JP2007507206A - 幹細胞の増幅調節のための方法および組成物 - Google Patents

幹細胞の増幅調節のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、造血幹細胞のような幹細胞の増幅を調節する方法および物質を提供する。したがって、本発明は、造血幹細胞、生殖幹細胞、神経幹細胞のような幹細胞の増幅を調節するための方法であって、（Ａ）幹細胞に、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を提供する工程；および（Ｂ）該幹細胞を、該増幅を調節するに十分な時間培養する工程、を包含する、方法を提供する。

Description

（発明の分野）
本発明は、幹細胞の分野にある。より詳細には、本発明は、組織幹細胞（例えば、神経幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞）の増幅を調節する技術およびそれを応用した治療に関する。さらに詳細には、本発明は、幹細胞の分化促進、または増幅（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）またはその多能性（もしくは未分化性のレベル）もしくは自己複製能を維持するための組成物、方法およびキットに関する。本発明はまた、そのような方法を用いて調製された幹細胞（特に、造血幹細胞、神経幹細胞、生殖幹細胞）にも関する。
（発明の背景）
再生医学（再生医療）による疾患治療が最近注目を浴びている。しかし、これを臓器ないし組織機能不全を呈する多くの患者に対して日常的に適応するまでには至っていない。現在まで、そのような患者の治療として、臓器移植のほか、医療機器での補助システムの利用がごく限られた患者に適応されているにすぎない。しかし、これらの治療法には、ドナー不足、拒絶、感染、耐用年数などの問題がある。特に、ドナー不足は深刻な問題であり、骨髄移植の場合、国内外で骨髄ないし臍帯血バンクが次第に充実してきたといっても、限られたサンプルを多くの患者に提供することが困難である。従って、これらの問題を克服するために幹細胞治療とその応用を中心とした再生医学に対する期待がますます高まっている。
造血幹細胞の増幅および分化は、再生医療において重要課題のひとつであり、幹細胞を理解すること、およびその機構を理解した上での疾患の処置において非常に重要な役割を果たすと考えられており、近年その研究が進んでいる。
したがって、幹細胞（特に、造血幹細胞、神経幹細胞、生殖幹細胞）の増幅および分化を調節する、特に増幅を促進する因子の同定は、いまだに当業者が待ち焦がれている解決されていない課題のひとつである。
再生医学においては、器官・臓器の再構築が最重要となる。この場合、大きく分けて生体外で器官を構築し人工器官として用いる方法と、生体内で器官を再構築させる方法とがある。いったん幹細胞が得られたとしても、制御された再生方法が利用可能でない限り、その応用方法は制限される。
一方、幹細胞に遺伝子を導入し、その幹細胞を移植することによって遺伝子治療を行う試みが始まっている。例えば、Ｘ連鎖性重症複合免疫不全症の患者にＩＬ−２受容体γ鎖を導入した幹細胞（ＣＤ３４陽性骨髄細胞）を移植することによって臨床症状が改善することが報告されている（非特許文献１）。しかし、幹細胞に遺伝子を導入することによって、増幅を調節した例はほとんど知られていない。
幹細胞の増幅および分化を調節する機構として種々のタンパク質が重要な役割を果たす。例えば、幹細胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒまたはｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦともいう）は、造血幹細胞では注目されている因子である。
ＳＣＦは、骨髄ストロマ細胞により生成され、多能性幹細胞および骨髄系細胞、リンパ系前駆細胞に作用し、これらの増幅および分化を支持する。すなわち造血幹細胞から前駆細胞に作用して、他のサイトカインによる最終分化段階への分化誘導する作用を助けるとされる（非特許文献２）。
しかし、ＳＣＦ単独の作用は弱く、他の因子と協働でなければ充分に機能しないようである。例えば、ＳＣＦは、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの他のサイトカインの存在下で、造血幹細胞の分化・増殖を強く誘導する。また、肥満細胞、赤芽球系前駆細胞、顆粒球マクロファージ系前駆細胞、巨核球系前駆細胞などの分化・増殖も誘導する。
従って、ＳＣＦは増幅および分化そのものを制御するというよりは、多くの種類の造血系細胞の生存を支持しながら、種々のサイトカインに対する反応性を高めると位置づけることができる。
トロンボポイエチン（ＴＰＯ）もまた注目されている。この因子は、巨核球系の分化と血小板産生を支持するが、幹細胞にも作用しその増幅および分化を誘導する。また、幹細胞の自己複製にも関与することが分かっている。
このように、従来の因子では、幹細胞の分化を制御不能に促進することはなしえても、制御可能に分化促進を行うことはできないという問題点があった。
Ｂｍｉ−１という因子が注目されている。しかし、この因子の性状解析は始まったばかりで、外来的に加えたときの効果は知られていない。
Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００）２８８：６６９−６７２ 北村聖（Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ）（平野俊夫（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ）編）「サイトカインの最前線」、羊土社（２０００年）、１７４頁〜１８７頁
（発明の要旨）
上記課題は、本発明者らが、Ｂｍｉ−１が造血幹細胞、生殖幹細胞、神経幹細胞のような幹細胞を増幅（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）させる機能を有することを予想外に発見したことによって、解決された。
Ｐｏｌｙｃｏｍｂ Ｇｒｏｕｐ（ＰｃＧ）遺伝子Ｂｍｉ−１は、機能喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）分析を用いて、造血幹細胞（ＨＳＣ）の維持に関連しているとされてきた。本明細書において、本発明者らは、Ｂｍｉ−１の増大した発現が、ＨＳＣの自己再生を促進することを実証する。Ｂｍｉ−１の強制（誘導）発現は、ＨＳＣの対称細胞分裂を増進し、細胞分裂を通して幹細胞特性の遺伝の高い可能性を媒介した。同様に、Ｂｍｉ−１の強制発現は、他のＰｃＧ遺伝子と異なり、多能性前駆細胞のエキソビボでの著しい増幅、およびインビボでのＨＳＣ再増殖能の著しい増強を生じた。機能喪失分析は、ＰｃＧ遺伝子のうち、Ｂｍｉ−１が無いことが、ＨＳＣの自己再生における重大な欠損と特に関連していることを示した。本発明者らの知見は、Ｂｍｉ−１をＨＳＣの自己再生において中心的な役割を果たすものと定義し、そしてＢｍｉ−１がＨＳＣの治療的操作のための新規標的であることを実証する。
本発明において、機能喪失分析および機能獲得分析の両方が、インビトロおよびインビボ両方におけるＨＳＣの自己再生の維持、およびエキソビボでのＨＳＣ活性の増強における、他の成分ではない、Ｂｍｉ−１の中心的役割を明らかにした。本発明者らの知見は、Ｂｍｉ−１の発現レベルが、ＨＳＣの自己再生能に対する最も重要な決定因子であることを示唆する。
本発明の一つの局面によると、幹細胞の増幅を調節するための方法が提供される。この方法は、
（Ａ）幹細胞に、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を提供する工程；および
（Ｂ）上記幹細胞を、上記増幅を調節するに十分な時間培養する工程、
を包含する。
本発明の一つの実施形態において、上記増幅の調節は、増幅促進である。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、外因性または内因性である。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、外因性である。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、核酸形態および／またはタンパク質形態である。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、
（ａ）配列番号１または３に記載の核酸配列（それぞれ、アクセッション番号Ｌ１３６８９またはＭ６４２７９）もしくはそのフラグメントによってコードされる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する、改変体ポリペプチド；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、
（ａ）配列番号１または３に記載の塩基配列（それぞれ、アクセッション番号Ｌ１３６８９またはＭ６４２７９）またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列を有し、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、低分子、脂質分子、糖鎖分子、およびそれらの複合分子からなる群より選択される。
本発明の一つの実施形態において、上記幹細胞は、造血幹細胞、生殖幹細胞および神経幹細胞からなる群より選択される幹細胞を含む。
本発明の一つの実施形態において、造血、生殖または神経系に関連する疾患、障害または異常状態を調節するための方法であって、
（Ａ）幹細胞の増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を被検体に提供する工程；および
（Ｂ）上記被検体を、上記増幅を調節するに十分な時間インキュベートする工程、
を包含する。
本発明の一つの局面によると、幹細胞の増幅を調節するための組成物が提供される。この組成物は、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を含む。
本発明の一つの実施形態において、上記増幅の調節は、増幅促進である。
本発明の一つの実施形態において、上記幹細胞は、造血幹細胞、生殖幹細胞および神経幹細胞からなる群より選択される幹細胞を含む。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、
（ａ）配列番号１または３に記載の核酸配列（それぞれ、アクセッション番号Ｌ１３６８９またはＭ６４２７９）もしくはそのフラグメントによってコードされる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する、改変体ポリペプチド；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、
（ａ）配列番号１または３に記載の塩基配列（それぞれ、アクセッション番号Ｌ１３６８９またはＭ６４２７９）またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１は、Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８またはＭ３３と複合体を形成する。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１は、Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８およびＭ３３と複合体を形成する。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、恒常的に活性型である。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、一過的に活性型である。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１は、配列番号１に記載の配列（アクセッション番号Ｌ１３６８９）からなる。
本発明の一つの実施形態において、上記組成物は、さらなる細胞生理活性物質を含む。
本発明の一つの実施形態において、上記細胞生理活性物質は、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ−３Ｌからなる群より選択される因子を含む。
本発明の一つの実施形態において、上記組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１調節因子は、Ｂｍｉ−１の活性化因子を含む。
本発明の一つの実施形態において、Ｂｍｉ−１のプロモーターの活性を上げる因子またはＢｍｉ−１を含むＰｃＧ複合体に結合しその機能を増強する因子をさらに含む。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、タンパク質または複合タンパク質形態をとる。
本発明の一つの実施形態において、上記Ｂｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、核酸形態をとる。
本発明の一つの実施形態において、上記核酸形態のＢｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、ベクターに含まれる。
本発明の一つの実施形態において、上記ベクターは、レトロウイルスベクターである。
本発明の別の局面によると、造血、生殖および神経系に関連する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための方法が提供される。この方法は、処置または予防するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を、そのような調節を必要とする被検体に投与する工程、を包含する。
本発明の別の局面によると、造血、生殖および神経系に関連する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための薬学的組成物が提供される。この薬学的組成物は、処置または予防するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を含む。
本発明の別の局面によると、幹細胞の増幅を調節するためのキットが提供される。このキットは、
（Ａ）増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を含む組成物；および
（Ｂ）上記組成物を幹細胞へ提供し、造血幹細胞を培養することを指示する指示書、
を備える。
本発明の別の局面によると、幹細胞の増幅を調節するための、Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子の使用が提供される。
本発明の別の局面によると、幹細胞系列の増幅細胞を生産するための方法が提供される。この方法は、
（Ａ）幹細胞または始原細胞を提供する工程；
（Ｂ）上記幹細胞または始原細胞に、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を提供する工程；および
（Ｃ）上記幹細胞を、上記増幅を調節するに十分な時間培養する工程、
を包含する。
本発明の一つの実施形態において、上記幹細胞は、造血系、生殖系および神経系からなる群より選択される。
本発明の別の局面によると、上に記載の方法によって得られた細胞が提供される。
本発明の別の局面によると、上に記載の方法によって得られた細胞から得られた組織が提供される。
本発明の別の局面によると、上に記載の方法によって得られた細胞から得られた臓器が提供される。
本発明の別の局面によると、上に記載の方法によって得られた細胞を含む、医薬が提供される。
本発明の別の局面によると、幹細胞またはそれに由来する増幅細胞を必要とする疾患または障害を処置または予防するための方法が提供される。この方法は、
Ａ）上に記載の方法によって得られた細胞をそのような処置または予防を必要とする被検体に投与する工程、
を包含する。
本発明の別の局面によると、上に記載の方法によって得られた細胞の、幹細胞またはそれに由来する増幅細胞を必要とする疾患または障害を処置または予防するための使用が提供される。
本発明の別の局面によると、幹細胞の増幅を調節するための因子をスクリーニングするための方法が提供される。この方法は、
Ａ）上記因子の候補物質を提供する工程；
Ｂ）上記物質をＢｍｉ−１を含む細胞に曝露する工程；および
Ｃ）上記Ｂｍｉ−１が調節されたかどうかを決定する工程であって、上記Ｂｍｉ−１が調節された場合、上記物質を幹細胞の増幅調節因子であると判断する、工程、
を包含する。
本発明の別の局面によると、上に記載の方法によって得られる、造血幹細胞の増幅調節因子が提供される。
本発明の作用および効果は、添付の図面を参照にしながら、以下の詳細な説明から当業者に明らかであることが理解される。
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「Ｂｍｉ−１」とは、オンコジーンの一種として同定された因子であり、すなわち、Ｐｏｌｙｃｏｍｂ Ｇｒｏｕｐ（ＰｃＧ）ファミリーのメンバーとして同定された。代表的なＢｍｉ−１としては、配列番号１および３（アクセッション番号：Ｌ１３６８９（ヒト）およびＭ６４２７９（マウス）＝核酸配列）および２および４（それぞれヒトおよびマウス＝アミノ酸配列）に示されるような配列を有する因子および他の種の動物において対応する因子（オルソログ）が挙げられるがそれに限定されない。Ｂｍｉ−１は、例えば、図１に示されるように、Ｎ末端にリングフィンガー（Ｒｎｆ）と呼ばれるＢｍｉ−１の核内における局在の場の決定に関与する配列を有する。このような配列は、代表的に、Ｃ−Ｘ−（Ｉ，Ｖ）−Ｃ−Ｘ１１−３０−Ｃ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−（Ｆ，Ｉ，Ｌ）−Ｃ−Ｘ２−Ｃ−（Ｉ，Ｌ，Ｍ）−Ｘ１０−１８−Ｃ−Ｐ−Ｘ−Ｃという特徴的な配列を有する。また、Ｂｍｉ−１は、ほぼ中央部（図１に示す配列番号２および４の配列では、およそ１６５位−２２０位）にＨＴＨＴＨＴで代表的に示されるヘリックスターン部分があり、この部分がＭｐｈ−１／Ｒａｅ２８と相互作用することが特徴である。したがって、代表的なＢｍｉ−１は、Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８と相互作用することを特徴とする。Ｂｍｉ−１はまた、代表的にＣ末端にＰｒｏ／Ｓｅｒ（プロリン、セリンがリッチな配列）を有する（図１に示す配列番号２および４の配列では、およそ２４８位−３２４位）。ＰｃＧは、悪性形質転換、リンパ球発生、神経学的発達、および線維芽細胞の老化などに連鎖している（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｇｔ、Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８，７５７−７６９（１９９４）；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９１，１２１６−１２２４（１９９９）；Ｋｉｙｏｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３９６，８４−８８）１９９８）；およびｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｇｔ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．５８，１５３−１６４（１９９６））。Ｂｍｉ−１の発現は造血細胞の発達とともに減少するとされている。ＰｃＧグループの因子は、シス作用性ＤＮＡエレメントを結合し、ヒストンデアセチラーゼを補充し、および／またはクロマチン構造を変化させることが特徴である。このようにＢｍｉ−１は、ＰｃＧ複合体を形成することが知られている。
細胞型特異的遺伝子発現パターンは、クロマチン構造における変化により安定化される。クロマチン修飾の細胞記憶は、トリソラックス（ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）群（ＴｒｘＧ）の転写活性化因子ならびにｐｏｌｙｃｏｍｂ ｇｒｏｕｐ（ＰｃＧ）のタンパク質およびリプレッサーの反作用により、連続する細胞周期を通じて忠実に維持される（Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６０２，１５１−１６１，２００２；Ｏｒｌａｎｄ，Ｖ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３，２４２−２４５，２００３）。ＰｃＧタンパク質は、標的遺伝子の転写抑制の維持に重要な役割を果たす多重タンパク質複合体を形成する。少なくとも２種の異なるＰｃＧ複合体が、同定および十分に特徴付けされている。一方の複合体はＥｅｄ、ＥｚＨ１およびＥｚＨ２を含み、他方はＢｍｉ−１、Ｍｅｌ−１８、Ｍｐｈ１／Ｒａｅ２８、Ｍ３３、Ｓｃｍｈ１およびＲｉｎｇ１Ａ／Ｂを含む。Ｅｅｄ含有複合体は、ヒストン脱アセチル化酵素の補充、その後の局所的クロマチン脱アセチル化、およびＥｚＨ２によるヒストンＨ３リジン２７のメチル化により、遺伝子抑制を制御する。対照的に、Ｂｍｉ−１含有複合体に関しては、酵素活性は未だ何も報告されていない。しかし、Ｂｍｉ−１複合体は、上記ＳＷＩ−ＳＮＦ複合体によるクロマチンリモデリングをアンタゴナイズし（Ｓｈａｏ，Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ９８，３７−４６．，１９９９）、そしてＭ３３クロモドメインによりメチル化ヒストンＨ３リジン２７に補充され、後生的な記憶の静的な維持に寄与する（Ｆｉｓｃｈｌｅ，Ｗ．ら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １７，１８７０−１８８１，２００３）。これら２種の型の複合体は、発生の間のＨｏｘ遺伝子発現パターンを調節することにより、前後軸に沿う位置的な記憶を協調的に維持する（Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１６０２，１５１−１６１，２００２；Ｏｒｌａｎｄ，Ｖ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３，２４２−２４５，２００３）。他方において、これら２種の型の複合体は、最終的な造血において相反的な役割（上記Ｅｅｄ含有複合体による負の調節およびＢｍｉ−１含有複合体による正の調節）を果たす（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３，２６９１−２７０３，１９９９）。
上記Ｂｍｉ−１含有複合体は、造血幹細胞および白血病性幹細胞の維持に関係する（Ｏｈｔａ，Ｈ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９５，７５９−７７０，２００２；Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２３，２５５−２６０，２００３）。Ｍｐｈ１／Ｒａｅ２８−／−胎仔肝臓は、野生型よりの２０分の１の長期的リンパ造血性再増殖ＨＳＣを含む（Ｏｈｔａ，Ｈ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９５，７５９−７７０，２００２）。より重要なことに、Ｂｍｉ−１−／−マウスは胚性造血の正常な発生を示すが、Ｂｍｉ−１−／− ＨＳＣは自己複製能力における重大な欠損を有する。それらは、長期的に骨髄（造血）を再増殖し得ず、これが進行性出生後汎血球減少症につながる（Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｇｔ，Ｎ．Ｍ．，ら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．８，７５７−７６９，１９９４）。特に、その自己再生欠損はＨＳＣに限定されず、白血病性幹細胞および神経幹細胞にも適用可能である（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ ４２３，２５５−２６０，２００３；Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｖ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２５，９６２−９６７，２００３）。現在までのところ、ＨＳＣの欠損性自己複製は、Ｂｍｉ−１標的遺伝子であるｐ１６Ｉｎｋ４ａおよびｐ１９Ａｒｆの脱抑制に起因し、そしてこれらの遺伝子の欠損が、Ｂｍｉ−１−／−幹細胞における自己複製欠損を部分的に回復する（Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｇｔ，Ｎ．Ｍ．，ら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８，７５７−７６９，１９９４；Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｖ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２５，９６２−９６７，２００３；Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９７，１６４−１６８，１９９９）。より最近は、Ｂｍｉ−１はまた、小脳顆粒細胞前駆体の増幅に必須であると報告され、ここでＢｍｉ−１発現は、ソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路により、報告のように調節される（Ｌｅｕｎｇ，Ｃ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２８，３３７−３４１，２００４年４月）。これらの知見の全てが、後生的な修飾による幹細胞調節の新規な局面を明らかにする。しかし、Ｂｍｉ−１−／−マウスにおけるＨＳＣの欠損はまだ、インビトロおよびインビボでのクローンレベルにおいて詳細には特徴付けされていない。さらに、上記ＰｃＧ複合体の各成分の役割ならびにＨＳＣ自己再生に対するＢｍｉ−１の強制発現または誘導発現の影響を含む重要な疑問が残っている。
Ｂｍｉ−１は、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ１９ＡＲＦの発現を負に制御することが知られており、例えば、Ｊａｃｏｂｓ，ＪＪＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９７，１６４−１６８，１９９９に記載されている。したがって、ある因子がインビトロ実験でＢｍｉ−１またはＢｍｉ−１の等価物であるかどうかを決定するには、このようなｐ１６、ｐ１９などの発現細胞のｐ１６、ｐ１９のｍＲＮＡの発現を抑制することをアッセイすることによって、確認することができる。
Ｂｍｉ−１は、ヒト、ラットおよびマウスなどを含む哺乳動物のほか、ショウジョウバエなどでもそのホモログが知られている。従って、本明細書においてＢｍｉ−１は、通常、哺乳動物のほか、生物一般において存在するＢｍｉ−１を指す。
Ｂｍｉ−１には、哺乳動物などではＭｅｌ−１８という非常に類似した分子が存在することが知られる。本発明では、そのような類似した分子が存在する場合、どちらの分子でも同様の作用を有することが企図される。ある好ましい実施形態では、配列番号５および７（ヒトおよびマウス、核酸配列）、配列番号６および８（ヒトおよびマウス、アミノ酸配列）（アクセッション番号は、ヒトではＮＭ−００７１４およびマウスではＤ９００８５）で示される配列が使用され得る。
本明細書において「活性型Ｂｍｉ−１」とは、Ｂｍｉ−１が活性状態にあるものをいい、他のＰｃＧ遺伝子産物（例えば、Ｒａｅ２８／Ｍｐｈ１、Ｍ３３など）と複合体を形成し、シス作用性ＤＮＡエレメントに結合し、ヒストンデアセチラーゼを補充し、クロマチン構造を変化させる能力を有する分子をいう。そのような活性型Ｂｍｉ−１は、代表的にはＲａｅ２８／Ｍｐｈ１またはＭ３３と複合体化していること、好ましくはＲａｅ２８／Ｍｐｈ１およびＭ３３と複合体化していることが特徴である。
本明細書において「Ｍ３３」とは、ＰｃＧ遺伝子産物の一種であり、Ｂｍｉ−１と相互作用し、代表的に配列番号１３（ヒト核酸）、１４（ヒトアミノ酸）、１５（マウス核酸）、１６（マウスアミノ酸）で示す配列を有する。
本明細書において「Ｒａｅ２８」または「Ｍｐｈ１」とは、交換可能に用いられ、代表的に配列番号配列番号９（アクセッション番号 ＮＨ＿００４４２６；ヒト核酸）、１０（ヒトアミノ酸）、１１（アクセッション番号 Ｕ５３３８６；マウス核酸）、１２（マウスアミノ酸）で示す配列を有する。この遺伝子はまた、Ｒａｅ２８／Ｍｐｈ１とも称される。
活性型Ｂｍｉ−１は、人工的に作製するか、または合成することなどにより作製することもできる。そのような人工的に作製されたＢｍｉ−１としては、細胞内で他のＰｃＧ遺伝子産物と恒常的に複合体化し得る構造を有するＢｍｉ−１が挙げられる。そのような活性型Ｂｍｉ−１としては、例えば、他のＰｃＧ遺伝子産物との複合体が挙げられるがそれに限定されない。
別の実施形態では、活性型Ｂｍｉ−１は、低分子化合物（例えば、コンビナトリアルライブラリーの生成物）であり得る。当業者であれば、容易にそのような低分子化合物をスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニングは、本明細書において記載されるように、他のＰｃＧ遺伝子産物との複合体化能を検出することにより行うことができる。
本明細書において、本発明のＢｍｉ−１は、天然に存在するＢｍｉ−１が有する機能を有する限り、どのような分子でもよい。そのような機能としては、例えば、Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８と複合体を形成し、核に局在化する能力などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、活性型Ｂｍｉ−１は、天然に存在するＢｍｉ−１複合体が有する機能を有する限り、どのような分子でもよい。ある因子が活性型Ｂｍｉ−１であるかどうかは、Ｂｍｉ−１の候補因子が他のＰｃＧ遺伝子産物と形成する複合体がシス作用性ＤＮＡエレメントに結合するかどうか、ヒストンデアセチラーゼを補充するかどうかおよび／またはクロマチン構造を変化させるかどうかを有することを判定することによって、判断することができる。具体的には、核移行はその因子が核酸分子である場合、Ｂｍｉ−１遺伝子を細胞にトランスフェクトし、抗Ｂｍｉ−１抗体を用いて免疫染色し、核への局在を確認することで判定することができる。あるいは、他のＰｃＧ遺伝子産物に対する抗体を用いて、候補因子をトランスフェクトした細胞の免疫染色および核への局在化を確認することによっても判定することができる。そのような因子がタンパク質などの場合は、直接細胞内に導入し、その後、核内にそのような因子が移行するかどうかを、その因子に特異的な抗体を用いて免疫染色することによって確かめることができる。そのような技術は、当該分野において周知である。
抗体がＭｐｈ−１／Ｒａｅ２８に結合する能力を判断するために、細胞内での結合を以下の通りに調べる。Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８を発現可能な細胞にある因子をトランスフェクションした後、核抽出液を精製し、Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８あるいはＢｍｉ−１に対する抗体で得られる免疫沈降物中にＢｍｉ−１あるいはＭｐｈ−１／Ｒａｅ２８が共沈物として確認することによって判定することができる。通常は、複合体の形成が有意に確認することができれば、その因子は、天然にあるＢｍｉ−１と少なくとも一つの同一の機能を有すると判断することができる。
活性型Ｂｍｉ−１であるかどうかを判断するには、以上の少なくとも１つで有意な活性が判定することができることで十分である。
Ｂｍｉ−１は、Ｈｏｘ遺伝子発現において重要な役割を果たし、胎児発生期において、前後軸のパターン化において役割を果たすといわれる。Ｂｍｉ−１の発現は、造血幹細胞において見出されており、造血幹細胞における役割が期待されるが、外部から加えた場合の効力はなんら知られていない。本発明は、Ｂｍｉ−１が活性化されることにより、Ｔ細胞・Ｂ細胞等の免疫細胞、造血細胞、肝細胞、神経細胞に対して、増殖・分化・細胞死の抑制など多種多様なシグナルを細胞内へ伝えることを実証した。従って、本発明では、活性型Ｂｍｉ−１を生成するような条件を提供することによっても、同様の効果を達成することができることが企図される。
本明細書において「恒常性」の活性型Ｂｍｉ−１とは、特に何も刺激しない場合には、活性型Ｂｍｉ−１の機能を保持するものをいう。これに対し、「一過性」の活性型Ｂｍｉ−１とは、ある一定期間のみ活性型Ｂｍｉ−１の機能を発揮するものをいう。恒常性の活性型Ｂｍｉ−１には、例えば、複合体として安定に存在するように改変されたＢｍｉ−１および種相同体における対応する配列が同様の改変体（例えば、ヒトホモログなど）が挙げられるがそれに限定されない。
本明細書において、「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。
本発明において用いられる活性型Ｂｍｉ−１について、糖鎖が付加され得る部分としては、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどが結合するＮ−グルコシド結合可能な部分、およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合をする部分（セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分）が挙げられる。本明細書において使用されるＢｍｉ−１または活性型Ｂｍｉ−１は、糖鎖の有無は特に活性に影響を与えるというわけではないが、これらの糖鎖が付加されたタンパク質は、通常生体内での分解に対して安定であり、強い生理活性を有し得る。従って、これら糖鎖が付加されたポリペプチドもまた、本発明の範囲内にある。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が挙げられる。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または複数のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。このようなポリペプチド形態の本発明の遺伝子産物は、本発明の診断、予防、治療または予後のための組成物として有用である。言い換えると、本発明は、本発明の診断、予防、治療または予後の実施形態において組成物として有用である。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１または複数の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。本発明の遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。このようなポリヌクレオチド形態の本発明の遺伝子または遺伝子産物は、本発明の診断、予防、治療または予後のための組成物として有用である。
本明細書では「核酸分子」もまた、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」と互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、本発明の遺伝子には、そのスプライス変異体もまた包含され得る。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。遺伝子は、通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、Ｂｍｉ−１の遺伝子などというときは、通常、構造遺伝子ならびにそのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列を包含する。本発明では、構造遺伝子のほか、転写および／または翻訳などの調節配列もまた、神経再生、神経疾患の診断、治療、予防、予後などに有用であることが理解される。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
本明細書において用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。従って、本明細書においてマウスＢｍｉ−１における特定のアミノ酸配列は、アラインメントなどの解析によって、ヒトＢｍｉ−１における特定のアミノ酸に対して対応付けることができる。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスのＢｍｉ−１などの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスのＢｍｉ−１などの遺伝子）の配列をクエリー配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能（例えば、他の分子との特異的相互作用）が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。「接触」とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
本明細書において用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらのフラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
本明細書中で使用される「モノクローナル抗体」は、同質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定されない。この用語は、全免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして以下でより十分に記載される。
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）またはその改変（例えば、Ｂｕｃｋら（１９８２）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １８：３７７）を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合したタンパク質で免疫化し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一細胞を解離する。必要に応じて、この脾臓細胞は、非特異的接着細胞の除去後、抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することにより、スクリーニングされ得る。抗原に特異的なイムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣でもリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞（すなわちすべての剥離した脾臓細胞）をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを得、このハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生させる。
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。
本明細書において「単鎖抗体」とは、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがペプチド架橋を介して連結されることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じたものをいう。
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、「発現」とは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチド（例えば、Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントなど）の発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチド（例えば、Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントなど）の発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。このような遺伝子または遺伝子産物（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）の発現の増加または減少は、本発明の治療形態、予後形態または予防形態において有用であり得る。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。「特異的に発現する」とは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは「特異的に発現する」とは、ある部位においてのみ発現することをいう。したがって、本発明において、ある実施形態では、罹患した箇所（例えば、神経）に局所的にＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントなどを特異的に発現させてもよい。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、２つの因子が相互作用する（例えば、Ｂｍｉ−１とその特異的因子とが結合する）場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。具体的には、ＭｐｈＩ／Ｒａｅ−２８との複合体を形成することを、例えば、免疫沈降法により確認することなどを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。このような活性は、Ｂｍｉ−１に対する特異的因子の結合の競合阻害のようなアッセイによって測定され得る。
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ（アデニン）配列のみまたはＴ（チミン）配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。
なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１（アクセッション番号；Ｌ１３６８９）などの核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましいＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１または３に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用されるＢｍｉ−１などには、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−２４４８、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
（１） ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２） ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３） ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４） ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５） ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列を６つの読み枠で変換したものを、ヌクレオチド配列データベースと比較。
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリー配列または核酸のクエリー配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータープログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原決定基をいう。エピトープは、必ずしもその正確な位置および構造が判明していないとしても使用することができる。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは線状であってもコンフォメーション形態であってもよい。
（遺伝子、タンパク質分子、核酸分子などの改変）
あるタンパク質分子（例えば、Ｂｍｉ−１など）において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
親水性指数もまた、本発明のアミノ酸配列を改変するのに有用である。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体の例としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子改変体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを少なくとも１つ、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に少なくとも１つ、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから少なくとも１つ、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
本発明のポリペプチドがポリマーに結合している、化学修飾されたポリペプチド組成物は、本発明の範囲に包含される。このポリマーは、水溶性であり得、水溶性環境（例えば、生理学的環境）でこのタンパク質の沈澱を防止し得る。適切な水性ポリマーは、例えば、以下からなる群より選択され得る：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。この選択されたポリマーは、通常は改変され、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有し、その結果、重合度は制御され得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして、このポリマーは分枝状でも分枝状でなくてもよく、そしてこのようなポリマーの混合物はまた、使用され得る。この化学修飾された本発明のポリマーは、治療用途に決定付けられる場合、薬学的に受容可能なポリマーが使用するために選択される。
このポリマーがアシル化反応によって改変される場合、このポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。あるいは、このポリマーが還元アルキル化によって改変される場合、このポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。好ましい反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコール、プロピオンアルデヒド（このプロピオンアルデヒドは、水溶性である）または、そのモノＣ１〜Ｃ１０の、アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと）。
本発明のポリペプチドのペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知の、任意のペグ化反応によって実施され得る：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３，４−１０（１９９２）；ＥＰ ０ １５４ ３１６ ；およびＥＰ ０ ４０１ ３８４（これらの各々は、本明細書中で、全体が参考として援用される）。好ましくは、このペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本発明のポリペプチド（例えば、Ｂｍｉ−１、Ｍｅｌ−１８、Ｍ３３、Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８など）のペグ化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、ＰＥＧの任意の形態の包含することを意味し、ここで、このＰＥＧは、他のタンパク質（例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アリールオキシポリエチレングリコール）を誘導体するために使用される。
本発明のポリペプチドの化学誘導体化を、生物学的に活性な物質を活性化したポリマー分子と反応させるのに使用される適切な条件下で、実施され得る。ペグ化した本発明のポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する：（ａ）Ｂｍｉ−１が１以上のＰＥＧ基に結合するような条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの、反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とこのポリペプチドを反応させる工程および（ｂ）この反応生成物を得る工程。公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者に容易である。
ペグ化された本発明のポリペプチドは、一般に、本明細書中に記載のポリペプチドを投与することによって、緩和または調節され得る状態を処置するために使用され得るが、しかし、本明細書中で開示された、化学誘導体化された本発明のポリペプチド分子は、それらの非誘導体分子と比較して、さらなる活性、増大された生物活性もしくは減少した生物活性、または他の特徴（例えば、増大された半減期または減少した半減期）を有し得る。本発明のポリペプチド、それらのフラグメント、改変体および誘導体は、単独で、併用して、または他の薬学的組成物を組み合わせて使用され得る。これらのサイトカイン、増殖因子、抗原、抗炎症剤および／または化学療法剤は、徴候を処置するのに適切である。
同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
（遺伝子工学）
本発明において用いられるＢｍｉ−１などならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を標的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいウイルス粒子としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
従って、本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ，４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え哺乳動物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、発生的に調節されたプロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３，５３７−５４６））、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１，２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３，２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８，７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３，７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３，７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開番号２６４，１６６）が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１などが例示される。
本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７など、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙなど、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。
本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 前出（特にＵｎｉｔｓ ９．９−９．１４）などに記載されるように、当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズして胚性幹細胞を単一細胞懸濁物（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）にした後、ウイルス産生細胞（ｖｉｒｕｓ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）（パッケージング細胞株＝ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）の培養上清と一緒に１〜２時間共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。
本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川 寛 監修 秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイなど）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「塩基対の」および「Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対の」という表現は、本明細書では同義に用いられ、二重らせん状のＤＮＡにおいて見られるものと同様に、アデニン残基（Ａ）が２つの水素結合によってチミン残基（Ｔ）またはウラシル残基（Ｕ）と結合し、３つの水素結合によってシトシン残基（Ｃ）とグアニン残基（Ｇ）とが結合するという配列の正体に基づいて互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照）。
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
（ポリペプチドの製造方法）
本発明のポリペプチド（例えば、Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントなど）をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のポリペプチドを採取することにより、本発明に係るポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した細胞または器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。
例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチド（例えば、Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントなど）が本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。このような融合タンパク質では、発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素およびこれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７，３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明のポリペプチドの生理活性は、公知の測定法に準じて測定することができる。
本発明において有用な可溶性ポリペプチドの産生もまた、当該分野で公知の種々の方法によって達成され得る。例えば、ポリペプチドは、エキソペプチダーゼ、エドマン分解またはその両方と組み合わせて特定のエンドペプチダーゼを使用することによるタンパク質分解によって、インタクトな膜貫通Ｂｍｉ−１ポリペプチド分子から誘導され得る。このインタクトなＢｍｉ−１ポリペプチド分子は、従来の方法を使用して、その天然の供給源から精製され得る。あるいは、インタクトなＢｍｉ−１ポリペプチドは、ｃＤＮＡ、発現ベクターおよび組換え遺伝子発現のための周知技術を利用する組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。
好ましくは、本発明において有用な可溶性ポリペプチドは、直接的に産生され、従って、出発材料としてのＢｍｉ−１ポリペプチド全体の必要性を排除する。これは、従来の化学合成技術によって達成され得るか、または周知の組換えＤＮＡ技術（ここで、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列のみが形質転換された宿主で発現される）によって達成され得る。例えば、所望の可溶性Ｂｍｉ−１ポリペプチドをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成機を使用する化学的手段によって合成され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、所望の可溶性Ｂｍｉ−１ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。所望のペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼフラグメントの単離によってか、またはｃＤＮＡからの特定の領域のＰＣＲ合成によって、全長ＤＮＡ配列から誘導され得る。
（変異型ポリペプチドの作製方法）
本発明のポリペプチド（例えば、Ｂｍｉ−１など）のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加（融合を含む）は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
１実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質または本発明のポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはこれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３７：１２３３。
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、上記）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。
（疾患）
１つの局面において、本発明は、幹細胞の増幅を適用し得る任意の疾患、障害または異常状態、例えば、生殖系の疾患、障害または異常状態、神経疾患、障害または異常状態、あるいは造血関連疾患、障害または異常状態を処置するための方法を提供する。
生殖系の疾患または障害としては、例えば、男性生殖器疾患（男性不妊、前立腺肥大症、前立腺癌、精巣癌など）、女性生殖器疾患（女性不妊、卵巣機能障害、子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮癌、子宮内膜症、卵巣癌、絨毛性疾患など）以下が挙げられるがそれらに限定されない。本発明の方法を用いて、生殖系幹細胞（例えば、精子幹細胞）を増幅することによって、これらの疾患または障害を処置または予防することができる。精子幹細胞の移植法は、例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１：１１２９８−１１３０２に記載されている。具体的には、不妊の宿主マウスの精巣に精子幹細胞をドナー細胞として移植すると、このドナーの幹細胞が宿主の精巣の中で増殖して、ドナー由来の性母細胞を得ることができる。このように、本発明は、種々の不妊の予防または治療に用いることができる。
造血関連の疾患としては、循環器系の疾患が挙げられ、例えば、血液細胞などであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、不応性貧血など）、癌または腫瘍（例えば、白血病）およびその化学療法処置後の造血不全、血小板減少症、急性骨髄性白血病（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、急性リンパ性白血病（特に、第１寛解期、第２寛解期以降の寛解期）、慢性骨髄性白血病（特に、慢性期、移行期）、悪性リンパ腫（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、多発性骨髄腫（特に、発症後早期）、先天性免疫不全症候群などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「神経疾患」または「神経学的疾患」とは、本明細書において同義で用いられ、神経の機能，構造，器官などの断絶，停止，または障害をいい、通常、次の基準のうち少なくとも２つを満たす病変をいう：１）病因物質をもつこと；２）はっきりと指摘できる徴候および／または症候群があること；３）一致した解剖学的変化があること。神経疾患としては、例えば、脳血管障害（脳出血、くも膜下出血、脳梗塞、一過性脳虚血発作、脳動脈硬化症、Ｂｉｎｓｗａｎｇｅｒ病、脳静脈洞血栓・脳静脈血栓、高血圧性脳症、側頭動脈炎、一過性全健忘、もやもや病、線維筋性形成異常症、内頚動脈海綿静脈洞瘻、慢性硬膜下血腫、アミロイドアンギオパチー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病参照）など）；脊髄血管障害（例えば、脊髄梗塞、一過性脊髄虚血、脊髄出血、脊髄血管奇形、脊髄くも膜下出血、亜急性壊死性脊髄炎など）；感染性・炎症性疾患（例えば、髄膜炎、脳炎、単純ヘルペス脳炎（ＨＳＥ）、日本脳炎、その他の脳炎、狂犬病、遅発性ウイルス感染症（例えば、亜急性硬化性全脳炎、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ病（ＣＪＤ）など）、神経Ｂｅｈｃｅｔ病、小舞踏病、ＡＩＤＳ痴呆症候群、神経梅毒、脳膿瘍、脊髄硬膜外膿瘍、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパシー（ＨＡＭ）、ポリオ）；脱髄疾患（多発性硬化症（ＭＳ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、Ｂａｌｏ同心円硬化症、炎症性汎発性硬化症、白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、Ｋｒａｂｂｅ病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、Ｃａｎａｖａｎ病（白質ジストロフィー）、Ｐｅｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ病（白質ジストロフィー）、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ病（白質ジストロフィー）など）；痴呆性疾患（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ型老年痴呆（ＳＤＡＴ）、Ｐｉｃｋ病、脳血管性痴呆、Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ病（ＣＪＤ）、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ痴呆複合、正常圧水頭症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）など）；基底核変性疾患（例えば、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ病（ＰＤ）、症候性ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ、進行性核上性麻痺（ＳＮＧ）、線条体黒質変性症、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ痴呆複合、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ病（ＨＤ）、本態性振戦、アテトーゼ、ジストニー症候群（例えば、特発性捻転ジストニー、局所性ジストニー（痙性斜頚、書痙、Ｍｅｉｇｅ症候群など）、症候性ジストニー（Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｓ病、薬剤性ジストニーなど）、Ｇｉｌｌｅｓ、ｄｅ、ｌａ、Ｔｏｕｒｅｔｔｅ症候群など）；脊髄小脳変性疾患（例えば、脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）（Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ症候群、Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病（ＭＪＤ）など）、Ｌｏｕｉｓ−Ｂａｒ症候群、Ｂａｓｓｅｎ−Ｋｏｒｎｚｗｅｉｇ症候群、Ｒｅｆｓｕｍ病、他の小脳失調症など）；運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性球麻痺（筋萎縮性側索硬化症参照）、家族性筋萎縮性側索硬化症、Ｗｅｒｄｎｉｇ−Ｈｏｆｆｍａｎｎ病（ＷＨＰ）、Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ−Ｗｅｌａｎｄｅｒ病（Ｋ−Ｗ）、球脊髄性筋萎縮症、若年性一側上肢筋萎縮症など）；脳・脊髄の腫瘍性疾患（例えば、頭蓋内腫瘍、脊髄腫瘍、髄膜癌腫症など）；機能性疾患（例えば、てんかん、慢性頭痛、失神（失神参照）、特発性頭蓋内圧亢進症、Ｍｅｎｉｅｒｅ病、ナルコレプシー、Ｋｌｅｉｎｅ−Ｌｅｖｉｎ症候群など）；中毒・代謝性疾患（例えば、薬物中毒（フェノチアジン系向精神薬中毒、鎮静・催眠薬中毒、抗生物質中毒、抗Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ病薬、抗癌薬中毒、β遮断薬中毒、Ｃａ拮抗薬中毒、クロフィブラート中毒、制吐薬中毒、スモン、サリチル酸中毒、ジギタリス中毒、麻薬中毒など）、慢性アルコール中毒（Ｗｅｒｎｉｃｋｅ脳症、Ｍａｒｃｈｉａｆａｖａ−Ｂｉｇｎａｍｉ症候群、橋中心髄鞘崩壊症など）、有機溶剤中毒、農薬中毒（例えば、有機リン剤中毒、カーバメイト剤中毒、クロルピクリン中毒、パラコート中毒など）、有機リン系神経ガス中毒、一酸化炭素中毒、硫化水素中毒、シアン化物中毒、水銀中毒な（金属水銀中毒、無機水銀中毒、有機水銀中毒など）、鉛中毒、四エチル鉛中毒、ヒ素中毒、カドミウム中毒、クロム中毒、マンガン中毒、金属熱、睡眠薬・鎮静薬中毒、サリチル酸中毒、ジギタリス中毒、麻薬中毒、食中毒（例えば、自然毒食中毒（フグ中毒、麻痺性貝毒食中毒、下痢性貝毒食中毒、シガテラ、キノコ中毒、ジャガイモ中毒など）、ビタミン欠乏症（ビタミンＡ欠乏症、ビタミンＢ１欠乏症、ビタミンＢ２欠乏症、ペラグラ、壊血病、ビタミン依存症）、リピドーシス（Ｇａｕｃｈｅｒ病、Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病など）、先天性アミノ酸代謝異常、Ｗｉｌｓｏｎ病、アミロイドーシスなど）；先天奇形（Ａｒｎｏｌｄ−Ｃｈｉａｒｉ奇形、Ｋｌｉｐｐｅｌ−Ｆｅｉｌ症候群、頭蓋底陥入症、脊髄空洞症）；神経・皮膚症候群（例えば、母斑症、ｖｏｎ−Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ病、結節性硬化症、Ｓｔｕｒｇｅ−Ｗｅｂｅｒ病、ｖｏｎ、Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ病など）；脊椎疾患（変形性脊椎症、椎間板ヘルニア、後縦靱帯骨化症など）などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「神経障害」とは、神経の機能、構造、あるいは両方の障害で、発育における遺伝、発生上の欠陥、または毒素、外傷、疾病など外因性要因に起因するものをいう。そのような神経障害としては、例えば、末梢神経障害、糖尿病性神経障害などが挙げられるがそれらに限定されない。末梢神経は各種の原因で障害されるが、原因のいかんを問わずすべての末梢神経の障害は、総称して神経障害（ニューロパシー）と呼ばれる。神経障害の原因としては、例えば、遺伝、感染、中毒、代謝障害、アレルギー、膠原病、癌、血管障害、外傷、機械的圧迫、腫瘍などが挙げられるがそれらに限定されない。神経障害の原因は、臨床では特定されないことがあるが、本発明の処置の対象にはそのような原因不明の神経障害も包含される。神経障害としては、実質性神経障害および間質性神経障害が挙げられるがそれらに限定されない。実質性神経障害とは、末梢神経の実質であるニューロン、シュワン細胞および髄鞘の少なくとも１つに病因が作用し、病変が現れたものをいい、間質性神経障害とは、間質に作用して障害が現れるものであり、物理的圧迫、血管性病変（結節性動脈周囲炎（ＰＡＮ）、膠原病など）、炎症反応、肉芽組織（例えば、癩結節、サルコイドーシスなど）による障害が挙げられるがそれらに限定されない。ニューロン全体の代謝が障害を受けると、ニューロンの末梢部から変性し、神経細胞に向けて変性が進行し、最終的に神経細胞が萎縮する（逆行性死滅神経障害）。神経障害の症候としては、運動障害、知覚障害、筋力低下、筋萎縮、反射低下、自律神経障害、およびそれらの組み合わせなどが挙げられる。本発明は、このような神経障害の処置、予防などにも有効である。
本明細書において「神経の状態」とは、神経の健常度を示す度合いをいう。そのような状態は、種々のパラメータによって表すことができる。本発明により、Ｂｍｉ−１の発現量などを測定することにより神経の状態が判定できるようになった。
本明細書中に使用される用語「中枢神経系障害」は、中枢神経系（ＣＮＳ）の異常な機能に関連する任意の病理学的状態をいう。この用語は、脳組織に対する物理的外傷、ウイルス感染、自己免疫機構および遺伝的変異から生じる、変化された中枢神経系機能を含むが、これに限定されない。
本明細書中に使用される用語「脱髄性疾患」は、稀突起膠細胞の細胞膜のミエリン鞘の変性によって特徴付けられる病理学的障害をいう。
本発明の分子および方法を使用して処置され得る例示的疾患、障害および損傷（状態）としては、大脳損傷、脊髄損傷、発作、脱髄疾患（例えば、多発性硬化症）、単語症脱髄、脳脊髄炎、多病巣性白質脳症、汎脳炎、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病、海綿状変性、アレクザンダー病、キャナヴァン病、異染性白質萎縮症およびクラッベ病が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「予防（する）」は、生物が病気にかかる（ｃｏｎｔｒａｃｔ）かまたは異常な状態を発生する可能性を減少させることをいう。
本明細書において「処置（する）」は、治療効果を有すること、および生物における異常な状態を少なくとも部分的に軽減するかまたは抑止することをいう。
本明細書において「治療効果」は、異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害因子または活性化因子をいう。治療効果は、異常な状態の症状の１つ以上をある程度緩和する。異常な状態の処置に関して、治療効果とは、以下の１つ以上をいい得る：（ａ）細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、および／または分化における増加；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち、遅らせることまたは停止させること）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に関連する症状の１つ以上をある程度緩和する；および（ｅ）罹患した細胞集団の機能を強化すること。異常な状態に対する効力を示す化合物は、本明細書中に記載されるように同定され得る。
本明細書において「異常な状態」は、生物におけるその正常な機能から逸脱する、生物の細胞または組織における機能をいう。異常な状態は、細胞増殖、細胞分化、細胞シグナル伝達、または細胞生存に関連し得る。異常な状態としてはまた、造血障害、肥満、網膜変性のような糖尿病合併症、ならびにグルコースの取り込みおよび代謝における不規則性、ならびに脂肪酸の取り込みおよび代謝における不規則性が挙げられ得る。
異常な細胞増殖状態としては、例えば、がん、新生物、腫瘍および炎症などが挙げられる。
異常な分化状態としては、例えば、奇形、がんなどが挙げられる。
異常な細胞シグナル伝達状態としては、例えば、異常な細胞分化などが挙げられる。
異常な細胞生存状態はまた、アポトーシス（プログラム細胞死）経路が活性化されるかまたは抑止される状態に関連する。多数のタンパク質キナーゼが、アポトーシス経路に関連している。タンパク質キナーゼのいずれか１つの機能における異常は、細胞不死または未熟な細胞死を生じ得る。
別の局面において、本発明は、神経疾患、障害または異常状態、あるいは造血関連疾患、障害または異常状態のある（罹患しているおそれのある）被験体または上記障害を有する被験体を処置する、予防的方法および治療的方法の両方を提供する。
生物学的活性レベルの増加（疾患または障害を罹患しない被験体と比較して）によって特徴付けられる疾患および障害は、活性をアンタゴナイズする（すなわち、減少または阻害する）治療剤で処置され得る。活性をアンタゴナイズする治療剤は、治療様式または予防様式において投与され得る。利用され得る治療剤としては、限定されないが、以下が挙げられる；（ｉ）Ｂｍｉ−１（例えば、ポリペプチド）、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはそのホモログ；（ｉｉ）Ｂｍｉ−１に対する抗体；（ｉｉｉ）Ｂｍｉ−１をコードする核酸（因子がポリペプチドの場合）；（ｉｖ）アンチセンス核酸および「機能障害性」（すなわち、Ｂｍｉ−１（ポリペプチドである場合）に対するコード配列のコード配列内における異種挿入に起因する）の核酸（例えば、ＲＮＡｉ）の投与は、相同組換えによるＢｍｉ−１の「ノックアウト」内在性機能に利用される（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，１２８８−１２９２を参照のこと）；あるいは（ｖ）Ｂｍｉ−１とその結合パートナーとの間の相互作用を調節する因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに特異的な抗体を含む）。
生物学的活性レベルの減少（疾患または障害を罹患していない被験体と比較して）によって特徴付けられる疾患または障害は、活性を増加させる（すなわち、アゴニストである）治療剤で処置され得る。活性を上方制御する治療剤は、治療様式または予防様式で投与され得る。利用され得る治療剤としては、限定されないが、Ｂｍｉ−１、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントまたはそのホモログ；あるいはバイアベイラビリティーを増大させるアゴニストが挙げられる。
レベルの増加または減少は、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、患者組織サンプル（例えば、生検組織から）を得てＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド（またはＢｍｉ−１のｍＲＮＡ）の構造および／または活性に関してインビトロで上記サンプルをアッセイすることによって、容易に検出され得る。当該分野で周知の方法としては、限定されないが、免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫組織化学などによって）、および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）が挙げられる。
本発明はまた、Ｂｍｉ−１の発現または少なくとも１つのＢｍｉ−１の活性を調節する薬剤を被験体に投与することによって、被験体において、異常なＢｍｉ−１の発現またはＢｍｉ−１の活性に関連する疾患または状態を予防するための方法を提供する。異常なＢｍｉ−１の発現またはＢｍｉ−１の活性によって引き起こされるかまたは寄与される疾患に対するリスクのある被験体は、例えば、本明細書中に記載されるような診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定され得る。予防剤の投与は、Ｂｍｉ−１の異常に特徴的な症状の出現の前に行い得、その結果、疾患または障害が予防されるか、またはその進行を遅らせる。Ｂｍｉ−１の異常の型に基づいて、例えば、Ｂｍｉ−１のアゴニスト薬剤またはＢｍｉ−１のアンタゴニスト薬剤が、被験体を処置するために使用され得る。適切な薬剤は、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
本発明はまた、治療目的のためのＢｍｉ−１の発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節法は、細胞を、細胞と関連するＢｍｉ−１の活性の１つ以上の活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。Ｂｍｉ−１の活性を調節する薬剤は、本明細書中で記載されるような薬剤であり得、例えば、核酸またはタンパク質、Ｂｍｉ−１の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、Ｂｍｉ−１のペプチド模倣物、または他の低分子であり得る。１つの実施形態において、薬剤は、１つ以上のＢｍｉ−１の活性を刺激する。このような刺激剤の例としては、活性Ｂｍｉ−１および細胞中に導入されたＢｍｉ−１をコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、薬剤は、１つ以上のＢｍｉ−１活性を阻害する。このような阻害剤の例としては、アンチセンスＢｍｉ−１核酸分子および抗（Ｂｍｉ−１）抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、薬剤を被験体に投与することによって）実行され得る。このように、本発明は、Ｂｍｉ−１（例えば、ポリペプチド）またはそれをコードする核酸分子の異常発現または異常活性によって特徴付けられる疾患または障害に悩まされる個々を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、薬剤（例えば、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）、またはＢｍｉ−１発現またはＢｍｉ−１活性を調節する（例えば、上方制御または下方制御する）薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、本方法は、減少したＢｍｉ−１発現もしくは活性または異常なＢｍｉ−１発現もしくは活性を補うための治療として、Ｂｍｉ−１またはそれをコードする核酸分子を投与する工程を包含する。
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、本発明の正常な遺伝子の核酸配列、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下の通りである。
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；およびＭａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
したがって、本発明では、Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子を用いた遺伝子治療が有用であり得る。
本明細書において「形質」および「表現型」という用語は、本明細書では交換可能に用いられ、生物の可視的な性質、検出可能な性質またはこれ以外の場合における測定可能な性質すべてを意味するものであり、一例として疾患の徴候または疾患に対する感受性があげられる。本明細書では通常、「形質」または「表現型」という用語は、神経疾患、障害または異常状態、あるいは造血関連疾患、障害または異常状態、あるいはこれらに対する羅患性を示すときに用いられ得る。
本明細書において「遺伝子型」という用語は、ある生物個体の遺伝子の構成をいい、しばしば個体または試料中に存在する対立遺伝子を意味することがある。試料または個体の「遺伝子型を決定する」という表現は、個体の特定の遺伝子の配列を解析することを包含する。
本明細書において「多型」という用語は、異なるゲノムまたは個体間で２以上の選択的ゲノム配列または対立遺伝子が出現することを示すために用いられる。「多型（の）」という表現は、特定のゲノム配列の２以上の変異体が個体群に見出される可能性がある状態を示す。「多型部位」は、そのような変異が発生する遺伝子座である。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）は、多型部位で１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されたものである。１つのヌクレオチドの欠失または１つのヌクレオチドの挿入によっても単一ヌクレオチド多型が生じる。本明細書において「単一ヌクレオチド多型」は、１つのヌクレオチドの置換を示すものであることが好ましい。一般に、異なる個体間では、多型部位を２つの異なるヌクレオチドが占めている場合がある。本発明では、Ｂｍｉ−１などの多型もまた、神経疾患に関連すると考えられることから、１つの実施形態では、このような多型の分析によって同定された対立遺伝子を用いることが神経の、再生、予防、診断、治療または予後に有効であり得る。
本明細書中で使用される、用語「合成（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」または「合成する（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ）」とは、酵素的方法とは対照的に、純粋に化学的に生成された化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）をいう。従って、「全体が」（ｇｌｏｂａｌｌｙ）合成された化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）は、その全体が化学的手段によって生成され、そして「部分的に」合成された化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）は、その得られた化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）の一部分のみが化学的手段によって生成された化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）を包含する。
本明細書において使用される用語「領域」によって、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続した部分によって定義される。用語「ドメイン」は、本明細書中で、生体分子の既知の機能または推測されている機能に寄与する、その生体分子の構造部分をいうものとして定義される。ドメインは、領域またはその部分と同じ広がりを有し得；ドメインはまた、その領域の全てまたは一部に加えて、特定の領域と区別される生体分子の一部を組み込み得る。本発明のＢｍｉ−１のドメインの例としては、シグナルペプチド、細胞外（すなわち、Ｎ末端）ドメイン、ロイシンリッチ反復ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
（治療活性または予防活性の証明）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性（例えば、神経疾患、障害または異常状態、あるいは造血関連疾患、障害または異常状態など）について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
（再生／治療／予防のための投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物の投与による、神経疾患、障害または異常状態、あるいは造血関連疾患、障害または異常状態の処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。
本明細書において「診断、予防、処置または予後上有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができる。
本発明が対象とする動物は、神経系または類似の系を有するものであれば、どの生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。
本発明の核酸分子またはポリペプチドが医薬として使用される場合、そのような医薬は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントなどのポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。
固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストラン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。
固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における崩壊阻害剤の好適な例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠などが含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、バクテリア保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
さらに、本発明の医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版、その補遺またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を、処置の必要な領域（例えば、中枢神経、脳など）に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中に封入された状態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された徐放系中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。
さらに別の実施形態において、制御された徐放系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
他の制御された徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドなどの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人１日あたり、経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１０ｇであり、好ましくは、０．１ｍｇ〜１ｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇなどであり得る。非経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１ｇであり、好ましくは、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇなどであり得る。
本明細書中、「投与する」とは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドなどまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、生物の細胞または組織に取り込むことを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
異常な状態はまた、生物へのシグナル伝達経路に異常を有する細胞の群に化合物を投与することによって予防または処置され得る。次いで、化合物を投与することの生物機能に対する効果が、モニターされ得る。この生物は、好ましくは、マウス、ラット、ウサギまたはヤギ、より好ましくは、サル（ｍｏｎｋｅｙまたはａｐｅ）、および最も好ましくは、ヒトである。
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査室の結果またはＢｍｉ−１などに関連する疾患（例えば、神経疾患）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、Ｂｍｉ−１などに関連する疾患（例えば、神経疾患）の再発により再開することができる。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。
血漿、腫瘍および主要器官中での薬物および代謝産物の血漿半減期および体内分布はまた、障害を阻害するのに最も適切な薬物の選択を容易にするように決定され得る。このような測定が行われ得る。例えば、ＨＰＬＣ分析は、薬物で処置された動物の血漿において行われ得、放射線標識された化合物の位置が、Ｘ線、ＣＡＴスキャンおよびＭＲＩのような検出方法を用いて決定され得る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが、薬物動態学的特徴が不十分な化合物は、化学構造の変更や再試験によって最適化され得る。この点について、良好な薬物動態学的特徴を示す化合物が、モデルとして使用され得る。
毒性研究はまた、血液細胞組成物を測定することによって行われ得る。例えば、毒性研究は、以下のような適切な動物モデルにおいて行われ得る：（１）化合物がマウスに投与される（未処置のコントロールマウスもまた、使用されるべきである）；（２）各々の処置群中の１匹のマウスから尾静脈を介して血液サンプルを周期的に得る；そして（３）上記サンプルを、赤血球および白血球の数、血液細胞組成物ならびにリンパ球と多形核細胞との割合について分析する。各々の投薬レジメンについての結果とコントロールとの比較は、毒性が存在するか否かを示す。
各々の毒性研究の終了の際に、動物を屠殺することによって、さらなる研究を行い得る（好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ，（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０２：２２９−２４９に従う）。次いで、各処置群からの代表的な動物が、転移、異常な病気または毒性の直接的な証拠のために全体的な検屍によって試験され得る。組織における全体の異常が記載され、組織が組織学的に試験される。体重の減少または血液成分の減少を引き起こす化合物は、主要な器官に対する有害作用を有する化合物と同様に好ましくない。一般的に、有害作用が大きいほど、その化合物は好ましくない。
（造血系細胞の増幅）
造血細胞は骨髄の中でつくられ、分化して、赤血球、血小板、白血球などになり末梢血液の中を流れる。骨髄系細胞の分化を見ると、一番大元には多能性幹細胞があり、次に造血系細胞に特化した造血幹細胞があり、多能性前駆細胞へと分化し、さらに骨髄球系前駆細胞およびリンパ球系前駆細胞へと分化する
骨髄系では多能性幹細胞からＣＦＵ−ＧＥＭＭという細胞へ分化する。そのＣＦＵ−ＧＥＭという細胞からＣＦＵ−ＧＭという細胞へ、次いで骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球という形で分化する。これらは骨髄中に存在する細胞であり、これが分化すると好中球となって末梢血中を流れる。次のラインへいくと、ＣＦＵ−ＧＭという細胞から単球の方へ行き、単芽球、前単球、単球と分化する。この単球が末梢血へあらわれる。３番目のラインでは、ＣＦＵ−ＧＥＭＭという細胞からＢＦＵ−Ｅ細胞へと分化し、それから前赤芽球、赤芽球、赤血球へと分化する。また、巨核球系というものもあり、ＣＦＵ−Ｍｅｇ（メガカリオサイトの略）、巨核芽球、巨核球、血小板へと分化する。
このような分化の過程で白血病は、多能性幹細胞の異常に起因する。したがって、本発明は、このような異常を改善するという意味で白血病の治療にも応用され得る。
リンパ球系では、ＣＭＬでは、多能性幹細胞からリンパ系の幹細胞へと分化し、Ｂ細胞系とＴ細胞系とに分かれる。それと別個にＮＫ細胞の方へ分かれていくというラインが存在する。Ｂ細胞系のラインとしては前駆Ｂ細胞、前駆Ｂ細胞（ｐｒｅ−Ｂ−ｃｅｌｌ）、初期Ｂ細胞（ｅａｒｌｙ−Ｂ−ｃｅｌｌ）などへと分化し、中間Ｂ細胞（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ− Ｂ−ｃｅｌｌ）、成熟Ｂ細胞（ｍａｔｕｒｅ Ｂ−ｃｅｌｌ）、形質球様細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ−Ｂ−ｃｅｌｌ）、形質細胞（ｐｌａｓｍａ−ｃｅｌｌ）へと分化する。Ｔ細胞系としては、胸腺前駆細胞、未成熟胸腺細胞、共通胸腺細胞（ｃｏｍｍｏｎ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ）、成熟胸腺細胞へと分化する。別のルートとしてヘルパー／インデューサーＴ細胞へいく系統と、成熟胸腺細胞から抑制／細胞傷害性Ｔ細胞へと分化する系統が存在する。したがって、これらのＴ細胞および／またはＢ細胞の異常の処置または予防についても本発明の因子または組成物は有効であり得る。このような分化に関する模式的スキームを図８に示す。図８では、分化において有用なマーカーも記載されている。このような分化に関するより詳細な説明については、赤司浩一、最新医学 ５６（２）、１５−２３，２００１を参照のこと。この文献は、本明細書において参考として援用される。
本明細書において、以下の略号を分化細胞系統に使用する。
ｎ：好中球
ｍ：マクロファージ
ｅ：好酸球
ｍａｓｔ：マスト細胞
Ｍ：巨核球
Ｅ：赤血球
ＧＭ：顆粒球／マクロファージ
ＧＥＭ：顆粒球／赤血球／マクロファージ
ＧＭＭ：顆粒球／マクロファージ／巨核球
ＧＥＭＭ：顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球。
（造血幹細胞の同定法）
以下に代表的な造血幹細胞の同定法を説明する。
（ａ．脾コロニー形成法）
致死量放射線照射したマウスに同系マウスの造血細胞を静注すると、８〜１４日目に脾臓表面に隆起（コロニー）が認められる。各々のコロニーが種々の血液細胞から成っているが、１個のコロニーは１個の幹細胞に由来しており、この脾コロニーを形成する母細胞はＣＦＵ−Ｓ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ ｉｎ ｓｐｌｅｅｎ）と呼ばれる。８日目に形成される脾コロニー（Ｄａｙ ８ ＣＦＵ−Ｓ）を形成する細胞は赤芽球が主体であるのに対し、１２日目形成される脾コロニー（Ｄａｙ １２ ＣＦＵ−Ｓ）は、赤芽球のほかに顆粒球や巨核球、更にはＢリンパ球まで含み増殖能も高く、多能性幹細胞に由来している。Ｄａｙ １２ ＣＦＵ−Ｓは多能性幹細胞の指標として用いられている。また、抗癌剤である５−フルオロ−ウラシル（５−ＦＵ）投与後に残存する造血幹細胞は非常に高い増殖能を示すことより、ＣＦＵ−Ｓの母細胞にあたるｐｒｅ−ＣＦＵ−Ｓと呼ばれる。当初未分化な造血幹細胞の指標になると思われたＤａｙ １２ ＣＦＵ−Ｓも実は不均一な細胞集団であり、必ずしも未分化な造血幹細胞の指標にはなりえない。
（ｂ．長期骨髄再構築法）
移植した細胞により致死量放射線照射されたマウスの造血系を再構築し、長期間維持する事ができるか否かを観察する方法である。現在、造血幹細胞の多分化能と自己複製能をみる上で最も信頼性が高い。マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子の発現や、雄雌の性染色体、コンジェニックマウス等が用いられている。この方法では定量化が困難であったが、最近ではドナーの造血細胞とともにレシピエントの造血細胞を移植し、その再構築の割合を調べる競合再増殖アッセイが用いられるようになった。また、ヒトにおいてはマウスのようにｉｎ ｖｉｖｏの移植実験系を組むことは困難であるので、リンパ球が欠如するために拒絶反応を起こさない免疫不全マウス（ＳＣＩＤ ｍｏｕｓｅ）にヒトの造血幹細胞を移植する、Ｓｃｉｄ−ｈｕマウスが用いられる。この系では、マウスの中で長期間ヒトの造血機構を維持することができる。
（ｃ．インビトロコロニー法）
造血細胞（骨髄細胞・脾細胞等）を各種サイトカイン存在下にメチルセルロース、軟寒天等の半固形培地中で培養し、形成された細胞集団（コロニー）から造血幹細胞の数や性質を推定する方法である。このコロニーを分析することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて種々の造血前駆細胞や造血幹細胞の分化・増殖過程の観察や測定が可能になっている。混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ，ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）や分化能の高いコロニー（ＨＰＰ−ＣＦＣ；ｈｉｇｈ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）は、単系統のコロニーを形成する細胞（ＣＦＵ−ＧＭ， ＢＦＵ−Ｅ等）より未分化であり、芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ｂｌａｓｔ）は最も未分化であるとされている。この方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて造血幹細胞や前駆細胞の増殖・分化過程をとらえることができる。さらに、近年では無血清培地を用いたり造血幹細胞の単細胞培養を行うことにより、造血に関与する種々のサイトカインの作用を推定することができる。
（ｄ．ストロマ細胞との共培養系）
造血幹細胞の分化・増殖には造血微小環境が密接に関与している。１９７７年Ｄｅｘｔｅｒらは、骨髄間質（ストロマ）細胞上で造血幹細胞が数ヵ月以上の長期間にわたって培養可能であることを示した（Ｄｅｘｔｅｒ培養法）が、その後造血を維持するストロマ細胞株が次々に樹立され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ において造血微小環境の再現が可能になった。この培養系では、造血前駆細胞は早期にコロニー形成能を失うのに対して、未分化な造血幹細胞は長期間コロニー形成能や骨髄再構築能を維持できる。このため、未分化な造血幹細胞活性の測定にも用いられる。特にヒトにおいてはｉｎ ｖｉｖｏの系が用いにくいため、ストロマ細胞上で長期間コロニー形成能を維持できる細胞をＬＴＣ−ＩＣ（Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）として未分化な造血幹細胞の指標として用いられている。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
１つの局面において、本発明は、造血幹細胞の増幅を調節するための方法を提供する。この方法は、（Ａ）造血幹細胞に、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を提供する工程；および（Ｂ）該造血幹細胞を、該増幅を調節するに十分な時間培養する工程、を包含する。造血幹細胞にＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を提供する技術は、当該分野において周知であり、例えば、細胞を培地中で培養し、その培地中にこのような因子を提供することを包含するが、それらに限定されない。増幅を調節するに十分な量は、当業者が適宜決定することができる。造血幹細胞の培養は、当該分野において周知の慣用技術を用いることができる。増幅を調節するに十分な時間は、当業者が本明細書を参酌することにより適宜決定することができる。
したがって、本発明の別の局面では、造血幹細胞の増幅を調節するための組成物であって、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を含む、組成物が提供される。好ましくは、この組成物は、薬学的組成物または農学的組成物であり得る。このような場合、この組成物は、薬学的または農学的に受容可能なキャリアを含み得る。
本発明は、好ましくは、幹細胞（例えば、造血幹細胞）の増幅促進のための組成物および方法を提供する。造血幹細胞のような幹細胞を効率よく増幅促進する方法はこれまで知られておらず、当該分野において驚くべき効果を提供する。ここで、増幅促進とは、幹細胞の自己複製を促進することをいい、細胞集団についていう場合は、細胞集団において未分化状態を保った幹細胞の比率が増加することをいう。増幅促進が起こったかどうかの指標は、細胞を観察することによって確認することができる。
本発明において使用されるＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、外因性であっても内因性であってもよい。好ましくはこの因子は外因性である。本発明は、外因性のＢｍｉ−１またはその等価物が細胞に提供されることによって、その細胞の増幅の調節（特に、促進）を行うことができるという従来予測できなかった効果を奏する。本発明のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、内因性であってもよい。そのような場合、外因性の因子が加えられて、内因性のＢｍｉ−１が増強され得る。
本発明において使用されるＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、核酸形態であっても、タンパク質形態であっても、他の形態（例えば、低分子、脂質分子、糖、これらの複合分子）であってもよい。
１つの実施形態において、本発明において使用されるＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子が、タンパク質形態で使用される場合、
（ａ）配列番号１または３に記載の核酸配列（それぞれ、アクセッション番号、Ｌ１３６８９またはＭ６４２７９）もしくはそのフラグメントによってコードされる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する、改変体ポリペプチド；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。
１つの好ましい実施形態において、上記（ｃ）における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよく、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、Ｂｍｉ−１と類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
別の好ましい実施形態において、上記（ｄ）における上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、Ｂｍｉ−１ポリペプチドとの相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドに対する相同性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも３の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、ある因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、配列番号２に示す配列の全長と同一であってもよく、それを超える長さであってもよい。
１つの実施形態において、Ｂｍｉ−１ポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体は、配列番号２に示す全範囲を含む。より好ましくは、Ｂｍｉ−１、またはそのフラグメントもしくは改変体は、配列番号２のアミノ酸全範囲からなることが有利であり得る。
１つの実施形態において、本発明において使用されるＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子が、核酸形態で使用される場合、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列（アクセッション番号、Ｌ１３６８９）またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、であり得る。
１つの好ましい実施形態において、上記（ｃ）における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、Ｂｍｉ−１と類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
別の好ましい実施形態において、上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、Ｍｅｌ−１８との複合体形成、Ｍｐｈ１／Ｒａｅ−２８との複合体形成などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的アッセイ、リン酸化定量などによって測定することができる。
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
好ましい実施形態において、本発明のＢｍｉ−１をコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１（アクセッション番号、Ｌ１３６８９）に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
１つの実施形態において、Ｂｍｉ−１をコードする核酸分子、またはそのフラグメントもしくは改変体は、配列番号１の核酸配列（アクセッション番号、Ｌ１３６８９）の全範囲を含む。より好ましくは、Ｂｍｉ−１をコードする核酸分子、またはそのフラグメントもしくは改変体は、配列番号１の核酸配列（アクセッション番号、Ｌ１３６８９）の全範囲からなる。
好ましい実施形態において、本発明は、さらなる細胞生理活性物質を含み得る。そのような細胞生理活性物質としては、例えば、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、カルジオトロフィンのような増殖活性を有するものが挙げられるがそれらに限定されない。ある特定の実施形態において、そのような細胞生理活性物質は、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ−３Ｌからなる群より選択されるものを使用する。ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ−３Ｌは、未分化能を維持する際に効果があることが報告されているからである。この場合、このＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ−３Ｌはすべて使用されてもよい。
サイトカインおよび増殖因子などの細胞生理活性物質は一般に、機能重複現象（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）があることから、他の名称および機能で知られるサイトカインまたは増殖因子であっても、本発明に使用される細胞生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本明細書における好ましい活性を有してさえいれば、本発明の好ましい実施形態において使用することができる。
本発明では、どのような細胞生理活性物質も使用され得る。本発明の１つの好ましい実施形態において、細胞生理活性物質として、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有するサイトカインまたは増殖因子が使用される。造血活性またはコロニー刺激活性を有するサイトカインとしては、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）などが挙げられる。細胞増殖活性を有する増殖因子としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。本発明の１つの好ましい実施形態では、細胞増殖活性を有する細胞生理活性物質（例えば、サイトカインまたは増殖因子）が使用され得る。好ましい実施形態では、そのような細胞生理活性物質は、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ−３Ｌを含む。
サイトカインおよび増殖因子のような細胞生理活性物質はまた、そのレセプター（例えば、サイトカインレセプター）によって分類することもできる。サイトカインレセプターは、非キナーゼ型およびキナーゼ型に分類される。非キナーゼ型としては、Ｇタンパク質結合型レセプター、ＮＧＦ／ＴＮＦレセプターファミリー、ＩＦＮレセプターファミリー、サイトカインレセプタースーパーファミリーなどが挙げられる。キナーゼ型としては、増殖因子型レセプター（チロシンキナーゼ型、例えば、ＨＧＦの場合はｃ−ｍｅｔ）、ＴＧＦβレセプターファミリー（セリン・スレオニンキナーゼ型）などが挙げられる。細胞生理活性物質は、場合により、レセプターサブユニットを共有することから、上記好ましいサイトカインまたは増殖因子とレセプターサブユニットを共有するサイトカインまたは増殖因子もまた、好ましいサイトカイン及び増殖因子であり得る。
サイトカインおよび増殖因子のような細胞生理活性物質はまた、タンパク質または核酸の形態で提供される場合、相同性比較により分類され得る。従って、本発明の好ましい実施形態として、本発明の好ましい細胞生理活性物質と相同性のある細胞生理活性物質が使用される。そのような相同性を有する細胞生理活性物質としては、例えば、ＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータを用いて比較した場合に、比較対照の細胞生理活性物質に対して、少なくとも約３０％、好ましくは、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の相同性を有する細胞生理活性物質が挙げられる。
好ましい実施形態において、本発明に使用されるＢｍｉ−１は、Ｍｅｌ−１８と複合体化されていることが有利であり得る。このような複合体は、造血系細胞の増幅を促進することが本発明において判明したからである。より好ましくは、このＢｍｉ−１は、さらに、Ｍｐｈ１／Ｒａｅ−２８と複合体化されていることが有利である。このような複合体は、造血系細胞の増幅を促進することが本発明において判明したからである。
本発明において用いられるＢｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、恒常的に活性型であってもよく、一過的に活性型となってもよい。このような一過性または恒常性は、そのような因子が使用される目的に応じて変動する。
別の好ましい実施形態において、本発明は、Ｂｍｉ−１調節因子として、Ｂｍｉ−１の活性化因子を含む。このような活性化因子は、当該分野において周知の技術によって、物質ライブラリーをスクリーニングすることによって選択することができる。そのようなＢｍｉ−１の活性化因子としては、Ｂｍｉ−１のリン酸化状態を制御する分子、Ｂｍｉ−１の発現を転写レベルで制御する分子などが挙げられるがそれらに限定されない。
別の好ましい実施形態において、本発明のＢｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、タンパク質または複合タンパク質形態をとることが有利であり得る。あるいは、本発明のＢｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、核酸形態をとってもよい。
核酸形態をとる場合、そのような核酸は、ベクターに含まれていてもよい。このようなベクターは、例えば、レトロウイルスベクターであり得る。
本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
本発明は、他の実施形態において、本発明の活性成分（例えば、ポリペプチドまたは核酸）と同等に有効な因子をスクリーニングするための道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物もまた、本発明に包含される。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、最近ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｅｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。
活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用して行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ａｎｄ Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物を設計することができる。
別の局面において、本発明は、造血関連疾患、障害または異常状態を処置または予防するための方法を提供する。このような方法は、処置または予防するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を、そのような調節を必要とする被検体に投与する工程を包含する。
別の局面において、本発明は、造血関連疾患、障害または異常状態を処置または予防するための薬学的組成物であって、処置または予防するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１ 調節因子を含む、組成物を提供する。
本発明が対象とする「疾患」は、大量の幹細胞またはそれに由来する分化細胞、組織、臓器を必要とするものであれば、どのようなものでもよい。本発明により処置され得る疾患または障害は、本発明の幹細胞が分化または増幅の結果生じ得る分化細胞、組織または臓器の障害に関連する疾患または障害であり得る。
１つの実施形態において、本発明の対象とする疾患は、造血、循環器系（血液細胞など）の疾患または障害であり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、不応性貧血など）、癌または腫瘍（例えば、白血病）およびその化学療法処置後の造血不全、血小板減少症、急性骨髄性白血病（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、急性リンパ性白血病（特に、第１寛解期、第２寛解期以降の寛解期）、慢性骨髄性白血病（特に、慢性期、移行期）、悪性リンパ腫（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、多発性骨髄腫（特に、発症後早期）など。あるいは、心不全、狭心症、心筋梗塞、不整脈、弁膜症、心筋・心膜疾患、先天性心疾患（たとえば、心房中隔欠損、心室中隔欠損、動脈管開存、ファロー四徴）、動脈疾患（たとえば、動脈硬化、動脈瘤）、静脈疾患（たとえば、静脈瘤）、リンパ管疾患（たとえば、リンパ浮腫）のようなものも対象であり得る。本発明の幹細胞増幅因子によって、上述のような疾患を処置するにおいて、従来の天然物由来の幹細胞または分化細胞の移植治療に伴う副作用（特に、異物、異種細胞に伴うもの、例えば、感染、移植片対宿主病など）が回避された。この効果は、自在に増幅させる能力を有する因子を利用することにより、初めて効率よく達成されたものであり、従来技術では不可能であったかまたは困難であった格別の効果といえる。
このような方法および組成物における具体的形態および好ましい実施形態は、上述の造血幹細胞の増幅の調節のための方法および組成物と同様のものが使用され得る。本明細書において、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（必携血液内科診療ハンドブック、溝口秀昭、１９９９、南江堂を参照）。
本発明が医薬として使用される場合、好ましくは、例えば、ＳＣＦ（幹細胞因子＝ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＰＯ（トロンボポエチン＝ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）のような他の追加の薬剤を含ませることが有利であり得る。
別の局面において、本発明は、造血幹細胞の増幅を調節するためのキットを提供する。このキットは、（Ａ）増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を含む組成物；および（Ｂ）該組成物を造血幹細胞へ提供し、造血幹細胞を培養することを指示する指示書、を備える。キットには、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このようなキットの構成要件（例えば、容器）に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。
別の局面において、本発明は、造血幹細胞系列の分化細胞を生産するための方法を提供する。この方法は、（Ａ）造血幹細胞または始原細胞を提供する工程；（Ｂ）該造血幹細胞または始原細胞に、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を提供する工程；および（Ｃ）該造血幹細胞を、該増幅を調節するに十分な時間培養する工程、を包含する。ここで、造血幹細胞または始原細胞は、初代培養細胞であってもよく、培養細胞であってもよい。
別の局面において、本発明は、本発明の造血幹細胞の増幅促進によって生産された細胞、組織、臓器、生物体、それらを含む医薬に関する。
したがって、別の局面において、本発明は、造血幹細胞またはそれに由来する分化細胞を必要とする疾患または障害を処置または予防するための方法を提供する。このような方法は、Ａ）本発明の方法によって得られた細胞をそのような処置または予防を必要とする被検体に投与する工程、を包含する。
本発明はまた、本発明の因子（例えば、ポリペプチドなど）の、本発明の目的（例えば、造血関連の疾患、障害、異常状態の治療、診断、予防、処置、予後など）のための使用または医薬組成物の製造のための本発明の因子の使用に関する。それらの詳細な実施形態は上述したものと同様であり、当業者は適宜応用することができる。
別の局面において、本発明は、造血幹細胞の増幅を調節するための因子をスクリーニングするための方法を提供する。このような方法は、Ａ）該因子の候補物質を提供する工程；Ｂ）該物質をＢｍｉ−１を含む細胞に曝露する工程；およびＣ）該Ｂｍｉ−１が調節されたかどうかを決定する工程であって、該Ｂｍｉ−１が調節された場合、該物質を造血幹細胞の増幅調節因子であると判断する、工程、を包含する。このような場合、Ｂｍｉ−１が上方調節される場合は、造血幹細胞の増幅促進剤として判断してもよい。このような候補物質は、ライブラリーとして提供され得る。本発明はまた、このようなスクリーニング方法によって得られた造血幹細胞の増幅調節因子（好ましくは、増幅促進因子）を提供する。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
（実施例）
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。動物の取り扱いは、東京大学において規定される基準を遵守した。
（共通実験方法）
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６−Ｌｙ５．２）マウスを日本チャールズリバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ）から購入した。マウスは、Ｌｙ５遺伝子座についてコンジェニックであり（Ｂ６ Ｌｙ５．１）、これを交配して、東京大学医科学研究所動物研究センターにおいて動物愛護精神に則って維持した。
（プラスミド）
マウスのＢｍｉ−１、Ｍ３３、Ｍｐｈ−１は、千葉大学Ｈ．Ｋｏｓｅｋｉ博士、早稲田大学のＴ．Ｈｉｇａｓｈｉｎａｋａｇａｗａ博士、およびＴｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＭ．ｖａｎ Ｌｏｈｕｉｚｅｎ博士からそれぞれ得た。これら３つの遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３（アクセッション番号、Ｍ６４２７９）（Ｂｍｉ−１）、配列番号１５（アクセッション番号、ＢＣ０３５１９９）（Ｍ３３）および配列番号１１（Ｍｐｈ−１）に示すものを用いた。マウスＢｍｉ−１およびＭｐｈ−１のｃＤＮＡは、Ｎ末端でＦＬＡＧタグ化しておいた。一連のＢｍｉ−１変異体ｃＤＮＡを、Ｎ末端でＦＬＡＧタグ化しておき、これをＰＣＲ増幅した。これらｃＤＮＡを、以下のように命名した：ＲＩＮＧフィンガードメイン欠失（ＤＲＦ；Ｄ１８−５６；配列番号１９）；ＨＴＨＴＨＴドメイン欠失（ＤＨＴ；Ｄ１６５−２２０；配列番号２１）；およびプロリン／セリンリッチ領域欠失（ＤＰ／Ｓ；Ｄ２４８−３２４；配列番号２３）。Ｈｏｘ遺伝子は、Ｔｅｒｒｅｙ Ｆｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃａｎａｄａ）のＤｒ．Ｒ．Ｈ．Ｈａｍｐｈｒｉｅｓから入手した。欠失変異体は、当該分野において周知の部位特異的変異誘発法に基づいて作製した。
（レトロウイルス生成）
レトロウイルスベクターＧＣＤｓａｍ（ｐＧＣＤｓａｍ）を使用した。このベクターは、ＭＳＣＶに由来するＬＴＲを伴い、サブゲノムｍＲＮＡの生成のためのインタクトなスプライスドナーおよびスプライスアクセプターの配列を有する（Ｋａｎｅｋｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：３５−４４，２００１）。マウスＢｍｉ−１、Ｍ３３、Ｍｐｈ−１および一連のＢｍｉ−１変異体のｃＤＮＡをｐＧＣＤｓａｍのＩＲＥＳ−ＥＧＦＰコンストラクトの上流の部位にサブクローニングした。組換えレトロウイルス遺伝子を生成するために、プラスミドＤＮＡを２９３ｇｐ細胞にトランスフェクトした。２９３細胞は、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むが、エンベロープ遺伝子を欠失する。ここでは、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを用いてＣａＰＯ４共沈澱することによってトランスフェクトを行った。トランスフェクトした細胞の上清を、１６時間６，０００×ｇで遠心分離することによって濃縮し、ペレットをＳクローン培地（上清の初期容量の１／２００）中で再懸濁した。ベクターの力価は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞株）への感染によって決定した。この場合、ウイルスストックからの系列希釈物を感染させ、これをＧＦＰ＋細胞についてＦＡＣＳ分析（ＦＡＣＳ Ｃａｌｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を行うことによって解析を行った。
（マウス造血幹細胞の分離）
マウス造血幹細胞（ＣＤ３４−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎｉａｇｅ−ｍａｒｋｅｒ−細胞）を、２ヶ月齢のＢ６−Ｌｙ５．１マウスの骨髄細胞から以前に記載されるように（Ｏｓａｗａ Ｍ， Ｈａｎａｄａ Ｋ， Ｈａｍａｄａ Ｈ， Ｎａｋａｕｃｈｉ Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６ Ｊｕｌ １２；２７３（５２７２）：２４２−２４５）分離した。手短に述べると、低密度の細胞をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（１．０８６ｇ／ｍｌ；Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて分離した。この分離した細胞を、ビオチン化抗Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）、Ｍａｃ−１（Ｍ１／７０）、Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８（５３−６．７）、およびＴｅｒ−１１９の各モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からなる抗体カクテルを用いて染色した。細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した抗ＣＤ３４抗体（４９Ｅ９，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、フィコエリトリン（ＰＥ）標識した抗Ｓｃａ−１抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識した抗ｃ−Ｋｉｔ抗体（ＡＣＫ−２；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）でさらに染色した。ビオチン化した抗体をストレプトアビジン−テキサスレッド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で発色させた。４色の分析およびソーティングをＦＡＣＳ ＶａｔａｇｅＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。死んだ細胞をプロピディウムヨージド染色により排除した。ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、組換えフィブロネクチンフラグメント（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）でコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート中に１ウェルあたり１５０細胞いれておいた。
（Ｂｍｉ−１の造血細胞における発現）
Ｂｍｉ−１の発現を種々の細胞において観察した。発現の観察は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって行った。細胞としては、骨髄細胞、脾臓細胞および胸腺を用いた。
Ｂｍｉ−１の造血細胞における発現を図１に示す。
（ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の形質導入）
ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１００ｎｇ／ｍｌトロンボポイエチン（ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を加えたＳ−Ｃｌｏｎｅ ＳＦ−０３（Ｓａｎｋｏ Ｊｕｎｙａｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中で２４時間インキュベートし、次に硫酸プロタミン（５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下でＭＯＩ ６００（感染多重度）でレトロウイルスを用いて形質導入した。形質導入後、細胞をさらにインキュベートし、示された時点でインビトロコロニーアッセイおよび競合的骨髄再建能の検討を行った。
（コロニーアッセイおよびインビトロ液体培養）
示されたレトロウイルスで形質導入したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ，ＩＬ−３および５０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯおよび２単位／ｍｌ ＥＰＯ（これらは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから入手した）を含むメチルセルロース培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ．ＢＣ）中で培養した。培養ディッシュは、５％ＣＯ２雰囲気の下で３７℃でインキュベートした。コロニー数は１０日目に数えた。
（競合的骨髄再建能の検討）
Ｌｙ５システムを用いた競合的骨髄再建能の検討は、記載されるように（Ｏｓａｗａ Ｍ．， Ｈａｎａｄａ Ｋ．， Ｈａｍａｄａ Ｈ．， Ｎａｋａｕｃｈｉ Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６ Ｊｕｌ １２；２７３（５２７２）：２４２−５）行った。手短に述べると、形質導入されたＬｙ５マウス由来の造血幹細胞を、２×１０５個の骨髄細胞（Ｂ６−Ｌｙ５．２）と混合し、そして９．５Ｇｙの線量を照射したＢ６−Ｌｙ５．２マウス中に移植した。移植後４週間後および１２週間後、レシピエントの末梢血液細胞をビオチン化抗Ｌｙ５．１（Ａ２０）およびＦＩＴＣ標識抗体Ｌｙ５．２を用いて染色した（Ｏｓａｗａ Ｍ．， Ｈａｎａｄａ Ｋ．， Ｈａｍａｄａ Ｈ．， Ｎａｋａｕｃｈｉ Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６ Ｊｕｌ １２；２７３（５２７２）：２４２−５）。この細胞を、ＰＥ標識抗Ｂ２２０抗体またはそのＰＥ標識抗Ｍａｃ−１抗体およびＰＥ標識抗Ｇｒ−１抗体あるいはＰＥ標識抗ＣＤ４抗体とＰＥ標識抗ＣＤ８抗体との組み合わせによって、同時に染色した。ビオチン化抗体は、ストレプトアビジンＡＰＣ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて発色した。この細胞をＦＡＣＳ ＶａｎｔａｇｅＴＭ上で分析した。キメリズム百分率は、（Ｌｙ５．１細胞のパーセント）×１００／（Ｌｙ５．１細胞のパーセントおよびＬｙ５．２細胞のパーセント）として計算する。キメリズム百分率が末梢血液中の細胞において１％以上であり、骨髄球とリンパ球ともにＬｙ５．１のドナー細胞による再構築を認めたときに、レシピエントのマウスにおいて、多系統の血液細胞が再構築されたとみなされるべき（ポジティブマウス）と記載する。
（実施例１：外因性Ｂｍｉ−１の発現による増幅促進）
上述の方法を用いて外因性Ｂｍｉ−１の発現による増幅促進を確認するために、Ｂｍｉ−１をレトロウイルスを用いてマウスＣＤ３４−ＫＳＬ造血幹細胞へと導入した。導入は、細胞から遺伝子産物が発現していることを確認したことによって行った。
本発明者らは、ＧＣｓａｍ−Ｂｍｉ−１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰレトロウイルスベクターで細胞を形質導入し、これにより、Ｂｍｉ−１および増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の両方の発現を単一のジシストロン性メッセージをもとに行った。形質導入後、形質導入効率を、蛍光倒立顕微鏡で評価した。本発明者らは、すべての実験において約８０％の効率を達成した。培養７日目および１４日目には（形質導入５日後および１２日後）、細胞をインビトロコロニーアッセイに供した。Ｂｍｉ−１形質導入した細胞の培養物は、高度に増殖性の高いコロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ；コロニーサイズ＞１ｍｍ）を、ＨｏｘＢ４（コントロール）で形質導入したコントロール細胞よりもはるかに、かつ、形質導入していない細胞よりも有意により多くの数を含んだ。結果を図２に示す。ホメオボックス遺伝子は、インビトロで造血幹細胞およびその始原細胞を増幅させることが知られている遺伝子である。
重要なことに、Ｂｍｉ−１の発現によって、多能性の造血幹細胞・前駆細胞の増幅を促進し、コロニー形成単位・顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨芽核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）への増幅を促進した（最初の７日間の培養；図３参照）。培養１４日目、Ｂｍｉ−１形質導入した細胞は、なおも、コントロールより有意に多い数のＨＰＰ−ＣＦＣ（絶対ＨＰＰＣ数）を持っていたが、増幅能は７日目のデータに比べて若干限定されていた（図４参照）。ＨＰＰ−ＣＦＣの増加は、細胞総数の増加の原因である（図１）。これらのデータは、Ｂｍｉ−１の造血幹細胞での発現が多能性造血幹細胞・前駆細胞に関しＨｏｘＢ４よりもはるかに効率的であることを示す。
このように、液体培養における細胞数に差異は見られていないものの、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭ、ＣＦＵ−ＧＭＭといった未分化な細胞の増幅がコロニーアッセイで認められた。
したがって、本発明のＢｍｉ−１は、従来より優れた造血幹細胞増幅促進能を示した。
（実施例２：１００個の幹細胞から始めた例）
次に、別のインビトロ実験を行った。この実施例では、１００個の幹細胞から始めた実験を行って本発明の効果を確認した。
外来性Ｂｍｉ−１の発現は、実施例１に記載のプロトコルにしたがって行った。本実施例では、本発明の因子としてＢｍｉ−１を使用し、ネガティブコントロールとしてＧＦＰ単独を用い、他のコントロールとして、ＨｏｘＢ４を発現させたものを利用した。本実施例では、培養７日目および１４日目のＨｉｇｈ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌを計数した。その結果を図５および６に示す。
図５および６に示されるように、本発明のＢｍｉ−１が発現された幹細胞は、ＧＭおよびＧＭＭといった系統の細胞が顕著に増加していた。この増加効果は、ＨｏｘＢ４よりも顕著に高かった。したがって、本発明のＢｍｉ−１は、従来より優れた造血幹細胞増幅促進能を示した。また、その効果は７日目にすでに顕著に現れていた。また、Ｂｍｉ−１の効果は、Ｈｏｘ４Ｂ（コントロール）分子よりも有意に顕著であった。
（実施例３：動物モデルへの移植）
次に、本発明のＢｍｉ−１の増幅促進効果を確認するために、動物モデルを用いて、幹細胞を移植し、その後の増幅の様子を確認した。
以下に、手短に実験プロトコルを記載する。まず、造血幹細胞を実施例１に記載の通りに得、これを１日間実施例１に記載のように培養した。次に、実施例１に記載されるように、レトロウイルスによる感染によりＢｍｉ−１を強制発現させた。この発現後の細胞を７〜１０日間培養した。培養後、放射線をあてたマウスに移植した。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６−Ｌｙ５．２）マウスを日本チャールズリバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ）から購入した。このマウスは、ＣＤ４５．１が特異的マーカーである。放射線を当てた後に、２×１０５骨髄競合細胞（Ｂ６−Ｌｙ５．２）も培養した細胞と一緒に移植した。この骨髄細胞は、ＣＤ４５．２マーカーが特異的マーカーである。この後４週後および８週後に末梢血の有核細胞全体を解析した。解析には、ＣＤ４５．１のほか、ＧＦＰ、Ｇｒ−１、Ｍａｃ１、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０などを利用した。詳細なプロトコルは、共通実験方法に記載されている。その結果を以下の表１および２に示す。
以上の表に基づいて作成したＢｍｉ−１の発現の様子を、図７に示す。このように、ドナー細胞でもＢｍｉ−１の発現が見られたことから、細胞のキメリズムが起こっていることが確認される。
このように、本実施例において、Ｂｍｉ−１が強制発現されると造血幹細胞の増殖が促進されることが見出された。従って、移植実験からも造血幹細胞が増幅および維持されることが示された。このような効果は、従来知られておらず、したがって、本発明は、顕著な効果を有することが実証された。
（実施例４：ＰｃＧ複合体での効果）
実施例１と同様の実験を、Ｂｍｉ−１を含むＰｃＧ複合体を用いて行う。ここで、本実施例では、Ｂｍｉ−１の代わりにＰｃＧ複合体（Ｂｍｉ−１と、Ｍｐｈ１／Ｒａｅ２８またはＭ３３との複合体）を用いて同様の実験を行う。ＰｃＧ複合体は、各々の成分を調製し、それらを混合しインキュベートすることによって調製する。
これらの複合体を造血幹細胞に重複感染させ、単独感染と重複感染とでどのように効果が異なるかを比べる。あるいは、Ｂｍｉ−１と効果が知られているＨｏｘＢ４を重複感染させその効果を比較する。
その結果、本発明のＢｍｉ−１がＰｃＧ複合体として存在する場合も従来より優れた造血幹細胞増幅能を示すことが示される。
（実施例５：造血幹細胞の増幅によって得られる細胞の利用）
ヒト造血幹細胞ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞にＢｍｉ−１を導入しエキソビボで増幅後、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本チャールズリバー）に移植し、Ｂｍｉ−１による骨髄再建能の増幅を確認する。
（実施例６：Ｂｍｉ−１関連物質のスクリーニング）
Ｂｍｉ−１遺伝子（配列番号１（アクセッション番号、Ｌ１３６８９））のプロモーターにＧＦＰ（配列番号１７（アクセッション番号、ＡＪ２４９６４６））をつないだ遺伝子を恒常的に組み込んだ細胞株を樹立し、この細胞を用いて低分子化合物をスクリーニングし、Ｂｍｉ−１遺伝子の発現を促進する化合物を選別する。
このようにして選別された化合物は、Ｂｍｉ−１遺伝子の発現を促進することから、造血幹細胞・神経幹細胞の増幅のための因子として使用することができる。
（実施例７：Ｂｍｉ−１関連物質のスクリーニング）
ｐ１６ＩＮＫ４ａ（配列番号２７（アミノ酸配列は配列番号２８）；染色体４；ＡＦ０４４３３６）またはｐ１９ＡＲＦ（配列番号２９（アミノ酸配列は配列番号３０）；染色体１１；ＮＭ＿００７４７６）の遺伝子座位に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号１７（アミノ酸配列は配列番号１８））をノックインさせた細胞を作製する。具体的には、以下の通り行う。
まず、ｐ１６ＩＮＫ４ａの開始コドン部位にインフレームでＧＦＰ遺伝子を相同組み換えによりノックインしたＥＳ細胞を樹立する。同様の細胞株をＢｍｉ−１欠損ＥＳ細胞を用いて樹立する。これらのＥＳ細胞を用いて低分子化合物をスクリーニングし、野生型ＥＳ細胞でのみｐ１６ＩＮＫ４ａの発現を抑制し、Ｂｍｉ−１欠損ＥＳ細胞は抑制しない化合物を選別する。
このようにして、Ｂｍｉ−１に関連する化合物をスクリーニングすることができる。
（実施例８：改変体での効果）
次に、ＲＩＮＧフィンガードメイン欠失（ＤＲＦ；Ｄ１８−５６；配列番号２０）；ＨＴＨＴＨＴドメイン欠失（ＤＨＴ；Ｄ１６５−２２０；配列番号２２）；およびプロリン／セリンリッチ領域欠失（ＤＰ／Ｓ；Ｄ２４８−３２４；配列番号２４）の改変体をはじめとして、複数の欠失変異体を作製し、それぞれの効果を確認する。配列番号４の所望の部位を変異させた配列を用いて、同様の効果が見出されるかどうかを確認する。
このような改変体は、上述のような方法あるいは部位特異的変異誘発法によって作製する。作製された核酸分子配列は、確認のため、配列決定機によってＤＮＡ配列を確認する。正しい配列が見出される場合、その核酸分子を用いて改変体を製造する。
この改変体を実施例１および３に記載されるようなプロトコルを用いて造血幹細胞の増殖効果を観察することができる。これにより、このような改変体を用いても、Ｂｍｉ−１同様の造血幹細胞の増殖効果が示されることが明らかになる。そのような効果としては、例えば、上記変異体の中に造血幹細胞の増殖効果が野生型を上回るものが見出されることが期待される。そのような変異体をさらに改変し効果をより強いＢｍｉ−１分子を模索することができる。
（実施例９：他のＢｍｉ−１関連因子）
Ｂｍｉ−１のシグナル伝達に関連するＢｍｉ−１以外の分子であるＭｐｈ−１、Ｍ３３を利用した増殖効果実験を行った。コントロールとしてＨｏｘ４Ｂを用いた系を利用した。その結果を図５および６に示す。その結果、Ｂｍｉ−１因子の効果ほどではないが、Ｍｐｈ−１およびＭ３３は、コントロールよりも有意に高い造血幹細胞増幅促進能が示されることがわかった。したがって、Ｂｍｉ−１に類似する効果をＰｃＧ関連分子が有することが明らかになった。
（実施例１０：生殖系幹細胞における効果）
本発明者らは、造血幹細胞以外の幹細胞として、生殖系幹細胞である精子幹細胞を用いて、本発明のＢｍｉ−１が与える影響を調べた。
まず、本発明者らは、Ｂｍｉ−１が精巣において発現するかどうかを確認した。８週齢の野生型マウス（ＷＴ；ａ，ｂ）、ヘテロマウス（＋／−；ｃ，ｄ）、ノックアウトマウス（−／−；ｅ，ｆ）の精巣切片を用いた。これらのマウスは、野生型マウスは、日本チャールズリバーから得たものを利用し、ヘテロマウスおよびノックアウトマウスは、常法を用いて作製した。図９Ａに、Ｂｍｉ−１で免疫染色した精巣切片の写真を示す。ｂ、ｄ、ｆは２００倍の画像を示し、ａ、ｃ、ｅの４００倍の画像を示す。精原細胞および精子細胞に染色像が見られるが、ノックアウトマウスでも若干の染色が見られる。
次に、精巣をとった個体と同じ個体からの脾臓を用いたＢｍｉ−１のウエスタンブロット実験を行った。その結果を図９Ｂに示す。レーン１および２にはポジティブコントロールとしてＦＬＡＧ−Ｂｍｉ−１を発現させた細胞を用いた。レーン２〜５は、抗Ｂｍｉ−１抗体（ＵＢＩ）を用いた。矢印で示した位置がＢｍｉ−１の位置を示す。レーン３〜５では矢印の黒矢頭のバンドがＢｍｉ−１を示し、白矢頭の位置に非特異的なバンドが見られている。このことから、図９Ａで示したＢｍｉ−１の発現は、非特異的な染色を含むと考えられるが、ノックアウトマウスでは、精原細胞に染色細胞が見られないことから、少なくとも精原細胞ではＢｍｉ−１が発現していることは間違いないと考えられる。
次に、Ｂｍｉ−１ノックアウトマウスの精巣を用いたＨＥ染色を行った。ＨＥ染色は、以下の常法に基づいて行った。必要に応じて脱パラフィン（例えば、純エタノールにて）、水洗を行い、オムニのヘマトキシリンでサンプルを１０分浸した。その後流水水洗し、アンモニア水で色出しを３０秒間行った。その後、流水水洗を５分行い、塩酸エオジン１０倍希釈液で２分間染色し、脱水し、透徹し、封入した。８週齢の野生型マウス（ＷＴ；ａ，ｂ）、ヘテロマウス（＋／−；ｃ，ｄ）、ノックアウトマウス（−／−；ｅ，ｆ）の精巣切片を用いてこのＨＥ染色を行った。その結果を図１０Ａに示す。ｂ、ｄ、ｆは２００倍の画像を示し、ａ、ｃ、ｅの４００倍の画像を示す。基底膜上に扁平な形態を示す精子幹細胞が多く見られる。Ｂｍｉ−１ノックアウトマウスでも精子形成が行われており、精子幹細胞も存在していることが分かる。次に、１８週齢（野生型、ａ，ｂ）および２２週齢（野生型、ｃ、ｄ）の精巣切片および１８週齢のノックアウトマウス（−／−；ｅ，ｆ）の精巣切片のＨＥ染色を行った。その結果を、図１０Ｂに示す。ｂ、ｄ、ｆは２００倍の画像を示し、ａ、ｃ、ｅの４００倍の画像を示す。野生型マウスでは、１８週齢、２２週齢ともに矢頭で示した精子幹細胞が多く確認されるが、Ｂｍｉ−１ノックアウトマウスでは精子幹細胞の特徴的な形態を示す細胞がほとんど見られなかった。
以上の結果、Ｂｍｉ−１は、特に、精子幹細胞において強く発現することが明らかになった。また、Ｂｍｉ−１のノックアウトマウスでは、週齢が進むにつれて精子幹細胞の減少が見られた。したがって、Ｂｍｉ−１は、造血幹細胞と同様に精子幹細胞の自己複製に深く関与するものと考えられる。
このことをもとに、Ｂｍｉ−１の機能を制御することによって、精子幹細胞を増幅することが可能であると考えられる。このことを実証するために、以下の実験を行った。
精子幹細胞をマウス新生仔精巣から当該分野において公知の手順により純化する。マウスを麻酔し、腹部を切開して陰嚢内にある精巣を取り出す。精巣上体の周りにある脂肪組織を腹膜に針で縫いつけ、腹膜、皮膚を癒合して手術を終了する。ここで設定した睾丸は、実験的停留睾丸として使用する。この実験的停留睾丸が使えるまで２〜３ヶ月停留させ、その全体を切り出す。これをハンクス液の中に浸し、精巣を包む薄膜をはがす。精細管のみになった精巣をＦａｌｃｏｎチューブに移し、コラゲナーズ溶液で１５分間、３２℃でインキュベートし、この間適宜攪拌する。その後コラゲナーゼ溶液を除き、ハンクス液でリンスする（例えば、２回）。次いで、０．２５％トリプシン・ＤＮａｓｅ（７ｍｇ／ｍｌ）溶液（量比で４：１）を加え、１０分間インキュベートする。このとき精細管がよくほぐす。これをピペッティングし、等量のＰＢＳ／１％ ＦＢＳ溶液でトリプシン反応を中和する。これを、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットを、適量のＰＢＳ／１％ ＦＢＳに懸濁する。この細胞を免疫染色する。１００μｌに１０６の細胞を加え、１μｇの抗体を入れる。これをセルソーティングに用いる。抗体としては、ＰＥで標識された抗α６−インテグリン抗体とビオチン化された抗αＶ−インテグリン抗体とをＡＰＣ標識されたストレプトアビジンを用いて染色する。染色用の緩衝液にはＰＢＳ／１％ ＦＢＳを用いることができる。死細胞を除くために、ＰＩを加えて、セルソーティングの準備が終わる。これをセルソーティングする（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ；４８８ｎｍアルゴンレーザーと６３３ｎｍのヘリウムネオンレーザーとが装着される）。
純化した精子幹細胞に、レンチウイルスを用いてＢｍｉ−１遺伝子を導入し、レシピエントの精巣に移植することによって、幹細胞の増幅を検定する。
男子不妊症の原因は様々であるが、精子形成不全はその主要な原因であり、Ｂｍｉ−１の機能制御がその解決につながる。したがって、Ｂｍｉ−１の機能制御が生殖機能異常疾患の治療に有用であることが認識される。
（実施例１１：神経幹細胞）
Ｂｍｉ−１ノックアウトマウスにおいて精子幹細胞が徐々に減少することを本発明者らは見出した。従って、精子幹細胞についても本発明の効果を示すことができると考えられる。
Ｂｍｉ−１は、神経にも発現し、神経幹細胞の自己複製などに関与することが考えられる。従って、神経幹細胞増幅の可能性に関して検討を行う。マウス脳室下層から神経幹細胞を当該分野において公知の手順により純化しインビトロで培養する。純化は以下の手順を用いることができる。
胎生期マウスを妊娠マウスから取り出し、断頭し、脳を取り出しＰＢＳＧの中に入れる。実体顕微鏡の下でＰＢＳＧ中、ピンセットと鋏とで線条体または脳室下層を抉り取る。取り出した組織を１５ｍｌチューブに移し、ピペットでＰＢＳＧを除去する。２匹分の組織あたり１００μｌのＭＨＭ培養液を加え、ピペッティングし組織を細切する。
１００μｌのＭＨＭ培養液を加え、細胞数を計数する。成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦまたは２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦあるいはその両方）を加えたＭＨＭ培養液中に２×１０５細胞／ｍｌ以下となるように懸濁して３７℃、５％ＣＯ２で７日間培養し、これを神経幹細胞として用いる。
あるいは、成体マウスから、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを分離し神経幹細胞を調製することもできる。ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは細胞集塊を形成しており、インビトロで培養可能である。この系を用いて、造血幹細胞と同様の解析を行うことができる。
レトロウイルスを用いてＢｍｉ−１を導入した際の神経幹細胞の増幅が得られるか、また増幅した神経幹細胞から機能的な神経細胞を誘導し、マウスに移植可能かどうかを検討する。これらの解析から、限られた神経幹細胞を効率よく増幅し、細胞治療用の神経細胞供給の効率化の可能性を図ることができる。
（実施例１２：ＨＳＣにおけるＢｍｉ−１含有複合体の異なる成分の役割）
（実験手順）
（マウス）
少なくとも８回Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６−Ｌｙ５．２）バックグラウンドと戻し交配させた、Ｂｍｉ−１−／−マウス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｇｔ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．８，７５７−７６９，１９９４）、Ｍｅｌ−１８−／−マウス（Ａｋａｓａｋａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，１５１３−１５２２，１９９６）、Ｍ３３−／−マウス（Ｋａｔｏｈ−Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９３，６８８−６９３，１９９８）およびｐ１９−／−マウス（Ｋａｍｉｊｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９１，６４９−６５９，１９９７）を、本発明において使用した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６−Ｌｙ５．２）マウスを、日本チャールズリバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ）から購入した。Ｌｙ５遺伝子座についてコンジェニックであるマウス（Ｂ６ Ｌｙ５．１）を東京大学医科学研究所動物研究センターにおいて交配および維持した。
（マウス造血幹細胞の純化）
マウス造血幹細胞（ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞）を、２ヶ月齢マウスの骨髄細胞から純化した。手短に述べると、低密度の細胞をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（１．０８６ｇ／ｍｌ；Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて分離した。この細胞を、ビオチン化抗Ｇｒ−１ｍＡｂ、ビオチン化抗Ｍａｃ−１ｍＡｂ、ビオチン化抗Ｂ２２０ｍＡｂ、ビオチン化抗ＣＤ４ｍＡｂ、ビオチン化抗ＣＤ８ｍＡｂ、およびビオチン化抗Ｔｅｒ−１１９ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からなる抗体カクテルを用いて染色した。Ｌｉｎｅａｇｅ−陽性細胞を、ストレプトアビジン磁性ビーズ（Ｍ−２８０；Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）で枯渇させた。この細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化した抗ＣＤ３４抗体、フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化した抗Ｓｃａ−１抗体、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合体化した抗ｃ−Ｋｉｔ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）でさらに染色した。ビオチン化した抗体をストレプトアビジン−テキサスレッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で検出した。４色の分析およびソーティングをＦＡＣＳ Ｖａｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。
（ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の形質導入）
マウスＢｍｉ−１のｃＤＮＡおよびマウスＭｐｈ−１のｃＤＮＡを、それらのアミノ末端でＦＬＡＧタグ化した。ＭＳＣＶに由来するＬＴＲを伴う、レトロウイルスベクターＧＣＤＮｓａｍ（ｐＧＣＤＮ）は、サブゲノムｍＲＮＡの生成のためのインタクトなスプライスドナーの配列およびスプライスアクセプターの配列を有する（Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１２，３５−４４．２００１）。マウスＢｍｉ−１ ｃＤＮＡ、マウスＭｐｈ−１ ｃＤＮＡ、マウスＭ３３ ｃＤＮＡ、およびマウスＢｃｌ−ｘＬ ｃＤＮＡをｐＧＣＤＮｓａｍのＩＲＥＳ−ＥＧＦＰコンストラクトの上流の部位にサブクローニングした。組換えレトロウイルス遺伝子を生成するために、プラスミドＤＮＡを２９３ｇｐ細胞（２９３細胞は、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むが、エンベロープ遺伝子を欠失する）に、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを用いてＣａＰＯ４共沈澱することによってトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞の上清を、１６時間、６，０００×ｇで遠心分離することによって濃縮し、次いで、１％ ＦＣＳを加えたα−ＭＥＭ（上清の初期容量の１／２００）中に再懸濁した。ウイルスの力価は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞株）への感染によって決定した。ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、組換えフィブロネクチンフラグメント（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）でコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート中に１ウェルあたり５０〜１５０細胞いれておき、そして１％ ＦＣＳ、１００ｎｇ／ｍｌマウス幹細胞因子（ＳＣＦ）、１００ｎｇ／ｍｌヒトトロンボポイエチン（ＴＰＯ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を加えたα−ＭＥＭ中で２４時間インキュベートした。次いで、硫酸プロタミン（５μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、感染多重度（ＭＯＩ）６００で、レトロウイルスベクターを用いて２４時間形質導入した。形質導入後、細胞を１％ ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、および１００ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯを加えたＳ−Ｃｌｏｎｅ ＳＦ−０３（Ｓａｎｋｏ Ｊｕｎｙａｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中でさらにインキュベートし、示された時点でインビトロコロニーアッセイまたは競合的再増殖アッセイに供した。蛍光倒立顕微鏡下で観察したＧＦＰ発現から判断すると、すべての実験において、形質導入効率は８０％より高かった。
（コロニーアッセイ）
示されたレトロウイルスで形質導入したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのマウスＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌ ヒトＴＰＯ、および２単位／ｍｌ ヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を加えたメチルセルロース培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）中にプレートした。培養ディッシュを、５％ ＣＯ２雰囲気の下で３７℃でインキュベートした。ＧＰＦ＋のコロニー数は１４日目に数えた。ＨＰＰ−ＣＦＣ（コロニー直径＞１ｍｍ）から得たコロニーを回収し、スライドガラス上にサイトスピンし、次いで形態学的試験のためにメイ−グリュンワルトギムザ染色に供した。
（娘細胞対アッセイ）
ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、０．１％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＦＣ、および１００ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯを加えたＳ−Ｃｌｏｎｅ ＳＦ−０３中で９６ウェルマイクロタイタープレート中にクローンとして沈積させておいた。一つの細胞が細胞分裂を行い、二つの娘細胞を生じたときに、娘細胞を、前述の顕微操作技術（Ｓｕｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１，２５２０−２５２４，１９８４，１９８４；Ｔａｋａｎｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９，２９５−３０２，２００４年２月）によって異なるウェルに分離した。個々の娘細胞対を、１０％ ＦＣＳ、２０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ，２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３、５０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、および２単位／ｍｌ ＥＰＯを加えたＳ−Ｃｌｏｎｅ ＳＦ−０３中でさらにインキュベートした。各娘細胞から生成したコロニーを、形態学的試験のために回収した。ＨＳＣ発生運命に対するＢｍｉ−１の効果を評価するために、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、上記のようにＢｍｉ−１レトロウイルスで形質導入した。２４時間の形質導入後、細胞を顕微操作によって９６ウェルマイクロタイタープレート中にクローンとして分離した。一つの細胞が細胞分裂を行ったときに、娘細胞を顕微操作によって再度分離し、上記のように処理した。
（競合的再増殖アッセイ）
競合的再増殖アッセイを、Ｌｙ５コンジェニックマウス系を用いて行った。手短に述べると、Ｂ６−ｌｙ５．２マウス由来の造血細胞を、骨髄競合細胞（Ｂ６−Ｌｙ５．１）と混合し、そして９．５Ｇｙの線量を照射したＢ６−ｌｙ５．１マウス中に移植した。Ｌｙ５．１造血細胞の場合は、細胞を骨髄競合細胞（Ｂ６−Ｌｙ５．２）と混合し、そしてＢ６−ｌｙ５．２マウス中に移植した。移植の４週間後および１２週間後、レシピエントの末梢血液細胞をビオチン化抗Ｌｙ５．１（Ａ２０）およびＦＩＴＣ結合体化抗Ｌｙ５．２（１０４）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて染色した。この細胞を、ＰＥ−Ｃｙ５．５結合体化抗Ｂ２２０抗体、ＡＰＣ結合体化抗Ｍａｃ−１抗体とＡＰＣ結合体化抗Ｇｒ−１抗体との混合物、およびＰＥ結合体化抗ＣＤ４抗体とＰＥ結合体化抗ＣＤ８抗体との混合物（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）によって、同時に染色した。このビオチン化抗体を、ストレプトアビジン−テキサスレッドを用いて検出した。細胞を、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ上で分析した。キメリズム百分率を、（ドナー細胞のパーセント）×１００／（ドナー細胞のパーセント＋レシピエント細胞のパーセント）として計算した。キメリズム百分率が骨髄性リンパ系列、Ｂリンパ系列およびＴリンパ系列において１．０を上回る場合、レシピエントのマウスを、多系統の再構築された（ポジティブマウス）とみなした。再増殖単位（ＲＵ）を、Ｈａｒｒｉｓｏｎ法（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９３）を用いて以下のように計算した：ＲＵ＝（ドナー細胞のパーセント）×（競合細胞の数）×１０５／１００−（ドナー細胞のパーセント）。各ＲＵの決定により、１×１０５ＢＭ細胞の再増殖活性を示す。本実施例において、ＢＭ競合細胞の数を２×１０５細胞として固定した。上に規定したＴ／Ｃ比を、Ｈａｒｒｉｓｏｎの式に以下のように当てはめた：ＲＵ＝Ｔ／Ｃ比×２。
（ＲＴ−ＰＣＲ）
半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、前述（Ｏｓａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１００，２７６９−２７７７，２００２）のようにＴａｑＭａｎげっ歯動物ＧＡＰＤＨコントロール試薬（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いる定量的ＰＣＲによって、正規化したｃＤＮＡを用いて行った。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル上で分離し、そしてエチジウムブロマイド染色によって可視化した。
（結果）
ヒト造血細胞における、ＰｃＧ遺伝子のＨＳＣ発現分析におけるＢｍｉ−１含有複合体の種々の成分の役割について、Ｂｍｉ−１が始原細胞において優先的に発現されることであり、他方、Ｍ３３、Ｍｅｌ−１８、およびＭｐｈ１／Ｒａｅ−２８を含む他のＰｃＧ遺伝子は始原細胞において検出可能でないが、分化とともに上方制御されるということであることが実証されている（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１３，２６９１−２７０３，１９９９）。しかしながら、本発明者らの詳細なマウス造血細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析によって、Ｂｍｉ−１含有複合体の成分をコードする全てのＰｃＧ遺伝子（例えば、Ｂｍｉ−１、Ｍｐｈ１／Ｒａｅ−２８、Ｍ３３、およびＭｅｌ−１８）が、わずか０．００４％の骨髄単核細胞を含むＣＤ３４−ＫＳＬ ＨＳＣにおいて高度に発現され（Ｏｓａｗａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：２４２−２４５，１９９６）、そして全てが、骨髄（ＢＭ）において分化の間に下方制御されることが明らかとなった（図１１ａ）。対照的に、Ｅｅｄ（その産物は別のＰｃＧ複合体を構成する）は、一様に発現された。これらの発現プロフィールは、Ｂｍｉ−１含有複合体による、ＨＳＣ自己再生の正の制御という概念を支持する（Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，２５５−２６０，２００３）。ＨＳＣの維持において、特徴づけされていないＰｃＧ成分であるＭｅｌ−１８およびＭ３３の役割を評価するために、本発明者らは、競合細胞よりも１０倍以上の、Ｂｍｉ−１−／−マウス、Ｍｅｌ−１８−／−マウス、Ｍ３３−／−マウスからの胎仔肝細胞を用いて競合的再増殖アッセイを行った。報告されているように、Ｂｍｉ−１−／−胎仔肝細胞は、長期間の再構築に対してまったく寄与しなかった（図１１ｂ）。再増殖活性の重大な欠損が、放射線防護アッセイにおいて確証された。このアッセイにおいて、Ｂｍｉ−１−／−マウス由来の胎仔肝細胞およびＢＭ細胞のいずれも、致死量放射線照射したレシピエントマウスを放射線保護しなかった（図１７ａ）。Ｍｅｌ−１８は、ドメイン構造、特にそれらのＮ末端ＲＩＮＧフィンガードメインおよびへリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）ドメインにおいて、Ｂｍｉ−１と非常に関連している。予想外なことに、Ｍｅｌ−１８−／−胎仔肝細胞は、Ｂｍｉ−１−／−胎仔肝細胞と比較したときに、再増殖能において非常に軽度の欠損症を示した（図１１ｂ）。さらに、Ｍ３３−／−胎仔肝細胞は、正常な再増殖能を示した（図１１ｂ）。Ｂｍｉ−１−／−胎仔肝臓の場合と同様に、Ｍｅｌ−１８−／−胎仔肝臓およびＭ３３−／−胎仔肝臓の両方が、肉眼でみえる異常（造血細胞の数を含む）を何ら示さなかった。Ｂｍｉ−１−／−の造血微小環境を試験するために、野生型ＢＭ細胞を、致死量以下の放射線照射Ｂｍｉ−１−／−マウスに移植した。引き続く２次移植は、Ｂｍｉ−１−／−のＢＭおよび脾臓の両方が、長期のリンパ性造血を支援し得ることを示し、Ｂｍｉ−１−／− ＨＳＣの内因性の欠損を再び示唆する（図１７ｂ）。
（実施例１３：Ｂｍｉ−１−／− ＨＳＣの不完全な自己再生および加速された分化）
本実施例はＢｍｉ−１−／− ＨＳＣの不完全な自己再生および加速された分化を実証する。材料および方法は、実施例１２の記載と同一であった。
（結果）
（Ｂｍｉ−１−／− ＨＳＣの不完全な自己再生および加速された分化）
Ｔｈｙ１．１ｌｏｗｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎｅｃａｇｅマーカー−ＨＳＣの数の、進行性の生後減少が、Ｂｍｉ−１−／−マウスにおいて観察されてきた（Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３）。本発明者らはまた、８週齢のＢｍｉ−１−／−マウスにおけるフローサイトメトリーにより測定したところ、約１０分の１の総ＣＤ３４−ＫＳＬ ＨＳＣを観察した。ＢＭにおけるＢｍｉ−１−／− ＨＳＣの増殖能および分化能を評価するために、本発明者らは、長期間の再増殖ＨＳＣについて非常に強化されたＣＤ３４−ＫＳＬ分画を純化した（Ｏｓａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３，２４２−２４５，１９９６）。Ｂｍｉ−１−／− ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞は、培養の第１週にわたり、野生型細胞およびＢｍｉ−１＋／−細胞と匹敵する増殖を示したが、その後、Ｂｍｉ−１−／− ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞は十分に増殖しなかった（図１２ａ）。単一細胞の成長アッセイは、Ｂｍｉ−１−／− ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞が、検出可能なコロニーを、Ｂｍｉ−１＋／＋ ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞およびＢｍｉ−１＋／− ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞と匹敵する頻度で形成することができるが、高い増殖性の潜在的なコロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）を３分の１含むことを実証した。直径が２ｍｍより大きいコロニーを生じるＨＰＰ−ＣＦＣの減少は、さらに顕著（７倍）であった（図１２ｂ）。直径が１ｍｍより大きいすべてのＨＰＰコロニーを、形態学的に評価した。驚くべきことに、Ｂｍｉ−１−／− ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞から生成されたＨＰＰコロニーの大半が、好中球およびマクロファージのみからなっていた。Ｂｍｉ−１−／− ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞は、多重系統分化能を保持する、それらのコロニー形成単位−好中球／マクロファージ／赤芽球／巨芽核球（ＣＦＵ−ｎｍＥＭ）の頻度において、Ｂｍｉ−１＋／＋ ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞に比べて９分の１に減少したことを示した（図１２ｃ）。Ｂｍｉ−１−／− ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞が、多重系統分化能力を連続的な細胞分割を通して遺伝できなかったことは、娘細胞対アッセイにおいて明らかであった（図１２ｄ）。Ｂｍｉ−１＋／＋ ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞から生成されたほとんどの娘細胞対において、この２つの娘細胞のうち少なくとも１つはｎｍＥＭ分化能を遺伝し、他方では、Ｂｍｉ−１−／− ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞は、多重系統分化能の加速された喪失を示し、それらの子孫の限定された分化および非効率な増幅を生じた。分化に関して、数が減少しているにもかかわらず、Ｂｍｉ−１−／− リンパ球において、あきらかな分化の遮断は観察されなかった（Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９７，１６４−１６８，１９９９）。ＢＭ中の骨髄性前駆細胞の分析においては、共通の骨髄性前駆細胞（ＣＭＰ）、顆粒球／マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）、または巨芽核球／赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）のいずれの比率の偏差も何ら検出されなかった（図１８）、このことは、Ｂｍｉ−１−／− マウスにおいて観察された異常な造血が、骨髄系統のいかなる特定の分化遮断も伴わないことを示す。Ｂｍｉ−１−／− ＨＳＣ機能のこれらの重大な欠損は、ＨＳＣにおけるＢｍｉ−１が無いと、回復不能なさらなる後成的異常を引き起こし、そしてＣＤ３４−ＫＳＬ細胞はもはや幹細胞特性を保持しないという可能性を想起させる。しかしながら、Ｂｍｉ−１を用いたＢｍｉ−１−／− ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞のレトロウイルス形質導入は、インビトロでの増殖および多重系統分化能におけるそれらの欠損（図１３ａおよび１３ｂ）、そしてインビボでの長期間の再増殖能（図１３ｃ）を完全にレスキューした。これらの発見は、幹細胞活性の実行が決定的にＢｍｉ−１に依存していることを示唆する。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるＭｅｌ−１８−／−マウスおよびＭ３３−／−マウスは、周産期の間か、あるいは生後まもなくに死亡するので、本発明者らは成体ＢＭ ＨＳＣにおけるそれらの役割を評価できなかった。
Ｂｍｉ−１−／− ＨＳＣにおける自己再生欠損において、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ遺伝子およびｐ１９Ａｒｆ遺伝子の脱抑制関係が報告されており（Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，２５５−２６０，２００３）、本発明者らは、造血細胞におけるそれらの発現を試験した。報告されているように、両方がＢｍｉ−１−／−Ｌｉｎ−細胞において有意に上方制御された（図１９ａ）。ｐ１６の過剰発現がＧ１−Ｓ進行を阻害し、そして増大されたｐ１９はｐ５３依存性成長停止およびアポトーシスを引き起こす（Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６０２，１５１−１６１，２００２；Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，２５５−２６０，２００３）。しかしながら、Ｂｍｉ−１−／− ＢＭ細胞（ＫＳＬ始原前駆細胞を含む）の細胞周期分析（図１３ｂ）は、野生型マウスとＢｍｉ−１−／− マウスとの間の差異を何ら判別しなかった。さらに、単一細胞アッセイにおいて、Ｂｍｉ−１−／− ＣＤ３４−ＫＳＬ ＨＳＣは、野生型コントロールと類似の様式で１回目の細胞分裂を行い（図１９ｃ）、そして総Ｂｍｉ−１−／− ＢＭ細胞が、アポトーシス細胞の割合においてわずかではあるが有意な増加を示した（図１９ｄ）にもかかわらず、検出可能なアポトーシスによる細胞死を示さなかった。さらに、レトロウイルスで形質導入されたＢｃｌ−ｘＬは、インビトロでＢｍｉ−１−／− ＨＳＣに影響を与えなかった（図１３ａおよび図１３ｂ）。これらの発見は、Ｂｍｉ−１−／− ＨＳＣにおけるｐ１６遺伝子およびｐ１９遺伝子の脱抑制が、ＨＳＣの細胞周期または生存には大きく影響しないということを示唆する。
（実施例１４：Ｂｍｉ−１の強制発現によるＨＳＣ活性の増強）
本実施例は、Ｂｍｉ−１の強制発現によるＨＳＣ活性の増強を示す。材料および方法は、実施例１２に記載のものと同一であった。
（結果）
（Ｂｍｉ−１の強制発現によるＨＳＣ活性の増強）
ＨＳＣ自己再生能力の維持におけるＢｍｉ−１の必須の役割により、本発明者らは、ＰｃＧ遺伝子によるＨＳＣ活性の増強の決定が促進された。ＣＤ３４−ＫＳＬ ＨＳＣを、Ｂｍｉ−１、Ｍｐｈ１／Ｒａｅ２８またはＭ３３のいずれかに形質導入し、次いでさらに１３日間インキュベートした（合計１４日間のエキソビボ培養）。形質導入効率は、全ての実験において８０％を超えた。ＨＳＣおよび子孫の分化よりもむしろそれらの増幅を支持するＳＣＦおよびＴＰＯの存在下では、Ｂｍｉ−１およびＭｐｈ１／Ｒａｅ２８の強制発現は、ＧＦＰコントロールと比較して、培養における明らかな増殖優位性を与えなかった（図１４ａ）。しかし、顕著なことに、Ｂｍｉ−１形質導入細胞は、多数のＨＰＰ−ＣＦＣを含んでいたが、Ｍｐｈ１／Ｒａｅ２８はそうではなかった（図１４ｂ）。コロニーの形態学的評価によって、Ｂｍｉ−１によるＣＦＵ−ｎｍＥＭの顕著な増幅が明らかになった。図１２ｄに示されるように、新たに純化したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の６０％がＣＦＵ−ｎｍＥＭと規定され得ることを考慮すると、Ｂｍｉ−１培養物において１４日かかって５６倍〜８０倍のＣＦＵ−ｎｍＥＭの正味の増幅が存在した（図１４ｃ）。Ｂｍｉ−１のこの効果は、周知のＨＳＣ活性化因子であるＨｏｘＢ４の効果に匹敵する（Ａｎｔｏｎｃｈｕｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０９，３９−４５，２００２）（図１４ｃ）。さらに、Ｂｍｉ−１形質導入細胞およびＨｏｘＢ４形質導入細胞の両方が、ＧＦＰコントロールと比較して、より高い増殖能力を示し、より大きなコロニーを生じた。予想外のことに、Ｍ３３の発現は、増殖に対して有害な効果を誘導し、そしてマクロファージへの加速した分化を引き起こし、このマクロファージは培養皿の底部に付着した（図１４ａ）。
完全な範囲の分化能力を保持するＣＦＵ−ｎｍＥＭの劇的な増幅をもたらす機構を決定するために、本発明者らは、娘細胞対アッセイを用いて、Ｂｍｉ−１の過剰発現がＨＳＣの対称的な分裂をインビトロで促進するか否かを確認した。２４時間の予備刺激の後、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、Ｂｍｉ−１発現レトロウイルスでさらに２４時間形質導入した。形質導入後、単細胞培養を、顕微操作によって開始した。一つの細胞が細胞分裂を行ったときに、娘細胞を再度分離してコロニーを形成させた。本発明から方向付けられた子孫を排除しながらＨＳＣの方向付けプロセスを評価するために、本発明者らは、遡及的推論によってｎｍＥＭ分化能を保持する娘細胞を選択した。Ｂｍｉ−１の発現を、ＧＦＰ発現によって評価した。予測した通り、Ｂｍｉ−１の強制発現は、娘細胞の対称細胞分裂を顕著に促進した（図１５）。このことは、Ｂｍｉ−１が、ＨＳＣの自己再生を促進することによりＣＦＵ−ｎｍＥＭ発現に寄与することを示す。本発明者らは次に、レシピエントマウス１匹あたり２０個の初期ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞に対応する、１０日目のエキソビボ培養細胞を用いて競合再増殖アッセイを行った。３ヵ月後、Ｂｍｉ−１形質導入ＨＳＣを受け取ったマウスは、多系列再増殖の顕著な増強を実証したが、一方、ＧＦＰ形質導入ＨＳＣによって媒介された再増殖はほとんど検出できなかった（図１６ａ）。細胞集団における再増殖能は、ドナー細胞と多数の競合細胞とのキメラから再増殖単位（ＲＵ）を算出することにより定量され得る（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１，２０６−２１９，．１９９３）。Ｂｍｉ−１形質導入ＨＳＣは、ＧＦＰコントロールと比較して３５倍高いＲＵを示した（図１６ｂ）。競合再増殖アッセイを、ｐ１９−／− ＨＳＣを用いて平行して同様に行った。本発明者らは、再増殖のＢｍｉ−１依存性増強の低下を予想した。なぜなら、ｐ１９は、Ｂｍｉ−１によって負に調節される標的の１つであるからである。それにもかかわらず、ｐ１９−／− ＨＳＣにおけるＢｍｉ−１の発現は、ｐ１９−／− ＧＦＰコントロール細胞と比較して、多系列再増殖を再度増強した（図１６ａ）。Ｂｍｉ−１形質導入ｐ１９−／− ＨＳＣを用いると、ＧＦＰ形質導入ｐ１９−／− ＨＳＣと比較して１５倍のＲＵ増加が得られた（図１６ｂ）。このデータは、ｐ１９がＨＳＣにおけるＢｍｉ−１の主な標的ではないことを示唆する。さらに、別のＢｍｉ−１標的遺伝子であってエキソビボ培養において上方制御されるｐ１６の発現は、培養細胞において、Ｂｍｉ−１によって完全に抑制された（図１６ｃ）。ＩＮＫ４遺伝子（ｐ１５ＩＮＫ４ｂ、ｐ１８ ＩＮＫ４ｃ、およびｐ１９ ＩＮＫ４ｄ）およびＣｉｐ／Ｋｉｐ遺伝子（ｐ２１、ｐ２７およびｐ５７）のような他の細胞周期調節遺伝子の発現は、Ｂｍｉ−１発現によって、それほど大きく影響されなかった。各造血系列におけるドナー細胞のキメリズム百分率の分析は、Ｂｍｉ−１形質導入ＨＳＣが骨髄性系列およびリンパ系系列に沿って完全な分化能を保持することを明らかにした（図１６ｂ）。インビトロでのデータから予測した通り、Ｍ３３で形質導入したＨＳＣは、再増殖には全く寄与しなかった（図１６ｂ）。
（考察）
ＰｃＧ遺伝子であるＢｍｉ−１およびＭｐｈ１／Ｒａｅ−２８の機能喪失分析によって、Ｂｍｉ−１およびＭｐｈ１／Ｒａｅ−２８が成体のＢＭ ＨＳＣの維持に必須ではあるが、欠損性ＨＳＣの成育には必須ではないことが実証されている（Ｏｈｔａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９５，７５９−７７０，２００２；Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，２５５−２６０，２００３）。しかし、Ｍｐｈ１／Ｒａｅ−２８−／−マウスと比較すれば、造血欠損は、Ｂｍｉ−１−／−マウスにおいて、より重篤であり、そしてＨＳＣ自己再生の弱化に起因する（Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，２５５−２６０，２００３）。本発明では、発明者らは、胎児のＭｅｌ−１８−／−の肝臓およびＭ３３−／−の肝臓においてもまた、造血欠損の正常な発達を観察した。Ｍｅｌ−１８遺伝子およびＭ３３遺伝子の両方は、ＨＳＣにおいて大いに発現されるが（図１１ａ）、Ｍｅｌ−１８−／−ＨＳＣおよびＭ３３−／−ＨＳＣは、軽度の欠損を示すか、もしくは欠損をまったく示さず、そして長期的な再増殖の能力を保持した（図１１ｂ）。従って、ＨＳＣにおけるＰｃＧ遺伝子の過剰発現は、Ｂｍｉ−１のみがＨＳＣ機能を増強するが、Ｍ３３は、完全にＨＳＣ機能を無効にすることを示した（図１４および図１６）。これらの知見はすべて、ＨＳＣの維持におけるＢｍｉ−１の中心的な役割を明瞭に述べ、そしてＢｍｉ−１タンパク質のレベルが、ＨＳＣにおけるＰｃＧ複合体の活性の決定的な決定要素であることを示唆する。Ｂｍｉ−１は、遺伝子サイレンシングに必須な分子を補充する際に、ＰｃＧ複合体のコア成分としてふるまい得るか、またはＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＨｏｘＤ遺伝子調節エレメント上のＰｌｚｆ（Ｂａｒｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ３，４９９〜５１０、２００２）、ならびに多量体クロマチン修飾因子をＥ２Ｆ応答性遺伝子およびＭｙｃ応答性遺伝子に標的化するＥ２Ｆ６（Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８，１５１９〜２４，２００１；Ｏｇａｗａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，１１３２〜１１３６，２００２）のためのドッキング部位を提供し得る。他方で、Ｍ３３が欠損性ＨＳＣの維持に不必要であるという知見は、驚きである。Ｂｍｉ−１およびＭ３３は、両方とも、発生の間ホメオ遺伝子の発現パターンの維持に関与しており、そして、上記２種の遺伝子間の強度の投与量の相互作用が、このプロセスで観察されている（Ｂｅｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５，３５４３−３５５１，１９９８）。しかし、本発明者らの知見は、Ｍ３３がＨＳＣにおいてＢｍｉ−１ ＰｃＧ複合体に寄与しないという可能性を提示する。Ｍ３３は、ヒストンＨ３の、Ｅｅｄを含む複合体によりメチル化されたリジン２７へと補充され、これにより、ＰｃＧ標的へのＢｍｉ−１を含む複合体の標的化を媒介し得る（Ｆｉｓｃｈｌｅ，Ｗ．ら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１７，１８７０−１８８１，２００３）。従って、Ｍ３３は、Ｅｅｄ−およびＢｍｉ−１を含む複合体による、Ｈｏｘ遺伝子の協調した制御のための重要分子である。その一方、ＨＳＣにおけるＭ３３の不必要な役割と、造血欠損における２種の複合体の相反的な役割に十分に相関付けられ（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１３，２６９１〜２７０３，１９９９）、Ｂｍｉ−１を含む複合体がそれ自体のサイレンシング経路を有することを示す。ＨＳＣ上の過剰負荷されたＭ３３の負の作用は、Ｍ３３によるＰｃＧ成分の鎮圧に起因し得る。ＨＳＣは、自己再生を通して維持され、そして拡張される。ＨＳＣの自己再生は、細胞分裂を通して、高度の再増殖能力および多重系列分化の潜在能力を保証する。ＨＳＣが自己再生しない場合、ＨＳＣは、増殖および分化の潜在能力が限定された、より低次の前駆細胞へと分化する。インビトロでのＨＳＣの挙動をモニタリングする、娘細胞対アッセイ（Ｓｕｄａ，Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，２５２０−２５２４，１９８４，１９８４；Ｔａｋａｎｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９，２９５〜３０２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００４）は、Ｂｍｉ−１が、連続した細胞分裂を通してＣＤ３４−ＫＳＬ細胞が多系列分化の潜在能力を継承するのに、必須であることを実証した。特に、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞におけるＢｍｉ−１の過剰発現は、その細胞の対称的な細胞分裂を促進し、このことは、Ｂｍｉ−１によって媒介される幹細胞性の遺伝形質のより高い可能性を示した（図１５）。このことは、インビトロでのＨＳＣの自己再生の遺伝的操作が成功することの初めての証拠である。インビトロとインビボとの両方でのＢｍｉ−１−／−ＨＳＣの機能的レスキューと一緒のこれらのクローンの観察は、ＨＳＣ自己再生におけるＢｍｉ−１の必須の役割を強く支持する。ＨＳＣの増殖および分化のプロセスにおいて、各前駆細胞レベルにおいて前駆細胞増幅が起こる。Ｂｍｉ−１−／−ＨＳＣは、非常に低い増殖可能性を示した。対照的に、Ｂｍｉ−１の強制発現は、ＭＰＰ増幅によってＨＳＣに対して高い増殖能を与えた（図１４）。これらの知見は、Ｂｍｉ−１は、ＨＳＣ自己再生に対して必須であるだけでなく、前駆細胞増幅に対しても必須であることを示す。ＨＳＣ自己再生におけるＢｍｉ−１についての中心的な役割はまた、ＨＳＣにおけるＰｃＧ遺伝子の過剰発現実験によって実証された。Ｂｍｉ−１媒介性増殖の利点は、始原造血細胞にほぼ限定されていることである。エキソビボ培養の間、全細胞数は、そのコントロールにほぼ相当する一方、Ｂｍｉ−１培養物において、正味５６倍〜８０倍のＣＦＵ−ｎｍＥＭ増幅および１５倍〜３５倍高い再増殖活性が得られた（図１４および図１６）。これらのデータに一致して、ＨＳＣの対称的な細胞分裂が、Ｂｍｉ−１培養物において促進された（図１５）。これらの観察から、ＨＳＣ自己再生の可能性の増強と、Ｂｍｉ−１過剰発現によって媒介される前駆細胞増幅とが示唆される。Ｂｍｉ−１が形質導入されたＨＳＣは、インビボでより高い再増殖を確立するが、Ｂｍｉ−１が形質導入されたＨＳＣ子孫のキメリズムは、２〜３ヶ月の間でプラトーに達し、インビボでの持続的増殖の利点は示されない。このことは、フローサイトメトリー分析により検出された（データは示さず）ＧＦＰ強度の有意な減少によって示唆されるように、インビボでのレトロウイルスＢｍｉ−１発現のサイレンシングに起因し得る。従って、ＨＳＣ再増殖能力の顕著な増強は、エキソビボ培養の後にＨＳＣ回復を増強することによって得られ得る。あるいは、ＨＳＣがニッシェにおいて一旦静止状態になると、Ｂｍｉ−１の増加した発現は、安定状態の造血において増殖の利点を与え得ない。ＨｏｘＢ４（周知のＨＳＣ活性化因子（Ａｎｔｏｎｃｈｕｋ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ １０９，３９−４５，２００２））の効果に対するＢｍｉ−１の類似の効果が注目される。最近の知見は、ＨｏｘＢ４の遺伝的操作がＥＳ細胞からの長期間のＨＳＣ再増殖を作製することを支持し得ることを示し（Ｋｙｂａ，Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ ９１，１２１６−１２２４，１９９８）、ＨＳＣのエキソビボ増幅は、ＨｏｘＢ４タンパク質のＨＳＣへの直接の標的化によって得られ得る（Ａｍｓｅｌｌｅｍ，Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１４２３−１４２７，２００３；Ｋｒｏｓｌ，Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１４２８−１４３２，２００３）。ＨｏｘＢ４と同様に、Ｂｍｉ−１は、ＨＳＣの治療的操作に対する新規の標的であり得る。ＰｃＧタンパク質は、発生の間にＨｏｘＢ４を含む造血遺伝子の発現を調節する（Ｔａｋｉｈａｒａ，Ｙ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４，３６７３−３６８２，１９９７）が、最終的な造血細胞におけるＨｏｘ遺伝子の調節解除は、ＰｃＧ遺伝子を欠損したマウスにおいてもまだ同定されていない（Ｏｈｔａ，Ｈ．ら、ｅＪ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５，７５９−７７０，２００２；Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５．，２００３；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２３，２５５−２６０，２００３）。本発明において、ＨｏｘＢ４発現は、Ｂｍｉ−１を過剰発現する造血細胞においてどちらにも変更されなかった（図１６ｃ）。それにもかかわらず、２つの遺伝子によるＨＳＣ活性の増強は、多くの局面においてよく類似している。これらの２つの遺伝子がＨＳＣ活性化因子としてどのように働くか、そしてこれら２つの経路の間にクロストークが存在するか否かということを尋ねることは興味深い。Ｂｍｉ−１がＨＳＣを維持する機構は、まだ確定されていない。Ｂｍｉ−１標的遺伝子（ｐ１６およびｐ１９）の抑制解除はＨＳＣ自己再生の欠損に寄与しているが、ＣＤ３４−ＫＳＬ ＨＳＣの細胞周期の状態は、Ｂｍｉ−１−／−マウスにおいて大いには変更されなかった（図１８）。さらに、アポトーシスは、クローンのＨＳＣ培養を観察する間に増加しなかった。従って、Ｂｍｉ−１−／−ｐ１６−／−ｐ１９−／−ＨＳＣの詳細な分析が、ＨＳＣにおけるそれらの役割を規定するために必要である。それにもかかわらず、ｐ１９−／−ＨＳＣは、野生型コントロールよりも高い再増殖能力を示し（図１６ａおよび図１６ｂ）、Ｂｍｉ−１によって媒介されるＨＳＣ再増殖能力の増強は、エキソビボで培養されたＨＳＣにおいて抑制されたｐ１６およびｐ１９の発現に関連する（図１６ｃ）。１つの魅力的な仮説は、ｐ１６遺伝子およびｐ１９遺伝子の抑制解除が、Ｂｍｉ−１−／−マウス胚性線維芽細胞において報告されたように（Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９７，１６４−１６８，１９９９）、始原造血細胞の早期の老化を引き起こすことである。多能性造血細胞の場合において、Ｂｍｉ−１−／−マウスにおいて観察されたように、老化とは、分化の促進と、早期の細胞周期からの退去とを意味する。ＢＭにおいて、ＨＳＣは、骨芽細胞のような支持細胞と密接に接触したニッシェに存在し（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２５，８３６−８４１，２００３；Ｃａｌｖｉ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２５，８４１−８４６，２００３）、そこではほとんどのＨＳＣは、Ｇ０期に留まる。ＨＳＣの老化は、未熟なＨＳＣ増幅を防ぐ際に決定的な生物学的重要性を有する（Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，１８０４−１８０８，２０００）。これらを合わせて、ＨＳＣ幹細胞性は、細胞周期機構の繊細な調節によって維持され得る。自己再生を調節するさらなる機構は、分化を妨げ得る（Ｗａｎｇ，Ｚ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，２０１６−２０１９，２００４年３月）。本発明者らは、Ｂｍｉ−１が未成熟造血細胞株の分化を阻害することを見出した。ＨＳＣは、大部分の骨髄性遺伝子を低いレベルで発現することがよく認識されている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｔ．ら、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ３，１３７−１４７， ２００２）。ＨＳＣにおけるＢｍｉ−１は、生物学的に有意なレベルよりも低く分化関連遺伝子発現を抑制することに関連する。Ｂｍｉ−１発現の増加は、全てではないが多くのＣ／ＥＢＰα−／−ＨＳＣの表現型変化を媒介し得、
そしてまたＣ／ＥＢＰα−／−マウスで観察された骨髄分化の際の遮断の一部を媒介し得る。Ｂｍｉ−１−／−細胞における内在的な機構のさらなる分析が、Ｂｍｉ−１の自己再生および／または分化に対する相対的な寄与を明らかにするために必要とされる。しかし、最終的には、Ｃ／ＥＢＰαの破壊が、急性骨髄性白血病の多くのヒトにおいて記載されているので、Ｂｍｉ−１が白血病性芽細胞においてアップレギュレートされるか否か、そしてそのような上方制御が白血病性幹細胞の自己再生機能（この自己再生機能は、Ｂｍｉ−１を欠如する細胞における白血病の実験モデルにおいて欠陥がある（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４２３，２５５−２６０，２００３））に寄与するか否かを調査することもまた、興味深い。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明は、従来達成できなかった程度に有効な増幅調節能を有する造血幹細胞増幅調節因子を提供する。このことにより、従来調節が困難であった造血幹細胞の増幅を調節することが達成され、造血細胞の異常に関する疾患などに利用することができるようになった。
当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。従って、本明細書に付随する特許請求の範囲は、本明細書の記載に限定されることを企図せず、むしろ特許請求の範囲は広く解釈されるべきである。
図１は、Ｂｍｉ−１模式図（下部）である。図１はまた、Ｂｍｉ−１のマウス造血幹細胞における発現を示す。 図２は、Ｂｍｉ−１形質導入の細胞増殖に対する効果を示す図である。 図３は、Ｂｍｉ−１によるコロニー形成単位顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨芽核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）への分化を示す図（７日目）である。 図４は、Ｂｍｉ−１によるコロニー形成単位顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨芽核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）への分化を示す図（１４日目）である。 図５は、実施例２の培養７日目の結果である。 図６は、実施例２の培養１４日目の結果である。 図７は、動物への移植後のＢｍｉ−１の発現（末梢血におけるドナー細胞のキメラ現象）を示す図である。 図８は、造血細胞の分化に関する模式的スキームを示す。 図９は、精巣におけるＢｍｉ−１の発現を示す。図９Ａは、Ｂｍｉ−１の免疫染色を示す。図９Ｂは、精巣をとった個体と同じ個体からの脾臓を用いたＢｍｉ−１のウェスタンブロットを示す。 図１０は、Ｂｍｉ−１ノックアウトマウスの精巣のＨＥ染色を示す。図１０Ａは、８週齢の野生型マウス（ＷＴ；ａ，ｂ）、ヘテロマウス（＋／−；ｃ，ｄ）、ノックアウトマウス（−／−；ｅ，ｆ）の精巣切片を示す。図１０Ｂは、１８週齢（ａ，ｂ）および２２週齢（ｃ、ｄ）の野生型マウスと、１８週齢のＢｍｉ−１ノックアウトマウス（−／−；ｅ，ｆ）の精巣切片のＨＥ染色を示す。 図１１は、ＨＳＣにおけるＢｍｉ−１含有複合体の成分によって果たされる役割を示す。（ａ）造血細胞におけるマウスＰｃＧ遺伝子のｍＲＮＡ発現。分析した細胞は、骨髄ＣＤ３４−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎｅａｇｅ マーカー−幹細胞（ＣＤ３４−ＫＳＬ）、ＣＤ３４＋ＫＳＬ前駆細胞、Ｌｉｎｅａｇｅマーカー−細胞（Ｌｉｎ−）、Ｇｒ−１＋好中球、Ｍａｃ−１＋単球／マクロファージ、ＴＥＲ１１９＋赤芽細胞、Ｂ２２０＋Ｂ細胞、脾臓Ｔｈｙ−１．２＋Ｔ細胞、ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞、Ｂ２２０＋Ｂ細胞、ならびに胸腺のＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞（ＤＮ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＤＰ）、ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞（ＣＤ４ＳＰ）、およびＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８ＳＰ）であった。（ｂ）ＰｃＧ遺伝子欠損ＨＳＣの競合的リンパ性造血再増殖能。Ｂｍｉ−１−／−マウス、Ｍｅｌ−１８−／−マウス、およびＭ３３−／−マウス（Ｂ６−Ｌｙ５．２）からのＥ１４胎仔肝細胞およびＢ６−Ｌｙ５．１競合細胞を混合し、そして致死量放射線照射したＢ６−Ｌｙ５．１レシピエントマウスに注入した。移植の４週間後および１２週間後のドナー細胞の、パーセントキメリズムを、平均値±Ｓ．Ｄ．として示す。 図１２は、Ｂｍｉ−１−／−ＨＳＣの自己再生欠損および分化促進を示す。（ａ）Ｂｍｉ−１−／−ＣＤ３４−ＫＳＬ ＨＳＣのインビトロでの増殖。新たに分離されたＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、ＳＣＦおよびＴＰＯの存在下で１４日間培養した。その結果を、３つの培養の平均±Ｓ．Ｄ．として示す。（ｂ）単一細胞増殖アッセイ。９６個のＣＤ３４−ＫＳＬ ＨＳＣを、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＴＰＯ、およびＥＰＯの存在下で、９６ウェルマイクロタイタープレート中にクローンとして分離した。高増殖能コロニー形成細胞および低増殖能コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣ）を、１４日目のコロニーを計数して遡及的に評価した（ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣ：それぞれ、コロニー直径＞１ｍｍおよびコロニー直径＜１ｍｍ）。この結果を、３つの培養物の平均±Ｓ．Ｄ．として示す。（ｃ）各コロニー型の頻度。ＨＰＰ−ＣＦＣに由来するコロニーを回収し、コロニー形成細胞の組成について形態学的に試験した。（ｄ）娘細胞対アッセイ。単一のＣＤ３４−ＫＳＬ ＨＳＣが細胞分裂を行い、２個の娘細胞を生じたときに、娘細胞を顕微操作により分離し、さらに培養して骨髄系統に完全に分化させた。そのコロニーを、形態学的試験のために回収した。 図１３は、Ｂｍｉ−１の再発現による、Ｂｍｉ−１−／−細胞におけるＨＳＣの機能欠損のレスキューを示す。示されたレトロウイルス（ＧＦＰコントロール、Ｂｍｉ−１およびＢｃｌ−ｘｌ）で形質導入されたＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、メチルセルロース培地にプレートし、形質導入開始から３６時間コロニーを形成させた。ＨＰＰ−ＣＦＣに由来する、直径が１ｍｍより大きいＧＦＰ＋コロニーを１４日目に計数し（ａ）、形態学的分析のために回収して、各コロニー型の頻度を評価した（ｂ）。その結果を、３つの培養物の平均±Ｓ．Ｄ．として示す。（ｃ）示された数のＢｍｉ−１−／−ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、Ｂｍｉ−１で形質導入した。形質導入の開始から３．５日後に、細胞を、Ｌｙ５．１競合細胞と一緒に、致死量放射線照射したＬｙ５．１レシピエントマウスに注射した。レスキューされたＢｍｉ−１−／−ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞による再集合を、移植から１２週間後の末梢血におけるドナー細胞のキメリズムをモニターすることにより評価した。 図１４は、ＨＳＣにおけるＢｍｉ−１の強制（誘導）発現による、ＣＦＵ−ｎｍＥＭのエキソビボでの増幅を示す。（ａ）示されたＰｃＧ遺伝子レトロウイルスで形質導入されたＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、ＳＣＦおよびＴＰＯの存在下で培養し、その増殖をモニターした。１４日目における培養細胞の形態を、倒立顕微鏡（挿入図）で観察した。（ｂ）培養の１４日目に、コロニーアッセイを行い、培養物におけるＨＰＰ−ＣＦＣ含量を評価した。ＨＰＰ−ＣＦＣ由来のＧＦＰ＋コロニーを、形態学的分析により、そのコロニー型について試験した。（ｃ）１４日の培養期間のＣＦＵ−ｎｍＥＭの正味（ｎｅｔ）の増殖。その結果を、３つの培養物の平均±Ｓ．Ｄ．として示す。 図１５は、Ｂｍｉ−１の強制発現が、ＨＳＣの対称的な細胞分裂を促進することを示す。ＣＤ３４−ＫＳＬ ＨＳＣを、ＧＦＰレトロウイルスまたはＢｍｉ−１レトロウイルスのいずれかで形質導入した。形質導入から２４時間後、細胞を顕微操作によりクローンとして分離した。単一細胞が細胞分裂を行ったときに、娘細胞を再び顕微操作により分離し、さらに培養して骨髄系統に完全に分化させた。このコロニーを、形態学的試験のために回収した。親細胞が好中球（ｎ）分化能、マクロファージ分化能（ｍ）、赤芽球分化能（Ｅ）、および巨核芽球分化能（Ｍ）を保持するはずの細胞対のみを選択した。Ｂｍｉ−１で形質導入された娘細胞の対称細胞分裂の確率は、コントロールよりも有意に高かった（ｐ＜０．０４４）。 図１６は、Ｂｍｉ−１発現によるＨＳＣの再増殖活性の亢進を示す。野生型マウスまたはｐ１９−／−マウスのいずれかに由来するＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、示されたレトロウイルスで形質導入し、ＳＣＦおよびＴＰＯの存在下でさらに培養した。競合的再増殖アッセイを、レシピエントマウス当たり２０個の開始ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞に対応する、１０日目の培養細胞を使用して行った。ドナー細胞のキメリズムパーセント（移植から１２週間後）を、点でプロットし、その平均値を棒として示す（ａ）。各系統におけるキメリズムパーセントおよび各集団における再増殖単位（ＲＵ）（ｂ）。＊ｐ＜０．００１。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、示されたレトロウイルスで形質導入され、ＳＣＦおよびＴＰＯの存在下で１４日間培養されたＣＤ３４−ＫＳＬ細胞において行った（ｃ）。 図１７は、放射性防御アッセイおよび造血を支援するＢｍｉ−１−／−微小環境の分析を示す。（ａ）Ｂｍｉ−１−／−造血細胞の放射性防御能。Ｅ１４．５胚由来の胎仔肝細胞（２×１０６）および４週齢マウス由来の総ＢＭ細胞を、致死放射量照射したＢ６−ｌｙ５．１マウスに移植した。移植された細胞の放射性防御能を、レシピエントマウスの生存をモニターすることにより評価した。（ｂ）造血を支援するＢｍｉ−１−／−微小環境の能力。Ｂ６−Ｌｙ５．１マウス由来のＢＭ細胞を、６．０Ｇｙの用量にて照射された８週齢Ｂｍｉ−１−／−マウスに移植した。８週間後、末梢血におけるドナー細胞のキメリズムパーセントを分析した。次いで、レシピエントの一匹から回収されたＢＭ細胞および脾臓細胞を、９．５Ｇｙの用量で照射された第二のレシピエント（Ｂ６−Ｌｙ５．２）に移植した。１４週間後、末梢血におけるドナー細胞のキメリズムパーセントを得た。その結果を、平均±Ｓ．Ｄ．として示す。 図１８は、インビボでの骨髄前駆細胞の発生を示す。コミットした骨髄前駆細胞を、ｌＬ−７Ｒα−Ｌｉｎ−Ｓｃａ−ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＦｃｇＲＩＩ／ＩＩＩｌｏ（ＣＭＰ）、ｌＬ−７Ｒα−Ｌｉｎ−Ｓｃａ−ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＦｃｇＲＩＩ／ＩＩＩｈｉ（ＧＭＰ）、およびｌＬ−７Ｒα−Ｌｉｎ−Ｓｃａ−ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４−ＦｃｇＲＩＩ／ＩＩＩｌｏ（ＭＥＰ）として、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ上で、既に記載されているように検出した（Ａｋａｓｈｉ，Ｋ．，Ｔｒａｖｅｒ，Ｄ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｔ．，＆ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，ＩＬ．Ａ ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｍｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｇｉｖｅｓ ｒｉｓｅ ｔｏ ａｌｌ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４０４，１９３−１９７，２０００）。数字は、ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−Ｌｉｎ−集団における各骨髄前駆細胞の頻度を示す。 図１９は、ＨＳＣにおけるｐ１６Ｉｎｋ４ａおよびｐ１９Ａｒｆ遺伝子発現の脱抑制の効果を示す。（ａ）新たに分離された正常造血細胞およびＢｍｉ−１−／−Ｌｉｎ−細胞におけるマウスｐ１６遺伝子およびマウスｐ１９遺伝子のｍＲＮＡ発現。（ｂ）４週齢マウス由来のＢＭ ＫＳＬ細胞の細胞周期の状態。ＫＳＬ細胞の細胞周期の状態を、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ上で、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ＤＮＡ Ｄｙｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して測定した。その結果を、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）として示す。（ｃ）ＣＤ３４ＫＳＬ細胞の１回目の細胞分裂の累積百分率。９６個のＣＤ３４ＫＳＬ ＨＳＣを、ＳＣＦおよびＴＰＯを含む９６ウェルマイクロタイタープレート中に、クローンとして分離した。１回目の細胞分裂が起こる日を、各単一細胞について顕微鏡的にモニターした。（ｄ）ＢＭにおけるアポトーシス細胞の頻度。アポトーシスを、６〜８週齢マウス由来の細胞を用いて、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ上でヨウ化プロピジウムおよび抗アネキシンＶ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用して評価した。初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋ＰＩ−）、後期アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋ＰＩ＋）、および総アポトーシス細胞（初期＋後期）を示す。この結果を、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝７）として示す。
配列表の説明
配列番号１は、ヒトＢｍｉ−１の核酸配列を示す（アクセッション番号：Ｌ１３６８９）。
配列番号２は、ヒトＢｍｉ−１のアミノ配列を示す。
配列番号３は、マウスＢｍｉ−１の核酸配列を示す（アクセッション番号：Ｍ６４２７９）。
配列番号４は、マウスＢｍｉ−１のアミノ配列を示す。
配列番号５は、ヒトＭｅｌ−１８の核酸配列を示す（アクセッション番号：ＮＭ＿００７１４４）。
配列番号６は、ヒトＭｅｌ−１８のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、マウスＭｅｌ−１８の核酸配列を示す（アクセッション番号：Ｄ９００８５）。
配列番号８は、マウスＭｅｌ−１８のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ヒトＭｐｈ−１の核酸配列を示す（アクセッション番号：ＮＭ＿００４４２６）。
配列番号１０は、ヒトＭｐｈ−１のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、マウスＭｐｈ−１の核酸配列を示す（アクセッション番号：Ｕ６３３８６）。
配列番号１２は、マウスＭｐｈ−１のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ヒトＭ３３の核酸配列を示す（アクセッション番号：ＸＰ＿３００６７４）。
配列番号１４は、ヒトＭ３３のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、マウスＭ３３の核酸配列を示す（アクセッション番号：ＢＣ０３５１９９）。
配列番号１６は、マウスＭ３３のアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ＧＦＰをコードする核酸配列を示す（アクセッション番号：ＡＪ２４９６４６）。
配列番号１８は、ＧＦＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、Ｂｍｉ−１（配列番号４）のＲＩＮＧフィンガードメイン欠失（ＤＲＦ；Ｄ１８−５６）変異体をコードする核酸配列を示す。
配列番号２０は、Ｂｍｉ−１（配列番号４）のＲＩＮＧフィンガードメイン欠失（ＤＲＦ；Ｄ１８−５６）変異体のアミノ配列を示す。
配列番号２１は、Ｂｍｉ−１（配列番号４）のＨＴＨＴＨＴドメイン欠失（ＤＨＴ；Ｄ１６５−２２０）変異体をコードする核酸配列を示す。
配列番号２２は、Ｂｍｉ−１（配列番号４）のＨＴＨＴＨＴドメイン欠失（ＤＨＴ；Ｄ１６５−２２０）変異体のアミノ配列を示す。
配列番号２３は、Ｂｍｉ−１（配列番号４）のプロリン／セリンリッチ領域欠失（ＤＰ／Ｓ；Ｄ２４８−３２４）変異体をコードする核酸配列を示す。
配列番号２４は、Ｂｍｉ−１（配列番号４）のプロリン／セリンリッチ領域欠失（ＤＰ／Ｓ；Ｄ２４８−３２４）変異体のアミノ配列を示す。
配列番号２５は、Ｈｏｘ遺伝子（４Ｂ）をコードする核酸配列である。
配列番号２６は、Ｈｏｘ遺伝子（４Ｂ）のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ｐ１６ＩＮＫ４ａをコードする核酸配列である。
配列番号２８は、ｐ１６ＩＮＫ４ａのアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ｐ１９ＡＲＦをコードする核酸配列である。
配列番号３０は、ｐ１９ＡＲＦのアミノ酸配列である。

Claims (43)

  1. 幹細胞の増幅を調節するための方法であって、
    （Ａ）幹細胞に、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を提供する工程；および
    （Ｂ）該幹細胞を、該増幅を調節するに十分な時間培養する工程、
    を包含する、方法。
  2. 前記増幅の調節は、増幅促進である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、外因性または内因性である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、外因性である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、核酸形態および／またはタンパク質形態である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、
    （ａ）配列番号１または３に記載の核酸配列（それぞれ、アクセッション番号Ｌ１３６８９またはＭ６４２７９）もしくはそのフラグメントによってコードされる、ポリペプチド；
    （ｂ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを有する、ポリペプチド；
    （ｃ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する、改変体ポリペプチド；または
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、
    （ａ）配列番号１または３に記載の塩基配列（それぞれ、アクセッション番号Ｌ１３６８９またはＭ６４２７９）またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド；または
    （ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列を有し、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、低分子、脂質分子、糖鎖分子、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記幹細胞は、造血幹細胞、生殖幹細胞および神経幹細胞からなる群より選択される幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 造血、生殖または神経系に関連する疾患、障害または異常状態を調節するための方法であって、
    （Ａ）幹細胞の増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を被検体に提供する工程；および
    （Ｂ）該被検体を、該増幅を調節するに十分な時間インキュベートする工程、
    を包含する、方法。
  11. 幹細胞の増幅を調節するための組成物であって、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を含む、組成物。
  12. 前記増幅の調節は、増幅促進である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記幹細胞は、造血幹細胞、生殖幹細胞および神経幹細胞からなる群より選択される幹細胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、
    （ａ）配列番号１または３に記載の核酸配列（それぞれ、アクセッション番号Ｌ１３６８９またはＭ６４２７９）もしくはそのフラグメントによってコードされる、ポリペプチド；
    （ｂ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを有する、ポリペプチド；
    （ｃ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する、改変体ポリペプチド；または
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
    を含む、請求項１１に記載の組成物。
  15. 前記Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子は、
    （ａ）配列番号１または３に記載の塩基配列（それぞれ、アクセッション番号Ｌ１３６８９またはＭ６４２７９）またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
    （ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列を有し、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    を含む、請求項１１に記載の組成物。
  16. 前記Ｂｍｉ−１は、Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８またはＭ３３と複合体を形成する、請求項１１に記載の組成物。
  17. 前記Ｂｍｉ−１は、Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８およびＭ３３と複合体を形成する、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記Ｂｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、恒常的に活性型である、請求項１１に記載の組成物。
  19. 前記Ｂｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、一過的に活性型である、請求項１１に記載の組成物。
  20. 前記Ｂｍｉ−１は、配列番号１（アクセッション番号Ｌ１３６８９）に記載の配列からなる、請求項１１に記載の組成物。
  21. さらなる細胞生理活性物質を含む、請求項１１に記載の組成物。
  22. 前記細胞生理活性物質は、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ−３Ｌからなる群より選択される因子を含む、請求項２１に記載の組成物。
  23. さらに、薬学的に受容可能なキャリアを含む、請求項１１に記載の組成物。
  24. 前記Ｂｍｉ−１調節因子は、Ｂｍｉ−１の活性化因子を含む、請求項１１に記載の組成物。
  25. Ｂｍｉ−１のプロモーターの活性を上げる因子またはＢｍｉ−１を含むＰｃＧ複合体に結合しその機能を増強する因子をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
  26. 前記Ｂｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、タンパク質または複合タンパク質形態をとる、請求項１１に記載の組成物。
  27. 前記Ｂｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、核酸形態をとる、請求項１１に記載の組成物。
  28. 前記核酸形態のＢｍｉ−１またはそのフラグメントもしくは改変体および／またはＢｍｉ−１調節因子は、ベクターに含まれる、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、請求項２８に記載の組成物。
  30. 造血、生殖および神経系に関連する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための方法であって、
    処置または予防するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を、そのような調節を必要とする被検体に投与する工程、
    を包含する、方法。
  31. 造血、生殖および神経系に関連する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための薬学的組成物であって、処置または予防するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を含む、組成物。
  32. 幹細胞の増幅を調節するためのキットであって、
    （Ａ）増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を含む組成物；および
    （Ｂ）該組成物を幹細胞へ提供し、造血幹細胞を培養することを指示する指示書、
    を備える、キット。
  33. 幹細胞の増幅を調節するための、Ｂｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子の使用。
  34. 幹細胞系列の増幅細胞を生産するための方法であって、
    （Ａ）幹細胞または始原細胞を提供する工程；
    （Ｂ）該幹細胞または始原細胞に、増幅を調節するに十分な量のＢｍｉ−１またはその改変体もしくはフラグメントおよび／またはＢｍｉ−１調節因子を提供する工程；および
    （Ｃ）該幹細胞を、該増幅を調節するに十分な時間培養する工程、
    を包含する、方法。
  35. 前記幹細胞は、造血系、生殖系および神経系からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 請求項３５に記載の方法によって得られた細胞。
  37. 請求項３５に記載の方法によって得られた細胞から得られた組織。
  38. 請求項３５に記載の方法によって得られた細胞から得られた臓器。
  39. 請求項３５に記載の方法によって得られた細胞を含む、医薬。
  40. 幹細胞またはそれに由来する増幅細胞を必要とする疾患または障害を処置または予防するための方法であって、
    Ａ）請求項３５に記載の方法によって得られた細胞をそのような処置または予防を必要とする被検体に投与する工程、
    を包含する、方法。
  41. 請求項３５に記載の方法によって得られた細胞の、幹細胞またはそれに由来する増幅細胞を必要とする疾患または障害を処置または予防するための使用。
  42. 幹細胞の増幅を調節するための因子をスクリーニングするための方法であって、
    Ａ）該因子の候補物質を提供する工程；
    Ｂ）該物質をＢｍｉ−１を含む細胞に曝露する工程；および
    Ｃ）該Ｂｍｉ−１が調節されたかどうかを決定する工程であって、該Ｂｍｉ−１が調節された場合、該物質を幹細胞の増幅調節因子であると判断する、工程、
    を包含する、方法。
  43. 請求項４２に記載の方法によって得られる、造血幹細胞の増幅調節因子。
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