CN1900282A - 大豆孢囊线虫特异性scar标记、特异性引物及快速pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明为“大豆孢囊线虫特异性SCAR标记、特异性引物及快速PCR检测方法”，属生物技术领域。大豆孢囊线虫特异性SCAR标记，其特征在于该SCAR标记具有SEQ NO1所示的核苷酸序列。根据大豆孢囊线虫特异性SCAR标记设计的引物SCNF1和SCNR1，在PCR快速检测大豆孢囊线虫的方法中，可扩增出500bp的片段，同时还可以在PCR反应体系中加入引物D2A和D3B作为内标，能同时扩增出800bp的片段。本发明提高了分子检测灵敏度并且快速准确，在大豆孢囊线虫检测和大豆孢囊线虫病的早期诊断方面，具有很高的应用价值。

Description

大豆孢囊线虫特异性SCAR标记、特异性引物 及快速PCR检测方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及大豆孢囊线虫特异性SCAR标记全序列、特异性SCAR标记引物序列及大豆孢囊线虫SACR特异性快速PCR检测方法。

技术背景

大豆孢囊线虫病(Heterodera glycines)是世界大豆生产上的重大毁灭性生物灾害，在美国、日本、韩国、中国、俄罗斯远东地区、阿根廷、巴西、埃及、印度尼西亚等国家普遍发生，危害严重。在我国，大豆孢囊线虫主要分布在东北和黄淮海两个大豆主产区，尤以东北三省西部风沙、干旱、盐碱地发生普遍严重，目前我国大豆孢囊线虫发生面积达6000万亩以上，一般发病造成损失10％-20％，严重时达30％-50％，使大豆减产约4亿公斤，引起的损失是达8亿元人民币。目前大豆孢囊线虫的鉴定多数情况下仍然依赖于传统的形态学鉴定方法，生理小种和致病性的鉴定主要是用鉴别寄主或寄主植物的不同品种的反应型来确立。但形态学鉴定非常困难，需要许多的技术、耗时、费力且许多表型特征的不稳定性，形态特征测量值有重叠等原因使鉴定时常出现误差。

以PCR为基础的分子生物学技术为解决线虫鉴定诊断存在的问题提供了最有力的工具。特异性引物PCR或多重PCR技术是近年来线虫分子诊断取得的重要进展。通过一次PCR测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。基于核糖体DNA(rDNA)而构建的线虫特异性引物进展较快，在诊断根腐线虫、根结线虫中取得了突破性进展，形成了特异性诊断4种重要根腐线虫如穿刺根腐线虫P.penetrans、斯克里布根腐线虫P.scribneri、咖啡根腐线虫P.Coffeae和卢赛根腐线虫P.loosi的特异性引物，以及3种根结线虫如戚乌得根结线虫M.Chitwoodi、法拉克斯根结线虫M.fallax和北方根结线虫M.Hapla(Zijlstra，C.1997，Petersen et al.，1997，Williamson et al.，1997)的特异性引物，诊断的水平达到单条幼虫的水平。

Mulholland et al.(1996)分别构建了马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的特异性引物，描述了一种基于rDNA-ITS区域特异性等位多重PCR技术检测这两种线虫的方法，能快速鉴定马铃薯白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应中应用了3个引物，通用引物5.8SrRNA、马铃薯金线虫的特异性引物ITS1-Gr和马铃薯白线虫的特异性引物ITS1-Gp。Bulman & Marshall(1997)成功应用多重PCR技术快速诊断马铃薯孢囊线虫。在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSr3和白线虫的特异性引物PITSp4，通用引物ITS5与PITSr3可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，与PITSp4可以扩增出265bp特异性识别马铃薯白线虫的DNA片段。在一个PCR反应中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5这3个引物，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出金线虫。

彭德良、Subbotin等构建了基于rDNA-ITS区域上的大豆孢囊线虫特异性引物GlyF1，应用两组引物D3A和D3B及大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1和引物rDNA2成功地对大豆孢囊线虫进行了分子诊断研究。第一对引物D3A和D3B是证实PCR扩增的成功性，第二对引物GlyFI和rDNA2是特异性检测大豆孢囊线虫。用这两对引物进行的双倍PCR扩增，从所有52个大豆孢囊线虫群体都扩大豆孢囊线虫的特异性DNA片段(181bp)，而在所有测试的其他8种孢囊线虫22群体没有181bp片段。大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1灵敏性非常高，能从单条幼虫的微量DNA中扩增出大豆孢囊线虫种特异性片段。

Amiri，Subbotin等(2002)构建了基于rDNA-ITS的甜菜孢囊线虫(H.schachtii)特异性引物SHF6。将特异性引物SHF6与通用引物AB28引物结合，同时将通用引物D2A和D3B放在一个PCR反应体系中，从58个孢囊线虫群体中成功地鉴定出甜菜孢囊线虫，从36个甜菜孢囊线虫群体中扩增200bp特异性片段，而没有甜菜孢囊线虫(H.schachtii)DNA的样品没有200bp的片段。

而基于基因组DNA的SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)标记植物线虫特异性引物进展较慢。但是在马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的快速分子诊断中取得进展，Fullanodo，A.et.al.(1999)用随机引物OPG5分别扩增出区分马铃薯金线虫特异性RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)标记片段为826bp，马铃薯白线虫特异性RAPD标记片段为1100bp。对扩增出的马铃薯金线虫和白线虫的RAPD标记片段进行全序列分析，将RAPD标记转化成SCAR标记，设计出马铃薯金线虫FullGrf和FullGrr以及马铃薯白线虫的SCAR特异性标记引物FullGpf和FullGpr，用FullGrf和FullGrr扩增出了315bp马铃薯金线虫的特异性片段，用FullGpf和FullGpr扩增出798bp的马铃薯白线虫的特异性片段。

国内外虽然有基于核糖体DNA的ITS区域的大豆孢囊线虫特异性引物GlyF1的报道，但是国内外尚未见基于基因组DNA的大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物检测大豆孢囊线虫的报道。

发明内容

针对上述技术领域的空白，本发明提供大豆孢囊线虫特异性SCAR标记的全长序列，同时提供了特异性SCAR标记的特异性引物。

本发明还提供大豆孢囊线虫SACR特异性快速PCR检测方法，为制定线虫的快速分子检测、大豆孢囊线虫病的早期诊断和制定线虫病害综合治理对策服务。

大豆孢囊线虫特异SCAR标记，其特征在于其具有SEQ NO1所示的核苷酸序列。

大豆孢囊线虫特异性SCAR标记的引物SCNF1和SCNR1，其序列为：

SCNFI：5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’，

SCNRI：5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’。

大豆孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有上述引物SCNF1和SCNR1。

所述PCR反应体系中还含有通用引物。

所述通用引物序列为：

D2A：5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′，

D3B：5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′。

本发明利用RAPD技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性RAPD标记，将RAPD标记转换成SCAR标记，经克隆测序后获得了特异性SCAR标记的全长序列SEQNO1，构建了特异性SCAR标记的特异性引物SCNFI和SCNRI(即SEQ NO2和SEQ NO3)。利用大豆孢囊线虫特异性引物SCNFI和SCNRI，在PCR扩增条件下，所有大豆孢囊线虫群体都获得了500bp的特异性SCAR标记片段，而其它线虫类则没有500bp的特异性SCAR标记片段。为防止假阴性反应，可以在PCR反应体系中加入通用引物作内标。本发明选用核糖体引物D2A和D3B与上述特异性引物SCNF1和SCNR1相结合，利用一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫，在PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了500bp的特异性SCAR标记片段和800bp片段，而其它线虫类则没有500bp的特异性SCAR标记片段，只有800bp片段，增加了可靠性。

本发明应用特异性SCAR标记及核糖体基因相结合的一步双重聚合酶链式反应PCR检测技术检测目标线虫，与重复性较差的RAPD技术(RAPD-PCR)、核糖体DNA限制性内切酶技术(RFLP-PCR)检测方法相比，更能够省时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的大豆孢囊线虫检测技术。该技术可应用于对大豆孢囊线虫田间土壤样品及大豆孢囊线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

附图说明

图1：用随机引物OPA06扩增大豆孢囊线虫、马铃薯白线虫、马铃薯金线虫和禾谷孢囊线虫的RAPD的特异性DNA片段结果。

M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-2分别为马铃薯白线虫(编码为PCNp1，PCNp2)，3-4分别为马铃薯金线虫(编码为PCNr3，PCNr4)，5-13分别为大豆孢囊线虫群体(编码为SCN08，SCN09，SCN06，SCN10，SCN11，SCN03，SCN05，SCN07，SCN29)，14-15分别为禾谷孢囊线虫群体(编码为CCN02，CCN01)；16为阴性对照

图2：用大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物(SCNFI和SCNRI)扩增4种孢囊线虫的结果。M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-7分别为大豆孢囊线虫7个不同群体(编码为SCN29，SCN11，SCN03，SCN05，SCN10，SCN16，SCN07)，8-9分别为马铃薯金线虫2个不同群体(编码为PCNr3，PCNr4)，10-11别为马铃薯白线虫2个不同群体(编码为PCNp1，PCNp2)；12为禾谷孢囊线虫群体(编码为CCN02)；13为阴性对照。

图3：大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(D2A和D3B)结合一步双重PCR检测结果。

M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-16分别为大豆孢囊线虫SCN01，SCN02，SCN04，SCN06，SCN08，SCN09，SCN12，SCN13，SCN14，SCN15，SCN17，SCN18，SCN19，SCN20，SCN21，SCN22；17：阴性对照

图4：大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(D2A和D3B)结合一步双重PCR检测5种孢囊线虫的结果。

M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-13分别为大豆孢囊线虫群体SCN23，SCN24，SCN25，SCN26，SCN27，SCN28，SCN30，SCN31，SCN32，SCN33，SCN34，SCN35，SCN36；14-15为马铃薯白线虫群体PCNp1，PCNp2，16-17为马铃薯金线虫群体PCNr3，PCNr4，18为甜菜孢囊线虫群体BCN，19-23为禾谷孢囊线虫群体CCN01，CCN03，CCN05，CCN07，CCN09；24：阴性对照

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明的实验选用的材料：

37个大豆孢囊线虫群体为本实验室长期从吉林省、黑龙江省、辽宁省、河北省、河南省、湖北省、山东省、山西省、北京等地收集保存且繁殖在大豆上的孢囊线虫种群，11个禾谷孢囊线虫群体为本实验室从北京、河北、河南等省市收集保存，1个甜菜孢囊线虫群体及4个马铃薯孢囊线虫群体为本实验室工作人员从比利时收集(见表1、表2)。

表1大豆孢囊线虫样品代码及群体来源

样品代码Codes	群体来源Origin of populations	寄主植物Plant host	生理小种Races
				SCN 01SCN 02SCN 03SCN 04SCN 05SCN 06SCN 07SCN 08SCN 09SCN 10SCN 11SCN 12SCN 13SCN 14SCN 15SCN 16SCN 17SCN 18SCN 19SCN 20SCN 21SCN 22SCN 23SCN 24SCN 25SCN 26SCN 27SCN 28	吉林省长岭县光明乡吉林省长岭县广太乡吉林省长岭县流水乡吉林省通榆县花道乡吉林省通榆县边昭乡吉林省榆树县榆树乡吉林省梨树县梨树乡吉林省公主岭吉林省白城辽宁省昌图辽宁省开原市庆云辽宁省开原市中固辽宁省台安县台安镇黑龙江省安达1黑龙江省安达2黑龙江省萝北县宝泉岭黑龙江省哈尔滨山东省昌邑县山东省菏泽县山东省胶县山东省潍坊市河南省商丘河南省垦利河南省长垣河南省滑县河南省温县山西省阳高山西省繁峙县	大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆	n.tn.tn.t553n.tn.t3n.tn.tn.tn.tn.tn.t3374n.t74447744

SCN 29SCN 30SCN 31SCN 32SCN 33SCN 34SCN 35SCN 36SCN 37

河北省廊坊湖北省武穴湖北省黄冈农科院植保所农场北镇北京市植保站山西省太谷县内蒙古乌兰浩特兴安盟内蒙古扎兰屯呼伦贝尔

大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆

n.tn.tn.tn.tn.tn.t4n.tn.t

表2供试非大豆孢囊线虫群体样品代码及来源

样品代码Codes	群体来源Origin of populations	寄主植物Plant host	生理小种Races
				CCN01CCN02CCN03CCN04CCN05CCN06CCN07CCN08CCN09CCN10CCN11BCNPCNp1PCNp2PCNr3PCNr4	北京房山涿州河南省郑州韩寨2河南省郑州韩寨3河南省郑州八面神5河南省郑州八面神12河南省郑州赵小树路河南省郑州八面神7河南省郑州饲料厂8河南省郑州饲料厂9河南省郑州饲料厂10德国比利时Belgium比利时Belgium比利时Belgium比利时Belgium	小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦甜菜马铃薯马铃薯马铃薯马铃薯	n.tn.tn.tn.tn.tn.tn.tn.tn.tn.tn.tn.tn.tn.tn.tn.t

主要试剂：Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、DNA marker购自TaKaRa公司，限制性内切酶(Biolabs)购自京科宏达生物技术公司；引物由上海博亚生物技术有限公司合成；pGEM-T Easy Vector(Promega，美国)购自北京华绿源生物技术公司。

实施例1：大豆孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段、特异性引物

1.1大豆孢囊线虫DNA的提取

手挑大豆孢囊线虫、马铃薯白线虫、马铃薯金线虫各群体各1个孢囊，放入14μl灭菌的重蒸水中，-20℃冰箱中冷冻1h。用75％酒精消毒的玻璃棒在eppendorf tube中转动至冰融化，加入3μl的10X的PCR buffer，3μl蛋白酶K溶液(600μg/ml)，然后在-20℃下冷冻至少2h。2h后，将eppendorftube从冰箱中取出，置65℃下温育1.5h，以降解脱氧核糖核酸；接着在95℃10min，使蛋白酶K变性，最后1000rpm下离心1min，取上清DNA悬浮液于-20℃保存备用。

1.2大豆孢囊线虫特异性RAPD标记(SCAR标记)的筛选

根据彭德良(彭德良，小麦和大豆孢囊线虫毒性、分子诊断及线虫病害生防因子研究博士学位论文，2001年7月)研究大豆孢囊线虫群体的遗传变异分析结果，在能产生多态性的RAPD引物中，遴选12个Operon系列的含10个碱基的随机引物OPA02、OPA03、OPA06、OPA09、OPA13、OPA18、OPB15、OPC06、OPD13、OPG06、OPG08、OPK16(见表3)进行扩增。从扩增结果来看，随机引物OPA06扩增效果好，获得的特异性片段稳定，因此选用OPA06对24个大豆孢囊线虫群体和6个其他孢囊线虫群体的DNA进行扩增，寻找出大豆孢囊线虫群体的特异性SCAR标记片段位500bp。

RAPD-PCR反应体系：采用25μl的PCR反应体系，配比如下：10X PCR-buffer(含Mg++)2.5μl，dNTPs 2.0μl，引物OPA06为0.5μl，Taq DNA多聚酶0.2μl(5U/μl)，模板DNA0.5μl，灭菌重蒸水补足25μl。在EppendorfPCR扩增仪上进行扩增。

PCR扩增条件为94℃ 4min；94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1min，10个循环；94℃ 30s；35℃ 30s；72℃ 2min，35个循环；72℃延伸10min；4℃过夜。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，用1X TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳1小时，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。如图1。

表3本发明所使用引物代码和序列

引物代码Code of Primers	引物序列(5’to 3’)sequences
		OPA02OPA03OPA06	5’-TGCCGAGCTG-3’5’-AGTCAGCCAC-3’5’-GGACCCTGAC-3’

OPA09OPA13OPA18OPB15OPC06OPD13OPG06OPG08OPK16

5’-GGGTAACGCC-3’5’-CAGCACCCAC-3’5’-AGGTGACCGT-3’5’-GGAGGGTGTT-3’5’-AAGACCCCTC-3’5’-GGGGTGACGA-3’5’-GTGCCTAACC-3’5’-TCACGTCCAC-3’5’-GAGCGTCGAA-3’

用随机引物OPA06经过多次RAPD扩增多态性较稳定，从图1中可以看出用随机引物OPA06扩增大豆孢囊线虫群体获得500bp的特异性DNA片段(图1中5-13泳道)，用随机引物OPA06扩增马铃薯白线虫得到520bp的特异性DNA片段，用随机引物OPA06扩增马铃薯金线虫获得480bp的特异性DNA片段。

1.3、大豆孢囊线虫特异性SCAR的序列测定及构建特异性SCAR标记引物

将随机引物OPA06扩增大豆孢囊线虫获得的500bp的RAPD特异性DNA片段从琼脂糖凝胶上切割，使用大连宝生物公司的DNA回收试剂盒对500bp的RAPD特异性DNA片段进行回收和纯化后，纯化后的RAPD-PCR产物连接到pGEM-T easy Vector载体上，PCR产物与载体连接后，转化到E.coli中进行克隆，用原来的RAPD引物和限制性内切酶EcoRI对质粒DNA进行检测。将表现为阳性克隆的重组质粒委托大连宝生物公司进行序列测定。用Vector NTI 9.0(InforMax Co.)软件对序列进行分析比较。

测定的500bp大豆孢囊线虫特异性SCAR标记的全序列如下：

5’-GGACCCTGACCAAAAAGTTTCCGCTGGTAGGATTTTAAGTTGAAGTGTTGGCTAAAAGTTAAAAAAAATTCCAG

GCCGCTATCTCTAACCCCCTGGGCTGGGTGCTTCTAGAACTTTTCAGTACCAACTTTGTCCAGTTCAGTCCACGTTGA

ATAACTCATTAGGCTTTGACCTGAGCGCAGGGTGGCCAGCAGACTTATTGTAGAGCTTTAAAAGCCCGATTTTTCCAA

ATTTTAAAATTTCGAAAATTTTCAAAATTTTTCGAGCTAGGCCTAAAAAACTGTTTTCGGGTTTTTGAATTTTAGGAT

TTTTTAACGAATTTTCCCAGAGAAACGGAGACCACTTCCAAAACATAGTTTTTCGAGCTCTATCGATTGGTAATTTTT

TCGGAAAATTTTCGATTTTTTTTCGGAAATAGAAAAATTTTTTGGCCTCAGCGGGACATTTGAGTCCCGGGCCCATAA

CTCGTCAGGGTCC-3’

根据大豆孢囊线虫特异性SCAR标记的序列测序结果，上游引物以OPA06序列为起点，下游引物以OPA06序列5’-GGACCCTGAC的互补序列为起点，两端各延长14个碱基，构建了一对大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物，该引物对各含24碱基。将大豆孢囊线虫特异性SCAR标记上游引物和下游引物分别命名为SCNFI和SCNRI，其序列特征如下：

SCNFI(5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’

SCNRI(5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’

实施例2：大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物的分子检测

本发明构建的大豆孢囊囊线虫特异性SCAR标记引物SCNFI和SCNRI由上海博亚生物有限公司合成，特异性SCAR标记的扩增反应体系总体积为50μl，其中含有5μl 10XPCRbuffer(含Mg++)；4μl 2.5mM dNTP；0.5μl SCNFI(0.1μg/μl)；0.5μl SCNRI(0.1μg/μl)；1UTaq DNA聚合酶(5U/μl)；2μl模板DNA(大豆孢囊线虫及其它孢囊线虫群体提取的DNA)；ddH₂O 37.8μl。

所应用的大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物序列如下：

SCNFI(5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’

SCNRI(5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’

PCR扩增程序为：94℃预变性4min，然后94℃30S，75℃60S，72℃2min循环35次，72℃延伸10min，保存在4℃条件下。取5μl PCR反应产物与1μl上样缓冲液(0.09％溴酚兰，60％甘油，60mM EDTA)混匀，点入含0.5mg/L EB的1.2％琼脂糖凝胶中，在100V下电泳1小时，取出凝胶，采用Kodak EDAS-120凝胶分析系统进行照相分析。统计特异条带的分离结果(见图2)，与特异RAPD标记的分离情况进行对比分析。

利用大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物，在65℃的退火温度和35个循环的条件下扩增，所有大豆孢囊线虫群体都获得500bp特异性SCAR标记片段(图2中1-7泳道)，而马铃薯金线虫(图2中8-9泳道)、马铃薯白线虫(图2中10-11泳道)和禾谷孢囊线虫(图2中12泳道)没有获得500bp SCAR标记片段。说明本发明所构建的SCAR标记引物对大豆孢囊线虫具有特异性，这是目前国际首例大豆孢囊囊线虫特异性SCAR标记引物。

实施例3：特异性SCAR标记引物与通用引物(D2A和D3B)一步双重PGR方法检测大豆孢囊

线虫

本发明将构建的大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物SCNFI、SCNRI与通用引物D2A和D3B等4个引物置于同一个PCR反应中，SCNFI与SCNRI特异性扩增大豆孢囊线虫基因组DNA的SCAR标记片段，引物D2A和D3B用于扩增rDNA基因D2和D3扩展区域的DNA片段。本发明所采用的一步双重PCR方法为世界首例大豆孢囊线虫分子诊断方法，此分子检测方法含有基因组DNA和核糖体DNA两个片段。

本发明的大豆孢囊线虫分子检测方法含用20μl的PCR反应体系，配比如下：10XPCR-buffer(含Mg++)2.0μl，dNTPs 1.6μl，D2A 0.2μl，D3B 0.2μl，SCNFI1 0.2μl，SCNRI 0.2μl，Taq DNA多聚酶0.2μl(5U/μl)，模板DNA2.0μl，灭菌重蒸水12.6μl。

PCR反应扩增程序为：94℃预变性4min，然后94℃30S，65℃60S，72℃2min循环35次，72℃延伸10min后，4℃条件下保存。取3μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40min，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。相同样品的双重PCR至少重复两次以证实结果的准确性。同一采样地点的样品的鉴定试验重复三次。

所应用的大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物序列如下：

SCNFI 5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’

SCNRI 5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’

D2A   5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′

D3B   5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′

用特异性SCAR标记引物SCNFI、SCNRI和D2A及D3B两对引物在同一个PCR反应体系中对53个孢囊线虫群体进行PCR扩增(见图3，图4，大豆孢囊线虫SCN01，SCN02，SCN04，SCN06，SCN08，SCN09，SCN12，SCN13，SCN14，SCN15，SCN17，SCN18，SCN19，SCN20，SCN21，SCN22、SCN23，SCN24，SCN25，SCN26，SCN27，SCN28，SCN30，SCN31，SCN32，SCN33，SCN34，SCN35、SCN36等29个全部扩增到特异性SCAR标记的500bp片段(图3中1-17，图4中1-13)及D2和D3扩展区的800bp两个DNA片断。

而马铃薯白线虫群体PCNp1，PCNp2(图4中14-15)、马铃薯金线虫群体PCNr3，PCNr4(图4中16-17)、甜菜孢囊线虫群体BCN(图4中18)和禾谷孢囊线虫CCN01，CCN03，CCN05，CCN07，CCN09(图4中19-23)等4种其它孢囊线虫16个群体仅扩增到D2和D3扩展区的800bpDNA片断，而没有特异性SCAR标记的500bp片段(见图4)。说明本发明所构建的SCAR标记引物与通用引物(D2A和D3B)一步双重PCR方法对大豆孢囊线虫具有特异性，这是目前国际首例大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(D2A和D3B)一步双重特异性检测大豆孢囊线虫的分子方法。

附：本发明所涉及的核苷酸序列

SEQ NO1：大豆孢囊线虫特异性SCAR标记的全序列

5’-GGACCCTGACCAAAAAGTTTCCGCTGGTAGGATTTTAAGTTGAAGTGTTGGCTAAAAGTTAAAAAAAATTCCAG

GCCGCTATCTCTAACCCCCTGGGCTGGGTGCTTCTAGAACTTTTCAGTACCAACTTTGTCCAGTTCAGTCCACGTTGA

ATAACTCATTAGGCTTTGACCTGAGCGCAGGGTGGCCAGCAGACTTATTGTAGAGCTTTAAAAGCCCGATTTTTCCAA

ATTTTAAAATTTCGAAAATTTTCAAAATTTTTCGAGCTAGGCCTAAAAAACTGTTTTCGGGTTTTTGAATTTTAGGAT

TTTTTAACGAATTTTCCCAGAGAAACGGAGACCACTTCCAAAACATAGTTTTTCGAGCTCTATCGATTGGTAATTTTT

TCGGAAAATTTTCGATTTTTTTTCGGAAATAGAAAAATTTTTTGGCCTCAGCGGGACATTTGAGTCCCGGGCCCATAA

CTCGTCAGGGTCC-3’

大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物序列

SEQ NO2：上游引物SCNFI(5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’)

SEQ NO3：下游引物SCNRI(5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’)

Claims (6)

1.大豆孢囊线虫特异性SCAR标记，其特征在于该SCAR标记具有SEQ NO1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的大豆孢囊线虫特异性SCAR标记的引物SCNFI和SCNRI，其核苷酸序列为：

SCNFI：5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’，

SCNRI：5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’。

3.大豆孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有权利要求2所述引物SCNFI和SCNRI。

4.根据权利要求3所述的大豆孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，所述PCR反应体系中还含有通用引物。

5.根据权利要求4所述的大豆孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，所述通用引物的核苷酸序列为：

D2A：5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′，

D3B：5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′。

6.根据权利要求5所述的大豆孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，所述PCR检测为一步双重PCR检测。

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