CN116406445A - 使用基于毛细管的免疫测定系统进行的用于糖缀合物的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于鉴定和定量复杂糖缀合物组合物的分析方法，特别是用于分析包含至少4种糖缀合物的样品中的糖缀合物的分析方法。

Description

使用基于毛细管的免疫测定系统进行的用于糖缀合物的分析 方法
本发明涉及用于鉴定和定量复杂糖缀合物组合物的分析方法，具体地涉及包含至少4种糖缀合物的样品中的糖缀合物的分析，特别是在糖缀合物导致产生可能包含未完全分辨的峰的宽信号的情况下。
监管机构对生物制药制造商施加的压力越来越大，要求他们展示令人满意的程序来理解、测量和控制基于糖缀合物的药物中的糖基化。然而，复杂糖缀合物组合物(诸如糖缀合物疫苗)的分析(即，这种组合物内各个糖缀合物的鉴定和定量)是一项具有挑战性的任务。这种分析通常涉及劳动密集型方法，诸如酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)或手动斑点印迹法Western(manual dot blot Western)。
这种方法通常涉及大量的人工劳动。
此外，经常使用的ELISA没有提供关于每种糖缀合物的不同糖基化变体的信息。
最近的替代方法是基于毛细管的免疫测定方法，即毛细管蛋白质印迹，除了样品制备步骤外，该方法可以是完全自动化的[参见例如Rustandi等人，Applications of anAutomated and Quantitative CE-Based Size and Charge Western Blot forTherapeutic Proteins and Vaccines.2016.Tran N.,Ta-verna M.(编辑)CapillaryElectrophoresis of Proteins and Peptides:Methods and Protocols.Methods inMolecular Biology，第1466卷，第197-217页]。这种方法可以显著减少人工劳动量以及整体分析时间。
在此类方法中，样品的不同组分在毛细管内被分离并借助于特异性抗体被检测到。
Hamm等人[Analytical Biochemistry 2015,478:33-39]描述了使用基于毛细管的免疫测定法来鉴定糖缀合物疫苗组合物内的各个糖缀合物。然而，他们并没有报道所述组合物内糖缀合物的定量，而仅仅提出进行定量的可能性。因此，该文献也没有描述用于产生校准曲线的校准样品的测量。为了实现糖缀合物疫苗组合物内所有糖缀合物的准确定量，必须能够准确地对与每个单独糖缀合物相对应的整个信号进行积分。因此，该文献仅公开了糖缀合物的鉴定测试。因此，它也没有公开允许对导致产生包含未完全分辨的峰的宽信号的糖缀合物进行定量的计算机程序。此外，没有公开生物缀合物的分析。
Minsker等人[Vaccine 2020,38:7155-7174]描述了使用毛细管蛋白质印迹来鉴定和相对定量糖蛋白。在该方法中，检测糖蛋白的蛋白质组分，并将所得信号用于确定糖蛋白的相对丰度。因此，该方法不包括用于产生校准曲线的校准样品的测量，也不包括感兴趣糖蛋白的绝对定量。此外，没有提供关于数据分析的细节。相反，它指出“按默认供应商建议应用所有未指定的设置”。
Markely等人[Biotechnology progress 2015,32(1):235-241]描述了一种用于相对定量不同唾液酸化形式的糖蛋白以便监测细胞培养期间唾液酸化的相对变化的等电聚焦免疫测定方法。因此，该文献既没有描述校准曲线的产生，也没有描述糖缀合物的绝对定量。使用Compass软件根据制造商的指南进行该文件中的数据分析。
然而，一般来讲，导致产生宽信号(特别是包含未完全分辨的峰的宽信号)的分析物的定量仍然是一个挑战[参见例如Castle等人，J.Biol.Chem.2019,294(8):2642-2650中的图5D]。
虽然一些糖缀合物可导致产生可通过目前可用的基于毛细管的免疫测定方法进行量化的窄信号，但其它糖缀合物则不会。例如，包含具有四个糖基化位点的EPA载体蛋白的糖缀合物可以以单糖基化、二糖基化、三糖基化或四糖基化形式存在。这种糖缀合物可以通过例如使用PglB寡糖基转移酶将多糖组分酶促缀合到载体蛋白而产生[参见例如WO2015/124769；WO 2020/191082；Poolman和Wacker,J.Infect.Dis.(2016)第213(1)卷，第6-13页及其中的参考文献)。在这种情况(即，将多糖组分酶促缀合到细胞中的载体蛋白)下，糖缀合物也被称为生物缀合物。
在借助于基于毛细管的免疫测定方法进行分析时针对此类生物缀合物产生的信号通常是宽的并且包括对应于不同糖基化状态(例如，生物缀合物的单糖基化、二糖基化、三糖基化或四糖基化形式的混合物)的数个峰，这些峰通常是未完全分辨的，即未基线分离的。
在这种情况下，目前可用的基于毛细管的免疫测定系统即WesTM系统联合软件“Compass for SW第3.1.7版”[可从Bio-techne商购获得；https://www.proteinsimple.com/wes.html，2020年9月7日访问]无法提供有关测试样品的可靠定量数据。
因此，已知的基于毛细管的免疫测定方法不适用于所有糖缀合物、特别是产生宽信号的糖缀合物(因为生物缀合物通常就是这种情况)的鉴定和绝对定量。此类宽信号可跨越100kDa-500kDa、通常200kDa-400kDa的分子量范围。其示例是包含具有限定数量(例如，1-10个，诸如4个)的糖基化位点的载体蛋白并且其中聚糖缀合到有限数量(例如，1-10个，诸如1、2、3或4个)的特定糖基化位点的生物缀合物。具体地，包含以下项的生物缀合物及其混合物就是这种情况：
●具有四个糖基化位点的EPA载体蛋白，以及
●对应于不同大肠杆菌(Escherichia coli)O-抗原的多糖组分。
如上所述，其中将聚糖偶联到有限数量(诸如4个)的特定糖基化位点偶联的这种生物缀合物可以通过使用PglB寡糖基转移酶将多糖组分酶促缀合到载体蛋白而产生[例如WO 2015/124769；WO 2020/191082；Poolman和Wacker,J.Infect.Dis.(2016)第213(1)卷，第6-13页及其中的参考文献)。
此外，密切相关的糖缀合物(即，仅在对应于抗原的不同血清型的PS组分方面不同的糖缀合物)的鉴定和绝对定量对于每种糖缀合物、特别是生物缀合物来说是一个独特的挑战。尚未针对上述糖缀合物描述借助于基于毛细管的免疫测定方法进行这种分析。
因此，本发明的目的是减轻现有技术的这些限制。
下面将更详细地描述本发明。应当理解，如本说明书中提供/公开的各种实施方案、优选要求和范围可随意组合。此外，取决于具体的实施方案，所选择的定义、实施方案或范围可能不适用。
附图说明
图1：由如实施例1中所述，使用WESTM系统中包括的软件“Compass for SW 3.1.7版本”的Dropped Lines功能，测量包含EPA载体蛋白和对应于大肠杆菌O-抗原(血清型O6)的PS组分的糖缀合物所得的电泳图的分析。这种类型的面积计算也被称为垂直下降方法。使用Compass软件进行分析无法对整个信号面积进行积分(Compass软件仅对标记的面积进行积分)。Y轴表示化学发光信号强度，并且X轴表示以kDa表示的分子量(MW)。
图2：由如实施例1中所述，使用如本文所述的计算机程序，分析包含EPA载体蛋白和对应于大肠杆菌O-抗原(血清型O4)的PS组分的糖缀合物所得的电泳图的积分。Y轴表示化学发光信号强度，并且X轴表示以kDa表示的分子量(MW)。
使用WESTM系统进行测量。积分范围由100kDa和480kDa处的两个竖直矩形指示。矩形的宽度表示用于计算特定毛细管的背景信号的分子量窗口。从由相应毛细管内的分析物所得的信号中自动减去背景信号。积分范围和用于计算毛细管特异性背景信号的分子量窗口的宽度可以由用户调节。
A)由分析四个校准样品所得的电泳图的叠加(示出一个重复)。这用于产生校准曲线。
B)在包含10种糖缀合物的多价糖缀合物疫苗组合物中分析上述糖缀合物的4个重复的叠加。这证实了分析物的身份确定和绝对定量的技术再现性。
图3：由使用WESTM系统三次测量(一式三份)O25B O-EPA生物缀合物所得的电泳图的分析。Y轴表示化学发光信号强度，并且X轴表示以kDa表示的分子量(MW)。
A-C：使用WESTM系统中包括的软件“Compass for SW 3.1.8版本”的Dropped Lines功能(也被称为垂直下降方法)对O25B-EPA一式三份测量进行积分。使用Compass软件进行分析导致每次测量的积分范围(标记面积)不同。在每种情况下，Compass软件都无法对整个信号面积进行积分。
D-F：与A-C中相同的O25B O-EPA一式三份测量的积分，但使用如本文所述的计算机程序进行积分。积分范围由100kDa和570kDa处的两个竖直矩形指示。矩形的宽度表示用于计算特定毛细管的背景信号的分子量窗口。从由相应毛细管内的分析物所得的信号中自动减去背景信号。整个信号面积的积分以可再现方式执行。
除非另有说明，否则以下定义将适用于本说明书：
如本文所用，在本发明的上下文中(特别是在权利要求书的上下文中)使用的术语“一个”、“一种”和“该/所述”以及类似术语应理解为涵盖单数和复数两者，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。
如本文所用，术语“包括”、“含有”和“包含”在本文中以其开放、非限制性意义使用。应当理解，各种实施方案、优选要求和范围可随意组合。
糖缀合物：术语“糖缀合物”在本领域中是已知的并且特别描述了与一种或多种多糖(PS)共价结合的化学实体。这种糖缀合物可通过在活细胞中进行生物缀合获得(“生物缀合物”或“生物学缀合物”)，或可通过多糖的化学缀合来获得(“化学”或“合成”糖缀合物)。合适的化学实体包括蛋白质/肽和脂质，相应的糖缀合物是糖蛋白和糖脂。在本发明的范围内，特别合适的是选自糖蛋白组的糖缀合物。如上所述，使用现有技术的方法鉴定和绝对定量作为生物缀合物(即，糖蛋白亚组)的糖缀合物是特别具有挑战性的。然而，在本发明的上下文中，生物缀合物是特别合适的糖缀合物。
更详细地，术语“糖蛋白”包括“传统糖蛋白”和“糖缀合物疫苗”。
在传统糖蛋白中，重点在于蛋白质部分，诸如例如对于其中“活性”原理更多地存在于蛋白质部分的抗体或促红细胞生成素，并且聚糖在半衰期或定义其它特性方面发挥作用。此类传统糖蛋白广泛用于药物应用中，诸如用于肿瘤学或炎性疾病中。
在糖缀合物疫苗中，重点在于需要对其产生免疫反应的聚糖部分，因为聚糖是相关抗原，而蛋白质部分仅作为载体以产生所需的T细胞记忆免疫反应。因此，糖缀合物疫苗不同于上述“传统糖蛋白”。
在优选的实施方案中，糖缀合物是作为糖缀合物疫苗组合物的一部分的糖缀合物疫苗。糖缀合物疫苗包含与一种或多种PS组分连接的载体蛋白，所述PS组分对应于抗原，特别是细菌O-抗原。与化学糖缀合物相反，生物缀合物最近已成为特别合适的糖缀合物疫苗。
在本发明的范围内特别合适的是选自糖缀合物疫苗组的糖蛋白，更特别是生物缀合物。
生物缀合物：该术语在上面讨论。具体地，生物缀合物是在宿主细胞中制备的糖缀合物，其中宿主细胞机器产生聚糖和载体蛋白并例如经由天冬酰胺或精氨酸的N-连接将聚糖连接到载体蛋白。用于产生生物缀合物的特别优选的宿主细胞是大肠杆菌，该大肠杆菌优选地包含编码以下项的核酸：(i)载体蛋白，(ii)寡糖基转移酶，诸如空肠弯曲菌(C.jejuni)PglB，其能够经由N-连接的糖基化将O-抗原多糖共价连接到载体蛋白中的糖基化共有序列(Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸)中的天冬酰胺(Asn)残基，以及(iii)rfb基因簇，其编码负责产生所需血清型的O抗原多糖的酶。通过产生具有不同rfb基因座的宿主细胞，可以制备例如包含来自不同大肠杆菌或志贺氏菌属(Shigella)血清型的O-抗原多糖的不同生物缀合物。培养此类宿主细胞将在宿主细胞的周质内产生包含载体蛋白的生物缀合物，由rfb基因座编码的O-抗原多糖共价附接到该载体蛋白。在此类宿主细胞中产生生物缀合物的更详细描述可以例如在WO 2009/104074、WO 2015/124769、WO 2017/035181或WO 2020/191082中找到。用于产生特异性大肠杆菌O-抗原的生物缀合物的PglB寡糖基转移酶的优化变体已经在WO 2020/191088中有所描述。本发明涉及鉴定和绝对定量从此类宿主细胞产生的生物缀合物的新型和改进的方法。用于产生生物缀合物的宿主细胞通常是细菌细胞，优选革兰氏阴性细菌细胞，并且在优选的实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。
特别有用的生物缀合物包括一种或多种多糖所附接的载体蛋白。此类生物缀合物例如用作某些疫苗的活性组分，其旨在诱导针对生物缀合物的多糖的功能性免疫反应。在本发明的实施方案中，所述生物缀合物包含一种载体蛋白和与所述载体蛋白共价结合的一种或多种多糖，优选与所述载体蛋白共价结合的1至4种多糖。
在本发明的实施方案中，生物缀合物是含有与载体蛋白共价结合的大肠杆菌O-抗原多糖的缀合产物。在本发明的实施方案中，生物缀合物是含有与载体蛋白共价结合的志贺氏菌属O-抗原多糖的缀合产物。
术语“O-抗原”在本领域中是已知的并且在其正常的上下文中使用，它不与O-连接的混淆。在典型的实施方案中，O-抗原多糖与载体蛋白N-连接。术语“O-抗原多糖”通常是指细菌诸如大肠杆菌的LPS内包含的重复聚糖聚合物。大肠杆菌的O-抗原是免疫原性重复寡糖(通常为1-40个重复单元，例如5-30个重复单元)的聚合物并且通常用于血清分型和糖缀合物疫苗产生。
载体蛋白：该术语在上面讨论。在本发明的具体实施方案中，载体蛋白是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的脱毒外毒素A(EPA；术语“铜绿假单胞菌的外毒素A和外蛋白A”或EPA可互换使用)。在此类实施方案中，EPA优选地包含1至10个、优选2至4个糖基化位点。
在一个具体实施方案中，EPA包含四个糖基化位点。在一个具体实施方案中，EPA包含具有SEQ ID NO 1、优选地具有SEQ ID NO 2的四个糖基化位点。参见例如WO 2015/124769、WO 2017/035181或WO 2020/191082对各种大肠杆菌O-抗原多糖与EPA载体蛋白的生物缀合以及EPA载体蛋白的代表性氨基酸序列的示例的描述。参见例如WO 2009/104074对志贺氏菌属O-抗原多糖与EPA载体蛋白的生物缀合的示例的描述。
对于EPA，各种脱毒蛋白变体已经在文献中进行了描述并且可以用作载体蛋白。例如，脱毒可以通过突变和缺失催化必需残基L552V和ΔE553来实现。
在一个非限制性优选实施方案中，根据本发明的生物缀合物的载体蛋白包含SEQID NO:3。
包含具有四个糖基化位点的EPA载体蛋白的糖缀合物，特别是生物缀合物可以以单糖基化、二糖基化、三糖基化或四糖基化形式存在。
多糖：术语“多糖”在本领域中是已知的并且特别描述了由通过糖苷键结合在一起的单糖单元构成的聚合碳水化合物，所述聚合碳水化合物是直链的或支链的。此类多糖的特征在于它们的重复单元，每个重复单元用它们各自的单糖组成来描述。所述重复单元包括一种或多种单糖，所述单糖也可以被化学修饰(例如，胺化、酰胺化、磺化、乙酰化、磷酸化等)。通常在所述重复单元中发现的单糖是含有三至七个碳原子的环状或直链单糖。在糖缀合物疫苗的特定情况下，缀合的多糖源自具有由特定病原体的遗传学定义的所述重复单元的病原物种(例如，大肠杆菌)。因此，重复单元可以是病原体的特异性标记物/标识物。
因此，术语“多糖组分”表示糖缀合物的一个或多个聚糖链。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，但通常含有至少三种糖，并且可以是直链的或支链的。聚糖可包括天然糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等)和/或修饰的糖(例如，2'-氟核糖、2'-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6'-磺基N-乙酰基葡糖胺等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还涵盖糖缀合物(例如，糖蛋白、糖肽、糖脂)的聚糖组分。该术语还涵盖游离聚糖，包括已经从糖缀合物裂解或以其它方式释放的聚糖。
如本文所用的术语“O-乙酰化多糖”是指其中重复单元的一个或多个单糖通过乙酰化被化学修饰的多糖。所述单糖的一个或多个存在的羟基基团被乙酰化。对于在糖缀合物疫苗中使用的病原体衍生的重复单元，某些单糖的O-乙酰化对于诱导对所述病原体的免疫反应可能是必不可少的。病原体衍生的多糖组分的非限制性示例在表1中示出。
如本文所用的术语“血清型”是指具有衍生自不同细菌血清型的不同多糖链的糖缀合物。来自许多大肠杆菌血清型的聚糖的示例在下表1中鉴定。
在具体实施方案中，糖缀合物的PS组分对应于大肠杆菌(E.coli)的“O-抗原”的不同血清型。
“O-抗原”是细菌脂多糖(LPS)的一部分。LPS由脂质和PS组分组成，其中PS组分进一步分为核心结构和“O-抗原”。此外，每个O-抗原由n个重复单元构成，其中n是1-100，诸如1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、3-50、3-40，例如至少5、诸如5-40、5-30，例如7-30，例如7至25，例如10至20，例如5-20个重复单元。每个重复单元包含未修饰的和/或修饰的单糖。
非限制性实施方案中的术语“修饰的单糖”包括单糖的N-乙酰化、O-乙酰化、酰胺化和/或胺化。此类修饰的单糖可在同一单糖上包含一种或多种修饰，特别是上述修饰中的一种、两种或三种。
在具体实施方案中，修饰的单糖是O-乙酰化单糖和/或N-乙酰化单糖，特别是包含一个O-乙酰化或N-乙酰化的单糖。
在本发明的实施方案中，合适的重复单元包括选自由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、修饰的甘露糖、修饰的鼠李糖、修饰的葡萄糖、修饰的岩藻糖和修饰的半乳糖组成的组的单糖。
大肠杆菌O-抗原多糖的非限制性和示例性结构在下表1中示出。示出了每个大肠杆菌O-抗原多糖的单个重复单元。在该表中，每个n独立地是1至100的整数，诸如1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、3-50、3-40、5-30，例如至少5，诸如5-40，例如7-30，例如7至25，例如10至20，例如5-20，但在一些情况下可以是1-2。
表1：大肠杆菌O-抗原多糖的结构
Figure BDA0004216313550000091
Figure BDA0004216313550000101
各种血清型大肠杆菌在O-抗原的糖组成方面有所不同。然而，在同一血清型分类中，O-抗原在重复单元数量和乙酰化程度方面可能不同。
样品：术语“样品”在本领域中是已知的。它包括任选地在稀释后可提供给分析系统的任何材料。如本文所用，术语“测试样品”涉及待分析的样品。测试样品包含至少一种糖缀合物，优选生物缀合物，以及其它组分，通常为至少四种糖缀合物、优选生物缀合物和一种或多种其它组分的混合物。此类样品特别包括(i)糖缀合物的生产批次(包括过程中批次和释放/储存的生产批次)；(ii)包含多种糖缀合物的组合物，诸如包含多价疫苗的药物组合物。
除了糖缀合物之外，合适的测试样品还包含(i)水性基质；(ii)任选的未与载体蛋白结合的多糖(本文：“游离PS”)；(iii)任选的非相关蛋白；(iv)任选的不含多糖的载体蛋白。水性基质(i)可含有以下中的一种或多种：缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂)、无机盐(例如，NaCl)、糖醇(例如，D-山梨糖醇)、非离子表面活性剂(例如，聚山梨酸酯80)。非相关蛋白(iii)可包括至多10％的过程相关杂质(例如，宿主细胞蛋白)。在一个实施方案中，测试样品包含至少4种且至多20种糖缀合物，例如至少4种且至多12种糖缀合物，例如4、5、6、7、8、9、10、11或12种糖缀合物。在某些实施方案中，测试样品包含4、9或10种糖缀合物。
术语“校准样品”涉及包含已知浓度的待分析的糖缀合物的样品。因此，一组校准样品涉及多种具有分级浓度的糖缀合物的校准样品。该一组校准样品的浓度范围还涵盖测试样品内糖缀合物的预期浓度。这样的一组校准样品适于建立用于绝对定量测试样品内的糖缀合物的校准曲线。
术语“对照样品”涉及包含已知浓度的待分析的糖缀合物的样品，以验证基于毛细管的免疫测定系统是否适合进行预期分析。此类对照样品也被称为系统适合性对照(SSC)。此类对照样品可包含另外的组分，诸如合适的缓冲剂(例如，与测试样品相同的缓冲剂)，但仅包含一种糖缀合物，因此通常不同于测试样品。通常，对照样品中糖缀合物的浓度高于测试样品中糖缀合物的浓度。
术语“阶梯样品”或简称为“阶梯”涉及包含尺寸标准的样品。此类尺寸标准是已知的并且通常包括已知分子量的蛋白质或修饰蛋白质的混合物。合适的阶梯样品包含分子量跨越范围为66kDa至440kDa的生物素化蛋白质的混合物。
基于毛细管的免疫测定：术语“免疫测定”通常是指其中抗体用于鉴定和/或定量样品内的特定组分的分析方法。在毛细管中进行测定的情况下，该方法被称为基于毛细管的免疫测定。详细信息可例如从Moser等人，Electrophoresis 2008,29(16):3279-3295(其以引用方式并入)获得。另选地，可用适配体代替抗体检测。在本发明的范围内，基于毛细管的免疫测定是指自动的、基于毛细管的蛋白质印迹。用于进行此类基于毛细管的蛋白质印迹的系统在本领域中是已知的并且可商购获得。一个具体示例是来自Bio-Techne的WesTM系统，参见https://www.proteinsimple.com/wes.html(2020年9月7日访问)。该系统已经用于分析几种糖缀合物[例如，Rustandi等人，Applications of an Automated andQuantitative CE-Based Size and Charge Western Blot for Therapeutic Proteinsand Vaccines.Tran N.,Taver-na M.(编辑)Capillary Electrophoresis of Proteinsand Peptides.Methods in Molecular Biology，第1466卷]。然而，目前可用的方法不适于实现本发明的目的，本发明的目的是糖缀合物，特别是生物缀合物(包括导致产生包含未完全分辨的峰的宽信号的那些)的鉴定和绝对定量。如上所述，这种糖缀合物的示例是包含具有四个糖基化位点的EPA载体蛋白和对应于如权利要求5(ii)中所列的大肠杆菌O-抗原的PS组分的糖缀合物。
糖缀合物的鉴定和/或绝对定量：如上所述，分析包括糖缀合物，特别是生物缀合物的鉴定和绝对定量。原则上，糖缀合物的鉴定和定量都可以与作为一个整体的糖缀合物或所述糖缀合物的各个组分(即，载体蛋白和/或PS组分)有关。决定性方面是应用于检测糖缀合物的一抗的选择(例如，一抗可识别PS组分或载体蛋白)。然后，一抗的恒定区(Fc)可以被能够产生可检测信号的二抗识别，该可检测信号可以用于基于校准曲线对糖缀合物进行绝对定量。
在本发明的上下文中，特别是PS组分的鉴定和绝对定量是相关的。因此，使用与糖缀合物的PS组分特异性结合的一抗。因此，在一个优选实施方案中，糖缀合物的鉴定和绝对定量是指糖缀合物的PS组分的鉴定和绝对定量。
因此，如在以下步骤(a1)中提及的糖缀合物的浓度是指PS组分的浓度。例如，0.100μg mL-1的糖缀合物浓度是指PS组分的0.100μg mL-1的浓度，与样品内载体蛋白的量无关(如上所述，一种或多种多糖与载体蛋白共价结合)。然而，关于载体蛋白鉴定和绝对定量糖缀合物也是可能的。在这种情况下，可以使用与所述载体蛋白特异性结合的一抗。
在整个本说明书中使用了许多缩写，包括：
E.coli 大肠杆菌
EPA 铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A
Fc 抗体的恒定区
HRP 辣根过氧化物酶
LPS 脂多糖
PS 多糖
SSC 系统适合性对照
上述缩写在本领域中是常见的。
本发明涉及一种用于分析测试样品中的糖缀合物的方法，所述测试样品包含至少4种糖缀合物的混合物，其中所述分析包括所述糖缀合物的鉴定和所述糖缀合物的定量两者。本发明方法包括以下步骤：
(a)提供所述测试样品和用于建立校准曲线的一组校准样品，任选的阶梯样品以及任选的对照样品；
(b)借助于基于毛细管的免疫测定系统在各个毛细管中测量：所述测试样品、所述校准样品、任选的所述阶梯样品和任选的所述对照样品，从而产生每个毛细管的数据集；以及
(c)借助于计算机程序分析所述数据集，所述计算机程序至少提供以下功能：
●接收积分限制；以及
●计算每个毛细管的背景信号；以及
●从在每个毛细管中产生的信号中减去背景信号。
更准确地说，术语“鉴定”是指基于所述糖缀合物的PS组分来鉴定糖缀合物，并且术语“定量”是指基于校准曲线来绝对定量所述糖缀合物。
如本文所用的术语“接收限制”是指“接收分子量范围限制”，即对信号进行积分的分子量范围的接收限制。如上所述，此类积分限制可例如跨越100kDa-500kDa(例如，积分限制为100kDa至500kDa)、通常200kDa-400kDa的分子量范围。将在下面首先参考合适的样品随后参考各个方法步骤更详细地解释该方法：
测试样品：在本发明的上下文中可使用范围广泛的样品。可定量的糖缀合物还包括导致产生包含未完全分辨的峰的宽信号并且因此不可通过目前可用的基于毛细管的免疫测定方法来量化的糖缀合物。此类宽信号可例如跨越50kDa-600kDa、优选100kDa-500kDa、通常200kDa-400kDa的分子量范围。此类宽信号的示例在图1-图3中示出。例如，图1中所示的信号跨越大约370kDa的分子量范围，即信号在大约80kDa处开始并在大约450kDa处结束。在这种情况下，WESTM系统中包括的Compass软件无法可靠地对整个信号面积进行积分。此类分析方法还可应用于紧密相关的糖缀合物(即仅在多糖组分方面不同的糖缀合物，特别是生物缀合物)的混合物。
在一个实施方案中，糖缀合物包含一种载体蛋白和与所述载体蛋白共价结合的一种或多种多糖，优选地，其中所述载体蛋白是具有四个糖基化位点的铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A(EPA)。
在一个实施方案中，糖缀合物包含一种载体蛋白和与所述载体蛋白共价结合的一种或多种多糖，其中所述多糖是大肠杆菌O-抗原，优选地选自由O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B或O75抗原组成的组。
在一个实施方案中，糖缀合物包含一种载体蛋白和与所述载体蛋白共价结合的一种或多种多糖，其中所述糖缀合物通过在大肠杆菌中使用寡糖基转移酶(诸如PglB)将PS组分酶促缀合到载体蛋白而产生。由此，糖缀合物被称为“生物缀合物”，并且在该实施方案中与其中载体蛋白和PS组分化学偶联的糖缀合物不同。
在某些实施方案中，所述多糖包含1-100个、优选3-30个、更优选5-20个重复单元。所述重复单元包含未修饰的单糖和/或修饰的单糖。具体地，修饰的单糖是O-乙酰化单糖和/或N-乙酰化单糖，例如包含一个O-乙酰化或N-乙酰化的单糖。
测试样品可包含并且通常确实包含另外的组分。在一个实施方案中，测试样品还包含水性基质，该水性基质任选地包括缓冲剂、无机盐、糖醇和/或非离子表面活性剂中的一种或多种。任选地，样品还包含未与载体蛋白结合的多糖(“游离PS”)。任选地，样品还包含非相关蛋白，例如宿主细胞蛋白。任选地，样品还包含不含多糖的载体蛋白。
在某些实施方案中，测试样品包含多种不同的糖缀合物，优选4-20种，例如4-10种糖缀合物。在一个特定实施方案中，样品包含4、9或10种糖缀合物，所述糖缀合物在上面所列的大肠杆菌多糖组分方面不同。
在一个优选的实施方案中，测试样品是适于直接用于有需要的受试者的多价疫苗组合物。
鉴于以上内容，本发明方法还允许借助于本文所述的基于毛细管的免疫测定方法来鉴定和/或定量所述糖缀合物的单糖基化变体、二糖基化变体、三糖基化变体或四糖基化变体以及它们的混合物。因此，本发明还提供了一种方法，其中所述分析包括鉴定所述糖缀合物的单糖基化变体、二糖基化变体、三糖基化变体和/或四糖基化变体以及它们的混合物以及/或者定量所述糖缀合物的单糖基化变体、二糖基化变体、三糖基化变体和/或四糖基化变体以及它们的混合物。
如上所述，术语“鉴定”更准确地是指基于所述糖缀合物的PS组分来鉴定糖缀合物，并且术语“定量”更准确地是指基于校准曲线来绝对定量所述糖缀合物的单糖基化变体、二糖基化变体、三糖基化变体和/或四糖基化变体。
步骤a：向分析装置提供样品本身是已知的。测试样品中糖缀合物的浓度可在宽范围内变化，如果需要，在下面概述的步骤(a1)中对其进行调整。在一个优选的实施方案中，步骤(a)还包括以下步骤(a1)、(a2)和/或(a3)中的一个或多个，优选地按所指示的顺序：
在一个实施方案中，这包括(a1)将糖缀合物的浓度调节至0.01μg mL-1-0.50μgmL-1的预期浓度。如上所述，糖缀合物的浓度与糖缀合物的PS组分的浓度有关。技术人员将清楚该步骤是任选的，例如，如果已经预期糖缀合物的浓度在该范围内，则不需要该步骤。
在一个实施方案中，这包括(a2)向样品中添加一种或多种辅助试剂，所述辅助试剂选自样品缓冲剂、二硫桥还原剂(诸如二硫苏糖醇)和一种或多种标记物(诸如具有已知分子量的荧光蛋白标记物)。所述标记物可以用作每个毛细管内的分子量参考并且用于说明各个毛细管之间的电泳迁移差异。
在一个实施方案中，这包括(a3)应用加热程序并由此使样品变性。合适的加热程序的示例是将相应的样品在95℃下加热5分钟。
步骤b：借助于基于毛细管的免疫测定方法测量样品本身是已知的。在一个优选的实施方案中，步骤(b)还包括以下步骤(b1)至(b7)中的一个或多个，优选地按所指示的顺序：
在一个实施方案中，这包括(b1)将分析基质加载到所述免疫测定系统的毛细管中；优选地，分析基质是尺寸排阻基质；优选地，所述尺寸排阻基质包含至少两种具有不同孔径的基质组分(堆叠和分离基质)。
在一个优选的实施方案中，基于大小/分子量分离糖缀合物。因此，在一个优选的实施方案中，借助于免疫测定系统进行糖缀合物的鉴定和绝对定量是指借助于基于大小/基于分子量的免疫测定系统进行糖缀合物的鉴定和绝对定量。基于大小/分子量进行糖缀合物的分析不同于基于它们的等电点进行糖缀合物的分析(例如，等电聚焦免疫测定)。
在一个实施方案中，这包括(b2)将测试样品、校准样品、任选的阶梯样品和任选的对照样品加载到所述免疫测定系统的毛细管中。
在一个实施方案中，这包括(b3)优选地根据每个组分的分子量分离所述样品的组分。该分离是在所述免疫测定系统的毛细管中的分析基质中进行的。
在一个实施方案中，这包括(b4)例如通过光化学交联固定所述样品的组分。
在一个实施方案中，这包括(b5)施用与所述糖缀合物结合的聚糖特异性一抗。聚糖特异性抗体与糖缀合物的PS部分结合，并且对给定的PS结构是特异性的。它们本身是已知的并且可以从商业来源获得或通过已知的标准技术制备。它们可以是单克隆或多克隆抗体。
在一个实施方案中，这包括(b6)施用与一抗结合并且产生可检测信号的二抗。二抗可例如与一抗的恒定区(Fc)结合。产生所述可检测信号(步骤b6)的多种可能性是本领域技术人员公知的。例如，所述信号可以通过在步骤(b6)中施用与能够催化化学发光反应、化学荧光反应或者产生有色或荧光产物的化学反应的酶共价连接的二抗而产生。此类酶的示例是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
然而，本领域技术人员清楚的是，可检测信号也可以通过其它方式产生。例如，所述二抗(步骤b6)可以与荧光染料(诸如Alexa Fluor、Alexa Fluor Plus、IRDye、异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy3、Cy5、别藻蓝蛋白(APC)、四甲基罗丹明、DyLight、Texas Red、TexasRed-X、藻红蛋白(R-PE)、Qdot、3-羧基-6,8-二氟-7-羟基香豆素或太平洋橙染料)连接。
另一种可能性是在步骤(b5)中施用与生物素连接的一抗。在这种情况下，可检测信号可通过在步骤(b6)中施用与HRP连接的链霉亲和素蛋白而不是施用二抗来产生。如上所述，在步骤(b7)中，施用HRP的底物。
另一种可能性是在步骤(b6)中施用与金纳米颗粒连接的二抗。
在一个实施方案中，这包括(b7)，在二抗与酶连接的情况下，施用所述酶的底物。在一个优选的实施方案中，所述二抗与酶辣根过氧化物酶(HRP)连接。可检测信号通过在步骤(b7)中施用底物而产生。在一个优选的实施方案中，底物是鲁米诺/过氧化物混合物。
步骤c：通过计算机程序进行数据分析是已知的。然而，如上所述并且如图1、图3和表3-5所示，目前的标准数据分析方法是不充分的并且不允许可靠的定量。
通过遵循上述方案，解决了这一缺点。在一个优选的实施方案中，步骤c)还包括以下步骤中的一个或多个，优选地按所指示的顺序：
(c1)接收在步骤b)中产生的每个毛细管的所述数据集；
(c2)鉴定每个毛细管的背景；
(c3)从相应毛细管的测量信号中减去各个背景信号；
(c4)通过在血清型特异性和可手动调节积分范围内对背景校正信号进行积分来获得每个毛细管的曲线下面积；
(c5)通过将非线性回归应用于由具有已知浓度的校准样品产生的信号并由此绘制每个信号的计算的曲线下面积与相应校准样品的浓度的关系图来建立校准曲线；
(c6)通过将所测量的曲线下面积与所述校准曲线进行比较来计算所述测试样品内所述糖缀合物的浓度；
(c7)通过与预定义的接受标准进行自动比较来评价计算浓度的有效性。
在步骤(c1)中，由计算机接收在步骤(b)中产生的数据集。
在步骤(c2)中，通过应用从在积分范围开始之前针对每个毛细管测量的信号到在积分范围结束之后测量的信号的线性回归来鉴定每个毛细管的背景。
通常，技术人员将期望鉴定多个毛细管上的平均背景信号或来自一个参考毛细管的参考背景信号并且从每个毛细管减去所述参考或平均背景信号是足够的。然而，人们惊奇地发现，当针对每个毛细管鉴定各个背景信号时，提高了结果的准确性。不希望受理论束缚，这可能是由于在一个毛细管中产生的可检测信号与在相邻毛细管中产生的信号的干扰。
该步骤如下更详细地解释：
在第一步骤中，设置信号积分的极限，从而定义积分范围。
在第二步骤中，计算在积分范围开始之前在第一可调节分子量窗口内测量的至少3个数据点、优选所有数据点的平均值(平均数据点P1)，以及在积分范围结束之后在第二可调节分子量窗口(用于计算背景信号的范围)内测量的至少3个数据点、优选所有数据点的平均值(平均数据点P2)。
分子量窗口：
可以单独选择第一窗口和第二窗口的开始和宽度。作为一个示例，第一窗口可跨越从X1＝“作为积分范围的一部分的最低X轴值”到X2＝X1-“第一可调节分子量窗口的宽度[kDa]”的范围。第二窗口可跨越从X3＝“作为积分范围的一部分的最高X轴值”到X4＝X3+“第二可调节分子量窗口的宽度[kDa]”的范围。
可调节分子量窗口的合适宽度为10kDa。然而，也可将分子量窗口的宽度调节为偏离10kDa的预定值，例如8kDa或13kDa，只要第一窗口和第二窗口各自包含至少3个数据点即可。
数据点：
在一个实施方案中，相应的平均数据点P1和P2由相应的第一分子量窗口或第二分子量窗口内的至少3个数据点的信号强度(y轴)的平均值和这些数据点处的分子量(X轴)的平均值组成。
在另一个实施方案中，相应的平均数据点P1和P2分别由相应的第一分子量窗口或第二分子量窗口内的至少3个数据点的信号强度(y轴)和积分范围开始或结束时的分子量的平均值组成。
在第三步骤中，在上面计算的平均数据点P1与P2之间进行线性回归。
在步骤(c3)中，从每个特定单独分子量处的相应总信号中减去每个特定分子量处的背景信号(其可从上面计算的线性回归线获得)，即每个分子量处在毛细管内检测到的信号与相应分子量处的背景信号之间的差异。
在步骤(c4)中，在(c2)第一步骤中设置的积分限制之间积分背景校正信号。所述积分得到每种分析物的曲线下面积。WesTM系统中包括的Compass软件不提供接收积分限制以及在这些限制内可靠地对整个信号面积进行积分的选项。人们惊奇地发现，在如本文所述的糖缀合物，特别是生物缀合物的情况下，WesTM系统中包括的Compass软件无法提供整个信号面积的可靠积分(参见图1、图3和表3-5)。
在步骤(c5)中，通过将非线性回归应用于由步骤b)中的校准样品产生的信号来建立校准曲线。校准曲线包括取决于相应校准样品的浓度的每个信号的计算的曲线下面积。优选地，应用具有二次效应的双对数回归模型具体地根据以下公式建立校准曲线：ln(面积)＝A ln(浓度)^2+B ln(浓度)+C。
WesTM系统中包括的Compass软件不提供基于这种模型建立校准曲线的选项，而是使用线性回归模型或四参数逻辑(4PL)曲线模型。然而，人们惊奇地发现，基于具有二次效应的双对数回归模型建立校准曲线提高了结果的准确性。
在步骤(c6)中，通过将针对测试样品测量的曲线下面积与校准曲线进行比较来计算测试样品内糖缀合物的浓度。
在步骤(c7)中，通过与预定义的接受标准进行自动比较来评价计算浓度的有效性。预定义的接受标准的示例是：
●校准曲线的确定系数(R2)，例如R2≥0.85，诸如R2≥0.90
●校准样品的变异系数，例如CV≤30％，诸如CV≤25％
●测试样品内糖缀合物的变异系数，例如CV≤25％，诸如CV≤20％
●测试样品内对照样品的变异系数，例如CV≤25％，诸如CV≤20％
●针对对照样品计算的浓度与对照样品的已知浓度的相对差异，例如
([计算浓度]–[已知浓度])/[已知浓度]≤35％
因此，通过数据分析中两个特征的组合解决了上述缺点：
第一个特征是计算每个毛细管的背景信号并从由该毛细管内的糖缀合物产生的信号中减去所述背景信号。背景信号在毛细管之间变化，因此降低了定量的再现性，除非在每个毛细管中考虑。
第二个特征是接收信号积分的极限的可能性。这些极限通常由用户设置。由此计算的浓度自动与预定义的接受标准进行比较。这允许评价测试样品是否符合预定义的接受标准。
本发明的以下实施例旨在进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。
实施例1：根据本发明方法分析O-EPA生物缀合物
I.参考材料的制备
大量糖蛋白样品直接从生产批次中获取，并对其进行等分并适当储存(例如，-80℃)。对所述糖蛋白样品的解冻等分试样进行不同的表征步骤。
所使用的测试样品是包含10种不同糖缀合物(各自是生物缀合物，包含十种不同生物缀合物的组合物在例如WO 2020/191082中描述)的糖缀合物疫苗，每种糖缀合物包含具有四个糖基化位点的EPA载体蛋白，该载体蛋白与对应于血清型O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B或O75的大肠杆菌O-抗原中的一种的PS组分共价连接。由于存在4个糖化位点，糖缀合物中的每一种作为同一血清型的单糖基化变体、二糖基化变体、三糖基化变体或四糖基化变体或它们的混合物存在。以下实施例涉及包含对应于大肠杆菌血清型O4的PS组分的O-EPA糖缀合物的鉴定和绝对定量，该糖缀合物存在于上述10种不同O-EPA生物缀合物的混合物中但同样适用于其它血清型(图1涉及大肠杆菌血清型O6，图2涉及大肠杆菌血清型O4，图3涉及大肠杆菌血清型O25B；表2、表4和表5示出了包含对应于不同大肠杆菌血清型的九种或十种糖缀合物的糖缀合物疫苗组合物的结果)。
1)参考材料的正确身份的确定。使用特异性抗体遵循标准蛋白质印迹方案，已经选择该特异性抗体并测试其对感兴趣的糖缀合物的多糖链的特异性。任选地，使用针对载体蛋白的特异性抗体来确定载体蛋白的正确身份。
2)参考材料内的总多糖含量的确定。根据以下说明，将总酸水解成单糖，后续通过离子色谱和脉冲安培检测(IC-PAD)进行分析。
使用最终浓度为1.8M的三氟乙酸(TFA)在120℃下将参考材料的等分试样水解2小时。最佳水解条件(温度、TFA浓度和时间)可取决于多糖的起始浓度而不同。最佳条件必须证明能够从多糖链中定量释放所有单糖，而不会进一步降解针对于绝对定量的单糖分子。
水解后，将样品冷却至室温，然后使用SpeedVac在30℃下干燥过夜。将干燥样品完全重悬于H2O(MilliQ级)中并转移到HPLC小瓶中。使用可商购获得的单糖(在这种情况下为N-乙酰基葡糖胺；GlcNAc)制备一组校准标准物；如果用于定量的目标单糖在上述水解步骤期间经历修饰(例如，N-乙酰化葡糖胺被转化为葡糖胺)，则必须使用合适的单糖(例如，葡糖胺)，或者另选地，上述水解程序也必须在该一组校准标准物上进行。
然后，制备配备有脉冲安培检测器(PAD)和一次性聚四氟乙烯(PTFE)金电极的离子色谱系统(例如，Dionex ICS-5000)。Dionex Car-boPac PA1分析柱(4×250mm)与DionexCarboPac PA1保护柱(4×50mm)组合使用。用洗脱液A(用于样品洗脱的16mM NaOH)和洗脱液B(用于柱清洗的500mM NaOH)平衡系统。使用以下仪器方法/梯度曲线依次注入样品和该组校准标准物：
-0至24分钟，100％洗脱液A，流速为1mL/min(洗脱)
-25至32分钟，100％洗脱液B，流速为1mL/min(洗涤)
-33至60分钟，100％洗脱液A，流速为1mL/min(重新平衡)
取决于目标单糖，可能需要优化这些梯度。
使用测量的校准组的曲线下面积来获得校准曲线，然后对未知样品进行定量。任选地，也可以使用目标单糖的量来反向计算糖缀合物样品中重复单元/多糖的绝对量(以μg/mL为单位)。
II.基于毛细管的免疫测定系统上的分析
待分析(鉴定和绝对定量)的测试样品直接从糖缀合物疫苗的生产批次中获得。如上所述制备反映相同糖缀合物种类(即，相同PS组分(在这种情况下为大肠杆菌O4抗原多糖)和相同载体蛋白(在这种情况下为具有SEQ ID NO:3的脱毒EPA))的参考材料。如上所述，测试样品另外包含对应于大肠杆菌血清型O1A、O2、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75的九种另外的O-EPA生物缀合物。
在配备有软件“Compass for SW第3.1.7版”的WESTM系统(Bio-Techne)上进行测量。
1.测试样品、校准样品和对照样品的浓度的调节
使用由Bio-Techne(目录号042-195)提供的0.1x样品缓冲剂(SB)将存在于测试样品、校准样品和对照样品内的O4 O-EPA生物缀合物的浓度稀释至相应的目标浓度。对于测试样品，根据在将各个糖缀合物组合成多价糖缀合物疫苗组合物之前针对各个糖缀合物的制造批次测量的浓度计算预期浓度。
对于包含与对应于血清型O4的大肠杆菌O-抗原的PS组分共价连接的具有四个糖基化位点的EPA载体蛋白(SEQ ID NO:3)的生物缀合物，进行以下稀释：
(i)根据具有不同PS浓度(0.200μg/mL、0.155μg/mL、0.110μg/mL和0.065μg/mL)的4个校准样品产生校准曲线。一式三份地制备每个校准样品；
(ii)将测试样品(即，糖缀合物疫苗批次)稀释至PS浓度(大肠杆菌O4多糖)为0.150μg/mL。一式四份地制备测试样品；
(iii)将对照样品(SSC)稀释至PS浓度为0.100δμg/mL。一式三份地制备对照样品。
校准样品和测试样品的最佳稀释度必须针对每种糖缀合物单独进行评价。发现上述稀释度对于O4 O-EPA生物缀合物的鉴定和绝对定量是最佳的。
2.荧光标记物和生物素化阶梯的制备
荧光标记物和生物素化阶梯从Bio-Techne获得(目录号PS-FL03-8)。在每个毛细管中包括两种荧光标记物，并将其用于解释各个毛细管之间的电泳迁移差异。荧光标记物在57kDa和280kDa处迁移。生物素化阶梯包含多种已知分子量的蛋白质，并在单独的毛细管中进行分析。阶梯用作待分析的糖缀合物的大小参考。生物素化阶梯内蛋白质的分子量跨越66kDa至440kDa的范围。根据制造商的说明书制备荧光标记物和生物素化阶梯：
(i)将荧光标记物重悬于补充有400mM DTT的10X样品缓冲剂(目录号042-195)中，以产生5X荧光主混合物；
(ii)将生物素化阶梯重悬于去离子水中。
3.用于加载到基于毛细管的免疫测定系统的测定板上的测试样品、校准样品和对 照样品的制备
(i)将4.8μL的稀释测试样品、校准样品和对照样品中的每一种各自与1.2μL的5X荧光主混合物混合；
(ii)将混合物在95℃下孵育5分钟；
(iii)通过在冰上孵育5分钟将混合物冷却；
(iv)将混合物短暂涡旋、离心，并将5μL加载到测定板的单独隔室中。该测定板的一个隔室已经用分离基质3、堆叠基质2、分流运行缓冲剂3和基质去除缓冲剂(Bio-Techne，目录号SM-W006)预填充。该隔室已被供应商密封。
4.用于加载到测定板上的抗体和底物的制备
(i)在抗体稀释剂2(Bio-Techne，目录号042-203)中稀释对O4-EPA糖缀合物(大肠杆菌O-抗原，血清型O4)的PS组分具有特异性的第一大鼠单克隆抗体以达到0.05mg/mL的最终浓度；
(ii)在抗体稀释剂2中以1:100的比率稀释第二抗大鼠HRP抗体(Biolegend,，目录号405405)；
(iii)通过混合在检测模块(Bio-Techne，目录号DM-003)中提供的15μL Luminol-S试剂和15μL过氧化物试剂来制备毛细管#1的底物；
(iv)通过混合在ClarityTMWestern ECL底物试剂盒(BioRad，目录号170-5060)中提供的220μL Luminol/增强剂试剂和220μL过氧化物试剂来制备毛细管#2-25的底物；
(v)将抗体(每孔10μL)和底物(每孔15μL)加载到在步骤3(iv)中制备的测定板的单独隔室中；
(vi)根据制造商的说明书将洗涤缓冲剂(Bio-Techne，目录号042-202)添加到测定板的单独隔室中(每隔室500μL)；
(vii)将测定板盖上盖子并在室温下以1100×g离心5分钟，以确保液体位于所有孔的底部。
5.将测定板加载到WESTM系统上并开始测量
在该步骤中，将在步骤4(vii)之后获得的测定板加载到WESTM设备(Bio-Techne)上以开始分析：
(i)开启毛细管蛋白质系统及其相关计算机。在仪器的光信号停止脉冲之后，系统准备好使用，并且启动随WESTM系统提供的Compass软件；
(ii)在Compass软件中打开“新运行”窗口，并选择以下参数：“大小”作为测定类型，“66-440kDa”作为大小范围，“25”作为卡盒；
(iii)将毛细管卡盒(Bio-Techne，目录号SM-W006)插入适当的保持器中，并且内部光从橙色变为蓝色，表明卡盒被适当地插入；
(iv)在移除测定板盖子后，通过将蒸发密封件牢固地保持在工作台上来小心地将其从板上剥离；如果分离基质孔中存在气泡，则可以使用干净的针(在这种情况下不是必需的)来去除此类气泡；
(v)将预填充的测定板放置在板保持器上，关闭仪器门并从Compass软件开始测定运行。
6.数据分析
(i)在Compass软件中，验证荧光标记物(57kDa和280kDa)的正确位置：如果对应于荧光标记物的信号被软件错误分配，则可以通过选择“Not a standard”或“ForceStandard”(在这种情况下不是必需的)来将信号的位置分别校正为57kDa和280kDa；
(ii)通过选择以下项来从Compass软件输出数据集：File→ExportSpectra→TextFormat(在保存运行的同一文件夹中自动创建含有光谱的新文件夹)；
(iii)将数据集合(Sample Plots Raw.txt)输入本发明方法的计算机程序中以分析数据；
(iv)输入样品ID、血清型、所用仪器和分析日期；
(v)输入积分范围(100kDa-480kDa)和相对基线评价范围(分子量窗口：10kDa；90kDa-100kDa和480kDa-490kDa)；
(vi)通过将具有二次效应的双对数回归模型应用于由校准样品产生的信号根据以下公式建立校准曲线：ln(面积)＝A ln(浓度)^2+Bln(浓度)+C。校准曲线包括取决于相应校准样品的浓度的每个信号的计算的曲线下面积。通过将针对测试样品测量的曲线下面积与校准曲线进行比较来计算测试样品内糖缀合物的浓度。该比较是通过对上述校准曲线所依据的回归函数进行反演来进行的。上述回归函数的所述反演产生2个结果。选择最可能的结果，即更接近测试样品内糖缀合物的预期含量的结果。
步骤(v)：由计算机程序计算毛细管特异性背景信号，并从在该毛细管内测量的总信号中减去该背景信号。
与上述类似，使用相应的抗体测定糖缀合物疫苗内存在的其它九种生物缀合物的浓度(每种生物缀合物包含与血清型O1A、O2、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B或O75的大肠杆菌O-抗原多糖中的一种共价连接的具有SEQ ID NO:3的脱毒EPA)。
该具体实施例的结果如下(考虑步骤II,3中的稀释)：
表2：使用本发明方法分析包含十种不同O-EPA生物缀合物(大肠杆菌O-多糖)的糖 缀合物疫苗组合物的结果
大肠杆菌血清型 测量的PS含量[μg/ml] 目标PS含量[μg/ml]
O1A 8.22 8
O2 7.61 8
O4 6.49 8
O6A 8.59 8
O8 6.40 8
O15 8.23 8
O16 8.36 8
O18A 6.28 8
O25B 15.87 16
O75 7.38 8
实施例2：根据现有技术和本发明方法对比分析O25B O-EPA生物缀合物
根据现有技术(具有Compass软件的WesTM)和本发明方法对两批包含9种不同生物缀合物的糖缀合物疫苗组合物的O25B O-EPA生物缀合物浓度(每种生物缀合物包含与血清型O1A、O2、O4、O6A、O15、O16、O18A、O25B和O75的大肠杆菌O-抗原多糖中的一种共价连接的具有SEQ ID NO:3的脱毒EPA)进行分析。
基于4个O25B糖缀合物校准样品(0.080μg/mL、0.063μg/mL、0.045μg/mL、0.028μg/mL；基于PS组分的浓度)根据上述程序(在WesTM系统的不同毛细管中进行平行分析；如发现对于O25B O-EPA生物缀合物是最佳的稀释度)建立校准曲线。在独立制备的三次重复中测量上述校准样品中的每一个(重复在表3中表示为a-c)。使用可商购获得的Compass软件(现有技术)和本文所述的计算机程序(本发明方法)两者来分析每个样品的整个信号面积。在下表3中示出了根据两种方法所得的AUC和基于一式三份测量的变异系数(CV)。对应于一式三份0.063μg/ml O25B O-EPA校准样品的电泳图在图3中示出(A-C：经由Compass软件进行积分；D-F：经由如本文所述的计算机程序进行积分)。
从图3和表3中都可以看出：
(i)由于整个信号面积的不完全积分，根据现有技术方法的AUC低于根据本发明方法的AUC；以及
(ii)根据现有技术的分析精度较低(CV较高)；各个测量的偏差较高，包括偶尔无法对信号进行积分(再现性较低)。
表3：根据现有技术和本发明方法分析的O25B O-EPA生物缀合物校准样品
Figure BDA0004216313550000261
基于表3中所示的结果根据以下模型建立标准曲线：
a)在Compass软件中提供的线性模型(另选地，在Compass软件中提供的是“四参数逻辑模型”，但不适于数据集)；或者
b)根据以下公式的具有二次效应的双对数回归模型：ln(面积)＝A ln(浓度)^2+Bln(浓度)+C(本发明方法)。
然后，在如上所述的WesTM系统上一式四份地测量两批上述包含9种不同生物缀合物的糖缀合物疫苗组合物(每种生物缀合物包含与血清型O1A、O2、O4、O6A、O15、O16、O18A、O25B和O75的大肠杆菌O-抗原多糖中的一种共价连接的具有SEQ ID NO:3的脱毒EPA)(重复在表4中表示为a-d)。基于大肠杆菌O25B PS组分，将测试样品稀释至0.063μg/ml的O25B O-EPA目标浓度。使用Compass软件(现有技术)或使用本文所述的计算机程序进行整体信号积分。
然后，基于以下项进行存在于上述9价糖缀合物疫苗组合物中的O25BO-EPA生物缀合物的绝对定量：
a)使用Compass软件(现有技术)获得的上述校准曲线；或者
b)使用本文所述的计算机程序(本发明方法)获得的上述校准曲线。
与上述类似，平行测量(单独的毛细管)O25B O-EPA生物缀合物对照样品(系统适合性对照；SSC)并根据现有技术方法或本发明方法进行分析。
结果(考虑稀释)在表4中示出。
表4：根据现有技术和本发明方法分析的存在于9价糖缀合物疫苗组合物中的O25B O-EPA生物缀合物(大肠杆菌血清型O1A、O2、O4、O6A、O15、O16、O18A、O25B和O75)
Figure BDA0004216313550000271
Figure BDA0004216313550000281
从表4中可以看出，现有技术的方法(Compass软件)无法提供两批糖缀合物疫苗组合物和对照样品的O25B O-EPA生物缀合物的可靠绝对定量，而本发明方法提供了关于两批测试样品和关于对照样品的准确数据。
与上述类似，还根据现有技术(Compass软件)和本发明方法分析了存在于批次1的上述9价糖缀合物疫苗组合物内的其它O-EPA生物缀合物。结果(独立三次重复的平均值)在下表5中示出。
表5：使用本发明方法或根据现有技术分析包含九种不同O-EPA生物缀合物(大肠 杆菌O-多糖)的糖缀合物疫苗组合物的对比结果
Figure BDA0004216313550000282
虽然根据现有技术的分析可提供关于存在于9价糖缀合物组合物中的一些O-EPA生物缀合物的准确数据，但是现有技术的方法无法提供关于其它生物缀合物(例如，O6A、O18A和O25B O-EPA生物缀合物)的可靠绝对定量。在一些情况(O18A和O25B O-EPA生物缀合物)下，Compass软件实际上完全无法提供有意义的数据。
然而，本发明方法提供了对所有生物缀合物(包括特别具有挑战性的O18A和O25BO-EPA生物缀合物)的可靠绝对定量。
通过在PS特异性抗体与每种生物缀合物结合时产生可检测信号成功地实现了生物缀合物的鉴定。
序列的描述：
SEQ ID NO:1(糖基化共有序列)
Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸
SEQ ID NO:2(优化的糖基化共有序列)
Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何氨基酸
SEQ ID NO:3(包括4个N-连接的糖基化共有序列的EPA载体蛋白)
GSGGGDQNATGSGGGKLAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKDNNNSTPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLEAFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCPVAKDQNRTKGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRWSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRVTILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLKLGSGGGDQNAT

Claims (13)

1.一种用于分析测试样品中的糖缀合物的方法，所述测试样品包含至少4种糖缀合物的混合物，
其中所述分析包括：
●鉴定所述糖缀合物，以及
●基于校准曲线绝对定量所述糖缀合物；
其中所述方法包括以下步骤：
(a)提供所述测试样品和一组校准样品、任选的阶梯样品和任选的对照样品；
(b)借助于基于毛细管的免疫测定系统在各个毛细管中测量：所述测试样品、所述校准样品、任选的所述阶梯样品和任选的所述对照样品，从而产生每个毛细管的数据集；以及
(c)借助于计算机程序分析所述数据集，所述计算机程序至少提供以下功能：
●接收积分限制；以及
●计算每个毛细管的背景信号；以及
●从在每个毛细管中产生的信号中减去背景信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖缀合物的测量产生宽信号，特别是包含未完全分辨的峰的宽信号。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述糖缀合物是糖缀合物疫苗的组分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述糖缀合物是生物缀合物，特别是通过优选地在大肠杆菌中使用PglB寡糖基转移酶系统将多糖组分酶促缀合到载体蛋白而产生的生物缀合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述糖缀合物包含一种载体蛋白和与所述载体蛋白共价结合的一种或多种多糖，其中
(i)所述载体蛋白是铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A(EPA)，并且
(ii)所述多糖是选自由O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B或O75组成的组的大肠杆菌O-抗原。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多糖包含1-100个、优选3-30个、更优选5-20个重复单元，所述重复单元包含未修饰的单糖和/或修饰的单糖，所述修饰的单糖特别是O-乙酰化单糖和/或N-乙酰化单糖。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述测试样品还包含：
●水性基质，所述基质任选地包括缓冲剂、无机盐、糖醇和/或非离子表面活性剂中的一种或多种；
●任选的未与载体蛋白结合的多糖(“游离PS”)；
●任选的非相关蛋白。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述测试样品包含多种不同的糖缀合物，优选4-20种糖缀合物，优选4-10种糖缀合物，诸如4、9或10种糖缀合物，所述糖缀合物在权利要求5(ii)中所列的多糖组分方面不同。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述分析包括
●鉴定所述糖缀合物的单糖基化变体、二糖基化变体、三糖基化变体和/或四糖基化变体，以及/或者
●基于校准曲线来绝对定量所述糖缀合物的单糖基化变体、二糖基化变体、三糖基化变体和/或四糖基化变体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述步骤a)还包括以下步骤中的一个或多个，优选地按所指示的顺序：
(a1)将所述糖缀合物的浓度调节至0.01μg mL-1–0.50μgmL-1的预期浓度；
(a2)向所述样品中添加一种或多种辅助试剂，所述辅助试剂选自样品缓冲剂、二硫桥还原剂和一种或多种标记物；
(a3)使所述样品变性，优选地通过加热进行。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述步骤b)还包括以下步骤中的一个或多个，优选地按所指示的顺序：
(b1)将优选地包含尺寸排阻基质的分析基质加载到所述免疫测定系统的所述毛细管中；
(b2)将所述测试样品、校准样品、任选的阶梯样品和任选的对照样品加载到所述免疫测定系统的各个毛细管中；
(b3)分离所述样品的组分；
(b4)固定所述样品的组分；
(b5)施用与所述糖缀合物结合的聚糖特异性一抗；
(b6)施用与所述一抗结合并且产生可检测信号的二抗；
(b7)在所述二抗与酶连接的情况下，施用所述酶的底物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在步骤(b6)中，产生所述可检测信号是因为所述二抗与能够催化化学发光反应、化学荧光反应或者产生有色或荧光产物的化学反应的酶诸如辣根过氧化物酶共价连接。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中步骤c)还包括以下步骤中的一个或多个，优选地按所指示的顺序：
(c1)接收在步骤b)中产生的每个毛细管的所述数据集；
(c2)鉴定每个毛细管的背景；
(c3)从相应毛细管的测量信号中减去各个背景信号；
(c4)通过在多糖特异性和可调节积分范围内对背景校正信号进行积分来获得每个毛细管的曲线下面积；
(c5)通过将非线性回归、优选地通过将具有二次效应的双对数回归模型应用于由具有已知浓度的校准样品产生的信号并由此绘制每个信号的计算的曲线下面积与相应校准样品的浓度的关系图来建立校准曲线；
(c6)通过将所测量的曲线下面积与所述校准曲线进行比较来计算所述测试样品内所述糖缀合物的浓度；以及
(c7)通过与预定义的接受标准进行自动比较来评价计算浓度的有效性。
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