该化合物的非存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)从(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)在该化合物的低浓度存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)从(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的非存在下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱出的抗原结合结构域；
步骤(c)在该化合物的存在下使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱出的抗原结合结构域；
步骤(c)在该化合物的高浓度存在下使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域置于化合物的非存在下；
步骤(d)分离抗原结合活性在前述步骤(c)中较前述步骤(b)中选择的基准弱的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域置于化合物的低浓度存在下；
步骤(d)分离抗原结合活性在前述步骤(c)中较前述步骤(b)中选择的基准弱的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”在本说明书中同义地使用，这样的命名包括细胞或细胞系的所有后代。这样，例如，“转化体”和“转化细胞”之类的术语则包括来源于它们的初级对象细胞（primary target cell）和培养物，而与传代数无关。此外，还应理解由于故意突变(intentional mutations)或偶然突变的缘故，在所有后代中，DNA的内容未必精确地相同。还可包括如在最初的转化细胞中筛选的那些实质上具有相同功能或生物学活性的突变体的后代。在记载意欲表示不同命名的情形中，根据该记载的上下文关系可明确这样的意图。作为所使用的细胞，从前述“抗体”一项中记载的细胞中适宜选择合适的细胞。
提及编码序列的表达时的控制序列是指在特定宿主生物中可操作地连接的编码序列的表达所需的DNA碱基序列。例如适宜于原核生物的控制序列包括：启动子、根据情况的操纵基因序列、核糖体结合位点、和可能还不甚理解的其它序列。真核细胞中，为了表达编码序列，公知的是利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
关于核酸，“可操作地连接”意指该核酸与其它核酸序列具有功能性关系。例如，前序列（presequence）或分泌前导肽的DNA在作为与某多肽的分泌相关的前体蛋白表达时，则与该多肽的DNA可操作地连接。启动子或增强子在其影响某编码序列的转录的情况下，则与该序列可操作地连接。或者，核糖体结合位点在其位于使翻译变得容易的位置时，则与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指连接的DNA序列连续，在分泌前导肽的情况下是指连续位于阅读框内。但是，增强子没有连续的必要。连接是在合适的限制性位点通过连接作用来实现。不存在这样的位点时，根据以往的惯例使用合成寡核苷酸衔接头或接头。还可通过上述重叠延伸PCR方法制作连接的核酸。
“连接作用”是在2个核酸片段之间形成磷酸二酯键的方法。为了2个片段的连接，片段的末端必须彼此适应。根据情况，该末端在核酸内切酶消化后立即具有适应性。但是，为了适合连接，首先需要将核酸内切酶消化后通常所形成的交错末端转变为平端。为了形成平端，将DNA在合适的缓冲液中，在4种脱氧核糖核苷三磷酸的存在下，在15℃用约10单位的DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶的Klenow片段处理至少15分钟。接着，通过酚-氯仿提取和乙醇沉淀、或二氧化硅纯化（silica purification）来纯化DNA。将要连接的DNA片段以等摩尔量加入溶液。在该溶液中除了ATP、连接酶缓冲液外，还含有相对于DNA0.5μg为约10单位的T4DNA连接酶之类的连接酶。将DNA与载体连接时，首先通过利用适当限制性核酸内切酶的消化作用将将载体线性化。然后，通过用细菌碱性磷酸酶或小牛肠碱性磷酸酶来处理经线性化的片段，可以防止连接步骤期间的该片段的自身连接。
本发明的制造方法中，分离通过上述“靶组织特异性化合物依赖性的抗原结合结构域”一项中说明的方法选择的、靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域。例如，如此分离的抗原结合结构域是选自文库中时，如后述实施例所记载的那样，编码该抗原结合结构域的多核苷酸通过通常的基因扩增由噬菌体等病毒分离。此外，如此分离的抗原结合结构域或抗体是选自杂交瘤等细胞的培养液中时，如前述抗体一项所示，抗体基因等通过通常的基因扩增由该细胞分离。
抗原结合分子的制造方法
本发明提供靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合分子的制造方法。
即，本发明提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)获得靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(b)获得靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(c)选择靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码在(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
此外，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)获得靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(b)获得靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(c)选择靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码在(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的存在下使抗原结合结构域或它们的文库与抗原接触；
步骤(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域置于该化合物的非存在下；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域或它们的文库与抗原接触；
步骤(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域置于该化合物的低浓度存在下；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
此外，本发明还提供包含以下步骤 (a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的非存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)从(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
此外，本发明还提供包含以下步骤 (a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)从(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的存在下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)在该化合物的非存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中洗脱出的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)在该化合物的低浓度存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中洗脱出的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)从(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的非存在下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱出的抗原结合结构域；
步骤(c)在该化合物的存在下使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)从(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱出的抗原结合结构域；
步骤(c)在该化合物的高浓度存在下使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)从(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域置于化合物的非存在下；
步骤(d)分离抗原结合活性在前述步骤(c)中较在前述步骤(b)中选择的基准弱的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
(g)从(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含以下步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在靶组织特异性化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域置于化合物的低浓度存在下；
步骤(d)分离抗原结合活性在前述步骤(c)中较在前述步骤(b)中选择的基准弱的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
(g)从(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
作为其多核苷酸序列与编码抗原结合结构域的多核苷酸连接的Fc区的非限定的一个方案，例示有人IgG1（SEQ ID NO:5）、IgG2（SEQ ID NO:6）、IgG3（SEQ ID NO:7）、或IgG4（SEQ ID NO:8）所示的抗体的恒定区所含的Fc区。Fc区是从以EU编号表示的大约216位氨基酸的木瓜蛋白酶切割位点的铰链区N末端开始，包含该铰链、CH2和CH3结构域的抗体重链恒定区的一部分。Fc区可由人IgG1获得，但并不限于IgG的特定的亚类。
此外，作为其多核苷酸序列与编码抗原结合结构域的多核苷酸连接的Fc区的非限定的一个方案，还例示有Fcγ受体结合活性较天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高的Fc区。作为这样的Fc区，可例示下述Fc区，其中，选自以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位中的至少一个以上的氨基酸与SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的对应的EU编号的氨基酸残基不同。
此外，作为前述Fc区的非限定的一个方案，例如，可举出下述Fc区，其包含SEQ IDNO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸的改变：
221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一者，
222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一者，
223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一者，
224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一者，
225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一者，
227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者，
228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者，
230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一者，
231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一者，
232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者，
233位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
234位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
235位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
236位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
237位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
238位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
239位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一者，
241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一者，
243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一者，
244位的氨基酸为His，
245位的氨基酸为Ala，
246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一者，
247位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中的任一者，
249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一者，
250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一者，
251位的氨基酸为Phe，
254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一者，
255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一者，
256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一者，
258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一者，
260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一者，
262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一者，
263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一者，
264位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
265位的氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一者，
267位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
268位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中的任一者，
269位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
270位的氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
271位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
272位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一者，
274位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一者，
276位的氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
278位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一者，
279位的氨基酸为Ala，
280位的氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中的任一者，
281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一者，
282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一者，
283位的氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中的任一者，
284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一者，
285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一者，
286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一者，
288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一者，
290位的氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一者，
292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一者，
293位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
294位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
295位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
296位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一者，
297位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
298位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
299位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一者，
300位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一者，
301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一者，
302位的氨基酸为Ile，
303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一者，
304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一者，
305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一者，
313位的氨基酸为Phe，
315位的氨基酸为Leu，
317位的氨基酸为Glu或Gln，
318位的氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中的任一者，
320位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
322位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
323位的氨基酸为Ile，
324位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
325位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
326位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
327位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
328位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
329位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
330位的氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
331位的氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
332位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一者，
333位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中的任一者，
334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一者，
335位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一者，
336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一者，
337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一者，
339位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中的任一者，
376位的氨基酸为Ala或Val中的任一者，
377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一者，
378位的氨基酸为Asp，
379位的氨基酸为Asn，
380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一者，
382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一者，
385位的氨基酸为Glu，
392位的氨基酸为Thr，
396位的氨基酸为Leu，
421位的氨基酸为Lys，
427位的氨基酸为Asn，
428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一者，
429位的氨基酸为Met，
434位的氨基酸为Trp，
436位的氨基酸为Ile、或者
440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一者。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为两处以上的氨基酸改变的组合，例如可举出如表1（表1-1～表1-3）中记载的组合。
作为其多核苷酸序列与编码抗原结合结构域的多核苷酸连接的Fc区的非限定的一个方案，还例示有抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高的Fc区。具体地，作为这种Fc区的非限定的一个方案，例示有对FcγRIIb的结合活性较对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性高的Fc区。
此外，作为前述Fc区的非限定的一个方案，优选可举出例如，SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中的以EU编号表示的238或328位的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。作为这种Fc区的实例，优选可举出：前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。
进而，在前述Fc区的非限定的一个方案中，优选可举出PCT/JP2012/054624中所例示的改变为下述任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238位的Pro替换为Asp、以及以EU编号表示的237位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Phe、以EU编号表示的267位的氨基酸为Val、以EU编号表示的267位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly、以EU编号表示的326位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的326位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Met、以EU编号表示的239位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的267位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的234位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的234位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的237位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的237位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Met、以EU编号表示的237位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的330位的氨基酸为Lys、以EU编号表示的330位的氨基酸为Arg、以EU编号表示的233位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ser、以EU编号表示的326位的氨基酸为Thr、以EU编号表示的323位的氨基酸为Ile、以EU编号表示的323位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的323位的氨基酸为Met、以EU编号表示的296位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的330位的氨基酸为Met。
作为其多核苷酸序列与编码抗原结合结构域的多核苷酸连接的Fc区的非限定的一个方案，例示有：在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区。作为可实现这样的改变的氨基酸，可举出例如：如国际公开WO1997/034631中所记载的那样，以EU编号表示的252位、254位、256位、309位、311位、315位、433位和/或434位以及与这些氨基酸组合的253位、310位、435位和/或426位的氨基酸。优选可举出如国际公开WO2000/042072中记载的那样以EU编号表示的238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位和/或447位的氨基酸。同样地，作为可实现这种改变的氨基酸，还可优选举出例如：如国际公开WO2002/060919中记载的那样以EU编号表示的251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位和/或436位的氨基酸。进而，作为可实现这种改变的氨基酸，还可举出如国际公开WO2004/092219中记载的那样以EU编号表示的250位、314位和428位的氨基酸。此外，作为可实现这种改变的氨基酸，还优选举出例如国际公开WO2006/020114中记载的238位、244位、245位、249位、252位、256位、257位、258位、260位、262位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、307位、311位、312位、316位、317位、318位、332位、339位、341位、343位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、423位、427位、430位、431位、434位、436位、438位、440位和/或442位的氨基酸。此外，作为可实现这种改变的氨基酸，还优选举出例如国际公开WO2010/045193中所记载的以EU编号表示的251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位和/或436位的氨基酸。
作为前述Fc区的非限定的一个方案，例如，可举出下述Fc区，其包含SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸的改变：
251位的氨基酸为Arg或Leu中的任一者，
252位的氨基酸为Phe、Ser、Thr、或Tyr中的任一者，
254位的氨基酸为Ser或Thr中的任一者，
255位的氨基酸为Arg、Gly、Ile、或Leu中的任一者，
256位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、或Thr中的任一者，
308位的氨基酸为Ile或Thr中的任一者，
309位的氨基酸为Pro，
311位的氨基酸为Glu、Leu、或Ser中的任一者，
312位的氨基酸为Ala或Asp中的任一者，
314位的氨基酸为Ala或Leu中的任一者，
385位的氨基酸为Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中的任一者，
386位的氨基酸为Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中的任一者，
387位的氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中的任一者，
389位的氨基酸为Asn、Pro、或Ser中的任一者，
428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中的任一者
433位的氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中的任一者，
434位的氨基酸为His、Phe、或Tyr中的任一者，或者
436位的氨基酸为Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中的任一者。对上述改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的另一方案，可举出例如，SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的308位的氨基酸为Ile、309位的氨基酸为Pro、和/或311位的氨基酸为Glu的Fc区。此外，该Fc区的另外的非限定的一个方案可举出包含下述的Fc区：308位的氨基酸为Thr、309位的氨基酸为Pro、311位的氨基酸为Leu、312位的氨基酸为Ala、和/或314位的氨基酸为Ala。此外，该改变的又一另外的非限定的一个方案可举出包含下述的Fc区：308位的氨基酸为Ile或Thr、309位的氨基酸为Pro、311位的氨基酸为Glu、Leu或Ser、312位的氨基酸为Ala、和/或314位的氨基酸为Ala或Leu。该改变的不同的非限定的一个方案可举出包含下述的Fc区：308位的氨基酸为Thr、309位的氨基酸为Pro、311位的氨基酸为Ser、312位的氨基酸为Asp、和/或314位的氨基酸为Leu。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的另一个方案，可举出例如，包含下述的Fc区：SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的251位的氨基酸为Leu、252位的氨基酸为Tyr、254位的氨基酸为Ser、或Thr、255位的氨基酸为Arg、和/或256位的氨基酸为Glu。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的不同的一个方案，可举出例如包含下述的Fc区：SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中的任一者，433位的氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中的任一者，434位的氨基酸为His、Phe、或Tyr中的任一者，和/或436位的氨基酸为Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中的任一者。此外，该改变的另外的非限定的一个方案可举出包含下述的Fc区：428位的氨基酸为His或Met、和/或434位的氨基酸为His或Met。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的其它不同的一个方案，可以是例如下述改变，其包括SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的385位的氨基酸为Arg、386位的氨基酸为Thr、387位的氨基酸为Arg、和/或389位的氨基酸为Pro。此外，该改变的另外的非限定的一个方案可举出下述Fc区，其包含：385位的氨基酸为Asp、386位的氨基酸为Pro和/或389位的氨基酸为Ser。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的另外的一个方案，可举出例如下述Fc区，其包含SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸：
250位的氨基酸为Gln或Glu中的任一者，或者
428位的氨基酸为Leu或Phe中的任一者。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的另外一个方案，可举出例如包含下述的Fc区：SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的250位的氨基酸为Gln、和/或428位的氨基酸为Leu或Phe中的任一者。此外，作为该改变的另外的非限定的一个方案，可举出包含下述的Fc区：250位的氨基酸为Glu、和/或428位的氨基酸为Leu或Phe中的任一者。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的另外一个方案，可举出例如下述Fc区，其包含SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的选自下述中的至少两个以上的氨基酸：
251位的氨基酸为Asp或Glu中的任一者，
252位的氨基酸为Tyr，
307位的氨基酸为Gln，
308位的氨基酸为Pro，
378位的氨基酸为Val，
380位的氨基酸为Ala，
428位的氨基酸为Leu，
430位的氨基酸为Ala、或Lys中的任一者，
434位的氨基酸为Ala、His、Ser、或Tyr中的任一者，或者
436位的氨基酸为Ile。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的另外一个方案，可举出例如包含下述的Fc区：SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的307位的氨基酸为Gln、和434位的氨基酸为Ala或Ser中的任一者。此外，作为该Fc区的另外的非限定的一个方案，可举出包含以下的Fc区：308位的氨基酸为Pro、和434位的氨基酸为Ala。此外，作为该Fc区的更另外的非限定的一个方案，可举出包含以下的Fc区：252位的氨基酸为Tyr、和434位的氨基酸为Ala。作为该Fc区的不同的非限定的一个方案，可举出包含以下的Fc区：378位的氨基酸为Val、和434位的氨基酸为Ala。作为该Fc区的另外的不同的非限定的一个方案，可举出包括下述的改变：428位的氨基酸为Leu、和434位的氨基酸为Ala。此外，作为该Fc区的又一另外的不同的非限定的一个方案，可举出包含下述的Fc区：434位的氨基酸为Ala、和436位的氨基酸为Ile。进而，作为该改变的又一非限定的一个方案，可举出包含下述的Fc区：308位的氨基酸为Pro、和434位的氨基酸为Tyr。进而，作为该改变的其它又一非限定的一个方案，可举出包含下述的Fc区：307位的氨基酸为Gln、和436位的氨基酸为Ile。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的另外的一个方案，可举出例如包含下述中的任一者的Fc区：SEQID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的307位的氨基酸为Gln、380位的氨基酸为Ala、和434位的氨基酸为Ser。此外，作为该Fc区的其它非限定的一个方案，可举出包含下述的Fc区：307位的氨基酸为Gln、380位的氨基酸为Ala、和434位的氨基酸为Ala。此外，作为该Fc区的进一步其它非限定的一个方案，可举出包含下述的Fc区：252位的氨基酸为Tyr、308位的氨基酸为Pro、和434位的氨基酸为Tyr。作为该Fc区的不同的非限定的一个方案，可举出包含下述的Fc区：251位的氨基酸为Asp、307位的氨基酸为Gln、和434位的氨基酸为His。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的其它的一个方案，可举出例如，SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸的改变：
238位的氨基酸为Leu，
244位的氨基酸为Leu，
245位的氨基酸为Arg，
249位的氨基酸为Pro，
252位的氨基酸为Tyr，
256位的氨基酸为Pro，
257位的氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中的任一者，
258位的氨基酸为Asp，
260位的氨基酸为Ser，
262位的氨基酸为Leu，
270位的氨基酸为Lys，
272位的氨基酸为Leu、或Arg中的任一者，
279位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中的任一者，
283位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中的任一者，
285位的氨基酸为Asn，
286位的氨基酸为Phe，
288位的氨基酸为Asn、或Pro中的任一者，
293位的氨基酸为Val，
307位的氨基酸为Ala、Glu、或Met中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、Ile、Lys、Leu、Met、Val、或Trp中的任一者，
312位的氨基酸为Pro，
316位的氨基酸为Lys，
317位的氨基酸为Pro，
318位的氨基酸为Asn、或Thr中的任一者，
332位的氨基酸为Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中的任一者，
339位的氨基酸为Asn、Thr、或Trp中的任一者，
341位的氨基酸为Pro，
343位的氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中的任一者，
375位的氨基酸为Arg，
376位的氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中的任一者，
377位的氨基酸为Lys，
378位的氨基酸为Asp、或Asn中的任一者，
380位的氨基酸为Asn、Ser、或Thr中的任一者，
382位的氨基酸为Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
423位的氨基酸为Asn，
427位的氨基酸为Asn，
430位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
431位的氨基酸为His、或Asn中的任一者，
434位的氨基酸为Phe、Gly、His、Trp、或Tyr中的任一者，
436位的氨基酸为Ile、Leu、或Thr中的任一者，
438位的氨基酸为Lys、Leu、Thr、或Trp中的任一者，
440位的氨基酸为Lys、或者，
442位的氨基酸为Lys。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变两处的氨基酸，也可以改变三处以上的氨基酸。
作为前述的在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性较人IgG1的起始Fc区的结合活性强的Fc区的非限定的另外的一个方案，可举出例如：SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中包含下述的Fc区：以EU编号表示的257位的氨基酸为Ile、和311位的氨基酸为Ile。此外，作为该Fc区的另外的非限定的一个方案，可举出包含下述的Fc区：257位的氨基酸为Ile、和434位的氨基酸为His。此外，作为该Fc区的进一步其它非限定的一个方案，可举出包含下述的Fc区：376位的氨基酸为Val、和434位的氨基酸为His。
作为其多核苷酸序列与编码抗原结合结构域的多核苷酸连接的Fc区的非限定的一个方案，可例示在pH中性范围条件下具有人FcRn结合活性的Fc区。作为在pH中性范围具有人FcRn结合活性的Fc区，例如，可例示SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中选自以EU编号表示的221位～225位、227位、228位、230位、232位、233位～241位、243位～252位、254位～260位、262位～272位、274位、276位、278位～289位、291位～312位、315位～320位、324位、325位、327位～339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375位～378位、380位、382位、385位～387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426位～438位、440位和442位的至少一个以上的氨基酸被替换的Fc区。
作为前述的在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区的非限定的其它的一个方案，例如，可例示SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区所含的Fc区的氨基酸残基中以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位和436位的氨基酸被替换的Fc区。通过将选自这些氨基酸中的至少1个氨基酸替换为其它的氨基酸，抗原结合分子所含的Fc区可以在pH中性范围与人FcRn结合。
作为前述的在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区的非限定的其它的一个方案，可举出包含以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
237位的氨基酸为Met，
248位的氨基酸为Ile，
250位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
252位的氨基酸为Phe、Trp、或Tyr中的任一者，
254位的氨基酸为Thr，
255位的氨基酸为Glu，
256位的氨基酸为Asp、Asn、Glu、或Gln中的任一者，
257位的氨基酸为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val中的任一者，
258位的氨基酸为His，
265位的氨基酸为Ala，
286位的氨基酸为Ala或Glu中的任一者，
289位的氨基酸为His，
297位的氨基酸为Ala，
303位的氨基酸为Ala，
305位的氨基酸为Ala，
307位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
308位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr中的任一者，
309位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中的任一者，
311位的氨基酸为Ala、His、或Ile中的任一者，
312位的氨基酸为Ala或His中的任一者，
314位的氨基酸为Lys或Arg中的任一者，
315位的氨基酸为Ala、Asp或His中的任一者，
317位的氨基酸为Ala，
332位的氨基酸为Val，
334位的氨基酸为Leu，
360位的氨基酸为His，
376位的氨基酸为Ala，
380位的氨基酸为Ala，
382位的氨基酸为Ala，
384位的氨基酸为Ala，
385位的氨基酸为Asp或His中的任一者，
386位的氨基酸为Pro，
387位的氨基酸为Glu，
389位的氨基酸为Ala或Ser中的任一者，
424位的氨基酸为Ala，
428位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
433位的氨基酸为Lys，
434位的氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中的任一者，或者
436位的氨基酸为His 、Ile、Leu、Phe、Thr、或Val。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为这些氨基酸的改变的组合，可举出例如表2-1～2-33所示的氨基酸的改变。
作为其多核苷酸序列与编码抗原结合结构域的多核苷酸连接的Fc区的非限定的一个方案，可例示对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低的Fc区。作为该Fc区的非限定的其它的一个方案，优选可举出：以EU编号表示的的234、235、236、237、238、239、270、297、298、325、328、和329中的任一个以上的氨基酸为被改变为与例如SEQ ID NO:5、6、7或8所示的天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区，但Fc区的改变并不限于上述改变，也可以是例如Cur. Opin. in Biotech. (2009) 20 (6), 685-691中记载的脱糖链（N297A, N297Q）、IgG1-L234A/L235A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E等改变、和国际公开WO2008/092117中记载的G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、N325L/L328R等改变、以及EU编号233位、234位、235位、237位的氨基酸的插入、国际公开WO2000/042072中记载的位置的改变。
作为前述对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低的Fc区的非限定的其它的一个方案，可举出包含以EU编号表示的选自下述中的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
234位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp中的任一者，
235位的氨基酸为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Arg中的任一者，
236位的氨基酸为Arg、Asn、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Tyr中的任一者，
237位的氨基酸为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val、Tyr或Arg中的任一者，
238位的氨基酸为Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Thr、Trp或Arg中的任一者，
239位的氨基酸为Gln、His、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr或Arg中的任一者，
265位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
266位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
267位的氨基酸为Arg、His、Lys、Phe、Pro、Trp或Tyr中的任一者，
269位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
270位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
271位的氨基酸为Arg、His、Phe、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
295位的氨基酸为Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一者，
296位的氨基酸为Arg、Gly、Lys或Pro中的任一者，
297位的氨基酸为Ala，
298位的氨基酸为Arg、Gly、Lys、Pro、Trp或Tyr中的任一者，
300位的氨基酸为Arg、Lys或Pro中的任一者，
324位的氨基酸为Lys或Pro中的任一者，
325位的氨基酸为Ala、Arg、Gly、His、Ile、Lys、Phe、Pro、Thr、TrpTyr、或者Val中的任一者，
327位的氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
328位的氨基酸为Arg、Asn、Gly、His、Lys或Pro中的任一者，
329位的氨基酸为Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val或Arg中的任一者，
330位的氨基酸为Pro或Ser中的任一者，
331位的氨基酸为Arg、Gly或Lys中的任一者，或者
332位的氨基酸为Arg、Lys或Pro中的任一者。此外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。
作为本发明的非限定的一个方案中的抗原结合分子所含的Fc区，可适当使用形成以上述的双特异性抗体为来源的Fc区的两个多肽。更具体地，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的349位氨基酸为Cys、366位氨基酸为Trp，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Cys、366位氨基酸为Ser、368氨基酸为Ala、407位氨基酸为Val。
作为另外的本发明的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp，在另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys。在上述方案中，409位氨基酸可以是Glu以代替Asp，399位氨基酸可以是Arg以代替Lys。此外，除399位氨基酸Lys以外，还可以适当追加作为360位氨基酸的Asp或作为392位氨基酸的Asp。
作为本发明的另外的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的357位氨基酸为Lys。
作为本发明的另外的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys。
作为本发明的其它的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用上述组合得到的以下方案中的任一者：
(i) 形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、370位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys (本方案中，以EU编号表示的370位氨基酸可以是Asp以代替Glu，可以是以EU编号表示的392位氨基酸的Asp以代替370位氨基酸的Glu)；
(ii) 形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys (在本方案中，可以是以EU编号表示的360位氨基酸的Asp以代替439位氨基酸的Glu、可以是以EU编号表示的392位氨基酸的Asp或439位氨基酸的Asp)；
(iii) 形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的357位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys；或者
形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、370位氨基酸为Glu、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys (本方案中，以EU编号表示的370位氨基酸可以替换成Glu，而且370位氨基酸不替换成Glu，并且439位氨基酸Glu可以替换成Asp、或者392位氨基酸Asp可以替换成439位氨基酸Glu)。
进而，在本发明的其它的非限定的一个方案中，还优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的435位氨基酸为Arg、439位氨基酸为Glu。
进而，在本发明的其它的非限定的一个方案中，还优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu、435位氨基酸为Arg、439位氨基酸为Glu。
从经所期望的表达载体转化的细胞的培养液分离本发明的抗原结合分子，该载体可操作地连接有如上所述经连接的编码抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸。
在本发明的抗原结合分子所含的Fc区是以与该Fc区结合的糖链的组成中结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例变高的方式、或添加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区的比例变高的方式进行了修饰的Fc区的情形中，作为前述经转化的细胞，适宜使用要受到糖链修饰的多肽的形成糖链结构的活性被改变而使对糖链添加岩藻糖的能力低的宿主细胞（国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等）。作为该宿主细胞的非限定的一个方案，适宜使用选自岩藻糖基转移酶（EC 2.4.1.152）、岩藻糖转运体（SLC35C1）、GMD（GDP-甘露糖4,6-脱水酶）（EC 4.2.1.47）、Fx（GDP-酮-6-脱氧甘露糖3，5-表异构酶，4-还原酶）（EC1.1.1.271）、和GFPP（GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶）（EC 2.7.7.30）中的酶或转运体的活性缺失的宿主细胞（国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等）。这种活性缺失的宿主细胞可通过破坏对CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、HEK293细胞、或杂交瘤细胞等为内源性的这些功能性蛋白的基因使之不能发挥功能的方法等来制作。
本发明的抗原结合分子所含的Fc区为包含具有平分型GlcNAc的糖链的Fc区时，作为前述经转化的细胞，为了制作包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体，适宜使用表达编码功能性蛋白的基因的宿主细胞，该功能性蛋白具有GnTIII（β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶）（EC 2.4.1.144）活性或GalT（β-1,4-半乳糖基转移酶）（EC2.4.1.38）活性（国际公开WO2002/079255等）。在其它非限定的优选的一个方案中，适宜使用除了前述功能性蛋白之外，还共表达编码具有人ManII（甘露糖苷酶II）（3.2.1.114）活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTI（β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶I）（EC 2.4.1.94）活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTII（β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶II）（EC 2.4.1.143）活性的功能性蛋白的基因、编码具有ManI（甘露糖苷酶）（EC 3.2.1.113）活性的功能性蛋白的基因、和α-1,6-岩藻糖基转移酶（EC 2.4.1.68）的宿主细胞（国际公开WO2004/065540）。
使用从上述细胞的培养液分离等依照上述抗体一项中记载的抗体制造方法的方法，制造本发明的抗原结合分子。作为前述包含Fc区的多肽的非限定的一个方案，例如，可例示SEQ ID NO:5、6、7或8所示的抗体的恒定区。此外，作为本发明的抗原结合分子的非限定的一个方案，可举出全长抗体分子。
药物组合物
根据本发明，提供包含抗原结合分子的药物组合物，该抗原结合分子为了在避免副作用的同时发挥药效而在正常组织或血液中不全身性地作用，但在作为病变部位的癌或炎性部位作用。本发明的药物组合物所含的抗原结合分子与癌组织的癌细胞・免疫细胞・基质细胞等中表达的抗原、分泌于癌组织中的抗原、或炎性组织的免疫细胞等中表达的抗原、分泌于炎性组织的抗原结合，但不能与正常组织中表达的抗原结合，因此在避免对正常组织的细胞毒性作用、中和作用等所致的副作用的同时，发挥对癌的强效的细胞毒性作用或增殖抑制作用、免疫增强作用等、或对炎性组织的炎性细胞的免疫抑制效果等。例如，包含癌组织特异性化合物依赖性地与T细胞上表达的CD3结合的抗原结合结构域、以及与癌细胞上表达的EGFR结合的抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子或双互补位抗原结合分子不与正常组织中表达的EGFR结合，但与癌细胞中表达的EGFR结合，因而在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。即，与存在于癌细胞附近的T细胞上表达的CD3癌组织特异性化合物依赖性地结合，但不与存在于癌细胞附近以外的T细胞上表达的CD3结合，因而将存在于癌细胞附近的T细胞活化而在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。
如此，在靶组织中与抗原结合、但在靶组织以外的正常组织或血液中不与抗原结合的抗原结合分子可在避免副作用的同时发挥药效。本发明提供的将生物体内的靶组织中高浓度存在的低分子作为开关而与抗原结合的抗原结合分子，即，低分子开关抗原结合分子（Small molecule switch antigen binding molecule）可以在该低分子不存在的正常环境中不与抗原结合，而在该低分子以高浓度存在的靶组织中与抗原结合。
作为这种低分子开关抗原结合分子的非限定的一个方案，首先例示将在癌组织或炎性组织中高浓度存在、并且能够作为开关起作用的癌组织或炎性组织特异性化合物，即，腺苷（adenosine）、三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate; ATP）、肌苷（inosine）、犬尿氨酸（犬尿氨酸）、前列腺素E2（prostaglandin E2; PGE2）、琥珀酸（succinic acid）、乳酸（lactic acid）夹在本发明的抗原结合分子（所含的互补位）与抗原（所含的表位）中，从而发挥开关功能的癌组织或炎性组织特异性化合物依赖性的抗原结合分子。若该化合物不存在，则本发明的抗原结合分子所含的互补位与抗原所含的表位的相互作用变得不充分，本发明的抗原结合分子无法与抗原结合，但若该化合物存在，则通过夹在本发明的抗原结合分子所含的互补位与抗原所含的表位之间，在该化合物以高浓度存在的癌组织或炎性组织等靶组织中已与抗原结合的该抗原结合分子可以对表达该抗原的细胞发挥药效。此外，由于该作为开关的化合物的结合是可逆的，因而认为借助这些化合物的开关的本发明的抗原结合分子对抗原的结合的控制是可逆的。因此，可以在癌组织或炎性组织等病变部位中与癌组织或炎性组织的癌细胞或免疫细胞等病原细胞结合、或与癌组织或炎性组织中所分泌的抗原结合从而发挥药效的本发明的抗原结合分子作为药物组合物有用。本发明的药物组合物中可含有药学上可接受的载体。
本发明中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防、或检查・诊断的药剂。此外，本发明中，“包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合分子的药物组合物”的用语即可以说成“包括对治疗对象给予抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合分子的疾病的治疗方法”，也可以说成“抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合分子在制造用于治疗疾病的药物中的用途”。此外，还可将“包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合分子的药物组合物”的用语说成“抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合分子的用于治疗疾病的用途”。
本发明的药物组合物可使用本领域技术人员公知的方法来进行制剂化。例如，可以以水或其以外的药学上可接受的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以适宜组合药理学上可接受的载体或介质、具体地、适宜组合灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等，以通常所认可的制药实践所要求的单位用量形态进行混和，由此进行制剂。设定这些制剂中的有效成分量，以便可得到指示范围的适当容量。
用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水之类的载体按照通常的制剂实践来进行配制。作为注射用水溶液，可举出例如生理盐水、包含葡萄糖或其它辅助药（例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠）的等渗液。可以并用适当的溶解助剂，例如，醇（乙醇等）、多元醇（丙二醇、聚乙二醇等）、非离子表面活性剂（聚山梨醇酯80（TM）、HCO-50等）。
油性液可举出芝麻油、大豆油，还可以并用苯甲酸苄酯和/或苯甲醇作为溶解助剂。此外，还可以与缓冲剂（例如、磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液）、止痛剂（例如、盐酸普鲁卡因）、稳定剂（例如、苯甲醇和苯酚）、抗氧化剂配合。所制备的注射液通常填充于适当的安瓿中。
本发明的药物组合物优选通过非口服给药来给予。给予例如注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、经皮给予型的组合物。通过例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等可全身或局部给予。
给予方法可根据患者的年龄、症状而适宜选择。含有抗原结合分子的药物组合物的给予量可设定为例如对于一次给药体重每1 kg为0.0001 mg至1000 mg的范围。或者，可设定例如每个患者为0.001～100000 mg的给予量，本发明并受上述数值的限制。给予量和给予方法根据患者的体重、年龄、症状等而改变，本领域技术人员可以考虑这些条件设定适当的给予量和给予方法。
应予说明，本发明中记载的氨基酸序列中所含的氨基酸有时也会在翻译后受到修饰（例如，N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰基化而修饰成为焦谷氨酸是本领域技术人员熟知的修饰），这种氨基酸经翻译后修饰的情形自然也包含在本发明中记载的氨基酸序列中。
应予说明，本说明书中引用的全部现有技术文献作为参考并入本说明书中。
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例所限制。
实施例
〔实施例1〕将在靶组织中以高浓度存在的低分子作为开关而与抗原结合的抗体的概念
为了在避免副作用的同时发挥药效，需要一种在正常组织或血液中不全身性地作用、但在作为病变部位的癌或炎性部位中作用的药物的研发技术。在给药后可以与癌细胞上表达的抗原结合，但不与正常组织中表达的抗原结合的抗体分子可以在避免对正常组织的细胞毒性作用所致的副作用的同时发挥对癌的强效细胞毒性作用。例如，改变前述EGFR-BiTE（非专利文献9）得到的抗原结合分子，其是不与正常组织中表达的EGFR结合，但可与癌细胞上表达的EGFR结合的分子，可以在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。此外，BiTE经由CD3募集并活化T细胞从而发挥抗肿瘤效果（非专利文献8），因而只要对EGFR-BiTE赋予与存在于癌细胞附近的T细胞上表达的CD3结合，但不与存在于癌细胞附近以外的T细胞上表达的CD3结合的性质，则被赋予了这种性质的改变EGFR-BiTE可在癌中活化T细胞，可在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。
并不限于针对癌的抗体药物，若抗体分子在类风湿性关节炎中已发生炎症的关节的滑液中与细胞因子结合并抑制其作用，但不全身性地抑制，则认为可在避免全身性的细胞因子的中和所致的感染疾病风险增大的同时，对类风湿性关节炎等炎性疾病・自身免疫疾病发挥良好的治疗效果。
如此，在癌组织中与抗原结合、但在癌组织以外的正常组织或血液中不与抗原结合的抗体可以在避免副作用的同时发挥药效。然而，迄今为止尚未报道具有这种特性的理想抗体。因此，将生物体内的癌组织中高浓度存在的低分子作为开关而与抗原结合的抗体分子，即，低分子开关抗体（Small molecule switch antibody），如图1所示，可以在低分子不存在的环境中不与抗原结合、而在低分子以高浓度存在的靶组织中与抗原结合。
在研发这种低分子开关抗体时，首先对在癌组织中以高浓度存在、并且被认为能够用作开关的低分子进行了探究。其结果，腺苷（adenosine）、三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate; ATP）、肌苷（inosine）、犬尿氨酸（犬尿氨酸）、前列腺素E2（prostaglandinE2; PGE2）、琥珀酸（succinic acid）、乳酸（lactic acid）有望作为开关。这些低分子均是由癌细胞自身产生、或由已发生细胞死亡的癌细胞所释放、或由浸润于癌组织的免疫细胞等产生，从而在癌组织中以高浓度存在，而在正常组织或血液中以相较于癌组织的低浓度存在。这些低分子只要能够如图2所示夹在抗体与抗原的复合体间，则该低分子可以发挥开关功能。即，若低分子不存在则抗体与抗原的相互作用变得不充分，抗体无法与抗原结合，但若低分子存在则通过夹在抗体与抗原之间，抗体可以与抗原结合。换而言之，在低浓度的低分子存在下，抗体与抗原的相互作用变得不充分，抗体无法与抗原结合，但在高浓度的低分子存在下，通过夹在抗体与抗原之间，抗体可以与抗原结合。此外，由于该作为开关的低分子的结合是可逆的，因而借助这些低分子开关的抗原结合的控制也是可逆的。
因此，首先尝试了获得针对被报道参与癌细胞增殖的IL-6（Br. J. Haematol.(2011) 152 (5), 579-92）的低分子开关抗体。
〔实施例2〕从使用噬菌体展示技术的人抗体文库获得在低分子存在下与人IL-6结合的抗体
（2-1）天然人抗体噬菌体展示文库的制作
将由人PBMC制作的Poly A RNA或市售的人Poly A RNA等作为模板，按照本领域技术人员公知的方法，构建由展示彼此不同的人抗体序列的Fab结构域的多个噬菌体组成的人抗体噬菌体展示文库。
（2-2）通过珠淘选从文库获得在低分子存在下与人IL-6结合的抗体
从（2-1）中构建的天然人抗体噬菌体展示文库中，进行在低分子存在下表现出抗原结合活性的抗体的筛选。即，收集展示抗体的噬菌体，该抗体在低分子存在下对被珠捕获的抗原表现出结合活性。从在低分子非存在的条件下从珠洗脱出的噬菌体洗脱液回收噬菌体。本获得方法中，使用经生物素标记的人IL-6作为抗原。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生的噬菌体通过通常的方法纯化。然后得到经TBS透析处理的噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度为4%的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（Dynabeads M-280 Streptavidin）。
为了有效率地获得低分子（该低分子能够在癌组织中发挥开关功能）依赖性的低分子开关抗体，实施了对在这些低分子（腺苷（adenosine）、三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate; ATP）、肌苷（inosine）、犬尿氨酸(犬尿氨酸)、前列腺素E2（prostaglandinE2; PGE2）、琥珀酸（succinic acid）、乳酸（lactic acid））的混合液（以下，表述为SC（低分子cocktail，低分子混合液））的存在下与抗原结合、但在SC非存在下与抗原不结合的抗体进行浓缩的淘选。
具体地，对于制备的噬菌体文库液，使250 pmol的生物素标记抗原、以及包含各终浓度为1 mM的三磷酸腺苷钠盐（ATP-Na）、腺苷（Adenosine）、肌苷（Inosine）、琥珀酸（Succinic acid）和乳酸（Lactic acid）、终浓度为1μM的前列腺素E2（PGE2）、以及终浓度为100μM的犬尿氨酸（犬尿氨酸）且通过NaOH将其pH调整为7.4的SC与该噬菌体文库液在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用SC/TBS（含有SC的TBS）清洗1次。然后，将加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在低分子存在下结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行能够在SC存在下与抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40 pmol的生物素标记抗原和SC、NaOH，由此使噬菌体文库在室温与抗原和低分子接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1 mL的SC/TBST和SC/TBS清洗。然后将加入有0.5 mL的TBS的珠在室温悬浮后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。再次重复该操作后，将分2次洗脱出的噬菌体液混合。进而，对残留的珠加入0.5mL的TBS，将该珠在室温搅拌5分钟。由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。在回收的噬菌体溶液中加入100 mg/mL的胰蛋白酶5μL，由此将不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白（来源于辅助噬菌体的pIII蛋白）切断，使得不展示Fab的噬菌体丧失感染大肠杆菌的能力。将从经胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x225 mm的板上。此时，将通过第2次淘选得到的2种感染大肠杆菌分别以等量混合，接着，由接种的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，从而回收噬菌体文库液。将获得在SC存在下具有抗原结合活性的抗体的淘选重复进行3次。
（2-3）利用阴性选择法（negative selection method）从文库获得在低分子存在 下与人IL-6结合的抗体
从构建的天然人抗体噬菌体展示文库中，进行在低分子存在的条件下对抗原表现出抗原结合活性的抗体的筛选。为了筛选，首先使天然人抗体噬菌体展示文库在低分子非存在下与生物素标记抗原-链酶亲和素接触，除去展示即使在低分子非存在下也对抗原具有结合活性的抗体的噬菌体。接着，在低分子的存在下同样地进行淘选，由此实施在低分子存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。使用经生物素标记的IL-6作为抗原。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。将产生的噬菌体通过通常的方法纯化后，针对TBS进行透析处理，得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度为4%的方式添加BSA。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-Mag SpeedBeadsNeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（Dynabeads M-280 Streptavidin），实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。
在制备的噬菌体文库液中，通过加入250 pmol的生物素标记抗原、以及包含各终浓度为1 mM的ATP-Na、腺苷、肌苷、琥珀酸和乳酸、终浓度为1μM的PGE2、以及终浓度为100μM的犬尿氨酸、并且通过NaOH将其pH调整为7.4的SC，使之与该噬菌体文库液在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用SC/TBS清洗1次。然后，将加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在SC存在下结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行能够在SC存在下与抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，对经BSA封闭的Sera-Mag中和亲和素珠加入250pmol生物素化抗原，在室温结合15分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以BSA进行了封闭的噬菌体文库液，在室温结合1小时。使用磁力架将珠分离，由此回收未与抗原和珠结合的噬菌体。对回收的噬菌体加入40 pmol的生物素标记抗原和SC、NaOH，使噬菌体文库在室温与抗原和SC所含的低分子接触60分钟。接着，在标记抗原、SC和噬菌体文库的混合液中加入经BSA封闭的磁珠，在室温使抗原和噬菌体的复合体与磁珠结合15分钟。将珠用1 mL的SC/TBST和SC/TBS清洗。然后，将1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入至该混合液中。将该混合液在室温搅拌20分钟后，由使用磁力架分离的珠回收噬菌体。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。将获得在SC存在下对抗原具有结合活性的抗体的淘选重复进行3次。
（2-4）通过噬菌体ELISA评价低分子存在下的结合活性
由根据上述的方法得到的大肠杆菌的单克隆，按照常法（Methods Mol. Biol.(2002) 178, 133-145），回收含有噬菌体的培养上清。使用NucleoFast 96（MACHEREY-NAGEL），对回收的培养上清进行超滤。对各孔中添加有培养上清各100μL的NucleoFast 96进行离心分离（4,500g, 45分钟），由此除去穿流物（flow-through portion）。将各孔中加入有100μL的H2O的该NucleoFast 96再次进行离心分离（4,500g, 30分钟离心），由此进行清洗。最后加入TBS 100μL，回收在室温静置5分钟的该NucleoFast 96的各孔的上清中所含的噬菌体液。
加入有TBS或SC/TBS的纯化噬菌体通过以下步骤供于ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL TBS包被一晩。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去抗原，然后将该孔用250μL的2%脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2%脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了所制备纯化噬菌体的该培养板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的抗原在SC非存在/存在下结合。在经TBST或SC/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或SC/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用TBST或SC/TBST清洗后，向各孔添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。
使用分离得到的96个克隆进行噬菌体ELISA，由此得到在低分子cocktail存在下对作为抗原的人IL-6具有结合活性的克隆“I6NMSC1-3_A11”。
〔实施例3〕在低分子存在下与抗原结合的抗体的评价
（3-1）与人IL-6结合的抗体的表达和纯化
由实施例2噬菌体ELISA所示的、判断为在SC存在下具有抗原结合活性的克隆I6NMSC1-3_A11，使用特异性引物（SEQ ID NO:110和112）进行扩增，对所得基因的碱基序列进行解析（重链的序列由SEQ ID NO:30所示，轻链的序列由SEQ ID NO:31所示）。将编码I6NMSC1-3_A11的可变区的基因插入人IgG1/Lambda的动物表达用质粒，将编码已知的抗人IL-6抗体CLB8-F1（重链为SEQ ID NO:32、轻链为SEQ ID NO:33）、和作为阴性对照的抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC413（重链为SEQ ID NO:34、轻链为SEQ ID NO:35）的可变区的基因分别插入人IgG1/kappa的动物表达用质粒。使用以下方法表达抗体。对于在FreeStyle293 Expression Medium培养基（Invitrogen）中以1.33 x 106细胞/mL的细胞密度悬浮、并以每孔3 mL接种于6孔板的各孔中的来源于人胚肾细胞的FreeStyle 293-F株（Invitrogen），通过脂质体转染法导入所制备的质粒。在CO2培养箱（37℃、8%CO2, 90 rpm）中培养4天，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences），通过本领域技术人员公知的方法由培养上清纯化抗体。使用分光光度计测定纯化抗体溶液在280 nm下的吸光度。通过PACE法由所得测定值算出吸光系数，使用该吸光系数算出纯化抗体的浓度（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。
（3-2）鉴定所获得的抗体与人IL-6结合所需的低分子
将所获得的I6NMSC1-3_A11（以下简称为A11）与对照的CLB8-F1和GC413这3种抗体在表3所示的9个条件下供于ELISA。另外，使用表4所示的缓冲液以表3所示的浓度适宜制备各低分子。使用经生物素标记的人IL-6作为抗原。
首先，将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL的PBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用清洗缓冲液清洗从而除去未与培养板结合的抗原后，将该孔用封闭缓冲液 250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在以表3的终浓度含有低分子的样品缓冲液中制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各IgG与各孔中存在的抗原结合。使用以表3的终浓度含有低分子的清洗缓冲液进行清洗后，将经加入有相同低分子的样品缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体（BIOSOURCE）添加至各孔中，将培养板孵育1小时。用含有各低分子的清洗缓冲液清洗后，向各孔添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。
测定结果示于图3。结果表明，对于CLB8-F1，无论低分子的种类和存在的有无如何，吸光度均相同，而对于I6NMSC1-3_A11，与条件8（全部低分子cocktail溶液）下的吸光度相比，条件9（无低分子）下的吸光度显著地低。根据结果，与噬菌体 ELISA同样地确认到I6NMSC1-3_A11具有依赖于低分子的有无而使与抗原的结合发生变化的性质。另外，I6NMSC1-3_A11在条件7（犬尿氨酸 100μM存在下）中显示与条件8相同的吸光度，在其它条件下吸光度显著地低，该结果表明其是在犬尿氨酸存在下与作为抗原的人IL-6结合、在犬尿氨酸非存在下与IL-6不结合的抗体。
〔实施例4〕通过表面等离子体共振评价犬尿氨酸对人IL6结合的影响
（4-1）评价犬尿氨酸对人IL-6结合的开关功能
使用Biacore T200 (GE Healthcare) ，分析A11与人IL-6（鎌倉テクノサイエンス）的抗原抗体反应的相互作用。在用胺偶联法固定了适当量protein A/G（Invitrogen）的传感器芯片CM5（GE Healthcare）上捕获目标抗体，使之与作为抗原的IL-6相互作用。流动缓冲液（running buffer）使用了10 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v)Tween20、100μmol/L 犬尿氨酸、pH7.4、或10 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v)Tween20、pH7.4这2 种。与作为抗原的IL-6的相互作用在37 ℃下进行测定，IL-6的稀释中使用了与流动缓冲液相同的缓冲液。
以流速5μL/min注入人IL-6稀释液和作为空白的流动缓冲液3分钟，使人IL-6与传感器芯片上捕获的A11相互作用。然后，以流速5μL/min通入3分钟流动缓冲液，观察到人IL-6从抗体解离后，以流速30μL/min注入10 mmol/L Glycine-HCl、pH1.5 30秒钟，将传感器芯片再生。由测定所得的传感图算出作为动力学参数的结合速度常数 ka（1/Ms）、和解离速度常数 kd（1/s），基于它们算出A11与人IL-6的解离常数KD（M）。各参数的计算中使用了Biacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare）。
将该测定中获得的100μmol/L 犬尿氨酸存在下、或非存在下的A11与4μmol/L的人IL-6的相互作用的传感图示于图4。如图4所示，A11在100μmol/L的犬尿氨酸存在下与IL-6结合，但在犬尿氨酸非存在下未观察到对IL-6的结合。由此确认A11具有以犬尿氨酸为开关而与IL-6结合的性质。此外，100μmol/L 犬尿氨酸存在下的A11的解离常数KD为1.0E-6 mol/L。
（4-2）评价犬尿氨酸浓度对人IL-6结合造成的影响
接着，使用Biacore T200（GE Healthcare），评价犬尿氨酸浓度对A11与人IL-6的抗原抗体反应的影响。作为流动缓冲液，使用10 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05%(w/v) Tween20、pH7.4，在25 ℃下测定A11与人IL-6的抗原抗体反应。将A11通过胺偶联固定于传感器芯片CM5上，将用含有以各种浓度制备的犬尿氨酸的10 mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4进行了稀释的1μmol/L的IL-6作为分析物，使之相互作用60秒钟，观察其结合量的变化。其结果示于图5。该结果表明，作为开关的犬尿氨酸浓度越高，则IL-6与A11结合越多。
接着，为了评价犬尿氨酸浓度对固定于传感器芯片CM5上的、作为A11的犬尿氨酸开关功能的对照的来源于文库的与人IL-6结合的H01抗体（重链为SEQ ID NO:36、轻链为SEQ ID NO:37）与人IL-6的抗原抗体反应的的影响，进行与上述相同的实验。其结果示于图6。由该结果确认，即使犬尿氨酸浓度变化，来源于文库的作为对照抗IL-6抗体的H01与IL-6的结合也不发生变化。
接着，使用Biacore T200（GE Healthcare），对A11以二价与IL-6结合时的、作为开关的犬尿氨酸的浓度对该结合造成的影响进行评价。流动缓冲液使用10 mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4，在25 ℃下测定A11与人IL-6的抗原抗体反应。将IL-6通过胺偶联固定于传感器芯片CM5上，将用含有以各种浓度制备的犬尿氨酸的10mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4进行了稀释的0.1μmol/L的A11作为分析物，使之相互作用60秒钟，观察以二价结合时的A11与IL-6的结合量的变化。其结果示于图7。在该评价体系中，IL-6固定于传感器芯片上，因而认为A11以二价结合。在这种A11以二价识别IL-6的评价体系中，也观察到犬尿氨酸浓度越高则A11与IL-6的结合量越增加。该结果表明，在二价的结合中，A11具有以犬尿氨酸为开关而与IL-6结合的性质。
（4-3）犬尿氨酸开关对抗体从人IL-6解离的效果
使用Biacore T200（GE Healthcare），评价在犬尿氨酸存在下与IL-6结合了的A11是否会在犬尿氨酸非存在下犬尿氨酸浓度依赖性地解离。作为流动缓冲液，使用10 mmol/LACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4和10 mmol/L ACES、150 mmol/LNaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4、100μmol/L 犬尿氨酸，在25 ℃下进行测定。将用含有100μmol/L犬尿氨酸的10 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4进行了稀释的0.1μmol/L的A11作为分析物，使之与通过胺偶联固定有IL-6的传感器芯片CM5相互作用60秒钟，然后观察各流动缓冲液条件下的IL-6的解离状况。为了比较各流动缓冲液条件下的解离程度，对以100μmol/L的犬尿氨酸存在下的A11与IL-6的结合量为100而进行了标准化（normalize）的值进行比较。将示出该标准化后的A11与IL-6的相互作用的状况的传感图示于图8。图8的结果表明，A11具有在犬尿氨酸存在下与IL-6结合、然后在犬尿氨酸不存在时将IL-6快速解离的性质。即，确认到基于犬尿氨酸的对抗体与人IL-6的结合的控制是完全可逆的。
这些结果表明，A11是以犬尿氨酸作为开关而在犬尿氨酸存在下与IL-6结合、在犬尿氨酸非存在下从IL-6解离的抗体。此外，还确认到A11可实现在犬尿氨酸非存在下完全不显示人IL-6结合活性的完全ON/OFF控制，推测以图2所示的方案实现开关功能。
（4-4）评价犬尿氨酸与人IL-6的结合性
使用Biacore T200（GE Healthcare），分析IL-6（鎌倉テクノサイエンス）与犬尿氨酸的相互作用。使800、400、200、100、50、25 nmol/L的犬尿氨酸，与以胺偶联法固定有约5000 RU的IL-6的传感器芯片CM5（GE Healthcare）相互作用。作为流动缓冲液，使用10mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4。前述相互作用均在25 ℃下测定。犬尿氨酸的稀释使用了流动缓冲液。所获得的IL-6与犬尿氨酸的相互作用的传感图示于图9。
前述实验中固定了IL-6约5000 RU。IL-6对分子量为约20,000 g/mol，犬尿氨酸的分子量为约200 g/mol，因此期待最大50 RU左右的犬尿氨酸相互作用。但是，本次测定条件中，即使使最大浓度800 nmol/L的犬尿氨酸相互作用，也未能观察到与IL-6的明显相互作用。
根据前述实施例的结果推测，包含A11、IL-6和犬尿氨酸的复合体的形成中的犬尿氨酸的KD为数十nM至数nM。据此还可认为，如果假设犬尿氨酸与IL-6直接相互作用，则通过使犬尿氨酸以800 nmol/L进行相互作用，将观察到明显的相互作用。该结果暗示了下述可能性：犬尿氨酸并非与IL-6直接相互作用，而是以数十nM与A11相互作用、或者与A11和IL-6的复合体相互作用。
〔实施例5〕通过兔B细胞克隆获得抗腺苷抗体
（5-1）用于腺苷结合文库制作的免疫原的设计
作为对兔进行免疫的免疫原，使用了图10中所示的2'-腺苷-PEG-破伤风毒素 p30辅助肽（2'-腺苷-PEG-肽）、和图11中所示的5'-腺苷-PEG- 破伤风毒素 p30 辅助肽（5'-腺苷-PEG-肽）。破伤风毒素 p30 辅助肽由FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE（SEQ ID NO:4）的氨基酸序列组成，其是被鉴定为辅助T细胞上表达的T细胞受体的表位的肽（Eur. J. Immunol.(1989) 19, 2237-2242）。已知活化抗体产生（J. Immunol. (1992) 149, 717-721），通过与腺苷连接而作为佐剂发挥作用，因此期待增强针对腺苷的抗体的产生。为了使所产生抗体的表位难以在含有腺苷的同时还含有破伤风毒素 p30 辅助肽，设计使得腺苷与破伤风毒素 p30 辅助肽通过PEG而连接。腺苷是ATP的代谢物，由于ATP的磷酸基添加于腺苷的5'位羟基，因此认为不以腺苷的5'位羟基作为表位的抗体除了腺苷之外还可与ATP结合。即，设想通过使用5'-腺苷-PEG- 破伤风毒素 p30 辅助肽作为免疫原，容易得到能够与腺苷和ATP两者结合的抗体，通过使用2'-腺苷-PEG-破伤风毒素 p30 辅助肽作为免疫原，容易得到与腺苷结合但不与ATP结合的抗体，因此，如（5-2）所述制作了包含与腺苷的2'位或5'位连接的破伤风毒素 p30 辅助肽的二种免疫原。
另外，如下所述制作了替代破伤风毒素 p30 辅助肽而缀合了生物素的2'-腺苷-PEG-生物素（图12）和5'-腺苷-PEG-生物素（图13）。通过验证与这二种腺苷-PEG-生物素的结合，可以判断并不是含有破伤风毒素 p30 辅助肽作为表位的抗体。
（5-2）用于腺苷结合文库制作的免疫原的合成
如下所述合成2'-腺苷-PEG-肽（腺苷 2'-PEG-肽缀合物或2'-(PEG-肽)腺苷）和2'-腺苷-PEG-生物素（腺苷 2'-PEG-生物素缀合物或2'-(PEG- 生物素)腺苷）。另外，所合成的2'-腺苷-PEG-肽或2'-腺苷-PEG-生物素在以下条件下进行分析或制备。
LCMS的分析条件如下所述。
HPLC的制备条件如下所述。
（5-2-1）化合物006（Boc-Phe-Asn-Asn-Phe-Thr (tBu)-Val-Ser (tBu)-Phe-Trp(Boc)-Lue-Arg (Pbf)-Val-Pro-Lys (Boc)-Val-Ser (tBu)-Ala-Ser (tBu)-His (Trt)-Leu-Glu (tBu)-OH）的合成
[化6]
。
使用肽合成仪（Multipep RS; Intavis），通过Fmoc法进行肽合成。所有的Fmoc氨基酸购自渡边化学工业。另外，操作的详细步骤依照合成仪所带的操作说明。
在合成仪中，设置结合有C末端的Fmoc-Glu(tBu)-OH的2-氯三苯甲基树脂（每1柱250 mg、30柱、11.7 mmol）、各种Fmoc氨基酸（0.6mol/L）与1-羟基-7-氮杂苯并三唑（0.375mol/L）的N,N-二甲基甲酰胺溶液、以及二异丙基碳二亚胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液（10%v/v），使用含5%（wt/v）脲的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液（20%v/v）作为Fmoc脱保护溶液，进行合成反应。树脂用N,N-二甲基甲酰胺清洗后，进行Fmoc脱保护，然后进行Fmoc氨基酸的缩合反应，将上述操作作为1个循环，通过重复进行该循环，使肽在树脂表面上延伸。延伸结束后，将树脂用三氟乙醇清洗，加入三氟乙醇/二氯甲烷（＝1/1），从树脂切出肽，以粗产物形式得到化合物006（7.2 g）。
保留时间：1.24分（分析条件SQDAA05）。
（5-2-2）化合物007的合成
[化7]
。
在冷却至0℃的腺苷（2.00 g、7.48 mmol）的N,N-二甲基甲酰胺 （40 ml）悬浮液中，加入60%氢化钠（0.42 g、10.48 mol），将反应液在0℃搅拌1小时。加入溴乙酸甲酯（0.76ml、8.01 mmol），将该反应液在室温搅拌5小时。加入乙酸（1ml）和甲醇（3ml），将所得反应混合物减压浓缩。将所得残渣通过正相硅胶柱色谱（二氯甲烷/甲醇）纯化，得到化合物007（0.93 g、37%）。
保留时间：0.27分（分析条件SQDFA05）。
（5-2-3）化合物008的合成
[化8]
。
将加入有叔丁基二甲基氯硅烷（999 mg、6.63 mol）和咪唑（722 mg、10.61 mol）的化合物007（900 mg、2.65 mmol）的吡啶（8 ml）溶液在室温搅拌4小时。将用乙酸乙酯/水由反应混合物提取的有机层用饱和盐水清洗。将经无水硫酸钠干燥的有机层过滤后，减压浓缩。将所得残渣通过正相硅胶柱色谱（二氯甲烷/甲醇）纯化，得到化合物008（1.17 g、78%）。
保留时间：1.10分（分析条件SQDFA05）。
（5-2-4）化合物009的合成
[化9]
将加入有溶解于水（0.17 ml）的氢氧化锂（61 mg、2.55 mol）的化合物008（290mg、0.511 mmol）的甲醇（0.34 ml）/四氢呋喃（0.34 ml）溶液在室温搅拌30分钟。将用1M盐酸中和的反应混合物进行减压浓缩。将用乙酸乙酯/水由浓缩残渣提取得到的有机层用饱和盐水清洗。将经无水硫酸钠干燥的有机层过滤后，进行减压浓缩，得到化合物009（319mg、90%）。
保留时间：0.97分（分析条件SQDFA05）。
（5-2-5）化合物010和化合物011的合成
[化10]
[化11]
。
将加入有1-羟基苯并三唑（75 mg、0.553 mol）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（106 mg、0.553 mol）的化合物009（255mg、0.460 mmol）的N,N-二甲基甲酰胺 （1.5 ml）溶液在室温搅拌3分钟。将加入有O-（2-氨基乙基）-O'-2-叠氮乙基）九聚乙二醇（291 mg、0.553 mmol）的反应液在室温搅拌3小时。将经减压浓缩得到的反应混合物的残渣通过反相硅胶柱色谱（10 mM乙酸铵水溶液/甲醇）进行纯化，得到化合物010（177 mg、42%）和011（72 mg、19%）。
化合物010
保留时间：0.98分（分析条件SQDFA05）。
化合物011
保留时间：0.67分（分析条件SQDFA05）。
（5-2-6）化合物012的合成
[化12]
。
将加入有10%钯-碳（34 mg）的化合物010（170 mg、0.160 mmol）的乙醇（1 ml）溶液在氢气氛下搅拌2小时。进而加入10%钯-碳（34 mg），在氢气氛下搅拌2小时，结束反应。将反应液的滤液减压浓缩，得到化合物012（34 mg、95%）。
保留时间：0.70分（分析条件SQDFA05）。
（5-2-7）化合物013和化合物014的合成
[化13]
[化14]
。
将加入有化合物006（354 mg、0.110 mmol）、1-羟基苯并三唑（13 mg、0.100 mol）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（19 mg、0.100 mol）的、化合物012（86mg、0.083 mmol）的N,N-二甲基甲酰胺（1.5 ml）溶液在室温搅拌2小时。将反应混合物的滤液按照表6所记载的制备条件A进行纯化，得到化合物013和014的混合物（72 mg）。
化合物013
保留时间：1.13分（分析条件SQDAA50）。
化合物014
保留时间：1.02分（分析条件SQDAA50）。
（5-2-8）2'-腺苷-PEG-肽（腺苷 2'-PEG-肽缀合物或2'-(PEG-肽)腺苷）（化合物015）的合成
[化15]
。
将加入有三氟乙酸（16 ml）、二氯甲烷（8 ml）、水（1.3 ml）、和四异丙基硅烷（1.3ml）的化合物013和014的混合物（42 mg）在室温搅拌6小时。将经减压浓缩得到的反应混合物的残渣按照表6中记载的制备条件B进行纯化，得到化合物015（10 mg）。
保留时间：0.52分（分析条件SQDAA50）。
（5-2-9）化合物016的合成
[化16]
。
将加入有10%钯-碳（34 mg）的化合物011（70 mg、0.074 mmol）的乙醇（1ml）溶液在氢气氛下搅拌5小时。将反应液的滤液减压浓缩，得到化合物016（58 mg、85%）。
保留时间：0.50分（分析条件SQDFA05）。
（5-2-10）化合物017的合成
[化17]
。
将加入有D-生物素N-琥珀酰亚胺酯（24 mg、0.069 mmol）、和三乙胺（13μl、0.094mol）的化合物016（58 mg、0.063 mmol）的N,N-二甲基甲酰胺 （1 ml）溶液在室温搅拌2小时。进而，加入D-生物素N-琥珀酰亚胺酯（5 mg、0.015 mmol）后，在室温搅拌1.5小时，结束反应。将反应混合物通过反相硅胶柱色谱（10 mM乙酸铵水溶液/甲醇）进行纯化，得到化合物017（50 mg、69%）。
保留时间：1.04分（分析条件SQDFA05）。
（5-2-11）2'-腺苷-PEG-生物素（腺苷 2'-PEG-生物素缀合物或2'-(PEG- 生物素)腺苷）（化合物018）的合成
[化18]
。
将加入有1M氟化四正丁基铵四氢呋喃溶液（65μl、0.065 mmol）的化合物017（62mg、0.054 mmol）的四氢呋喃（2 ml）溶液在室温搅拌1小时。进而，加入1M氟化四正丁基铵四氢呋喃溶液（20μl、0.020 mmol），在室温搅拌1小时，结束反应。将经减压浓缩得到的反应液的残渣通过反相硅胶柱色谱（0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈）进行纯化，得到化合物018（12 mg、21%）。
保留时间：0.71分（分析条件SQDAA05）。
此外，5'-腺苷-PEG-肽和5'-腺苷-PEG-生物素也使用同样的反应来合成。
（5-3）通过动物制作腺苷结合抗体以及抗体的筛选
通过通常的方法用2'-腺苷-PEG-肽和/或5'-腺苷-PEG-肽对兔进行免疫。使用autoMACS Pro Separator 和FACSAria（BD），以腺苷-PEG-生物素结合性和兔IgG的表达作为指标，从采集自免疫兔的血液的细胞悬浮液选取具有腺苷结合活性的细胞的候选。接着，筛选分泌在选取细胞的培养上清中的抗体。作为筛选，通过ELISA法来评价是否具有对腺苷-PEG-生物素的结合活性。此外，还通过ELISA法评价了将腺苷与腺苷-PEG-生物素一起以1000倍以上的量加入时，是否会抑制对腺苷-PEG-生物素的结合。以具有腺苷-PEG-生物素结合活性，并且在与腺苷-PEG-生物素一起加入腺苷时腺苷-PEG-生物素结合受到抑制作为指标进行选取，使用PCR法由所选细胞获得H链可变区和L链可变区。将所获得的可变区与人IgG1重链恒定区、和人轻链恒定区进行组合并表达。
（5-4）用于腺苷结合免疫文库制作的B细胞的获得
由经2'-腺苷-PEG-破伤风毒素 肽和5'-腺苷-PEG-破伤风毒素肽免疫的兔的脾脏采集的细胞悬浮液，使用autoMACS Pro Separator与FACSAria（BD），以腺苷-PEG-生物素结合性和兔IgG或IgM的表达作为指标，选取具有腺苷结合活性的细胞的候选。由经PBS(-)清洗的前述选取细胞制备细胞团粒，将该团粒供免疫文库的制作。
〔实施例6〕评价由兔B细胞克隆得到的克隆
（6-1）评价由兔B细胞克隆得到的克隆与2'-腺苷-PEG-生物素的结合活性
使用SPR法评价由兔B细胞克隆法得到的克隆与腺苷的结合活性。使用Biacore4000（GE Healthcare），对上述克隆与2'-腺苷-PEG-生物素的抗原抗体反应进行动力学分析。在用胺偶联法固定有适当量的protein A/G（Invitrogen）的传感器芯片CM5（GEHealthcare）上捕获目标抗体。接着，使作为分析物的100 nmol/L的2'-腺苷-PEG-生物素相互作用60秒钟后，跟踪60秒钟测定分析物的解离。流动缓冲液使用HBS-P+（GEHealthcare）。测定均在25 ℃实施，分析物的稀释使用流动缓冲液。
将使2'-腺苷-PEG-生物素相互作用时的结合量除以各抗体的捕获量（RU）得到的值（N_结合_100）、与使2'-腺苷-PEG-生物素的相互作用后2'-腺苷-PEG-生物素从各抗体解离60秒后的值除以各抗体的捕获量（RU）得到的值（N_稳定性_100）作为指标，对各抗体与2'-腺苷-PEG-生物素的结合活性进行比较。其中，捕获量为1500 RU以下的抗体无法充分观察到结合，因而从研究对象中排除。该结果示于图14。图14的结果表明，通过B细胞克隆法得到了以各种亲和力与腺苷结合的克隆。
（6-2）2'-腺苷-PEG-生物素结合克隆与腺苷和ATP的结合活性的评价及其序列分 析
观察到与2'-腺苷-PEG-生物素的结合的克隆与腺苷或ATP的结合通过SPR法和竞争ELISA法进行评价。
（6-2-1）通过2'-腺苷-PEG-生物素结合克隆的SPR法来评价与腺苷或ATP的结合
使用Biacore T200（GE Healthcare），分析通过B细胞克隆法而得的抗体SMB0002、SMB0089、SMB0104与腺苷、ATP的抗原抗体反应的相互作用。在传感器芯片CM5（GEHealthcare）上以胺偶联法固定适当量的protein A/G（Invitrogen），在该芯片上捕获目标抗体，并使作为抗原的腺苷、或ATP相互作用。流动缓冲液使用10 mmol/L ACES、150 mmol/LNaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4。测定均在25 ℃实施，抗原的稀释使用流动缓冲液。
关于SMB0002、SMB0089、SMB0104，以流速20μL/min注入抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液2分钟，使在传感器芯片上捕获的抗体与各抗原相互作用。然后，以流速20μL/min流过3分钟的流动缓冲液，观察到抗原从抗体解离。然后，以流速30μL/min注入10 mmol/L Glycine-HCl, pH1.5 30秒钟，将传感器芯片再生。由测定所得的传感图算出作为动力学参数的结合速度常数 ka (1/Ms)、和解离速度常数 kd (1/s)。基于这些常数算出解离常数KD (M)。各参数的计算中使用了Biacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare）。
结果发现，以SMB0002为代表的SMB0089、SMB0104等多个克隆与腺苷和ATP两者结合。对于各克隆，将在腺苷 500、125、31.3、7.81 nM和ATP 5000、1250、313、78.1 nM的浓度下评价结合时所观察到的传感图总结于图15。如图15所示，观察到SMB0002、SMB0089、SMB0104与腺苷和ATP两者结合。SMB0002、SMB0089、SMB0104相对于腺苷的KD分别为9.3E-9 、6.9E-9 、和4.1E-8 (mol/L)，SMB0002、SMB0089、SMB0104相对于ATP的KD分别为1.0E-5 、8.8E-7 、1.4E-7 (mol/L)。
同样地，使用Biacore 4000（GE Healthcare），分析由B细胞克隆法得到的抗体SMB0171与腺苷、ATP的抗原抗体反应的相互作用。在传感器芯片CM5（GE Healthcare）上以胺偶联法固定适当量的protein A/G（Invitrogen），在该芯片上捕获目标抗体，并使作为抗原的腺苷、或ATP相互作用。流动缓冲液使用HBS-P+ (GE Healthcare)。测定均在25 ℃实施，抗原的稀释使用流动缓冲液。
关于SMB0171，以流速10μL/min注入抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液1分钟，使在传感器芯片上捕获的抗体与各抗原相互作用。然后，以流速10μL/min流过3分钟的流动缓冲液，观察到抗原从抗体解离。然后，以流速30μL/min注入10 mmol/L Glycine-HCl,pH1.5 30秒钟，将传感器芯片再生。由测定所得的传感图算出作为动力学参数的结合速度常数 ka (1/Ms)、和解离速度常数 kd (1/s)。基于这些常数算出解离常数KD (M)。各参数的计算中使用了Biacore 4000 Evaluation Software（GE Healthcare）。
结果，对于SMB0171，观察到与ATP结合。对于各克隆，将在ATP 50、5 μM的浓度下评价结合时所观察到的传感图示于图16。如图16所示，观察到SMB0171与ATP的结合。SMB0171相对于ATP的KD为5.9E-6 (mol/L)。
（6-2-2）通过2'-腺苷-PEG-生物素结合克隆的竞争ELISA法评价与腺苷和ATP的结 合
将观察到与2'-腺苷-PEG-生物素的结合的抗体以达到1μg/mL的方式用PBS稀释，加入384 孔的MAXISorp（Nunc）的各孔中，在室温放置1小时以上，使之与培养板结合。将培养板的各孔中的用PBS稀释的抗体除去后，加入含1% BSA的TBS，将该培养板放置1小时以上。然后，除去含1% BSA的TBS pH7.4，加入用PBS稀释的50nM的2'-腺苷-PEG-生物素、用PBS稀释的50 nM的2'-腺苷-PEG-生物素与500μM的腺苷的混合物、用PBS稀释的50 nM的2'-腺苷-PEG-生物素与500μM的ATP的混合物、或仅PBS中的任一者，将该培养板在室温放置1小时。然后，将该培养板的各孔用含0.05% Tween-20的PBS 80μL清洗3次。然后，向各孔加入用PBS稀释20000倍的链霉亲和素-HRP（Thermo fisher scientific），将培养板在室温放置1小时以上。在经含0.05% Tween-20的PBS 80μL清洗3次的该培养板的各孔中，加入显色底物（ABTS 过氧化物酶底物）。将该培养板孵育1小时后，将各孔中的溶液的显色通过MolecularDevice社制SpectraMax测定405nm的吸光度。
结果，如图17所示，对于SMB0002，通过过量添加腺苷和ATP，2'-腺苷-PEG-生物素结合受到抑制，因此确认这些克隆是不仅与2'-腺苷-PEG-生物素结合，还与腺苷和ATP两者结合的抗体。
（6-2-3）对通过SPR法鉴定为与腺苷和ATP结合的克隆进行序列分析
观察到与腺苷和ATP两者结合的克隆的氨基酸序列如表7所示。
[实施例7]使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得与腺苷和/或ATP结合的抗体
（7-1）天然人抗体噬菌体展示文库的制作
以由人PBMC制作的Poly A RNA或市售的人Poly A RNA等作为模板，依照本领域技术人员公知的方法，构建了由展示彼此不同的人抗体序列的Fab结构域的多个噬菌体组成的人抗体噬菌体展示文库。
（7-2）通过珠淘选由文库获得与腺苷和/或ATP结合的抗体
由（7-1）中构建的天然人抗体噬菌体展示文库，进行表现出抗原结合活性的抗体的筛选。即，收集展示抗体的噬菌体，该抗体对捕获于珠上的抗原表现出结合活性。作为抗原，使用生物素化ATP、2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生的噬菌体通过通常的方法进行纯化。然后获得经TBS透析处理的噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4%的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（DynabeadsM-280 Streptavidin）。
然后，加入所制备的噬菌体文库液与250 pmol的生物素化ATP、2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素，由此使该噬菌体文库液与腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使腺苷和/或ATP与噬菌体的复合体和磁珠在室温结合15分钟。将珠用TBS清洗1次。然后，将加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第2次淘选中，进行能够与腺苷和/或ATP结合的噬菌体的浓缩。在所得噬菌体文库液中加入各50 pmol的生物素化ATP、2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素，由此使该噬菌体文库液与腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使腺苷和/或ATP与噬菌体的复合体和磁珠在室温结合15分钟。将珠用TBST清洗3次、用TBS清洗2次。然后，将加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
以相同的步骤重复3次获得能够与腺苷和/或ATP结合的抗体的淘选。第4次淘选中，TBST、TBS清洗均进行5次。
（7-3）通过噬菌体ELISA评价腺苷和ATP结合性
由利用上述实施例中所示的淘选法得到的大肠杆菌的单菌落，依照常法（MethodMol. Biol. (2002) 178, 133-145）回收含有噬菌体的培养上清。接着，使用NucleoFast96 (MACHERY-NAGEL)对回收的培养上清进行超滤。将培养上清各100μL添加于NucleoFast96的各孔中，进行4,500g, 45分钟离心分离，除去穿流物。加入H2O 100μL，再次通过4,500g, 30分钟离心分离进行清洗。然后，加入TBS 100μL，在室温静置5分钟后，回收上清所含的噬菌体液。
加入有TBS的纯化噬菌体通过以下步骤供于ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原（将2'-腺苷-PEG-生物素、5'-腺苷-PEG-生物素、和ATP-PEG-生物素分别等量混合）的100μL的TBS在室温包被1小时。将该培养板的各孔用TBST（含0.1%Tween20的TBS）清洗，由此除去抗原后，将该孔用250μL的2%脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2%脱脂奶粉-TBS，然后在各孔中加入所制备的纯化噬菌体，将该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的抗原结合。在经TBST清洗的各孔中，加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用TBST清洗后，添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。
从实施了噬菌体ELISA的192个克隆中，获得与2'-腺苷-PEG-生物素、5'-腺苷-PEG-生物素、ATP-PEG-生物素中的任一者、任意2者、或者3者全部具有结合能力的106个克隆。
接着，为了确认这些克隆与2'-腺苷-PEG-生物素, 5'-腺苷-PEG-生物素, ATP-PEG-生物素中的何种抗原具有结合能力，将相同纯化噬菌体用TBS稀释后，通过以下步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原（2'-腺苷-PEG-生物素, 5'-腺苷-PEG-生物素, ATP-PEG-生物素中的任一者）的100μL的TBS在室温包被1小时。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去抗原后，将该孔用250μL的2% 脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2% 脱脂奶粉-TBS，然后在各孔中加入所制备的纯化噬菌体，将该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的抗原结合。在经TBST清洗的各孔中，加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用TBST清洗后，添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。噬菌体ELISA的结果记载于以下表8。
在实施了噬菌体ELISA的克隆中，确认到与二种以上抗原结合的是1个克隆，以本抗体片段作为模板，通过特异性引物扩增，并进行所得基因的碱基序列分析。本克隆是对5'-腺苷-PEG-生物素, ATP-PEG-生物素这二者具有结合能力的克隆，命名为ATNLSA1-4_D12。ATNLSA1-4_D12抗体的重链可变区的序列记载于SEQ ID NO:46，轻链可变区的序列记载于SEQ ID NO:47。
（7-4）通过噬菌体竞争ELISA评价腺苷或者ATP结合性
噬菌体ELISA的结果判断为与5'-腺苷-PEG-生物素和ATP-生物素这两者具有结合能力的克隆ATNLSA1-4_D12（重链可变区序列：46、轻链序列：47），在5'-腺苷-PEG-生物素,ATP-PEG-生物素的结构上来说，残留有识别生物素标签或者PEG区的可能性。因此，为了表明并非识别生物素标签或PEG的抗体，使用ATNLSA1-4_D12和作为阴性对照准备的IL-6R结合克隆PF1（重链序列：48、轻链序列：49），通过噬菌体ELISA确认与抗原的结合是否会被腺苷或者ATP抑制。ATNLSA1-4_D12和PF1分别用TBS稀释，通过以下步骤供ELISA。
将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原（5'-腺苷-PEG-生物素, ATP-PEG-生物素的混合）的100μL的TBS在室温包被1小时。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去抗原后，将该孔用250μL的2% 脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2% 脱脂奶粉-TBS，然后在各孔中加入所制备的纯化噬菌体，将该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的抗原结合。接着，在该孔中加入不含抗原、以及含有抗原与等量直至10,000倍量的ATP稀释系列的TBS。通过将该培养板在室温静置1小时，使固定的抗原与ATP竞争。然后，在经TBST清洗的各孔中，加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（AmershamPharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用TBST清洗后，添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。
测定结果示于图18。确认到随着ATP浓度的变高，ATNLSA1-4_D12在过量ATP存在下显色值变小，确认到ATNLSA1-4_D12与抗原的结合ATP浓度依赖性地受到抑制。另外，对于作为阴性对照进行了比较实验的PF1，确认到与ATP浓度无关地与抗原结合。由此确认，ATNLSA1-4_D12是具有ATP结合能力的抗体，并非识别生物素标签或PEG的抗体。
（7-5）与ATP和腺苷结合的抗体的表达与纯化
由实施例7的噬菌体ELISA所示的、判断为与ATP和腺苷具有结合活性的克隆ATNLSA1-4_D12，使用特异性引物进行扩增，并分析所得基因的碱基序列（重链的序列由SEQID NO:46所示，轻链的序列由SEQ ID NO:47所示）。将编码ATNLSA1-4_D12的可变区的基因插入人IgG1/Lambda的动物表达用质粒。使用以下方法表达抗体。对于在FreeStyle 293Expression Medium培养基（Invitrogen）中以1.33 x 106细胞/mL的细胞密度悬浮、并以每孔3 mL接种于6孔板的各孔中的来源于人胚肾细胞的FreeStyle 293-F株（Invitrogen），通过脂质体转染法导入所制备的质粒。在CO2培养箱（37℃、8%CO2, 90 rpm）中培养4天，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences），通过本领域技术人员公知的方法由培养上清纯化抗体。使用分光光度计测定纯化抗体溶液在280 nm下的吸光度。通过PACE法由所得测定值算出吸光系数，使用该吸光系数算出纯化抗体的浓度（ProteinScience (1995) 4, 2411-2423）。
（7-6）使用表面等离子体共振评价ATP结合抗体、腺苷结合抗体的ATP、腺苷结合
使用Biacore T200 (GE Healthcare)，分析具有ATP和腺苷结合活性的克隆ATNLSA1-4_D12的可变区与IgG的恒定区连接了的D12的抗原抗体反应的相互作用。在用胺偶联法固定了适当量的protein A（Life technologies）的传感器芯片CM5或CM4（GEHealthcare）上捕获目标抗体，使之与作为抗原的ATP (Wako)、腺苷(Wako)、ADP (二磷酸腺苷) (Wako)相互作用。流动缓冲液使用50 mM Tris-HCl (Takara, T903), 500 mM NaCl,0.01% (w/v) Tween20。使抗原以流速30μL/min相互作用30秒钟，解离30秒钟。与抗原的相互作用在15℃下进行测定，抗原的稀释使用与流动缓冲液相同的缓冲液。
由测定所得的传感图算出作为动力学参数的结合速度常数 ka（1/Ms）、和解离速度常数 kd（1/s），基于它们算出解离常数KD（M）。或使用稳态分析法 (Steady stateanalysis) 算出解离常数KD（M）。各参数的计算中使用了Biacore T200 EvaluationSoftware（GE Healthcare）。
为了算出相对于腺苷的KD，在20μmol/L ADP存在下和非存在下获得各浓度的腺苷存在下的结合应答，另外获得在20μmol/L ADP存在下的结合应答。将推测为非特异性结合成分的、从ADP存在下的对各浓度的腺苷的结合应答中减去ADP单独存在下的应答而得的值，从ADP非存在下的对腺苷的结合应答的值中减去，由此获得对腺苷的特异性结合的应答(R)。以腺苷浓度为X轴，以通过式2算出的R为Y轴进行描点得到曲线，使用OfficeExcel2007 (Microsoft)的Solver函数对该曲线适用最小二乘法，由此确定相对于腺苷的KD值。
（式2）
R = Rmax× conc /(KD + conc)
式2中，conc意指腺苷浓度（mol/L），Rmax意指腺苷与抗体最大结合时所期待的应答值。实测应答值的提取使用Scrubber2（BioLogics. Inc）。
该测定中获得的D12相对于ATP的KD是8.5μmol/L、相对于ADP的KD是0.25μmol/L、相对于腺苷的KD是1100μmol/。由此认为D12对ATP、ADP、腺苷具有结合活性，而且对于AMP（单磷酸腺苷）和cAMP（环单磷酸腺苷）也具有结合活性。
〔实施例8〕利用抗ATP/腺苷抗体的ATP/腺苷开关抗体获得用文库的设计
已知在癌组织和炎性组织中，不仅腺苷而且ATP的浓度也高。因此，不仅只将腺苷或ATP中的任一者用作开关的抗体，而且可以将腺苷和ATP两者（本实施例中记载为ATP/腺苷）用作开关的抗体（即只要腺苷或ATP任一以高浓度存在则能够与抗原结合的抗体）也是有用的。实施例7-4中所示的ATNLSA1-4_D12是与ATP/腺苷结合的抗体，对于该抗体，如图19所示，认为ATP/腺苷夹在抗体和靶抗原之间，因此包含与靶抗原接触的抗体可变区。因此认为，通过将能够如此与靶抗原接触并能够保持与ATP/腺苷的结合的抗体可变区部分文库化，可以制作合成抗体文库，该文库可以获得ATP/腺苷开关抗体，该抗体对任意抗原的任意抗原结合活性根据ATP/腺苷的有无而变化。
对在实施例7-4中由人抗体文库获得的ATP/腺苷抗体ATNLSA1-4_D12与ATP的复合体的结晶结构进行分析。根据结晶结构分析的结果，鉴定了该抗体识别的腺苷（和ATP）的识别模式、以及设想基本不参与腺苷（和ATP）结合的抗体可变区的氨基酸残基。主要参与腺苷（ATP）结合的氨基酸残基被鉴定为重链中的Ser52、Ser52a、Arg53、Gly96、Leu100a、Trp100c（Kabat编号）。
设计文库时，满足以下条件中的至少一个的位点被选定作为能够文库化的位点。
条件1）不密切参与ATP结合的位点、或即使参与结合也存在不使ATP结合降低的天然序列以外的氨基酸的位点；
条件2）作为人抗体的组成成分，具有某程度的氨基酸出现频率的多样性的位点；
条件3）对于典型结构(Canonical structure)的形成不重要的位点。
重链、轻链均满足上述条件的ATNLSA1-4_D12的序列所含的位点中，关于CDR1和CDR2的位点将种系中的出现频率为2%以上的氨基酸、关于CDR3的位点将种系中的出现频率为1%以上的氨基酸全面地替换，制作组合了这些替换的多个ATNLSA1-4_D12的改变体。
重链的位点中被改变的位点（表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点）以及该位点的改变前的氨基酸（表中记载为“天然序列”的氨基酸）和改变后的氨基酸（表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸）示于表9。
轻链的位点中被改变的位点（表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点）以及该位点的改变前的氨基酸（表中，记载为“天然序列”的氨基酸）和改变后的氨基酸（表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸）示于表10。
通过实施例7-1所示的方法表达和纯化的各改变体与ATP和腺苷的结合通过与实施例7-6中所示的使用Biacore的测定方法相同的方法进行测定。测定的结果，各改变体与ATP的亲和力以KD值的形式算出。将作为重链的位点的通过改变不会使ATP结合能力低于ATNLSA1-4_D12的1/5的结合能力的那些（即KD值小于42.5μmol/L的那些）、和作为轻链的位点的高于ATNLSA1-4_D12的结合能力的那些（即KD值小于8.5μmol/L的那些)判定为可改变的位点，在该位点处被替换的氨基酸被判定为可以文库化的氨基酸（文库中出现的柔性残基）。
根据各改变体的ATP结合能力的评价结果，预期通过将各位点文库化而降低ATP结合能力。因此，对推测参与ATP结合的位点的附近位点进行替换，通过全面地评价组合了这些替换的各种改变体，验证是否可以鉴定预期增强ATP结合能力的效果的改变。如此被改变的位点（表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点）以及该位点的改变前的氨基酸（表中，记载为“天然序列”的氨基酸）和改变后的氨基酸（表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸）示于表11。
通过实施例7-1所示的方法表达和纯化的各改变体与ATP和腺苷的结合通过与实施例7-6中所示的使用Biacore的测定方法相同的方法进行测定。测定的结果，预期与ATP和腺苷的结合增强的改变判定为Kabat编号所示的56位、100b位等位点（例如Tyr56His、Asn100bLeu等氨基酸的改变），在该位点处被替换的氨基酸也被判定为可文库化的氨基酸（文库中出现的柔性残基）。
对ATNLSA1-4_D12的CDR的位点中，包含根据前述改变体的分析选出的可文库化的氨基酸（文库中出现的氨基酸柔性残基）与该氨基酸的改变前的氨基酸（即，ATNLSA1-4_D12的天然序列所含的氨基酸）的氨基酸组成成分以及包含该组成成分的位点进行设计，构建ATP/腺苷开关抗体获得用的文库。以氨基酸组成成分所含的各氨基酸的出现频率相等的方式（例如，氨基酸组成成分为10种时，以各氨基酸分别10%出现的方式）构建文库。
包含重链中的氨基酸组成成分的位点（表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点）以及该位点处的氨基酸组成成分示于表12。包含轻链中的氨基酸组成成分的位点（表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点）以及该位点处的氨基酸组成成分示于表13。
根据序列分析的结果，推测ATNLSA1-4_D12的框架来源于VH3-21种系。因此，出于提高抗体稳定性的目的，为了将ATNLSA1-4_D12的框架序列恢复至VH3-21种系序列，而将Gln01Glu、Gln05Val、Asp10Gly、Asn30Ser、Leu48Val、Asn58Tyr（数字表示Kabat编号）的改变导入ATNLSA1-4_D12的框架序列。通过实施例7-1所示的方法表达和纯化的ATNLSA1-4_D12的改变体的Tm利用DSC进行测定。利用DSC的测定通过本领域技术人员公知方法实施。添加了这些改变的ATNLSA1-4_D12的改变体的Tm由74.37℃大幅上升至81.44℃，确认到其结构的稳定化。作为抗体文库，由于有时优选使用稳定性高的框架，因而添加了前述改变的框架序列可用作文库的框架序列。文库所用的框架示于表14。
合成包含这样设计的文库中所含的各序列的基因（DNA2.0），将这些各种基因的集合体（文库）用作模板，通过可分别扩增VH和VL的引物来扩增基因文库。另外，VL扩增用引物的序列记载于SEQ ID NO:102和103，VH扩增用引物的序列记载于SEQ ID NO:104和105。将扩增得到的合理设计人抗体重链可变区的基因文库和人抗体轻链可变区的基因文库导入具有来源于人IgG的CH1序列和来源于人IgG的轻链恒定区序列这两者的合适的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建合理设计文库，其展示包含人抗体可变区-恒定区的Fab结构域、且可获得能够以腺苷或ATP为开关而与抗原结合的抗体。如此由多样的具有腺苷或ATP结合活性的H链和L链构成的合理设计文库被认为可用作包含人抗体的文库，其中，如图19所示，腺苷或ATP夹在抗体与抗原之间，且可以效率良好地获得针对任意抗原的ATP/腺苷开关抗体。此外，如上所述ATNLSA1-4_D12不仅与腺苷和ATP结合，还与ADP结合，因而预测对于和ATP、ADP及腺苷的结构类似的AMP和cAM也具有结合活性。因此，认为本文库可用于获得对任意靶抗原的结合活性根据ATP、ADP、AMP、cAMP、或腺苷中的任一者以上的低分子的有无而变化的开关抗体。
〔实施例9〕包含抗ATP/腺苷抗体组成成分的腺苷/ATP开关抗体获得用免疫文库的构建
实施例5-4中，通过使用MACS和FACS的选取，将由表达腺苷-PEG-生物素结合抗体的B细胞群回收的mRNA作为模板，构建展示包含兔抗体序列的Fab结构域的多个兔抗体噬菌体展示文库。作为构建方法，参考了Rader（Methods Mol. Biol. (2009) 525, 101-28）。
更具体地，将从由9只免疫兔选取的600,000细胞的上述B细胞回收的mRNA作为模板，通过逆转录反应制备cDNA。以该cDNA为模板使用表15中记载的引物，通过PCR反应，在适当的条件下PCR扩增重链可变区、和轻链可变区-恒定区序列。
将扩增得到的兔抗体重链可变区的基因文库和兔抗体轻链可变区-恒定区的基因文库的组合导入具有来源于兔IgG的CH1序列的适当的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建兔抗体噬菌体展示文库（以下称为腺苷免疫兔抗体文库），其展示包含兔抗体可变区-恒定区的Fab结构域、且可获得能够以腺苷或ATP为开关而与抗原结合的抗体。如此由多样的发挥腺苷结合性的H链和L链构成的腺苷免疫文库被认为可用作免疫文库，其中，如图20所示，腺苷（或ATP）夹在抗体与抗原之间，且可对任意抗原获得腺苷/ATP开关抗体。
〔实施例10〕使用噬菌体展示技术从抗体文库获得在腺苷、ATP存在下与抗原结合的抗体
（10-1）利用腺苷和ATP的混合物从文库获得在低分子存在下与抗原结合的抗体
从构建的腺苷免疫兔抗体噬菌体展示文库、合理设计抗体噬菌体展示文库获得在腺苷和/或ATP存在条件下表现出抗原结合活性的抗体。为了获得，回收展示在腺苷和ATP存在下对捕获于珠上的抗原表现出结合能力的抗体的噬菌体，然后从在腺苷和ATP的非存在条件下从珠洗脱出的溶出液中回收噬菌体。
由保持构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5 M NaCl/10%PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4%的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-MagSpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（Dynabeads M-280Streptavidin）。
在制备的噬菌体文库液中加入500 pmol的生物素标记抗原、以及各终浓度 1 mM的ATP-Na和腺苷，使该噬菌体文库液在室温与抗原和腺苷、以及ATP接触60分钟。接着，在该噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用溶解有ATP和腺苷的TBS清洗1次。然后，将加入有1 mg/mL的胰蛋白酶0.5 mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在腺苷和ATP存在下与抗原结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行能够在仅腺苷和ATP存在下与抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40 pmol的生物素标记抗原以及各终浓度1 mM的腺苷和ATP，由此使噬菌体文库在室温与抗原以及腺苷和ATP接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1 mL的溶解有腺苷和ATP的TBST（以下，称为(腺苷＋ATP)/TBST）以及溶解有腺苷、腺苷和ATP的TBS（以下，称为(腺苷＋ATP)/TBS）进行清洗。然后将加入有0.5 mL的TBS的珠在室温悬浮后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。再次重复该操作后，将分2次洗脱出的噬菌体液混合。在回收的噬菌体溶液中加入100 mg/mL的胰蛋白酶5μL，由此将不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白（来源于辅助噬菌体的pIII蛋白）切断，使得不展示Fab的噬菌体丧失感染大肠杆菌的能力。将从经胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。将获得在腺苷和ATP存在下具有抗原结合活性的抗体的淘选重复3次。
（10-2）利用阴性选择法从抗体文库获得在腺苷、ATP存在下与抗原结合的抗体
从由腺苷免疫兔构建的抗体噬菌体展示文库、或合理设计抗体噬菌体展示文库中，进行在腺苷和/或ATP存在的条件下对抗原表现出抗原结合活性的抗体的筛选。为了筛选，首先使抗体噬菌体展示文库在腺苷和ATP非存在下与生物素标记抗原-链酶亲和素接触，除去展示即使在腺苷和ATP非存在下也对抗原具有结合活性的抗体的噬菌体。接着，在腺苷和ATP存在的条件下同样地进行淘选，由此实施在腺苷和ATP存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5 M NaCl/10%PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4%的方式添加BSA。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（Dynabeads M-280 Streptavidin），实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。
在制备的噬菌体文库液中加入250 pmol的生物素标记抗原、以及各终浓度为1 mM的腺苷和ATP的混合液，由此使该噬菌体文库液与抗原以及腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用(腺苷＋ATP) /TBS清洗1次。然后，将加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在腺苷和ATP存在下结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行能够在仅腺苷和ATP存在下与抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，对经BSA封闭的Sera-Mag中和亲和素珠加入250 pmol生物素化抗原，在室温结合15分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以BSA进行了封闭的噬菌体文库液，在室温结合1小时。使用磁力架将珠分离，由此回收未与抗原和珠结合的噬菌体。对回收的噬菌体添加40 pmol的生物素标记抗原以及各终浓度1 mM的腺苷和ATP，由此使噬菌体文库在室温与抗原以及腺苷和ATP接触60分钟。接着，在该标记抗原以及腺苷和ATP与噬菌体文库的混合液中加入用BSA封闭的磁珠，在室温使抗原与噬菌体的复合体和磁珠结合15分钟。将珠用1 mL的腺苷＋ATP) /TBST与(腺苷＋ATP) /TBS进行清洗。然后，将1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入至该混合液中。将该混合液在室温搅拌20分钟后，由使用磁力架分离的珠回收噬菌体。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225 mm的板上。将获得在腺苷和ATP存在的条件下具有抗原结合活性的抗体的淘选重复3次。
（10-3）利用交替淘选法从抗体文库获得在腺苷、ATP存在下与抗原结合的抗体
从由腺苷免疫兔构建的抗体噬菌体展示文库、或合理设计抗体噬菌体展示文库中，进行在腺苷和/或ATP存在的条件下对抗原表现出抗原结合活性的抗体的筛选。为了筛选，首先使抗体噬菌体展示文库在非标记抗原存在的条件下与生物素化腺苷和ATP-中和亲和素接触，回收在抗原存在下与腺苷和/或ATP结合的抗体噬菌体展示文库。接着，使该抗体噬菌体展示文库在腺苷和ATP存在的条件下与生物素化抗原-链酶亲和素接触，回收在腺苷和ATP存在下与抗原结合的抗体。通过交替地进行这种淘选，实施在腺苷和ATP存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。
由保持构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5 M NaCl/10%PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4%的方式添加BSA。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（Dynabeads M-280 Streptavidin），实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。
在制备的噬菌体文库液中加入250 pmol的生物素化ATP、2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素以及1000 pmol的非标记抗原，由此使该噬菌体文库液与抗原以及腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原以及腺苷和/或ATP与噬菌体的复合体和磁珠在室温结合15分钟。将珠用含1000 pmol抗原的TBS清洗1次。然后，加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第2次淘选中，进行可在腺苷和ATP存在的条件下与生物素化抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40 pmol的生物素化抗原以及终浓度1 mM的腺苷和ATP，由此使该噬菌体文库液与抗原以及腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原以及腺苷和/或ATP与噬菌体的复合体和磁珠在室温结合15分钟。将柱用含有终浓度1 mM的腺苷和ATP的TBST清洗3次、用含有终浓度1 mM的腺苷和ATP的TBS清洗2次。然后，加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
之后，在第偶数次淘选中，通过与第2次淘选相同的条件重复实施淘选。其中，第4次以后的淘选中，利用(腺苷＋ATP)/TBST和(腺苷・ATP)/TBS的珠的清洗增加至总计5次来实施。
在第3次淘选中，再次进行可在抗原存在下与生物素化腺苷和ATP结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入250 pmol的生物素化ATP、2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素以及1000 pmol的非标记抗原，由此使该噬菌体文库液与抗原以及腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原以及腺苷和/或ATP与噬菌体的复合体和磁珠在室温结合15分钟。将珠用含有1000 pmol抗原的TBST清洗3次、用含有1000 pmol抗原的TBS清洗2次。然后，加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
之后，在第奇数次淘选中，通过与第3次淘选相同的条件重复实施淘选。其中，利用含有抗原的TBST和含有抗原的TBS的珠的清洗在第4次以后的淘选中增加至共计5次来实施。或者，对于第3次以后的淘选，无论是第偶数次还是第奇数次，以后均按与第3次淘选相同的条件重复实施淘选。其中，利用含有抗原的TBST和含有抗原的TBS的珠的清洗在第4次以后的淘选中增加至共计5次来实施。
（10-4）通过噬菌体ELISA评价腺苷和/或ATP的存在下和非存在下的结合活性
由根据上述方法得到的大肠杆菌的单菌落，依照常法（Methods Mol. Biol.(2002) 178, 133-145）回收含有噬菌体的培养上清。使用NucleoFast 96（MACHEREY-NAGEL），对回收的培养上清进行超滤。对各孔中添加有培养上清各100μL的NucleoFast 96进行离心分离（4,500g、45分钟），由此除去穿流物。将各孔中加入有100μl的H2O的该NucleoFast 96再次进行离心分离（4,500g、30分钟），由此进行清洗。最后加入TBS 100μL，回收在室温静置5分钟的该NucleoFast 96的各孔的上清中所含的噬菌体液。
加入有TBS、或(腺苷＋ATP)/TBS的纯化噬菌体通过下述步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL TBS包被一晩。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去抗原，然后将该孔用250μL的2%脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2%脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了所制备纯化噬菌体的该培养板在37℃静置1小时，由此使展示抗体的噬菌体与各孔中存在的抗原在腺苷和/或ATP的非存在下和存在下结合。在经TBST或(腺苷＋ATP)/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或(腺苷＋ATP)/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用TBST或(腺苷＋ATP)/TBST清洗后，添加了TMB single溶液（ZYMED）的各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止，然后通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。其结果，确认到在低分子存在下与人IL6、人IL6 受体、HSA（Human Serum Albumin,人血清白蛋白）这三种抗原结合的多个抗体。还可以从人天然抗体文库获得在ATP存在下结合的抗体，可以以较其高的效率获得针对人IL6、人IL6 受体、HSA的开关抗体。噬菌体ELISA的结果示于表16。
（10-5）抗原结合活性根据腺苷和ATP的有无而变化的开关抗体的结合能力的评价 以及序列分析
由（10-4）中所示的噬菌体ELISA的结果判断为在腺苷或ATP存在的条件下具有抗原结合活性的克隆，使用特异性引物（SEQ ID NO:111和112）进行扩增，并对所得基因的碱基序列进行分析。分析的结果，获得了与抗原人IL6、HSA、 人IL6R结合的多个具有彼此不同的序列的抗体。人IL6的抗体即I6DL2C1-4_076、HSA的抗体即HSDL3C5-4_015、以及人IL-6R的抗体即6RAD2C1-4_011和6RAD2C1-4_076的氨基酸序列示于表17。
（10-6）所得抗体与抗原结合所需的低分子的鉴定
将所得的I6DL2C1-4_076、 HSDL3C5-4_015、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_076的各抗体供ELISA。作为低分子，使用1mM ATP、腺苷及其混合物。作为抗原，使用经生物素标记的人IL6、人IL6R、HSA。
首先，将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL的TBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的生物素标记抗原，然后将该孔用2% Skimmilk/TBS 250μL封闭1小时以上。在除去了2%Skimmilk/TBS的各孔中，加入展示抗体的噬菌体50μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各噬菌体与各孔种存在的生物素标记抗原在ATP和/或腺苷的存在下和非存在下结合。在经含有ATP和/或腺苷的TBST或者不含的TBST清洗后，向各孔加入用TBS或(腺苷和/或ATP)/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用含有各低分子的TBST、和不含各低分子的TBST进行清洗后，向各孔添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定(图25、26、27)。
〔实施例11〕实施例2中获得的抗体在犬尿氨酸（Kynurenine）以外的氨基酸代谢物的存在下的人IL-6结合活性
实施例2-4中获得的在低分子存在下与人IL-6结合的抗体I6NMSC1-3_A11是如实施例3-2所示在犬尿氨酸存在下与人IL-6结合的抗体。犬尿氨酸是色氨酸代谢物，而且犬尿氨酸通过犬尿氨酸酶转化为邻氨基苯甲酸，通过犬尿氨酸3-羟化酶转化为3-羟基犬尿氨酸，通过犬尿氨酸氨基转移酶转化为犬尿酸（Stefan Lob et. Al. Nat Rev Cancer.(2009) 9 (6), 445-452）。对这样的一系列的色氨酸代谢物等氨基酸代谢物是否适合作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案进行了验证。
将实施例3-2所示的在犬尿氨酸存在下具有抗原结合活性的抗体I6NMSC1-3_A11和已知的抗人IL-6抗体CLB8-F1、以及作为阴性对照的GC413在表18所示的7个条件下供ELISA。另外利用表4所示的缓冲液以表18所示的浓度适宜制备各氨基酸及其代谢物。使用经生物素标记的人IL-6作为抗原。
首先，将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL的PBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用清洗缓冲液清洗从而除去未与培养板结合的抗原后，将该孔用封闭缓冲液 250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在以表18的终浓度含有低分子的样品缓冲液中制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各IgG与各孔中存在的抗原结合。在用以表18的终浓度含有氨基酸和氨基酸代谢物的清洗缓冲液进行清洗后，向各孔中添加经含有氨基酸和氨基酸代谢物的样品缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体（BIOSOURCE），将培养板孵育1小时。用含有各氨基酸和氨基酸代谢物的清洗缓冲液清洗后，添加了TMB single溶液（ZYMED）的各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸来终止，然后通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。另外，作为缓冲液，使用了包含表4中记载的组成的缓冲液。
测定结果示于图21。对于CLB8-F1，无论低分子的种类及其存在与否，吸光度均相同，而对于I6NMSC1-3_A11，与条件1（犬尿氨酸溶液）中的吸光度相比，条件7（无低分子）中的吸光度显著地低。另外，相同地，条件2（色氨酸溶液）与条件5（3-羟基犬尿氨酸溶液）中的吸光度也表现出与条件1相同的高吸光度，由此表明，I6NMSC1-3_A11是不仅在犬尿氨酸存在下、而且在犬尿氨酸前体氨基酸（色氨酸）和犬尿氨酸的代谢物存在下也与抗原人IL-6结合的抗体。
由此，认为通过使用同样的方法可以获得不仅在一种氨基酸代谢物的存在下、而且在结构不同的多种氨基酸或氨基酸代谢物存在下也与目标抗原结合的抗体。
〔实施例12〕
使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得在低分子存在下与人IL-6结合的抗体
（12-1）利用珠淘选或阴性选择法从文库获得在低分子存在下与人IL-6结合的抗 体
由实施例2-1中构建的天然人抗体噬菌体展示文库，通过与2-2和2-3所示方法相同的方法进行在低分子存在下表现出抗原结合活性的抗体的筛选。
（12-2）利用噬菌体ELISA评价低分子存在下的结合活性
通过与实施例2-4所示方法相同的方法，由所得大肠杆菌的单菌落回收含有噬菌体的培养上清，将纯化噬菌体供ELISA。使用分离的768个克隆进行噬菌体ELISA，由此新得到在低分子cocktail存在下对作为抗原的人IL-6具有结合活性的克隆“I6NMSC1-3_#03”和“I6NMSC1-3_#17”。
（12-3）与人IL-6结合的抗体的表达和纯化
由噬菌体ELISA中所示的判定为在SC存在下具有抗原结合活性的克隆I6NMSC1-3_#03和I6NMSC1-3_#17，使用特异性引物（SEQ ID NO:110和112）进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析。I6NMSC1-3_#03的重链的序列为SEQ ID NO:50，轻链的序列为SEQ IDNO:51。此外，I6NMSC1-3_#17的重链的序列为SEQ ID NO:52，轻链的序列为SEQ ID NO:53。将编码I6NMSC1-3_#17的可变区的基因序列插入人IgG1/Lambda的动物表达用质粒，将编码I6NMSC1-3_#03、已知抗人IL-6抗体即CLB8-F1（重链由SEQ ID NO:32所示，轻链由SEQ IDNO:33所示）、和作为阴性对照的抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC413（重链由SEQ ID NO:34所示，轻链由SEQ ID NO:35所示）的可变区的基因序列插入人IgG1/Kappa的动物表达用质粒。表达的抗体通过实施例3中记载的方法进行纯化。
（12-4）I6NMSC1-3_#03抗体与人IL-6结合所需的低分子的鉴定
将I6NMSC1-3_#03在表3所示的9个条件下供ELISA。另外，使用表4所示的缓冲液以表3所示的浓度适宜制备各低分子。使用经生物素标记的人IL-6作为抗原。
首先，将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL的PBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用清洗缓冲液清洗从而除去未与培养板结合的抗原后，将该孔用封闭缓冲液 250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在以表3的终浓度含有低分子的样品缓冲液中制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各IgG与各孔中存在的抗原结合。使用以表3的终浓度含有低分子的清洗缓冲液进行清洗后，将经加入有相同低分子的样品缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体（BIOSOURCE）添加至各孔中，将培养板孵育1小时。用含有各低分子的清洗缓冲液清洗后，向各孔添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。另外，作为缓冲液，使用包含表4中记载的组成的缓冲液。
测定结果示于图22。对于I6NMSC1-3_#03结果是，与条件8（全部低分子cocktail溶液）中的吸光度相比，条件9（无低分子）中的吸光度低。该结果与噬菌体 ELISA同样地确认到，I6NMSC1-3_#03具有与抗原的结合根据低分子的有无而变化的性质。另外，I6NMSC1-3_#03的结果是在条件7（犬尿氨酸 100uM）中表现出与条件8相同的吸光度，在其它条件下则吸光度低，由此与实施例3中记载的I6NMSC1-3_A11相同地表明，其是在犬尿氨酸存在下与作为抗原的人IL-6结合的抗体。I6NMSC1-3_#03具有不同于I6NMSC1-3_A11的氨基酸序列，表明通过使用这样的方法，可以获得多种在低分子存在下与抗原结合的抗体。
（12-5）I6NMSC1-3_#17抗体与人IL-6结合所需的低分子的鉴定
将所得的I6NMSC1-3_#17与对照CLB8-F1以及阴性对照GC413这3种抗体在表3所示的9个条件下供ELISA。另外，使用表4所示的缓冲液以表3所示的浓度适宜制备各低分子。使用经生物素标记的人IL-6作为抗原。
首先，将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL的PBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用清洗缓冲液清洗从而除去未与培养板结合的抗原后，将该孔用封闭缓冲液 250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在以表3的终浓度含有低分子的样品缓冲液中制备为0.15μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各IgG与各孔中存在的抗原结合。使用以表3的终浓度含有低分子的清洗缓冲液进行清洗后，将经加入有相同低分子的样品缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体（BIOSOURCE）添加至各孔中，将培养板孵育1小时。用含有各低分子的清洗缓冲液清洗后，向各孔添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。另外，作为缓冲液，使用包含表4中记载的组成的缓冲液。
测定结果示于图23。结果是：对于CLB8-F1，无论低分子的种类和存在与否，吸光度均相同，而对于I6NMSC1-3_#17，与条件8（全部低分子cocktail溶液）中的吸光度相比，条件9（无低分子）中的吸光度低。该结果与噬菌体 ELISA同样地确认到，I6NMSC1-3_#17具有与抗原的结合根据低分子的有无而变化的性质。另外，对于I6NMSC1-3_#17，在条件1（ATP-Na1mM）和条件5（琥珀酸 1mM）中，表现出与条件8相同的吸光度，在其它条件下则吸光度低，该结果表明，其是在ATP-Na或琥珀酸的任一者存在的条件下，与作为抗原的人IL-6结合的抗体。已知ATP由癌细胞释放出，关于琥珀酸也已知是癌细胞特异性地在细胞内外蓄积。癌细胞在有氧环境下并非通过氧化磷酸化而是糖酵解系统依赖性地进行代谢的现象作为瓦伯格效应为人所知，在缺血性癌症中，慢性血流不足导致糖酵解和氧化磷酸化均受到慢性限制，因而在更恶劣的环境下获得能量。已知这种缺血性的癌症进行依赖于富马酸酸呼吸的能量代谢，作为其结果，富马酸代谢物即琥珀酸(Succinic acid)发生蓄积（Cancer Res.(2009) 69 (11）, 4918-4925）。
表明通过使用这种方法，可获得在犬尿氨酸以外的低分子存在下与抗原结合的抗体。此外还表明可以获得在ATP-Na与琥珀酸等虽然分享具有多个负电荷这一共同特征但其结构彼此不同的低分子的各自存在下与抗原结合的抗体。
〔实施例13〕使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得在低分子存在下与人血清白蛋白（Human Serum Albumin，以下也称为HSA）结合的抗体
（13-1）通过珠淘选从文库获得在低分子存在下与HSA结合的抗体
由实施例2中构建的天然人抗体噬菌体展示文库，进行在低分子存在下表现出HSA结合活性的抗体的筛选。即，收集展示抗体的噬菌体，该抗体在低分子存在下对捕获于珠上的HSA表现出结合活性。从在低分子非存在的条件下从珠洗脱出的噬菌体洗脱液回收噬菌体。本获得方法中，使用经生物素标记的HSA作为抗原。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生的噬菌体通过通常的方法纯化。然后得到经TBS透析处理的噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到3%的方式添加脱脂奶粉。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（DynabeadsM-280 Streptavidin）。
为了有效率地获得低分子（该低分子能够在癌组织中发挥开关功能）依赖性的低分子开关抗体，实施了对在这些低分子（腺苷（adenosine）、三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate; ATP）、肌苷（inosine）、犬尿氨酸(犬尿氨酸)、前列腺素E2（prostaglandinE2; PGE2）、琥珀酸（succinic acid）、乳酸（lactic acid））的混合液（以下，表述为SC（低分子cocktail，低分子混合液））的存在下与抗原结合、但在SC非存在下与抗原不结合的抗体进行浓缩的淘选。
具体地，对于制备的噬菌体文库液，加入250 pmol的生物素标记抗原、以及包含各终浓度为1 mM的三磷酸腺苷钠盐（ATP-Na）、腺苷（Adenosine）、肌苷（Inosine）、琥珀酸（Succinic acid）和乳酸（Lactic acid）、终浓度为1μM的前列腺素E2（PGE2）、以及终浓度为100μM的犬尿氨酸（犬尿氨酸）且通过NaOH将其pH调整为7.4的SC，使它们在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经脱脂奶粉封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用SC/TBS（含有SC的TBS）清洗1次。然后，将加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在低分子存在下结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行能够在低分子存在下与抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40 pmol的生物素标记抗原和SC、NaOH，由此使噬菌体文库在室温与抗原和低分子接触60分钟。加入用脱脂奶粉封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1 mL的SC/TBST和SC/TBS清洗。然后将加入有0.5 mL的TBS的珠在室温悬浮后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。再次重复该操作后，将分2次洗脱出的噬菌体液混合。进而，对残留的珠加入0.5mL的TBS，将该珠在室温搅拌5分钟。由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。在回收的噬菌体溶液中加入100 mg/mL的胰蛋白酶5μL，由此将不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白（来源于辅助噬菌体的pIII蛋白）切断，使得不展示Fab的噬菌体丧失感染大肠杆菌的能力。将从经胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。此时，将通过第2次淘选得到的2种感染大肠杆菌分别以等量混合，接着，由接种的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，从而回收噬菌体文库液。将获得在低分子存在下具有抗原结合活性的抗体的淘选重复进行3次。
（13-2）利用阴性选择法从文库获得在低分子存在下与HSA结合的抗体
从构建的天然人抗体噬菌体展示文库中，进行在低分子存在的条件下对HSA表现出HSA结合活性的抗体的筛选。为了筛选，首先使天然人抗体噬菌体展示文库在低分子非存在下与生物素标记抗原-链酶亲和素接触，除去展示即使在低分子非存在下也对HSA具有结合活性的抗体的噬菌体。接着，在低分子的存在下同样地进行淘选，由此实施在低分子存在的条件下对HSA具有结合活性的抗体的筛选。使用经生物素标记的HSA作为抗原。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。将产生的噬菌体通过通常的方法纯化后，针对TBS进行透析处理，得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到3%的方式添加脱脂奶粉。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-MagSpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（Dynabeads M-280Streptavidin），实施使用固定于磁珠的生物素标记HSA的淘选。
在制备的噬菌体文库液中，通过加入250 pmol的生物素标记HSA、以及包含各终浓度为1 mM的ATP-Na、腺苷、肌苷、琥珀酸和乳酸、终浓度为1μM的PGE2、以及终浓度为100μM的犬尿氨酸、并且通过NaOH将其pH调整为7.4的SC，使之与该噬菌体文库液在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经脱脂奶粉封闭的磁珠，使生物素标记HSA和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用SC/TBS清洗1次。然后，加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在低分子存在下结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行能够在低分子存在下与生物素标记HSA结合的噬菌体的浓缩。具体地，对经脱脂奶粉封闭的Sera-Mag中和亲和素珠加入250pmol生物素标记HSA，在室温结合15分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以脱脂奶粉进行了封闭的噬菌体文库液，在室温结合1小时。使用磁力架将珠分离，由此回收未与生物素标记HSA和珠结合的噬菌体。对回收的噬菌体加入40pmol的生物素标记HSA和SC、NaOH，由此使噬菌体文库在室温与生物素标记HSA和SC中所含的低分子接触60分钟。接着，在生物素标记HSA、SC和噬菌体文库的混合液中加入经脱脂奶粉封闭的磁珠，在室温使生物素标记HSA和噬菌体的复合体与磁珠结合15分钟。将珠用1 mL的SC/TBST和SC/TBS清洗。然后，将1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入至该混合液中。将该混合液在室温搅拌20分钟后，由使用磁力架分离的珠回收噬菌体。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225 mm的板上。将获得在低分子存在下具有生物素标记HSA结合活性的抗体的淘选重复3次。
（13-3）通过噬菌体ELISA评价低分子存在下的结合活性
由根据上述的方法得到的大肠杆菌的单克隆，按照常法（Methods Mol. Biol.(2002) 178, 133-145），回收含有噬菌体的培养上清。使用NucleoFast 96（MACHEREY-NAGEL），对回收的培养上清进行超滤。对各孔中添加有培养上清各100μL的NucleoFast 96进行离心分离（4,500g, 45分钟），由此除去穿流物（flow-through portion）。将各孔加入有100μL的H2O的该NucleoFast 96再次进行离心分离（4,500g, 30分钟离心），由此进行清洗。最后加入TBS 100μL，回收在室温静置5分钟的该NucleoFast 96的各孔的上清中所含的噬菌体液。
加入有TBS或SC/TBS的纯化噬菌体通过以下步骤供于ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记HSA的100μL TBS包被一晩。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去生物素标记HSA，然后将该孔用250μL的2%脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2%脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了所制备纯化噬菌体的该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的生物素标记HSA在SC非存在/存在下结合。在经TBST或SC/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或SC/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（AmershamPharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用TBST或SC/TBST清洗后，向各孔添加TMBsingle溶液（ZYMED），各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。
使用分离的782个克隆进行噬菌体ELISA，由此得到在低分子cocktail存在下对作为抗原的HSA具有结合活性的克隆HSNMSC1-4_#22。
（13-4）与HSA结合的抗体的表达和纯化
由（13-3）中记载的噬菌体ELISA所示的判定为在SC存在下具有生物素标记HSA结合活性的克隆HSNMSC1-4_#22，使用特异性引物（SEQ ID NO:110和112）进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析（重链的序列由SEQ ID NO:54所示，轻链的序列由SEQ ID NO:55所示）。将编码HSNMSC1-4_#22的可变区的基因插入人IgG1/Lambda的动物表达用质粒。另外，将编码作为阴性对照的抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC413（重链为SEQ ID NO:34、轻链为SEQ ID NO:35）的可变区的基因插入人IgG1/Kappa的动物表达用质粒。表达的抗体通过实施例3中记载的方法进行纯化。
（13-5）所得抗体与HSA结合所需的低分子的鉴定
将所得的HSNMSC1-4_#22和GC413这2种抗体在表3所示的9个条件下供ELISA。另外，使用表19所示的缓冲液以表3所示的浓度适宜制备各低分子。使用经生物素标记的HSA作为抗原。
首先，将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记HSA的100μL的PBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用清洗缓冲液清洗从而除去未与培养板结合的生物素标记HSA后，将该孔用封闭缓冲液 250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在以表3的终浓度含有低分子的样品缓冲液中制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各IgG与各孔中存在的生物素标记HSA结合。使用以表3的终浓度含有低分子的清洗缓冲液进行清洗后，将经加入有相同低分子的样品缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体（BIOSOURCE）添加至各孔中，将培养板孵育1小时。用含有各低分子的清洗缓冲液清洗后，向各孔添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。另外，作为缓冲液，使用包含表19中记载的组成的缓冲液。
测定结果示于图24。对于HSNMSC1-4_#22结果是，与条件8（全部低分子cocktail溶液）中的吸光度相比，条件9（无低分子）中的吸光度显著地低。该结果与噬菌体 ELISA同样地确认到，HSNMSC1-4_#22具有与抗原的结合根据低分子的有无而变化的性质。另外，HSNMSC1-4_#22在条件2（腺苷 1mM）中表现出与条件8相同的吸光度，在其它条件下则吸光度显著地低，该结果表明其是在腺苷存在下与作为抗原的HSA结合的抗体。表明通过使用这种方法，可获得在犬尿氨酸以外的低分子的存在下与抗原结合的抗体。
〔实施例14〕使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得在低分子存在下与人IL-6受体（hIL-6R）结合的抗体
（14-1）通过珠淘选从天然人抗体文库获得在低分子存在下与hIL-6R结合的抗体
由实施例2中构建的天然人抗体噬菌体展示文库，筛选在低分子存在下表现出hIL-6R结合活性的抗体。即，收集展示抗体的噬菌体，该抗体在低分子存在下对捕获于珠上的hIL-6R表现出结合活性。从在低分子非存在的条件下从珠洗脱出的噬菌体洗脱液回收噬菌体。本获得方法中，使用经生物素标记的hIL-6R作为抗原。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生的噬菌体通过通常的方法纯化。然后得到经TBS透析处理的噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4%的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（Dynabeads M-280 Streptavidin）。
为了有效率地获得低分子（该低分子可以在癌组织中发挥开关的功能）依赖性的低分子开关抗体，实施（2-2）中记载的对在SC的存在下与抗原结合，在SC非存在下不与抗原结合的抗体进行浓缩的淘选。
具体地，在所制备的噬菌体文库液中加入250 pmol的生物素标记抗原，以及如（2-2）中所述制备的SC，在室温使它们接触60分钟。接着，对经BSA封闭的磁珠加入噬菌体文库液，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用SC/TBS（含有SC的TBS）清洗1次。然后，加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
为了将不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白（来源于辅助噬菌体的pIII蛋白）切断，使不展示Fab的噬菌体丧失感染大肠杆菌的能力，加入100 mg/mL的胰蛋白酶10μL，除此之外实施（2-2）中记载的淘选。
（14-2）使用阴性选择法从天然人抗体文库获得在低分子存在下与hIL-6R结合的 抗体
从构建的天然人抗体噬菌体展示文库中，筛选在低分子存在的条件下对hIL-6R表现出hIL-6R结合活性的抗体。为了筛选，首先使天然人抗体噬菌体展示文库在低分子非存在下与生物素标记抗原-链酶亲和素接触，除去展示即使在低分子非存在下也对hIL-6R具有结合活性的抗体的噬菌体。接着，在低分子的存在下同样地进行淘选，由此筛选在低分子存在的条件下对hIL-6R具有结合活性的抗体。使用经生物素标记的hIL-6R作为抗原。接着，通过使用生物素标记hIL-6R作为抗原的（2-3）中记载的方法制备噬菌体文库液。
（14-3）通过噬菌体ELISA评价低分子存在下的结合活性
由（14-2）中所得的大肠杆菌的单菌落，按照常法（Methods Mol. Biol. (2002)178, 133-145），回收含有噬菌体的培养上清。通过（2-4）中记载的方法纯化的纯化噬菌体按照以下步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记hIL-6R的100μL TBS包被一晩。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去生物素标记hIL-6R，然后将该孔用250μL的2%脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2%脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了所制备纯化噬菌体的该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的生物素标记hIL-6R在SC非存在/存在下结合。在经TBST或SC/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或SC/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用TBST或SC/TBST清洗后，向各孔添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。
使用分离的960个克隆进行噬菌体ELISA，由此得到在低分子cocktail存在下对作为抗原的hIL-6R具有结合活性的克隆6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02。
（14-4）与hIL-6R结合的抗体的表达和纯化
由（14-3）中记载的噬菌体ELISA所示的判定为在SC存在下具有生物素标记hIL-6R结合活性的克隆6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02，使用特异性引物（SEQ ID NO:110和112）进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析（6RNMSC1-2_F02：重链的序列由SEQ ID NO:86所示，轻链的序列由SEQ ID NO:87所示；6RNMSC1-3_G02：重链的序列由SEQ ID NO:88所示，轻链的序列由SEQ ID NO:89所示）。将编码6RNMSC1-2_F02、6RNMSC1-3_G02和作为阴性对照的抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC413（重链为SEQ ID NO:34、轻链为SEQ ID NO:35）的可变区的基因插入人IgG1/Kappa的动物表达用质粒。表达的抗体通过实施例3中记载的方法进行纯化。
（14-5）所得抗体与hIL-6R结合所需的低分子的鉴定
将所得的6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02とGC413这3种抗体在表3所示的9个条件下供ELISA。另外，使用表19所示的缓冲液以表3所示的浓度适宜制备各低分子。使用经生物素标记的hIL-6R作为抗原。
首先，将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记hIL-6R的100μL的PBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用清洗缓冲液清洗从而除去未与培养板结合的生物素标记hIL-6R后，将该孔用封闭缓冲液 250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在以表3的终浓度含有低分子的样品缓冲液中制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各IgG与各孔中存在的生物素标记hIL-6R结合。使用以表3的终浓度含有低分子的清洗缓冲液进行清洗后，将经加入有相同低分子的样品缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体（BIOSOURCE）添加至各孔中，将培养板孵育1小时。用含有各低分子的清洗缓冲液清洗后，向各孔添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。另外，作为缓冲液，使用包含表19中记载的组成的缓冲液。
测定结果示于图28和图29。使用6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02的情形中，得到下述结果：与条件8（全部低分子cocktail溶液）中的吸光度相比，条件9（无低分子）中的吸光度显著地低。由该结果确认到，6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02具有与抗原的结合根据低分子的有无而变化的性质。另外，使用6RNMSC1-2_F02的情形中，在条件7（犬尿氨酸100uM）中表现出与条件8相同的吸光度，在其他条件下则吸光度显著地低，由该结果表明，6RNMSC1-2_F02是在犬尿氨酸存在下与作为抗原的hIL-6R结合的抗体（图28）。另外，使用6RNMSC1-3_G02的情形中，在条件1（ATP-Na 1mM）中表现出与条件8相同的吸光度，在其它条件下则吸光度显著地低，由该结果表明，6RNMSC1-3_G02是在ATP存在下与作为抗原的hIL-6R结合的抗体（图29）。表明通过使用这种方法，可以一次获得多个在不同的低分子的存在下与抗原的结合能力发生变化的抗体。
〔实施例15〕6RNMSC1-2_F02抗体的表征
（15-1）通过ELISA评价犬尿氨酸以外的氨基酸和氨基酸代谢物存在下的hIL6R结 合活性
实施例14中获得的在低分子存在下与hIL-6R结合的抗体6RNMSC1-2_F02是在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合的抗体。对实施例11中记载的一系列的色氨酸代谢物等氨基酸代谢物是否适合作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案进行了验证。
将实施例14中所示的在犬尿氨酸存在下具有抗原结合活性的抗体6RNMSC1-2_F02和作为阴性对照的GC413在表18所示的7个条件下供ELISA。另外利用表4所示的缓冲液以表18所示的浓度适宜制备各氨基酸及其代谢物。使用经生物素标记的hIL-6R作为抗原。ELISA采用实施例11中记载的方法。
测定结果示于图30。使用6RNMSC1-2_F02的情形中，与条件1（犬尿氨酸溶液）中的吸光度相比，条件7（无低分子）中的吸光度显著地低。另外，相同地，条件5（3-羟基犬尿氨酸溶液）中的吸光度也表现出与条件1相同的高吸光度，由此表明，6RNMSC1-2_F02是不仅在犬尿氨酸存在下、而且在犬尿氨酸的代谢物存在下也与作为抗原的hIL-6R结合的抗体。此外，在其它条件则吸光度显著地低，由此表明，6RNMSC1-2_F02是即使在犬尿氨酸前体色氨酸的存在下，也不与作为抗原的hIL-6R结合的抗体。在癌症微环境中，代谢色氨酸而产生犬尿氨酸的酶即IDO的表达上升，因而认为在色氨酸存在下不与抗原结合、但在犬尿氨酸及其代谢物存在下与抗原结合的抗体作为仅在癌症微环境下与抗原结合的抗体是重要的。由此，认为通过使用同样的方法可以获得不仅在一种氨基酸代谢物的存在下、而且在结构不同的多种氨基酸代谢物存在下也与目标抗原结合的抗体。
（15-2）通过表面等离子体共振评价犬尿氨酸对人IL6受体结合的影响
使用Biacore T200 (GE Healthcare)，分析6RNMSC1-2_F02与人IL-6受体（IL-6R）的抗原抗体反应的相互作用。在用胺偶联法固定了适当量的protein A（Invitrogen）的传感器芯片CM5（GE Healthcare）上捕获目标抗体，使之与作为抗原的IL-6R相互作用。流动缓冲液使用20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4。与作为抗原的IL-6R的相互作用在25 ℃下进行测定，IL-6R的稀释使用了流动缓冲液，在流动缓冲液中加入了100 μmol/L 犬尿氨酸的缓冲液、以及用于比较对照而在流动缓冲液中加入了10mmol/L ATP的缓冲液。
以流速10μL/min注入IL-6R稀释液和作为空白的流动缓冲液1 分钟，使捕获于传感器芯片上的6RNMSC1-2_F02与IL-6R相互作用。然后，以流速10μL/min流过1 分钟的流动缓冲液，观察到IL-6R从抗体解离后，以流速30μL/min注入30 秒钟的10 mmol/L Glycine-HCl、pH1.5，将传感器芯片再生。由测定得到的传感图算出作为动力学参数的结合速度常数ka（1/Ms）、和解离速度常数 kd（1/s），基于它们计算6RNMSC1-2_F02相对于IL-6R的解离常数KD（M）。各参数的计算中使用了Biacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare）。
该测定中获得的在100μmol/L 犬尿氨酸存在下、10 mmol/L ATP存在下、或非存在下的6RNMSC1-2_F02与1μmol/L的IL-6R的相互作用的传感图示于图31。如图31所示，6RNMSC1-2_F02在100μmol/L的犬尿氨酸存在下与IL-6R结合，但在犬尿氨酸非存在下则未观察到与IL-6R的结合。由此确认到，6RNMSC1-2_F02具有以犬尿氨酸作为开关而与IL-6R结合的性质。此外，100μmol/L 犬尿氨酸存在下的6RNMSC1-2_F02的解离常数KD为1.5μmol/L。
（15-3）犬尿氨酸开关对抗体从IL-6R解离的效果
使用Biacore T200（GE Healthcare），评价在犬尿氨酸存在下与IL-6R结合了的6RNMSC1-2_F02在犬尿氨酸存在下是否犬尿氨酸浓度依赖性地解离。作为流动缓冲液，使用20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4和20 mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4、100 μmol/L 犬尿氨酸，在25 ℃下进行测定。将用含有100 μmol/L的犬尿氨酸的20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v)Tween20、pH7.4进行了稀释的5μg/mL的6RNMSC1-2_F02作为分析物，使之与通过胺偶联固定了IL-6R的传感器芯片CM5相互作用180 秒钟，然后观察各流动缓冲液条件下的IL-6R的解离的状况。为了比较各流动缓冲液条件下的解离的程度，将100μmol/L 犬尿氨酸存在下的6RNMSC1-2_F02对IL-6R的结合量设为100进行标准化（normalize），对所得的值进行比较。示出进行了该标准化后的6RNMSC1-2_F02与IL-6R的相互作用的状况的传感图示于图32。由图32的结果表明，6RNMSC1-2_F02具有在犬尿氨酸存在下与IL-6R结合，然后在犬尿氨酸变得不存在时将IL-6R快速解离的性质。即，确认到由犬尿氨酸实现的对抗体和IL-6R的结合的控制是可逆的。
（15-4）评价犬尿氨酸对IL-6R结合造成的影响
接着，使用Biacore T200（GE Healthcare），评价6RNMSC1-2_F02与IL-6R的抗原抗体反应中的犬尿氨酸浓度的影响。作为流动缓冲液，使用20 mmol/L ACES、150 mmol/LNaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4，6RNMSC1-2_F02与人IL-6R的抗原抗体反应在25 ℃下进行测定。在传感器芯片CM5上通过胺偶联固定IL-6R，将用含有以各种浓度制备的犬尿氨酸的20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4进行了稀释的1μg/mL的6RNMSC1-2_F02 作为分析物，使之相互作用180 秒钟，构成其结合量的变化。其结果示于图33。该结果表明，作为开关的犬尿氨酸浓度越高，则6RNMSC1-2_F02与IL-6R结合越多。
此外，在该评价体系中，IL-6R固定于传感器芯片上，因而认为6RNMSC1-2_F02以二价结合。在这种6RNMSC1-2_F02以二价识别IL-6R的评价体系中，还观察到犬尿氨酸浓度越高，则6RNMSC1-2_F02与IL-6R的结合量越增加。该结果表明，在二价的结合中，6RNMSC1-2_F02具有以犬尿氨酸为开关而与IL-6R结合的性质。
这些结果表明，6RNMSC1-2_F02是以犬尿氨酸作为开关而在犬尿氨酸存在下与IL-6R结合、在犬尿氨酸非存在下则从IL-6R解离的抗体。此外，还确认到6RNMSC1-2_F02可实现在犬尿氨酸非存在下完全不显示IL-6R结合活性的完全ON/OFF控制，推测以图2所示的方案实现开关功能。
（15-5）犬尿氨酸对6RNMSC1-2_F02的ADCC活性的影响
将实施例14中确定的编码6RNMSC1-2_F02的可变区的基因插入包含含有SEQ IDNO:90的重链抗体恒定区和含有SEQ ID NO:91的轻链kappa恒定区序列的人IgG1/Kappa的动物表达用质粒。将编码（重链的序列由SEQ ID NO:92所示，轻链的序列由SEQ ID NO:93所示）已知的抗人IL-6R抗体MRA的可变区的基因也插入具有上述（SEQ ID NO:90、和91）的恒定区的人IgG1/Kappa的动物表达用质粒中。使用以下方法表达抗体。对于在FreeStyle 293Expression Medium培养基（Invitrogen）中以1.33 x 106细胞/mL的细胞密度悬浮、并以每孔3 mL接种于6孔板的各孔中的来源于人胚肾细胞的FreeStyle 293-F株（Invitrogen），通过脂质体转染法导入所制备的质粒。在CO2培养箱（37℃、8%CO2, 90 rpm）中培养4天，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences），通过本领域技术人员公知方法由培养上清纯化抗体。使用分光光度计测定纯化抗体溶液在280 nm下的吸光度。通过PACE法由所得测定值算出吸光系数，使用该吸光系数算出纯化抗体的浓度（ProteinScience (1995) 4, 2411-2423）。
对实施例14中所示的在犬尿氨酸存在下具有抗原结合活性的抗体6RNMSC1-2_F02与现有可溶型hIL-6R的结合进行评价。为了评价6RNMSC1-2_F02对hIL-6R表达细胞的ADCC活性，首先评价6RNMSC1-2_F02是否对hIL-6R表达细胞上表达的膜型hIL-6R具有结合能力。具体地，使用流式细胞仪测定并分析6RNMSC1-2_F02与BaF/hIL-6R细胞株（WO2012/073992）的结合。将制备为适当细胞数的BaF/hIL-6R用含有2%FBS的PBS在冰上封闭1小时以上。经封闭的细胞通过离心分离除去上清，在终浓度100μM的犬尿氨酸存在或非存在下的二个条件下添加100μL的6RNMSC1-2_F02或者对照抗体MRA（重链的序列由SEQ ID NO:92所示，轻链的序列由SEQ ID NO:93所示）。此时在冰上使抗体与细胞膜上的hIL-6R接触30分钟。将细胞与抗体的复合体用含有犬尿氨酸的清洗缓冲液或不含的清洗缓冲液清洗，接着在犬尿氨酸的存在下或非存在下，使该复合体与识别抗体恒定区的二抗（Beckman Coulter IM1627）接触。在冰上与抗体反应30分钟后，再次用清洗缓冲液清洗细胞，然后再悬浮于含有2%FBS的PBS中。通过BD FACS cant II 流式细胞仪（BD）测定并分析6RNMSC1-2_F02与所制备的细胞的结合。
测定结果示于图34。对照抗体MRA无论犬尿氨酸是否存在均观察到荧光显色，而6RNMSC1-2_F02在犬尿氨酸 100μM存在下开始观察到荧光位移（fluorescence shift），在犬尿氨酸非存在下则未观察到荧光显色，因此表明6RNMSC1-2_F02是在犬尿氨酸存在下对细胞膜上表达的hIL-6R具有结合能力的抗体。
通常，对于天然型抗体，靶细胞上的抗原与抗体Fab直接结合，进而效应细胞上的FcγR与抗体Fc结合，因此由效应细胞诱导对靶细胞的细胞毒性（ADCC活性）。所以依照下述方法验证是否通过6RNMSC1-2_F02在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合而对表达hIL-6R的细胞发挥ADCC活性。
使用了6RNMSC1-2_F02的效应作用（effector activity）增强改变体（重链的序列由SEQ ID NO:94所示，轻链由SEQ ID NO:91所示）。依照参考例1的方法，在犬尿氨酸的存在或非存在下，测定针对表达hIL-6R的细胞的不同浓度的6RNMSC1-2_F02的ADCC活性。测定结果示于图35。
测定的结果，在犬尿氨酸存在下，确认到针对表达hIL-6R的细胞的由6RNMSC1-2_F02产生的抗体浓度依赖性的ADCC活性。该结果表明，通过犬尿氨酸介导的抗原与抗体的结合，诱导该抗体对表达抗原的细胞的ADCC活性，因此在作为开关的低分子分子存在下与抗原结合的抗体还可通过作为开关的低分子的有无来控制ADCC活性等抗肿瘤活性等功能。
此外，正常组织中的犬尿氨酸浓度与肿瘤组织中的犬尿氨酸浓度具有浓度差，因此理想的是仅在肿瘤组织中犬尿氨酸浓度下发挥抗体对表达抗原的肿瘤细胞的ADCC活性，但在正常组织中的浓度下则不发挥或减弱ADCC活性。因此，依照参考例2的方法，测定不同的犬尿氨酸浓度下的6RNMSC1-2_F02对表达hIL-6R的细胞的ADCC活性。测定结果示于图36。测定的结果，犬尿氨酸浓度依赖性地确认到6RNMSC1-2_F02对表达hIL-6R的细胞的ADCC活性。进而，在被视为正常组织中的犬尿氨酸浓度的4～6μM下，ADCC活性为约10%，而在被视为肿瘤组织中的犬尿氨酸浓度的30～40μM下，ADCC活性为约25%。
根据这些结果，在犬尿氨酸浓度低的正常组织中，6RNMSC1-2_F02对表达hIL-6R的细胞的ADCC活性弱，在浓度高的肿瘤组织中，6RNMSC1-2_F02对表达hIL-6R的细胞的ADCC活性较强。以上表明，通过给予以犬尿氨酸作为开关的抗体，可以在维持针对表达靶抗原的肿瘤组织的药效的同时，减轻针对表达靶抗原的正常组织的毒性。
（15-6）通过IgG ELISA评价所得的抗体与小鼠血清中的hIL-6R的结合活性
实施例14中所得的在低分子存在下与hIL-6R结合的抗体6RNMSC1-2_F02是在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合的抗体。迄今为止，对6RNMSC1-2_F02在PBS或TBS等缓冲液中与抗原的结合能力进行了评价。认为在小鼠血清中以氨基酸为代表的未知低分子大量存在，因而无法否定这些低分子有可能对6RNMSC1-2_F02的抗原结合造成影响。因此，评价了小鼠血清中的6RNMSC1-2_F02的抗原结合能力。
将实施例14中所示的在犬尿氨酸存在下具有抗原结合活性的抗体6RNMSC1-2_F02和已知的抗hIL-6R抗体MRA在表20所示的二个条件下供ELISA。使用经生物素标记的hIL-6R作为抗原。
首先，将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL的PBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用清洗缓冲液清洗从而除去未与培养板结合的抗原后，将该孔用封闭缓冲液 250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在以表20所示的条件2下制备为2.5μg/mL的纯化IgG的各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各IgG与各孔中存在的抗原结合。用含100μM的犬尿氨酸的清洗缓冲液进行清洗后，向各孔添加经含有犬尿氨酸的样品缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体（BIOSOURCE），将培养板孵育1小时。用含有犬尿氨酸的清洗缓冲液清洗后，向各孔添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。
测定结果示于图37。使用MRA的情形中，无论犬尿氨酸是否存在，吸光度均相同，而在使用6RNMSC1-2_F02的情形中，与表20所示的条件2（犬尿氨酸存在的小鼠血清）中的吸光度相比，条件1（犬尿氨酸不存在的小鼠血清）中的吸光度显著地低。由此表明，6RNMSC1-2_F02不受小鼠血清中的未知低分子的影响，是在犬尿氨酸存在下与作为抗原的hIL-6R结合的抗体。
〔实施例16〕使用噬菌体展示技术从抗体文库获得在腺苷、ATP非存在下与抗原结合的抗体
（16-1）利用腺苷和ATP的混合物从文库获得在低分子存在下与抗原的结合受到抑 制的抗体
在上述实施例中，获得了在作为开关的低分子的存在下与靶抗原结合的抗体。本实施例中，尝试获得在低分子非存在下与靶抗原结合的抗体。
从构建的合理设计抗体噬菌体展示文库中，获得在腺苷和/或ATP非存在条件下对抗原表现出抗原结合活性、并且结合能力在它们的存在下减弱的抗体。为了获得，首先使抗体噬菌体展示文库与生物素化腺苷和ATP-中和亲和素接触，回收与腺苷和/或ATP结合的抗体噬菌体展示文库。接着，使该抗体噬菌体展示文库在腺苷和ATP非存在条件下与生物素化抗原-链酶亲和素接触，回收在腺苷和ATP非存在下与抗原结合的抗体。通过交替地进行这种淘选，筛选对腺苷和/或ATP、以及抗原这两者具有结合活性的抗体。期待具有这种性质的抗体在腺苷和ATP存在下，通过腺苷和/或ATP与抗体的结合，使得抗体与抗原的结合被抑制。
由保持构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5 M NaCl/10%PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4%的方式添加BSA。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（Dynabeads M-280 Streptavidin），实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。
在所制备的噬菌体文库液中加入500 pmol的生物素化ATP、2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素，由此使该噬菌体文库液与腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使腺苷和/或ATP与噬菌体的复合体和磁珠在室温结合15分钟。将珠用TBS清洗1次。然后，加入1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL。
将珠在室温悬浮15分后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第2次淘选中，进行能够在腺苷和ATP非存在条件下与生物素化抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入250 pmol的生物素化抗原，使该噬菌体文库液与抗原在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用TBST清洗2次、用TBS清洗1次。然后，加入有1 mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5 mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
然后，在第奇数次的淘选中，通过与第1次淘选相同的条件重复实施淘选。其中，利用TBST和TBS的珠的清洗分别增加至3次、2次来实施。
然后，在第偶数次的淘选中，通过与第2次淘选相同的条件重复实施淘选。其中，第4次以后的淘选中，将生物素化抗原减至40pmol，将利用TBST和TBS的珠的清洗分别增加至3次、2次来实施。
（16-2）通过噬菌体ELISA评价低分子存在下的结合活性
由根据上述方法得到的大肠杆菌的单菌落，按照常法（Methods Mol. Biol.(2002) 178, 133-145），回收含有噬菌体的培养上清。使用NucleoFast 96（MACHEREY-NAGEL），对回收的培养上清进行超滤。对各孔中添加了培养上清各100μL的NucleoFast 96进行离心分离（4,500g, 45分钟），由此除去穿流物。将各孔中添加有100μL的H2O的该NucleoFast 96再次离心分离（4,500g, 30分钟离心），由此进行清洗。最后加入TBS 100μL，在室温静置5分钟，回收该NucleoFast 96的各孔的上清中所含的噬菌体液。
加入有TBS、或者ATP和腺苷/TBS的纯化噬菌体通过以下步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL的TBS包被一夜。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去抗原，然后将该孔用250μL的2%脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2%脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了制备的纯化噬菌体的该培养板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的抗原在腺苷和ATP10 mM存在下或非存在下结合。在经TBST或者10 mM ATP和腺苷/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或者10 mM ATP和腺苷/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用TBST或者10 mM ATP和腺苷/TBST清洗后，向各孔中添加TMB single溶液（ZYMED），各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸来终止后，通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。
使用分离的96个克隆进行噬菌体ELISA，由此通过合理设计抗体文库得到在ATP和腺苷非存在下对作为抗原的人IL-6表现出结合活性的克隆“I6RLSA1-6_011”、在ATP和腺苷非存在下对于作为抗原的人血清白蛋白(HSA)表现出结合活性的克隆“HSADSA1-6_020”、和在ATP和腺苷非存在下对人IL-6 受体表现出结合活性的克隆“6RRLSA1-6_037”、“6RRLSA1-6_045”（图38、39、45）。
（16-3）以腺苷和ATP作为开关的抗体的序列分析
由（16-2）中所示的噬菌体ELISA的结果判断为在腺苷或ATP的非存在条件下具有抗原结合活性的克隆，使用特异性引物SEQ ID NO:111和112）进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析。对于分析结果，在以下表21中示出氨基酸序列。
〔实施例17〕使用多价展示噬菌体展示技术从抗体文库获得在腺苷、ATP存在下与抗原结合的抗体
（17-1）利用多价展示从文库获得在低分子存在下与抗原结合的抗体
利用抗体在噬菌体上的多价展示，由合理设计抗体噬菌体展示文库获得在腺苷、和/或ATP存在下对抗原表现出结合活性的抗体。在从文库获得抗体时，低分子存在下和非存在下的抗原结合能力比越大，则获得概率越高。因此，为了有效率地回收在低分子存在下具有结合能力的抗体，实施利用了表观结合能力的增强的淘选。更具体地，通过使噬菌体多价展示抗体，亲和力效应（多价引起的对抗原的结合效果）使得表观结合能力增强。首先，使合理设计抗体噬菌体展示文库在腺苷和ATP存在下与生物素化抗原接触，回收在腺苷和ATP存在下与抗原结合的抗体噬菌体展示文库。接着，参照Rondot（Nat. Biotechnol. (2001)19, 75-78）中记载的方法，使感染了回收的抗体噬菌体展示文库的大肠杆菌，感染编码pIII的基因缺失的辅助噬菌体，制备抗体被展示于所有pIII的抗体多价展示噬菌体展示文库。使该抗体多价展示噬菌体展示文库在腺苷和ATP存在条件下与生物素化抗原-链酶亲和素接触，回收后，在腺苷和ATP非存在条件下对珠进行洗脱，从洗脱液中回收噬菌体。通过进行多次这种噬菌体制备和淘选，筛选仅在腺苷和/或ATP存在下对抗原具有结合活性的抗体。
使辅助噬菌体M13KO7感染保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌，在30℃培养一晩，由此产生抗体单价展示噬菌体展示文库。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5 M NaCl/10%PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4%的方式添加BSA。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）或涂布有链霉亲和素的珠（Dynabeads M-280 Streptavidin），实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。
在制备的噬菌体文库液中加入作为抗原的500 pmol的生物素标记人IgA-Fc（SEQID NO:99）、以及各终浓度 1 mM的ATP-Na和腺苷，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原和腺苷、以及ATP接触60分钟。接着，在该噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用溶解有ATP和腺苷的TBS清洗1次。然后，将加入有1 mg/mL的胰蛋白酶0.5 mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，使辅助噬菌体M13KO7、或者M13KO7ΔpIII（也称作超级噬菌体）（PROGEN Biotechnik）感染接种的大肠杆菌的培养液，在30℃培养一晩，由上清回收噬菌体，由此分别制备抗体单价展示噬菌体文库和抗体多价展示噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在腺苷和ATP存在下与抗原结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行能够在仅腺苷和ATP存在下与抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入250 pmol的生物素标记抗原以及各终浓度1 mM的腺苷和ATP，由此使噬菌体文库在室温与抗原和腺苷以及ATP接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1 mL的溶解有腺苷和ATP的TBST（以下，称为(腺苷＋ATP)/TBST）和溶解有腺苷和ATP的TBS（以下，称为(腺苷＋ATP)/TBS）进行清洗。然后将加入有0.5 mL的TBS的珠在室温悬浮后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。再次重复该操作后，混合分2次洗脱出的噬菌体液。在回收的噬菌体溶液中加入100 mg/mL的胰蛋白酶5μL，由此将不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白（来源于辅助噬菌体的pIII蛋白）切断，使得不展示Fab的噬菌体丧失感染大肠杆菌的能力。将从经胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加至达到对数生长期（OD600为0.4-0.7）的10 mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225 mm x 225 mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中，与第1次淘选相同地回收噬菌体，回收抗体单价展示噬菌体文库和抗体多价展示噬菌体文库液。将获得在腺苷和ATP存在下具有抗原结合活性的抗体的淘选重复3次。其中，在第3次以后的淘选中，使用生物素化抗原40 pmol。
（17-2）通过噬菌体ELISA评价腺苷和/或ATP的存在和非存在下的结合活性
由根据上述方法得到的大肠杆菌的单菌落，依照常法（Methods Mol. Biol.(2002) 178, 133-145）回收含有噬菌体的培养上清。使用NucleoFast 96（MACHEREY-NAGEL），对回收的培养上清进行超滤。对各孔中添加有培养上清各100μL的NucleoFast 96进行离心分离（4,500g、45分钟），由此除去穿流物。将各孔中加入有100μl的H2O的该NucleoFast 96再次进行离心分离（4,500g、30分钟），由此进行清洗。最后加入TBS 100μL，在室温静置5分钟，回收该NucleoFast 96的各孔的上清中所含的噬菌体液。
加入有TBS、或(腺苷＋ATP)/TBS的纯化噬菌体通过下述步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板（Roche）用含有生物素标记抗原的100μL的TBS包被一夜。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去抗原，然后将该孔用250μL的2%脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2%脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了制备的纯化噬菌体的该培养板静置1小时，由此使展示抗体的噬菌体与各孔中存在的抗原在腺苷和ATP的非存在和存在下结合。在经TBST或(腺苷＋ATP)/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或(腺苷＋ATP)/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech），将培养板孵育1小时。用TBST或(腺苷＋ATP)/TBST清洗后，添加了TMB single溶液（ZYMED）的各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止，然后通过450 nm的吸光度对该显色进行测定。其结果，在抗体多价展示噬菌体展示文库中，大量获得了在低分子存在下具有结合活性的抗体（图40、41）。这暗示了通过使用抗体多价展示噬菌体展示法，可以更有效率地获得在低分子存在下具有结合活性的抗体。噬菌体ELISA的结果示于以下的表22。
（17-3）以腺苷和ATP作为开关的抗体的结合能力的评价和序列分析
由（17-2）所示的噬菌体ELISA的结果判断为在腺苷和ATP存在的条件下具有抗原结合活性的克隆，使用特异性引物（SEQ ID NO:111和112）进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析。结果获得了在腺苷和ATP存在下表现出抗原结合活性的克隆“IADL3C5-4_048（重链SEQ ID NO:100、轻链SEQ ID NO:101）”（图42）。
〔实施例18〕 由文库获得的ATP/腺苷依赖性抗体的表征
（18-1）由文库获得的ATP/腺苷依赖性抗体的制备
由实施例10中获得的、判断为在ATP或者腺苷存在下对生物素标记hIL-6R具有结合活性的克隆6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011，使用特异性引物进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析（表23）。
将6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011的可变区序列插入包含具有SEQ ID NO:90的重链抗体恒定区与具有SEQ ID NO:91的轻链kappa恒定区序列的人IgG1/Kappa的动物表达用质粒。使用以下方法表达抗体。对于在FreeStyle 293Expression Medium培养基（Invitrogen）中以1.33 x 106细胞/mL的细胞密度悬浮、并以每孔3 mL接种于6孔板的各孔中的来源于人胚肾细胞的FreeStyle 293-F株（Invitrogen），通过脂质体转染法导入所制备的质粒。在CO2培养箱（37℃、8%CO2, 90 rpm）中培养4天，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）通过本领域技术人员公知的方法从培养上清纯化抗体。使用分光光度计测定纯化抗体溶液在280 nm下的吸光度。通过PACE法由所得测定值算出吸光系数，使用该吸光系数算出纯化抗体的浓度（ProteinScience (1995) 4, 2411-2423）。
（18-2）通过表面等离子体共振评价各种低分子对人IL6受体结合的影响
使用Biacore T200（GE Healthcare），评价由文库获得的9个ATP/腺苷依赖性抗体克隆（6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011）与IL-6R的抗原抗体反应中的各种低分子的影响。作为流动缓冲液，使用20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05%(w/v) Tween20、pH7.4，在25 ℃进行测定。在传感器芯片CM5上通过胺偶联固定IL-6R，将抗体作为分析物使之相互作用120 秒钟，观察其结合量的变化。抗体的稀释使用了流动缓冲液以及在流动缓冲液中分别添加有ATP、ADP、AMP、cAMP、或腺苷(ADO)中的任一者的缓冲液，制备为各低分子的终浓度为1 mM、抗体的终浓度为1μM。此外，在1 mM ATP条件下，对数个梯度的抗体浓度系列进行测定，根据相对于抗体浓度的平衡值的描点，算出各克隆相对于IL-6R的解离常数KD（mol/L）。参数的计算使用了 Biacore T200 Evaluation Software（GEHealthcare）。1 mM ATP存在下的各克隆的解离常数KD示于表24。
该测定中获得的在1 mM 的各低分子存在下、或非存在下的各克隆与IL-6R的结合量示于图43。如图43所示，各克隆在1 mM ATP存在下与IL-6R结合，但在ATP非存在下则未观察到对IL-6R的结合。由此确认，其具有以ATP作为开关而与IL-6R结合的性质。对于ATP以外的低分子，全部克隆均在ADP存在下观察到结合，一部分克隆还观察到AMP和cAMP存在下的结合。在ADO存在下，未观察到与IL-6R的结合。
表明通过使用合理设计文库，可以获得能够在ATP、ADP、AMP、cAMP的一者或任意存在下与靶抗原结合的抗体。本实施例中，在设计文库的设计时所参照的抗体即ATNLSA1-4_D12所结合的ATP与ADO共存下进行了淘选，结果在ATNLSA1-4_D12较强结合的ATP存在下获得了与靶抗原强结合的抗体，而在ATNLSA1-4_D12较弱（与ATP相比）结合的ADO存在下，未获得与靶抗原强结合的抗体。通过在仅所期望的低分子存在的条件下使抗原与文库接触并分离与抗原结合的抗体，由此可以获得仅依赖于该低分子而与抗原结合的抗体。例如，认为通过在仅ADO存在下进行淘选，可以从本文库有效率地获得在ADO存在下结合的抗体。
（18-3）ATP对所得抗体的ADCC活性的影响
依照下述方法验证所得的抗体6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_011是否通过在三磷酸腺苷（ATP）存在下与hIL-6R结合而对表达hIL-6R的细胞发挥ADCC活性。本验证中使用了实施例18-1中制作的6RAD2C1-4_030的效应作用增强改变体（重链抗体可变区：SEQ ID NO:119、轻链抗体可变区：SEQ ID NO:120、重链抗体恒定区：SEQ ID NO:90、轻链抗体恒定区：SEQ ID NO:91）、6RAD2C1-4_011的效应作用增强改变体（重链抗体可变区：SEQ ID NO:82、轻链抗体可变区：SEQ ID NO:83、重链抗体恒定区：SEQ ID NO:90、轻链抗体恒定区：SEQ IDNO:91）、和实施例15-5中制作的已知的抗人IL-6R抗体MRA（重链抗体可变区：SEQ ID NO:92、轻链抗体可变区：SEQ ID NO:92、重链抗体恒定区：SEQ ID NO:90、轻链抗体恒定区：SEQID NO:91）。依照参考例3的方法，在ATP存在、或非存在下，测定针对表达hIL-6R的细胞的、不同抗体浓度的6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_011、MRA的ADCC活性。测定结果示于图44。
测定的结果，在ATP存在下，确认到6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_011
的抗体浓度依赖性的ADCC活性。该结果表明，不仅犬尿氨酸而且通过ATP介导的抗原与抗体的结合也诱导该抗体对表达抗原的细胞的ADCC活性，因此在作为开关的低分子分子存在下与抗原结合的抗体可通过作为开关的低分子来控制ADCC活性等抗肿瘤活性等功能。
根据这些结果，认为在ATP浓度低的正常组织中，针对表达hIL-6R的细胞的ADCC活性的诱导弱，在浓度高的肿瘤组织中，针对表达hIL-6R的细胞的ADCC活性的诱导强。以上暗示，通过给予以ATP作为开关的抗体，可以在维持针对表达靶抗原的肿瘤组织的药效的同时减轻针对表达靶抗原的正常组织的毒性。
〔参考例1〕使用人外周血单核细胞作为效应细胞的被测抗体的ADCC活性
依照以下方法，测定犬尿氨酸依赖性地与抗原结合的抗体在不同的抗体浓度下对表达抗原的细胞的ADCC活性。将人外周血单核细胞（以下，称为人PBMC）用作效应细胞，如下所述测定各被测抗体的ADCC活性。
（1）人PBMC溶液的制备
使用预先注入有1000单位/ml的肝素溶液（Novo-Heparin注射用5000单位；NovoNordisk）200μl的注射器，由中外制药株式会社所属的正常人志愿者（成年男性）采集外周血50 ml。使用PBS（-）稀释2倍后，将四等分的该外周血加入预先注入了15 ml的Ficoll-Paque PLUS并进行了离心分离操作的Leucosep淋巴细胞分离管（Greiner bio-one）中。在分配（分注）了该外周血后，供于通过2150 rpm的速度在室温进行10分钟离心分离的操作，由分离管收集单核细胞级分层。用含有10%FBS的RPMI-1640（nacalai tesque）（以下称为10%FBS/RPMI）清洗一次，将该级分层所含的细胞在10%FBS/ RPMI中以其细胞密度为1x107细胞/ml的方式悬浮。将该细胞悬浮液作为人PBMC溶液供以后的实验。
（2）靶细胞的制备
将0.74MBq的Cr-51添加至3x106细胞的、在Ba/F3中强制表达人IL-6受体的BaF/hIL6R（Mihara等（Int. Immunopharmacol. (2005) 5, 1731-40）中。然后在5%二氧化碳培养箱中在37℃孵育1小时，将该细胞用10%FBS/RPMI清洗3次后，在10%FBS/RPMI中以其细胞密度为2x105 细胞/ ml的方式悬浮。将该细胞悬浮液作为靶细胞供以后的实验。
（3）犬尿氨酸溶液的制备
使用PBS（-）将L-犬尿氨酸（sigma）稀释为5 mM，使用10%FBS/RPMI将其调整为400μM的浓度。将该溶液作为犬尿氨酸溶液供以后的试验。
（4）铬释放试验（ADCC活性）
ADCC活性通过使用铬释放法的特异性铬释放率来进行评价。首先，将调整为各浓度（0、0.04、0.4、4、40μg/ml）的抗体溶液在96孔U底培养板的各孔中每孔添加50μl。接着，在该孔中每孔接种（2）中制备的靶细胞50μl（1x104 细胞/孔）。进而，在该孔中每孔添加（3）中制备的犬尿氨酸溶液50μl，将培养板在室温静置15分钟。接着在其各孔中加入（1）中制备的人PBMC溶液各50μl（5x105 细胞/孔），在5%二氧化碳培养箱中在37℃静置4小时，将该培养板供离心分离操作。该培养板各孔中的100μl培养上清的放射活性使用伽马计数器测定。基于下式计算特异性铬释放率。
铬释放率(%)＝(A-C)×100/(B-C)
上式中，A表示各孔中的100μl培养上清的放射活性（cpm）的平均值。此外，B表示相对于靶细胞添加有50μl的4% NP-40水溶液（Nonidet P-40、ナカライテスク）和100μl的10%FBS/RPMI的孔中的100μl培养上清的放射活性（cpm）的平均值。进而，C表示相对于靶细胞添加有150μl的10% FBS/RPMI或100μl的10% FBS/RPMI 和50μl的犬尿氨酸溶液的孔中的100μl培养上清的放射活性（cpm）的平均值。试验按照双份（duplicate）实施，算出反映各被测抗体的ADCC活性的前述试验中的特异性铬释放率（%）的平均值。
〔参考例2〕使用人外周血单核细胞作为效应细胞的各被测抗体的ADCC活性
依照以下方法，测定犬尿氨酸依赖性地与抗原结合的抗体在不同的犬尿氨酸浓度下对表达抗原的细胞的ADCC活性。将人外周血单核细胞用作效应细胞，如下所述测定各被测抗体的ADCC活性。另外，人PBMC溶液和靶细胞通过与参考例1相同的方法制备。
（1）犬尿氨酸溶液的制备
使用PBS（-）将L-犬尿氨酸（sigma）稀释至5 mM，使用10%FBS/RPMI将其调整为400、133、44、14.8、4.9μM的浓度。将该溶液作为犬尿氨酸溶液供以后的试验。
（2）铬释放试验（ADCC活性）
ADCC活性通过使用铬释放法的特异性铬释放率来进行评价。首先，将调整为200μg/ml的抗体溶液在96孔U底培养板的各孔中每孔添加50μl。接着，在该孔中每孔接种前述靶细胞50μl（1x104 细胞/孔）。接着，在该孔中每孔添加（1）中制备的各浓度的犬尿氨酸溶液50μl，将培养板在室温静置15分钟。接着在各孔中加入前述人PBMC溶液各50μl（5x105 细胞/孔），在5%二氧化碳培养箱中在37℃静置4小时，将培养板供离心分离操作。该培养板各孔中的100μl培养上清的放射活性使用伽马计数器测定。基于参考例1中记载的式子求出特异性铬释放率。
〔参考例3〕使用人NK细胞株NK92作为效应细胞的各被测抗体的ADCC活性
依照以下方法，测定ATP依赖性地与抗原结合的抗体在不同的抗体浓度下对表达抗原的细胞的ADCC活性。将在人NK细胞株NK92中强制表达人FcgRIIIa的NK92-CD16(V)用作效应细胞，如下所述测定各被测抗体的ADCC活性。
（1）NK92-CD16(V)的制备
将NK92-CD16(V)在10%FBS/ RPMI中以其细胞密度为1x107 细胞/ml的方式悬浮。将该细胞悬浮液作为NK92-CD16(V)溶液供以后的实验。
（2）靶细胞的制备
向在CHO中强制人IL-6受体的CHO/hIL6R 3x106细胞中加入0.74MBq的Cr-51。然后在5%二氧化碳培养箱中在37℃孵育1小时，将该细胞用10%FBS/RPMI清洗3次后，在10%FBS/RPMI中以其细胞密度为2x105 细胞/ ml的方式悬浮。将该细胞悬浮液作为靶细胞供以后的实验。
（3）ATP溶液的制备
使用10%FBS/RPMI将ATP（sigma）稀释至100 mM，并调整为4 mM的浓度。将该溶液作为ATP溶液供以后的试验。
（4）铬释放试验（ADCC活性）
ADCC活性通过使用铬释放法的特异性铬释放率来进行评价。首先，将调整为各浓度（0、0.04、0.4、4、40μg/ml）的抗体溶液在96孔U底培养板的各孔中每孔添加50μl。接着，在该孔中每孔接种（2）中制备的靶细胞50μl（1x104 细胞/孔）。进而，在该孔中每孔添加（3）中制备的ATP溶液50μl，将培养板在室温静置15分钟。接着，在其各孔中加入（1）中制备的NK92-CD16(V)溶液各50μl（5x105 细胞/孔），在5%二氧化碳培养箱中在37℃静置4小时，将该培养板供离心分离操作。该培养板各孔中的100μl培养上清的放射活性使用伽马计数器测定。基于参考例1中记载的式子求出特异性铬释放率。
序列表
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120> 靶组织特异性抗原结合分子
<130> C1-A1204Y1P
<140> PCT/JP2013/064975
<141> 2013-05-30
<150> JP 2012-123781
<151> 2012-05-30
<150> JP 2012-177311
<151> 2012-08-09
<160> 126
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 468
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg
20 25 30
Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro
35 40 45
Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys
50 55 60
Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg
65 70 75 80
Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys
85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val
100 105 110
Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser
115 120 125
Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr
130 135 140
Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp
145 150 155 160
Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys
165 170 175
Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met
180 185 190
Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe
195 200 205
Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val
210 215 220
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp
225 230 235 240
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg
245 250 255
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp
260 265 270
Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His
275 280 285
Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser
290 295 300
Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr
325 330 335
Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr
340 345 350
Ser Leu Pro Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu
355 360 365
Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile
370 375 380
Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly
385 390 395 400
Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu
405 410 415
Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val
420 425 430
Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro
435 440 445
Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr
450 455 460
Phe Phe Pro Arg
465
<210> 2
<211> 1407
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
atgctggccg tcggctgcgc gctgctggct gccctgctgg ccgcgccggg agcggcgctg 60
gccccaaggc gctgccctgc gcaggaggtg gcgagaggcg tgctgaccag tctgccagga 120
gacagcgtga ctctgacctg cccgggggta gagccggaag acaatgccac tgttcactgg 180
gtgctcagga agccggctgc aggctcccac cccagcagat gggctggcat gggaaggagg 240
ctgctgctga ggtcggtgca gctccacgac tctggaaact attcatgcta ccgggccggc 300
cgcccagctg ggactgtgca cttgctggtg gatgttcccc ccgaggagcc ccagctctcc 360
tgcttccgga agagccccct cagcaatgtt gtttgtgagt ggggtcctcg gagcacccca 420
tccctgacga caaaggctgt gctcttggtg aggaagtttc agaacagtcc ggccgaagac 480
ttccaggagc cgtgccagta ttcccaggag tcccagaagt tctcctgcca gttagcagtc 540
ccggagggag acagctcttt ctacatagtg tccatgtgcg tcgccagtag tgtcgggagc 600
aagttcagca aaactcaaac ctttcagggt tgtggaatct tgcagcctga tccgcctgcc 660
aacatcacag tcactgccgt ggccagaaac ccccgctggc tcagtgtcac ctggcaagac 720
ccccactcct ggaactcatc tttctacaga ctacggtttg agctcagata tcgggctgaa 780
cggtcaaaga cattcacaac atggatggtc aaggacctcc agcatcactg tgtcatccac 840
gacgcctgga gcggcctgag gcacgtggtg cagcttcgtg cccaggagga gttcgggcaa 900
ggcgagtgga gcgagtggag cccggaggcc atgggcacgc cttggacaga atccaggagt 960
cctccagctg agaacgaggt gtccaccccc atgcaggcac ttactactaa taaagacgat 1020
gataatattc tcttcagaga ttctgcaaat gcgacaagcc tcccagtgca agattcttct 1080
tcagtaccac tgcccacatt cctggttgct ggagggagcc tggccttcgg aacgctcctc 1140
tgcattgcca ttgttctgag gttcaagaag acgtggaagc tgcgggctct gaaggaaggc 1200
aagacaagca tgcatccgcc gtactctttg gggcagctgg tcccggagag gcctcgaccc 1260
accccagtgc ttgttcctct catctcccca ccggtgtccc ccagcagcct ggggtctgac 1320
aatacctcga gccacaaccg accagatgcc agggacccac ggagccctta tgacatcagc 1380
aatacagact acttcttccc cagatag 1407
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 3
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 梭状芽胞杆菌（Clostridium sp.）
<400> 4
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
Ala Ser His Leu Glu
20
<210> 5
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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<220>
<223> 人工合成序列
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
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Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
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195 200 205
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 智人
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
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Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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275 280 285
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gtg gac acc aca aag gca gtg atc act ttg cag cct cca tgg gtc agc 96
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gtg ttc caa gag gaa acc gta acc ttg cac tgt gag gtg ctc cat ctg 144
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gat aag ctg gtg tac aat gtg ctt tac tat cga aat ggc aaa gcc ttt 432
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Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Pro
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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<211> 214
<212> PRT
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<400> 31
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Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
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Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
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165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
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195 200 205
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<210> 32
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 32
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35 40 45
Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 33
Gln Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 34
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 35
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 36
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Leu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gln Ser Gly Asp Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Ser Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Leu Ile Thr Ala Ala Gly Pro Pro Pro Phe Glu His
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 37
<211> 213
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Met Pro Cys Ser Gly Asn Gly Leu Gly Asp Lys Phe Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Val Ala Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ala Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala
65 70 75 80
Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gly Thr Ala
85 90 95
Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu Gly Gln Pro Lys Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
115 120 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
130 135 140
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 38
<211> 446
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 38
Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ile Ile Gly Ala Asp Ser Ser Thr Trp Tyr Pro Ser Trp Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
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130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 39
<211> 220
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 39
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Trp Asn Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
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Leu Ile Phe Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
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Gln Cys Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gly Ser Tyr Ala Asn
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Ser Gly Trp Tyr Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
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Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
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Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
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Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 40
<211> 452
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 40
Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Pro Trp Ala Ile
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val
85 90 95
Lys Ser Tyr Val Asn Ser Asn Gly Tyr Phe Ile Phe Ser Arg Leu Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
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Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro
450
<210> 41
<211> 218
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 41
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Lys Ser Val Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 42
<211> 446
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 42
Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Asn
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
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145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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195 200 205
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 43
<211> 219
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 43
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Gly
20 25 30
Asn Phe Phe Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Thr Tyr Tyr Asn
85 90 95
Ser Gly Trp Ser Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 44
<211> 443
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 44
Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Met Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Asp Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
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85 90 95
Gly Val Asn Val Asp Tyr Tyr Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 45
<211> 217
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 45
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Val Cys Asp Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Tyr Gly
85 90 95
Gly Ile Gly Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 46
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Asn Tyr Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Arg Lys Gly Asp Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 48
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
100 105
<210> 50
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Val Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 51
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asn Arg
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Asn Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu His Leu Pro Arg Thr Phe Gly Leu Arg Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Met Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 53
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
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Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
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165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
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195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<211> 456
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Tyr Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Asp Ala Ser Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Ser Ser Pro Lys Thr Pro Thr Ser Thr Trp Ser Ser
100 105 110
Leu Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
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290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
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370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 55
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
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Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Met Ile His Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
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100 105 110
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115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
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<210> 58
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
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<210> 60
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
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20
<210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr
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<210> 62
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys
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<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210> 64
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 未归类特征（misc_feature）
<222> (38)..(38)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 64
tattactcgc ggcccagccg gccatggcag ccwtcganwt gacccagact 50
<210> 65
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 未归类特征（misc_feature）
<222> (39)..(39)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 65
tattactcgc ggcccagccg gccatggcag cctatgatnt gacccagact 50
<210> 66
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 66
tattactcgc ggcccagccg gccatggcag cbcaagtgct gacccagact 50
<210> 67
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 67
tattactcgc ggcccagccg gccatggcag ccmtygtgat gacccagact 50
<210> 68
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 68
tattactcgc ggcccagccg gccatggcag ccgccgtgct gacccagact 50
<210> 69
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 69
tattactcgc ggcccagccg gccatggcgg ctgacattgt gatgacccag 50
<210> 70
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 70
tattactcgc ggcccagccg gccatggccg ccgayrtygt gatgacccag 50
<210> 71
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 71
ctcttctaga acgcgtctaa gcgtcacccc tattgaagct c 41
<210> 72
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 72
tattactcgc ggcccagccg gccatggcgc agcyygtgct gactcagtcg ccctc 55
<210> 73
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 73
ctcttctaga acgcgtctaa gcttctgcag gggccaggct cttc 44
<210> 74
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 74
ttccgcctcg gcgctagccc aggagcagst ggwggagtcc 40
<210> 75
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 未归类特征（misc_feature）
<222> (25)..(26)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 75
ttccgcctcg gcgctagccc agtcnntgga ggagtccggg 40
<210> 76
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 未归类特征（misc_feature）
<222> (26)..(27)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 76
ttccgcctcg gcgctagccc agtcgnngga ggagtccggg 40
<210> 77
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 77
ttccgcctcg gcgctagccc agcagcagct ggwggagtcc 40
<210> 78
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly His
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Thr His Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Arg Arg Trp Ala Met Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Gly Gly Ser Lys Lys Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Leu Lys Ser Tyr Ala
85 90 95
Glu Gly Pro Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 80
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Asn His Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly His Arg Arg Asp Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 81
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Phe Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Gly Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Val Thr Tyr Ser Ile
85 90 95
Ala Asp Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Ala Leu Gly Gln Met Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Asp Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Ser Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Arg Ser Ser Ser
85 90 95
Met Asn Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr Gly Ala Leu Gly Gln Arg Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Asp Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Gln Thr Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Arg Ser Ile Lys
85 90 95
His Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 86
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ala Pro Val Val Ala Arg Pro Arg Gly Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile His Glu Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 88
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Val Pro Ser Ser Gly Tyr Pro Gly Arg Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 89
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 90
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 91
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 92
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 94
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 95
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ser His Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Arg Lys Tyr Arg Met Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Phe Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Val Thr Gly Ile
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Trp Ser Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 97
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
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Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Asn His Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val
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Ala Arg Phe Gly Lys Lys Gly Arg Tyr Leu Trp Val Phe Asp Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 98
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Tyr Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Leu Thr Thr Asp Ser
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100 105 110
<210> 99
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala
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Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser
50 55 60
Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe
65 70 75 80
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100 105 110
Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys
115 120 125
Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln
130 135 140
Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg
145 150 155 160
Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu
165 170 175
Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met
180 185 190
Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp
195 200 205
Arg Leu Ala Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe
210 215 220
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
225 230
<210> 100
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly His
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Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Phe Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Ser Pro Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 102
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<210> 103
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 103
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<210> 104
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 104
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<220>
<223> 人工合成序列
<400> 105
tgggcccttg gtcgacgc 18
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Gly His Arg His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Lys Lys Gly Asn Arg Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Ser Thr Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
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100 105 110
<210> 108
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
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1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Asn His Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
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Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Thr Tyr
20 25 30
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<223> 人工合成序列
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工合成序列
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工合成序列
<400> 112
tgagttccac gacaccgtca c 21
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<211> 122
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<213> 智人
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Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly His
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Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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<213> 智人
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Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Asp Tyr
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50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
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Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Asp Tyr
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Met Ile Tyr Gln Val Ser Lys Lys Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
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Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
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Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Gly Tyr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Asp Tyr
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Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Met Ile Tyr Gln Val Ser Lys Lys Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Arg Thr Ala Asn
85 90 95
Ala Gly Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Ala Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Arg Leu Asn Ser His Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 122
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Phe Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Gln Gly Ser Lys Lys Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
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100 105 110
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<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<400> 124
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Asp Tyr
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<400> 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
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<213> 智人
<400> 126
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Thr Tyr
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Arg Ala Ile Thr
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Arg Gly Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110

Claims (19)

1.含有抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法，其中所述方法包括：通过比较在不同浓度的靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性，选择抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域，所述靶组织特异性化合物是低分子化合物且不是生物高分子。
2.权利要求1的方法，所述方法包括：
(a)测定靶组织特异性化合物的第一浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
(b)测定靶组织特异性化合物的第二浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性，其中所述第二浓度与所述第一浓度不同；和
(c)选择所述化合物的第一浓度存在下的抗原结合活性与所述化合物的第二浓度存在下的抗原结合活性不同的抗原结合结构域。
3.权利要求2的方法，其中所述第二浓度比所述第一浓度高，且在(c)中选择的抗原结合结构域是所述化合物的第二浓度存在下的抗原结合活性比所述化合物的第一浓度存在下的该抗原结合结构域的抗原结合活性高的抗原结合结构域。
4.权利要求3的方法，其中所述第一浓度为零。
5.权利要求1的方法，所述方法包括：
(a)在靶组织特异性化合物的第一浓度存在下使抗原结合结构域或者抗原结合结构域的文库与抗原接触；
(b)将在(a)中与抗原结合的抗原结合结构域暴露于靶组织特异性化合物的第二浓度，其中所述第二浓度与所述第一浓度不同；和
(c)选择(b)中与抗原解离的抗原结合结构域。
6.权利要求5的方法，其中所述第二浓度比所述第一浓度低。
7.权利要求6的方法，其中所述第二浓度为零。
8.权利要求1的方法，所述方法包括：
(a)在靶组织特异性化合物的第一浓度存在下使抗原结合结构域或者抗原结合结构域的文库与抗原接触；
(b)选择在(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
(c)在靶组织特异性化合物的第二浓度存在下使(b)中选择的抗原结合结构域与抗原接触，其中所述第二浓度与所述第一浓度不同；和
(d)选择(c)中与抗原结合的抗原结合结构域。
9.权利要求8的方法，其中所述第二浓度比所述第一浓度高。
10.权利要求9的方法，其中所述第一浓度为零。
11.权利要求1至10中任一项的方法，所述方法包括：
(i)培养用载体转染的细胞，该载体可操作地连接有编码所选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
(ii)从(i)中培养的细胞的培养基收集含有抗原结合结构域的抗原结合分子。
12.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述抗原结合分子含有抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)。
13.权利要求12的方法，其中所述抗原结合分子为抗体片段。
14.权利要求1至10和13中任一项的方法，其中所述靶组织是癌组织。
15.权利要求14的方法，其中，所述靶组织特异性化合物是癌组织特异性化合物，其中所述癌组织特异性化合物选自由以下组成的组：癌细胞特异性代谢产物、浸润于癌组织的免疫细胞特异性代谢产物、和癌组织的基质细胞特异性代谢产物。
16.权利要求1至10和13中任一项所述的方法，其中，所述靶组织是炎性组织。
17.权利要求16的方法，其中，所述靶组织特异性化合物是炎性组织特异性化合物，其中所述炎性组织特异性化合物是浸润于炎性组织的免疫细胞特异性代谢产物、或在炎性组织中受伤害的正常细胞特异性代谢产物。
18.权利要求1至10、13、15和17中任一项的方法，其中，所述靶组织特异性化合物是选自下述中的至少一种化合物：具有嘌呤环结构的核苷、氨基酸及其代谢产物、脂质及其代谢产物、糖代谢的一次代谢产物、和烟酰胺及其代谢产物。
19.权利要求1至10、13、15和17中任一项的方法，其中，所述靶组织特异性化合物是选自下述中的至少一种化合物：腺苷、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、肌苷、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、犬尿氨酸、前列腺素E2、琥珀酸、柠檬酸、和1-甲基烟酰胺。
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