CN105296629A - 一种葱鳞葡萄孢菌的快速检测方法及应用 - Google Patents

一种葱鳞葡萄孢菌的快速检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明建立了一种针对葱鳞葡萄孢菌进行快速检测的特异性分子标记引物和检测方法，该方法通过PCR反应能特异性扩增出属于葱鳞葡萄孢菌的特征性产物，大小为301bp。本发明适用于从田间到采后的各个环节，能够实现对葱蒜类蔬菜的主要病害——葱鳞葡萄孢菌进行快速可靠的诊断和鉴定，为葱蒜类蔬菜的病害预警、防治，并为该类作物采后的安全贮运提供保障。本发明还提出了一种包含所述用于快速检测葱鳞葡萄孢菌的特异性分子标记引物的试剂盒，以及将所述检测方法用于葱鳞葡萄孢菌的鉴别或葱蒜类蔬菜作物的田间和采后灰霉病的诊断和预警中的应用。

Description

一种葱鳞葡萄孢菌的快速检测方法及应用
技术领域
本发明属于作物病害诊断及防治技术领域，具体涉及一种快速检测葱属类作物主要病原菌葱鳞葡萄孢菌(Botrytissquamosa)的快速检测方法及应用。
技术背景
葱蒜类蔬菜是具有特殊气味的一类作物，主要包括葱、大蒜、蒜薹、蒜苗、洋葱、韭菜等。富含糖分、维生素以及多种矿物质，并具有杀菌作用，在东西方饮食文化中都占据重要地位。然而葱蒜类蔬菜无论在田间栽培还是采后储运过程中，都容易受到病害的威胁，其中一种最主要的真菌性病原为葱鳞葡萄孢菌，其拉丁学名为：BotrytissquamosaWalker，该菌属半知菌亚门葡萄孢属，在葱蒜类蔬菜的主要种植产区如亚洲、欧洲、南美洲及北美洲造成重大的经济损失。以我国的特色蔬菜蒜薹为例，在采收以后由B.squamosa引起的灰霉病，每年可导致20-30％的损失。
B.squamosa主要侵染葱蒜类蔬菜的叶片。该菌的菌丝及分子孢子可随病残体越冬；或以菌核形态在土壤中越冬越夏，并随种苗调运传播，当遇有较低的温度和较高的湿度条件时即可发生和流行。该菌的分生孢子可在3-27℃范围内由菌核产生，而且一旦侵染寄主便会大量产生分生孢子，引发二次侵染，并迅速扩展。因此，快速、准确地检测和鉴定B.squamosa并有效控制其引起的病害，对降低葱蒜类蔬菜的经济损失至关重要。
传统的真菌鉴定方法主要通过形态学，如菌落、分生孢子等形态来鉴定。但形态学鉴定方法繁琐，耗时长，而且需要丰富的实践经验。随着分子生物学技术的迅速发展，分子标记成为鉴定真菌种类的主要技术手段。在各种分子标记技术中，基于RAPD结合SCAR的技术，可以获得物种特异性的标记，其基本原理是，首先RAPD利用随机引物(一般为8—10bp)通过PCR反应随机扩增DNA片段，通过凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性，并在目的菌种与近缘物种间进行比较，获取目的菌种所特有的扩增产物，并将其从凝胶中切割回收，将回收的产物进行克隆并测序，进一步获得目的菌株经RAPD扩增所获的特异性产物的序列信息，并以片段两端序列设计特异引物(>18bp)，对基因DNA片段再进行PCR特异扩增，就能把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。RAPD结合SCAR获得的针对特定物种的特异性引物，对待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示，可以方便、快捷、可靠地检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。与传统的真菌鉴定方法相比，分子标记能准确、快速地从植物组织上附着的混合微生物群体中鉴定出特定类型的病原菌。
对于葱鳞葡萄孢菌B.squamosa这种危害葱蒜类蔬菜作物的主要病原真菌，目前还缺乏有效的分子标记，本发明则通过RAPD结合SCAR技术开发了B.squamosa特异性的分子标记引物，并建立了快速、准确地鉴定B.squamosa的新方法。
发明内容
本发明克服现有技术存在的问题，旨在提出一种快速、有效且容易操作的检测方法来鉴定葱蒜类蔬菜作物的重要病原菌葱鳞葡萄孢菌(Botrytissquamosa，B.squamosa)。
本发明提出的葱鳞葡萄孢菌的快速检测方法，所述方法主要包括以下步骤：
(1)设计检测所述葱鳞葡萄孢菌(B.squamosa)的特异性引物：
本发明中，设计检测B.squamosa的特异性引物为：采用RAPD(RandomAmplificationPolymorphicDNA,RAPD)和SCAR(Sequence-characterizedAmplifiedRegions)相结合的方法，开发设计一对能够特异性检测B.squamosa的引物，如以下SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：
上游引物5’-CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'(SEQIDNO.1)；
下游引物5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'(SEQIDNO.2)。
(2)提取对待检样品的总DNA；
(3)以待检样品DNA为模板，用所述葱鳞葡萄孢菌特异性引物进行PCR聚合酶链式反应；
(4)将得到的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，经GoldenView染色后，在凝胶成像系统下进行分析，以是否具有301bp的葱鳞葡萄孢菌的特异性扩增产物，判断对应的待检样品(包括植物样品)是否受到葱鳞葡萄孢菌的侵染。
本发明技术方案包括：设计开发特异性检测葱鳞葡萄孢菌的特异性引物，葱鳞葡萄孢菌检测方法的建立及应用。本发明检测方法中，在一具体实施方案中包括如下步骤：
(1)设计葱鳞葡萄孢菌特异性引物：
上游引物5’-CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'(SEQIDNO.1)；
下游引物5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'(SEQIDNO.2)。
(2)CTAB法提取待测样品的DNA
a)取幼嫩菌丝0.05g于研钵中，充分研磨破碎后，加入提前预热的1mLCTAB提取液，再将混合液转入2mLEP管中，65℃水浴处理1h；
b)向EP管中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，震荡混匀后，12000rpm离心10min；
c)取上清液于新的EP管中，依次加入等体积的异丙醇溶液和1/10体积的NaAc，轻轻上下颠倒，-20℃沉淀30min；
d)12000rpm离心10min，小心倒去上清液留沉淀，再加入500mL75％的乙醇清洗沉淀；
e)12000rpm离心5min，倒去上清，室温晾干沉淀；
f)加入20-30uL无菌水溶解DNA,-20℃保存备用。
CTAB提取液配方(1L)：CTAB20g；NaCl81.82g；1MTris-Hcl(pH8.0)100mL；0.5MEDTA(pH8.0)40mL，蒸馏水定容至1L。
(3)PCR扩增：反应体系20μl，包括商品化的2×TiandzTaqPCRmix10μl，DNA10-20ng，上下游引物各0.5μl，ddH2O补齐值20μl。PCR扩增条件为：第一循环94℃预变性5min；第二循环94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环；第三循环72℃终延伸7min。
(4)PCR产物6μl，2％琼脂糖凝胶电泳，电压90V，40min，凝胶成像仪观察并拍照，在301bp处出现条带，则说明该病原菌为B.squamosa。
本发明还提出了一对用于特异性检测葱鳞葡萄孢菌的引物，所述引物如以下SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：
上游引物5’-CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'(SEQIDNO.1)；
下游引物5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'(SEQIDNO.2)。
本发明主要提出了用于特异性检测葱鳞葡萄孢菌的检测试剂盒，所述试剂盒包含如以下SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物：
上游引物5’-CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'(SEQIDNO.1)；
下游引物5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'(SEQIDNO.2)。
所述试剂盒还进一步包括：
PCR反应体系；其中，所述PCR反应体系20μl包括：2×TiandzTaqPCRmix10μl，待测样品的DNA10-20ng，上下游引物各0.5μl，ddH2O补齐至20μl。
所述试剂盒还进一步包含：CTAB提取DNA缓冲液、酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)、异丙醇、NaAc溶液，乙醇溶液(75％)。
本发明还提出了将所述检测方法应用于对葱属类蔬菜作物主要病原菌葱鳞葡萄孢菌快速检测诊断中。
本发明有益效果包括：利用一对特异性PCR引物，通过基本的PCR操作，利用PCR扩增产物的有无，鉴定侵染葱属类致病菌B.squamosa，相比于对待测样品进行病原菌的分离、纯化、鉴定的现有传统方法相比，本发明提供的快速、简便检测B.squamosa方法的优点包括：(1)周期短：传统方法从对病原菌的分离纯化和培养，到对病原菌生物学特性的分析鉴定，至少需要耗时3～7天，而本方法从DNA提取，到PCR和电泳检测，可在1天之内完成。(2)简便易行：用传统方法进行葱鳞葡萄孢菌鉴定，需要工作人员具备非常特殊的植物病理学、微生物培养和形态学分析等方面的专业知识，且步骤繁琐，而本方法仅需具备普通的分子生物学技术基础就可以完成鉴定工作。(3)鉴定结果客观可靠：植物病原菌形态学鉴定和诊断的传统方法需要依赖于鉴定人员对病原微生物形态学知识积累的主观经验，而本发明检测方法针对葱鳞葡萄孢菌所开发的分子标记，则依赖于物种间DNA的差异和PCR扩增的多态性，仅需按照标准的流程操作，以扩增产物的有无来特异性区分该病原菌与其它病原菌，对结果的判定客观、高效、可靠。
附图说明
图1表示葱鳞葡萄孢菌B.squamosa特异性引物在已知种型的菌株PCR鉴定结果。其中：M：D2000marker；1-31泳道为灰霉菌属真菌：0022、0023、0024、0025、0026、0027、0050、0051、0060、0061、0080、0081、0094、0111、0128、0158、0160、0163、0164、0165、0166、0167、0168、0174、0175、0198、0205、0239、0361、0364、0510；32-33泳道为葱鳞葡萄孢菌EXGL-9、Bc-2；34-42泳道分别为：Bc-38、Bc-30、Bcp-72、EXOL-1、PH-1、0112、Alt、Col、H2O。
图2表示葱鳞葡萄孢菌B.squamosa特异性引物在洋葱组织中的检测结果，葱鳞葡萄孢菌侵染洋葱后PCR鉴定结果。其中：M：50bpmarker；泳道1为B.squamosa基因组DNA；泳道2为洋葱病组织基因组DNA；泳道3为健康洋葱组织基因组DNA。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：已知菌种的菌株的PCR鉴定结果
1、菌株的DNA提取
实验所用菌株如表1所示，其中包含一株葱鳞葡萄孢(Botrytissquamosa，EXGL-9)，分离自葡萄、草莓、茄子、番茄、生菜等寄主的葡萄孢属(Botrytissp.)的病原真菌，由华中农业大学李国庆教授馈赠的大葱盲种葡萄孢菌(Botrytisporri，Bc-38)、拟蚕豆葡萄孢菌(Botrytisfabiopsis，Bc-30)、中国葱葡萄孢菌(Botrytissinoallii，Bc-72)菌株，以及镰刀菌属、链格孢属、炭疽菌属的菌株(PH-1、0112、Alt、Col)。各菌株接种在铺有玻璃纸的PDA培养基上，25℃生长1天，挑取各菌株菌丝，采用CTAB法提取DNA备用。
2、特异引物的合成
上游引物：5’-CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'(SEQIDNO.1)；
下游引物：5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'(SEQIDNO.2)。
3、PCR反应体系及扩增程序
反应体系为20μl，包括商品化的2×TiandzTaqmastermix(2×TiandzTaqPCRmix)10μl，特异性上下游引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2各0.5μl，DNA10-20ng，ddH2O补齐至20μl。
扩增程序为：第一循环94℃预变性5min；第二循环94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环；第三循环72℃终止延伸7min。PCR产物4℃保存。
4、PCR产物的鉴定
PCR产物6μl，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电压90V，时间40min，凝胶成像仪观察并拍照。
5、实验结果
利用本发明的特异性引物，以已知种型的菌株为模板，PCR扩增结果如图1所示，1-31和34-37泳道为灰霉属真菌、38-41为其它属的PH-1(Fusariumgraminearum)、0112(Fusariumoxysporum)、Alt(Alterariatenuissima)、Col(Colletotrichumsp.)菌株，均不能扩增出条带，32、33泳道为B.squamosa可以在301bp处扩增出结果，且与已知结果相符。
本实施例中，检测方法中所用的试剂盒包括：CTAB提取DNA缓冲液、酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)、异丙醇、NaAc溶液，乙醇溶液(75％)、商品化PCRMix。
实施例2：发病洋葱组织的PCR扩增结果
1、植物病组织中真菌DNA的提取
本发明提取B.squamosa侵染的洋葱组织内真菌基因组DNA。
PCR扩增体系、程序、特异引物及合成，同实施例1。
2、实施结果
利用本发明的特异性引物，以B.squamosa侵染的洋葱病组织基因组DNA为模板，PCR扩增结果如图2，泳道1为B.squamosa真菌基因组DNA，可以在301bp处扩增出条带；泳道2为洋葱病组织基因组DNA，也可在301bp处扩增出条带；泳道3为健康洋葱组织DNA，其不能扩增出条带。结果表明本发明提供的特异性引物和技术方案可有效的检测洋葱组织中是否存在B.squamosa侵染。
本实施例中，检测方法中所用的试剂盒包括：CTAB提取DNA缓冲液、酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)、异丙醇、NaAc溶液，乙醇溶液(75％)、商品化PCRMix。
表1供试菌株种类与来源

Claims (6)

1.一种葱鳞葡萄孢菌的快速检测方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：
(1)设计检测所述葱鳞葡萄孢菌的特异性引物为：采用RAPD和SCAR相结合的方法，设计一对能够特异性检测的引物，所述引物如以下SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：
上游引物5’-CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'(SEQIDNO.1)；
下游引物5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'(SEQIDNO.2)；
(2)提取对待检样品的总DNA；
(3)以待检样品DNA为模板，用所述葱鳞葡萄孢菌特异性引物进行PCR聚合酶链式反应；
(4)将得到的PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，经GoldenView染色后，在凝胶成像系统下进行分析，以是否具有301bp的葱鳞葡萄孢菌的特异性扩增产物，判断对应的待检样品是否受到葱鳞葡萄孢菌的侵染。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述PCR反应体系包括：2×TiandzTaqPCRmix10μl，DNA10-20ng，上下游引物各0.5μl，ddH2O补齐至20μl。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述PCR扩增条件为：第一循环94℃预变性5min；第二循环94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环；第三循环72℃终止延伸7min。
4.一对用于特异性检测葱鳞葡萄孢菌的引物，其特征在于，
所述引物如以下SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：
上游引物5’-CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'(SEQIDNO.1)；
下游引物5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'(SEQIDNO.2)。
5.一种用于特异性检测葱鳞葡萄孢菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如以下SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物：
上游引物5’-CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'(SEQIDNO.1)；
下游引物5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'(SEQIDNO.2)。
6.如权利要求1所述的检测方法在葱鳞葡萄孢菌的鉴别或葱蒜类蔬菜作物的田间和采后灰霉病的诊断和预警中的应用。
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