PT2283154E - Diagnóstico molecular para cancros cervicais invasivos induzidos por hpv e as suas lesões precursoras de alto grau - Google Patents

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DESCRIÇÃO "METILAÇÃO DE PROMOTOR MAL E CADMl, UM MARCADOR DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA CANCROS CERVICAIS INVASIVOS INDUZIDOS POR HPV E AS SUAS LESÕES PRECURSORAS DE ALTO GRAU"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção diz respeito ao campo da prevenção do cancro e diagnóstico médico; está relacionada com um marcador de diagnóstico molecular para cancros induzidos pelo papilomavirus humano (HPV) e suas lesões precursoras de alto grau, tais como cancro invasivo do colo do útero e lesões do colo do útero pré-malignas. Em particular, a presente invenção diz respeito à utilização da sequência genómica e regulatória MAL ou seus produtos genéticos como marcador de lesões pré-malignas induzidas por hrHPV com potencial invasivo e cancros invasivos induzidos por hrHPV.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro do colo do útero é o segundo cancro mais comum nas mulheres a nivel mundial e é responsável por aproximadamente 250 mil mortes de cancro por ano. O desenvolvimento do carcinoma de células escamosas do colo do útero caracteriza-se por uma sequência de lesões pré-malignas, a denominada neoplasia intraepitelial cervical (CIN), com graus que vão de 1 a 3, referindo-se a displasia ligeira (CIN 1), displasia moderada (CIN 2) e displasia/carcinoma grave in situ (CIN 3), respetivamente. CIN 1 também é referido como lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (LSIL) e CIN 2 e CIN 3 ambas como lesão 2 intraepitelial escamosa de alto grau (HSIL) . Para o adenocarcinoma cervical, o adenocarcinoma in situ (ACIS) é uma lesão precursora estabelecida. Em princípio, estas lesões pré-malignas são reversíveis, apesar de quanto mais grave a lesão, menor serem as probabilidades de regressão espontânea. 0 cancro do colo do útero é considerada uma doença prevenível porque as fases pré-malignas podem ser detetadas por citologia exfoliativa e tratadas com relativa facilidade quando necessário, com efeitos secundários menores. 0 rastreio do colo do útero tem como objetivo o diagnóstico precoce de lesões cancerosas tratáveis pré-malignas de alto grau (ou seja, CIN 2/3 e adenocarcinoma in situ), reduzindo assim a mortalidade do cancro do colo do útero invasivo. A prática médica habitual compreende o tratamento de todas as mulheres com CIN 2, CIN 3 e adenocarcinoma in situ morfologicamente confirmados, por forma a evitar 0 desenvolvimento do cancro do colo do útero.

Ao longo da última década, ficou bem assente que a carcinogenese do colo do útero é iniciada por uma infeção pelo papilomavírus humano de alto risco (hrHPV). Foi demonstrador que a expressão dos oncogenes virais E6 e E7, que perturbam as vias supressoras de tumor p53 e Rb, respetivamente, é essencial para o advento da oncogénese e a manutenção de um fenótipo maligno. Como tal, o teste de hrHPV surgiu como uma ferramente de rastreio primária e atraente. Contudo, consistente com um processo multifásico de carcinogénese, são necessárias alterações adicionais no genoma da célula hospedeira para progressão de uma célula infetada com hr-HPV para célula cancerígena invasiva. Apenas uma pequena proporção de mulheres infetadas com HPV de alto risco desenvolvem lesões do colo do úteros pré-malignas de alto grau (CIN 2/3) e, se não for tratado, 3 cancro do colo do útero. Na maioria das mulheres com lesões do colo do útero pré-malignas as lesões regridem de forma espontânea. Das mulheres que participam em rastreio populacional cerca de 5-6% têm um teste hrHPV positivo (Bulkmans et al., Int J Câncer 2004,110:94-101). Contudo, apenas um máximo de 20% delas (1% das mulheres participantes) têm >CIN 2/3. Como tal, o rastreio primário por teste de hrHPV será acompanhado de um número substancial de procedimentos de acompanhamento redundantes e ansiedade desnecessária entre as mulheres, a não ser que possam ser aplicados marcadores a esfregaços cervicais que permitam a estratificação de mulheres com hrHPV positivo para risco de >CIN 2/3 e >adenocarcinoma in situ.

Um grande desafio é reduzir a percentagem de mulheres com teste positivo para aquelas que têm lesões clinicamente significativas. Uma forma é usar a citologia como teste secundário (a chamada triagem) para mulheres com hrHPV positivo. Ainda assim, isto ainda deixa um número substancial de mulheres com hrHPV positivo com citologia normal (3,5% das mulheres na população rastreada), das quais 10% têm ou adquiriram >CIN 2/3. Para além disso, a citologia não é uma opção para espécimes cervico-vaginais autorecolhidos que possam ser feitos em casa, já que não são representativos do estado citológico do colo do útero (Brink et al., 2006, J. Clin. Microbiol. 44:2518-2523). Como tal, existe a necessidade de ferramentas suplementatres ou alternativas para estratificar mulheres com hrHPV positivo naquelas com ou sem áciN 2/3 e >adenocarcinoma in situ. A WO 2004/087962 revela um método de metilação do promotor CADM1 em lesões do colo do útero pré-malignas e malignas. A WO 2007/007205 revela um método de metilação do promotor CADM1 em lesões do colo do útero pré-malignas e malignas. 4

SUMARIO DA INVENÇÃO

Os inventores desenvolveram agora um marcador diagnóstico (molecular) baseado em alterações MAL, em particular MAL mRNA reduzido e expressão de proteina, bem como uma hipermetilação do promotor MAL para identificar lesões pré-cancerigenas de alto grau induzidas por papilomavírus humano (HPV) como as lesões do colo do útero pré-malignas de cancro do colo do útero invasivo e lesões precursoras de alto risco induzidas por papilomavirus humano (HPV) de cancros invasivos não-cervicais em material celular obtido por raspagem, lavagem ou por outros meios e/ou tecido. Em particular, a presente revelação diz respeito à utilização do gene MAL (incluindo o seu promotor) e os seus produtos do gene como marcador para lesões de alto grau induzidas por HPV, permitindo uma deteção precoce e melhores opções de tratamento para o aciente individual.

Foi agora descoberto de forma surpreendente que a codificação do gene da proteina associada à maturação do linfócito T, também conhecida como proteína de diferenciação de célula T (de seguida referida como MAL; Genbank Accession NM_002371) está envolvida como gene supressor de tumor em carcinogénese cervical e que um baixo nivel de expressão do gene MAL sobretudo causado por metilação do promotor MAL é um determinante importante da carcinogénese do colo do útero. As sequências genómicas e regulatórias MAL e os seus produtos genéticos providenciam assim marcadores valiosos para diagnosticar o cancro cervical invasivo e as suas lesões precursoras de alto grau. Em particular quando combinadas com análise de metilação de CADM1 (Genbank ID NM 014333.3) para cancro do colo do útero invasivo e suas lesões precursoras de alto grau é alcançada uma grande sensibilidade que excede a 5 registada na citologia do colo do útero. Adicionalmente, a presente revelação adequa-se a diagnose de cancros invasivos associados a hrHPV não-cervical e às suas lesões precursoras de alto grau. 0 cancro do colo do útero está quase exclusivamente associado a infeção pelo papilomavirus humano (HPV). Os virus do papiloma humano consitutem um grupo de mais de 100 tipos de virus identificados por variações da sequência de ADN. Os vários HPV provocam uma variedade de doenças cutâneas e mucosas. Os HPV são classificados genericamente em tipos de alto e baixo risco, com base na sua capacidade de induzir alterações malignas nas células infetadas. Os tipos de HPV de baixo risco como 1, 2, 4, 6, 11, 13 e 32 são essencialmente associados a lesões benignas ou verrugas comuns, enquanto os tipos de alto risco como 16, 18, 31, 33, 35 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, e 68 estão essencialmente associados a lesões epiteliais malignas e pré-malignas. Estes tipos de HPV de alto risco provocam crescimentos que são normalmente planos e quase invisíveis quando comparados com as verrugas causadas por tipos de baixo risco, por exemplo HPV-6 e HPV-11. Foi descoberto que os tipos de HPV de alto risco causam carcinoma invasivo do colo do útero, bem como carcinoma invasivo noutros locais do trato anogenital e/ou zona da cabeça e pescoço. Como tal, a presente revelação não só se adequa à deteção de cancro cervical invasivo e seus estágios precursores associados com proteína associada a maturação linfócita T (MAL), mas também outros cancros invasivos e correspondentes estágios precursores induzidos por HPV, em particular do tipo de alto risco. Assim, a presente revelação providencia um método para avaliação de risco de qualquer lesão pré-maligna ou cancro invasivo de alto risco induzido por HPV. 6

Em conformidade, a presente invenção providencia métodos como definido na reivindicação 1.

Lesões precursoras e cancros invasivos induzidos por HPV muito adequados no contexto da presente invenção são lesões cervicais pré-cancerigenas e cancros cervicais invasivos, mas também lesões precursoras e cancros invasivos induzidos por HPV de alto risco em outros tecidos como a cavidade oral, orofaringe, ânus, reto, pénis, vulva, vagina, etc.

Uma célula de teste pode ser uma célula (pré)neoplástica, uma célula cervical proliferativa, ou qualquer outra célula em que a presença de uma lesão precursora induzida por HPV com potencial invasivo e cancro invasivo induzido por HPV associados a proteina associada a maturação do linfócito T (MAL) deve ser detetada. A presente revelação também providencia métodos de detetar lesões precursoras induzidas por HPV com potencial invasivo ou cancro invasivo induzido por HPV associado a proteina associada a maturação do linfócito T (MAL) num sujeito necessitado, o referido método compreendendo contactar um componente celular alvo de uma célula de teste com um reagente que deteta MAL e detetando uma alteração em MAL quando comparada com a de uma célula normal comparável, de preferência sendo determinada na referida deteção uma metilação aumentada do promotor de MAL e sequências intrónicas ricas em CpG na célula de teste e/ou uma produção de MAL reduzida na célula de teste quando comparada com uma célula normal comparável.

Em outro aspeto, a presente revelação diz respeito à utilização de marcadores de diagnóstico moleculares como definido na reivindicação 13 para a deteção de lesões precursoras de alto grau induzidas por HPV e cancro 7 invasivo induzido por HPV associado à proteína associada à maturação do linfócito T (MAL), em que o referido marcador indica a metilação do promotor MAL e/ou expressão de mRNA associada à produção do polipéptido MAL. Com esta utilização, pode ser prevista a presença de uma lesão pré-cancerígena de alto grau ou cancro invasivo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a região reguladora de MAL 5' , a sequência de codificação, a parte rica em CpG da primeira sequência intrónica e sequências não codificadas 3' transcritas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO "Expressão" refere-se à transcrição de um gene para RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou RNA mensageiro (mRNA) e, se aplicável, translação subsequente para um polipéptido ou proteína. 0 termo "cancro invasivo induzido por HPV" refere-se a um carcinoma induzido por HPV de alto risco que invade o tecido circundante. Isto inclui todos os histotipos de carcinoma induzidos por HPV, ou seja, carcinomas de célula escamosa, adenocarcinomas, carcinomas adenoescamosos e carcinomas neuroendócrinos em órgãos relevantes como o colo uterino, cavidade oral, orofaringe, ânus, reto, pénis, vulva, vagina, etc. 0 termo "cancro cervical invasivo" refere-se a um carcinoma cervical invadindo tecido circundante. Isto inclui todos os histotipos de carcinoma, ou seja, carcinomas de célula escamosa, adenocarcinomas, carcinomas adenoescamosos e carcinomas neuroendócrinos.

Os termos "lesão pré-maligna" e "lesão precursora" referem-se a uma etapa na evolução celular multifásica até cancro com uma hipótese fortemente aumentada de progredir para carcinoma. Com a morfologia clássica, o patologista não consegue predizer qual destas lesões progredirá ou regredirá no paciente individual. A presente patente refere-se a um método que pode prever cancro invasivo ou uma sua lesão precursora de alto grau. 0 termo "lesão cervical pré-maligna de alto grau" refere-se a uma etapa na evolução celular multifásica até cancro cervical com uma hipótese fortemente aumentada de progredir para carcinoma cervical. 0 termo "capaz de hibridizar especificamente para" refere-se a uma sequência de ácido nucleico capaz de fazer par de base especifico com uma sequência de ácido nucleico complementar e de se ligar ai para formar um duplex de ácido nucleico.

Um "complemento" ou "sequência complementar" é uma sequência de nucleótidos que forma um duplex de ligação hidrogénio a outra sequência de nucleótidos de acordo com as regras de pares de base Watson-Crick. Por exemplo, a sequência de base complementar para 5'-AAGGCT-3' é 3'-TTCCGA-5'. 0 termo "condições de hibridização estringentes" refere-se a condições de hibridização que afetam a estabilidade de hibridos, por exemplo a temperatura, a concentração de sal, o pH, a concentração de formamida e semelhantes. Estas condições são empiricamente otimizadas para maximizar a ligação especifica e minimizar a ligação não-especifica do primário ou sonda à sua sequência alvo de ácido nucleico. Os termos como usados incluem referência a condições sob as quais uma sonda ou primário irá hibridizar para a sua 9 sequência alvo, para um grau detetavelmente maior do que outras sequências (por exemplo pelo menos duas vezes sobre o fundo). As condições estringentes dependem da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. As sequências mais longas hibridizam especificamente a temperaturas mais elevadas. Em geral, as condições estringentes são selecionadas para ser cerca de 5°C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica a uma forma iónica definida e pH. Tm é a temperatura (sob força iónica e pH definidos) em que 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza para uma sonda ou primário perfeitamente compatíveis. Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 ião M Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 de concentração de ião M Na (ou outros sais) com pH 7.0 a 8.3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas ou primários curtos (por exemplo 10 a 50 nucleótidos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas ou primários longos (por exemplo maior do que 50 nucleótidos). As condições estringentes podem também ser alcançadas mediante adição de agentes desestabilizadores como a formamida. Condições estringentes exemplarmente baixas ou "condições de estringência reduzida" incluem hibridização com uma solução tamponada de 30% de formamida, 1 M NaCI, 1% SDS a 37°C e uma lavagem em 2 x SSC a 40°C. Condições de estringência exemplares incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M NaCI, 1% SDS a 37°C e uma lavagem em 0,1 x SSC a 60°C. Os procedimentos de hibridização são conhecidos na área e são descritos por exemplo em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994. O termo "oligonucleótido" refere-se a uma sequência curta de monómeros nucleótidos (normalmente 6 a 100 nucleótidos) unidos por ligações de fósforo (por exemplo fosfodiéster, 10 alquila e aril-fosfato, fósforotioato) ou ligações não-fósforo (por exemplo péptido, sulfamato e outros) . Um oligonucleótido pode conter nucleótidos modificados com bases modificadas (por exemplo citosina 5-metila) e grupos de açúcar modificado (por exemplo ribosila 2'0-metila, ribosila 2' -O-metoxietila, ribosila 2'-fluor, ribosila 2'-amino e semelhantes) . Os oligonucleótidos podem ocorrer naturalmente ou podem ser moléculas sintéticas de ADN de cadeia dupla ou única e RNA de cadeia dupla ou única com formas circulares, ramificadas ou lineares e opcionalmente incluindo dominios capazes de formar estruturas secundárias estáveis (por exemplo estruturas de haste-ansa e ansa-haste-ansa). O termo "primário" como aqui usado refere-se a um oligonucleótido capaz de recozimento para o alvo de amplificação permitindo uma polimerase ADN para se ligar assim servindo como ponto de iniciação da sintese ADN quando colocada sob condições nas quais é induzida a sintese do produto de extensão primário que é complementar a uma cadeia de ácido nucleico, ou seja na presença de nucleótidos e de um agente para polimerização como polimerase ADN e a uma temperatura adequada e pH. O primário (amplificação) é de preferência de cadeia única para eficiência máxima na amplificação. De preferência o primário é um ribonucleótido oligodeoxi. O primário tem de ser suficientemente longo para primar a sintese de produtos de extensão na presença do agente de polimerização. Os comprimentos exatos dos primários dependerão de muitos fatores, incluindo a temperatura e origem do primário. Um "par de primários bidirecionais" como aqui usado refere-se a um primário de avanço e um de retrocesso como normalmente usados no campo da amplificação de ADN, como na amplificação de reação em cadeia polimerase (PCR). 11 0 termo "sonda" refere-se a uma sequência de oligonucleótido de cadeia única que irá reconhecer e formar um duplex de ligação hidrogénio com uma sequência complementar num analito alvo de sequência de ácido nucleico ou o seu derivado cADN. 0 gene MAL (proteína associada a maturação do linfócito T) (Genbank Acession NM_002371) tem originalmente sido identificado como um gene expressado diferencialmente durante o desenvolvimento da célula T (Alonso e Weisman 1987, Proc.Natl.Acad.Sei, USA, 84, 1997-2001). MAL codifica uma proteína de membrana integral 17kDa e é um componente de microdomínios de membrana ricos em glicolípidos ou lajes (Kim et al., 1995, J.Neurosci .Res., 42, 413-422). MAL tem um papel essencial como componente da maquinaria de proteína para transporte atípico de proteínas de membrana e secretórias em células epiteliais polarizadas (Cheong et al., 1999, Proc.Natl.Acad.SCI, USA, 84, 6241-6248).

Foi detetada expressão MAL reduzida em vários cancros humanos, incluindo cancro do esófago, gástrico e coloretal (Mimori, et al., 2003, Oncogene,22, 3463-3471; Mimori 2007 et al., Ann. Surg. Oncol., 14, 1670-1677).

No cancro coloretal, a infra-regulação de MAL tem sido associada com hipermetilação de promotor (Mori et al., 2006, Gastroenterology, 131, 797-808; Lind et al., 2007 Gastroenterology, 132, 1631-1632).

Um papel funcional de MAL atuando como gene supressor de tumor foi demonstrado por re-expressão do gene MAL em células cancerígenas do esófago, resultando numa supressão de mobilidade, invasão e tumorogenicidade, ao mesmo tempo que promovia a apoptose (Mimori et al., 2003, Oncogene, 22, 3463-3471). 12

Os presentes inventores estabeleceram agora que as alterações em MAL, incluindo metilação do promotor MAL e expressão MAL reduzida são um acontecimento frequente em carcinomas cervicais dos histotipos carcinoma de célula escamosa, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma e carcinoma neuroendócrino, e nas suas lesões precursoras de alto grau. Estudos in vitro mostraram um envolvimento funcional de inativação MAL no desenvolvimento do cancro cervical, como sobreexpressão de MAL em células de HPV16 contendo proliferação reduzida de linha celular de cancro cervical SiHa e crescimento independente de ancoragem suprimido. Ainda mais interessante, os presentes inventores demonstraram que pode ser detetada nas amostras de raspagens cervicais não apenas a hipermetilação do promotor MAL mas também, de forma notável, a expressão mRNA, e assim predizer a presença de uma lesão CIN de alto grau ou carcinoma invasivo. Para além disso, a metilação do promotor MAL pôde ser detetada em espécimes cervico-vaginais recolhidos por auto-amostragem e descobriu-se estar associada à presença de uma lesão CIN de alto grau subjacente ou cancro cervical invasivo.

De forma interessante, ao combinar análise de metilação de MAL com uma região promotora de CADM1 recentemente selecionada (Genbank ID NM_014333.3) é atingida uma elevada sensibilidade para >CIN 2 que excede a da citologia. Para além disso,, ao contrário da citologia, a análise de metilação para ambos os genes pode também ser realizada com sucesso em espécimes cervico-vaginais e vulvares provenientes de auto-recolhas.

Estes resultados indicam que a deteção de metilação de promotor MAL em combinação ou não com expressão MAL reduzida ou metilação de promotor CADM1 em raspagens 13 cervicais e espécimes cervico-vaginais auto-recolhidos pode predizer doenças CIN de alto grau ou cancro cervical.

Em conformidade, a presente revelação providencia métodos como definido na reivindicação 1 de deteção de lesões pré-cancerígenas de alto grau induzidas por HPV e cancro invasivo induzido por HPV associado a proteína associada a maturação do linfócito T (MAL) num sujeito necessitado, ou com tal indicação, o referido método compreendendo contactar um componente celular de uma célula de teste do sujeito com um reagente que deteta o nivel de componente celular na célula de teste e determina uma modificação no nível do componente celular na célula de teste quando comparada com uma célula saudável comparável, em que o componente celular indica o nível de MAL na célula e a modificação indica a presença de lesões precursoras induzidas por HPV com potencial invasivo e cancros cervicais induzidos por HPV. A célula de teste do sujeito pode compreender uma célula de uma amostra das células mucosas, como células cervicais, e também outro tecido como da cavidade, oral, orofaringe, pénis, vulva, ânus, reto e outros tecidos em que uma lesão precursora ou cancro associados a HPV deverão ser detetados. Todas estas amostras podem ser usadas num método da presente revelação. Uma amostra de células de uma paciente para utilização no método da presente invenção compreende células cervicais como células de teste. As células cervicais podem ser por exemplo apresentadas como espécime histológico ou citológico. Os espécimes citológicos compreendem esfregaços cervicais convencionais, bem como preparações de camada fina de espécimes cervicais e espécimes cervico-vaginais ou vaginais recolhidos por auto-amostragem. 14

Um método da presente invenção é particularmente adequado para a deteção de lesões cervicais pré-cancerigenas de alto grau e cancros invasivos associados à proteína associada a maturação do linfócito T (MAL) que são induzidos por HPV de alto risco. Um método para detetar lesões pré-cancerígenas de alto grau induzidas por HPV e cancros invasivos induzidos por HPV associados à proteína associada à maturação do linfócito T (MAL) pode em conformidade relacionar-se com a medição da expressão MAL, como sob a forma de medição de transcritos do gene MAL e/ou proteínas subsequentes traduzidas dos referidos transcritos. Também um método de deteção de lesões pré-cancerígenas de alto grau induzidas por HPV com potencial invasivo e cancros invasivos induzidos por HPV pode compreender a medição da metilação do promotor MAL como indicação da capacidade de expressão MAL e/ou capacidade de produção da proteína MAL. A Figura 1 mostra a região promotora rica em CpG e primeira sequência intrónica rica em CpG do gene MAL, bem como a sequência de codificação e sequência 3' não codificada transcrita. A metilação das sequências ricas em CpG particularmente na região promotora resultará numa transcrição fortemente diminuída ou mesmo bloqueio total da transcrição. Como tal, a região promotora providencia uma sequência de marcador positiva para o potencial de expressão deste gene. Em alternativa, a expressão do gene MAL pode ser detetada medindo os transcritos do gene. Assim, a região de codificação para a proteína MAL neste gene providencia uma sequência de marcador para deteção de transcritos do gene. Ainda em outra alternativa, a expressão do gene MAL pode ser detetada medindo diretamente a proteína MAL. 0 componente de célula de teste contactado pode assim ser ácido nucleico, como ADN ou RNA, de preferência mRNA, ou 15 proteína. Quando um componente celular é proteína, o reagente é tipicamente um anticorpo anti-MAL. Quando o componente é ácido nucleico, o reagente é tipicamente uma sonda de ácido nucleico (ADN ou RNA) ou primário (PCR) . Ao usar tais sondas ou primários, os produtos de expressão de gene como mRNA podem por exemplo ser detetados. Em alternativa, quando o componente é ácido nucleico, o reagente pode também ser uma endonuclease de restrição, de preferência uma endonuclease de restrição sensível à metilação para a deteção da presença de grupos metila no ácido nucleico da célula de teste, o referido ácido nucleico da célula de teste sendo então de preferência ADN. 0 componente de célula de teste pode ser detetado diretamente in situ ou pode ser isolado de outros componentes de célula por métodos comuns conhecidos dos especialistas antes de contactar com o reagente (ver, por exemplo, "Current protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. 1995. 4th edition, John Wiley and Sons; "A Laboratory Guide to RNA: Isolation, analysis and synthesis", Krieg (ed.), 1996, Wiley-Liss; "Molecular

Cloning; A Laboratory Manual", J. Sambrook, E.F. Fritsch. 1989. 3 Vols, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory

Press) .

Os métodos de deteção incluem tais análises como análises Southern e northern blot, proteção RNase, imunoensaios, hibridização in situ, PCR (Mullis 1987, U.S. Pat. N° 4,683,202 en 4,800,159), LCR (Barany 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:189-193; EP Application N° 320,308), 3SR (Guatelli e tal., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173-1777), Q-Beta Replicase (Lizardi et al., 1988,

Bio/Technology 6:1197), Rolling Circle Amplification (RCA) ou outros métodos para a amplificação de ADN. Num método alternativo, pode ser detetado RNA por tais métodos como 16 NASBA (L.Malek et al., 1994, Meth. Molec. Biol. 28, Ch. 36, Isaac PG, ed., Humana Press, Inc., Totowa, N.J.) ou TMA.

As sondas de ácido nucléico, primários e anticorpos podem ser etiquetados de forma detetável, por exemplo, com um radioisótopo, um composto fluorescente, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, um quelante de metal, uma enzima ou uma estrutura ligante biologicamente relevante como a biotina ou digoxigenina. Os especialistas da área conhecerão outras etiquetas adequadas para associar aos reagentes ou conseguirão determiná-las usando experiências de rotina.

Outros métodos de deteção incluem análises como as que podem ser realizadas com sistemas de ácido nucléico (consultar entre outros Chee et al., 1996, Science 274(5287):610-614). Por exemplo, podem ser usadas matrizes de ADN para a deteção de ácidos nucleicos de acordo com a invenção. Tais matrizes compreendem oligonucleótidos com sequências capazes de hibridizar sob condições estringentes para o componente celular de ácido nucléico do qual é detetado o nível num método da presente invenção.

Uma vez que a presente revelação mostra que um nível reduzido de transcrição MAL é muitas vezes resultado da hipermetilação do gene MAL, é muitas vezes desejável determinar se o gene MAL está hipermetilado. Em particular, as zonas ricas em citosina denominadas "ilhas CpG", que se situam essencialmente nas regiões regulatórias 5' dos genes são normalmente não-metiladas. O termo "hipermetilação" inclui qualquer metilação de citosina numa posição normalmente não-metilada na sequência do gene MAL (por exemplo, o promotor MAL, primeira sequência exon e primeira sequência intrónica, ver Figura 1). A hipermetilação pode, por exemplo, ser detetada por tratamento de endonuclease 17 de restição do (gene) polinucleótido MAL e análise Southern blot. Como tal, num método da invenção a análise de endonuclease de restrição é preferida para detetar a hipermetilação do gene MAL. Pode ser usada qualquer endonuclease de restrição que inclua CG como parte do seu sitio de reconhecimento e que seja inibida quando o C é metilado. As endonucleases de restrição sensiveis à metilação como BssHII, Mspl, Notl ou Hpall, usadas isoladamente ou em combinação, são exemplos de tais endonucleases. Outras endonucleases de restrição sensiveis à metilação serão do conhecimento dos especialistas da área.

Outros métodos para deteção da hipermetilação do promotor MAL envolvem modificação de bissulfitos de ADN, na qual as citosinas não-metiladas são convertidas para uma uracila, enquanto as citosinas metiladas são protegidas de modificação química. A subsequente amplificação PCR e sequenciamento revelam se as citosinas nas ilhas CpG são mantidas em caso de metilação ou substituídas por uma uracila em caso de um estado não-metilado. Outro método envolve o tratamento de um produto amplificado por PCR gerado por ADN modificado por bissulfitos com endonuclease de restrição que inclui CG como parte do seu sítio de reconhecimento.

Um meio alternativo de testar sequências metiladas é um PCR de metilação espcífica que também se baseia na modificação por bissulfitos do ADN, seguida de reação PCR específica que visa sequências ricas em CpG.

Para propósitos de revelação, um anticorpo (ou seja, um anticorpo anti-MAL) ou sonda de ácido nucleico específica para MAL podem ser usados para detetar a presença de polipéptidos MAL (usando o anticorpo) ou polinucleótidos 18 MAL (usando sonda de ácido nucleico) em fluidos biológicos ou tecidos. Os oligonucleótidos primários baseados em qualquer região de sequência de codificação e região de sequência reguilatória na sequência MAL são úteis para amplificar o ADN, por exemplo por PCR.

Ao usar primários PCR, sondas de ácido nucleico ou endonucleases de restrição é analisada a região regulatória 5', primeira sequência intrónica e sequência de codificação da sequência MAL (como especificado na Figura 1).

Pode ser usado qualquer espécime contendo uma quantidade detetável de antigénio polinucleótido MAL ou polipéptido MAL. 0 ácido nucleico também pode ser analisado por métodos RN A in situ conhecidos dos especialistas na área tal como hidridização in situ. As amostras preferidas para teste de acordo com os métodos da invenção incluem espécimes como raspagens (cervicais ou vaginais), lavagens ou zaragatoas cervico-vaginais, e/ou biópsias (cervicais) e semelhantes. Apesar do sujeito poder ser qualquer mamífero, de preferência o sujeito é um humano.

Os métodos revelados podem usar anticorpos imunoreativos com polipéptido MAL, cuja sequência aminoácida prevista se encontra disponível como GenBank Accession n° NP_002362.1, e 3 transcritos alternativos NP_071883.1, NP_071884.1, NP_071885.1, ou seus fragmentos imunoreativos. Podem ser usados anticorpos consistindo essencialmente de anticorpos monoclonais agrupados com diferentes especificidades epitópicas, bem como diferentes preparados de anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais são feitos de antigénio contendo fragmentos da proteína por métodos conhecidos dos especialistas da área (Kohler, et al., Nature, 256: 495, 1975). 19 0 termo anticorpo como usado nesta revelação pretende incluir moléculas intactas, bem como os seus fragmentos, como Fab e F(ab')2, que são capazes de ligar um determinante epitópico em MAL. 0 anticorpo como aqui referido também se referirá a outras moléculas de proteína ou não-proteína com especificidade de ligação de antigénios tais como minianticorpos, peptidomiméticos, anticalinos, etc.

Os anticorpos monoclonais podem ser usados nos métodos de diagnóstico revelados, por exemplo em imunoensaios nos quais podem ser usados na fase líquida ou ligados a um portador de fase sólida. Além disso, os anticorpos monoclonais destes imunoensaios podem ser etiquetados de forma detetável de várias formas. Os exemplos de tipos de imunoensaios que podem usar anticorpos monoclonais da invenção são imunoensaios competitivos e não-competitivos tanto em formato direto como indireto. Exemplos de tais imunoensaios são o radioimunoensaio (RIA) e o ensaio "sanduíche" (imunométrico). A deteção dos antigénios usando os anticorpos monoclonais da invenção pode ser feita usando imunoensaios que são realizados tanto nos modos de avanço, retroceder ou simultâneo, incluindo ensaios imunohistoquímicos ou imunocitoquímicos em amostras fisiológicas. Os especialistas na área saberão, ou conseguirão distinguir rapidamente, outros formatos de imunoensaios sem experimentação indevida.

Os anticorpos monoclonais podem ser ligados a muitos portadores diferentes, e usados para detetar a presença de MAL. Exemplos de portadores conhecidos são o vidro, polistireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilases, celuloses naturais ou modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetite. A natureza do portador pode ser solúvel ou insolúvel para propósitos da 20 invenção. Os especialistas na área conhecerão outros portadores adequados para ligar anticorpos monoclonais ou saberão determiná-los usando experimentação de rotina.

Ao realizar os ensaios, pode ser desejável incluir certos "bloqueadores" no meio de incubação (normalmente adicionados com o anticorpo solúvel etiquetado). Os "bloqueadores" são adicionados para assegurar que proteínas não-especificas, proteases ou imunoglobulinas antiheterofilicas e imunoglobulinas anti-MAL presentes na amostra experimental não fazem ligações transversais ou não destroem os anticorpos no apoio de fase sólida ou anticorpo indicador radioetiquetado para dar resultados positivos falsos ou negativos falsos. A seleção de "bloqueadores" pode assim aumentar substancialmente a especificidade dos ensaios descritos na presente invenção. Podem ser usados como "bloqueadores" um número de anticorpos não-relevantes (ou seja, não-especificos) da mesma classe ou subclasse (isotipo) dos usados nos ensaios (por exemplo lgGI, lgG2a, lgM, etc) . A concentração dos "bloqueadores" (normalmente 1-100 yg/yL) pode ser importante para manter a sensibilidade adequada mas ainda assim inibir qualquer interferência indesejada ao ocorrerem mutuamente proteínas de reatividade cruzada no espécime.

Os métodos de diagnóstico para a deteção de produção MAL, expressão do gene MAL ou distúrbios afins incluem métodos em que é providenciada uma amostra de teste, amostra que compreende uma preparação celular de tecido cervical ou outro. De preferência tais amostras são providenciadads como esfregaços ou outras amostras citológicas.

Uma amostra celular ou de tecido obtida de um mamifero, de preferência um humano, é pré-tratada de forma adequada para permitir o contacto entre um componente celular alvo de uma 21 célula de teste compreendida na referida amostra com um reagente que deteta MAL e detetando uma redução em MAL quando comparada com a de uma célula normal comparável. As amostras podem ser montadas num suporte adequado para permitir a observação de células individuais. Exemplos de materiais de suporte conhecidos incluem o vidro, polistireno, polipropileno, polietileno, policarbonato, poliuretano, opcionalmente providenciado com camadas para melhorar a adesão celular e imobilização da amostra, tais como camadas de poli-L-lisina ou silano. Os esfregaços ou biópsias vaginais podem, por exemplo, ser preparados como é feito para o teste do Papanicolau (Pap) ou uma sua modificação adequada conhecida pelo especialista e pode ser fixada por procedimentos que permitam acesso adequado do reagente ao componente alvo. Em certas formas de realização da invenção, os espécimes citológicos são providenciados como amostras de esfregaços convencionais ou preparações de camada fina de células cervicais ou amostras citológicas de base liquida ou qualquer outra preparação conhecida dos especialistas da área. Se for necessário armazenamento, os procedimentos de rotina usam formalina tamponada para fixação seguida de inclusão em parafina, que providencia uma infraestrutura de tecido bem preservada. Para permitir a coloração imunohistoquímica ou imunofluorescente, a antigenicidade do material de amostra tem de ser recuperada ou desmascarada. Um método de recuperar a antigenicidade de proteínas reticuladas com formaldeído envolve o tratamento da amostra com enzimas proteolíticas. Este método resulta numa absorção (parcial) do material e meros fragmentos das proteínas originais podem ser acedidos pelos anticorpos.

Outro método para recuperar a imunoreatividade dos antigénios reticulados com formadeído envolve o processamento térmico usando calor ou tratamento de alta energia para as amostras. Um tal método é descrito por 22 exemplo na patente americana n° 5,244,787. Ainda outro método de recuperação de antigénios de tecidos fixados por formadeido é a utilização de uma panela de pressão, quer em combinação com um microondas ou em forma de uma autoclave, como descrito por exemplo por Norton, 1994, J. Pathol. 173(4):371-9 e Taylor et al. 1996. Biotech Histochem 71 (5) :263-70.

Podem ser usadas várias alternativas ao formadeido, como o etanol, metanol, butanol, methacarn ou glioxal, acetona citrada, ou podem ser usados fixadores em combinação. Em alternativa, a amostra pode ser seca ao ar antes de prosseguir o processamento.

De forma a permitir a deteção com sondas de ácido nucleico, o material de amostra tem de ser recuperado ou desmascarado no caso de material de formalina fixada e incluído em parafina. Um método envolve o tratamento com enzimas proteolíticas e uma pós-fixação com paraformaldeido. A digestão proteolitica pode ser precedida de uma etapa de desnaturação em HCI. Este método resulta numa absorção (parcial) do material, permitindo a entrada de sondas no alvo. Não são necessários procedimentos específicos de desmascaramento no caso de material fixado com não-formalina, por exemplo material congelado. Antes da hibridização, as amostras podem ser acetiladas por tratamento com trietanolamina tamponada.

As sondas de ácido nucleico ou anticorpos são então contactados com o material de amostra num tampão adequado e é permitido que hibridizem especificamente ou que se liguem ao seu ácido nucleico ou proteina alvo. Após ligação especifica das sondas de ácido nucleico ou anticorpos aos componentes alvo, as sondas e/ou anticorpos etiquetados podem ser detetados por métodos como a microscopia confocal 23 por varredura laser, microscopia de campo brilhante, citometria de fluxo opcionalmente em combinação com fluorescência associada a separação de células, ou modificações destas técnicas que são conhecidas dos especialistas da área.

Em uma forma de realização de um método da revelação, uma metilação aumentada do promotor MAL na célula de teste e/ou produção reduzida de MAL na célula de teste é detetada quando comparada com a célula normal comparável. A presente invenção também providencia um conjunto de peças como definido na reivindicação 4.

Um tal conjunto pode compreender de forma adequada uma escova ou espátula para realizar uma raspagem (cervical), juntamente com um recipiente cheio com agente de recolha para recolher as células de teste. Em alternativa, serão incluídos um dispositivo de amostragem consistindo de uma seringa de irrigação, um cateter descartável de urina para mulheres e um recipiente com fluido de irrigação para recolher células cervicais por lavagem cervico-vaginal. Um conjunto de acordo com a presente invenção compreende primários e/ou sondas para a deteção de metilação do promtor MAL. Um conjunto de acordo com a revelação pode compreender anticorpos e reagentes para a deteção de expressão de proteína MAL em raspagens cervicais ou espécimes de tecido.

Um conjunto de peças de acordo com a invenção compreende meios para deteção de metilação do promotor MAL, enzimas de restrição sensíveis a metilação, ou sondas ou primários capazes de hibridizar para a sequência nucleótida da Figura 1. 24

Num conjunto da revelação, os meios para a deteção de metilação do promotor MAL ou expressão MAL podem ser combinados com meios de deteção de infeção HPV, de preferência para a deteção de infeção HPV do tipo de alto risco. Tais meios podem compreender primários ou sondas específicas para HPV, marcadores de proteína para infeção HPV ou mesmo marcadores substitutos para infeção HPV como os conhecidos no campo. Um conjunto de acordo com a invenção com os meios para deteção de metilação do promotor MAL é combinado com os meios para deteção de metilação do promotor CADM1 (Genbank ID NM 014333.3). A deteção de metilação do promotor CADM1 é realizada com métodos semelhantes aos usados na deteção de metilação do promotor MAL, como acima descrito. A presente invenção será agora ilustrada por meio dos seguintes exemplo não limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Silenciamento de MAL em carcinomas cervicais e lesões precursoras de alto grau

Por análise de expressão de micro-matriz de carcinomas cervicais, MAL foi identificado como um dos genes mais significativamente infra-regulados em carcinomas cervicais guando comparado com amostras epiteliais de controlo normais. A subseguente análise de transcriptase reversa quantitativa PCR (qRT-PCR) num conjunto de validação independente de carcinomas cervicais confirmou a infra-regulação de expressão MAL mRNA nestes tumores. A expressão reduzida MAL mRNA foi detetada em 100% de carcinomas cervicais (n=12) e 93% de lesões CIN de alto grau (n=15), em comparação com 8% 25 de controlos normais (n=12). Estudos in vitro revelaram um envolvimento funcional de inativação MAL no desenvolvimento do cancro cervical, quando a sobreexpressão ectópica de MAL no HPV 16 contendo linha celular de carcinoma cervical SiHa resultou numa redução da proliferação e supressão de crescimento independente de ancoragem.

Exemplo 2: papel funcional de silenciamento do gene MAL na carcinogenese cervical

Para determinar o potencial papel funcional de MAL na carcinogenese cervical, tranfectámos de forma estável células da linha celular de cancro cervical SiHa contendo HPV16 com vetor de expressão MAL (SiHa_MAL) ou um vetor de controlo vazio (SiHa (-) ) . A expressão MAL ectópica de transfectantes SiHa_MAL foi confirmada por RT-PCR. Ambos os transfectantes foram examinados para apurar a sua taxa de proliferação, capacidade de migração e capacidade de crescer em agarose macio. Os transfectantes SiHa_MAL apresentaram uma redução de 43% na taxa de proliferação quando comparados com células SiHa (-), indicando que a expressão ectópica de MAL tem um efeito anti-proliferativo in vitro. Usando um ensaio de escarificação, descobrimos que a migração foi fortemente inibida nos transfectantes SiHa_MAL. Para além disso, as células SiHa_MAL exibiram uma redução de 53% no crescimento independente de ancoragem em comparação com transfectantes SiHa apresentando o vetor vazio.

Vistos em conjunto, estes dados demonstram que o silenciamento do gene MAL é um acontecimento biológico essencial no desenvolvimento do cancro cervical e que a re-expressão de MAL em células de cancro cervical reprime de forma eficaz caracteristicas bem estabelecidas das células 26 tumorais como a proliferação, migração e crescimento independente de ancoragem.

Exemplo 3:_silenciamente de MAL resultante de hipermetilação de promotor é um acontecimento frequente em lesões CIN de alto grau, carcinomas cervicais de células escamosas, carcinomas adenoescamosos, adenocarcinomas e carcinomas neuroendócrinos 0 facto de o gene MAL se localizar em 2qll-13, uma região cromossómica em que não encontrámos deleções cromossómicas recorrentes no cancro cervical, levou-nos a procurar uma potencial regulação epigenética da transcrição. 0 tratamento de linhas celulares do cancro cervical e linhas celulares imortalizadas por HPV com metilação e inibidores de desacetilação de histona resultou numa forte supra-regulação da expressão MAL mRNA, indicando que a infra-regulação MAL era de facto dependente de mecanismos de controlo epigenéticos.

De seguida analisámos a metilação de promotor MAL em espécimes de tecido cervical por PCR específico de metilação quantitativa (qMSP) visando duas regiões dentro do promotor MAL (ou seja, -680 a -573 e -92 a -7, relativas ao primeiro ATG; referidos como Ml e M2, respetivamente). O gene de housekeeping 6-actina (ACTB) foi escolhido como uma referência para medição da entrada total de ADN. Para todas as amostras, a quantidade de ADN metilado medido foi dividida pela quantidade de ACTB e as amostras com rácios acima de um corte predefinido (por exemplo controlo normal de rácio médio + 2,58x desvio padrão) foram classificadas como positivas.

Descobrimos que a metilação de ambas as regiões Ml e M2, doravante referida como metilação densa, não foi detável em 27 nenhuma das amostras de controlo cervical normal (n=2), 32% de lesões CIN1 (n=66) , 80% de lesões CIN3 (n=64) e 94% de carcinomas cervicais de célula escamosa (n=94).

Para além dos carcinomas cervicais de célula escamosa também analisámos metilação do promotor MAL em adenocarcinomas cervicais. Os adenocarcinomas, que constituem até 20% dos carcinomas cervicais, são de particular interesse, pois a incidência de adenocarcinoma cervical tem-se mantido a mesma ou tem mesmo aumentado em paises com um programa de rastreio do colo do útero a nivel nacional. Isto indica que o adenocarcinoma cervical e a sua lesão precursora glandular, ou seja, adenocarcinoma in situ (ACIS) ficam frequentemente por detetar pelos rastreios de base citológica. Com base na genética comparativa e estudos epigenéticos entre carcinomas cervicais de célula escamosa e adenocarcinomas cervicais foi descoberto que ambos os histotipos de tumor se desenvolvem por meio de vias carcinogenénicas distintas (Dong et al., 2001, Kang et al., 2005, Wilting et al., 2006, Henken et al., 2007) . Em virtude disto, a maior parte dos biomarcadores que permitem a deteção do carcinoma cervical de célula escamosa não detetam necessariamente o adenocarcinoma cervical. Um exemplo muito estudado é o marcador de metilação CADM1, que mostra metilação em 83% de carcinomas de célula escamosa, mas apenas 23% de adenocarcinoma (Overmeer et al., 2008). Um segundo exemplo vem de um estudo de metilação em 9 genes (APC, DAPK1, CDH1, HLTF, hMLHl, pl6, RASSFIA, THBS1 e TIMP3) que mostra metilação mais frequente de CDH1 e DAPK1 em carcinomas de célula escamosa, enquanto HLTF, TIMP3, RASSFIA e APC foram metilados com mais frequência em adenocarcinomas (Kang et al., 2005). Foram obtidos resultados semelhantes num estudo que analisou a metilação de pl6, APC, HICl, DAPK, MGMT e CDHl, no qual se descobriu que APC e HICl foram significativamente mais metilados em 28 adenocarcinomas, enquanto por outro lado pl6 e DAPK foram predominantemente metilados em carcinomas de célula escamosa (Dong et al., 2001).

De forma interessante, a metilação do promotor MAL pareceu ser uma exceção já que, em contraste com a maior parte dos marcadores conhecidos, detetou adenocarcinomas cervicais numa frequência similar à de carcinomas de célula escamosa; ou seja, 93% (26/28) de adenocarcinomas mostrados por metilação do promotor MAL em ambas as regiões Ml e M2. Foram obtidos resultados semelhantes para carcinomas cervicais adenoescamosos e carcinomas neuroendócrinos.

Como tal, a metilação do promotor MAL parece ser um marcador de metilação universal para todos os histotipos de carcinomas cervicais.

Exemplo 4: Deteção de expressão MAL mRNA reduzida e metilação do promotor MAL em raspagens cervicais

Usando uma abordagem de caso controlo aninhado de mulheres participando num ensaio de rastreio de base populacional, estudámos raspagens cervicais de mulheres hrHPV positivas em que ^CIN2 (incluindo carcinoma 1) foi diagnosticado dentro de 18 meses de acompanhamento (ou seja, casos) versus mulheres hrHPV positivas nas quais foi diagnosticado no máximo CIN1 dentro de um período de acompanhamento de 18 meses (ou seja, controlos) . As raspagens de linha de base destas mulheres foram recolhidas em meio de preservação no qual foram preservados tanto RNA como ADN. A aplicação de qRT-PCR a RNA isolado de um subconjunto destas raspagens mostrou expressão MAL reduzida em 71% dos casos em comparação com 28% dos controlos. Além disso, a 29 expressão MAL reduzida apenas foi encontrada em 13% (3/21) de mulheres com raspagens hrHPV negativas.

Tanto quanto sabemos, somos os primeiros a mostrar a deteção de infra-regulação de mRNA em raspagens cervicais. Até ao momento, a análise de expressão em raspagens cervicais tem-se restringido a genes supra-regulados e envolvendo sobretudo análise de expressão em vez de análise de expressão mRNA, pl6 sendo um exemplo muito estudado. A seguir, a análise de metilação foi realizada numa grande série de raspagens cervicais de mulheres hrHPV GP5+/6+-PCR positivas participando no rastreio cervical de base populacional em que áciN2 foi diagnosticado dentro de 18 meses de acompanhamento (Bulkmans et al., 2007; Hesselink et al., 2006). Estas incluíam mulheres com citologia anormal (ou seja, discariose limite ou pior) e citologia normal na linha base, em que os últimos foram descobertos apenas por um teste hrHPV positivo. Além disso, foram incluídas mulheres de controlo hrHPV positivo com citologia normal e CIN 1 ou melhor dentro de um período de 18 meses. A metilação em uma ou ambas as regiões MAL variou entre 31% de mulheres de controlo hrHPV positivo com citologia normal e 65% e 84% em mulheres com >CIN 2 com citologia normal e anormal na linha base, respetivamente. Ao combinar os últimos dois grupos foi encontrada metilação MAL em 79% de mulheres com ÚCIN 2.

Exemplo 5: metilação do promotor MAL em espécimes de auto-amostragem

Subsequentemente analisámos espécimes cervico-vaginais de auto-amostragem recolhidos usando um VibaBrush (Rovers Medicai Devices, Oss, Holanda) ou um aparelho coletor de amostras Pantarhei (Pantarhei Devices, Zeist, Holanda) 30 durante um estudo propetivo em que foi enviado um total de 45 mil embalagens com auto-amostras a mulheres que, mesmo depois de serem lembradas duas vezes, não responderam ao convite para fazerem um rastreio cervical regular (ver www.trialregister.nl, ensaio n°NTR962 (ensaio PROHTECT)). Cerca de um terço destas mulheres devolveram espécimes auto-recolhidos ao laboratório. Estas amostras são adequadas para análise HPV PCR (ou seja, PCR positivos em beta-globina) e testes por hrHPV GP5+/6+-PCR dando pelo menos tantas lesões >CIN 2 nesta população como as encontradas por rastreio regular numa população compatível de mulheres que responderam (Bais et al., Int J Câncer: 2001, 120 :1505-1510) .

Foram testadas um total de 186 mulheres hrHPV positivas sem sinais de doenças clinicamente significativas em acompanhamento e 68 mulheres com um esfregaço de acompanhamento anormal e uma lesão hciN 3 subjacente em busca de qMSP para ambas as regiões promotoras MAL Ml e M2. 62% das auto-amostras de mulheres que foram mais tarde diagnosticadas com >CIN 3 testaram positivo para uma ou ambas as regiões MAL, em comparação com apenas 28% de mulheres sem sinais de doença clinicamente significativa em acompanhamento. Estes dados mostram que a análise de metilação de promotor MAL em materiais auto-recolhidos é claramente viável e melhorará a deteção subjacente de doenças cervicais de alto grau.

Exemplo 6: Adição de deteção de metilação do promotor CADM1 à análise de metilação MAL em raspaqens de biópsias cervicais e espécimes auto-recolhidos

Com o objetivo de aumentar a sensibilidade a hciN 2, analisámos o valor aditivo de um segundo marcador de metilação, ou seja CADM1 (Genbank ID NM 014333; ver também 31 o exemplo 3) , que tinha sido previamente provado estar também funcionalmente envolvido na carcinogenese cervical (Steenbergen et al., 2004; Overmeer et al., 2008).

Ao combinar a análise de metilação das duas regiões promotoras de MAL com uma região promotora de CADM1, o número de lesões CIN de alto grau de metilação positiva aumentou de 80% para 91% (foi considerada positividade em caso de um resultado positivo para pelo menos uma destas regiões) . Por outro lado, adicionar a análise desta região CADM1 não influencou a positividade em colos do útero normais e lesões de baixo grau. Adicionar dados de metilação de outros genes não aumentou de forma acentuada os valores de sensibilidade. Como tal, comcluimos que esta combinação providencia um ótimo painel de marcadores para a >CIN 2/3.

Ao adicionar a análise de metilação CADM1 Genbank ID NM 014333) a raspagens cervicais, foram detetadas mais lesões >CIN 2 em mulheres com citologia anormal, resultando numa taxa de deteção geral de >CIN 2 de 83%. A subsequente análise de metilação combinada do promotor MAL e CADMl em espécimes de auto-amostragem resultou em 69% de positividade em auto-amostras de mulheres hrHPV positivas que foram mais tarde diagnosticadas com >CIN 3. Por outro lado, cerca de apenas um terço de mulheres hrHPV positivas sem sinais de doença clinicamente significativa no acompanhamento mostraram metilação para um ou ambos marcadores.

Após combinar dados de metilação com dados de genotipificação hrHPV, concluiu-se que 84% das mulheres diagnosticadas com >CIN 3 tinham metilação CADMl, metilação MAL e/ou presença de HPV 16, enquanto o número de mulheres 32 hrHPV positivas com marcador positivo sem sinais de doença clinicamente significativa no acompanhamento não se alterou de forma acentuada.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiéntenzorg Meijer,

Christo- phorus J.L. <120> MAL, um marcador de diagnóstico molecular para cancros invasivos induzidos por HPV e as suas lesões precursoras de alto grau <130> P84375PC00 <150> EP 08154496.7 <151> 2008-04-14 <160> 1

<170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 2904 <212> ADN <213> Homo sapiens 33 «40Q> 1 gaetcgggcg gafcfctcaggc ttcagtgttt gtaggaggaa acacagcaat cscactatta 60 atagtaaatt a aa a ca aatg ggcaactgct gcalxjgtaat acttfcttfctt fctaaggcaaa 120 aaa C a a a a a a tagtgaa&ca gagaaacaaa acatgaaaca ccggcagtca acaqgcaggc 180 aaagaacctg ggggtggggg tagcagcggt cccaccctca a.aaggcccgg gctgc-c.caga 240 ccsàag&Q&sa gcgstgaatc tcttctggta acgtcccttc ctgtcgcatg gsfcteaagge 300 cgacctgccc cagcaccaoc accagcaqcc ttctgctggg gccggcacag Ctgggãgcaa 360 cctcctactc tcaggcágac gcgcagcacc aagcagagag gcccggtgca ggatcccagc 420 gccgaaccag cgccggcfcca gtgg&cgcgg aaggggccgg cggccgeggc cggtcccatc 4 80 ccccactgca gac-cccagc ctgtggcggt ggtccagttc cgccaggaaa ccgccgcctg 540 gagctgtggg tcgcgcacat. taacgcatcc agcggaaaaa tjgaaggagac ccaaattcaa 600 a rtt· faa s r*a a /'íjí"* t' *'* o yi i< ·" ·>· - · -jfi> ·*· i>'— +·' +· f>f + /V * rV i -i v. ^ y i' >’ Λ-ν* «-·»..-r Ί3 >2 «· w >-· -j -j ^ ^ -w """ggttGct ££<> wv gatggttatc attcttacga gatgc.tggtc accfcacgaag ggagaaaggc acgaggagcg 720 eetgaccaaa gtggwtfctgc cctgcttccc gcaagaggtg gcacccacgg ctggaacgea 7S0 ggagtcag&c ccacagtccc caçctetgga cgcccgcagc ggggcet.cga agaggttcág 840 ggcggtgccc gcggcgcfccg ggccgggtct cccggggcgt ggggcgggcg gcggggttgg 900 gcggcggccg gggctcctcc ctcttctgcc ccgggctccc ctgcfccttaa ecegcgcgcg 960 ggggcgccca ggccaetggg ctccgcggag ccagcgagag gtctgcgcgg agtctgagcg 1020 g'cgetcgfc.cc cgtcccaagg ccgacgccag CâCCjCGÇi LCS tggcccccgc agcggcgacg 1000 34 ccctgcccag tggettctcg gtcttcaccã ccttgcccga cttgctcttc ia <30 «tctttgagt ttgtgagtgg ctcctggcc-g gggaagggsc ggggtgggct gagccçtçcg 1200 ctctctcggg cgcççaçcac agctgtcgga cgggatccgc tagctgegça çgttctggga 1260 gcat.egggge agcâggcgca gggoejgçj C taagccaggg «agtcccctc cca c c t c egg 1320 tcefctfcgtgc cettctagac ca acagaatg aggqgaacag tctacaggac tatggaggaa 3.380 «aacfcgggtt cccaset ggg gtcagatgta ggcagcgggg caggggggga cggctcttgg 3.440 fcfccgctggt.c ccaaagctgc gcgcqgggcc cacfcfcgacgc gcgcagcgcc accgaagctc 1500 ccgccgcgct ttgcgcggtt çggtagaagt gcgcagcfctt tacaagggag aaggfcttcgt .1560 taaaaaagaa aaaeaaatca a-caagagaaa cattagtact- accaacegag atttggagat 1.620 gagagggagc tgaãtccggt ttattttctt cfcggcetfctfc aaagttfcetg gcgagggaac 1680 gtatttgega ccaatt. cgat etggasatga ggccatcgfct tgcttggecg cagt.ccttct .1740 gcceegtgtg cggggtgggg gtggaggaga tggggggtgg gçggtggggg gtggeggega 1800 gagcgatccg cgcgeet cg a ctgaccCtgg gc&ggcccgg gçeetet.gea cctgcggtcg 1860 gtcccgccfct q c &og c^ocjof tçtctgectg aggctgcagg a&agegctxc ctactgagaa 1820 ctcctgataa gcg e fccacgg tgvcgcgaag ccgaagtgac ctccctcagc ctcaactccc 1880 cgggggccgc tcfçj: CC ÍC fcC íiC accc CC9999 gcctggtgtg gatcctggtg gcctcccccc 2 040 tggtgccctg gcceefcggtc cagggctggg tgatgtt-cgt gtctgtgttc tgcfctcgtgg 2100 ccaco&ceôc ettgateate etgtacaiaa fctggagccca cggtggagag aettectggg 2160 tcaeettgga cgcagcctac cactgcaccg ctgccct.ctt ttacctcagc gcetcagxec 222 0 tggaggeecfc ^^CCâCCât.C aega tgcaag acggcttcac cfcacaggcac taeeaigaaa 2280 acarxgetge cgtggogtfcc tcetacataç ccaccctgct ctacgtggtc catgcççtgt 2340 fcctctfcta&fc Cágatggaag tcttcataaa geegcaçfc&g aacfcfcgsgçt gaaaacccag 2400 afcggfcgttaa cfcggccgccc cacttt.ccgg cataactttt tagaaaacag aaatgccctt 2460 gatggfcggaa aaccaccccc ccâctgccca aaaaaaaaag ccctçccctg 2520 fcfcgctogtgg gtgcfcgtgtt tactcf.cccg tgtgecttcg cgtccgggtt gggagcttgc 2580 tgtgfccrtaa a eteeaactgc tgtgofcgtct gctagggtca cctcctgtt.t gtgaaagggg 2640 acctt-cttgt tegggggtgg gaagtggcga ccgtgacctg agaa-ggaa&g aaagatcctc 2700 tgetgaecce tggageagct ctcgsgasct acctgt.tggt. actgtceaca agetctcccg 2760 agegccecat ctcgcgccat: gtt^tâagtc ttcatggatg Ívw tgca vg 1» catggggact 2820 aaaaetcacc caacagatct ttceagaggt ccatggtgga agacgacaac cctgtgaaat 2880 actttatasa atgtcttsat gttc 2904

Lisboa, 22 de Agosto de 2013

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para deteção de uma lesão cervical pré-maligna induzida por HPV tendo uma neoplasia epitelial cervical (CIN) grau >2 num sujeito necessitado por caracterizado pela deteção de uma maior metilação do promotor CADM1 e detetando uma maior metilação do promotor MAL em células cervicais.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a referida lesão cervical pré-maligna induzida por HPV ser uma lesão cervical pré-maligna de alto risco.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizado por ser detetada uma metilação aumentada usando uma endonuclease de restrição, de preferência uma endonuclease de restrição sensível à metilação.

4. Conjunto de peças para utilização num método de deteção de lesões cervicais pré-malignas induzidas por HPV tendo uma neoplasia cervical intraepitelial (CIN) de grau >2 nas células de teste de um sujeito, caracterizado por o referido conjunto compreender - meios para a deteção de uma metilação do promotor MAL em que os referidos meios compreendem sondas e/ou primários específicos para a sequência de nucleótido MAL da Figura 1; e - meios para a deteção de metilação do promotor CADM1, em que os referidos meios compreendem sondas e/ou primários específicos para CADM1; e 2 - meios opcionais para a deteção de infeção HPV, em que os referidos meios compreendem sondas e primários específicos para HPV. Lisboa, 22 de Agosto de 2013