CN104053783A - 作为用于hpv-阳性妇女的分类工具的对自身样品的甲基化分析 - Google Patents

Abstract

本发明人目前已经开发出了在通过自我取样获得的细胞材料内基于标记物MAL和hsa-miR124中的改变(特别是启动子高甲基化)的检测的(分子)诊断检验，用以鉴定人乳头瘤病毒(HPV)-诱导的重度癌前期病变如浸润性宫颈癌的癌前宫颈病变。具体地，本发明涉及MAL基因(包含它的启动子)和hsa-miR124基因作为用于HPV-诱导的重度癌前病变的标记物的应用，允许个体患者的早期检测和更好的治疗选择。

Description

作为用于HPV-阳性妇女的分类工具的对自身样品的甲基化分析

技术领域

本发明涉及癌症预防和医学诊断学的领域；并且涉及用于人乳头瘤病毒(HPV)-诱导的浸润性(侵袭性，invasive)癌症和它的重度前期病变(precursor lesion)的分子诊断检验，如浸润性宫颈癌和癌前(恶化前，premalignant)宫颈病变。具体地，本发明涉及对(hrHPV-阳性)自我取样的样本的MAL和hsa-miR124启动子甲基化的综合分析在用于具有侵润性可能(浸润潜能)的hrHPV-诱导的癌前病变和hrHPV-诱导的浸润性癌症的检验中的应用。

背景技术

子宫颈癌症是世界范围内女性第二大常见癌症且导致一年约250000癌症死亡。

子宫颈鳞状细胞癌发展的特征是一系列癌前病变，所谓的宫颈上皮肉瘤样病变(CIN)，将其分为1至3等级，分别指的是轻度异生(CIN1)，中度异生(CIN2)和重度异生/原位癌(CIN3)。也将CIN1称为轻度鳞状上皮内病变(LSIL)并且同时将CIN2和CIN3称为重度鳞状上皮内病变(HSIL)。对于子宫颈腺癌，原位腺癌(ACIS)是已确定的前期病变。原则上，尽管病变越严重，自发消退的可能性越低，但是这些癌前病变是可逆的。认为宫颈癌是可预防性疾病，因为，可通过脱落细胞学检测癌变前阶段和在必要时，相对容易地治疗，仅具有较小的副作用。子宫颈筛查目的在于早期诊断重度癌变前的(也就是，CIN2/3和原位腺癌)和能治疗的癌病变，因此减少浸润性宫颈癌的死亡率。通用医疗实践包括具有形态学上确定的CIN2、CIN3和原位腺癌的所有的女性的治疗，以便避免宫颈癌的发展。

在过去的十年里，已经确定了，通过具有高危型人乳头瘤病毒(hrHPV)的感染开始子宫颈致癌作用。已经显示了病毒性致癌基因E6和E7的表达对肿瘤发生的开始和恶性表型的维持是必不可少的，E6和E7分别干扰p53和Rb肿瘤抑制路径。因此，对hrHPV的测验表现为有吸引力的，初步的筛选装置。然而，与致癌作用的多步过程一致，宿主细胞基因组中的另外的变化是hr-HPV受感染细胞至浸润性癌细胞的发展必须的。只有少部分感染高危型HPV的女性将发展为重度癌变前宫颈病变(CIN2/3)，并且如果没有治疗，将发展为宫颈癌。在大多数具有癌变前宫颈病变的女性中，病变自发地消退。关于参与荷兰人口基数筛查的女性，约5-6％具有阳性hrHPV检验(Bulkmans等人,Int J Cancer2004,110:94-101)。然而，他们中最多只有20％(参与的女性的1％)具有≥CIN2/3。因此，通过hrHPV检验的初步筛选将兼有大量多余的后续程序和对女性造成不必要的焦虑，除非可将标记物应用于子宫颈刮片，其允许为≥CIN2/3和≥原位腺癌的危险的hrHPV阳性的女性的分层。

已经在多个国家中建立了以医师-采取的刮片为基础的庞大的基于人群的筛选方案。然而，将显示不是所有的参与的女性都实施了子宫颈刮片检查。由不情愿通过护士或医师对这些女性实施子宫颈涂片检查的女性引起许多未显示。研究已经显示，可通过向这些女性提供用于在家里进行(子宫颈)阴道材料的自我采集的设备克服这点，可将其发送给实验室，用于HPV分析。同样地，自我取样增加非响应者在现有的筛选程序中的参与(等人2010Brit.Medical J.；340:c1040)。自我取样是用于子宫颈筛查的便宜的和被广泛接受的方法。更多地，因为HPV分析用于CIN2+/3+的检测在自我收集的样品上可如医师收集样品一样好，自我取样在将来可变成用于初级宫颈癌筛查的可替换的方法。因而，在未来几年内，(子宫颈)阴道材料的自我取样将变成宫颈癌的筛查的重要装置。

主要的挑战是减少hrHPV阳性的女性占具有临床上有意义的病变的百分比。然而，在传统的刮片上，细胞学可担当对hrHPV阳性的女性的第二(所谓的分类)检验，细胞学不是可在家里获取的自我取样的宫颈阴道样本的选择，因为这些不是子宫颈的细胞学状态的典型(Brink et al.,2006,J.Clin.微biol.44:2518-2523)。因此，需要补充的或可替换的分类装置，以便将hrHPV阳性女性分层为具有和没有≥CIN2/3和≥原位腺癌的那些。

早前已经显示了(WO2009/128714)，当应用于完全等同于细胞学执行的医师收集的子宫颈刮片时，编码T-淋巴细胞成熟相关的蛋白，也称为T-细胞分化蛋白的基因(进一步称为MAL；Genbank登录号NM002371.2)和编码细胞粘附分子1(CADM1)的基因的启动子甲基化的综合检验出现有吸引力的可替换的分子分类装置(Hesselink等人2011Clin Cancer Res.17(8):2459-65)。然而，这组检验不能很好地在自我取样的子宫颈-阴道样本上执行，主要因为，具有≥CIN2/3的女性的自我取样样品中的CADM1甲基化的信号比医师收集的子宫颈样品的情况中更频繁地在检验阈值之下。

因此，仍然需要可在自我取样样品上实施，并且可给予发展中的宫颈病变的存在或风险的更可靠的指示的检验。

发明内容

现在已经出人意外地发现了，当应用于对hrHPV检验呈阳性的自我取样的样本时，对编码T-淋巴细胞成熟相关的蛋白，也称为T-细胞分化蛋白的基因(进一步称为MAL；Genbank登录号NM_002371.2)和由3位于三个不同的基因组区域上的3个个体早熟微RNA(microRNA)序列编码的微RNA hsa-miR124(登录号MIMAT0000422)的启动子甲基化的综合检验，这3个个体早熟微RNA也就是在染色体8p23.1上的HSA-MIR124-1(登录号MI0000443)，在染色体8q12.3上的HSA-MIR124-2(登录号MI0000444)和在染色体20q12.33上的HSA-MIR124-3(登录号MI0000445)(如在miRNA数据库上指示登录号，miBase(www.mirbase.org)，曼切斯特大学，生命科学系)，两者在宫颈癌细胞中都具有肿瘤抑制性能，提供用于诊断浸润性宫颈癌和它的重度前期病变的有价值的检验。

因此，本发明涉及检测或预测HPV-诱导的重度癌前期病变和/或HPV-诱导的浸润性癌症的发生的方法，包括检验宫颈-阴道自身样品(self-sample)的T-淋巴细胞成熟相关的蛋白(MAL)和/或hsa-miR124的甲基化的变化的存在，其中所述变化指示具有浸润潜能的HPV-诱导的前期病变和/或HPV-诱导的浸润性癌的存在或未来的存在。优选地，在所述方法中，所述HPV-诱导的重度癌前病变或HPV-诱导的浸润性癌是重度癌变前宫颈病变或浸润性宫颈癌。同样地，在所述方法中优选的，所述HPV-诱导的浸润性癌是高危型HPV-诱导的浸润性癌。

在所述方法的另一个实施方式中，与正常的对照样品相比，所述变化是甲基化的增加。优选地，在本发明的方法中，在编码MAL多肽及其调控区以及hsa-miR124序列的核酸上检验甲基化，其中优选地，所述核酸是DNA。在进一步优选的实施方式中，利用限制性内切酶进行检验，优选地，甲基化敏感的限制性内切酶并且同样优选的是，试剂是结合到核酸上的核酸探针或引物，优选地，其中所述核酸探针或引物具有可检测的标签。特别优选的是具有选自由在表1中描述的序列组成的组的核苷酸序列的核酸探针。

同样地，本发明的部分是用于HPV-诱导的重度癌前病变或HPV-诱导的浸润性癌的检测的分子诊断标记物的应用，其中所述标记物指示MAL基因或启动子甲基化和/或hsa-miR124序列的甲基化。

本发明进一步包括用于检测在受试者的检验细胞中的HPV-诱导的重度癌前病变或HPV-诱导的浸润性癌的方法的部件的试剂盒(kit of parts)，所述试剂盒包括

-用于检测MAL基因或启动子甲基化的装置(means)，其中所述装置包括MAL特异性的或图1的MAL核苷酸序列特异性的探针、引物和/或甲基化敏感的限制性内切核酸酶；和

-用于检测hsa-miR124甲基化的装置(means)，其中所述装置包括hsa-miR124特异性的探针、引物和/或甲基化敏感的限制性内切核酸酶，

-可选地，用于检测HPV感染的装置，其中所述装置包括HPV特异性的探针和引物，以及

-可选地，用于获取子宫颈-阴道自身样品的装置，其中优选地，所述装置选自VibaBrush(Rovers Medical Devices,Oss,the Netherlands)和Pantarhei sampler(Pantarhei Devices,Zeist,The Netherlands)的组。

附图说明

图1显示MAL5’调控区，编码序列，第一内含子序列的CpG富集部分和转录的3’非编码序列。

图2显示三个miR124基因组区域的5’调控区和编码序列，A：hsa-miR124-1，B：hsa-miR124-2，C：hsa-miR124-3。

斜体/粗体序列是早熟微RNAs的编码序列。下划线的序列包括成熟的微RNA序列。以灰色标记CpG富集区域。显示野生型序列(上列)和在重亚硫酸盐处理之后的修饰的序列(下列)。

++代表CpG位点，::::指示转换至'T'的非-CpG'C'。

图3显示具有CIN3+的女性(具有实心正方形的虚线)和具有最大CIN2的女性(具有十字的虚线)的自身样品中以及具有CIN3+的女性(具有实心正方形的实线)和具有最大CIN2(具有十字的实线)的女性的医师获取的子宫颈刮片中的MAL(A)和CADM1(B)甲基化分析的十分位数的Ct比值的比较。这个图指示，在自我取样的样本中，具有CIN3+的女性的MAL信号等于医师获取的涂片中的那些，然而，与医师获取的涂片中的那些相比，具有CIN3+的女性的CADM1的那些较低，且在与没有子宫颈疾病的女性获得的水平相同的范围内大部分下降。

图4分别地显示具有CIN3+的女性(CADM1：十字；hsa-miR124-2：菱形)和具有≤CIN1的女性(CADM1：三角形；hsa-miR124-2：正方形)的自我取样样品中的CADM1(虚线)和hsa-miR124-2(实线)甲基化分析的十分位数的Ct比值的比较。这个图指示，自我取样的样本中具有CIN3+的女性的hsa-miR124-2信号比CADM1的那些更高。此外，与CADM1比较，hsa-miR124-2甲基化显示具有CIN3+的女性和具有≤CIN1的女性的自我取样的样本之间的较好的区别。

具体实施方式

宫颈癌几乎是唯一地与人乳头瘤病毒(HPV)感染相关。人乳头瘤病毒构成超过100种类型的病毒组，如由DNA序列中的变化鉴定的。各种HPV引起各种皮肤和粘膜疾病。基于它们诱导受感染的细胞中的恶性变化的能力，将HPV大致分为低危险的和高危险的类型。低危险的HPV类型如1、2、4、6、11、13和32主要地与良性病变或常见肉赘有关，而高危险类型，如16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68主要地与癌变前的和恶性上皮病变有关。与由低危险类型引起的肉赘，例如，HPV-6和HPV-11相比，这些高危险类型的HPV引起通常扁平的和几乎看不见的生长。

术语“HPV-诱导的浸润性癌”涉及由高危型HPV诱导的癌，其入侵周围的组织。这包含所有的HPV-诱导的癌组织型，也就是，子宫颈中的鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞状细胞癌和神经内分泌癌。

术语“浸润性宫颈癌”涉及入侵周围组织的宫颈癌。这包含所有的癌组织型，也就是，子宫颈中的鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞状细胞癌和神经内分泌癌。

术语“癌前病变”和“前期病变”涉及到具有强烈增加的向癌方面发展机会的癌症的多级细胞演变中的阶段。利用传统的形态学，病理学家不能预知个体患者中这些病变将发展或消退。现有的专利申请涉及方法，其可预知浸润性癌或它的重度前期病变。

术语“重度癌变前宫颈病变”涉及到具有强烈增加的向癌方面发展机会的癌症的多级细胞演变中的阶段。重度癌变前宫颈病变等于名称CIN2/3和更高(也就是，≥CIN2)。

术语“能够特异性地杂交到”涉及能够与互补的核酸序列特异性的碱基配对和能够结合到那里，以便形成核酸双链体的核酸序列。

“互补体”或“互补序列”是根据Watson-Crick碱基配对原则与另一个核苷酸序列形成氢键结合的双链体的核苷酸序列。例如，5'-AAGGCT-3'的互补碱基序列是3'-TTCCGA-5'。

术语“严格的杂交条件”涉及影响杂交稳定性的杂交条件，例如，温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度等等。以经验为主地最佳化这些条件，以便将特异性结合最大化并且将引物或探针到它的靶核酸序列的非特异性结合最小化。使用的术语包含对下面条件的参考，在所述条件下，探针或引物将在比其他序列可检测地更高的程度(例如，至少是背景的2倍)杂交到它的靶序列上。严格的条件是序列依赖的且在不同的环境中将不同。较长的序列在更高的温度上特异性地杂交。通常，对于在确定的离子强度和pH下的特异序列，选择的严格的条件是比热熔点(Tm)低约5℃。Tm是在所述温度上50％的互补靶序列杂交到完全匹配的探针或引物上的温度(在确定的离子强度和pH下)。通常，严格的条件将是其中在pH7.0至8.3上，盐浓度小于约1.0M Na离子，通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)并且对于短的探针或引物(例如，10至50个核苷酸)温度至少是约30℃和对于长的探针或引物(例如，大于50个核苷酸)至少是60℃的那些。也可能利用外加减稳剂，如甲酰胺获得严格的条件。示例性的低严格条件或“减少严格性的条件”包括在37℃利用30％甲酰胺的缓冲溶液，1M NaCl，1％SDS的杂交和在40℃在2×SSC中洗涤。典型的高严格条件包括在37℃利用50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS的杂交和在60℃在0.1×SSC中洗涤。杂交程序是本领域熟知的并且在Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc.,1994中描述。

术语“寡核苷酸”涉及由磷键(例如，磷酸二酯、烷基和芳基-磷酸盐、硫代磷酸酯)，或非磷键(例如，肽、氨基磺酸酯等)连接的核苷酸单体的短序列(通常6至100个核苷酸)。寡核苷酸可含有具有修饰的碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)和修饰的糖基团(2’-O-甲基核糖基、2’-O-甲氧乙基核糖基、2’-氟代核糖基、2’-氨基核糖基等)的修饰的核苷酸。寡核苷酸可以是自然地存在的或合成的双链和单链DNA以及双链和单链RNA的分子，所述DNA和RNA具有圆形、分支的或线性的形状，并且可选地包含能够形成稳定的二级结构的结构域(例如，茎-和-环(stem-and-loop)以及环-茎-环(loop-stem-loop)结构)。

此处使用的术语“引物”涉及当在其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下放置时，也就是，在核苷酸和用于聚合的试剂如DNA聚合酶的存在下和在适当的温度和pH下，能够退火成允许DNA聚合酶附着，因此担当DNA合成的引发点的扩增靶的寡核苷酸。优选地，为了最大的扩增效率，(扩增)引物是单链的。优选地，引物是寡聚脱氧核苷酸。引物必须足够长，以便在用于聚合的试剂的存在下引发(prime)延伸产物的合成。引物的精确长度将依赖于很多因素，包括温度和引物的来源。此处使用的“双向引物对”涉及通常在DNA扩增领域如聚合酶链式反应(PCR)扩增中使用的一个正向和一个反向引物。

术语“探针”涉及在靶核酸序列分析物或它的cDNA衍生物中识别和与互补序列形成氢结合的双链体的单链寡核苷酸序列。

“微RNA(小RNA)”(miRNA或MIR)是短核糖核酸(RNA)分子，平均只有22个核苷酸长且几乎在所有的真核细胞中都能发现。MIR通过到它们的靶mRNA的3’UTR的不完全的碱基配对，调节基因活性，导致mRNA降解或转录的抑制。一个单一MIR可调节多达200个不同的基因靶的表达，其意味着，可通过MIRs控制约三分之一的人类mRNA的表达。因此，MIR的变异表达可分别地通过增加或减少致癌基因和肿瘤抑制基因的表达导致恶性转化(由Calin and Croce,Nat Rev Cancer2006,6,857-866审核)。有限量的MIR的表达型提供非常精确的肿瘤亚型分类器，甚至产生比基于全组基因mRNA表达型的分类器更好的结果，这个事实通常强调miRNA在致癌作用中的重要性(Lu等人,Nature2005；435:834-8)。有趣的是，与正常组织相比，肿瘤中的miRNA表达水平整体上较低。如编码肿瘤抑制基因的蛋白，也是miRNA的沉默可产生于后生改变，如调控序列的DAN甲基化。

在基因间隔区或基因的反义方向中发现大多数微RNA基因，和含有它们自身的miRNA基因启动子和调控单元。

最初，已经将MAL(T-淋巴细胞成熟相关的蛋白)基因(Genbank登录号NM_002371.2)确定为T-细胞发育期间的差异表达的基因(Alonsoand Weisman1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,1997-2001)。MAL编码17kDa膜内在蛋白且是糖脂类富集的膜微结构域或自由基聚合的成分(Kim等人1995,J.Neurosci.Res.,42,413-422)。MAL在极化上皮细胞中作为用于膜和分泌蛋白的顶端运输的蛋白机制的成分具有重要的作用(Cheong等人,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,6241-6248)。

已经在许多人类癌症中检测到了减少的MAL表达，包含食道癌、胃癌和结肠癌(Mimori等人,2003,Oncogene,22,3463-3471；Mimori2007等人,Ann.Surg.Oncol.,14,1670-1677)。

在结肠癌中，MAL下调与启动子高甲基化相关(Mori等人,2006,Gastroenterology,131,797-808；Lind等人,2007Gastroenterology,132,1631-1632)。

通过MAL基因在食道癌细胞中的重新表达，导致运动性、侵入和致肿瘤性的抑制，同时增强凋亡，证明MAL担当肿瘤抑制基因的功能性作用(Mimori等人.,2003,Oncogene,22,3463-3471)。

在WO2009/128714中确认了，经常在鳞状细胞癌、腺鳞状细胞癌、腺癌和神经内分泌癌组织型，和它们的重度前期病变的宫颈癌中观察到MAL启动子甲基化的变化。体外研究显示MAL失活在宫颈癌发展中的功能性混乱，因为含有SiHa宫颈癌细胞系的HPV16细胞中的MAL过表达减少增殖和抑制锚着非依赖性生长(anchorage independent growth)。更有趣的是，其中，本发明的发明人已经示出，可在由自我取样收集的宫颈-阴道样本中检测到MAL启动子的高甲基化，并且发现高甲基化与潜在的重度CIN病变或浸润性宫颈癌的存在相关。

有趣的是，如在本发明的实验部分中显示的，通过联合MAL的甲基化分析与微RNA miR124-2的启动子区域的甲基化分析，实现≥CIN2的高敏感性。

这些结果表明，自我收集的宫颈-阴道样本中MAL启动子甲基化联合hsa-miR-124启动子甲基化的检测可预测重度CIN疾病或宫颈癌。

成熟hsa-miR124序列(登录号MIMAT0000422)由位于三个不同的基因组区域上的3个个体早熟微RNA序列编码，也就是，在染色体8p23.1上的HSA-MIR124-1(登录号MI0000443)，在染色体8q12.3上的HSA-MIR124-2(登录号MI0000444)和在染色体20q12.33上的HSA-MIR124-3(登录号MI0000445)(如在miRNA数据库上指示登录号，miBase(www.mirbase.org)，曼切斯特大学，生命科学系)。尽管成熟序列完全一样，但是早熟和调控序列是不同的(参考图2)。在该申请中，如果使用术语hsa-miR124，包含hsa-miR124的任何形式。

已经在多个人类癌症，包含胃癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌和急性淋巴细胞白血病中描述了hsa-miR124表达的后生下调(表观遗传下调epigenetic down-regulation)(Lujambio等人,Cancer Res2007,67,1424-1429；Andro IntJ Cancer2009；124:2367-2374,Agirre等人CancerRes2009；69:4443-4453)。由Lujambio等人和Agirre等人的早先研究已经指出hsa-miR124的假定的肿瘤抑制功能。在两个研究中，证明hsa-miR124表达的后生沉默(表观遗传沉默，epigenetic silencing)调节细胞周期蛋白D激酶6(CDK6)，即一个预知hsa-miR124的靶的上调。已知CDK6涉及细胞周期进程和分化且可使成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)，已知的肿瘤抑制基因失活，以便促进细胞生长。

因此，本发明提供检测或预测HPV-诱导的重度癌前期病变和HPV-诱导的浸润性癌的发生的方法，包括检验宫颈刮片的自我取样样品的T-淋巴细胞成熟相关的蛋白(MAL)和/或hsa-miR124的甲基化中的变化的存在，其中所述变化指示具有浸润潜在的和HPV-诱导的浸润性癌的HPV-诱导的前期病变的存在或未来的存在。通过增加的MLA基因和特别是它的启动子区域和hsa-miR124启动子区域的甲基化(也称为高甲基化)显示重度前期病变和/或浸润性癌的存在或未来的存在。

受试者的自我取样样品可含有粘膜细胞，如子宫颈细胞，其中检测与HPV相关的前期病变或癌症。

本发明的方法特别适合于由高危型HPV诱导的重度癌前期病变和浸润性癌的检测。优选地，对已经被归类为hrHPV阳性的样品实施本发明的检验方法。

图1显示MAL基因的CpG-富集的启动子区域和CpG-富集的第一内含子序列，以及编码序列和转录的3’非编码序列。特别是启动子区域中的CpG-富集的序列的甲基化将导致急剧减少的转录或甚至完全的转录封锁。相似的现象在hsa-miR124中起作用，在图2中描述它的序列。这里也指示CpG富集区域，并且这些的甲基化将导致急剧减少的转录或甚至完全的hsa-miR124分子的转录的封锁。优选地，对样品的核酸含量实施检验，其中试剂通常是核酸(DNA或RNA)探针或(PCR)引物。例如，通过利用这样的探针或引物，可检测基因表达产物，如mRNA。试剂也可能是限制性内切核酸酶，优选地用于样品核酸上的甲基基团的存在的检测的甲基化敏感的限制性内切核酸酶，此外，优选地，所述样品核酸是DNA。

可直接地原位检测样品核酸，或可在接触试剂之前，通过本领域的技术人员已知的常见方法从其他细胞组分分离样品核酸(参考，例如，"Current Protocols in Molecular Biology",Ausubel等人，1995.4th edition,John Wiley and Sons；"A Laboratoty Guide to RNA:Isolation,analysis,andsynthesis",Krieg(ed.),1996,Wiley-Liss；"Molecular Cloning:A laboratorymanual",J.Sambrook,E.F.Fritsch.1989.3Vols,2nd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press)。

看起来，MAL和/或hsa-miR124的甲基化状态预知重度前期宫颈病变或宫颈浸润性癌的存在或倾向。尤其在称为“CpG岛”(CpG island)的胞嘧啶富集区域中出现高甲基化，其主要地位于基因的5’调控区域，和其通常是未甲基化的。术语“高甲基化”包含在MAL基因序列(例如，MAL启动子，第一外显子和第一内含子序列，参考图1)或hsa-miR124序列(图2)中通常未甲基化的位置上的胞嘧啶的任何一个甲基化。例如，可通过MAL和hsa-miR124多核苷酸(基因)的限制性内切核酸酶处理和DNA印记分析检测高甲基化。因此，在本发明的方法的一个实施方式中，优选限制性内切核酸酶分析用于检测MAL基因或hsa-miR124序列的高甲基化。可利用任何限制性内切核酸酶，其包含作为它的识别位点的部分的CG并且当甲基化C时抑制所述核酸酶。单独或结合使用的甲基化敏感限制性内切核酸酶如BssHII、MspI、NotI或HpaII是这样的内切酶的实例。本领域的技术人员将熟知其他甲基化敏感的限制性内切核酸酶。

用于MAL基因或hsa-miR124序列高甲基化的检测的其他方法包含DNA的重亚硫酸盐修饰(bisulfite modification)，其中将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而使甲基化的胞嘧啶免受化学修饰。随后的PCR扩增和测序，包含焦磷酸测序将揭露是在甲基化的情况下维持CpG岛中胞嘧啶或在未甲基化的状态的情况下通过尿嘧啶取代。另一个方法包含利用包含作为它的识别位点的部分的CG的限制性内切核酸酶对从重亚硫酸盐修饰的DNA产生的PCR扩增的产物的处理。

对甲基化序列的检验的可替换的装置是甲基化特异性的PCR，其也以DNA的重亚硫酸盐修饰为基础，随后是靶向CpG富集序列的特异性PCR反应。

对于本发明的目的，可将MAL或hsa-miR124特异性的核酸探针用于检测生物体液或组织中的MAL或hsa-miR124多核苷酸的存在(利用核酸探针)。基于MAL或hsa-miR124序列中的任何编码序列区域和调控序列区域的寡核苷酸引物具有扩增DNA的用途，例如，通过PCR。

当应用PCR引物时，分析核酸探针或限制性内切核酸酶，5’调控区，MAL序列的第一内含子序列和编码序列(如图1指示的)或hsa-miR124序列(如图2指示的)。

在本发明的方法的一个实施方式中，与可比较的正常的细胞相比，检测检测细胞中增加的MAL基因(包含启动子区域)和/或hsa-miR124序列的甲基化。

根据本发明，本发明也提供用于检测具有浸润潜在的HPV-诱导的前期病变和HPV-诱导的浸润性癌的方法的部件的试剂盒。这样的试剂盒可适当地包括刷子或刮刀，以便获取(阴道)刮片，连同利用收集媒介填充的容器，以便收集检验细胞。可替换地，将包含由冲洗器、一次性女性尿道导管和具有冲洗流体的容器组成的采样设备，以便通过灌洗收集子宫颈-阴道细胞。根据本发明的试剂盒可包括用于MAL和hsa-miR124-2甲基化的检测的引物和探针。在表1和表2中给出用于本发明的引物和探针。

表1：用于对自身样品定量甲基化特异性PCR分析的MAL引物-探针组合：

MAL正向引物	F:GCGTAGTATTAAGTAGAGAGGTTCG
		MAL反向引物	R: AATAAAAAATAAAACCGACCGC
MAL探针	P:ACTAAACCGACGCTAATTCGACGCT

根据本发明的部件的试剂盒包括用于检测MAL和hsa-miR124甲基化的装置，如甲基化-敏感的限制性内切酶，或能够杂交到图1和图2的核苷酸序列上的探针或引物。

在本发明的试剂盒的还有的另一个可替换的实施方式中，可将用于MAL和hsa-miR124甲基化的检测的装置与用于HPV感染的检测的装置相结合，优选地，用于高危型的HPV感染的检测。这样的装置可包括本领域已知的HPV-特异性引物或探针，用于HPV感染的蛋白标记物或甚至用于HPV感染的替代的标记物。

实施例

实施例1.HPV-无限增殖化(永生化)的角质细胞系 (HPV-immortalized keratinocyte cell lines)和宫颈癌细胞系中的 Hsa-miR124甲基化

因为在三个不同的基因组位置上(hsa-miR124-1[8p23.1]、hsa-miR124-2[8q12.3]和hsa-miR124-3[20q13.33])编码成熟Hsa-miR124序列，所以通过定量甲基化特异性PCR(MSP)在所有的3个基因座上测定hsa-miR124甲基化状态。检测下列的扩增子：hsa-miR124-1：nt811至904；hsa-miR124-2：nt701至838；hsa-miR124-3：nt897至991，每一个涉及图2中显示的序列。将管家基因B-肌动蛋白(B-actin)用作内部参考(Harden等人,J Urology2003；169:1138-1142)。利用这些检验，我们没有在从三个不同的捐赠者分离的初级角质细胞中发现hsa-miR124甲基化(EK)，然而，在三个含有hrHPV的宫颈癌细胞系中(SiHa、HeLa和CaSki)甲基化所有三个基因组基因座的相应的CpG岛。在四个hrHPV-无限增值化的角质细胞系的早期和后期传代中(FK16A、FK16B、FK18A和FK18B)，代表HPV-诱导的恶性转化的连续阶段(Steenbergen等人,Oncogene1996；13:1249-1257)，频繁地甲基化hsa-miR124-1和hsa-miR124-2，尽管与后期传代中的高甲基化水平相比(传代70-96)，早期传代中的甲基化水平相对低(传代23-43)。没有甲基化任何HPV-无限增殖化的细胞系中的第三基因，hsa-miR124-3。然而，在SiHa宫颈癌细胞中检测不到hsa-miR124RNA表达，但是，我们确实在利用DNA-去甲基化试剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(DAC，5μM)处理的SiHa细胞中检测到了hsa-miR124重新表达。这指示，在SiHa细胞中，直接地通过后天修饰，主要地DNA甲基化介导hsa-miR124基因沉默。

实施例2：SiHa细胞中的hsa-miR124过表达具有抗增殖和抗迁移的 作用

为了确定减少的hsa-miR124表达在子宫颈致癌作用中的可能的功能相关性，利用含有导致hsa-miR124的稳定表达的基因构件的逆转录病毒载体转导两个宫颈癌细胞系SiHa和CaSki。利用RT-PCR的表达分析证实hsa-miR124转导子中的hsa-miR124的异位表达和利用空逆转录病毒载体转导的细胞中的缺少表达。在培养6天之后，与hsa-miR-ctrl转导子相比，SiHa和CaSki转导子中的hsa-miR124异位表达导致显著的细胞增殖的减少(p<0.05)。此外，利用创伤治愈检验，与SiHa hsa-miR-ctrl细胞相比，发现SiHa hsa-miR124转导子具有减少的迁移能力。

实施例3：子宫颈组织样本中的hsa-miR124启动子甲基化

为了测定是否和何时在体内子宫颈致癌作用的过程期间发生所有的三个hsa-miR124调控区的DNA高甲基化，我们在从正常的子宫颈获得的子宫颈组织样本上，轻度CIN病变(CIN1)，重度CIN病变(CIN3)和宫颈癌(SCCs和AdCas)，利用如表2中定义的引物和探针执行定量MSP分析。在正常的子宫颈中，6％(1/18)样品在hsa-miR124-3上标记甲基化阳性，而没有在正常的样品中，检测到其他两个基因调控区上的甲基化(hsa-miR124-1和hsa-miR124-2)。在CIN1病变中，在hsa-miR124-1上，28％(10/36)显示甲基化，在hsa-miR124-2上6％(2/36)和在hsa-miR124-3上11％(4/36)。CIN3病变中的甲基化阳性从hsa-miR124-1的46％(19/41)，hsa-miR124-2的20％(8/41)至hsa-miR124-3的10％(4/41)不同。如在SCCs中检测的hsa-miR124-1、hsa-miR124-2和hsa-miR124-3的频率分别是86％(25/29)、83(24/29)和72％(21/29)。在AdCa的情况中，在这些肿瘤中，检测到hsa-miR124-1、hsa-miR124-2和hsa-miR124-3的甲基化分别在93％(14/15)、80％(12/15)和73％(11/15)。当结合三个MSP检验时，应该发现，hsa-miR124-1和hsa-miR124-2的组合具有最高的组合敏感性和≥CIN3的特异性，因为所有正常的子宫颈上皮样品检验呈阴性，和59％的CIN3病变，93％的SCCs和93％的AdCas检验呈阳性。应该注意，上述频率说明只具有设定在100％特异性的阈值的组织样本。降低的阈值增加CIN3的敏感性，虽然降低特异性。

表2：用于MIR124-1、MIR124-2和MIR124-3的定量甲基化特异性PCR分析的引物和探针

实施例4：子宫颈刮片中的hsa-miR124甲基化

为了评价hsa-miR124甲基化在临床实践中的假定的标记物价值，我们评价子宫颈刮片中的hsa-miR124。

利用参与人口基础的筛选实验的女性的嵌入式病例-对照设计，我们研究其中在随访的18个月内诊断≥CIN2(包含1癌)的hrHPV阳性女性的子宫颈刮片(也就是，病例)，对其中在18个月随访期间内诊断最大在CIN1的hrHPV阳性的女性(也就是，对照)。在5％对照中和48％病例中检测到Hsa-miR124-1甲基化。在对照中缺少Hsa-miR124-2甲基化和在48％病例中检测到Hsa-miR124-2甲基化并且在5％对照中和24％病例中检测到Hsa-miR124-3甲基化。hsa-miR124-1和hsa-miR124-2的联合分析检测5％对照和71％病例。阈值设定的进一步调整将CIN3的敏感率增加到>80％，特异性比率仍然是可接受的(>50％)。

实施例5：自我取样的样本中的hsa-miR124甲基化

我们随后在预期研究期间，分析利用VibaBrush(Rovers MedicalDevices,Oss,the Netherlands)或Pantarhei取样器(Pantarhei Devices,Zeist,The Netherlands)收集的自我取样的子宫颈-阴道样本，其中将总数45000个自我取样包装发送给女性，这些女性，甚至在第二次暗示之后，也不响应定期的子宫颈筛查的邀请(参考www.trialregister.nl,Trial no.NTR962(PROHTECT trial))。约三分之一的这些女性将自我取样的样本送回到实验室。这些样品适合于HPV PCR分析(也就是，β-球蛋白PCR阳性)并且在响应者女性的匹配的人群中如通过定期筛选发现的这个人群中，通过hrHPV GP5+/6+-PCR的检验产生至少≥CIN2病变(等人2010Brit.Medical J.；340:c1040)。与在随访中仅有25％未显示出临床上有意义的疾病的女性相比，稍后诊断具有≥CIN3的女性的55％自身样本任何一个MIR124标记物检验呈阳性。这些数据显示，自我取样的材料上的MIR124甲基化分析是切实可行的并且将改善潜在的重度子宫颈疾病的检测。

实施例6：对于自我收集的子宫颈-阴道灌洗样本的CADM1和MAL 甲基化分析性能与它们在医师收集的子宫颈刮片上的性能的比较

当应用于完全等同于细胞学执行的医师收集的子宫颈刮片时，编码的T-淋巴细胞成熟相关的蛋白，也称为T-细胞分化蛋白(进一步称为MAL；Genbank登录号NM_002371)的基因和编码细胞粘附分子1(CADM1)的基因的启动子甲基化的联合检验出现吸引人的可替换的分子分类装置(Hesselink等人2011,Clin Cancer Res；17(8):2459-65)。同样地，我们接下来评价从非参加者获得的hrHPV DNA-阳性自收集的子宫颈-阴道灌洗样本上的MAL和CADM1启动子甲基化，其中所述非参加者参与PROHTECT群组研究(等人2010Brit.Medical J.；340:c1040)和将它们的性能与在如通过Hesselink等人描述的医师收集的子宫颈刮片中获得的结果比较(n＝236)(Hesselink等人2011,Clin Cancer Res；17(8):2459-65)。

在PROHTECT1实验中，在它们的自我收集的子宫颈-阴道灌洗样本上对hrHPV检验呈阳性的757女性之中，355女性最后具有有效的研究端点。这些包括已经诊断具有CIN3+的74个女性，包含四个鳞状细胞癌和一个腺癌，20个具有CIN2，并且261没有CIN2+的证据(也就是，最大为CIN1上)。将后面的组称为≤CIN1。根据与先前为医师收集的子宫颈刮片描述相同的标准，利用定量甲基化特异性PCR，检验所有的样品的MAL(区域M1)和CADM1(区域M18)甲基化(Hesselink等人2011,Clin CancerRes；17(8):2459-65)。

与医师收集的子宫颈刮片比较，发现MAL甲基化分析同样地在自收集的子宫颈-阴道灌洗样本上实施，两者都是关于CIN3+和CIN2+病变的检测(图3A)。与此相反，与在医师收集的子宫颈刮片中获得那些相比，在自我收集的子宫颈-阴道灌洗样本的CADM1甲基化分析上获得的信号显著地减少并且同样地特别地是，自我收集的子宫颈-阴道灌洗样本中的CIN3+的检测是不令人满意的(图3B)。

这种不一致最可能反应事实，即，自我收集的样本可具有不同于通过医师获取的子宫颈刮片的细胞成分(也就是，与阴道细胞相比，子宫颈细胞的相对缺少)。因此，没有必要直接地将hrHPV-阳性医师-获取的子宫颈刮片的最佳的分类标记物转化为自我取样样品。对于最佳的临床性能，可能需要不同组的甲基化标记物。

实施例7：自我收集的子宫颈-阴道灌洗样本中的hsa-miR124-2甲基 化联合MAL甲基化的分析

如实例1中描述的，需要可替换的甲基化标记物，以便增强自我收集的样本中的甲基化分析的临床性能。我们先前利用MAL和CADM1的研究显示，根据CIN3+检测，代表子宫颈致癌作用的多步过程中的不同功能事件的标记物可彼此互补(Overmeer等人,Int J Cancer2010Epub Dec28,；Hesselink等人.2011,Clin Cancer Res；17(8):2459-65)。因此，我们假设，对于自我收集的样本的分析，代表与CADM1相同的转化的阶段的可替换的标记物是优选的。然而，MAL甲基化在转化的相对早期发生，也就是，HPV-无限增值化细胞的早期传代中的高甲基化水平，和将CADM1甲基化连接到转化的后期阶段，如锚着非依赖生长和致肿瘤性，我们寻找功能上与转化的后期阶段相关联的甲基化事件。一个这样的事件是人类微RNA124的甲基化介导的沉默。在锚着非依赖的生长特征的获取上，编码这些微RNA的基因的高甲基化水平在HPV-转染的角质细胞的后期传代中变得明显。此外，发现hsa-miR124的过表达抑制宫颈癌细胞的致癌生长性能，支持在子宫颈致癌作用中的功能作用，参考实施例2。

因此，在与对CADM1和MAL的检验相同的一系列hrHPV-阳性自我收集的样本中，评价为CIN3+的检测补充MAL标记物潜能的甲基化标记hsa-miR124(参考实施例1)。有兴趣的是，与CADM1相比，hsa-miR124-2的分析显示更好的CIN3+的识别(图4)。最重要的是，发现hsa-miR124-2/MAL联合在自我收集的样本上具有极好的临床性能(也就是，在52.5％特异性上86.5％的CIN3+敏感性)，等于CADM1/MAL在医师收集的样品中的(也就是，在50％特异性上83.3％的CIN3+敏感性)。

在表1和表2中列出在自我收集的子宫颈-阴道样本上用于qMSP分析的所有的引物和探针组合。

Claims (12)

1.一种检测或预测HPV-诱导的重度癌前病变和/或HPV-诱导的浸润性癌的发生的方法，包括检验宫颈-阴道自身样品的T-淋巴细胞成熟相关的蛋白(MAL)和/或hsa-miR124的甲基化中变化的存在，其中所述变化指示存在或将来存在具有浸润潜能的HPV-诱导的前期病变和/或HPV-诱导的浸润性癌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述HPV-诱导的重度癌前病变或HPV-诱导的浸润性癌是重度癌变前宫颈病变或浸润性宫颈癌。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述HPV-诱导的浸润性癌是高危型HPV-诱导的浸润性癌。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与正常的对照样品相比，所述变化是甲基化的增加。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对编码MAL多肽及其调控区以及hsa-miR124序列的核酸检验所述甲基化。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸是DNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其中利用限制性内切核酸酶，优选地甲基化敏感的限制性内切核酸酶实施所述检验。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述试剂是结合到所述核酸上的核酸探针或引物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酸探针或引物具有可检测的标签。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述核酸探针具有选自由在表1中描述的序列组成的组中的核苷酸序列。

11.分子诊断标记物用于检测HPV-诱导的重度癌前病变或HPV-诱导的浸润性癌的应用，其中所述标记物指示MAL基因或启动子甲基化和/或hsa-miR124序列的甲基化。

12.用于在检测受试者的检验细胞中HPV-诱导的重度癌前病变或HPV-诱导的浸润性癌的方法中使用的部件的试剂盒，所述试剂盒包括：

-用于检测MAL基因或启动子甲基化的装置，其中所述装置包括MAL特异性的或图1的MAL核苷酸序列特异性的探针、引物和/或甲基化敏感的限制性内切核酸酶；和

-用于检测hsa-miR124甲基化的装置，其中所述装置包括hsa-miR124特异性的探针、引物和/或甲基化敏感的限制性内切核酸酶，

-可选地，用于检测HPV感染的装置，其中所述装置包括HPV特异性的探针和引物，以及

-可选地，用于获取宫颈-阴道自身样品的装置，其中优选地，所述装置选自VibaBrush(Rovers医疗装置，奥斯，荷兰)和Pantarhei取样器(Pantarhei装置，宰斯特，荷兰)的组。