CN102559669A

CN102559669A - 小麦禾谷孢囊线虫特异性scar标记及其快速pcr检测方法

Info

Publication number: CN102559669A
Application number: CN2012100320180A
Authority: CN
Inventors: 彭德良; 亓晓莉; 黄文坤; 彭焕; 贺文婷
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-02-13
Filing date: 2012-02-13
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2032-02-13
Also published as: CN102559669B

Abstract

本发明为“小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记及其快速PCR检测方法”，属生物技术领域。小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段，其特征在于该DNA片段具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。根据小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段设计的特异性引物HaF1和HaR1，在PCR快速检测小麦禾谷孢囊线虫的方法中，可扩增出1010bp的特异性片段。本发明提高了分子检测灵敏度并且快速准确，在小麦禾谷孢囊线虫检测和小麦孢囊线虫病的早期诊断方面，具有很高的应用价值。

Description

小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记及其快速PCR检测方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记全序列、特异性SCAR标记引物序列及小麦禾谷孢囊线虫SACR特异性标记快速PCR检测方法。

背景技术

小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae；俗名Cereal Cyst Nematode，CCN)是温带禾谷作物上的世界性重要病原线虫，自1874年在德国被发现以来，随后在英国、俄罗斯、挪威、澳大利亚、加拿大、美国、中国等40多个国家均发生不同程度的危害，严重影响禾谷作物尤其是麦类作物的产量和质量。我国自1989年彭德良等首次在湖北省天门县发现小麦禾谷孢囊线虫为害小麦后，目前已发现在湖北、河南、河北、北京、山东、山西、内蒙古、青海、江苏、安徽、甘肃、陕西、宁夏等13省市都有禾谷孢囊线虫的分布。因此，该线虫已成为严重威胁我国小麦生产的主要病害。

在为害小麦的孢囊线虫中，主要有禾谷孢囊线虫(H.avenae)，菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)，大麦孢囊线虫(H.latipons)三个种，它们具有很相似的形态学结构，形态学特征差异较小。目前孢囊线虫的鉴定大部分依赖于传统的形态学鉴定方法，耗时较多且需要很熟练的专业技术，通常需要专门从事分类的人员来完成，从而给危害小麦的孢囊线虫鉴定增加了难度。

以PCR为基础的分子生物学手段为解决线虫快速鉴定中存在的问题提供了工具。随着PCR检测技术的发展，线虫的分子诊断取得重要进展。Mulholland等(1996)分别构建了基于rDNA-ITS的马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(G.pallida)的特异性引物，描述了这两种线虫的特异性多重PCR检测技术，能快速鉴定马铃薯白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应中应用了3个引物，通用引物5.8S rRNA、马铃薯金线虫的特异性引物ITS1-Gr和马铃薯白线虫的特异性引物ITS1-Gp。通过一次PCR测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。Bulman和Marshall(1997)在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSr3和白线虫的特异性引物PITSp4，应用多重PCR技术可以快速诊断马铃薯孢囊线虫。通用引物ITS5与PITSr3可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，通用引物ITS5与PITSp4可以扩增出265bp马铃薯白线虫的特异性片段。在一个PCR反应中，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出金线虫。

Amiri和Subbotin等(2002)构建了基于rDNA-ITS的甜菜孢囊线虫(H.schachtii)特异性引物SHF6。特异性引物SHF6与通用引物AB28引物结合，同时与通用引物D2A和D3B放在一个PCR反应体系中进行一步双重PCR，从58个孢囊线虫群体中成功地鉴定出甜菜孢囊线虫，甜菜孢囊线虫群体中可以扩增200bp特异性片段，而非甜菜孢囊线虫中不能扩增出200bp的片段。

彭德良和Subbotin等(2001)构建了基于rDNA-ITS区域上的大豆孢囊线虫特异性引物GlyF1，应用两组引物D3A和D3B及大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1和引物rDNA2成功地对大豆孢囊线虫进行了分子诊断研究。内标引物D3A和D3B是保证DNA的有效性，第二对引物GlyFI和rDNA2是特异性检测大豆孢囊线虫。用这两对引物进行的双重PCR扩增，从所有52个大豆孢囊线虫群体都能扩增181bp的大豆孢囊线虫的特异性DNA片段，而在所有测试的其他8种孢囊线虫22个群体不能扩增出181bp的特异性片段。大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1灵敏性非常高，能从单条幼虫的微量DNA中扩增出大豆谷孢囊线虫种特异性片段。

此外，国外有一些基于基因组DNA的SCAR标记用于植物线虫特异性检测的报道。在马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的快速分子诊断中，Fullanodo等(1999)用RAPD随机引物OPG5分别扩增出马铃薯金线虫特异性片段826bp，马铃薯白线虫特异性片段1100bp。对扩增出的片段进行全序列分析，将RAPD标记转化成SCAR标记，设计马铃薯金线虫的SCAR标记特异性引物FullGrf和FullGrr，扩增出了315bp的特异性片段；设计马铃薯白线虫的SCAR特异性标记引物FullGpf和FullGpr，扩增出798bp的特异性片段，从而可以快速检测马铃薯金线虫和马铃薯白线虫。

Ou，S.Q.Peng D.L.(欧师琪彭德良等2008)采用RAPD技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，构建了大豆孢囊线虫特异性SCAR标记的特异性引物SCNFI和SCNRI，可扩增出473bp大豆孢囊线虫的特异性SCAR标记片段，选用核糖体引物D2A和D3B作为内标与上述特异性引物SCNF1和SCNR1相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫，PCR产物可获得473bp的特异性片段和800bp的内标片段，在PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了473bp的特异性SCAR标记片段和800bp片段。

国内外关于小麦禾谷孢囊线虫核糖体DNA的ITS区域有一些研究。主要集中在ITS序列特征、利用限制性内切酶分析ITS区酶切片段的长度多态性等方面，但未见基于基因组DNA的SCAR标记引物特异性检测小麦禾谷孢囊线虫的报道。因此，开发小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记，建立快速PCR检测方法，对于快速准确鉴定小麦禾谷孢囊线虫的种类，明确其发生与分布特征，制定相应的防控措施等具有重要意义。

发明内容

针对上述技术领域的空白，本发明提供小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的全长序列，同时提供了SCAR标记的特异性引物。

本发明还提供小麦禾谷孢囊线虫特异性SACR快速PCR检测方法，将为制定线虫的快速分子检测方法，开展小麦禾谷孢囊线虫病的早期诊断，制定其综合治理对策提供理论依据。

小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段，其特征在于具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

根据小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段设计的特异性引物。

优选为HaF1和HaR1，其序列为：

HaF1：5’-TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3’

HaR1：5’-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3’

小麦禾谷孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有上述特异性引物。

优选所述PCR反应体系中含有特异性引物HaF1和HaR1。

本发明利用RAPD技术，获得了基于小麦禾谷孢囊线虫基因组DNA的特异性RAPD标记，将RAPD标记转换成SCAR标记，经克隆、测序后获得了特异性SCAR标记的全长序列SEQ ID NO1，利用该SCAR标记的保守序列可以设计出其特异性引物，用于PCR检测出目标线虫。

本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物HaF1和HaR1(即SEQ ID NO2和SEQ IDNO3)。利用小麦禾谷孢囊线虫特异性引物HaF1和HaR1，在PCR扩增条件下，所有小麦禾谷孢囊线虫群体都获得了1010bp的特异性SCAR标记片段，而其它线虫类则没有1010bp的特异性SCAR标记片段。本发明构建的特异性引物HaF1和HaR1，特异性强，准确性好，灵敏度高。

本发明应用特异性SCAR标记PCR技术检测目标线虫，与随机扩增多态性DNA技术(RAPD-PCR)、核糖体DNA限制性片段长度多态性技术(RFLP-PCR)检测方法相比，更省时、更准确、更灵敏，能够更加快速、准确地检测小麦禾谷孢囊线虫。该技术可应用于携带小麦禾谷孢囊线虫的田间土壤样品及植株的早期快速分子检测，具有较高的实用价值。

附图说明

图1：用随机引物OPD13扩增的小麦禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫大麦孢囊线虫、马铃薯腐烂茎线虫的RAPD的多态性结果。

M为标准的DNA分子质量标记(DNA markerDL 2，000)；1-6为小麦禾谷孢囊线虫群体(编码为Ha01，Ha03，Ha07，Ha12，Ha17，Ha18)；7-8为菲利普孢囊线虫群体(编码为Hf01，Hf04)；9为大豆孢囊线虫群体(编码为Hg01)；10为旱稻孢囊线虫(编码为He01)；11为大麦孢囊线虫群体(编码为H101)12为马铃薯腐烂茎线虫群体(编码为Dd01)；13为阴性对照(群体代码及来源见表1和表2)

图2：小麦禾谷孢囊线虫SCAR标记特异性引物扩增检测的特异性DNA片段M为标准的DNA分子质量标记(DNA markerDL 2，000)；1-8分别为小麦禾谷孢囊线虫8个不同群体(编码为Ha01，Ha03，Ha07，Ha08，Ha10，Ha11，Ha12，Ha17)；9为菲利普孢囊线虫群体(编码为Hf01)；10为大豆孢囊线虫群体(编码为Hg01)；11为旱稻孢囊线虫群体(编码为He01)；12为为大麦孢囊线虫群体(编码为H101)13为马铃薯腐烂茎线虫群体(编码为Dd01)；14为阴性对照(群体代码及来源见表1和表2)

图3：小麦禾谷孢囊线虫SCAR标记特异性引物的灵敏度检测

M为标准的DNA分子质量标记(DNA marker DL 2，000)；1-7分别为1，10^-1，100^-2，0^-3，10^-4，10^-5，10^-6μl小麦禾谷孢囊线虫单个孢囊的DNA；8为阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明的实验选用的材料：

16个小麦禾谷孢囊线虫群体为本实验室长期从山东省、青海省、河南省、甘肃省、安徽等地收集且在小麦上进行繁殖的孢囊线虫种群，11个菲利普孢囊线虫群体为本实验室从河南等省市收集保存，2个小麦禾谷孢囊线虫国外群体，3个菲利普孢囊线虫国外群体以及其他线虫群体为本实验室工作人员收集(表1、表2)。上述样本本实验室均有保存，可以对公众发放。

表1供试小麦禾谷孢囊线虫及其它线虫样品代码及群体来源

表2供试非小麦禾谷孢囊线虫群体样品代码及来源

主要试剂：Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、DNA marker、PMD18-T vector购自宝生物工程(大连)有限公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；(TaKaRa，Dalian，China)，购自北京华绿源生物技术公司；DH5α感受态细胞购自天根生物工程有限公司。

实施例1：小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段、特异性引物

1.1小麦禾谷孢囊线虫基因组DNA的提取

分别挑取1个饱满的小麦禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫旱稻孢囊线虫、大麦孢囊线虫等供试孢囊线虫的孢囊，或者分别挑取单头根结线虫、马铃薯腐烂茎线虫、松材线虫、香蕉穿孔线虫等线虫的幼虫，放入含有10μl双蒸水的PCR管中，在液氮中快速冷冻。对于根结线虫，甘薯茎线虫等线虫群体则是挑取单头线虫放入10μl灭菌的双蒸水中，同样在液氮中冷冻。取出后置于冰上，用75％酒精消毒的玻璃棒在PCR管中转动至冰融化，将孢囊捅破释放其中的卵。加入8μl的10×的PCR buffer，2μl蛋白酶K溶液(600μg/ml)，在-80℃条件下冷冻2h以上。然后将PCR管取出，置65℃下温浴1.5h，95℃温浴10min，使蛋白酶K变性。最后在1000rpm下离心1min，取上清DNA悬浮液于-20℃保存备用。

1.2小麦禾谷孢囊线虫特异性RAPD标记的筛选和序列测定

借鉴彭德良研究小麦禾谷孢囊线虫群体的遗传变异分析结果(彭德良，小麦和大豆孢囊线虫毒性、分子诊断及线虫病害生防因子研究博士学位论文，2001年7月)，在能产生多态性的从RAPD引物中遴选出12个Operon系列的含10个碱基的随机引物OPA02、OPA03、OPA06、OPA09、OPA13、OPA18、OPB15、OPC06、OPD13、OPG06、OPG08、OPK16(见表3)进行扩增。从扩增结果来看，随机引物OPD13获得的特异性片段稳定，因此选用OPD13对18个小麦禾谷孢囊线虫群体和其他孢囊线虫群体的DNA进行扩增，获得小麦禾谷孢囊线虫群体的RAPD特异标记片段为1065bp。

以供试孢囊线虫的DNA为模板，以随机引物OPD13(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)进行PCR扩增。RAPD-PCR反应体系为25μl，配比如下：10×PCR-buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 2.0μl，引物OPD13 3.0μl，Taq DNA多聚酶0.25μl(5U/μl)，模板DNA 0.5μl，灭菌重蒸水补足25μl。在EppendorfPCR扩增仪上进行扩增。

PCR扩增条件为94℃5min；94℃30s，35℃30s，72℃1min，10个循环；94℃30s；35℃1min；72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V电压下电泳1小时，EB染色后，用BioRad GelDoc凝胶成像系统进行照相分析(图1)。

表3本发明所使用引物代码和序列

^*为本专利中所使用的RAPD随机引物

用随机引物OPD13经过多次RAPD扩增多态性较稳定，从图1中可以看出用随机引物OPD13扩增获得小麦禾谷孢囊线虫群体约1065bp的RAPD特异性DNA片段(图1中1-6泳道)。

将随机引物OPD13扩增获得的小麦禾谷孢囊线虫的约1065bp RAPD特异性DNA片段从琼脂糖凝胶上切割，用大连宝生物公司的DNA回收试剂盒对RAPD特异性DNA片段进行回收和纯化后，将纯化后的RAPD-PCR产物连接到PMD18-T Vector载体上，转化到DH5αE.coli中进行克隆，通过蓝白斑筛选将表现为阳性克隆的白斑重组质粒委托华大基因公司进行序列测定，测定结果禾谷孢囊线虫RAPD特异性DNA片段为1065bp，全序列如下：

5’-GGGGTGACGAGAACATATGATGGGGATGATGGTGGTGGGCAGCGGAAGGCAAGCCAAGCGGATTTTGGAACATCAGTGCTAACGCGGTGACCGCTTGGAGTTGGTCCTATGAGTGGAAAAATAGGCGTGTTGGGTTGTTTCATAAAAACTGCCGCCCCACCATAGGCATGTCATAAACCCGCCATTTTTATAAATTTTTGAGAAAATTCGTCATAACTTTTCTTGAAAGCAACCAAATTAAATAATCTTAGTATGTATGGTCCGAGAGCTATTAGTTAACTCTATTAGGTAGCCAAATTACAGAAAAGTTCAGCAAGTTGTAACGACAAAAAATAAAAATAAAATCGTTTTTCGTCCATTTTTTTTCTTAAAACAAAAATAAATTTTTTGAAATTTTGATGGCTAATAGAGCTAACAATTAGCTAGCGGATAATACCAAGATTGTTCAATTTTGTTGCGTTTGAGCACAGTTATGAAGCGTTTTTGTCGGAAAATCTGAAAATTGGCCGAATTTGTAAAACGCCCAGGGGTAATGGCGGTTGATAGGGAAAAAATTCTCCAAAATGAAGGCCAATGGCATGGCAAAGAAAAGACAACATTAAAATGGACTGACCGGACTAAGCGTTGTGTTCGATGGGAGAAGCGGTGGTGGTGGTGGCATTTGTGGTGCCGTAGTGTTAGACATGAACCCGGCGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTGCCACCATTGTTCTCAAATGAAGCATTATTGTTTTGTTGACCATTGCCGACCGTTGGCGATGCTTCATCTTCAACCGTTGTTGAATGAATGAACAATTCACGACCACTGAAAAAGGGATGAATCAGAAAAAGGCAAAACATAAAGAGATGTTTTCAAATAAGAAATTAAAATAAATTTCAGAGGGTTTAAAAGGGCCATTTTTTTTGGCAAAAATTCGAAAAGAAAAATCGCTTAATATTCGAAAAAGTCGACCGAATTTAGGTTGGCACTTTAGGTGCCCAAATTTTTTGTTAATGCTATTTAGAAGCAATTCCTGGGATCCATTTCATTCCCACCCCCTCGTCACCCC-3’

1.3、小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记引物的设计

用DNASTAR软件对上述小麦禾谷孢囊线虫RAPD序列进行分析比对，去掉上游易形成发夹结构的重复性碱基(5’-GGGG-)以及下游易形成发夹结构的重复性碱基(--GTCACCCC-3’)，上游引物以5’-TGACGAGAAC序列为起点，下游以5’-GAGGGGGTGG的反向互补序列为起点各延伸13个碱基构建了一对各含23碱基的小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记引物(下划线标记)。将小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记上游引物和下游引物分别命名为HaF1和HaR1，其序列特征如下：

HaF1：5’-TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3’

HaR1：5’-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3’

实施例2：小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记引物的分子检测

本发明构建的小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记引物HaF1和HaR1由上海生工生物有限公司合成，特异性SCAR标记的扩增反应体系总体积为50μl，其中含有5μl 10×PCR buffer(含Mg++)；4μl dNTP；1.0μl HaF1(0.1μg/μl)；1.0μl HaR1(0.1μg/μl)；2.5U Taq DNA聚合酶(5U/μl)；2μl模板DNA(小麦禾谷孢囊线虫及其它孢囊线虫群体提取的基因组DNA)；ddH₂O 36.5μl。

所应用的小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记引物序列如下：

HaF1：5’-TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3’

HaR1：5’-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3’

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃30S，59℃30S，72℃2min循环35次，72℃延伸10min，保存在4℃条件下。取5μl PCR反应产物与1μl上样缓冲液混匀在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V电压下电泳1小时，EB染色后，用BioRad GelDoc凝胶成像系统进行照相分析。观察特异行条带扩增结果(见图2)。

用小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记引物，在59℃的退火温度和35个循环的条件下扩增，小麦禾谷孢囊线虫群体都获得约1010bp特异性SCAR标记片段(图2中1-8泳道)，而菲利普孢囊线虫(图2中9泳道)，大豆孢囊线虫(10泳道)，旱稻孢囊线虫(11泳道)，大麦孢囊线虫(12泳道)，马铃薯腐烂茎线虫(13泳道)等都没有获得任何条带。说明本发明所设计构建的SCAR标记引物对小麦禾谷孢囊线虫具有特异性，这是目前国际首例报道的小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记引物。

将扩增小麦禾谷孢囊线虫获得的特异性SCAR标记片段从琼脂糖凝胶上切割，用大连宝生物公司的DNA回收试剂盒对SCAR标记片段进行纯化，纯化后的产物连接到PMD18-TVector载体上，转化到DH5α E.coli中进行克隆，通过蓝白斑筛选将表现为阳性克隆的重组质粒委托华大基因公司进行序列测定，测序结果表明特异性SCAR标记片段长度为1010bp，其序列如SEQ ID NO1所示。

实施例3：小麦禾谷孢囊线虫SCAR标记检测的灵敏度测定

以北京青云店地区的禾谷孢囊线虫的基因组DNA为初始模板，梯度稀释后，用SCAR引物对这些梯度稀释的基因组DNA进行扩增，当模板浓度大于10^-2μl时均可以检测到特异性的1010bp的条带(图3)。

PCR反应体系为25μl，配比如下：10×PCR-buffer 2.5μl；10mmol/L dNTP 2.0μl；引物HaF1(0.1μg/μl)1.0μl；HaR1(0.1μg/μl)1.0μl；Taq DNA多聚酶0.25μl(5U/μl)；模板DNA1.0μl；灭菌重蒸水补足25μl。

PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃30S，59℃30S，72℃2min循环35次，72℃延伸10min后，4℃条件下保存。取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳1h，用EB染色，用BioRad GelDoc凝胶成像系统进行照相分析。

所应用的小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记引物序列如下：

HaF1：5’-TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3’

HaR1：5’-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3’

Claims

1.小麦禾谷孢囊线虫特异SCAR标记的DNA片段，其特征在于该DNA片段具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段的保守序列设计的特异性引物。

3.权利要求2所述的特异性引物，其为HaF1和HaR1，其序列为：

HaF1：5’-TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3’，

HaR1：5’-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3’。

4.小麦禾谷孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有权利要求2或3所述的特异性引物。