JP2023549573A - キャピラリーベースのイムノアッセイシステムを使用する複合糖質の分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
●4つのグリコシル化部位を有するEPA担体タンパク質
●異なる大腸菌(Escherichia coli)O-抗原に対応する多糖成分。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈(特に、特許請求の範囲の文脈)において、「a」、「an」、「the」という用語、並びに同様の用語の使用は、本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈上明確に矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるものとする。
大腸菌(E.coli)大腸菌(Escherichia coli)
EPA緑膿菌(P.aeruginosa)の解毒された外毒素A
Fc抗体の定常領域
HRP西洋ワサビペルオキシダーゼ
LPSリポ多糖
PS多糖
SSCシステム適合性制御
(a)試験試料と、較正曲線を確立するためを確立するための較正試料のセットと、任意選択でラダー試料、及び任意選択で対照試料を提供することと、
(b)キャピラリーベースのイムノアッセイシステムを用いて、個々のキャピラリーにおいて、当該試験試料、当該較正試料、任意選択で当該ラダー試料、及び任意選択で当該対照試料を測定し、それによって各キャピラリーについてのデータセットを生成することと、
(c)少なくとも以下の機能、すなわち、
●積分のための限界を受け取る、及び
●各キャピラリーについてバックグラウンド信号を計算する、及び
●各キャピラリーで発生した信号からバックグラウンド信号を差し引く、を提供するコンピュータプログラムによって当該データセットを分析することと、を含む。
試験試料:広範囲の試料が、本発明の文脈において使用され得る。定量可能な複合糖質はまた、完全に分離されていないピークを含む広い信号の生成をもたらし、したがって現在利用可能なキャピラリーベースのイムノアッセイ法によって定量可能でない複合糖質を含む。そのような広い信号は、例えば、50~600kDa、好ましくは100~500kDa、典型的には200~400kDaの分子量範囲に及び得る。そのような広い信号の例を図1~3に示す。例えば、図1に示す信号は、約370kDaの分子量範囲に及ぶ、すなわち、信号は、約80kDaで始まり、約450kDaで終わる。この場合、WES(商標)システムに含まれるCompassソフトウェアは、全信号領域を確実に積分することができない。このような分析方法は、密接に関連する複合糖質の混合物、すなわち、多糖成分のみが異なる複合糖質、特にバイオコンジュゲートにも適用することができる。
(c1)工程b)で生成されたすべてのキャピラリーについてのデータセットを受け取ることと、
(c2)キャピラリーごとにバックグラウンドを同定することと、
(c3)個別バックグラウンド信号を対応するキャピラリーの測定信号から減算することと、
(c4)血清型特異的且つ手動で調節可能な積分範囲にわたってバックグラウンド補正信号を積分することによって、キャピラリーごとの曲線下面積を得ることと、
(c5)既知の濃度を有する較正試料によって生成された信号に非線形回帰を適用することによって較正曲線を確立し、それによって、対応する較正試料の濃度に対する各信号について計算された曲線下面積をプロットすることと、
(c6)測定された曲線下面積を較正曲線と比較することによって、試験試料中の複合糖質の濃度を計算することと、
(c7)予め定義された合格基準との自動比較によって、計算された濃度の妥当性を評価することと、のうちの1つ以上を、好ましくは示される順序で、更に含む。
第1及び第2のウィンドウの開始及び幅は、個別に選択することができる。一例として、第1のウィンドウは、X1=「積分範囲の一部である最低X軸値」からX2=X1-「第1の調節可能な分子量ウィンドウ[kDa]の幅」までの範囲に及び得る。第2のウィンドウは、X3=「積分範囲の一部である最高X軸値」からX4=X3+「第2の調節可能な分子量ウィンドウ[kDa]の幅」までの範囲に及び得る。
一実施形態では、それぞれの平均データポイントP1及びP2は、それぞれの第1又は第2の分子量ウィンドウ内の少なくとも3つのデータポイントの信号強度(y軸)の平均及びこれらのデータポイントにおける分子量(X軸)の平均からなる。
●較正曲線の決定係数(R2)、例えばR2≧0.85、例えばR2≧0.90
●較正試料の変動係数、例えばCV≦30%、例えばCV≦25%
●試験試料内の複合糖質についての変動係数、例えばCV≦25%、例えばCV≦20%
●試験試料内の対照試料の変動係数、例えばCV≦25%、例えばCV≦20%
●対照試料について計算された濃度の対照試料の既知濃度に対する相対差、例えば
([計算濃度]-[既知濃度])/[既知濃度]≦35%
第1の特徴は、各キャピラリーについてのバックグラウンド信号の計算、及びそのキャピラリー内の複合糖質によって生成される信号からの当該バックグラウンド信号の減算である。バックグラウンド信号はキャピラリー間で変動し、したがって、各キャピラリーにおいて考慮されない限り、定量化の再現性を低下させる。
第2の特徴は、信号積分の限界を受け取る可能性である。これらの限界は、典型的にはユーザによって設定される。こうして計算された濃度は、予め定義された合格基準と自動的に比較される。これにより、試験試料が予め定義された合格基準に適合するかどうかを評価することが可能になる。
I.参照物質の調製
大量の糖タンパク質試料を製造バッチから直接得て、等分し、適切に保存した(例えば、-80℃)。異なる特徴付け工程を、当該糖タンパク質試料の解凍アリコートに対して行った。
-0~24分、100%溶出液A、1mL/分の流速(溶出)
-25~32分、100%溶出液B、1mL/分の流速(洗浄)
-33~60分、100%溶出液A、1mL/分の流速(再平衡化)
分析(同定及び絶対定量化)される試験試料は、複合糖質ワクチンの製造バッチから直接得た。同じ複合糖質種、すなわち、同じPS成分(この場合、大腸菌(E.coli)O4抗原多糖)及び同じ担体タンパク質(この場合、配列番号3を有する解毒されたEPA)を反映する参照材料を、上記のように調製した。上記のように、試験試料は、大腸菌(E.coli)血清型O1A、O2、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B及びO75に対応する9つの更なるO-EPAバイオコンジュゲートを更に含んでいた。
試験試料、較正試料及び対照試料内に存在するO4O-EPAバイオコンジュゲートの濃度を、Bio-Techne(カタログ番号042-195)によって提供される0.1×試料緩衝液(SB)を使用してそれぞれの標的濃度に希釈した。試験試料について、予想濃度は、個々の複合糖質を多価複合糖質ワクチン組成物に組み合わせる前に、個々の複合糖質の製造バッチについて測定した濃度から計算した。
(i)較正曲線は、異なるPS濃度を有する4つの較正試料から生成したものである(0.200、0.155、0.110、及び0.065μg/mL)。各較正試料を三連で調製した。
(ii)試験試料、すなわち複合糖質ワクチンバッチを、0.150μg/mLのPS濃度(大腸菌(E.coli)O4多糖)に希釈した。試験試料を四連で調製した。
(iii)対照試料(SSC)を0.100μg/mLのPS濃度に希釈した。対照試料を三連で調製した。
蛍光マーカー及びビオチン化ラダーは、Bio-Techne(カタログ番号PS-FL03-8)から入手した。2つの蛍光マーカーを各キャピラリーに含め、個々のキャピラリー間の電気泳動移動における差異を説明するために使用した。蛍光マーカーは57kDa及び280kDaに移動した。ビオチン化ラダーは、既知の分子量の多数のタンパク質を含み、別のキャピラリーで分析した。ラダーを、分析される複合糖質のサイズ基準として使用した。ビオチン化ラダー内のタンパク質の分子量は、66kDa~440kDaの範囲に及んだ。蛍光マーカー及びビオチン化ラダーを、製造業者の指示に従って調製した。
(i)蛍光マーカーを、400 mMのDTTを補充した10×試料緩衝液(カタログ番号042-195)に再懸濁して、5×蛍光マスターミックスを作製した。
(ii)ビオチン化ラダーを脱イオン水に再懸濁した。
(i)希釈された試験試料、較正試料及び対照試料の各々の(i)4.8μLを、各々1.2μLの5X蛍光マスターミックスと混合した
(ii)タンパク質を5分間95℃でインキュベートした。
(iii)混合物を5分間氷上でインキュベートすることにより冷却した。
(iv)混合物を短時間ボルテックスし、スピンダウンし、5μLをアッセイプレートの別々の区画にロードした。このアッセイプレートの1つの区画には、分離マトリックス3、スタッキングマトリックス2、スプリットランニングバッファー3及びマトリックス除去バッファー(Bio-Techne、カタログ番号SM-W006)を予め充填しておいた。この区画は、販売者によって既に封止されていた。
(i)O4-EPA複合糖質(大腸菌(E.coli)O-抗原、血清型O4)のPS成分に特異的な一次ラットモノクローナル抗体を、抗体希釈剤2(Bio-Techne、カタログ番号042-203)で希釈して、最終濃度を0.05 mg/mLとした。
(ii)二次抗ラットHRP抗体(Biolegend、カタログ番号405405)を抗体希釈剤2中に1:100の比で希釈した。
(iii)検出モジュール(Bio-Techne、カタログ番号DM-003)に供給した15μLのルミノール-S試薬と15μLの過酸化物試薬とを混合してキャピラリー#1の基質を調製した。
(iv)220μLのルミノール/エンハンサー試薬と、Clarity(商標)ウェスタンECL基質キット(BioRad、カタログ番号170-5060)で供給される220μLの過酸化物試薬とを混合してキャピラリー#2-25の基質を調製した。
(v)抗体(10μL/ウェル)及び基質(15μL/ウェル)を、工程3(iv)で調製したアッセイプレートの別々の区画にロードした。
(vi)洗浄緩衝剤(Bio-Techne、カタログ番号042-202)を、製造業者の指示に従ってアッセイプレートの別々の区画に添加した(500μL/区画)。
(vii)アッセイプレートを蓋で覆い、1100×gで5分間、室温で遠心分離して、液体がすべてのウェルの底にあることを確実にした。
この工程では、工程4(vii)の後に得られたアッセイプレートを、WES(商標)機器(Bio-Techne)にロードして分析を開始した。
(i)キャピラリーウェスタンシステム及びその関連コンピュータのスイッチを入れた。機器の光信号がパルスを停止した後、システムは使用の準備ができ、WES(商標)システムと共に提供されたCompassソフトウェアを開始した。
(ii)「新しい実行」ウィンドウをCompassソフトウェアで開き、以下のパラメータを選択した。アッセイタイプとして「サイズ」、サイズ範囲として「66~440 kDa」、及びカートリッジとして「25」。
(iii)キャピラリーカートリッジ(Bio-Techne、カタログ番号SM-W006)を適切なホルダーに挿入し、内部の光がオレンジ色から青色に変化し、カートリッジが適切に挿入されたことを示した。
(iv)アッセイプレートの蓋を取り外した後、蒸発シールをベンチ上にしっかりと保持することによってプレートから注意深く剥がした。気泡が分離マトリックスウェル中に存在する場合、そのような気泡は、清浄な針を使用して除去することができる(この場合は不要であった)。
(v)予め充填されたアッセイプレートをプレートホルダー上に置き、機器のドアを閉じ、Compassソフトウェアからアッセイ実行を開始した。
(i)Compassソフトウェアにおいて、蛍光マーカー(57及び280 kDa)の正確な位置を検証した。蛍光マーカーに対応する信号がソフトウェアによって誤って割り当てられた場合、信号の位置は、「標準ではない」又は「標準を強制する」を選択することによって、それぞれ57及び280 kDaに補正することができる(この場合は不要であった)。
(ii)データセットは、以下を選択することによってCompassソフトウェアからエクスポートされた。→エクスポートスペクトル→テキストフォーマット(スペクトルを含む新しいフォルダは、ランが保存された同じフォルダに自動的に作成された)。
(iii)データセット(Sample Plots Raw.txt)を本発明の方法のコンピュータプログラムにインポートして、データを分析した。
(iv)試料ID、血清型、使用した機器及び分析の日付を入力した。
(v)積分範囲(100~480 kDa)及び相対ベースライン評価範囲(分子量ウィンドウ:10 kDa;90~100 kDa及び480~490 kDa)を入力した。
(vi)較正試料によって生成された信号に、式:ln(面積)=Aln(濃度)^2+B ln(濃度)+Cに従って、二次効果を有する双対数回帰モデルを用いた双対数を適用することによって較正曲線を確立した。較正曲線は、対応する較正試料の濃度に応じて各信号について計算された曲線下面積を含んでいた。試験試料中の複合糖質の濃度を、試験試料について測定された曲線下面積を較正曲線と比較することによって計算した。この比較は、較正曲線の基礎となる上述の回帰関数の反転によって行った。当該回帰関数の当該反転は2つの結果を生じる。最も可能性の高い結果、すなわち試験試料内の複合糖質の予想される含有量により近い結果が選択される。
9つの異なるバイオコンジュゲートを含む複合糖質ワクチン組成物の2つのバッチ(各バイオコンジュゲートは、血清型O1A、O2、O4、O6A、O15、O16、O18A、O25B、及びO75の大腸菌(E.coli)O-抗原多糖のうちの1つに共有結合した配列番号3を有する解毒されたEPAを含む)を、先行技術(Compass Softwareを備えたWes(商標))及び本発明の方法に従ってO25B O-EPAバイオコンジュゲート濃度に関して分析した。
(i)従来技術の方法によるAUCは、全信号領域の不完全な積分に起因して、本発明の方法によるAUCよりも低い。
(ii)従来技術によるより低い分析精度(より高いCV)、信号を積分するための偶発的な失敗(より低い再現性)を含む個々の測定のより高い偏差。
a)Compassソフトウェアで提供される線形モデル(代替的に、Compassソフトウェアで提供されるのは「4パラメータロジスティックモデル」であるが、これはデータセットに適していなかった)、又は
b)式:ln(面積)=Aln(濃度)^2+Bln(濃度)+C(本発明の方法)による、二次効果を有する双対数回帰モデル。
a)Compassソフトウェア(従来技術)を使用して得られた上記較正曲線又は
b)本明細書に記載のコンピュータプログラムを使用して得られた上記較正曲線(本発明の方法)。
配列番号1(グリコシル化コンセンサス配列)
Asn-X-Ser(Thr)、式中、XはProを除く任意のアミノ酸であり得る
配列番号2(最適化グリコシル化コンセンサス配列)
Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)、式中、X及びZはProを除く任意のアミノ酸から独立して選択される
配列番号3(4つのN結合型グリコシル化コンセンサス配列を含むEPA担体タンパク質)
Claims (13)
- 少なくとも4つの複合糖質の混合物を含む試験試料中の複合糖質を分析する方法であって、
前記分析が、
●前記複合糖質の同定及び
●較正曲線に基づく前記複合糖質の絶対定量化を含み、
前記方法が、
(a)前記試験試料と較正試料のセットと、任意選択でラダー試料、及び任意選択で対照試料を提供することと、
(b)キャピラリーベースのイムノアッセイシステムを用いて、個々のキャピラリーにおいて、前記試験試料、前記較正試料、任意選択で前記ラダー試料、及び任意選択で前記対照試料を測定し、それによって各キャピラリーについてのデータセットを生成することと、
(c)少なくとも以下の機能、すなわち、
●積分のための限界を受け取る、及び
●各キャピラリーについてバックグラウンド信号を計算する、及び
●各キャピラリーで発生した信号からバックグラウンド信号を差し引く、
を提供するコンピュータプログラムによって前記データセットを分析することと、
を含む、方法。 - 前記複合糖質の測定が、広い信号、特に完全に分離されていないピークを含む広い信号をもたらす、請求項1に記載の方法。
- 前記複合糖質が複合糖質ワクチンの成分である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記複合糖質が、バイオコンジュゲート、特に、好ましくは大腸菌(E.coli)におけるPglBオリゴサッカリルトランスフェラーゼ系を使用して、担体タンパク質への多糖成分の酵素的コンジュゲーションによって生成されるバイオコンジュゲートである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複合糖質が、1つの担体タンパク質と、前記担体タンパク質に共有結合した1つ以上の多糖とを含み、
(i)前記担体タンパク質が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(EPA)の解毒された外毒素Aであり、且つ、
(ii)前記多糖が、O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B又はO75からなる群から選択される大腸菌(Escherichia coli)O抗原である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記多糖が1~100個、好ましくは3~30個、より好ましくは5~20個の繰り返し単位を含み、前記繰り返し単位が非修飾単糖及び/又は修飾単糖を含み、前記修飾単糖が特にO-アセチル化及び/又はN-アセチル化単糖である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験試料が、
●緩衝剤、無機塩、糖アルコール、及び/又は非イオン性界面活性剤のうちの1つ以上を任意選択で含む水性マトリックス、
●任意選択で、担体タンパク質に結合していない多糖(「遊離PS」)、
●任意選択で非関連タンパク質、
を更に備える、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試験試料が、多数の異なる複合糖質、好ましくは4~20の複合糖質、好ましくは4~10の複合糖質、例えば4、9又は10の複合糖質を含み、前記複合糖質が、請求項5(ii)に記載の多糖成分において異なる、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析が、
●前記複合糖質のモノ-、ジ-、トリ-及び/若しくはテトラグリコシル化変異体の同定、並びに/又は
●較正曲線に基づく前記複合糖質のモノ-、ジ-、トリ-及び/又はテトラグリコシル化変異体の絶対定量化
を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記工程a)が、以下の工程、すなわち、
(a1)前記複合糖質の濃度を0.01~0.50μgmL-1の予想濃度に調整すること、
(a2)試料緩衝液、ジスルフィド架橋還元剤、及び1つ以上のマーカーから選択される1つ以上の補助試薬を前記試料に添加すること、
(a3)好ましくは熱を加えることによって、前記試料を変性させること、
のうちの1つ以上を、好ましくは示される順序で、更に含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記工程b)が、以下の工程、すなわち、
(b1)分析マトリックスを、好ましくはサイズ排除マトリックスを含む分析マトリックスを、前記イムノアッセイシステムのキャピラリーにロードすること、
(b2)前記試験試料、較正試料、任意選択のラダー試料、及び任意選択の対照試料を、前記イムノアッセイシステムの個々のキャピラリーにロードすること、
(b3)前記試料の成分を分離すること、
(b4)前記試料の成分を固定化すること、
(b5)前記複合糖質に結合するグリカン特異的一次抗体を適用すること、
(b6)前記一次抗体に結合し、且つ、検出可能な信号を生成する二次抗体を適用すること、
(b7)前記二次抗体が酵素に連結されている場合、前記酵素に対する基質を適用すること、
のうちの1つ以上を、好ましくは示される順序で、更に含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。 - 工程(b6)において、前記検出可能な信号が、前記二次抗体が、化学発光反応、化学蛍光反応、又は着色若しくは蛍光生成物をもたらす化学反応を触媒することができる西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素に共有結合されることによって生成される、請求項11に記載の方法。
- 前記工程c)が、以下の工程、すなわち、
(c1)工程b)で生成されたすべてのキャピラリーについての前記データセットを受け取ることと、
(c2)キャピラリーごとに前記バックグラウンドを同定することと、
(c3)前記個別バックグラウンド信号を前記対応するキャピラリーの測定信号から減算することと、
(c4)多糖特異的かつ調節可能な積分範囲にわたって前記バックグラウンド補正信号を積分することによって、キャピラリーごとの曲線下面積を得ることと、
(c5)既知の濃度を有する較正試料によって生成された信号に、非線形回帰を適用することによって、好ましくは、二次効果を有する双対数回帰モデルを適用することによって、較正曲線を確立し、それによって、対応する較正試料の濃度に対する各信号について計算された曲線下面積をプロットすることと、
(c6)前記測定された曲線下面積を前記較正曲線と比較することによって、前記試験試料中の前記複合糖質の濃度を計算することと、
(c7)予め定義された合格基準との自動比較によって、前記計算された濃度の妥当性を評価することと、
のうちの1つ以上を、好ましくは示される順序で、更に含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
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